[0001] 相关申请的交叉引用本申请要求2010年10月29日提交的美国临时申请序列号61/408,310(其内容整体通过引用并入本文)的权益。

[0002] 有关联邦政府资助的研究的声明本发明部分由美国政府资助编号5UO1 AI056410-03、和1UC1 AI062481 (NIH)、和W81XWH-06-2-0035 (DOD)支持。美国政府在本发明中具有某些权利。
发明领域

[0003] 本发明涉及在人受试者中引发针对登革病毒感染的免疫应答且可用于预防和/或治疗登革病毒感染的组合物，及其临床表现。

[0004] 发明背景黄病毒科包括原型黄热病病毒(YF)、登革病毒的4种血清型(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、日本脑炎病毒(JE)、蜱传播脑炎病毒(TBE)、西尼罗病毒(WN)、圣路易斯脑炎病毒(SLE)和约70种其他引起疾病的病毒。黄病毒是包含单一正链RNA基因组的小的包膜病毒。
10种基因产物由单个开放阅读框编码并翻译为以如下顺序组织的多聚蛋白：衣壳(C)，“膜前体”(preMembrane，prM，其在病毒粒子从细胞释放前才被加工成“膜”(M))，“包膜”(E)，接着是非结构(NS)蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5 (在Chambers, T. J. 等人, Annual Rev Microbiol (1990) 44:649-688; Henchal, E. A.和Putnak, J. R., Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396中综述)。然后通过由宿主以及病毒编码的蛋白酶介导的精确的加工事件产生各个黄病毒蛋白。

[0005] 黄病毒的包膜来源于宿主细胞膜并包含病毒编码的膜锚定的膜(M)和包膜(E)糖蛋白。E糖蛋白是最大的病毒结构蛋白并包含负责细胞表面附着和内体内融合(intra-endosomal fusion)活性的功能结构域。其也是宿主免疫系统的主要目标，诱导病毒中和抗体的产生，这与保护性免疫相关。

[0006] 登革病毒通过伊蚊属的蚊子、主要是埃及伊蚊(A. aegypti)和白纹伊蚊(A. albopictus)传播给人。登革病毒的感染导致各种临床表现，范围为从不明显的或轻度的发热疾病，通过由高烧、头痛、关节和肌肉疼痛、皮疹、淋巴结病和白细胞减少表征的典型登革热(DF)( Gibbons, R. V.和D. W. Vaughn, British Medical Journal (2002)324:1563-1566)，到儿童中更常见的更严重的感染形式，登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)，标志为血管通透性和/或严重出血表现，范围为从存在瘀点和瘀斑至自发性严重出血和如果不治疗可能导致死亡的深度休克。在没有诊断和及时医疗干预的情况下，DHF/DSS的突然发病和快速进展可以是致命的。

[0007] 登革病毒在全球发病率和死亡率的方面是节肢动物传播病毒的最重要组，每年发生的估计1亿例登革热包括250,000至500,000例的DHF/DSS(Gubler, D. J., Clin. Microbiol. Rev. (1998) 11:480-496; 同上的Gibbons)。随着全球人口的增加，人口、特别是整个热带地区的人口的城市化和持续蚊子控制措施的缺乏，登革的蚊子载体已经将它们的分布遍及热带、亚热带及一些温带地区，为超过一半世界人口带来了登革感染的风险。现代飞机旅行和人类迁徙已经促进了登革血清型的全球分布，使得多种登革血清型现在在许多地区是流行的。在过去20或更多年，存在登革流行频率和DHF/DSS发病率的增加。例如，在东南亚，DHF/DSS是儿童中住院和死亡的导致因素(Gubler, 同上；Gibbons和Vaughn，同上)。

[0008] 迄今为止，黄病毒疫苗的开发已经取得了混合的成功(mixed success)。为了产生保护免于由黄病毒引起的疾病的候选疫苗，已经实施了4种基本方法：活减毒、灭活的全病毒、重组亚单位蛋白和基于DNA的疫苗。黄热病病毒(Yellow Fever virus)的活减毒疫苗已存在了数十年。灭活的全病毒疫苗的应用已被证明用于TBE和JE病毒。

[0009] 尽管上文强调的YF、JE、和TBE疫苗取得了成功，但是使用活减毒病毒和灭活的病毒方法来开发登革病毒的疫苗已经遇到了显著挑战。存在四种血清型的登革病毒(DEN1、DEN2、DEN3、和DEN4)和发现每种血清型的毒株传播遍及整个世界的登革流行地区。自然感染为感染性血清型但非其他登革血清型赋予了持久的免疫力。当登革病毒的一种血清型感染随后为另一种血清型的第二次感染时，在第二次登革感染后最经常发生更严重形式的疾病(DHF/DSS)。已经假设DHF和DSS与第二次登革感染的更频繁关联是由于由一种病毒类型感染诱导的非中和抗体增强第二种登革病毒类型的感染性(抗体依赖性增强 - ADE)。这个概念对于疫苗开发具有重要的意义，因为有效的登革疫苗必须同时诱导针对所有四种登革血清型的平衡的特异性中和抗体和特异性记忆细胞(Halstead和Deen, 2002)。这已被证明是登革疫苗开发中的主要问题。

[0010] 迄今为止，临床测试的大多数疫苗是活减毒疫苗，所述活减毒疫苗提出了对于给予健康受试者的所有活病毒疫苗常见的安全性担忧。病毒减毒不足可导致病毒相关的副作用，而减毒过度可削弱疫苗效力。此外，可能发生回复为野生型或突变为提高的毒性(或降低的效力)。此外，即使适当地减毒，活病毒疫苗对特定患者群体，例如免疫缺陷或免疫抑制患者，以及正常群体的特定部分，例如怀孕妇女、婴儿或老年个体是禁忌的。

[0011] 用于登革的活减毒病毒方法的进一步问题包括与在四价疫苗中组合四种独立复制病毒相关的挑战。干扰的问题一直困扰着迄今为止测试的所有四价制剂，并且已经导致不平衡的四价免疫力和以延长时间间隔(例如0、6、12个月)施用的多剂量的要求。这不是很理想，可能给已经部分免疫并且暴露于野生型病毒的个体带来安全性问题，因为这些个体可能处于疾病(例如登革出血热)恶化的更高风险中。

[0012] Ivy等人(美国专利6,432,411)公开了包含DEN1-4 80% E(等同于DEN-2包膜多肽的氨基酸1-395)蛋白的四价亚单位疫苗。同上的Ivy等人也报道了包含DEN 1-4 80% E和ISCOMATRIX®佐剂的组合物。然而，仍然存在对于可以诱导针对所有四种登革血清型的平衡免疫应答的稳定的四价疫苗的需要。

[0013] 发明概述本发明提供了用于人患者群体中使用的疫苗和免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗与登革病毒感染相关的疾病。该疫苗通过组合源自一种或多种登革病毒包膜蛋白的一种或多种重组亚单位蛋白和佐剂而形成。设计本发明的登革病毒疫苗以诱导针对DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的平衡的、保护性四价免疫应答，同时提供可接受的安全性概况。

[0014] 独特的疫苗制剂取决于新的正确折叠的重组包膜亚单位蛋白(“登革80E”或“DEN-80E”或“DEN1-80E”或“DEN2-80E”或“DEN3-80E”或“DEN4-80E”或“DEN4 80EZip”)，所述包膜亚单位蛋白与佐剂组合以产生疫苗制剂。特别设计制剂的不同比例的单体和/或二聚体形式的重组包膜蛋白的独特组合以解决对于平衡的四价应答的需要。设计该疫苗以诱导相关的平衡的四价保护性免疫应答，如在健康人志愿者中的病毒中和抗体，并保持对于施用于健康和免疫功能低下的个体的可接受的安全性概括。本文所述的疫苗组合物的额外优势在于，它们不含有显著量的膜前体(prM)蛋白，可能使最近已经与抗prM抗体联系的ADE的风险最小化(Dejnirattisai等人, Science 328:745-748 (2010); Rodenhuis-Zybert等人, PLos Pathogens 6:1-9 (2010))。80E蛋白与prM共翻译地表达，但是多蛋白当运输至分泌途径的prM-E连接处时被宿主细胞信号肽酶切割，将80E成分释放到培养基中用于纯化(Clements等人, 2010 Vaccine 28:2705)。

[0015] 本发明的其他方面包括在可接受的载体中的治疗有效量的疫苗作为针对由登革病毒感染引起的疾病的免疫预防剂的用途和在可接受的载体中的治疗有效量的疫苗作为药物组合物的用途。

[0016] 如说明书通篇和附加权利要求书中所使用的，单数形式 “一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有清楚指出的。

[0017] 如说明书通篇和附加权利要求书中所使用的，下列定义和缩写应用于：术语“治疗”是指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的个体包括已经具有登革感染的那些，无论是否表现任何临床症状，以及处于被登革感染的风险中的那些，即登革感染和/或其临床表现待防止的那些受试者/患者。用本发明的登革疫苗治疗患者包括下列中的一种或多种：在患者中诱导/增加针对登革的免疫应答，在已经被登革感染的患者中预防、改善、消除或降低登革的临床表现的可能性，防止或降低发生登革热、DHF、或DSS和/或与登革感染相关的其他疾病或并发症的可能性，降低登革感染和/或与登革相关的其他疾病或并发症的临床症状的严重性或持续时间，和防止或降低登革感染的可能性。

[0018] 术语“治疗有效量”是指将足够的疫苗组合物引入患者以产生期望效果，包括，但不限于：在患者中诱导/增加针对登革的免疫应答，防止或降低登革感染或登革反复感染的可能性，在已经感染登革的患者中防止、改善或消除登革感染的临床表现，防止登革热、DHF和/或DSS，降低与登革相关的疾病的严重性或持续时间。本领域技术人员认识到该水平可以变化。

[0019] 术语“免疫应答”是指细胞介导的 (T-细胞)免疫应答和/或抗体(B细胞)应答。

[0020] 术语“患者”是指待接受本文所述的登革疫苗/免疫原性组合物的任何人，包括免疫活性和免疫功能低下的个体。如本文所定义的，“患者”包括已经感染登革的那些，无论是通过自然感染或接种疫苗，或者可能随后暴露的那些。

[0021] “MAA”是指Merck铝佐剂。MAA是无定形羟基磷酸铝硫酸盐佐剂。术语“MAA”在本文中可以与术语“无定形羟基磷酸铝硫酸盐”或“AAHS”互换使用。

[0022] “ISCOM样佐剂”是包含免疫刺激复合物(ISCOM)(其由皂素、胆固醇和磷脂构成，它们一起形成特征性的笼状颗粒)的佐剂，其具有独特的球形、笼状结构，其有助于其功能(对于综述，参见Barr和Mitchell, Immunology and Cell Biology 74:8-25 (1996))。该术语既包括ISCOM佐剂(其用抗原产生并且在ISCOM颗粒内包含抗原)，还包括ISCOM基质佐剂(其是没有用抗原产生的中空的ISCOM型佐剂)。在本文提供的组合物和方法的优选实施方案中，ISCOM型佐剂是ISCOM基质颗粒佐剂，如ISCOMATRIX®，其在没有抗原的情况下制造(ISCOM®和ISCOMATRIX®是CSL Limited, Parkville, Australia的注册商标)。

[0023] 附图简述图1显示纯化的cGMP级DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80EZip (每种样品
1 μg)的银染色的十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶(图A)和Western印迹(图B)。所有样品在10%凝胶上在非还原条件下电泳。使用识别所有登革病毒的小鼠单克隆抗体(4G2)显色Western印迹。在凝胶和印迹的左侧指示分子量标记的大小(以kD为单位)。

[0024] 图2显示四价登革恒河猴攻击研究的结果：如实施例6中描述，通过在Vero细胞上猴血清的直接蚀斑测定的攻击后定量病毒血症评价。

[0025] 发明详述如上所述，已经做出了开发用于人使用的登革疫苗的数次尝试，但是迄今为止，这些尝试一直受安全性和/或效力问题的困扰。为此，本发明提供了可以用于人受试者中预防和/或治疗登革病毒感染的组合物，和/或其临床表现。

[0026] 许多以前的努力已经针对开发既安全又有足够免疫原性(例如，能够在免疫的个体中诱导平衡的四价应答) 的人登革疫苗。尽管进行了这些努力，迄今仍未研制出完全满足这些条件的用于人使用的登革病毒疫苗。因此，本发明待解决的技术问题是发现满足2种主要条件的登革病毒疫苗；(1)在接种疫苗的个体(人受试者)中诱导平衡、四价保护性免疫应答，和(2)在人受试者中，包括婴儿、老年和免疫功能低下的人受试者中维持优越的安全性概况的能力。这代表了在登革病毒疫苗开发中的重大挑战，且迄今为止没有疫苗制剂已显示了充分解决该技术问题的所有方面。随着登革病毒感染流行性的增加，对解决方案存在高度、尚未满足且日益增长的需求。

[0027] 所有黄病毒包膜蛋白共享显著的同源性。针对包含在包膜蛋白中的所有三个外部结构域的表位的抗体能够中和病毒，即在体外抑制易感细胞的病毒感染。通常公认高滴度的病毒中和抗体是体内保护免于黄病毒感染和预防黄病毒诱导的疾病的最佳体外相关指标(correlate)(Markoff Vaccine (2000) 18:26-32; Ben-Nathan 等人, J. Inf. Diseases ( 2003) 188:5-12; Kreil 等人, J. Virol. (1998) 72:3076-3081; Beasley 等人, Vaccine (2004) 22:3722-26)。因此，诱导高滴度登革病毒中和应答的疫苗将类似地保护疫苗接种者免于由登革病毒诱导的疾病。

[0028] DHF和DSS与第二次登革感染的更频繁关联被假设是由于存在由第一次感染导致的交叉反应的非中和抗体，其通过促进具有Fc受体的细胞如单核细胞/巨噬细胞通过Fc受体介导的途径的感染而上调第二次感染血清型的复制(ADE; Halstead 1988; Halstead1989)。可替代地，更近的假说认为，通过“原始抗原痕迹(original antigenic sin)”的现象，初始免疫应答主要针对第一种感染血清型，这允许第二种感染血清型在可以起始更特异性的免疫应答之前复制并获得优势(Mongkolsapaya等人，2003)。无论机制，这种增强的第二次感染的现象对于疫苗开发具有重要的启示，因为有效的登革疫苗必须同时诱导针对所有四种登革血清型的平衡的特异性中和抗体和特异性记忆细胞(Halstead和Deen,
2002)。这已经被证明是登革疫苗开发中的主要问题。

[0029] 为了显示这个问题已经如何引起登革疫苗开发中的问题，综述迄今进行的努力是有用的。已经在开发候选的活减毒登革疫苗株中花费了大量努力；然而，许多测试的疫苗株已证实不令人满意并且病毒血清型之间的干扰已经证明是非常具有挑战性的。使用经典减毒病毒的两种开发计划进展到2期临床试验，但是由于干扰和/或生产问题而在2期停止或暂停。

[0030] 为了开发黄病毒疫苗，作为传统活减毒法的可选方案，已经使用了重组嵌合法。该方法使用已知的减毒株作为基础并用来自相关目的病毒的合适基因(对于黄病毒为prM和E)取代基础病毒的等同基因。已用于WN和登革疫苗开发的一种方法是使用基于减毒的DEN-4株的类型内嵌合体(intertypic chimeric)(Bray, M. 等人, J. Virol. (1996)70:4162-4166; Chen, W., 等人, J. Virol. (1995) 69:5186-5190; Bray, M.和Lai, C.-J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346; Lai, C. J. 等人, Clin. Diagn. Virol. (1998) 10:173-179)。另一种方法是使用YF 17D减毒株作为基础来开发日本脑炎病毒(JE病毒)、登革病毒和WN 病毒的重组嵌合疫苗(Guy, B. 等人， Vaccine (2011), doi: 10.1016/j.vaccine.2011.06.094; Lai, C.J.和Monath T.P. Adv Virus Res (2003) 61:469-509; Monath 等人 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006)
103:6694)。尽管使用活减毒嵌合法相比传统活减毒法有优势，但是嵌合法仍受到开发合适的减毒株所面临的困难的困扰，以及获得针对登革病毒的平衡的四价应答所面临的困难的困扰。

[0031] 目前存在使用全灭活病毒法生产的用于JE和TBE的可商业获得的疫苗。如同活减毒病毒法，灭活病毒法在某些黄病毒中的应用不能保证在其他黄病毒中成功。例如，开发灭活的DEN疫苗的努力遇到了一定困难(limited success)。主要这些方法受限于从细胞培养系统中不能获得足够的病毒产量。从昆虫细胞例如C6/36细胞中得到的病毒产量一般4 5
在10 至10 pfu/ml的范围，远低于产生低成本的灭活病毒疫苗所需的水平。从哺乳动物细胞(包括LLC-MK2和Vero细胞)中得到的产量更高，但从单一的Vero细胞系得到的约
6
10 pfu/ml的最高产量仍低于获得真正的低成本疫苗产品所需的水平。低产量可能进一步影响诱导平衡的四价应答的能力。

[0032] 为了开发用于DEN、JE、TBE 和WN的非复制型黄病毒疫苗，还已评估了裸DNA方法的应用(Porter 等人，1998; Raviprakash 等人，2000; Konishi 等人, 1998; Chang 等人, 2000; Schmaljohn 等人, 1997; Aberle 等人, 1999; Davis 等人, 2001)。DNA方法提供易于生产、使用确定的序列、由于体内抗原的表达引发体液和细胞免疫二者的潜力的优势。尽管具有这些优势，诱导持续和强烈的免疫应答的能力始终是此方法的主要障碍。尽管在动物模型中诱导相关保护性免疫应答中已经有一些成功(Davis等人，2001)，但是在人中诱导这些应答的能力还没有确定。另外，DNA疫苗面临额外的法规审查，因为担忧质粒序列整合进宿主基因组和产生针对双链DNA的自身抗体的潜能。

[0033] 用于黄病毒疫苗开发的重组亚单位蛋白质的使用是非复制型病毒方法的另一个实例。此方法提供产生非常确定的产品和引发特异性免疫应答的潜能的优势。尽管存在产生相关和强烈的免疫应答的潜能，也存在与使用重组亚单位相关的挑战。这是因为在引发期望的免疫应答中蛋白质的质量(类似天然的结构)和对佐剂的需要二者。重组亚单位疫苗具有历史悠久的安全性和保护效力，最有效的证据是重组亚单位乙肝疫苗(例如® ®RECOMBIVAX HB (Merck Sharp & Dohme Corp., Whitehouse Station, NJ)和ENGERIX B (GlaxoSmithKline Biologicals SA Corp., Belgium)，和最近的人乳头瘤病毒疫苗(例如® ®
GARDASIL (Merck Sharp & Dohme Corp.)和CERVARIX (GlaxoSmithKline Biologicals SA Corp.)。在生产过程中的任意时间不存在复制性病毒的事实有助于保证在预防背景下对健康或免疫功能低下的个体施用亚单位疫苗相关的极其有限的风险。此外，已显示乙肝和人乳头瘤病毒疫苗是高度免疫原性和有效的。

[0034] 重组黄病毒蛋白质的表达已集中在结构蛋白C、prM和E以及非结构蛋白NS1上。E蛋白是大多数研究的对象，因为此蛋白质暴露在病毒的表面且涉及病毒的重要生物学方面，并且在受感染的宿主中是中和抗体的目标(Chambers, 同上; Mason, P. W., J. Gen Virol (1989) 70:2037-2048)。此外，针对纯化的黄病毒E蛋白的单克隆抗体在体外是中和性的并且已显示有些在体内赋予被动保护(Henchal, E.A. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (1985) 34:162-169; Heinz, F. X. 等人, Virology (1983)130:485-501; Kimura-Kiroda, J.和Yasui, K., J. Immunol. (1988) 141:3606-3610; Trirawatanapong, T. 等人, Gene (1992) 116:139-150)。

[0035] 朝着生产用于疫苗中使用的重组黄病毒蛋白的目标，已经采用了各种表达系统，如大肠杆菌、酵母和杆状病毒。这些尝试受到低产量、黄病毒蛋白质的不正确加工和中等至较差的免疫原性的困扰 (Eckels和Putnak, 2003)。需要维持E蛋白的类似天然结构以使重组蛋白作为有效的免疫原。产生具有天然类似结构的重组E蛋白的能力高度依赖于使用的表达系统。美国专利6,165,477公开了在酵母细胞中表达DEN E蛋白质亚单位的方法。在酵母细胞中表达的E亚单位证明了相比细菌系统的改进的结构，但仍然面临有关过度糖基化和产量的问题。

[0036] 在新近的研究中，已经确定使用稳定转化的昆虫细胞表达E蛋白的截短形式得到维持类似天然结构的产物，如通过X射线结晶学所测定的(Modis 等人, 2003; Modis 等人, 2005; 和 Zhang 等人, 2004)。使用稳定转化的昆虫细胞系统已得到截短的重组黄病毒E蛋白如DEN 血清型1-4、 JE、TBE 和WN的E蛋白的成功表达。美国专利6,136,561公开了在稳定转化的昆虫细胞中表达DEN、JE、TBE和YF E亚单位蛋白的方法。Ivy等人(美国专利6,432,411)公开了当与包含皂素的类似ISCOM结构组合时，在稳定转化的昆虫细胞中表达的黄病毒E亚单位蛋白(等同于DEN-2包膜多肽的氨基酸1-395)作为候选疫苗的效用。Ivy等人进一步报道了包含来自所有四种DEN类型(DEN 1-4)的80％E蛋白的四价亚单位疫苗，以及包含DEN 1-4 80％E和ISCOMATRIX®佐剂的组合物。进行小规模初步研究，其在猴中分析了这种四价疫苗的免疫原性和保护效力(Clements等人, Vaccine28:2705-15 (2010); Coller等人.Vaccine 29:7267-75 (2011))。该疫苗被称为诱导针对多于一种登革类型的中和抗体和保护性免疫。美国专利6,749,857公开了截短的登革包膜蛋白如本申请中描述的DEN4-80EZip的二聚体形式的表达。美国专利6,416,763描述了在基于重组E的疫苗制剂中包括稳定转化的昆虫细胞系中产生的非结构蛋白1(NS1)的益处。这些专利证明了在动物模型中当与包含皂素的iscom样结构组合时，从稳定转化的昆虫细胞表达的黄病毒亚单位的效用。然而，这些专利没有解决或预测仅基于与已经证明在人受试者中的免疫原性的佐剂配制的E的疫苗制剂。许多疫苗候选已经证明在动物模型中潜在的效力，但是没有进行向人用途的成功转化。

[0037] 通常，使用非复制型病毒疫苗法例如灭活病毒、重组亚单位蛋白和DNA相比活减毒病毒疫苗法具有若干优势。这些优势主要涉及安全性，因为没有对受试者递送活病毒。其他优势包括，相比活减毒病毒，加快给药时间安排的能力以及通过调整剂量和佐剂化调节和平衡免疫应答的能力。

[0038] 在开发用于人的黄病毒疫苗中，基于在动物模型中的临床前数据难以预测候选疫苗在人受试者中的安全性和免疫原性。已证明许多已进入人临床试验的活减毒病毒候选疫苗面临挑战。最令人瞩目的完全失败的实例是克隆的登革病毒3型分离株展示的安全性概况，其在非人灵长类中展示了非常吸引人的安全性概况，但其在香港的疫苗接受者中诱导登革热(Sanchez 等人, FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2006) 24:4914-26)。通过使用非复制型病毒疫苗可减少此挑战，其不需要与复制型病毒疫苗相同水平的病毒/宿主相互作用以获得疫苗效力。然而，存在大量在临床前模型中显示了良好的安全性和保护效力，而在人中不能作为安全和有效的疫苗起作用的非复制型病毒候选疫苗的实例(例如，灭活的RSV疫苗；Murphy等人，J. Clin. Microbiol. (1986) 24: 197-202)。因此，可能存在与开发用于黄病毒的安全和有效的疫苗相关的多重挑战且开发经常需要数年的试验和错误。此外，基于动物模型的临床前研究可能不能预测疫苗在人受试者中的表现；和因此，人数据对证明候选疫苗的潜力是关键的。

[0039] 尽管在临床前研究和开发中的多个阶段中有若干研究中的登革疫苗，但仅有6种候选疫苗进入人临床试验。已在临床研究中已经测试的6种疫苗是：(1)活的、减毒的登革血清型4嵌合体(例如，Durbin 等人. 2006, Human Vaccines 2:167; Blaney 等人，2005, J. Virol. 79:5516)；(2)活的、减毒的黄热-登革嵌合体 (Chimerivax; 例如 Morrison 等人, 2010, J. Inf. Dis. 201:370)； (3)由Walter Reed Army Institute of Research开发的经典减毒病毒疫苗 (例如Sun等人, 2009, Human Vaccines 5:33); (4) 活减毒的登革血清型2嵌合体(例如Huang等人, 2003, J. Virol. 77:11436); (5) 表达prM-E的基于DNA的疫苗(Raviprakash等人, 2006, Virology 353:166);和(6)由Mahidol University开发的经典减毒病毒疫苗 (例如Bhamarapravati等人, 1987)。然而，候选疫苗中的每一种都具有相关的内在困难和潜在的缺点。

[0040] 用于登革的活减毒病毒的进一步问题包括与在四价疫苗中组合四种独立复制病毒相关的挑战。干扰的问题已经困扰着迄今测试的所有四价制剂，并且已经导致不平衡的四价免疫和以延长的时间间隔(例如0、6、12个月)施用的3个剂量的要求。这不是很理想，并且对于已经部分免疫并且暴露于野生型病毒的个体可能带来安全性问题，因为这些个体可能处于疾病(例如登革出血热)恶化的更高风险中。

[0041] 在临床试验中已检测的最终登革疫苗是DNA疫苗。目前裸DNA疫苗未证实用于任何感染性疾病，且由于诱导针对DNA的自身免疫反应而引起的潜在免疫病理学问题长期未得到解决。测试的疫苗制剂没有引发或仅仅引发低病毒中和抗体，提示潜在效力的缺乏。

[0042] 本文所述的本发明的一个方面提供了亚单位登革病毒包膜糖蛋白(例如，DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E、或DEN4-80EZip)，所述包膜糖蛋白使用重组表达系统产生和分泌，并且在疫苗制剂中与佐剂组合(例如，HBV-001 D1)。本发明公开的疫苗在人志愿者中有效诱导针对同源登革病毒的病毒中和抗体应答并且具有对于健康和处于危险的人受试者的可接受的安全性概况。

[0043] 为此，本发明的一个方面提供了免疫原性组合物，其包含有效量的纯化的血清型DEN-1、DEN-2、DEN3、和DEN-4的登革病毒包膜(“E”)蛋白、药学上可接受的赋形剂、和有效量的佐剂；其中所述E蛋白各自构成野生型E的长度的从其N-末端的氨基酸残基1开始的约80％，使得所述E蛋白当在宿主细胞中重组表达时被分泌到生长培养基中；其中DEN-4 E蛋白是二聚体的(“DEN4-80EZip”)；其中所述组合物在人受试者中诱导中和抗体的产生。在本发明的该方面的优选实施方案中，上述组合物中的E蛋白在昆虫宿主细胞中重组产生和表达。在进一步优选的实施方案中，E蛋白如下所述在黑腹果蝇Schneider 2 (S2)宿主细胞中重组产生和表达。

[0044] 本发明的重组亚单位登革病毒E蛋白是通过使用果蝇Schneider 2 (S2)细胞的细胞培养表达系统产生的。此系统已被证实，产生维持类似天然结构的登革重组包膜蛋白(Cuzzubbo 等人, Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2001) 8:1150-55; Modis 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100:6986-91; Modis 等人, Nature (2004) 427:313-9; Zhang 等人, Structure (2004)12(9):1607-18)。也已经显示该表达系统表达来自其他黄病毒如西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、丙型肝炎病毒和蜱传脑炎病毒的其他重组包膜蛋白。重组包膜蛋白典型地在C末端截短，剩下80%的天然包膜蛋白(“80E”)。因此80E被定义为E蛋白的从其N-端的氨基酸1开始的约前80%的连续氨基酸。

[0045] 本发明中使用的截短的80E蛋白的范围缺失了蛋白的膜锚定部分(E的羧基末端的约最后10％)，换言之，E的从其N-端的氨基酸1开始的最多达前90%的连续氨基酸，因此允许其被分泌至细胞外培养基，便于回收。截短进一步缺失了连接80E部分和膜锚定部分的E蛋白的“茎”部分；茎部分不包含重要的抗原表位和因此不包括在优选的抗原DEN1-80E、 DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E或DEN4-80EZip中。可克隆和分泌超过90%，但少于100%的E蛋白，即该蛋白可为90%+的长度，羧基端截短的，并且可以包括部分跨膜结构域，只要截短的E蛋白可分泌。“可分泌”指能够被分泌，和通常从表达系统中的转化细胞分泌。因此，本领域技术人员将意识到，可用于本发明的组合物和方法中的登革E蛋白可以与本文例举的80％不同，只要该蛋白是可分泌的。在本发明的每个方面的优选实施方案中，DEN E蛋白为约80％的长度，从包膜蛋白的N-末端氨基酸开始并且在第395至第401氨基酸的范围内的氨基酸结束，例如，登革病毒2型的从氨基酸1至氨基酸395的氨基酸结束。在本发明的每个方面的可替代的实施方案中，登革E蛋白可以是E的其N-末端的氨基酸1开始的连续氨基酸的约75％、约85％、约90％、约95％、或约98％。在本发明的方面的示例性实施方案中，DEN E蛋白是E蛋白的其N-末端的氨基酸1开始的连续氨基酸的约80％；
如SEQ ID NO:6中所述的DEN1-80E，如SEQ ID NO:7中所述的DEN2-80E，如SEQ ID NO:8中所述的DEN3-80E和如SEQ ID NO:9中所述的DEN4-80E。

[0046] 分泌的E蛋白可以进一步含有促进二聚化的结构域，如在DEN4-80EZip蛋白中，使得进一步增强重组蛋白的免疫原性。示例性DEN4-80EZip蛋白包含如SEQ ID NO:10中所述的氨基酸序列。通过组合来自四种登革病毒的重组E蛋白的二聚体和单体形式，可以调节免疫应答，使得平衡的四价应答得到诱导。当重组登革病毒80E亚单位蛋白正确配制用于人使用时，它们能够在人受试者中诱导强有力的病毒中和抗体。因此，本发明为关键的技术问题—产生证明在人受试者中具有高水平的安全性和平衡四价免疫原性的登革病毒疫苗—提供了新的解决方案。

[0047]佐剂
本发明的疫苗制剂/免疫原性组合物包括至少一种适于人用的佐剂。在优选的实施方案中，基于皂素(“ISCOM-样”) 的佐剂 (例如，ISCOMATRIX® 佐剂)和/或基于铝的佐剂(统称“铝”或“基于铝的佐剂”)配制登革80E重组亚单位蛋白。

[0048] 已经长期显示铝主要通过刺激TH2应答而刺激针对共同施用的抗原的免疫应答，基于铝的佐剂是在美国第一种注册用于人使用的佐剂。除如本文所述的登革80E抗原之外，本发明这方面的组合物被吸附到铝佐剂例如氢氧化铝、磷酸铝或其混合物。优选的是，本文提供的组合物的铝佐剂不是铝沉淀物的形式。铝沉淀的疫苗可以增加针对目标抗原的免疫应答，但是已经显示是高度异质的制剂，并且已经具有不一致的结果(参见Lindblad E.B.Immunology and Cell Biology 82:497-505 (2004))。相比之下，铝吸附的疫苗可以以标准化的方式进行，这是用于施用于人的疫苗制剂的本质特征。此外，认为将期望的抗原物理吸附到铝佐剂上在佐剂功能中具有重要的作用，可能部分通过允许从注射部位更慢的清除，或通过允许抗原呈递细胞更有效地摄取抗原。

[0049] 认为基于铝的佐剂至少部分通过储存机制起作用，且具有类似天然结构的重组登革80E抗原和铝的佐剂作用的组合足以在接种疫苗的个体(包括免疫缺陷群体成员)中诱导有效的免疫应答。

[0050] 本发明的铝佐剂可以是氢氧化铝(Al(OH)3)、磷酸铝(AlPO4)、羟基磷酸铝、无定形羟基磷酸铝硫酸盐(AAHS)或所谓的“明矾”(KAl(SO4)·12H2O)的形式(参见Klein等人，Analysis of aluminum hydroxyphosphate vaccine adjuvants by (27)Al MAS NMR., J. Pharm. Sci. 89(3):311-21 (2000))。在本文提供的本发明的示例性实施方案中，铝佐剂是氢氧化铝。

[0051] 在本发明的一些实施方案中，铝佐剂是AAHS的形式(本文可互换地被称为Merck铝佐剂(MAA))。MAA在中性pH时不携带电荷，而AlOH在中性pH时携带净正电荷并且AlPO4通常携带净负电荷。MAA具有比AlOH更高的结合一些抗原的能力，可能是由于铝佐剂的净电荷影响结合抗原的能力。在本文所述的本发明的还有其他示例性实施方案中，铝佐剂是Alhydrogel。

[0052] 本领域技术人员将能够确定最佳剂量的铝佐剂，所述最佳剂量的铝佐剂既安全又有效增加针对疫苗组合物的目标登革80E抗原的免疫应答。对于铝的安全性概况以及FDA批准的疫苗中包括的铝的量的讨论，参见Baylor等人, Vaccine 20:S18-S23 (2002)。通常，铝佐剂的有效和安全剂量从200至1200 g/mL浓度变化。在本发明的特定实施方案中，疫苗包含1.0至3.5 mg/mL的铝佐剂(最高达1.25 mg元素铝)。在本发明的制剂和组合物的可替代的实施方案中，每剂量疫苗具有约100、150、200、250、300、350、400、450或500 µg铝佐剂。

[0053] 具有基于铝的佐剂的制剂包含混合物，由此允许登革80E抗原结合铝佐剂，例如，Alhydrogel，使得≥ 75%的抗原结合氢氧化铝。在cGMP下配制和填充DEN1-80E + Alhydrogel疫苗(HBV-001 D1)以支持临床开发描述于实施例3中。

[0054] 如上所述，本发明的一个方面提供了包含与佐剂组合的登革80E抗原的疫苗和组合物。优选的佐剂是ISCOM佐剂。在本文提供的制剂和方法中，ISCOM佐剂包含皂素、胆固醇和磷脂，并且形成免疫刺激复合物或ISCOM。在超过80年前首先记载了皂素(通常从Quillaia saponaria 树的树皮分离)的强有力的佐剂活性(对于综述，参见Barr和Mitchell, Immunology and Cell Biology 74:8-25 (1996);以及Skene和Sutton, Methods 40:53-59 (2006))。与铝佐剂相比，ISCOM型佐剂或ISCOM能够激发针对共同施用的抗原的更广泛的免疫应答，包括T细胞和抗体应答。然而，发现毒性和溶血活性的可能性，这在当时限制了皂素用于人或动物使用的前景。

[0055] 从那时起，人们发现，当与胆固醇和磷脂组合时，皂素可以形成具有由20或更多的亚单位组成的笼状结构的特征性颗粒。这种独特的结构有助于ISCOM的佐剂活性。此外，显示将皂素与胆固醇和磷脂一起并入ISCOM消除了皂素的溶血活性。还显示，与游离皂素相比，当ISCOM被用作佐剂时，诱导免疫应答需要更少的佐剂(参见同上的Skene和Sutton)。出于这些原因，已经深入研究ISCOM作为潜在的疫苗佐剂。

[0056] 为此，本发明涉及包含登革80E抗原、ISCOM佐剂和药 学上可接受的载体的药物组合物，所述ISCOM佐剂包含皂素、胆固醇和磷脂，其中所述登革80E抗原构成野生型E的长度的从其N-末端的氨基酸残基1开始的约80％，使得当在宿主细胞中重组表达时所述E蛋白分泌进生长培养基中。上述组合物可以进一步包含铝盐佐剂。

[0057] 在本发明的该方面的优选实施方案中，组合物中包括的DEN1、DEN2和DEN3 80E抗原是单体的，并且DEN4 80E抗原是二聚体的。本文(参见实施例6)已经显示，包含DEN 1、DEN2和DEN3 80E蛋白亚单位的单体形式和DEN4 (DEN4-80EZip)的二聚体形式的四价组合物可以在恒河猴中诱导平衡的四价免疫应答并且可以提供免于病毒攻击的保护。上述组合物可以进一步包含铝盐佐剂。

[0058] 在本发明的该方面的可替代的实施方案中，组合物中的DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80E蛋白是单体的。在这样的实施方案中，DEN4成分存在的量是DEN1、DEN2、和DEN3蛋白的个别量的约1.5至约3倍，优选DEN1、DEN2、和DEN3成分(蛋白)的量的约2倍。

[0059] 在本发明的该方面的示例性实施方案中，ISCOM佐剂是ISCOMATRIX®佐剂，一种基于皂素的佐剂。具有ISCOMATRIX®佐剂的制剂包含混合物，其中80E抗原与佐剂一起递送。

[0060] 在本发明的可替代的实施方案中，疫苗组合物与基于铝的佐剂和ISCOM或基于皂素的佐剂一起配制。

[0061] 登革病毒包膜蛋白亚单位本文(参见实施例6)已经显示，包含DEN1-80E、DEN2-80E、和DEN3-80E蛋白亚单位的单体形式和DEN4 (DEN4-80EZip)的二聚体形式的四价组合物可以在恒河猴中诱导平衡的四价免疫应答并且可以提供免于病毒攻击的保护。相应地，在本发明的该方面的一些优选实施方案中，组合物中包括的DEN1、DEN2和DEN3 80E抗原是单体的，并且DEN4 80E抗原是二聚体的。下文描述了登革80E蛋白二聚体的形成。

[0062] 本文(参见实施例7)也已经显示的是，针对所有四种登革类型的高的平衡的免疫应答可以通过调整DEN4-80E成分的抗原含量使得DEN4抗原成分(DEN4-80E或DEN4-80EZip)的量约为组合物中存在的DEN1-80E、DEN2-80E、或DEN3-80E 抗原的量的两倍而实现。相应地，本发明提供了包含有效量的纯化的血清型DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80E的登革病毒包膜(“E”)蛋白、药学上可接受的赋形剂和有效量的佐剂的免疫原性组合物；其中所述E蛋白各自构成野生型E的长度的从其N末端氨基酸残基1开始的约80％，使得所述E蛋白当在宿主细胞中重组表达时被分泌到生长培养基中；并且其中所述组合物在人受试者中诱导中和抗体的产生；其中DEN4成分的抗原含量是DENl、DEN2、或DEN3成分的个别抗原含量的约1.5至约3倍。在本发明的该方面的优选实施方案中，组合物中的DEN1:DEN2:DEN3:DEN4抗原的比例为约1:1:1:2。

[0063] 在本发明的该方面的一些实施方案中，DEN4成分是DEN4-80E。因此，组合物包含DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80E的单体。在本发明的该方面的可替代的实施方案中，DEN4成分是DEN4-80EZip。在这样的可替代的实施方案中，组合物包含DEN1-80E、DEN2-80E、和DEN3-80E的单体和DEN4-80EZip的二聚体。

[0064] 在本发明的优选实施方案中，本文所述的登革病毒疫苗制剂的一种或多种重组蛋白成分(DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E、和/或DEN4-80EZip)由真核细胞培养表达系统，特别是黑腹果蝇S2细胞系统产生(Johansen, H.等人, Genes Dev.(1989)3:882-889; Ivey-Hoyle, M., Curr. Opin. Biotechnol. (1991) 2:704-707; Culp, J.S., 等人, Biotechnology (NY) (1991) 9:173-177)。这种表达方法成功地产生了来自黄病毒的截短的重组包膜蛋白，如登革血清型1-4、JE、TBE和WN。这些蛋白在C-末端处被截短，留下约80％的天然包膜蛋白(80E)。该截短缺失了蛋白的膜锚定，因此允许它被分泌到细胞外培养基，促进回收；该截短也缺失了茎部分，所述茎部分具有较小的免疫原性作用。此外，已经显示表达的蛋白被正确地糖基化并且维持天然构象，正如与构象敏感的单克隆抗体4G2的反应性所确定的。

[0065] 如前所述(Ivy等人, 美国专利号6,136,561; Ivy等人, 美国专利号6,165,477; McDonell等人, 美国专利号6,416,763; Ivy等人, 美国专利号6,432,411;和Peters等人, 美国专利号6,749,857)，并且如本文所使用的，DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E和DEN4-80EZip是指跨越登革包膜蛋白的蛋白，优选从包膜蛋白的N-末端氨基酸开始并且在第 395 至第401 个氨基酸的范围内结束的蛋白，例如这样的80E可以是包含登革病毒2型的氨基酸1至395的蛋白。如Peters等人，美国专利号6,749,857中所述，重组80E蛋白可以任选地含有通过柔软接头连接至80E蛋白的二聚化结构域(例如DEN4-80EZip)。包括蛋白的二聚体形式用于调节针对选择的组成的免疫应答，并且导致平衡四价应答的诱导。DEN-80E蛋白的表达描述于实施例1中。在本发明的优选实施方案中，提供了四价组合物，其中DEN4蛋白成分是二聚体的(例如DEN4-80EZip)。

[0066] 二聚体的80E蛋白亚单位，例如DEN4 80E二聚体，可以通过本领域中已知的方法产生(参见例如Peters等人，美国专利号US 6,749,857 B1)。简而言之，同上的Peters等人描述了构建二聚体的80％E分子的三种基本 方法。第一种方法涉及使用通过柔性接头彼此共价连接的80％E的串联拷贝。设计共价连接的两个拷贝的DEN2 80％E的一段来充当柔性系链，允许两个80％E分子以天然的头至尾二聚体方向结合，同时保持它们彼此的共价结合。选择还有其他接头序列对于本领域普通技术人员是易于显而易见的。本发明不限于具体公开的接头，但是限于使两个80％E分子以天然的头至尾二聚体方向结合、同时保持它们彼此的共价结合的任何氨基酸序列。

[0067] 第二种方法涉及将羧基末端的亮氨酸拉链结构域添加至单体的80％E以增强两个80％E-亮氨酸拉链分子之间的二聚化。可以采用这种方法的两个版本。一个版本包括连接亮氨酸拉链结构域的二硫键，导致共价连接的二聚体产物，而另一种基于亮氨酸拉链结构域的非共价结合。设计亮氨酸拉链结构域来与来自另一个80％E拉链分子的相同序列二聚化。非共价连接的亮氨酸拉链的形成将增强80％E分子的二聚化，其可以借助柔性接头以天然的头至尾构象结合，所述柔性接头用亮氨酸拉链结构域连接80％E分子。设计亮氨酸拉链结构域来与来自另一个80％E拉链分子的相同序列二聚化。一旦亮氨酸拉链二聚化，在两个末端之间形成二硫键，导致共价连接的二聚体产物。共价连接的亮氨酸拉链的形成将增强80％E分子的二聚化，其可以借助柔性接头以天然的头至尾构象结合，所述柔性接头用亮氨酸拉链结构域连接80％E分子。

[0068] 用于增强80％E的二聚化的最终办法是将螺旋 - 转角 - 螺旋结构域添加至80％E的羧基末端。来自一种修饰的80％E分子的螺旋 - 转角 - 螺旋结构域将与另一种的该结构域结合以形成二聚体的四螺旋束结构域。非共价结合的四螺旋束结构域的形成将增强80％E分子的二聚化，其可以借助柔性接头以天然的头至尾构象结合，所述柔性接头将80％E连接至螺旋束。

[0069] 在本发明的另一个实施方案中，DEN-80E被更广泛地定义为在Cys1-Cys2、Cys3-Cys8、Cys4-Cys6、Cys5-Cys7、Cys9-Cys10和Cys11-Cys12处包含6个二硫键的登革病毒包膜蛋白亚单位；其中所述蛋白作为重组蛋白从果蝇细胞中分泌；且其中所述蛋白当施用于人受试者时生成针对同源黄病毒的中和抗体应答。

[0070] 在更优选的实施方案中，重组登革病毒包膜蛋白亚单位还包含所述二硫化物模式和亲水性概况，其特征在于天然登革病毒包膜蛋白的从N末端的首个氨基酸开始的包膜蛋白的同源的80%部分(80E)。换言之，在包含登革病毒80E的序列中的氨基酸可被取代，只要维持二硫化物和亲水性概况以确保重组亚单位蛋白保留类似天然的结构和合适的免疫原性(引发病毒中和抗体的能力)。

[0071] 优选地，使用主细胞库(Master Cell Bank)在无血清培养基中表达登革病毒80E亚单位并通过以前描述的层析法(Ivy等人, 美国专利号6,432,411)纯化。实施例2中描述了在cGMP下制造一批DEN1-80E以支持临床试验。

[0072] 与在动物中测试的登革病毒制剂中包含非结构蛋白例如非结构蛋白1(NS1)的描述的额外益处形成对比(McDonell 等人, US 6,416,763)，本发明的DEN-80E蛋白在人受试者中，甚至在不包含NS1的情况下，作为有效的免疫原性疫苗。

[0073] 施用和用途本发明提供了预防或减弱由登革病毒感染引起的疾病的方法。如本文中使用的，如果对个体施用疫苗导致个体对疾病的完全或部分免疫性，或与疾病相关的症状或病症的完全或部分减弱(即，抑制)，则称疫苗预防或减弱疾病。

[0074] 相应地，本发明涉及用于人患者中提高保护性免疫应答的方法，该方法包括将如说明书始终全文描述的治疗有效量的免疫原性组合物施用于患者。

[0075] 所述发明的治疗组合物可通过皮下、肌内或皮内注射肠胃外地施用；然而，也可应用其他全身性施用模式。用于本发明的优选施用方法是肌内途径。因此，在本发明的方法的一些实施方案中，将组合物经由肌内途径施用于患者。在可替代的实施方案中，考虑皮内或皮下递送。

[0076] 本文还提供了在人中提供免于登革病毒诱导的疾病的免疫保护的方法，包括将有效量的本发明的组合物施用于患者，从而提供免于登革疾病的保护。在本发明的该方面，优选的施用途径选自：肌内、皮下和皮内。

[0077] 本发明还涉及用于在人患者中提高保护性免疫应答的方法，该方法包括施用治疗有效量的免疫原性组合物，所述组合物包含纯化的登革病毒包膜(“E”)蛋白和药学上可接受的赋形剂和有效量的佐剂，其中所述E蛋白构成野生型E的长度的从其N-末端的氨基酸残基1开始的约80%，使得所述E蛋白当在宿主细胞中重组表达时被分泌到生长培养基中，其中所述疫苗在人受试者中诱导中和抗体的产生。

[0078] 本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗登革疾病和/或登革感染的免疫原性组合物，其包含有效量的纯化的血清型DEN-1、DEN-2、DEN3、和DEN-4的登革病毒包膜(“E”)蛋白、药学上可接受的赋形剂、和有效量的佐剂；其中所述E蛋白各自构成野生型E的长度的从其N-末端的氨基酸残基1开始的约80％，使得所述E蛋白当在宿主细胞中重组表达时被分泌到生长培养基中；并且其中DEN-4 E蛋白任选地是二聚体的。在本发明的一些方面，将本文所述的组合物施用于免疫缺陷的群体。在进一步的方面，将组合物施用于儿童群体。

[0079] 在本发明的该方面的一些实施方案中，组合物的DEN4成分是DEN4-80EZip。在可替代的实施方案中，DEN4成分是DEN4-80E或DEN4-80Ezip，并且DEN4蛋白的量是DEN1-80E、DEN2-80E、或DEN3-80E成分的量的约1.5至约3倍。

[0080] 本发明的其他方面还描述了上面或整个说明书描述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防登革感染或由此引起的疾病。

[0081] 如本发明概述中所述，将本文所述的组合物的活性药物成分(登革80E和/或登革80Ezip)以“治疗有效量”、即生理上显著的量递送给患者。如果将组合物施用于患者导致受体患者的生理机能的可检测的变化，那么本发明的组合物的活性成分以生理显著量存在。在本发明中，在受体患者中可检测的变化是诱导针对同源登革病毒的中和抗体。

[0082] 本发明的活性疫苗可单独使用，或与其他活性疫苗(例如包含使其变得有效的程度的其他活性亚单位的疫苗)组合使用。在特定制剂中可包含来自一种或几种病毒或血清型的对应的或不同的亚单位。本发明的活性疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。

[0083] 当使用多次施用方案时，存在许多不同的技术用于免疫的时间选择。优选地使用本发明的组合物多于1次以提高被免疫的受试者表达的免疫球蛋白库的表达水平和多样性。通常，如果给予多次免疫，将间隔1至2个月给予免疫。本发明的优选免疫时间安排是在0、1和2个月时免疫受试者。也可使用其他免疫时间安排。例如，可使用可选的免疫时间安排例如0、1和3个月，或0、1和6个月。

[0084] 为了免疫受试者以抵抗例如登革病毒引起的疾病，使用通常涉及多次施用疫苗的常规的免疫方案对受试者施用包含亚单位的疫苗。施用通常通过注射，通常为肌内或皮下注射；然而，也可应用其他全身性施用模式。

[0085] 免疫原性组合物如上所述，在本发明的一个方面是包含有效量的纯化的血清型DEN-1、DEN-2、DEN3和DEN-4的登革病毒包膜(“E”)蛋白、药学上可接受的赋形剂和有效量的佐剂的免疫原性组合物；其中所述E蛋白各自构成野生型E的长度的从其N末端氨基酸残基1开始的约80％；
其中所述DEN-4 E蛋白是二聚体的；并且其中所述组合物在人受试者中诱导中和抗体的产生。

[0086] 在本发明的这个方面的实施方案中，对于每种血清型的登革E蛋白的量为约1 μg至约150 μg、约1 μg至约10 μg、约1 μg至约5 μg、约2 μg至约4 μg、约3 μg至约6 μg、约5 μg至约25 μg、约10 μg至约20 μg、约5 μg至约10 μg、约20 μg至约25 μg、约40 μg至约60 μg、约75 μg至约125 μg、或约90 μg至约110 μg。在可替代的实施方案中，每种登革蛋白的量为约1 μg、约2 μg、约3 μg、约4 μg、约5 μg、约6 μg、约7 μg、约8 μg、约9 μg、约10 μg、约15 μg、约20 μg、约25 μg、约
30 μg、约35 μg、约40 μg、约45 μg、约50 μg、约55 μg、约60 μg、约65 μg、约70 μg、约75 μg、约80 μg、约85 μg、约90 μg、约95 μg、约100 μg、约110 μg、约120 μg、约130 μg、约140 μg、或约150 μg。在本发明的优选的实施方案中，每种登革E蛋白的量为约3 μg、约6 μg、约10 μg、约20 μg、约50 μg、约100 μg、3 μg、6 μg、10 μg、20 μg、50 μg、或100 μg。

[0087] 还提供了免疫原性组合物，其包含有效量的纯化的血清型DEN-1、DEN-2、DEN3、和DEN-4的登革病毒包膜(“E”)蛋白、药学上可接受的赋形剂、和有效量的佐剂；其中所述E蛋白各自构成野生型E的长度的从其N-末端的氨基酸残基1开始的约80％；其中DEN4蛋白的量是DEN1、DEN2、和DEN3蛋白的个别量的约1.5至约3倍，并且其中所述组合物在人受试者中诱导中和抗体的产生。在本发明的该方面，DEN1、DEN2、DEN3和DEN4 E蛋白是单体的(例如、DEN-80E)、或者DEN1、DEN2、和DEN3 E蛋白是单体的并且DEN4蛋白是二聚体的。

[0088] 在发明的该方面，组合物中的登革E蛋白以上述量存在，前提是DEN4 E蛋白，无论是单体或二聚体，以DEN1、DEN2、和DEN3 E蛋白的个别量的约1.5至约3倍的量存在。因此，仅仅作为实例，如果DEN1、DEN2、和DEN3 E蛋白以约3 μg的量存在于组合物中，那么DEN4 E蛋白以约4.5 μg至约9 μg、优选约6 μg的量存在于组合物中。作为进一步实例，如果DEN1、DEN2、和DEN3 E蛋白以约10 μg的量存在于组合物中，那么DEN4 E蛋白以约15 μg至约30 μg、优选约20 μg的量存在于组合物中。在另一个进一步实例中，如果DEN1、DEN2、和DEN3 E蛋白以约50 μg的量存在于组合物中，那么DEN4 E蛋白以约75 μg至约150 μg、优选约100 μg的量存在于组合物中。本领域技术人员将意识到，尽管DEN1、DEN2、和DEN3 E蛋白的量近似相等，但是该量可以变化，并且不必以准确的1:1:1比例存在。本领域技术人员将能够确定每种DEN E蛋白既安全又诱导针对DEN1、DEN2、DEN3 和DEN4的平衡的四价免疫应答的最佳剂量。

[0089] 在本发明的优选的实施方案中，免疫原性组合物包含约3 μg DEN1、DEN2和DEN3 E蛋白和约6 μg DEN4 E蛋白(DEN4-80E或DEN4-80EZip)。在进一步优选的实施方案中，免疫原性组合物包含约10 μg DEN1、DEN2和DEN3 E蛋白和约20 μg DEN4 E蛋白(DEN4-80E或DEN4-80EZip)。在进一步优选的实施方案中，免疫原性组合物包含约50 μg DEN1、DEN2和DEN3 E蛋白和约100 μg DEN4 E蛋白(DEN4-80E或DEN4-80EZip)。

[0090] 用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体包括在采用的剂量和浓度对患者无毒的任何相容试剂，如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇、缓冲液等及其组合。载体还可以含有额外组分，如稳定剂、增溶剂、等渗调节剂，如NaCl、MgCl2或CaCl2等，表面活性剂及其混合物。

[0091] 根据所述发明，治疗组合物的“有效量”是足以获得期望的生物学效果的量。通常，提供组合物有效量所需的剂量将取决于下述因素而变化，例如受试者的年龄、病症、性别和疾病程度(如果有的话)，以及本领域普通技术人员可调整的其他变量。本发明的抗原制剂可以有效量的单个或多个剂量施用。本发明的组合物的有效量可在0.01-500μg/产物/剂量，更优选1-100μg/产物/剂量，和最优选5-50μg/产物/剂量中变化。本发明的组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。

[0092] 根据本发明，显示了以大规模且在cGMP下生产DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80EZip活性成分和HBV-001 D1和四价登革疫苗以支持施用于人受试者(实施例1-4)。描述了在非人灵长类动物和健康的成年志愿者(实施例5-8)中本发明疫苗的安全性和免疫原性(效力)的测定。本发明的登革疫苗的实施方案结合了两个重要方面。一方面，重组亚单位蛋白与佐剂的组合的内在安全性提供了健康和免疫功能低下个体中的疾病预防的最佳方法。在第二方面，在现行优良制造规范(cGMP)下，以足够实际应用的量生产构象相关的重组DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E和DEN4-80EZip抗原导致在非人灵长类和人受试者中诱导平衡的四价病毒中和抗体的疫苗，提供了保护免于疾病的机制。
利用单体和二聚体的80E蛋白且以各种比例的独特组合以保证对于使疾病如DHF的恶化的风险最小化关键的四价平衡。这些新的方面的组合导致在人受试者中安全和有效的登革病毒疫苗的新发明。这些疫苗制剂的进一步特征在于以下意料之外的发现，即对于有效的免疫原性和保护不需要包含非结构蛋白NS1。此外，公开的登革疫苗解决了如下技术问题：在接种疫苗的个体中诱导相关保护性免疫应答同时维持可接受的安全性概况，特别是针对处于患严重疾病的最高风险下的那些受试者，包括婴儿、老年和免疫功能低下个体。

[0093] 本文提到的所有出版物通过引用并入，其目的为描述并公开可以与本发明关联使用的方法和材料。本文任何内容均不被解释为承认本发明无权凭借先前发明早于这样的公开内容。

[0094] 已经参照附图描述了本发明的优选实施方案，应当理解的是，本发明不限于那些精确实施方案，并且在不背离如随附权利要求定义的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中影响各种变化和修改。

[0095] 以下实施例说明但不限制本发明。

[0096] 实施例1在果蝇S2系统中表达和纯化登革80E蛋白
表达质粒pMttbns(来源于pMttPA)包含以下元件：黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)金属硫蛋白启动子，人组织纤溶酶原激活物分泌前导序列(tPAL)和SV40早期多聚腺苷酸化信号。从pMttbns载体上切除14 个碱基对的BamHI(来自Bacillus amyloliqufacience 的限制性酶)片段以得到包含唯一的XhoI (来自Xanthomonas holicicola 的限制性酶)位点以及现有的唯一的BglII(来自球芽孢杆菌(Bacillus globigii)的限制性酶)位点的pMttΔXho。此表达载体促进表达的蛋白分泌至培养基。使用这些唯一的BglII和XhoI位点将登革序列引入pMttΔXho载体。用于本文所述的研究的登革序列由如下SEQ ID NO 1-5表示：(1) SEQ ID NO:1; DEN1 prM-80E; (2) SEQ ID NO:2; DEN2 prM-80E; (3) SEQ ID NO:3; DEN3 prM-80E; (4) SEQ ID NO:4; DEN4 prM-80E;和(5) SEQ ID NO:5; DEN4 prM-80EZip。为了表达羧基截短的登革包膜蛋白，从病毒RNA或cDNA克隆扩增相关的基因片段。合成的prM80E(膜前体蛋白-80％糖蛋白E)基因片段包括紧随最后的登革密码子的两个终止密码子。

[0097] 使用(i)磷酸钙共沉淀法或(ii)Cellfectin (Invitrogen Kits, Carlsbad, CA)，根据制造商的建议，用表达质粒和编码潮霉素抗性的pCoHygro选择质粒共转化S2细胞。用20：1的表达质粒与选择质粒的比例，用20 μg总DNA共转化细胞。用300 μg/ml的潮霉素B(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)选择转化体。在选择后，使细胞适应在无血清培养基Excel 420 (JRH, Lenexa, KS)中生长。为了研究表达，在6
Excel 420、300 μg/ml潮霉素中培养细胞，并用200 μM CuSO4诱导。以2 X 10 个细胞/ml的密度接种细胞并允许生长6-7天。在最佳条件下，在6-7天的生长后得到1.5至2 X
7
10 个细胞/ml的细胞密度。通过SDS-PAGE和Western印迹检查培养物上清中的表达蛋白。

[0098] 为了在Western印迹上检测DEN-80E，使用针对纯化灭活登革病毒开发的兔多克隆抗登革病毒抗体和随后的抗-兔IgG-碱性磷酸酶缀合的二级抗体。使用NBT/BCIP (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) 固相碱性磷酸酶底物显色印迹。

[0099] 使用单克隆抗体(MAb)4G2，通过免疫亲和层析(IAC)实现DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E 或 DEN4-80EZip蛋白的纯化。简而言之，程序涉及表达后的培养基的澄清。然后将原材料上样至IAC柱，其包含通过N-羟基琥珀酰亚胺化学法共价偶联的固定化的MAb。在样品上样后，用包含0.05% (v/v) 吐温-20的10 mM磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7.2(PBST, 140 mM NaCl)清洗基质。用20 mM甘氨酸缓冲液, pH 2.5从IAC柱上洗脱结合的蛋白。中和洗脱液然后将缓冲液替换为PBS。通过SDS-PAGE使用考马斯或银染、Western印迹、UV吸收和酶联免疫吸附试验(ELISA)常规地分析纯化产物，以分别测定纯度、身份(identity)、量和生物活性。另外，通过N-末端氨基酸测序和氨基酸分析来分析样品。这些分析提供了纯化产物的身份和量的验证。

[0100] 图1提供了纯化的DEN-80E蛋白的代表性SDS-PAGE(图A)和Western印迹(图B)概况。为了分析，在非还原条件下电泳样品。DEN1-80E、DEN2-80E和DEN3-80E分子以单个条带迁移并具有与从氨基酸组成测定的一致的相对分子量(即45kD)。DEN4-80EZip蛋白在非还原条件 下主要作为二聚体迁移，表观分子量约为90kD。

[0101] 实施例2生产DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E或DEN4-80EZip的cGMP批次
在cGMP条件下从每个S2细胞系中制备主细胞库(MCB)。cGMP制造方法包括将S2 MCB细胞系扩增至搅拌槽生物反应器和然后收获包含分泌的蛋白质的培养基。使用深层滤器通过过滤将细胞从培养基中分离。然后通过使用4G2单克隆抗体的免疫亲和层析从得到的澄清上清中纯化DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E或 DEN4-80EZip。免疫亲和纯化产物然后经历低pH病毒灭活步骤和病毒过滤步骤，使用具有能够去除20nm颗粒的孔径的膜来进行。
通过低pH病毒灭活和病毒过滤步骤获得重组亚单位疫苗成分的能力是与活减毒疫苗相比的优势，在活减毒疫苗中这是不可能的。这些病毒清除步骤明显简化了外来试剂测试，并且为产物提供了额外的安全性水平。DEN-80E蛋白的最终处理涉及缓冲液交换和通过超滤浓缩，然后是最终的通过0.2 µm滤器的过滤。

[0102] 如下所述实现在cGMP下制备DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E或DEN4-80EZip 的批次。解冻每个MCB小瓶且每个解冻小瓶的内容物在10 mL体积的EX-CELL培养基中于26℃下培养5天。将每份培养物扩增至500 mL一次性摇瓶。使培养物培养直至得到1.5 X
7
10/mL的细胞密度。合并培养瓶并用于在一次性摇瓶中接种更多的培养物，然后将其培养
7
3-4天。将培养物生长直到得到2 X 10 个细胞/mL的密度。然后在一次性摇瓶中将培养
7
物扩增为多份培养物。将这些培养物培养直至得到1.6 X 10 个细胞/mL的平均细胞密度。
合并培养瓶中的细胞并用于接种20L的不锈钢生物反应器。将培养物培养直至得到1.2 X
7
10 个细胞/mL的细胞密度。将合适量的细胞从20L生物反应器转移至100L不锈钢生物反
6 6
应器以得到2 X 10 个细胞/mL的初始细胞密度。将培养物培养直至得到>4.0 X 10 个细胞/mL的细胞密度。然后通过加入硫酸铜至培养物以得到0.2 mM的终浓度而诱导培养物。然后将培养物培养5天。使用0.45 μm滤芯(filter cartridge)，接着使用0.2 μm滤芯，通过深层过滤收获100L的每种培养物。在单个使用袋中以10 L体积收集滤过液并贮存于-20℃。

[0103] DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E或DEN4-80EZip容积收获物在环境温度(15-25oC)解冻约24小时。然后通过使材料通过5 μm孔径的滤器去除颗粒。将滤过的容积收获物直接上样至4G2-琼脂糖柱。上样后，用包含0.05% 吐温-20 的11 mM PBS, pH 7.1(PBST)洗涤柱，然后通过用甘氨酸缓冲液降低pH洗脱保留的80E。合并亚批次，然后通过降低pH至3.8的终pH并在环境温度(15-25℃)孵育材料16-24小时而灭活病毒，然后将pH调节至7.0 ± 0.5。使材料通过0.2 μm的预滤器以去除小颗粒，然后使用20 nm孔径的膜过滤病毒。然后通过超滤浓缩材料和替换缓冲液，并通过0.2 μm滤器直接滤入无菌袋完成最终的无菌过滤。在释放用于配制成疫苗产品前，对纯化的80E生物物质进行大量的安全性、身份、强度和纯度的评估。

[0104] 实施例3配制HBV-001 D1疫苗用于临床研究中使用
单价DEN1-80E铝吸附的(HBV-001 D1)疫苗的配制在cGMP下进行。简而言之，解冻在实施例2中描述的纯化的生物物质DEN1-80E并转移至Class 100层流流动区。用无菌Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(DPBS)稀释DEN1-80E以得到0.20 mg/mL的最终蛋白目标浓度以及无菌过滤稀释的80E溶液。将DPBS和Alhydrogel ‘85’体积计量地加入稀释的DEN1-80E溶液至2.50 mg/mL的最终铝浓度。溶液在2-8℃下过夜温和混合。

[0105] 在过夜吸附以后，测定未被吸附的DEN1-80E蛋白的量。最低75%的吸附是前进至HBV-001 D1疫苗的填充所需的。在准备好的无菌小瓶中装入适当量的HBV-001 D1疫苗。用塞子塞住填充的小瓶，封口并压褶。将填充的疫苗小瓶贮存于2-8℃。在临床研究中使用疫苗之前，进行了大量的安全性、强度、身份、效力和纯度的检测。

[0106] 实施例4配制四价登革抗原用于临床研究中使用
四价DEN-80E疫苗的配制在cGMP下进行。简而言之，将在实施例2中描述的纯化的生物物质DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、和DEN4-80EZip解冻并转移至Class 100层流流动区。将解冻的抗原无菌过滤并确定过滤后的蛋白浓度。将DEN-80E抗原各自用无菌Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(DPBS)稀释以得到0.50 mg/mL的最终蛋白目的浓度。以对于DEN1-80E:DEN2-80E:DEN3-80E:DEN4-80EZip为1:1:1:2的比例将四种蛋白溶液体积计量地混合以产生四价溶液，所述四价溶液含有0.1 mg/mL的DEN1-80E、0.1 mg/mL 的DEN2-80E、
0.1 mg/mL的DEN3-80E和0.2 mg/mL的DEN4-80EZip。将适当量的四价疫苗混合物转移至准备好的无菌小瓶中。用塞子塞住填充的小瓶，封口并压褶。将填充的疫苗小瓶贮存于
2-8℃。还制备含有DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80E的类似制剂以支持临床测试。在临床研究中使用疫苗之前，进行了大量的安全性、强度、身份、效力和纯度的检测。在施用于人受试者之前根据良好临床操作规范将四价抗原单独施用或与无菌填充佐剂混合地施用。

[0107] 实施例5HBV-001 D1登革1型重组亚单位疫苗的临床检测
在临床试验中检测了如实施例3中所述的在cGMP下制造的HBV-001 D1疫苗。在健康成年志愿者中评估HBV-001 D1生物产品的单中心、双盲、随机、1期研究评估了具有相同量Alhydrogel ‘85’佐剂的疫苗活性成分(DEN1-80E)的2种不同剂量水平。受试者在第0、4和8周接受研究疫苗的单次IM注射。在下表1中总结了研究设计。

[0108] 表1. 临床研究HBV-001-C-101的设计

[0109] 通过在研究志愿者中的定向的身体检查、常规实验室检测(血液学、临床化学和尿分析)和生命体征和不良事件的记录在研究全程中评估安全性和耐受性。另外，受试者在每次接种疫苗后使用14 +/-2天的日志卡以记录反应原性和耐受数据以及特定不良事件。在该研究中的效力评估包括测定病毒中和抗体滴度(即免疫原性)的比例和程度，如通过≥ 1:10的PRNT50(蚀斑降低中和试验)试验所测定的。在研究中没有鉴定的安全信号，提示该疫苗对于人受试者是安全的。

[0110] 来自免疫的个体的免疫原性数据总结于表2。在低剂量组群中的6位疫苗受体中，在第0、2和4周时所有受试者对于中和抗体滴度是阴性的。大部分受试者(4/6)在第10周(这是第三次疫苗剂量后2周)时产生中和抗体。没有受试者在第34周时表现可检测的抗体。1位受试者(007)显示在第6周(第二次疫苗剂量后2周)开始的阳性结果，所述阳性结果在第10周时也存在，但在第34周(剂量3后26周)时检测不到。

[0111] 在高剂量组群中的6位疫苗受体中，在第0、2和4周时所有受试者对于中和抗体滴度是阴性的。一位受试者显示在第6周(第二次疫苗剂量后2周)开始的阳性结果。两位受试者在第8周(第三次疫苗剂量当天)时显示中和抗体，大部分受试者(5/6))在第10周已经产生中和抗体。两位受试者在第34周时继续显示可检测的抗体滴度。这代表在人受试者中对于登革的非复制性疫苗的病毒中和抗体的诱导的首次显示。所有4位安慰剂受体在所有测量的时间点没有可检测的抗体滴度。

[0112] 表2. 受试者的中和抗体滴度总结抗体水平通过PRNT测定法来确定，最低可检测滴度为10。将没有可检测的抗体滴度的受试者指定为“<10”。
*受试者014只接受一个剂量的疫苗，但是完成所有研究随访和安全性评价。

[0113] 结果说明，HBV-001 D1疫苗在人患者中既是安全的，又能够诱导针对DEN1的免疫应答。此外，尽管对于有效的保护预期需要NS1(McDonell 等人, US 6,416,763)，但是在制剂中不含NS1的接种疫苗的个体中诱导了这种相关保护性免疫应答。

[0114] 实施例6在恒河猴中测试四价登革80E重组亚单位疫苗(w/DEN4-80EZip)
将包含单体DEN1-80E、单体DEN2-80E、单体DEN3-80E和二聚体DEN4-80EZip的独特组合的四价制剂制备作为与ISCOMATRIX®佐剂的混合物以便将1μg每种DEN-80E和47 ISCO单位的ISCOMATRIX®佐剂的剂量施用于恒河猴(组1)。制备第二种混合物，其包含相同的四价组合物，但还包括0.1 µg来自DEN2的NS1蛋白的剂量(组2)。12只猴的组每组以2个月的间隔施用3个剂量的混合物或单独的ISCOMATRIX® (组3)。在第三个剂量的疫苗后
30天(研究第150天)评价免疫原性。来自用没有NS1的四价制剂免疫的个体动物的抗体滴度显示于表3。如可以清楚看到的，单体和二聚体抗原的独特组合导致动物中的高滴度、平衡的四价病毒中和应答。

[0115] 表3. 3个剂量的四价疫苗后的病毒中和抗体应答接受最后剂量的疫苗后5个月，用野生型登革病毒攻击动物。对于攻击，将每组12只猴各自随机再分成4组，每组3只猴，用于用四种登革病毒之一进行攻击。用通过皮下途径
5
施用的约10 蚀斑形成单位的野生型登革病毒攻击每只猴。对于接下来的11天，动物每天采集血液样品。血液样品通过在Vero细胞上直接铺板或在蚊子C6/36细胞上扩增并且然后在Vero细胞上铺板而评价病毒(病毒血症)的存在。尽管恒河猴当用野生型登革病毒感染时没有发生疾病症状，但是它们确实发生病毒血症，并且病毒血症的预防被认为是保护效力的替代。攻击数据显示于图2中。尽管已经接受ISCOMATRIX®佐剂的12只对照动物中的11只仅在攻击后发生病毒血症，但是接受没有NS1的四价疫苗制剂的所有动物(组
1)被完全保护免于可检测的病毒血症。接受不含NS1的四价疫苗制剂的12只动物(组2)中的11只也被保护免于病毒血症，但是令人惊讶的是接受含有NS1的制剂的一只猴的确发生了一天的病毒血症。因此，含有单体和二聚体的没有NS1的蛋白的独特组合的四价疫苗制剂显示平衡的四价免疫力和完全保护免于病毒攻击，并且令人惊讶地似乎已经显示与含有NS1的制剂相比的优异的保护。

[0116] 实施例7在恒河猴中测试四价登革80E重组亚单位疫苗
这种非GLP恒河猴研究的目标是：1)比较DEN4-80E和DEN4-80EZip的免疫原性和保护效力和2)评价在与其他单体DEN-80E重组亚单位(DEN1-80E、DEN2-80E和DEN3-80E)的四价制剂中DEN4-80E的免疫原性和保护效力。在低、中等、高剂量(6、20和100 µg/剂量)评价DEN4-80E和DEN4-80Ezip。同样，在低(分别为3、3、3、6 µg的DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80E)、中等(10、10、10、20 µg)和高(50、50、50、100 µg)剂量评价四价制剂。大部分测试的制剂含有90 ISCO单位/剂量的ISCOMATRIX®佐剂。包括阴性对照组，其只接受90 ISCO单位/剂量的ISCOMATRIX®佐剂。对于比较目的，在研究中包括两个额外组。包括接受中等剂量的与225 µg Alhydrogel配制的DEN4-80E (20µg)的一组和接受与37.6 ISCO单位配制的中等四价疫苗剂量的一组。将每种疫苗或对照制剂施用于任一性别的健康成体恒河猴，所述恒河猴称重超过3 kg，并且通过ELISA测定是黄病毒(DEN 1、2、
3和4、和WN)抗体阴性的。当评价单价DEN4疫苗时使用三只猴/组，并且使用12只猴/组来评价四价制剂或ISCOMATRIX®阴性对照组。

[0117] 上述候选疫苗制剂通过肌内接种以0.5 mL总量施用。三个剂量的疫苗以4周时间间隔施用。病毒中和活性使用基于LiCor的微量中和测定每四周(T=0、4、8、12、16、20、24、28、32)来测定。对于第12周(剂量3后4周)的LiCor结果下文总结于表4中。来自第12周的关键结论之一导致DEN4-80E和DEN4-80Ezip的免疫原性在评价的剂量间是非常相当的。对于低、中等、高剂量的DEN4-80E的几何平均中和滴度分别为508、508和320，而DEN4-80Ezip的滴度为640、1016和320。还观察到接受用ISCOMATRIX®佐剂化的中等DEN4-80E剂量的组具有与接受Alhydrogel的组(32)相比基本上更高的几何平均中和滴度(508)。还看到，在接受四价疫苗制剂的组中实现了在所有登革类型间的高平衡应答。对于单一成分疫苗(DEN4-80E或DEN480E-zip)或四价疫苗没有观察到明确的剂量应答。

[0118] 表4. 在第12周(剂量3后4周)时恒河猴中由各种重组亚单位和对照制剂诱导的登革血清型中和抗体滴度(LiCor50 GMT)NT – 未检测到；*对于计算GM 的目的，<10的LiCor50结果被视作5。

[0119] 实施例8四价登革80E重组亚单位疫苗的临床试验
制备了在cGMP下制造的四价登革80E疫苗用于在临床试验中测试。该研究将由四价登革80E疫苗的I期研究组成。该研究将是随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增研究，其将评价四价(DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、和DEN4-80E)登革疫苗的不同制剂在18岁至45岁大的健康的未感染黄病毒的成体中的安全性、耐受性、和免疫原性。免疫原性数据将在每次接种疫苗后1个月、以及第三次接种疫苗后6个月和1年收集。

[0120] 在所有中，90位受试者将登记进研究中以接受在0、4和8周时施用的活性疫苗或安慰剂的3次肌内注射。如表5中所示，将评价3个剂量水平的登革1、登革2、登革3和登革4-80E抗原：低剂量(分别为3、3、3和6μg)、中等剂量(分别为10、10、10和20μg)和高剂量(分别为50、50、50和100 µg)制剂。每个剂量水平内，测试的特定疫苗将包括ISCOMATRIX®佐剂化的(用30或60 ISCO单位)、 Alhydrogel™佐剂化的、或未佐剂化的制剂。

[0121] 表5. 在方案001中待评价的研究制剂

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