环境中充斥着许多害虫，已有多种方法尝试防治害虫对植物的侵害。 经济作物常常是昆虫侵袭的目标。在过去的几十年中，用于防治植物中昆 虫侵害的更有效方法和组合物的开发已获得实质性进展。
化学杀虫剂对于根除虫害非常有效。然而，使用化学杀虫剂存在若干 缺点。它们不仅对环境有潜在危害，而且它们是没有选择性的并对多种作 物和非目标动物群有害。化学杀虫剂在环境中持续存在，其通常即使发生 代谢也十分缓慢。它们在食物链中特别是高等食肉动物中累积，在其中它 们可作为诱变剂和/或致癌剂从而导致不可逆的以及有害的遗传修饰。因 此，对于使用化学杀虫剂对抗作物害虫存在持续的争议。由于重复使用同 样的杀虫剂或具有同样作用模式的杀虫剂，它们可以迅速地获得针对这些 杀虫剂的抗性，并且由于累积也导致较高进化等级的物种中产生针对该杀 虫剂的抗性。
防治重要农作物的害虫是非常重要的，尤其是损伤茄科(Solanaceae family)植物的害虫，所述茄科植物特别是马铃薯(Solanum tuberosum)、 番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)、辣椒(Solanum capsicum)和茄属植物(例如，Solanum aculeastrum、S.bulbocastanum (一种野生马铃薯)、S.cardiophyllum、S.douglasii、欧白英(S. dulcamara)、S.lanceolatum、S.robustum和S.triquetrum)，尤其要防 治鞘翅目害虫。
使用印楝籽提取物进行生物防治已显示出针对植物鞘翅目害虫的效 果。基于印楝的市售杀虫剂将印楝素作为主要的活性成分。这些杀虫剂适 用于广谱的昆虫。它们作为昆虫生长调节剂；印楝素通过抑制产生昆虫激 素(蜕皮素)来阻碍昆虫蜕皮。
使用来自苏云金芽孢杆菌拟步行甲变种(tenebrionis)和圣地亚哥(san diego)变种的Cry3A蛋白以及衍生的杀虫蛋白进行生物防治是化学防治 的替代方案。所述Bt毒素蛋白对于防治马铃薯叶甲幼虫是有效的，所述蛋 白是作为喷洒于叶的制剂或者表达在马铃薯的叶中。
替代性生物制剂是dsRNA。在过去的几年里，借助RNA干扰或“RNAi” 下调多细胞生物中的基因(也称为“基因沉默”)已成为公知的技术。
RNA干扰或“RNAi”是序列特异性下调基因表达的方法(也称为“基因 沉默”或“RNA介导的基因沉默”)，其由序列互补于待下调靶基因区域的 双链RNA(dsRNA)起始(Fire，A.Trends Genet.Vol.15，358-363，1999； Sharp，P.A.Genes Dev.Vol.15，485-490，2001)。
在过去的几年里，借助RNA干扰(RNAi)下调多细胞生物的靶基因 已成为成熟的技术。可参考国际申请WO 99/32619(卡内基研究所)和 WO 00/01846(由本申请人申请)。
DsRNA基因沉默可在许多不同的领域中应用，例如临床应用 (WO2004/001013)和植物中dsRNA介导的基因沉默。在植物中，还设 计了用于基因沉默的dsRNA构建体，其被切割并加工成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。
也已计划将RNAi作为保护植物对抗植物寄生性线虫的方法，即通过 在植物中(例如在整个植物中，或植物的一部分、组织或细胞中)表达形 成针对植物寄生性线虫中靶基因的dsRNA片段的一种或多种核苷酸序列 来实现，所述靶基因对所述线虫的生长、繁殖和/或存活是必需的。可参考 国际申请WO 00/01846(由申请人申请)和美国专利6,506,559(基于WO 99/32619)。
尽管在植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和哺乳动物细胞领域中的 RNAi技术已经普遍知晓有数年了，然而迄今为止对于昆虫中使用RNAi 下调基因表达所知甚少。自从WO 00/01846和WO 99/32619申请的提交 和公开以来，仅有极少数涉及使用RNAi保护植物对抗昆虫的其它申请被 公开。这些包括国际申请WO 01/37654(DNA Plant Technologies)、WO 2005/019408(Bar Ilan university)、WO 2005/049841(CSIRO，Bayer Cropscience)、WO 05/047300(University of Utah Research foundation) 和美国申请2003/00150017(Mesa等)。
本发明提供了用于RNAi介导害虫防治的靶基因和构建体，尤其防治 植物的昆虫病原体。本发明还提供了通过抑制、延迟或降低特定害虫内部 靶基因的表达从而防治害虫侵害的方法。

本发明描述了用于防治作物害虫的基于非化合物、非蛋白质的新方法。 活性成分是核酸(双链RNA，即dsRNA)，其可用作杀虫制剂。在另一 实施方案中，该dsRNA可在宿主植物、植物的一部分、植物细胞或种子 中组成性地表达，从而保护该植物免受昆虫尤其是鞘翅目(如甲虫)的啃 食。所述dsRNA的序列对应于昆虫必需基因的一部分或完整基因，并通 过RNA干扰(RNAi)导致昆虫靶标的下调。由于mRNA的下调，所述 dsRNA阻止了昆虫靶蛋白的表达，并因此导致该昆虫死亡、生长停滞或不 育。
本发明的方法可实际应用在需要抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖 或者降低昆虫的致病性或侵染性的任何技术领域。本发明的方法还可实际 应用于需要特异性下调昆虫中一种或多种靶基因表达的情形。尤其有用的 实际应用包括但不限于保护植物免遭害虫侵害。
根据一个实施方案，本发明涉及防治昆虫在细胞或生物体上生长的方 法，或者阻止昆虫侵害对昆虫侵害敏感的细胞或生物体的方法，其包括将 昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条 链包含与昆虫靶基因核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，所述双 链RNA被昆虫摄入并因此控制生长或阻止侵害。
因此，本发明提供了分离的新的昆虫靶基因核苷酸序列，所述分离的 核苷酸序列包含选自以下的至少一种核酸序列:
(i)如下任意序列:SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23， 49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至 247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515， 517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773， 778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894， 896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081， 1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111， 1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627， 1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690， 1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065， 2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344， 2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384或2460，2461，2466，2471，2476，2481或 2486，或其互补序列，
(ii)与以下任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列:
SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183， 188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472， 473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592， 1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667， 1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372， 2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，以及
(iii)包含以下任意序列中至少17个连续核苷酸的序列:
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257， 259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089， 1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572， 1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647， 1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698， 1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085， 2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364， 2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含以下任意序列中至少17个连续核苷酸 的基因的直系同源物:SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至 2338、2384至2460，或其互补序列，
所述核酸序列可用于制备本发明的用于控制昆虫生长的双链RNA。
本发明使用的“防治害虫”意指杀死害虫，或阻止害虫发育或生长，或 阻止害虫侵染或侵害。本文使用的防治害虫还包括防治害虫的后代(卵的 发育)。本文使用的防治害虫还包括抑制害虫的存活、生长、发育或繁殖， 或降低害虫的致病性或侵染性。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持 生物的健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用以防治害虫或者阻碍 害虫生长或发育或侵染或侵害。本发明涉及的特定害虫是植物病原性害 虫。因此，本文使用的“防治昆虫”还包括防治昆虫的后代(如卵的发育)。 本文使用的的防治昆虫还包括抑制昆虫的存活、生长、发育或繁殖，或者 降低昆虫的致病性或侵染性。在本发明中，防治昆虫可以抑制昆虫中的生 物活性，其导致一种或多种以下特征:昆虫进食减少，昆虫生存力降低， 昆虫死亡，昆虫分化和发育的抑制，以下各项能力的丧失或下降:昆虫的 有性生殖、肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、 细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合 成、信息素感受、触角形成、翅形成、足形成、发育和分化、卵形成、幼 虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、 能量代谢、呼吸、凋亡以及真核细胞的细胞骨架结构的任何成员(如肌动 蛋白和微管蛋白)。本文所述的化合物和/或组合物可用于保持生物健康， 并可以以治疗性、预防性或全身性地使用以防治害虫或者阻碍害虫生长或 发育或侵染或侵害。因此，本发明可以使先前敏感的生物对昆虫的侵害产 生抗性。
本文使用的表述“与......的至少一部分互补”是指所述核苷酸序列与靶 标核苷酸序列在超过两个核苷酸的长度上，例如至少15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24或更多个连续核苷酸的长度上完全互补。
根据又一实施方案，本发明涉及用于下调昆虫中靶基因表达的方法， 其包括将所述昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补 链，其中一条链具有与待下调昆虫靶基因的至少一部分核苷酸序列互补的 核苷酸序列，由此所述双链RNA被昆虫摄入并因此下调昆虫靶基因的表 达。
当“靶基因”没有用量词限定时，就是指“至少一种”靶基因。同样地， 靶标生物是指“至少一种”靶标生物，以及RNA分子或宿主细胞是指“至少 一种”RNA分子或宿主细胞。这在后面还有详述。
根据一个实施方案，本发明的方法依赖于昆虫摄取其外部的双链RNA (例如，通过喂食)，并且不需要在昆虫细胞的内部表达双链RNA。另外， 本发明还包括如上所述的方法，其中所述昆虫与含有双链RNA的组合物 接触。
本发明还提供了用于下调靶标生物(其能够摄取植物、植物的一部分、 植物的细胞或种子)中至少一种靶基因表达的方法，其包括向靶标生物喂 食植物、植物的一部分、植物的细胞或种子，其中所述植物、植物的一部 分、植物的细胞或种子表达双链RNA。
在一个更优选的方面，本发明提供了用于下调靶标生物(其能够摄取 宿主细胞，或其提取物)中至少一种靶基因表达的方法，其包括向靶标生 物喂食宿主植物、植物的一部分、植物的细胞或种子，所述宿主植物、植 物的一部分、植物的细胞或种子表达双链RNA分子，所述双链RNA分子 包含互补于所述至少一种靶基因的至少一部分核苷酸序列的核苷酸序列 或代表所述至少一种靶基因的至少一部分核苷酸序列的RNA等价物，因 此靶标生物摄取宿主细胞、宿主植物、植物的一部分、植物的细胞或种子 造成和/或导致该至少一种靶基因表达的下调。
本发明提供了本文所定义的植物、植物的一部分、植物的细胞或种子 用于下调昆虫靶基因表达的用途。更详细地，本发明提供了本文所定义的 宿主细胞和/或RNA分子用于下调靶基因表达的用途，所述RNA分子包 含作为靶标生物靶基因的至少一部分核苷酸序列的RNA互补物或代表靶 标生物靶基因至少一部分核苷酸序列的RNA等价物的核苷酸序列，其在 植物、植物的一部分、植物的细胞或种子中通过核酸分子转录而产生，例 如用于制造商品。本发明中合适的靶基因和靶标生物在后面将有详细的讨 论。
根据一个实施方案，本发明的方法依赖于GMO方法，其中双链RNA 由被昆虫侵害或对昆虫侵害敏感的细胞或生物来表达。优选地，所述细胞 是植物细胞或者所述生物体是植物。
因此，本发明还涉及用于产生对植物病原性昆虫具有抗性的植物的方 法，其包括:
-用重组构建体转化植物细胞，所述重组构建体包含至少一个调节序 列，其有效地连接与以下(a)或(b)中序列的至少一部分互补的序列， (a)选自以下的靶标昆虫基因的核苷酸序列:
(i)与以下任意序列具有至少75％一致性的序列:
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255， 257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533 至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778， 783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890， 892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103， 1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700， 1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080， 2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349， 2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或 2481，或其互补序列，
(ii)包含以下任意序列的至少17个连续核苷酸的序列:SEQ ID NO 1、 3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至 472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576， 581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788， 793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894， 896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079， 1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105， 1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602， 1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667， 1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702， 1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085， 2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481， 或其互补序列，以及
(iii)包含含有(i)中核苷酸序列的有义链和含有(i)所述核苷酸序列 之互补序列的反义链的序列，其中由所述核苷酸序列编码的转录物能够形 成双链RNA，
或(b)作为包含以下任意序列中至少17个连续核苷酸之基因的昆虫直系 同源物的核苷酸序列:SEQ ID No 49至158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至 2338、2384至2460，或其互补序列；
-从已转化植物细胞再生植物；以及
-在适于表达所述重组构建体的条件下培养所述经转化的植物，所述培养 的转化植物与未经转化的植物相比对植物病原性昆虫具有抗性。
所述昆虫可以是任何昆虫，意指属于动物界、更具体为节肢动物门、 更具体为昆虫纲或蛛形纲的任何生物。本发明的方法适用于所有昆虫，它 们对通过RNA干扰进行的基因沉默是敏感的，并且能够内化来自它们紧 邻环境的双链RNA。本发明还适用于处于发育任何阶段的昆虫。因为昆虫 具有无生命的外骨骼，所以它们不能以均匀的速率生长，而是通过周期性 蜕落其外骨骼进行分阶段生长。该过程称作蜕皮。蜕皮之间的阶段称作 “龄”，并且这些阶段可以作为本发明的靶标。同时，昆虫的卵或活的初生 幼虫也可作为本发明的靶标。发育周期中的所有阶段(包括有翅昆虫中的 变态)均可以作为本发明的靶标。因此，单独的阶段(如幼虫、蛹、若虫 等发育阶段)均可以作为靶标。
在本发明的一个实施方案中，所述昆虫可以属于以下目:蜱螨目 (Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、 弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、 双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣 目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、 同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、 鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、 脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、 竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮 虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨 尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、 毛翅目(Trichoptera)和缺翅目(Zoraptera)。
在本发明优选但非限制性实施方案和方法中，所述昆虫选自植物害虫， 例如但不仅限于:褐飞虱属(Nilaparvata spp.)(例如，褐飞虱(N.lugens))、 灰飞虱属(Laodelphax spp.)(例如，灰飞虱(L.striatellus))、黑尾叶 蝉属(Nephotettix spp.)(例如，二点黑尾叶蝉(N.virescens)，或黑尾 叶蝉(N.cincticeps)，或二条黑尾叶蝉(N.nigropictus))、白背飞虱属 (Sogatella spp.)(例如，白背飞虱(S.furcifera))、杆长蝽属(Blissus spp.)(例如，美洲谷杆长蝽(B.leucopterus leucopterus))、黑蝽属 (Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽(S.vermidulate))、绿蝽属(Acrosternum spp.)(例如，拟绿蝽(A.hilare))、稻弄蝶属(Parnara spp.)(例如， 直纹稻弄蝶(P.guttata))、禾草螟属(Chilo spp.)(例如，二化螟(C. suppressalis)、台湾稻螟(C.auricilius)或黑头螟(C.polychrysus))、 禾草螟属(Chilotraea spp.)(例如稻杆螟(C.polychrysa))、蛀茎夜蛾 属(Sesamiaspp.)(例如，稻蛀茎夜蛾(S.inferens))、蛀禾螟属(Tryporyza spp.)(例如，白稻螟(T.innotata)或三化螟(T.incertulas))、纵卷叶 野螟属(Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻纵卷叶野螟(C.medinalis))、 潜蝇属(Agromyza spp.)(例如，日本稻潜蝇(A.oryzae)或玉米潜蝇(A. parvicornis))、杆草螟属(Diatraea spp.)(例如，小蔗螟(D.saccharalis) 或西南玉米杆草螟(D.grandiosella))、稻螟蛉属(Narnaga spp.)(例 如，双带夜蛾(N.aenescens))、黄夜蛾属(Xanthodes spp.)(例如， 犁纹黄夜蛾(X.transversa))、灰翅夜蛾属(Spodoptera spp.)(例如， 草地贪夜蛾(S.frugiperda)、甜菜夜蛾(S.exigua)、海灰翅夜蛾(S.littoralis) 或S.praefica)、秘夜蛾属(Mythimna spp.)(例如，Mythmna(Pseudaletia) seperata)、Helicoverpa spp.(例如，谷实夜蛾(H.zea))、Colaspis spp. (例如，C.brunnea)、稻水象属(Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲 (L.oryzophilus))、稻象属(Echinocnemus spp.)(例如，稻象(E. squamos))、Diclodispa spp.(例如，D.armigera)、禾谷负泥虫属(Oulema spp.)(例如，水稻负泥虫(O.oryzae))、米象属(Sitophilus spp.)(例 如，米象(S.oryzae))、Pachydiplosisspp.(例如，稻瘿蚊(P.oryzae))、 水蝇属(Hydrellia spp.)(例如，麦叶毛眼水蝇(H.griseola)或日稻毛眼 水蝇(H.sasakii))、Chlorops spp.(例如，稻杆潜蝇(C.oryzae))、 叶甲属(Diabrotica spp.)(例如，玉米根叶甲(D.virgifera virgifera)、 巴氏根叶甲(D.barberi)、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi)、 D.virgiferazeae、D.balteata)、杆野螟属(Ostrinia spp.)(例如，玉米 螟(O.nubilalis))、地虎属(Agrotis spp.)(例如，小地老虎(A.ipsilon))、 Elasmopalpus spp.(例如，南美玉米苗斑螟(E.lignosellus))、梳爪叩头 虫属(Melanotus spp.)(捻转血矛线虫)、圆头犀金龟属(Cyclocephala spp.) (例如，C.borealis或C.immaculata)、弧丽金龟属(Popillia spp.)(例 如，日本弧丽金龟(P.japonica))、跳甲属(Chaetocnema spp.)(例如， 玉米铜色跳甲(C.pulicaria))、龙颈象属(Sphenophorus spp.)(例如， 玉米长喙象(S.maidis))、缢管蚜属(Rhopalosiphum spp.)(例如，玉 米蚜(R.maidis))、圆尾蚜属(Anuraphis spp.)(例如，A.maidiradicis)、 黑蝗属(Melanoplus spp.)(例如，红足黑蝗(M.femurrubrum))、特 异黑蝗(M.differentialis)或迁飞黑蝗(M.sanguinipes))、种蝇属(Hylemya spp.)(例如，种蝇(H.platura))、呆蓟马属(Anaphothrips spp.)(例 如，黄呆蓟马(A.obscrurus))、Solenopsis spp.(例如，S.milesta)、 叶螨属(Tetranychus spp.)(例如，二点叶螨(T.urticae)、朱砂叶螨(T. cinnabarinus)、Helicoverpa spp.(例如，谷实夜蛾或棉铃虫(H.armigera))、 Pectinophora spp.(例如，红铃麦蛾(P.gossypiella))、金刚钻属(Earias spp.)(例如，翠纹钻夜蛾(E.vittella))、实夜蛾属(Heliothis spp.)(例 如，烟芽夜蛾(H.virescens))、花象属(Anthonomus spp.)(例如，棉 铃象甲(A.grandis))、Pseudatomoscelis spp.(例如，棉伪斑腿盲蝽(P. seriatus))、结翅粉虱属(Trialeurodes spp.)(例如，结翅粉虱(T. abutiloneus)、温室粉虱(T.vaporariorum))、小粉虱属(Bemisia spp.) (例如，银叶粉虱(B.argentifolii))、蚜属(Aphis spp.)(例如，棉蚜 (A.gossypii))、草盲蝽属(Lygus spp.)(例如，美国牧草盲蝽(L.lineolaris) 或L.hesperus)、美洲蝽属(Euschistus spp.)(例如，斑点美洲蝽(E. conspersus))、Chlorochroa spp.(例如，赛氏蝽(C.sayi))、绿蝽属 (Nezara spp.)(例如，稻绿蝽(N.viridula))、蓟马属(Thrips spp.) (例如，烟蓟马(T.tabaci))、花蓟马属(Frankliniella spp.)(例如， 烟褐蓟马(F.fusca)或西方花蓟马(F.occidentalis))、马铃薯叶甲属 (Leptinotarsa spp.)(例如，马铃薯叶甲(L.decemlineata)、伪马铃薯 叶甲(L.juncta，false potato beetle，FPB)或L.texana)、合爪负泥虫属 (Lema spp.)(例如，三条负泥虫(L.trilineata))、茄跳甲属(Epitrix spp.)(例如，美国马铃薯跳甲(E.cucumeris)、烟草跳甲(E.hirtipennis) 或块茎跳甲(E.tuberis))、豆芫菁属(Epicauta spp.)(例如，北美豆 芫菁(E.vittata))、猿叶甲属(Phaedon spp.)(例如，辣根猿叶甲(P. cochleariae))、食植瓢虫属(Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢虫(E. varivestis))、Acheta spp.(例如，美洲蟋蟀(A.domesticus))、绿小 叶蝉属(Empoasca spp.)(例如，蚕豆小绿叶蝉(E.fabae))、瘤蚜属 (Myzus spp.)(例如，桃蚜(M.persicae))、薯个木虱属(Paratrioza spp.) (例如，马铃薯木虱(P.cockerelli))、Conoderus spp.(例如，C.falli 或C.vespertinus)、麦蛾属(Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯麦蛾(P. operculella))、长管蚜属(Macrosiphum spp.)(例如，大戟长管蚜(M. euphorbiae))、Thyanta spp.(例如，T.pallidovirens)、麦蛾属(Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯麦蛾(P.operculella))、Helicoverpa spp.(例如， 谷实夜蛾)、Keiferia spp.(例如，K.lycopersicella)、Limonius spp.(捻 转血矛线虫)、Manduca spp.(例如，烟草天蛾(M.sexta)或番茄天蛾(M. quinquemaculata))、斑潜蝇属(Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潜蝇(L. sativae)、三叶草斑潜蝇(L.trifolli)或南美斑潜蝇(L.huidobrensis))、 果蝇属(Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蝇(D.melanogaster)、D.yakuba、 拟暗果蝇(D.pseudoobscura)或拟果蝇(D.simulans))、步甲属(Carabus spp.)(例如，粒步甲(C.granulatus))、摇蚊属(Chironomus spp.) (例如，摇蚊(C.tentanus))、栉首蚤属(Ctenocephalides spp.)(例如， 猫栉首蚤(C.felis))、非耳喙象属(Diaprepes spp.)(例如，根象鼻虫 (D.abbreviatus))、齿小蠹属(Ips spp.)(例如，美松齿小蠹(I.pini))、 拟谷盗属(Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗(T.castaneum))、舌蝇 属(Glossina spp.)(例如，刺舌蝇(G.morsitans))、按蚊属(Anopheles spp.)(例如，甘比亚按蚊(A.gambiae))、Helicoverpa spp.(例如，棉 铃虫(H.armigera))、Acyrthosiphon spp.(例如，豌豆蚜(A.pisum))、 蜜蜂属(Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂(A.melifera))、Homalodisca spp. (例如，琉璃叶蝉(H.coagulate))、伊蚊属(Aedes spp.)(例如，埃 及斑纹(A.aegypti))、蚕蛾属(Bombyx spp.)(例如，家蚕(B.mori))、 飞蝗属(Locusta spp.)(例如，飞蝗(L.migratoria))、牛蜱属(Boophilus spp.)(例如，微小牛蜱(B.microplus))、Acanthoscurria spp.(例如， A.gomesiana))、Diploptera spp.(例如，太平洋折翅蠊(D.punctata))、 袖蝶属(Heliconius spp.)(例如，瓦氏袖蝶(H.erato)或诗神袖蝶(H. melpomene))、象虫属(Curculio spp.)(例如，欧洲栎象(C.glandium))、 Plutella spp.(例如，小菜蛾(P.xylostella))、钝眼蜱属(Amblyomma spp.) (例如，彩饰花蜱(A.variegatum))、柞蚕属(Antheraea spp.)(例如， 天蚕(A.yamamai))和阿蚊属(Armigeres spp.)(例如，骚扰阿蚊(A. subalbatus))。
本发明优选的植物病原性昆虫是选自以下的植物害虫:马铃薯叶甲属 (例如，马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(L.juncta， false potato beetle，FPB)或L.texana)、褐飞虱属(例如，褐飞虱)、 灰飞虱属(例如，灰飞虱)、黑尾叶蝉属(例如，二点黑尾叶蝉，或黑尾 叶蝉，或二条黑尾叶蝉)、白背飞虱属(例如，白背飞虱)、禾草螟属(例 如，二化螟、台湾稻螟或C.polychrysus)、蛀茎夜蛾属(例如，稻蛀茎夜 蛾)、蛀禾螟属(例如，T.innotata或三化螟)、花象属(例如，棉铃象 甲)、猿叶甲属(例如，辣根猿叶甲)、食植瓢虫属(例如，墨西哥豆瓢 虫)、拟谷盗属(例如，赤拟谷盗)、Diabrotica spp.(例如，玉米根叶甲、 巴氏根叶甲、黄瓜十一星叶甲、D.virgifera zeae)、杆野螟属(例如，玉 米螟)、呆蓟马属(例如，黄呆蓟马)、Pectinophora spp.(例如，红铃 麦蛾)、实夜蛾属(例如，烟芽夜蛾)、结翅粉虱属(例如，结翅粉虱、 温室粉虱)、小粉虱属(例如，银叶粉虱)、蚜属(例如，棉蚜)、草盲 蝽属(例如，美国牧草盲蝽或L.hesperus)、美洲蝽属(例如，斑点美洲 蝽)、Chlorochroa spp.(例如，赛氏蝽)、绿蝽属(例如，稻绿蝽)、蓟 马属(例如，烟蓟马)、花蓟马属(例如，烟褐蓟马或西方花蓟马)、Acheta spp.(例如，美洲蟋蟀)、瘤蚜属(例如，桃蚜)、长管蚜属(例如，大 戟长管蚜)、杆长蝽属(例如，美洲谷杆长蝽)、绿蝽属(例如，拟绿蝽)、 禾草螟属(例如，C.polychrysa)、稻水象属(例如，稻水象甲)、缢管 蚜属(例如，玉米蚜)和圆尾蚜属(例如，A.maidiradicis)。
根据一个更具体的实施方案，本发明的方法适用于马铃薯叶甲属。马 铃薯叶甲属属于叶甲科(Chrysomelidae)。叶甲(如跳甲和玉米根虫)和 象甲(如苜蓿叶象甲)是特别重要的害虫。跳甲包括多种小型食叶甲虫， 其以多种草、谷类和草本植物的叶为食。跳甲包括多个属(例如，Attica、 Apphthona、Argopistes、Disonycha、茄跳甲属(Epitrix)、长跗跳甲属 (Longitarsus)、Prodagricomela、Systena和黄条跳甲属(Phyllotreta))。 萝卜菜跳甲(Phyllotreta cruciferae)(也叫作Rape Flea Beetle)是特别 重要的害虫。玉米根虫包括叶甲属的物种(例如，D.undecimpunctata undecimpunctata、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardii)、D. longicornis、玉米根叶甲(D.virgifera)和D.balteata)。玉米根虫对玉 米和瓜类(curcubit)造成广泛地破坏。西方斑点黄瓜甲虫(Western Spotted Cucumber Beetle，D.undecimpunctata undecimpunctata)在美国是瓜类 害虫。苜蓿叶象甲(亦称三叶草象甲)属于叶象属(紫苜蓿叶象(H.postica)、 埃及苜蓿叶象(H.brunneipennis)、H.nigrirostris、三叶草叶象(H. punctata)和H.meles)，并且认为其是重要的豆类害虫。埃及苜蓿象甲 (H.brunneipennis)在美国是重要的苜蓿害虫。
马铃薯叶甲属物种多于30种。因此，本发明包括用于防治马铃薯叶甲 属物种的方法，更具体地用于杀死昆虫，或阻碍马铃薯叶甲属昆虫发育或 生长，或者防止昆虫侵染或侵害。本发明所防治的特定马铃薯叶甲属物种 包括马铃薯叶甲(Colorado Potato Beetle，CPB)(马铃薯叶甲(Say)和 伪马铃薯叶甲(Say))。
CPB对于我们本国的马铃薯，其它栽培和野生的有块茎和无块茎的马 铃薯物种(例如，S.demissum、S.phureja a.o.)以及其它茄属植物物种是 (严重的)害虫，这些物种包括:
(a)作物物种番茄(几种番茄属物种)、茄子、胡椒(几种辣椒属物种)、 烟草(几种烟草属物种，其包括观赏植物)和醋栗(酸浆属)；
(b)杂草/草本植物物种，北美刺龙葵(S.carolinense)、欧白英(S. dulcamara)、颠茄(颠茄属)、曼陀罗(曼陀罗属)、天仙子(天仙子 属)和黄花刺茄(S.rostratum)。
FPB主要发现于北美刺龙葵上，也发生在欧白英(common nightshade)、醋栗(ground cherry)和酸浆(hust tomato)(酸浆属) 上。
术语“昆虫”包括所有类型以及所有发育阶段的昆虫，包括卵、幼虫或 若虫、蛹和成虫阶段。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是马铃薯叶甲，所述植 物是马铃薯、茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗或者稻、玉米或棉花。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是辣根猿叶甲，所述植 物是芥菜、大白菜、芜菁、羽衣甘蓝或小白菜。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥豆瓢虫，所述 植物是豆类、蚕豆、四季豆、食荚菜豆、利马豆、绿豆、青豆、牛眼豆、 绒毛豆、大豆、豇豆、木豆、三叶草或苜蓿。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是棉铃象甲，所述植物 是棉花。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是赤拟谷盗，所述植物 是以贮存谷物的形式，如面粉、谷类、粗粉、饼干、豆类、调味品、面食、 点心粉、干的宠物食品、干花、巧克力、坚果、种子甚至干的博物馆样品。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是桃蚜，所述植物是树 木如李属(Prunus)，特别是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花 科和葫芦科的蔬菜作物，其包括但不限于:朝鲜蓟、芦笋、豆类、甜菜、 青花菜、抱子甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉米、黄 瓜、茴香、无头甘蓝、大头菜、芜菁、茄子、莴苣、芥菜、菜秋葵、欧芹、 欧洲防风草、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜、菠菜、南瓜、番茄、芜菁、豆 瓣菜和西瓜；农作物例如但不限于:烟草、糖用甜菜和向日葵；开花作物 或其它观赏植物。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是褐飞虱，所述植物是 稻类植物。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是二化螟，所述植物是 稻类植物、大麦、高粱、玉米、小麦或草。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是小菜蛾，所述植物是 芸苔属的，例如但不限于卷心菜、大白菜、抱子甘蓝、无头甘蓝、油菜、 青花菜、花椰菜、芜菁、芥菜或萝卜。
本发明包括如本文所述的方法，其中所述昆虫是美洲蟋蟀，所述植物 是本文所述的任何植物或任何有机体。
受益于本发明的“敏感生物”包括任何对害虫侵害敏感的生物。优选地， 植物可受益于本发明，而免遭植物害虫的侵害。
在一个优选的实施方案中，所述敏感生物是植物，所述害虫是植物病 原性昆虫。在该实施方案中，通过在被植物病原性害虫侵害或对侵害敏感 的植物、植物的一部分、植物的细胞或种子中表达dsRNA分子使所述昆 虫与RNA分子接触。
在本文中，术语“植物”包括期望被处理从而防止或降低昆虫生长和/ 或昆虫侵害的任何植物材料。这包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖材料(如 种子、插条、接穗、外植体等)，以及植物细胞和组织培养物等等。所述 植物材料应该表达RNA分子或者具有表达RNA分子的能力，所述RNA 分子包含至少一种核苷酸序列，所述核苷酸序列是害虫至少一种靶基因的 有义链核苷酸序列的至少一部分的RNA互补序列或代表其RNA等价物， 从而所述RNA分子通过植物与害虫的相互作用被害虫吸收，所述RNA分 子能够通过RNA干扰抑制靶基因或者下调靶基因的表达。
所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因，例如对于害虫的生存、生 长、发育或繁殖是必需的靶基因。本发明涉及昆虫中可被下调的任何目的 基因(在此可称作“靶基因”)。
术语“下调基因表达”和“抑制基因表达”可互换地使用，其指在靶基因 的蛋白质产物和/或mRNA产物水平上可测量的或可观察的基因表达减少 或者完全消除可检测的基因表达。优选地，所述下调不显著地直接抑制昆 虫其它基因的表达。与正常的基因表达相比时，dsRNA对基因表达的下调 效果可计算为至少30％、40％、50％、60％，优选70％、80％，甚至更优 选90％或95％。根据靶基因的性质，可通过对细胞或整只昆虫进行表型分 析或者通过使用分子技术测量mRNA或蛋白质的表达来验证昆虫细胞中 基因表达的下调或抑制，所述分子技术如RNA溶液杂交、PCR、核酸酶 保护实验、Northern杂交、逆转录、用微阵列监测基因表达、抗体结合、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射免疫测定、(RIA)、 其它免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)。
“靶基因”可以是期望被抑制的几乎任何基因，因为其干扰昆虫的生长 或致病性或侵染性。例如，如果本发明的方法用于阻碍昆虫生长和/或侵害， 则优选地选择对于昆虫的生存力、生长、发育或繁殖是必需的靶基因，或 者涉及昆虫的致病性或侵染性的任何基因，使得对靶基因的特异性抑制导 致致死表型或者降低或阻止昆虫侵害。
根据一个非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法下 调或抑制其表达时昆虫被杀死或者昆虫的繁殖或生长被阻止或阻滞的基 因。认为这类靶基因是昆虫生存所必需的，其称作必需基因。因此，本发 明包括本文所述的方法，其中所述靶基因是必需基因。
根据又一非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法将 其下调时昆虫的侵害或侵染、昆虫造成的破坏和/或昆虫侵害或侵染宿主生 物和/或导致这样的破坏的能力被降低的基因。一般地，术语“侵害”和“侵 染”始终可互换使用。认为这类靶基因参与昆虫的致病性或侵染性。因此， 本发明延及本文所述的方法，其中所述靶基因涉及昆虫的致病性或侵染 性。选择后一类型靶基因的优势在于阻断了昆虫侵染其它植物或植物部 分，并且抑制其形成后代。
根据一个实施方案，靶基因是保守基因或者昆虫特异性基因。
另外，在本发明的方法中可以使用能够指导RNAi或RNA介导的基因 沉默或者抑制昆虫靶基因的任何适当的双链RNA片段。
在另一实施方案中，选择事实上涉及害虫(如昆虫)生长、发育和繁 殖的基因。示例性的基因包括但不限于核糖体蛋白的结构亚基和β-外被体 基因(如CHD3基因)。核糖体蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是参与 蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并且是胞浆小核糖体亚基的组分， 核糖体蛋白如L9和L19是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并 且定位于核糖体。秀丽隐杆线虫中的β-外被体基因编码形成膜泡包被的多 聚复合体的亚基蛋白质。已在多种生物中发现类似的序列，如拟南芥 (Arabidopsis thaliana)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在多种生物中发现相关的序列，如马 铃薯叶甲、辣根猿叶甲、墨西哥豆瓢虫、棉铃象甲、赤拟谷盗、桃蚜、褐 飞虱、二化螟、小菜蛾和美洲蟋蟀。
本发明使用的其它靶基因可包括例如在生存、生长、发育、繁殖和侵 染性中扮演重要角色的基因。这些靶基因包括例如持家基因、转录因子和 害虫特异性基因或者在线虫或果蝇中的致死敲除突变。本发明使用的靶基 因还可以是来自另一些生物的基因，例如来自昆虫或蛛形纲(例如，马铃 薯叶甲属、猿叶甲属、食植瓢虫属、花象属、拟谷盗属、瘤蚜属、褐飞虱 属、禾草螟属、Plutella属或Acheta属)。
优选的靶基因包括表1A中具体列出的基因以及来自另一些靶标生物 (如来自另一些害虫生物)的直系同源基因。
在本发明的方法中，使用dsRNA抑制昆虫生长或干扰昆虫的致病性或 侵染性。
因此，本发明涉及包含退火互补链的分离的双链RNA，其中一条链包 含与昆虫靶基因靶标核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。所述靶 基因可以是本文所述的任何靶基因，或者发挥同样功能的所述基因一部 分。
根据本发明的一个实施方案，提供了包含退火互补链的分离的双链 RNA，其中一条链包含与昆虫靶基因核苷酸序列的至少一部分互补的核苷 酸序列，其中所述靶基因包含选自以下的序列:
(i)与以下任意序列具有至少75％一致性的序列:SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任意序列的至少17个连续核苷酸的序列:SEQ ID NO 1、 3、5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者，其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列至少17个连续核苷酸的基 因的昆虫直系同源物:SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至 2338、2384至2460或其互补序列。
取决于用于测量基因沉默的测定，与已用对照dsRNA处理的害虫相 比，生长抑制可被定量为大于约5％、10％，更优选约20％、25％、33％、 50％、60％、75％、80％，最优选约90％、95％或约99％。
根据本发明的另一个实施方案，提供了分离的双链RNA，其中至少一 条所述退火互补链包含以下任意序列中至少一种核苷酸序列的RNA等价 物:SEQ ID NO 1、3、5、 7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493， 498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609， 621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883， 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476或2481，或者其中至少一条所述退火互补链包含长度为至少17个碱 基对的片段的其RNA等价物，优选其长度为至少18、19、20或21，更优 选至少22、23或24个碱基对。
如果本发明的方法用于在宿主细胞或宿主生物中或者对宿主细胞或宿 主生物进行特异性防治特定昆虫的生长或侵害，则优选双链RNA不与任 何宿主基因具有任何显著的同源性，或者至少不与宿主的任意必需基因具 有任何显著的同源性。在本文中，优选双链RNA与宿主细胞任意基因的 核酸序列一致性低于30％，更优选低于20％，更优选低于10％，甚至更 优选低于5％。序列一致性百分比应该跨越全长双链RNA区域计算。如果 可获得宿主生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信息学工具来交 叉校验与双链RNA的序列一致性。在一个实施方案中，dsRNA和宿主序 列之间没有超过21个连续核苷酸的序列一致性，这表明在本文中优选 dsRNA的21个连续碱基对不存在于宿主生物的基因组中。在另一实施方 案中，dsRNA与宿主物种的任意核苷酸序列在超过24个连续核苷酸的长 度上序列一致性低于约10％或低于约12.5％。
所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链包含对应于待下调靶 基因靶标核苷酸序列的核苷酸序列。该双链RNA的另一条链能够与所述 第一条链碱基配对。
昆虫靶基因的“靶区域”或“靶标核苷酸序列”可以是该基因的任何合适 区域或核苷酸序列。所述靶区域应包含靶基因的至少17、至少18或至少 19个连续核苷酸，更优选至少20或至少21个核苷酸，并且更优选所述靶 基因的至少22、23或24个核苷酸。
优选(至少部分的)所述双链RNA与昆虫靶基因的靶区域具有100％ 的序列一致性。然而应当理解的是，在全长双链区域上具有100％的序列 一致性不是功能性RNA抑制的必要条件。还发现相对于靶序列来说带有 插入、缺失和单点突变的RNA序列对RNA抑制是有效的。术语“对应于” 或“互补于”在本文可互换使用，并且当这些术语用于指双链RNA和靶基 因靶区域之间的序列对应性时，应理解为并非绝对需要100％的序列一致 性。然而，双链RNA和靶区域之间的序列一致性百分比通常为至少80％ 或85％一致，优选至少90％、95％、96％，或者更优选至少97％、98％， 更优选至少99％。当两条核酸链的碱基对至少85％一致时，它们是“基本 上互补的”。
本文使用的术语“互补的”既代表DNA-DNA互补又代表DNA-RNA互 补。类似地，术语“RNA等价物”实际上指在DNA序列中碱基“T”可以被 通常存在于核糖核酸中的对应碱基“U”所替代。
尽管dsRNA包含对应于靶基因靶区域的序列，然而整个dsRNA都对 应于靶区域的序列却不是绝对必需的。例如，所述dsRNA可包含位于靶 标特异性序列侧翼的短的非靶序列，只要该序列不实质性影响dsRNA在 抑制RNA方面的性能即可。
所述dsRNA可包含一种或多种替代碱基从而优化RNAi的作用。对于 本领域技术人员来说，如何依次改变dsRNA的每个碱基并测试所得 dsRNA的活性(例如，在合适的体外测试系统中)从而优化给定dsRNA 的作用是显而易见的。
所述dsRNA还可以包含DNA碱基、非天然碱基或非天然骨架连接或 糖-磷酸骨架修饰，从而例如增强储存期间的稳定性或者增强对核酸酶降解 的抗性。
先前已有报道，对于有效的基因沉默来说，形成约21bp的短干扰RNA (siRNA)是理想的。然而，在申请人的各项应用中已显示dsRNA的最小 长度优选至少约80-100bp以便于某些害虫有效吸收。有迹象表明，在无 脊椎动物(如自由生活的秀丽隐杆线虫或植物寄生的南方根结线虫)中， 这些较长的片段在基因沉默中更加有效，这可能由于无脊椎动物摄取这些 较长的dsRNA更为有效所致。
最近还有提示认为，与常规的21聚体siRNA相比，由27聚体平端组 成的合成RNA双链体或者具有29bp茎和2-nt 3’突出端的短发夹(short hairpin，sh)RNA是RNA干扰的更强诱导物。因此，基于以上鉴定靶标 并且作为27聚体平端或具有29bp茎和2-nt 3’突出端的短发夹RNA的分 子也包括在本发明的范围内。
因此，在一个实施方案中，所述双链RNA片段(或区域)本身的长 度优选为至少17bp，优选长18或19bp，更优选至少20bp，更优选长至 少21bp，或至少22bp，或至少23bp，或至少24bp、25bp、26bp或至 少27bp。“双链RNA片段”或“双链RNA区域”是指对应于(部分)靶基 因的双链RNA小实体。
通常，所述双链RNA优选约17-1500bp，更优选约80-1000bp，最优 选约17-27bp或约80-250bp；如双链RNA区域约为17bp、18bp、19bp、 20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、 150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550 bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300 bp、1400bp或1500bp。
双链RNA长度的上限可能取决于i)昆虫吸收dsRNA的需要，以及 ii)dsRNA在细胞内部加工成指导RNAi的片段的需要。所选长度还可受 RNA合成方法和向细胞递送RNA的模式的影响。优选地，本发明方法中 所使用的双链RNA的长度将小于10,000bp，更优选1000bp或更小，更 优选500bp或更小，更优选300bp或更小，更优选100bp或更小。对于 任何给定的靶基因和昆虫来说，dsRNA进行有效抑制的最佳长度可通过实 验来测定。
所述双链RNA可以是完全或部分双链。如果所述RNA仍能被昆虫吸 收并指导RNAi的话，则部分双链RNA在双链部分一端或两端可包含短 单链突出端。所述双链RNA还可包含内部非互补区。
本发明的方法包括向同一昆虫同时或依次提供两种或更多种不同的双 链RNA或RNA构建体，从而实现下调或抑制多个靶基因或者更有效地抑 制单个靶基因。
或者，所提供的命中多个靶序列的一种双链RNA可命中多个靶标， 并且多于一个拷贝的对应于靶基因的双链RNA片段可更有效地抑制该单 靶标。因此，在本发明的一个实施方案中，所述双链RNA构建体包含多 个dsRNA区域，每个dsRNA区域的至少一条链包含与昆虫靶基因靶标核 苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。根据本发明，所述RNA构建 体中的dsRNA区域可以互补于相同或不同靶基因和/或所述dsRNA区域可 互补于来自相同或不同昆虫物种的靶标。
术语“命中”表明dsRNA的至少一条链互补于靶基因或核苷酸序列并 因此可以与之结合。
在一个实施方案中，所述双链RNA区域包含多拷贝的与靶基因互补 的核苷酸序列。或者，所述dsRNA命中同一靶基因的多于一种靶序列。 因此，本发明包括分离的双链RNA构建体，其包含至少两拷贝的与昆虫 靶标的核苷酸序列至少一部分互补的所述核苷酸序列。
在本文中，本发明的术语“多种(个)”意指至少2种(个)、至少3 种(个)、至少4种(个)、至少5种(个)、至少6种(个)等。
“又一靶基因”或“至少一种其它靶基因”指例如第二、第三或第四种靶 基因等。
在本发明的方法中开发和使用了命中多于一种上述靶标的dsRNA或 者针对不同上述靶标的不同dsRNA的组合。
因此，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含至少两拷贝的以 下至少一种核苷酸序列的RNA等价物: SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173， 178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至 472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099， 1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039， 2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104， 2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，或者其长度至少为17个碱基对，优选其 长度至少为18、19、20或21，更优选至少22、23或24个碱基对之片段 的RNA等价物的至少两个拷贝。优选地，所述双链RNA包含核苷酸序列 SEQ ID NO 159或160的RNA等价物，或者其长度为至少17，优选至少 18、19、20或21，更优选至少22、23或24个碱基对的片段。在又一实施 方案中，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含至少两拷贝的核苷 酸序列SEQ ID NO 159或160的RNA等价物。
因此，本发明提供了本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互 补链，其中一条链包含与昆虫靶基因靶标核苷酸序列的至少一部分互补的 核苷酸序列，并且其包含彼此独立选择的至少两种核苷酸序列的RNA等 价物。在一个实施方案中，所述dsRNA包含独立选自以下序列的至少两 种，优选至少三种、四种或五种核苷酸序列的RNA等价物:
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253， 255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700， 1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090， 2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481， 或者其长度为至少17个碱基对的片段，优选其长度为至少18、19、20或 21，更优选至少22、23或24个碱基对的片段。
所述至少两种核苷酸序列可以来源于本文所述的靶基因。根据一个优 选的实施方案，所述dsRNA命中至少一种对于昆虫生存、生长、发育或 繁殖是必需的靶基因，并且命中至少一种涉及上文所述的致病性或侵染性 的基因。或者，所述dsRNA命中属于同一种类的多种基因，例如所述 dsRNA命中至少两种必需基因或至少两种参与同一细胞功能的基因。根据 又一实施方案，所述dsRNA命中至少两种靶基因，该靶基因涉及不同的 细胞功能。例如，所述dsRNA命中参与蛋白质合成(例如核糖体亚基)、 细胞内蛋白质运输、细胞核mRNA剪接或参与表1A中所述功能之一的两 种或更多种基因。
优选地，本发明提供了本文所述的方法，其中所述昆虫靶基因包含选 自以下的序列:
(i)与以下任意序列具有至少75％一致性的序列:SEQ ID NO
1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任意序列的至少17个连续核苷酸的序列:SEQ ID NO 1、 3、5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列中至少17个连续核苷 酸的基因的昆虫直系同源物:SEQ ID NO 49至158、275至472、533至 575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、 2120至2338、2384至2460或其互补序列。
所述双链RNA中的dsRNA区域(或片段)可如下进行组合:
a)当组合靶向单个靶基因的多个dsRNA区域时，在RNA构建体中可以 以原始的顺序(即，该区域在靶基因中出现的顺序)对它们进行组合，
b)或者，可以不管所述片段的原始顺序如何，将它们随机或有意地以任 何顺序组合成双链RNA构建体，
c)或者，单个片段可以在所述dsRNA构建体中重复若干次，例如1～10 次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或者
d)所述dsRNA区域(靶向单个或不同的靶基因)可以以有义或反义的方 向进行组合。
另外，所述待组合的靶基因可选自一种或多种如下类型的基因:
e)上述的“必需”基因或“致病性基因”包括对于一种或多种靶标昆虫来说很 关键，并且被沉默时导致致死或严重的(例如，进食、繁殖、生长)表型 的基因。选择强致死靶基因导致有效的RNAi作用。在本发明的RNA构 建体中，靶向相同或不同(非常有效的)致死基因的多个dsRNA区域可 以进行组合以进一步增强RNAi作用在防治害虫中的效力、功效或速度。
f)“弱”基因包括在本文所述的细胞途径之一中具有特别关注的功能，但是 当其被单独沉默时导致弱的表型作用的靶基因。在本发明的RNA构建体 中，靶向单个或不同的弱基因的多个dsRNA区域可以进行组合从而获得 更强的RNAi作用。
g)“昆虫特异性”基因包括在非昆虫生物中没有显著的同源性对应物的基 因，其可以通过生物信息同源性搜索进行测定，例如通过BLAST搜索。 选择昆虫特异性靶基因使得RNAi作用具有物种特异性，而在非靶标生物 中没有作用或没有显著的(有害)作用。
h)“保守基因”包括在靶标生物和非靶标生物之间(在氨基酸水平)保守 的基因。为了降低对于非靶标物种的可能的作用，分析这些有效但保守的 基因，并且选择来自这些保守基因可变区域的靶序列被RNA构建体中的 dsRNA区域所靶向。此时，在核酸序列水平上评估保守性。因此，在核酸 序列水平上，这些可变区域包含保守靶基因中的最不保守部分。
i)“保守途径”基因包括参与同样生物学途径或细胞过程的基因，或者包括 在不同昆虫物种中具有相同功能的基因，其导致特异性且有效的RNAi作 用并更有效地防治昆虫；
j)或者，本发明的RNA构建体靶向多个来自不同生物学途径的基因，其 导致更广泛的细胞RNAi作用并更有效地防治害虫。
根据本发明，所有双链RNA区域包含至少一条与本文所述任何靶基 因至少一部分核苷酸序列互补的链。然而，如果其中一个双链RNA区域 包含至少一条与本文所述任一靶基因的核苷酸序列一部分互补的链，则其 它双链RNA区域可包含至少一条与任何其它昆虫靶基因(包括已知的靶 基因)的一部分互补的链。
根据本发明的另一实施方案，提供了本文所述的分离的双链RNA或 RNA构建体，其还包含至少一种附加序列以及任选地包含接头。在一个实 施方案中，所述附加序列选自:(i)有利于大规模生产dsRNA构建体的 序列；(ii)导致所述dsRNA稳定性增加和降低的序列；(iii)允许蛋白 质或其它分子的结合从而有利于昆虫吸收所述RNA构建体的序列；(iv) 适体序列(aptamer)，其结合昆虫表面上或细胞质中的受体或分子，从 而有利于昆虫的摄取、胞吞和/或转胞吞；或者(v)催化dsRNA区域加工 的其它序列。在一个实施方案中，所述接头是条件性自切割RNA序列， 优选pH敏感性接头或疏水敏感性接头。在一个实施方案中，所述接头是 内含子。
在一个实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域通过 一个或多个接头进行连接。在另一实施方案中，所述接头存在于RNA构 建体中的某位点，其将所述dsRNA区域与另一目的区域分隔开。本发明 提供了dsRNA构建体的不同接头类型。
在另一实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域在不 使用接头的情况下连接。
在本发明的一个具体实施方案中，所述接头可用于在害虫中拆分成 多个较小的dsRNA区域。有利的是，在此情况下，所述接头序列可以在 特定的条件下促使将长的dsRNA分成较小的dsRNA区域，这导致在这些 条件下释放出分开的dsRNA区域并通过这些较小dsRNA区域导致更有效 的基因沉默。适当的条件性自切割接头的实例是在高pH条件下自切割的 RNA序列。这些RNA序列的适当实例由Borda等(Nucleic Acids Res.2003 May 15；31(10):2595-600)描述，该文献通过参考并入本文中。这些序列 源于锤头核酶HH16的催化核心。
在本发明的另一方面，接头定位于RNA构建体中的位点，这使得 dsRNA区域与另一(例如其它的)目的序列分隔，所述另一序列优选地向 所述RNA构建体提供了某种另外的功能。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的dsRNA构建体具有适体 从而有利于昆虫摄取该dsRNA。设计所述适体使之结合被昆虫所吸收的物 质。这样的物质可以来自昆虫或植物。一个具体的适体实例是结合跨膜蛋 白(例如，昆虫的跨膜蛋白)的适体。或者，所述适体可以结合昆虫吸收 的(植物)代谢物或营养物。
或者，所述接头在内涵体中进行自我切割。这在本发明的构建体通 过胞吞作用或转胞吞作用被昆虫吸收并因此在昆虫的内涵体中被区室化 时可能是有利的。所述内涵体可以具有低pH环境，导致所述接头的切割。
当用于经由细胞壁转运从一个细胞转运到另一个细胞时，例如当穿 过害虫细胞壁时，在疏水条件中自切割的上述接头对于本发明的dsRNA 构建体尤其有用。
内含子也可用作接头。本文使用的“内含子”可以是信使RNA的任何 非编码RNA序列。用于本发明的构建体的特别适合的内含子序列为(1) 富含U(35-45％)；(2)平均长度为100bp(在约50和约500bp之间变 化)，可随机选择其碱基对或者可以基于已知的内含子序列；(3)在5’ 端以-AG:GT-或-CG:GT-起始，和/或(4)在其3’端为-AG:GC-或-AG:AA。
非互补的RNA序列(约1个碱基对至约10,000个碱基对)也可用 作接头。
不希望拘泥于任何具体的理论或机制，人们认为昆虫从其直接环境 吸收长的双链RNA。然后，吸收进入肠道并转移至肠上皮细胞的双链RNA 通过内源核酸内切酶的作用在细胞内加工成为短的双链RNA(称为小干扰 RNA(siRNA))。然后，得到的siRNA通过形成多组分的RNA酶复合物 (称为RISC或RNA干扰性沉默复合物)来介导RNAi。
为了实现在昆虫细胞内下调靶基因，加至细胞壁外部的双链RNA可 以是任何可被吸收进入细胞然后在细胞内加工成siRNA的dsRNA或 dsRNA构建体，然后所述siRNA介导RNAi，或者加至细胞外部的RNA 可以本身是可被吸收进入细胞并由此指导RNAi的siRNA。
siRNA通常是短的双链RNA，其长度范围为19～25个碱基对，或 20～24个碱基对。在一些优选的实施方案中，可使用对应于待下调靶基因 的siRNA，其具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对，尤其是21 或22个碱基对。然而，本发明不意在限于这些siRNA的用途。
siRNA可以在双链部分两侧的一端或两端包含单链突出端。在一个 特别优选的实施方案中，所述siRNA可包含3’突出的核苷酸，优选两个3’ 突出的胸苷(dTdT)或尿苷(UU)。如果紧接所述dsRNA双链部分所包 含序列上游的靶基因序列是AA，则在siRNA中可包含3’TT或UU突出 端。这使得siRNA中的突出端TT或UU与靶基因杂交。尽管所述siRNA 的另一端也可包含3’TT或UU突出端，然而所述siRNA双链部分所包含 序列的下游靶序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA嵌合体 形式的siRNA也涵盖其中。这些嵌合体包括这样的siRNA，其中包含带有 3’DNA碱基突出端(例如，dTdT)的双链RNA(如上所述)，以及其中 一个或多个RNA碱基或核糖核苷酸、或者甚至整条链上所有的核糖核苷 酸被替换为DNA碱基或脱氧核糖核苷酸的多核苷酸形式的双链RNA。
所述dsRNA可由通过(非共价)碱基配对一起退火的两个独立的(有 义和反义)RNA链形成。或者，所述dsRNA可具有折回的茎-环或发夹结 构，其中所述dsRNA的两条退火链是共价连接的。在该实施方案中，所 述dsRNA的有义和反义链由部分自我互补的单个多核苷酸分子的不同区 域形成。如果dsRNA欲通过体内表达(例如如下所述在宿主细胞或生物 中)或通过体外转录进行合成，则具有该结构的RNA是适宜的。除了不 应该削弱所述分子的双链部分介导RNAi的能力以外，连接两条RNA链 的“环”的精确性质和序列通常对于本发明不重要。用于RNAi中的“发夹” 或“茎-环”RNA的特征通常是本领域已知的(参见，例如CSIRO名下的 WO99/53050，其内容通过参考并入本文中)。在本发明的另一些实施方 案中，所述环结构可以包含接头序列或如上所述的另一些序列。
本发明的另一方面是本文公开的昆虫靶基因的靶标核苷酸序列。所 述靶标核苷酸序列对于设计本发明的dsRNA构建体尤其重要。这些靶标 核苷酸序列的长度优选至少17，优选至少18、19、20或21，更优选至少 22、23或24个核苷酸。优选靶标核苷酸序列的非限制性实例在实施例中 给出。
根据一个实施方案，本发明提供了编码如上所述的双链RNA或双链 RNA构建体的分离的核苷酸序列。
根据一个更具体的实施方案，本发明涉及由以下任意序列组成的分 离的核酸序列:SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、621至767、 813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384 至2460，或者其至少17，优选至少18、19、20或21，更优选至少22、23 或24个核苷酸的片段。
本领域技术人员能够认识到，也可以找到这些靶基因的同源物并且 这些同源物也可用于本发明的方法。
如果蛋白质或核苷酸序列显示“显著”水平的序列相似性或更优选地 序列一致性，则它们可能是同源的。真正同源的序列通过从共同的祖先基 因趋异从而具有相关性。序列同源物可以有两种类型:(i)当同源物存在 于不同物种中时，它们被称为直系同源物(orthologue)。例如，小鼠和 人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物(paralogue)是在 一个物种内部的同源基因，例如小鼠中的α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物。
优选的同源物是包含与选自以下的序列具有至少约85％或87.5％， 更优选约90％，更优选至少约95％以及最优选至少约99％一致性的基因: SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275 至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099， 1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039， 2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104， 2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，
或其互补序列。用于测定序列一致性的方法是本领域常规技术，其包括使 用Blast软件和EMBOSS软件(The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)，Rice.P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277)。本文使用的术语“一致性”是指多个序列在核 苷酸水平上的关系。通过使用比较窗对最优比对的序列(例如，两条或更 多)进行比较来确定“一致性百分比”，其中比较窗中的序列部分与用于最 优序列比对的参考序列相比可包含插入或缺失。所述参考序列不包含插入 或缺失。所述参考窗选自至少10个连续的核苷酸至约50、约100或者至 约150个核苷酸，优选在约50和150个核苷酸之间。然后，通过测定所述 窗中序列之间一致的核苷酸数并将一致的核苷酸数除以所述窗中的核苷 酸数并乘以100来计算“一致性百分比”。
另一些同源物是包含以下任意序列之基因的等位基因: SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160- 163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255， 257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576， 581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797， 799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046， 1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093， 1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582， 1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657， 1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702， 1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368， 2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481。
另一些优选的同源物是与包含以下任意序列的基因相比包含至少一个单 核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNIP)的基因:
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21， 23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247， 249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087， 1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571， 1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642， 1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696， 1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080， 2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359， 2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481.
根据另一实施方案，本发明包括包含以下任意核苷酸序列的基因的 昆虫直系同源物靶基因:SEQ ID NO
1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193， 198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483， 488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873， 878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075， 1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105， 1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612， 1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684， 1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050， 2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至 2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466， 2471，2476或2481。
举例来说，直系同源物可包括以下任意核苷酸序列:SEQ ID NO 49至123、 275至434、533至562、621至738、813至852、908至1010、1161至1437、 1730至1987、2120至2290和2384至2438，或者其至少17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。表4中给出包含本发明 序列之一的至少一个17bp片段的昆虫或蛛形纲直系同源物基因或序列的 非限制性列表。
根据另一实施方案，本发明包括包含以下任意核苷酸序列的基因的 线虫直系同源物靶基因:1、3、 5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493， 498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609， 621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883， 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476或248。举例来说，线虫直系同源物可包含以下任意核苷酸序列:SEQ ID NO 124至135、435至446、563至564、739至751、853、854、1011 至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或2440，或者 其至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明因 此包括本文所述的用于防治线虫在生物中生长或者用于防止线虫侵害对 线虫侵染敏感的生物的任何方法，该方法包括使线虫细胞与双链RNA接 触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与包含以下 任意序列的至少17、18、19、20或21个核苷酸之片段的靶基因核苷酸序 列之至少一部分互补的核苷酸序列:SEQ ID NO 124至135、435至446、 563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、1988至 2001、2291至2298、2439或2440，所述双链RNA被线虫吸收并因此防 治生长或防止侵害。本发明还涉及包含以下任意序列的至少17、18、19、 20或21个核苷酸之片段的线虫抗性转基因植物:SEQ ID NO 124至135、 435至446、563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、 1988至2001、2291至2298、2439或2440。表5中给出包含本发明序列之 一的至少一个17bp片段的线虫直系同源物基因或序列的非限制性列表。
根据另一实施方案，本发明包括包含以下任意核苷酸序列的基因的 真菌直系同源物靶基因:1，3，5，7 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208， 215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498， 503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079， 1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109， 1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622， 1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688， 1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060， 2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339， 2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或 2481。举例来说，真菌直系同源物可包含以下任意核苷酸序列:SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、 1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460，或者其至少17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。根据另一 方面，本发明因此包括本文所述的用于防治真菌在细胞或生物上生长或者 用于防止真菌侵害对真菌感染敏感的细胞或生物的任何方法，该方法包括 将真菌细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其 中一条链包含与包含以下任意序列的至少17、18、19、20或21个核苷酸 之片段的靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列:SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、 1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460，所述双链RNA 被真菌吸收并因此防治生长或防止侵害。本发明还涉及包含以下任意序列 的至少17、18、19、20或21个核苷酸之片段的真菌抗性转基因植物:SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026 至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460。表6 中给出包含本发明序列之一的至少一个17bp片段的真菌直系同源物基因 或序列的非限制性列表。
在本发明的一个优选实施方案中，所述dsRNA可通过宿主细胞或宿 主生物表达(例如，在其中进行转录)，所述宿主细胞或生物是对昆虫侵 害敏感或易受其攻击的生物。在该实施方案中，RNAi介导的昆虫中一种 或多种靶基因的基因沉默可用作防治宿主生物中或宿主生物上生长的昆 虫和/或防止或降低昆虫侵害所述宿主生物的机制。因此，在宿主生物的细 胞内表达所述双链RNA可赋予对特定昆虫或者一类昆虫的抗性。如果所 述dsRNA命中多于一种昆虫靶基因，则所述双链RNA在宿主生物细胞内 的表达可赋予对多于一种昆虫或者多于一类昆虫的抗性。
在一个优选的实施方案中，所述宿主生物是植物，所述昆虫是植物 病原性昆虫。在该实施方案中，通过在植物或植物细胞中表达双链RNA 而使所述昆虫与双链RNA接触，所述植物或植物细胞被所述植物病原性 昆虫侵害或对该侵害敏感。
在本文中，术语“植物”包括期望对其进行处理从而防止或降低昆虫 生长和/或昆虫侵害的任何植物材料。这包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖 材料(如种子、插条、接穗、外植体等)等以及植物细胞和组织培养物。 所述植物材料应该表达或者有能力表达对应于所述昆虫一种或多种靶基 因的dsRNA。
因此在另一方面，本发明提供了表达或能够表达至少一种双链RNA 的植物(优选转基因植物)或(转基因)植物的增殖或繁殖材料或植物细 胞培养物，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条链具有与昆 虫靶基因靶标核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，从而所述双链 RNA通过植物-昆虫的相互作用被昆虫吸收，所述双链RNA能够通过RNA 干扰抑制所述靶基因或者下调所述靶基因的表达。所述靶基因可以是本文 所述的任何靶基因，例如对昆虫的生存、生长、发育或繁殖必需的靶基因。
在该实施方案中，所述昆虫可以是任何昆虫，然而优选植物病原性 昆虫。优选的植物病原性昆虫包括但不限于以上所列出的昆虫。
本发明的方法中使用的植物或者本发明的转基因植物包括任何植 物，然而优选对植物病原性昆虫侵害敏感的植物。
因此，本发明提供了本文所述的方法，其中所述植物选自以下植物 (或作物):苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、油梨、香蕉、大麦、豆、 甜菜、黑莓、蓝莓、青花菜、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜(canola)、 胡萝卜、木薯、花椰菜、谷类(a cereal)、芹菜、樱桃、柑桔、克莱蒙汀 小柑橘(clemintine)、咖啡树、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、 无花果、葡萄、葡萄柚、花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、莱姆酸 橙、松树、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麦(nut aot)、菜秋葵、 洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、豌豆、 胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、 油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大豆(soy)、大豆(soybean)、菠菜、 草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、橘子、茶树、烟草、番茄、藤本 植物、西瓜、小麦、山药以及密生西葫芦。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的方法，其中所述植物 是马铃薯，所述靶基因是来自选自下列的昆虫的基因:马铃薯叶甲属(例 如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或L.texana)、合爪负泥虫属(例如，三 条负泥虫)、茄跳甲属(例如，美国马铃薯跳甲或块茎跳甲)、豆芫菁属 (例如，北美豆芫菁)、猿叶甲属(例如，辣根猿叶甲)、绿小叶蝉属(例 如，蚕豆小绿叶蝉)、瘤蚜属(例如，桃蚜)、薯个木虱属(例如，马铃 薯木虱)、杆野螟属(例如，玉米螟)、Conoderus spp.(例如，C.falli 或C.vespertinus)和麦蛾属(例如，马铃薯麦蛾)；在另一实施方案中， 本发明提供了本文所述的方法，其中所述植物是番茄，所述靶基因是来自 选自下列的昆虫的基因:长管蚜属(例如，大戟长管蚜)、瘤蚜属(例如， 桃蚜)，结翅粉虱属(例如，温室粉虱或结翅粉虱)、小粉虱属(例如， 银叶粉虱)、花蓟马属(例如，西方花蓟马)、马铃薯叶甲属(例如，马 铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或L.texana)、茄跳甲属(例如，烟草跳甲)、 草盲蝽属(例如，美国牧草盲蝽或L.hesperus)、美洲蝽属(例如，斑点 美洲蝽)、绿蝽属(例如，稻绿蝽)、Thyanta spp.(例如，T.pallidovirens)、 麦蛾属(例如，马铃薯麦蛾)、Helicoverpa spp.(例如，谷实夜蛾)、Keiferia spp.(例如，K.lycopersicella)、灰翅夜蛾属(例如，甜菜夜蛾或S.praefica)、 Limonius spp.(捻转血矛线虫)、地虎属(例如，小地老虎)、Manduca spp. (例如，烟草天蛾或番茄天蛾)、斑潜蝇属(例如，蔬菜斑潜蝇(L.sativae)、 三叶草斑潜蝇(L.trifolli)或南美斑潜蝇(L.huidobrensis))和薯个木虱 属(例如，马铃薯木虱)；在另一实施方案中，本发明提供了本文所述的 方法，其中所述植物是玉米，所述靶基因是来自选自下列的昆虫的基因: Diabrotica spp.(例如，玉米根叶甲、巴氏根叶甲、黄瓜十一星叶甲、D. virgifera zeae、D.balteata)、杆野螟属(例如，玉米螟)、地虎属(例如， 小地老虎)、Helicoverpa spp.(例如，谷实夜蛾)、灰翅夜蛾属(例如， 草地贪夜蛾)、Diatraea spp.(例如，西南玉米杆草螟或小蔗螟)、 Elasmopalpus spp.(例如，南美玉米苗斑螟)、梳爪叩头虫属(捻转血矛 线虫)、圆头犀金龟属(例如，C.immaculata)、弧丽金龟属(例如，日 本弧丽金龟)、跳甲属(例如，玉米铜色跳甲)、龙颈象属(例如，玉米 长喙象)、缢管蚜属(例如，玉米蚜)、圆尾蚜属(例如，A.maidiradicis)、 杆长蝽属(例如，美洲谷杆长蝽)、黑蝗属(例如，红足黑蝗、迁飞黑蝗)、 种蝇属(例如，种蝇)、潜蝇属(例如，A.parvicornis)、呆蓟马属(例 如，黄呆蓟马)、Solenopsis spp.(例如，S.milesta)和叶螨属(Tetranychus spp.)(例如，二点叶螨(T.urticae)；在另一实施方案中，本发明提供 了本文所述的方法，其中所述植物是棉花，所述靶基因是来自选自下列的 昆虫的基因:Helicoverpa spp.(例如，谷实夜蛾)、Pectinophora spp.(例 如，红铃麦蛾)、Helicoverpa spp.(例如，棉铃虫)、金刚钻属(例如， 翠纹钻夜蛾)、实夜蛾属(例如，烟芽夜蛾)、灰翅夜蛾属(例如，甜菜 夜蛾)、花象属(例如，棉铃象甲)、Pseudatomoscelis spp.(例如，棉伪 斑腿盲蝽)、结翅粉虱属(例如，结翅粉虱、温室粉虱)、小粉虱属(例 如，银叶粉虱)、蚜属(例如，棉蚜)、草盲蝽属(例如，美国牧草盲蝽 或L.hesperus)、美洲蝽属(例如，斑点美洲蝽)、Chlorochroa spp.(例 如，赛氏蝽)、绿蝽属(例如，稻绿蝽)、蓟马属(例如，烟蓟马)、花 蓟马属(例如，烟褐蓟马或西方花蓟马)、黑蝗属(例如，红足黑蝗、特 异黑蝗)和叶螨属(例如，朱砂叶螨或二点叶螨)；在另一实施方案中， 本发明提供了本文所述的方法，其中所述植物是稻，靶基因是来自选自下 列的昆虫的基因:褐飞虱属(例如，褐飞虱)、灰飞虱属(例如，灰飞虱)、 黑尾叶蝉属(例如，二点黑尾叶蝉，或黑尾叶蝉或二条黑尾叶蝉)、白背 飞虱属(例如，白背飞虱)、杆长蝽属(例如，美洲谷杆长蝽)、黑蝽属 (例如，S.vermidulate)、绿蝽属(例如，拟绿蝽)、稻弄蝶属(例如， 直纹稻弄蝶)、禾草螟属(例如，二化螟、台湾稻螟或C.polychrysus)、 禾草螟属(例如，C.polychrysa)、蛀茎夜蛾属(例如，稻蛀茎夜蛾)、 蛀禾螟属(例如，T.innotata)、蛀禾螟属(例如，三化螟)、纵卷叶野 螟属(例如，稻纵卷叶野螟)、潜蝇属(例如，日本稻潜蝇)、Diatraea spp. (例如，小蔗螟)、Narnaga spp.(例如，N.aenescens)、黄夜蛾属(例 如，犁纹黄夜蛾)、灰翅夜蛾属(例如，草地贪夜蛾)、秘夜蛾属(例如， Mythmna(Pseudaletia)seperata)、Helicoverpa spp.(例如，谷实夜蛾)、 Colaspis spp.(例如，C.brunnea)、稻水象属(例如，稻水象甲)、稻象 属(例如，稻象)、Diclodispa spp.(例如，D.armigera)、禾谷负泥虫属 (例如，水稻负泥虫)、米象属(Sitophilus spp.)(例如，米象(S.oryzae))、 Pachydiplosis spp.(例如，稻瘿蚊)、水蝇属(例如，麦叶毛眼水蝇)、 Chlorops spp.(例如，稻杆潜蝇)和水蝇属(例如，日稻毛眼水蝇)。
本发明的转基因植物延及所有如上具体所述的植物种类，其对各自 如上具体所述的昆虫物种有抗性。优选的转基因植物(或者转基因植物的 繁殖或增殖材料，或者培养的转基因植物细胞)是包含选自以下核酸序列 的植物(或者转基因植物的繁殖或增殖材料，或者培养的转基因植物细 胞):
(i)与以下任何序列具有至少75％一致性的序列:SEQ ID NO
1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任何序列的至少17个连续核苷酸的序列:SEQ ID NO 1、3、 5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者其中所述核酸是包含以下任意序列的至少17个连续核苷酸的基 因的昆虫直系同源物:SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至 2338、2384至2460，或其互补序列。
本发明还包括表达或能够表达至少一种本发明核苷酸的植物(或者 转基因植物的殖或增殖材料，或者培养的转基因植物细胞)，所述至少一 种本发明核苷酸例如至少一种以下任意核苷酸序列:
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49 至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247， 249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517， 519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778， 783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896， 908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083， 1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161 至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637， 1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694， 1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075， 2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，
或其互补序列，或者包括包含其至少17，优选至少18、19、20或21，更 优选至少22、23或24个核苷酸的片段。
所述植物可以以下述形式提供，其中它在一种或多种细胞、细胞类 型或组织中活跃表达(转录)所述双链RNA。或者，所述植物可以“能够 表达”，意指其被编码所需dsRNA的转基因进行了转化，但是当提供该植 物时(以及在提供该植物的形式中)该转基因在所述植物中没有活性。
因此，根据另一实施方案，提供一种重组DNA构建体，其包含编码 本发明的dsRNA或dsRNA构建体的核苷酸序列，该核苷酸序列有效地与 至少一种调节序列连接。优选地，所述调节序列选自如下所述的组成性启 动子或组织特异性启动子。
所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因。优选地，所述调节元件 是在植物细胞中具有活性的调节元件。更优选地，所述调节元件源自植物。 术语“调节序列”应作广义理解，并且指能够实现与其有效连接的序列表达 的调节性核酸。
上述术语中包括激活或增强核酸表达的启动子和核酸或其合成的融 合分子或衍生物，称为激活子(activator)或增强子。本文使用的术语“有 效地连接”是指在启动子序列和目的基因之间的功能性连接，使得所述启动 子序列能够起始目的基因的转录。
举例来说，可将编码所述双链RNA的转基因核苷酸序列置于诱导型 或者生长或发育阶段特异性的启动子的控制下，通过加入针对诱导型启动 子的诱导物或者到达特定的生长或发育阶段时，该启动子允许起始dsRNA 转录。
或者，编码所述双链RNA的转基因置于例如选自包括任何以下的强 组成性启动子的控制下:CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子、泛素 启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、GOS2 启动子、玄参花叶病毒(FMV)34S启动子、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV) 启动子(Verdaguer B.et al，Plant Mol Biol.1998 37(6):1055-67)。
或者，编码所述双链RNA的转基因置于选自任何以下的组织特异性 启动子的控制下:编码III型PsMTA几丁质酶基因的根特异性启动子、光 合组织特异性启动子(如cab1和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LS1蛋 白的启动子)、JAS启动子、查耳酮合酶启动子以及来自草莓RJ39的启 动子。
在另一实施方案中，编码所述双链RNA的转基因置于昆虫诱导型启 动子的控制下，例如马铃薯蛋白酶抑制因子II(PinII)启动子(Duan X et al，Nat Biotechnol.1996，14(4):494-8)；或愈伤诱导型启动子，例如茉莉酸 和乙烯诱导型启动子、PDF1.2启动子(Manners JM et al.，Plant Mol Biol. 1998，38(6):1071-80)；或者置于防御相关的启动子控制下，例如水杨酸 诱导型启动子和植物致瘤相关蛋白(PR蛋白)启动子(PR1启动子 (Cornelissen BJ et al.，Nucleic Acids Res.1987，15(17):6799-811))， COMT启动子(Toquin V et al，Plant Mol Biol.2003，52(3):495-509)。
另外，当使用本发明的方法用于开发对昆虫具有抗性的转基因植物 时，将编码本发明所述双链RNA的核酸置于组织特异性启动子的控制下 可能是有利的。为了改善所述dsRNA从植物细胞向害虫的转移，所述植 物可优选在植物害虫首先接触或破坏的植物部分表达所述dsRNA。对于植 物病原性昆虫来说，优选的表达所述dsRNA的组织是叶、茎、根和种子。 因此，在本发明的方法中，可使用植物组织特异性启动子，如叶特异性启 动子、茎特异性启动子、韧皮部特异性启动子、木质部特异性启动子、根 特异性启动子或种子特异性启动子(蔗糖转运蛋白基因AtSUC启动子 (Baud S et al.，Plant J.2005，43(6):824-36)、小麦高分子量麦谷蛋白基因 启动子(Robert LS et al.，Plant Cell.1989，1(6):569-78.))。根特异性启动 子的适当实例是PsMTA(Fordam-Skelton，A.P.，et al.，1997 Plant Molecular Biology 34:659-668.)和III型几丁质酶启动子。叶和茎特异性 或光合组织特异性的启动子(其也被光活化)的实例是来自糖用甜菜的两 种叶绿素结合蛋白(cab1和cab2)(Stahl D.J.，et al.，2004 BMC Biotechnology 2004 4:31)、rbcS编码的核酮糖-二磷酸羧化酶(Rubisco) (Nomura M.et al.，2000 Plant Mol.Biol.44:99-106)、叶绿体甘油醛-3- 磷酸脱氢酶的A(gapA)和B(gapB)亚基(Conley T.R.et al.1994 Mol. Cell Biol.19:2525-33；Kwon H.B.et al.1994 Plant Physiol.105:357-67)的 启动子，编码叶和茎特异性(ST-LS1)蛋白的马铃薯基因的启动子(Zaidi M.A.et al.，2005 Transgenic Res.14:289-98)、茎调节性、防御诱导型基因 启动子，如JAS启动子(专利公开号20050034192/US-A1)。花特异性启 动子的实例例如查耳酮合酶启动子(Faktor O.et al.1996 Plant Mol.Biol. 32:849)以及果实特异性启动子的实例例如来自草莓的RJ39(WO 98 31812)。
在本发明的另一些实施方案中，使用对表达dsRNA有用的另一些启 动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶 III、T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的启动子。这些启动子通常用于 体外产生dsRNA，然后将所述dsRNA包含在抗杀虫剂中，例如在抗杀虫 剂液体、喷雾或粉末中。
因此，本发明还包括用于产生任何本发明的双链RNA或RNA构建 体的方法。该方法包括以下步骤:
a.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分进行接触； 或者
b.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体引入(例如，通过转化、 转染或注射)到细胞中，
以上步骤在允许所述核酸或重组DNA构建体转录从而产生所述 dsRNA或RNA构建体的条件下进行。
任选地，还可以将一种或多种转录终止序列加入到本发明的重组构 建体中。术语“转录终止序列”包含转录单元末端的控制序列，其指示原初 转录物的3’加工和聚腺苷酸化以及转录终止。所述表达构建体中还可引入 另一些调节元件(如转录或翻译增强子)。
本发明的重组构建体还可包括复制起点，其是在特定细胞类型中维 持和/或复制所需的。一个实例是在需要表达构建体作为细胞中游离型遗传 元件(例如，质粒或粘粒分子)维持在细菌细胞中。优选的复制起点包括 但不限于f1-ori和colE1 ori。
所述重组构建体任选地可包含选择标记基因。本文使用的术语“选择 标记基因”包括赋予细胞表型的任何基因，其中它与本发明的表达构建体一 起表达以利于鉴定和/或选择其转染或转化的细胞。适当的选择标记的实例 包括抗氨苄青霉素的基因(Ampr)、抗四环素的基因(Tcr)、抗卡那霉 素的基因(Kanr)、抗草丁膦的基因和抗氯霉素的基因(CAT)。另一些 适当的标记基因提供了代谢性状，例如manA。还可使用可见的标记基因， 其包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
已用编码所述dsRNA的转基因稳定转化的植物可以以并不主动表 达所述dsRNA但具有该能力的种子、繁殖材料、增殖材料或细胞培养材 料的形式提供。
因此，本发明包括植物(例如，稻)或种子(例如，稻种)或细胞 (例如细菌细胞或植物细胞)，其包含如上所述的至少一种双链RNA或 至少一种双链RNA构建体；或者如上所述的至少一种核苷酸序列或至少 一种重组DNA构建体；或者如上所述的至少一种植物细胞。本发明还包 括植物(例如，苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、油梨、香蕉、大麦、豆、 甜菜、黑莓、蓝莓、青花菜、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、 木薯、花椰菜、谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱蒙汀小柑橘(clemintine)、 咖啡树、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、 花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、 甜瓜、小米、蘑菇、燕麦、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番 木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、 石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大 豆(soy)、大豆(soybean)、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、 橘子、茶树、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或密生西葫芦； 优选马铃薯、茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗、稻米或棉花植物)，或者 种子或块茎(例如，苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、油梨、香蕉、大麦、 豆、甜菜、黑莓、蓝莓、青花菜、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝 卜、木薯、花椰菜、谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱蒙汀小柑橘、咖啡树、 玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、花生、 醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、甜瓜、 小米、蘑菇、燕麦、菜秋葵、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、 豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃 薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大豆、大豆、 菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、橘子、茶树、烟草、番茄、藤 本植物、西瓜、小麦、山药或密生西葫芦；优选马铃薯、茄子、番茄、胡 椒、烟草、醋栗、稻、玉米或棉籽或块茎)，或细胞(例如，细菌细胞或 植物细胞)，其包含本文所述的至少一种双链RNA或至少一种双链RNA 构建体；或者本文所述的至少一种核苷酸序列或至少一种重组DNA构建 体。优选地，这些植物或种子或细胞包含重组构建体，其中编码本发明的 dsRNA或dsRNA构建体的核苷酸序列与如上所述的至少一种调节元件有 效连接。
所述植物可以以如下形式提供，其中它在一种或多种细胞、细胞类 型或组织中主动表达(转录)所述RNA分子。或者，所述植物可以“能够 表达”，意指其被编码期望RNA分子的转基因所转化，但是当提供植物时 (以及在提供植物的形式中)该转基因在所述植物中没有活性。
在一个具体的实施方案中，提供了重组的(表达)构建体用于在植 物中或在植物细胞中表达RNA分子，所述植物或植物细胞中包含与核酸 分子有效地连接的至少一种调节序列，所述核酸分子包含以下序列的至少 14、15、16、17、18、19、20、21、22等个核苷酸，直至所有核苷酸:SEQ ID NO 1，3， 5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873， 878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602， 1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677， 1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040， 2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106， 2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460， 2461，2466，2471，2476，2481或2486，或者包含来自不同靶标物种的直系同源核 酸分子序列的至少14、15、16、17、18、19、20、21、22个等直至所有的 核苷酸。很多载体可用于此目的，适当载体的选择将主要取决于待插入该 载体的核酸的大小以及待用该载体转化的特定宿主细胞。
用于为RNAi目的而在植物中表达外源双链RNA的一般性技术在本 领域是已知的(参见Baulcombe D，2004，Nature.431(7006):356-63.RNA silencing in plants，其内容通过参考并入本文中)。更具体地，用于为在植 物害虫(如线虫或昆虫)中下调基因表达目的而在植物中表达双链RNA 的方法也是本领域已知的。可以以类似的方式应用类似的方法，从而为在 植物病原性昆虫中下调靶基因表达的目的而在植物中表达双链RNA。为了 实现该效果，仅仅需要所述植物在直接接触昆虫的植物部分表达(转录) 所述双链RNA，从而所述双链RNA可以被昆虫吸收。取决于昆虫及其与 宿主植物的关系，dsRNA的表达可以发生在植物的细胞或组织内，其中所 述昆虫在其生活史中也存在于所述植物的细胞或组织中，或者所述RNA 可分泌进入细胞间空间(如质外体)，其被昆虫在生活史中所占据。另外， 所述dsRNA可位于植物细胞中(例如在细胞溶胶中)，或者在植物细胞 的细胞器(如叶绿体、线粒体、液泡或内质网)中。
或者，所述dsRNA可通过植物细胞和通过植物被分泌至植物外部。 从而，所述dsRNA可在植物表面上形成保护层。
另一方面，本发明还提供了用于防止或保护植物免遭害虫侵害的方 法与组合物的组合。例如，一种方法提供使用植物转基因策略，其组合了 使用表达dsRNA分子的方法以及使用表达所述Bt杀虫蛋白质的方法。
因此，本发明还涉及本文所述的方法或者植物细胞或植物，其中表 达所述RNA分子的植物细胞或植物包含或表达选自以下的杀虫剂:马铃 薯块茎贮藏蛋白(patatin)、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌 (Xenorhabdus)杀虫蛋白、光杆状菌(Photorhabdus)杀虫蛋白、侧孢芽 孢杆菌(Bacillus laterosporous)杀虫蛋白和球形芽孢杆菌(Bacillus sphearicus)杀虫蛋白。优选地，所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自:Cry1、 Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋白CryET33和CryET34、 二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101以 及二元杀虫蛋白PS149B1。
在另一实施方案中，本发明涉及用于防治昆虫生长和/或防止或降低 昆虫侵害的组合物，该组合物包括至少植物的一部分、植物细胞、植物组 织或种子，其包含至少一种双链RNA，其中所述双链RNA包含退火的互 补链，其中一条链具有与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷 酸序列。任选地，所述组合物还至少包括一种适当的载体、赋形剂或稀释 剂。所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因。优选地，所述昆虫靶基因 是昆虫生存、生长、发育或繁殖所必需的。
另一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述昆虫靶基因包 含与选自以下的任意序列具有至少75％，优选至少80％、85％、90％，更 优选至少95％，98％或99％一致性的序列:
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249， 251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085， 1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至 1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637， 1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694， 1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075， 2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，
或其互补序列，或者其中所述昆虫靶基因是包含以下序列中至少17个连续 核苷酸的基因的昆虫直系同源物:SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476，2481或2486，或其互补序列。
根据又一实施方案，本发明提供了用于增加植物产量的方法，其包 括以可表达的形式向植物引入本文所述的任何核苷酸序列或重组DNA构 建体。该方法涉及的植物如前所述。
参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
附图和附表说明
图1-LD:用dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。用 50μl表面施加dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食第二幼虫 期的昆虫。7天后，将饲料替换为包含表面施加dsRNA的新鲜饲料。在第 2、5、7、8、9和13天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)计 算存活幼虫的百分比。靶标LD006:(SEQ ID NO 178)；靶标LD007(SEQ ID NO 183)；靶标LD010(SEQ ID NO 188)；靶标LD011(SEQ ID NO 193)；靶标LD014(SEQ ID NO 198)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图2-LD:用dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。用 50μl表面施加dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食第二幼虫 期的昆虫。在7天后将饲料替换为仅仅新鲜饲料。在第2、5、6、7、8、9、 12和14天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫 的百分比。靶标LD001(SEQ ID NO 163)；靶标LD002(SEQ ID NO 168)； 靶标LD003(SEQ ID NO 173)；靶标LD015(SEQ ID NO 215)；靶标 LD016(SEQ ID NO 220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图3-LD:在用dsRNA处理的马铃薯叶圆片喂食的马铃薯叶甲幼虫 的平均重量。用20μl表面施加dsRNA(靶标LD002或gfp)溶液(10ng/μl) 处理的叶圆片喂食第二幼虫期的昆虫。2天后，每天将昆虫转移至未经处 理的叶上。
图4-LD:用较短形式的靶标LD014 dsRNA和串联体dsRNA处理 的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。用经50μl表面施加dsRNA(靶标 或gfp对照)溶液处理的饲料喂食第二幼虫期的昆虫。在第3、4、5、6 和7天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫的百 分比。
图5-LD:用不同浓度的dsRNA(靶标LD002(a)、靶标LD007 (b)、靶标LD010(c)、靶标LD011(d)、靶标LD014(e)、靶标 LD015(f)、LD016(g)和靶标LD027(h))处理的人工饲料喂食的马 铃薯叶甲幼虫的存活。用经50μl表面施加dsRNA溶液处理的饲料喂食第 二幼虫期的昆虫。7天后，将饲料替换为包含表面施加dsRNA的新鲜饲料。 定期评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫的百分 比。
图6-LD.用dsRNA处理的马铃薯叶圆片喂食的马铃薯叶甲成虫的 存活。开始两天用经双链RNA处理的叶圆片喂食年幼成虫，然后将其置 于未经处理的马铃薯叶上。定期评估存活昆虫数；活的并且看起来运动正 常的昆虫记录为活动的昆虫；活的但似乎有病并且运动缓慢的昆虫记录为 濒死的昆虫-一旦将其背部朝下，这些昆虫不能自己翻身。靶标LD002 (SEQ ID NO 168)；靶标LD010(SEQ ID NO 188)；靶标LD014(SEQ ID NO 198)；靶标LD016(SEQ ID NO 220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图7-LD.喂食转基因马铃薯植株的马铃薯叶甲的死亡率和存活幼虫 的生长/发育迟滞。用包含LD002构建体(●)、空载体(▲)的转基因马 铃薯同胞(sibling)或野生型V系植物(■)喂食7只CPB L1幼虫7天。 死亡率以百分比表示，平均幼虫重量以mg计。
图1-PC:摄取的靶标dsRNA对辣根猿叶甲幼虫的存活和生长的影 响。用经25μl表面施加0.1μg/μl dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的 油菜叶圆片喂食初生幼虫。2天后，将昆虫转移至新鲜的经dsRNA处理的 叶圆片上。在第4天，收集针对每次处理来自一次重复的幼虫，并置于含 有未经处理的新鲜油菜叶的培养皿中。在第2、4、7、9和11天评估所述 昆虫。(a)用dsRNA处理的油菜叶圆片喂食的墨西哥豆瓢虫幼虫的存活。 相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫的百分比，(b)用经dsRNA 处理的油菜叶圆片喂食的辣根猿叶甲幼虫的平均重量。一起称重来自每个 重复的昆虫，确定每只幼虫的平均重量。误差线代表标准偏差。靶标1: SEQ ID 473；靶标3:SEQ ID NO 478；靶标5:SEQ ID NO 483；靶标 10:SEQ ID NO 488；靶标14:SEQ ID 493；靶标16:SEQ ID NO 498； 靶标27:SEQ ID NO 503；gfp dsRNA:SEQ ID NO 235。
图2-PC:用经不同浓度的dsRNA(a)靶标PC010和(b)靶标PC027 处理的油菜叶圆片喂食的辣根猿叶甲的存活。将初生幼虫置于经25μl表 面施加dsRNA溶液处理的油菜叶圆片上。在第2天，将昆虫转移至经处 理的新鲜叶圆片上。在第4天(对于靶标PC010)和第5天(对于靶标 PC027)，将昆虫转移至未经处理的叶子。在第2、4、7、8、9和11天(对 于PC010)和第2、5、8、9和12天(对于PC027)评估昆虫的存活数。 相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫的百分比。
图1-EV:用经dsRNA处理的豆叶圆片喂食的墨西哥豆瓢虫幼虫的 存活。用25μl表面施加1μg/μl dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的豆 叶圆片喂食初生幼虫。2天后，将昆虫转移至经dsRNA处理的新鲜叶圆片 上。在第4天，收集来自一个处理的幼虫，并置于含有未经处理的新鲜豆 叶的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天评估昆虫的死亡率。相对于第0 天(测定开始时)计算存活幼虫的百分比。靶标5:SEQ ID NO 576；靶标 10:SEQ ID NO 586；靶标15:SEQ ID NO 591；靶标16:SEQ ID NO 596； gfp dsRNA:SEQ ID NO 235。
图2-EV:摄取的靶标dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫之存活的影响以 及对食荚菜豆叶的虫害的抗性。(a)用经dsRNA处理的豆叶喂食的墨西 哥豆瓢虫成虫的存活。用经75μl表面施加0.1μg/μl dsRNA(靶标或gfp 对照)溶液处理的豆叶圆片喂食成虫。24小时后，将昆虫转移至经dsRNA 处理的新鲜叶圆片上。再过24小时后，收集来自一个处理的成虫，并置于 含有盆栽未处理的新鲜的整株豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、7、8和 11天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫的百 分比。靶标10:SEQ ID NO 586；靶标15:SEQ ID NO 591；靶标16:SEQ ID NO 596；gfp dsRNA:SEQ ID NO 235。(b)dsRNA对墨西哥豆瓢虫 成虫所造成豆叶损伤的抗性。在第9天目测检查包括来自一个处理(参见 (a))的昆虫的整株植物中的叶损伤。(i)靶标10；(ii)靶标15；(iii) 靶标16；(iv)gfp dsRNA；(v)未处理的。
图1-TC:用dsRNA(靶标14)处理的人工饲料喂食的赤拟谷盗幼 虫的存活。用基于含1mg dsRNA(靶标14)的面粉/奶混合物的饲料喂食 初生的幼虫。对照是含水(不含dsRNA)饲料。对于每个处理，进行4个 重复，每个重复使用10只1龄幼虫。在第6、17、31、45和60天评估昆 虫的存活作为百分比平均数。相对于第0天(测定开始时)计算存活幼虫 的百分比。误差线代表标准偏差。靶标TC014:SEQ ID NO 878。
图1-MP:摄取的靶标27dsRNA对桃蚜若虫存活的影响。将1龄昆 虫置于包含50μl液态饲料(含有2μg/μl dsRNA(靶标27或gfp dsRNA 对照))的喂料室中。对于每个处理，设立5个喂料室，其中每个喂料室 包括10只昆虫。在生物测定开始后的第8天评估存活数。误差线代表标准 偏差。靶标MP027:SEQ ID NO 1061；gfp dsRNA:SEQ ID NO 235。
图1-NL:用经dsRNA处理的液体人工饲料喂食的褐飞虱的存活。 在独立的生物测定中用补充有2mg/ml dsRNA靶标溶液的饲料喂食第一 至第二幼虫期的若虫:(a)NL002、NL003、NL005、NL010；(b)NL009、 NL016；(c)NL014、NL018；(d)NL013、NL015、NL021。将用仅仅 饲料和含同样浓度gfp dsRNA对照的饲料喂食的昆虫存活与用靶标喂食的 昆虫存活进行比较。每两天将饲料替换为含有dsRNA的新鲜饲料。每天 评估存活昆虫数。
图2-NL:用不同浓度的靶标dsRNA NL002处理的液体人工饲料喂 食的褐飞虱的存活。用补充有1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度)NL002 的饲料喂食第一至第二幼虫期的若虫。每两天将饲料替换为含有dsRNA 的新鲜饲料。每天评估存活昆虫数。
实施例
实施例1:高通量筛选中在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中沉默秀丽隐杆线 虫靶基因
在pGN9A载体中两个相同的T7启动子和终止子之间制备秀丽隐杆 线虫基因组广泛文库(WO 01/88121)，通过IPTG进行诱导在T7聚合酶 表达的情况下所述启动子和终止子驱动其正向和反向表达。
在96孔板形式中，将此文库转化入细菌菌株AB301-105(DE3)。 对于基因组范围的筛选，将这些细菌细胞喂食给核酸酶缺乏的秀丽隐杆线 虫nuc-1(e1392)株。
在96孔板形式中按照下述步骤将在细菌菌株AB301-105(DE3)中 产生的dsRNA喂食给秀丽隐杆线虫nuc-1(e1392):将nuc-1卵转移到不 同的板中，并使之在20℃下同时孵化以使得L1代同步化。将包含IPTG 的100微升液体培养基加入到96孔板中，并加入10微升OD6001带有秀丽 隐杆线虫dsRNA文库的AB301-105(DE3)细菌细胞培养物，该文库每个 载体带有用于表达dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将4只同步化的 L1线虫加入到每个孔中，在25℃孵育至少4至5天。这些实验一式四份 进行。在所述筛选中，使用6个对照:
-pGN29＝阴性对照，野生型
-pGZ1＝unc-22＝颤搐型表型
-pGZ18＝几丁质合酶＝胚胎致死
-pGZ25＝pos-1＝胚胎致死
-pGZ59＝bli-4D＝急性致死
-ACC＝乙酰辅酶A羧化酶＝急性致死
5天后，将用产生dsRNA的细菌喂食的秀丽隐杆线虫nuc-1(e1392) 和用空载体(pGN29)及用其它对照喂食的线虫的表型进行比较。针对亲 代(P0)的致死性(急性或幼虫)、子一代(F1)的致死性(胚胎)或者 针对P0的生长迟缓按照如下所述对用所述dsRNA喂食的线虫进行筛选: (i)P0急性致死:L1不发育且死亡，此表型不产生后代，所述孔看上去 十分空旷；(ii)P0(幼虫)致死:P0在比L1更晚的阶段死亡，此表型也 不产生后代。在孔中发现死亡的幼虫或死亡的成虫；(iii)F1致死:L1发 育至成虫期并仍然存活。此表型不产生后代。这可能是由于不育、胚胎致 死(孔底部有死亡的卵)、胚胎停滞或幼虫停滞(最终以致死结束)；(iv) 生长停滞及生长迟缓/延迟:与带有正常发育和正常后代数的孔进行比较。
对于表1A中所示的靶序列，所得结论为线虫中(例如秀丽隐杆线 虫)dsRNA介导的秀丽隐杆线虫靶基因沉默对线虫的生长和存活具有重大 影响。
接着上述dsRNA沉默实验，在24孔板中以高通量形式对秀丽隐杆 线虫进行了更细致的表型实验。按照如下步骤，将如上所述细菌菌株 AB301-105(DE3)中产生的dsRNA文库喂食给24孔板中的秀丽隐杆线 虫nuc-1(e1392):将nuc-1卵转移到不同的板中，并使之在20℃下同时 孵化以使得L1代同步化。然后，将100只同步化的L1线虫浸泡于500微 升S完全喂食培养基以及500微升秀丽隐杆线虫dsRNA文库的OD600 1AB301-105(DE3)细菌细胞培养物中，所述培养基包含5微克/毫升胆固 醇、4微升/毫升PEG和1mM IPTG，所述dsRNA文库每个都带有含表达 dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段的载体。将所浸泡的L1线虫在25℃转 动孵育2小时。
在离心并除去950微升上清后，将所剩的5微升及重悬的沉淀(包 含约10至15只线虫)转移到24孔板每个孔的中部，加入一层琼脂LB液 体培养基。将所接种的板在25℃下孵育2天。在成虫期，挑出1只成虫， 在25℃下孵育2天用于检查其后代。在最初的24孔板原位检查其它的成 虫。一式四份进行这些实验。
用第二批孵化的线虫重复此详细表型筛选，唯一的区别在于第二批 孵化的线虫在20℃孵育3天。
对用秀丽隐杆线虫dsRNA喂食的线虫之表型和用空载体喂食的秀 丽隐杆线虫nuc-1(e1392)之表型进行比较。
根据此实验，得出结论为如表1A中所示的秀丽隐杆线虫靶基因的 沉默对于线虫的生长和存活具有重大的影响，以及所述靶基因对于线虫的 存活是必要的。因此这些基因是用于通过dsRNA介导的基因沉默防治(杀 伤或阻止其生长)线虫之理想靶基因。因此本发明包含上述秀丽隐杆线虫 靶基因的线虫直系同源物用于防治线虫侵害(例如植物的线虫侵害)的用 途。
实施例2:鉴定黑腹果蝇(D.melanogaster)直系同源物
如实施例1中所述，鉴定了许多秀丽隐杆线虫的致死序列，其可用 于鉴定其它种属中的直系同源物。例如，秀丽隐杆线虫致死序列可用于鉴 定直系同源的黑腹果蝇序列。也就是说，每个秀丽隐杆线虫序列可用于在 公共数据库(例如GenBank)中搜索黑腹果蝇中的直系同源物。选择具有 高度序列同源性的(E值优选小于或等于1E-30)潜在黑腹果蝇直系同源 物，所述序列是blast相互最佳命中(hit)的，后者意指来自不同生物(例 如秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇)的序列是彼此的最高blast命中。例如，使 用BLAST比较来自秀丽隐杆线虫的序列C和黑腹果蝇中的序列。如果序 列C具有黑腹果蝇序列D作为最佳命中，而D与所有其它秀丽隐杆线虫 序列相比也是序列C作为最佳命中，那么D和C是相互最佳命中。此标 准经常用于定义直系同源物，意指不同物种的具有相似功能的相似序列。 黑腹果蝇序列标识示于表1A。
实施例3:马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata，Colorado potato beetle， CPB，科罗拉多马铃薯叶甲)
A.克隆来自马铃薯叶甲的部分基因序列
从4个不同幼虫期马铃薯叶甲(马铃薯叶甲；来源:Jeroen van Schaik，Entocare CV Biologische Gewasbescherming，Postbus 162，6700 AD Wageningen，the Netherlands)中使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说 明分离高质量的总RNA。按照使用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700， Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。使用市售试剂盒 (SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville， Maryland，USA)按照使用说明产生cDNA。
为了分离包含LD001，LD002，LD003，LD006，LD007，LD010， LD011，LD014，LD015，LD016，LC018和LD027基因一部分的cDNA序 列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了Amplitaq Gold(Cat. Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-LD中给出，其显示了包 含引物序列和所得cDNA序列的马铃薯叶甲靶基因。这些引物分别用于各 个PCR反应，其使用以下条件:95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30 秒、55℃1分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析、 纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片 段，将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)，并 测序。分别通过如表2-LD中给出的各个SEQ ID NO表示所得PCR产物 的序列，其指部分序列。分别通过如表3-LD中给出的各个SEQ ID NO表 示相应的部分氨基酸序列，其中读码框的起点以方括号表示。
B.产生马铃薯叶甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-LD中给 出。PCR反应的条件如下:95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、 55℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性 T7反向引物在使用如上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用 于扩增每个靶基因反义模板的各个引物序列在表8-LD中给出。在琼脂糖 凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混 合所产生的T7正向和反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行 DNA酶和RNA酶处理，通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得 每个靶基因的dsRNA有义链在表8-LD中给出。表8-LD显示了用于制备 马铃薯叶甲靶序列和串联体序列(concatemer sequence)的dsRNA片段 的序列，其中包含引物序列。
C.将马铃薯叶甲基因克隆进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰的机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向 克隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分 隔开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记物。使用 含attL入门克隆(见实施例1)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行重 组反应。这些克隆实验得到了LD002、LD006、LD007、LD010、LD011、 LD014和LD016基因各自的发夹构建物，其具有启动子-有义-内含子 -CmR-内含子-反义方向，或者启动子-反义-内含子-CmR-内含子-有义方 向，其中启动子是植物有效的35S启动子。带有35S启动子的二元载体 pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农杆菌(A.tumefaciens)。
对于LD002和LD010，对克隆进pCR8/GW/topo的LD002使用限 制性酶BsoBI和PvuI进行双消化(见实施例3A)。对于LD006、LD007、 LD011、LD014、LD016和LD027，使用限制性酶BsoBI对克隆进 pCR8/GW/topo的LD006进行消化(见实施例3A)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含有侧翼是attL位点的目的 基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段和150纳克 pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵育至少1个 小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组混合物转化 进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。发夹构建 物的完整序列是:
-LD002(反义-内含子-CmR-内含子-有义)在SEQ ID NO 240中表示；
-LD006(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 241中表示；
-LD007(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 242中表示；
-LD010(反义-内含子-CmR-内含子-有义)在SEQ ID NO 243中表示；
-LD011(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 244中表示；
-LD014(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 245中表示；
-LD016(反义-内含子-CmR-内含子-有义)在SEQ ID NO 246中表示；
-LD027(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 2486中表示；
表9-LD提供了每个发夹构建物的完整序列。
D.使用人工饲料针对抗马铃薯叶甲活性筛选dsRNA靶标
按照下述(修改自Gelman ef al，2001，J.Ins.Sc.，vol.1，no.7，1-10) 制备用于马铃薯叶甲的人工饲料:对水和琼脂高压灭菌，当温度降至55℃ 时加入余下成分(如下文表A所示)。在此温度下，完全混合所述成分， 然后将所述饲料以每孔1毫升的量等分至24孔板(Nunc)。人工饲料允许 在室温下冷却固化。饲料在4℃下保存最多3周。
表A:人工饲料的成分
  成分 1L体积 水 768ml 琼脂 14g 燕麦片 409 圆酵母 60g 水解乳白蛋白 30g 酪蛋白 10g 果糖 20g Wesson盐混合物 4g 番茄果粉末 12.5g 土豆叶粉末 25g β-谷甾醇 1g 山梨酸 0.8g 羟苯甲酸甲酯 0.8g 维生素混合物 12g 硫酸新霉素 0.2g 金霉素 0.130g 利福平 0.130g 氯霉素 0.130g 制霉菌素 0.050g 大豆油 2ml 小麦胚芽油 2ml
将浓度为1毫克/毫升的50微升dsRNA溶液表面施加到多孔板孔内 的固体人工饲料上。所述饲料在层流柜中干燥。每个处理，测试24只马铃 薯叶甲幼虫(2期)，每孔两只昆虫。在昆虫饲养室中保存所述板，条件为 25±2℃，60％相对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光周期。每1、2或3天 评估所述甲虫是活还是死。在7天后，对于靶标LD006、LD007、LD010、 LD011和LD014，用表面施加了相同浓度(1毫克/毫升)dsRNA的新鲜 饲料替换所述饲料；对于LD001、LD002、LD003、LD015和LD016，仅 仅用新鲜饲料替换所述饲料。针对仅仅饲料或者带有表面施加dsRNA的 饲料比较dsRNA靶标，所述dsRNA对应于GFP(green fluorescent protein， 绿色荧光蛋白)编码序列(SEQ ID NO 235)的片段。
将含有完好裸dsRNA的人工饲料喂食给马铃薯叶甲幼虫导致幼虫 的死亡率显著增加，如两个独立的生物测定中所显示的(图1LD-2LD)。
所有测试dsRNA7至14天后最终导致100％死亡率。在整个所述生 物测定中，用带有或不带GFP dsRNA的饲料维持所述昆虫时死亡率很小 或无死亡。
通常，在所有所观察的测定中，用带有或不带dsRNA的饲料正常喂 食CPB2期幼虫2天，所述幼虫蜕壳成为3期幼虫。在此新的幼虫期，观 察到CPB显著减少或完全停止进食，结果伴随死亡率提高。
E.使用马铃薯叶圆片进行dsRNA靶标抗马铃薯叶甲活性的生物测定
应用了使用马铃薯叶材料而非人工饲料作为CPB食物来源的替代 生物测定方法。用合适尺寸的穿孔器从2至3周龄的马铃薯植物叶子上切 下约1.1厘米直径的圆片(或约0.95平方厘米)。通过施加20微升10纳克 /微升靶标LD002 dsRNA或对照gfp dsRNA溶液到近轴叶表面制备所处理 的叶圆片。允许叶圆片干燥并分别单独放置在24孔板(Nunc)的24个孔 中。将单只第2幼虫期幼虫CPB放置于每个孔中，然后用吸水纸和多孔板 塑料盖将其覆盖。在28℃下将含有昆虫和叶圆片的板保持在昆虫室中，光 周期为16小时光照/8小时黑暗。允许所述昆虫食用叶圆片2天，之后将 所述昆虫转移到含有新鲜的处理叶圆片的新平板中。之后，每天将所述昆 虫转移到含有未处理叶圆片的平板，直至第7天。记录昆虫死亡率和重量 得分。
用表面施加了靶标LD002完好裸dsRNA的马铃薯叶圆片喂食马铃 薯叶甲幼虫导致幼虫死亡率显著增加(即在第7天所有昆虫死亡；100％死 亡率)，而对照gfp dsRNA对CPB存活无影响。靶标LD002 dsRNA在2 至3天后严重的影响幼虫生长，而用相同浓度gfp dsRNA喂食的幼虫发育 正常(图3-LD)。
F.针对抗马铃薯叶甲活性使用人工饲料筛选较短版本的dsRNA
此实施例举例说明以下发现，较短(60或100bp)的dsRNA片段 其自身或者作为串联体构建物足以造成对马铃薯叶甲的毒性。
LD014，已知在马铃薯叶甲中诱导致死性的靶标，被选择用于此实 施例。此基因编码V-ATPase亚基E(SEQ ID NO 15)。
另外选择100个碱基对的片段LD014_F1(在SEQ ID NO 15的 195-294位，SEQ ID NO 159)和60个碱基对的片段LD014_F2(在SEQ ID NO15的235-294位，SEQ ID NO 160)。也参见表7-LD。
设计了两个300碱基对的串联体，LD014_C1和LD014_C2(SEQ ID NO161和SEQ ID NO 162)。LD014_C1含有3个重复的上文所述100碱 基对片段(SEQ ID NO 159)，LD014_C2含有5个重复的上文所述60碱 基对片段(SEQ ID NO 160)。也参见表7-LD。
合成片段LD014_F1和LD014_F2作为有义和反义引物。在克隆之 前，退火这些引物形成双链DNA分子。在所述引物的5’和3’端分别包含 XbaI和XmaI限制性位点，以利于克隆。
所述串联体制成作为300碱基对的合成基因。在所述合成DNA片段 的5’和3’端分别包含XbaI和XmaI限制性位点，以利于克隆。
用XbaI和XmaI消化4个DNA分子，即2个单个单元(LD014_F1 和LD014_F2)和2个串联体(LD014_C1和LD014_C2)，并亚克隆到通 过XbaI和XmaI消化而线性化的pBluescriptII SK+中，分别得到重组质 粒p1、p2、p3和p4。
产生双链RNA:使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr.P1700，Promega)合成dsRNA。在两个独立的PCR反应中 产生最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7 启动子方向不同的靶序列。对于LD014_F1，使用特异性T7正向引物 oGBM159和特异性反向引物oGBM164(此处分别用SEQ ID NO 204和 SEQ ID NO 205表示)在PCR反应中使用下述条件产生有义T7模板: 95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，然 后是72℃10分钟。使用特异性正向引物oGBM163和特异性T7反向引物 oGBM160(此处分别用SEQ ID NO 206和SEQ ID NO 207表示)在使用 与上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所 得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat. Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正向和 反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理， 通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得dsRNA的有义链在本文 中由SEQ ID NO 203表示。
对于LD014_F2，使用特异性T7正向引物oGBM161和特异性反向 引物oGBM166(此处分别用SEQ ID NO209和SEQ ID NO 210表示)在 PCR反应中使用下述条件产生有义T7模板:95℃4分钟，然后是35个 循环的95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特 异性正向引物oGBM165和特异性T7反向引物oGBM162(此处分别用 SEQ ID NO 211和SEQ ID NO 212表示)在使用与上述相同条件的PCR 反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过 PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，C at.Nr.28106，Qiagen) 以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正向和反向模板，以进行转 录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理，通过醋酸钠纯化， 其按照制造商说明进行。所得dsRNA的有义链在本文中由SEQ ID NO 208 表示。
同样，对于所述串联体，在两个独立的PCR反应中产生独立的单5’ T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启动子方向不同的靶序 列。含有LD014_C1和LD014_C2的所述重组质粒p3和p4用XbaI或XmaI 线性化，纯化每个构建物的两种线性片段并用作体外转录测定的模板，其 中使用位于克隆位点侧翼的T7启动子。通过体外转录使用T7 RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)制备双链RNA。对于LD014_C1和 LD014_C2所得dsRNA的有义链在本文中分别由SEQ ID NO 213和214 表示。
靶标LD014和串联体的较短序列能够诱导马铃薯叶甲致死性，如图 4-LD所示。
G.使用人工饲料针对抗马铃薯叶甲活性在不同浓度下筛选dsRNA
将从1微克/微升(对于靶标LD027从0.1微克/微升)降至0.01纳 克/微升的一系列十倍稀释的50微升dsRNA溶液表面施加到24孔板 (Nunc)孔内的固体人工饲料上。所述饲料在层流柜中干燥。每个处理， 测试24只马铃薯叶甲幼虫(2期)，每孔两只昆虫。在昆虫饲养室中保存 所述板，条件为25±2℃，60％相对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光周期。 以固定间隔直至第14天评估所述甲虫是活还是死。在7天后，用表面施加 了相同浓度dsRNA的新鲜饲料替换所述饲料。将dsRNA靶标和仅使用饲 料进行比较。
在低至0.1至10纳克dsRNA/微升的浓度下将含有不同靶标完好裸 dsRNA的人工饲料喂食给马铃薯叶甲幼虫导致高幼虫死亡率，如图5-LD 所示。
H.成虫特别易感于经口摄取的对应靶基因的dsRNA
下文所提供的实施例强调了以下发现，昆虫成虫(不只是幼虫期昆 虫)特别易感于经口摄取的对应靶基因的dsRNA。
选择4个靶标用于此实验:靶标2、10、14和16(分别为SEQ ID NO 168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQ ID NO 235)用作对照。 从我们实验室饲养的培养物中随机挑选幼龄成虫(2-3天龄)，对昆虫性别 没有偏好。每个处理选择10只成虫。在处理开始前，所述成虫预先饥饿至 少6小时。在处理第一天，向每只成虫喂食4个马铃薯叶圆片(直径1.5 平方厘米)，其通过在表面施加每圆片25微升0.1微克/微升靶标dsRNA (如实施例3A中所述进行合成；表面施加如实施例3E所述)进行了预处 理。将每只成虫限制在小的培养皿(直径3厘米)中以确保所有昆虫摄取 相同量的食物，因此接受相同剂量的dsRNA。第二天，再次向每只成虫喂 食4片如上所述经处理的叶圆片。第三天，收集每个处理的所有10只成虫， 一起放置于由塑料盒(尺寸30厘米×20厘米×15厘米)构成的笼中，所述 盒的盖子中带有细密的尼龙网以提供良好通风。在盒子中，底部放置了一 些潮湿滤纸。所述纸的上面放置了一些(未处理的)马铃薯叶，以在实验 过程中维持成虫。从第5天起，进行定期评估对死亡、存活(活动的)和 濒死昆虫数量进行计数。对于濒死昆虫，将其背朝下放置以检查它们是否 能够在数分钟内自己翻转过来；只有不能翻过来的昆虫被认为是濒死的。
在此实验中证明了对应于不同靶标的双链RNA对马铃薯叶甲成虫 明确的特异性毒性作用(图6-LD)。对应于gfp片段的双链RNA在最终 评估日(第19天)显示对CPB成虫没有毒性。此实验清楚的显示出只有 当接触到经口递送的dsRNA几天后CPB成虫的存活率才显著降低。例如， 对于靶标10，在第5天，10只成虫中的5只濒死(病态并缓慢运动)；在 第6天，10只成虫中的4只死亡，3只濒死；在第9天，观察到所有成虫 死亡。
作为此实验的结论，可将施用靶标双链RNA抗昆虫侵害扩展到包括 昆虫侵害的两个生活期(即幼虫和成虫)，所述昆虫侵害可造成严重的作 物破坏，如马铃薯叶甲的情况。
I.测试转基因马铃薯植物抗马铃薯叶甲幼虫的实验室试验
下文提供的实施例举例说明了以下发现，表达CPB基因特异性发夹 RNA的转基因植物对马铃薯叶甲具有有害作用。
马铃薯转化
使用来自Julie Gilbert在NSF马铃薯基因组计划 (http://www.potatogenome.org/nsf5)中的改进方案获得稳定转化的马铃 薯植物。使用来源于马铃薯(Solanum tuberosum)6487-9的‘V系’马铃薯 的茎节间外植体(获得自PRI Wageningen的Laboratory of Plant Breeding，the Netherlands)作为转化起始材料。
用含所述发夹构建物的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) C58C1RifR接种体外来源的外植体。三天的共培养之后，将所述外植体 在含100毫克/升卡那霉素和300毫克/升特泯菌的选择培养基上。转化后 经过6周以后，摘下最初推定的芽然后使其在选择培养基上生根。来源于 不同外植体的芽作为独立事件处理，来源于相同愈伤组织的芽被称为‘同胞 (sibling)’，直至它们的克隆状况可被Southern确定，芽的节切断物(nodal cutting)被称为“克隆”。
可通过对靶序列的GFP荧光或阴阳性鉴定(plus/minus)PCR来检 查生根的芽的转基因状况。然后在组织培养中克隆性增殖阳性芽以确保有 足够的副本在转化后14周可以与可用于测试的最初植物一起用于马铃薯 叶甲测定。
生物测定
在植物培养室中下述条件下转基因马铃薯植物生长至8-12片展开叶 阶段:23±2℃，60％相对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光周期。通过将 500毫升瓶颠倒放置于植物上来罩住所述植物，瓶颈牢固的置于盆内泥土 中，在瓶底部切个开口，覆盖上一细尼龙网用以通风，减少内部凝结水并 防止幼虫逃走。
在此生物测定中，将7只新生CPB幼虫放置于每个转基因植物的叶 上。测试发夹构建物LD002(包含SEQ ID NO 240)(标记为pGBNB001/28A 至F)和空载体(标记为pK7GWIWG2D(II)/11A至F)的每个转化事件 之6个转基因马铃薯同胞(即来源于同一个愈伤组织)，以及两个野生型植 物。温度、湿度和光照条件如上所述。在第7天(生物测定开始后7天)， 对存活者数目计数，记录每个植物的存活幼虫平均重量。使用Spotfire Inc. 的  9.0软件(版本17.1.779)进行数据分析。
在此实验中，两个同胞植物(标记为pGBNB001/28A和 pGBNB001/28F)上所有马铃薯叶甲幼虫在第7天死亡(图7-LD)，所述 植物带有发夹构建物LD002，来自于单个转化事件。相比于空载体转基因 植物或野生型V系植物，这两株植物上的CPB幼虫造成的摄食损伤非常 低。
实施例4:辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae，Mustard leaf beetle，MLB)
A.通过家族PCR克隆辣根猿叶甲PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、 PC016和PC027基因的部分序列。
使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)按照制造商的说明从第三幼虫期辣根猿叶甲 (辣根猿叶甲；来源:Dr.Caroline Muller，Julius-von-Sachs-Institute for Biosciences，Chemical Ecology Group，University of Wuerzburg， Julius-von-Sachs-Platz 3，D-97082 Wuerzburg，Germany)中分离高质量 的总RNA。通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理按照制造商的说 明除去RNA制备物中存在的基因组DNA。使用市售试剂盒(SuperscriptTM III Reverse Transcriptase，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville， Maryland，USA)按照制造商的说明产生cDNA。
为了分离包含PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016 和PC027基因一部分的cDNA序列，按照制造商的说明进行一系列使用 简并引物和Amplitaq Gold(Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)的 PCR反应。
在表2-PC中给出了用于扩增每个基因的简并引物序列。这些引物分 别用于使用下述条件的各个PCR反应:95℃10分钟，然后是40个循环的 95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶 上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit，C at.Nr.28706，Qiagen)所得 PCR片段，并将其克隆入pCR4/TOPO载体(Cat.Nr.K4530-20， Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-PC中给出的各个SEQ ID NO表示 所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。
对应的部分氨基酸序列由表3-PC中给出的各个SEQ ID NO分别表 示。表3-PC提供了cDNA克隆的氨基酸序列，读码框的起始由方括号表 示。
B.产生辣根猿叶甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-PC中给 出。表8-PC提供制备辣根猿叶甲靶序列的dsRNA片段之细节，其包括引 物序列。
PCR反应的条件如下:95℃1分钟，然后是20个循环的95℃30秒、 60℃30秒和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃30秒、50℃30秒和72℃1 分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性T7反向引物在使用 如上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每个靶基因反 义模板的各个引物序列在表8-PC中给出。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr. 28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正向和反向 模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理，通 过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA有义 链在表8-PC中给出。
C.将辣根猿叶甲基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记物。使用含 attL入门克隆(见实施例4A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到了PC001、PC010、PC014、PC016和PC027 基因各自的发夹构建物，其具有启动子-有义-内含子-CmR-内含子-反义方 向，其中启动子是植物有效的35S启动子。带有35S启动子的二元载体 pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/TOPO质粒进行限制性酶消化(见实 施例4B)。对于PC001，使用BsoBI和PvuI双消化；对于PC010使用PvuI 和PvuII双消化；对于PC014，使用HincII、PvuI和XhoI三消化；对于 PC016，使用ApaLI单消化；对于PC027，使用AvaI和DrdI双消化。使 用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含有侧翼是 attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段和150纳 克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵育至少1 个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组混合物转 化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。发夹构 建物的完整序列是:
-PC001(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 508中表示；
-PC010(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 509中表示；
-PC014(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 510中表示；
-PC016(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 511中表示；
-PC027(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 512中表示；
表9-PC提供了每个发夹构建物的完整序列。
D.使用油菜叶圆片测试dsRNA靶标抗辣根猿叶甲活性的实验室试验
下文提供的实施例举例说明了以下发现，辣根猿叶甲(mustard leaf beetle，MLB)幼虫易感于经口摄入的对应于自身靶标基因的dsRNA。
为了测试抗MLB幼虫的不同双链RNA样本，采用了使用油菜 (Brassica napus品种SW Oban，来源Nick Balaam，Sw Seed Ltd，49 North Road，Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)叶材料作为食物来源的 叶圆片测定。在昆虫室中相同品种的油菜上保持所述昆虫培养物，条件为 25±2℃，60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。使用合适尺 寸的穿孔器从4至6周龄的油菜植物上切下约1.1厘米直径(或约0.95平 方厘米)的圆片。在含有0.05％Triton X-100的Milli-Q水中将双链RNA 样品稀释到0.1微克/微升。通过施加25微升靶标PC001、PC003、PC005、 PC010、PC014、PC016、PC027 dsRNA和对照gfp dsRNA的稀释溶液或 者0.05％ Triton X-100到近轴叶表面制备经处理的叶圆片。将叶圆片干燥 并单独放置到24孔多孔板的每一个孔中，所述孔含有1毫升凝胶化的2％ 琼脂，其有助于防止叶圆片干枯。将两只新生MLB幼虫放置于所述板的 每个孔中，然后用多孔塑料盖将其盖上。将所述板(含有48只昆虫的一个 处理)分为4个重复，每个重复12只昆虫(每行)。将含有所述昆虫和叶 圆片的平板保存在昆虫室中，条件为25±2℃，60±5％相对湿度，16小时 光照/8小时黑暗的光周期。用叶圆片喂食昆虫2天，之后将它们转移到含 有新鲜处理的叶圆片的新平板。然后，在生物测定开始后4天，收集来自 每个重复的昆虫并转移到含未处理新鲜油菜叶的培养皿。在第2、4、7、9 和11天记录幼虫死亡率和平均重量。
对于所有测试的靶标，在完好裸靶标dsRNA处理的油菜叶上饲养辣 根猿叶甲幼虫都导致幼虫死亡率显著增加，如图1(a)所示。对于靶标 PC010所测试的双链RNA第9天导致100％幼虫死亡率，对于PC027是 在第11天。对于所有其它的靶标，相比于对照gfp dsRNA、仅仅 0.05％Trition X-100或仅仅未处理的叶在第11天达到高死亡率值:(平均 值百分数±α0.05的置信区间)PC001(94.4±8.2)，PC003(86.1±4.1)， PC005(83.3±7.8)，PC014(63.9±20.6)，PC016(75.0±16.8)，gfp dsRNA (11.1±8.2)，0.05％ Triton X-100(19.4±10.5)，仅仅叶(8.3±10.5)。
基于它们的平均重量评估存活幼虫。对于所有所测试靶标，在所述 生物测定4天后，辣根猿叶甲幼虫具有显著降低的平均重量；同仅仅喂食 叶的幼虫一样，喂食对照gfp dsRNA或仅仅0.05％Trition X-100的昆虫正 常发育(图1(b)-PC)。
E.使用油菜叶圆片在不同浓度筛选dsRNA抗辣根猿叶甲幼虫活性的实验 室试验
将25微升一系列10倍稀释(从0.1微克/微升降至0.1纳克/微升) 的来自靶标PC010或PC027的dsRNA溶液表面施加到油菜叶圆片，如上 文实施例4D所述。作为阴性对照，将仅仅0.05％Triton X-100施加到叶圆 片。每个处理，测试24只辣根猿叶甲新生幼虫，每孔两只。在昆虫饲养室 中保存所述平板，条件是25±2℃，60±5％相对湿度，16:8小时的光照: 黑暗光周期。在第2天，将所述幼虫转移到含有新鲜dsRNA处理的叶圆 片的新平板。在第4天对于靶标PC010，第5天对于靶标PC027，将来自 每个重复的昆虫转移到含充足的未处理叶材料的培养皿。在第2、4、7、8、 9和11天对靶标PC010，以及在第2、5、8、9和12天对靶标PC027评 估所述甲虫的存活与否。
以低至1纳克dsRNA/微升溶液的浓度给辣根猿叶甲喂食含有所述 两个不同靶标(PC010和PC027)的完好裸dsRNA的油菜叶圆片导致高 死亡率，如图2(a)和(b)中所示。不同浓度dsRNA平均死亡率百分数 ±α0.05的置信区间:对于靶标PC010在第11天，0μg/μl:8.3±9.4，0.1μg/μl: 100，0.01μg/μl:79.2±20.6，0.001μg/μl:58.3±9.4，0.0001μg/μl:12.5±15.6， 对于靶标PC027在第12天，0μg/μl:8.3±9.4，0.1μg/μl:95.8±8.2，0.01 μg/μl:95.8±8.2，0.001μg/μl:83.3±13.3，0.0001μg/μl:12.5±8.2。
F.转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物上桃蚜(Myzus periscae) 虫害的实验室试验
产生转基因植物
用浸花法(floral dip)(Clough and Bent(1998)Plant Journal 16 735-743)转化拟南芥。将植物的空气中部分在含下列物质的溶液中孵育数 秒，所述溶液含有5％蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)C58C1 Rif菌株细胞以及0.03％的表面活性 剂Silwet L-77。接种后，用透明塑料覆盖植物16个小时以保持湿润。为 了增加转化效率，一周后重复所述步骤。随种子成熟停止浇水，收获干燥 种子，冷处理两天。灭菌后，将种子置于含卡那霉素的培养基中以选择转 化植物。
转移所选择的植物到泥土用以最优化的产生T2种子。
生物测定
通过使得分离的T2种子在合适选择培养基上萌发来选择转基因拟 南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们转移到新鲜人工培 养基或泥土，使得它们在最优条件下生长。测试整个转基因植物对桃蚜若 虫的抗性，显示(1)显著抵抗摄食若虫对植物的损害，(2)增加若虫的死 亡率，和/或(3)降低若虫存活者的重量(或者任何其它异常的昆虫发育)。
实施例5:墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivetis，Mexican bean beetle，MBB)
A.克隆墨西哥豆瓢虫部分基因序列
从4个不同幼虫期墨西哥豆瓢虫(墨西哥豆瓢虫；来源:Thomas Dorsey，Supervising Entomologist，New Jersey Department of Agriculture， Division of Plant Industry，Bureau of Biological Pest Control，Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory，PO Box 330，Trenton，New Jersey 08625-0330，USA)中使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明分离高质量的总 RNA。按照使用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去 RNA制备物中的基因组DNA。使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆 转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按 照使用说明产生cDNA。
为了分离包含EV005、EV009、EV010、EV015和EV016基因一部 分的cDNA序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了 Amplitaq Gold(Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明 进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-EV中给出，其显示了包 含引物序列和所得cDNA序列的墨西哥豆瓢虫靶基因。这些引物分别用于 各个PCR反应，其使用以下条件:对于EV005和EV009，95℃10分钟， 然后是40个循环的95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒，然后是72℃7 分钟；对于EV014，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、53℃1 分钟和72℃1分钟，然后是72℃7分钟；对于EV010和EV016，95℃10 分钟，然后是40个循环的95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分40秒，然后 是72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit， Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并将其克隆入pCR4/TOPO载体 (Cat.Nr.K4530 20，Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-EV中给出的 各个SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。分别通 过如表3-EV中给出的各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列，其中 读码框的起点以方括号表示。
B.产生墨西哥豆瓢虫基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(C at.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-EV中给 出。
PCR反应的条件如下:95℃1分钟，然后是20个循环的95℃30秒、 60℃30秒和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃30秒、50℃30秒和72℃1 分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性T7反向引物在使用 如上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每个靶基因反 义模板的各个引物序列在表8-EV中给出。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr. 28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正向和反向 模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理，通 过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA有义 链在表8-EV中给出。
C.将墨西哥豆瓢虫基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记。使用含 attL入门克隆(见实施例5A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到了每个靶基因的发夹构建物，其具有启动子 -有义-内含子-CmR-内含子-反义方向，其中启动子是植物有效的35S启动 子。带有35S启动子的二元载体pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农 杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/TOPO质粒进行限制性酶消化(见实 施例B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对 含有侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片 段和150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃ 孵育至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重 组混合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克 隆。
D.使用豆叶圆片测试dsRNA靶标抗墨西哥豆瓢虫幼虫活性的实验室试验
下文提供的实施例举例说明了以下发现，墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle，MBB)幼虫易感于经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA。
为了测试抗MBB幼虫的不同双链RNA样品，采用了使用油豆角 (Phaseolus vulgaris品种Montano，来源Aveve NV，Belgium)叶材料作 为食物来源的叶圆片测定。在昆虫室中相同品种的豆上保持所述昆虫培养 物，条件为25±2℃，60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。 使用合适尺寸的穿孔器从1至2周龄的豆植物上切下约1.1厘米直径(或 约0.95平方厘米)的圆片。在含有0.05％Triton X-100的Milli-Q水中将 双链RNA样品稀释到1微克/微升。通过施加25微升靶标Ev005，Ev010， Ev015，Ev016 dsRNA和对照gfp dsRNA的稀释溶液或者0.05％ Triton X-100到近轴叶表面制备经处理的叶圆片。将叶圆片干燥并单独放置到24 孔多孔板的每一个孔中，所述孔含有1毫升凝胶化的2％琼脂，其有助于 防止叶圆片干枯。将一只新生MBB幼虫放置于所述板的每个孔中，然后 用多孔塑料盖将其盖上。将所述板分为3个重复，每个重复8只昆虫(行)。 将含有所述昆虫和叶圆片的平板保存在昆虫室中，条件为25±2℃，60±5％ 相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶圆片喂食昆虫2天，之 后将它们转移到含有新鲜处理的叶圆片的新平板。然后，在生物测定开始 后4天，每天都将所述昆虫转移到含未处理新鲜豆叶的培养皿直至第10 天。在第2天以及之后每隔一天记录幼虫死亡率。
用含表面施加的完好裸靶标dsRNA的油豆角叶饲养墨西哥豆瓢虫 幼虫导致幼虫死亡率显著增加，如图1所示。8天后，所测试的靶标EV010、 Ev015和Ev016双链RNA导致100％死亡率，而靶标Ev005 dsRNA花费 10天杀死所有幼虫。在含对照gfp dsRNA或仅仅表面活性剂Triton X-100 的叶圆片饲养的大部分昆虫在整个生物测定中保持存活(图1-EV)。
E.使用豆叶圆片测试dsRNA靶标抗墨西哥豆瓢虫成虫活性的实验室试验
下文提供的实施例举例说明了以下发现，墨西哥豆瓢虫成虫易感于 经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA。
在与墨西哥豆瓢虫幼虫相似的生物测定设置中，测试MBB成虫抗 表面施加到豆叶圆片的双链RNA。每个靶标Ev010、Ev015和Ev016的测 试dsRNA在0.05％ Triton X-100中稀释至终浓度为0.1微克/微升。通过将 30微升测试溶液表面施加到每个圆片上对豆叶圆片进行处理。使所述圆片 完全干燥，然后将其放置24孔板每个孔中2％凝胶化琼脂薄片上。从培养 笼中收集三日龄成虫，禁食7-8小时，然后在生物测定板的每个孔中放置 一只成虫(因此每个处理24只成虫)。所述板保存在昆虫饲养室中(以与 MBB幼虫相同的条件保存24小时)，之后将所述成虫转移到含新鲜dsRNA 处理叶圆片的新板。再过24小时，收集来自每个处理的成虫，将其放置于 30厘米×15厘米×10厘米的塑料盒中，所述盒包含两盆未处理的3周龄豆 植物。从第4天到第11天评估昆虫死亡率。
所有三个被墨西哥豆瓢虫成虫摄入的靶标dsRNA(Ev010、Ev015 和Ev016)导致死亡率从第4天(生物测定开始后4天)开始增加，如图 2-EV(a)所示。从第5天开始，观察到最初用靶标dsRNA处理的豆叶圆 片喂食的昆虫与用含对照gfp dsRNA或表面活性剂Triton X-100圆片喂食 的昆虫之间进食模式的明显改变。对所有三个靶标，相比于gfp dsRNA和 仅仅表面活性剂对照，明显可见MBB成虫对未处理豆植物叶损伤的减少， 虽然水平各有不同；对昆虫喂食靶标15造成对豆叶最小的损伤(图2-EV (b))。
实施例6:棉铃象甲(Anthonomus grandis，Cotton boll weevil，CBW)
A.克隆棉铃象甲部分基因序列
从3龄棉铃象甲(棉铃象甲；来源:Dr Gary Benzon，Benzon Research lnc，7Kuhn Drive，Carlisle，Pennsylvania 17013，USA)中使用TRIzol试 剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA) 按照使用说明分离高质量的总RNA。按照使用说明通过DNA酶(Cat.Nr. 1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。使用市售试剂盒 (SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville， Maryland，USA)按照使用说明产生cDNA。
为了分离包含AG001、AG005、AG010、AG014和AG016基因一 部分的cDNA序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了 Amplitaq Gold(Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明 进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-AG中给出。这些引物分 别用于各个PCR反应，其使用以下条件:对于AG001、AG005和AG016， 95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30 秒，然后是72℃7分钟；对于AG010，95℃10分钟，然后是40个循环的 95℃30秒、54℃1分钟和72℃2分30秒，然后是72℃7分钟；对于AG014， 95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分，然 后是72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit， Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并将其克隆入pCR8/GW/TOPO 载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-AG中给 出的各个SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，其指部分序列。分别通 过如表3-AG中给出的各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.产生棉铃象甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-AG中给 出。按如下进行梯度降温(touch-down)PCR反应:95℃1分钟，然后是 20个循环的95℃30秒、60℃30秒(每个循环降低0.5℃)和72℃1分钟， 然后是15个循环的95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10 分钟。使用特异性正向和特异性T7反向引物在使用如上述相同条件的 PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每个靶基因反义模板的各个引物 序列在表8-AG中给出。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR 纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正向和反向模板，以进行转录， 退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理，通过醋酸钠纯化，其按 照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA有义链在表8-AG中给出。
C.将棉铃象甲基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记物。使用含 attL入门克隆(见实施例6A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到每个靶基因的发夹构建物，其具有启动子- 有义-内含子-CmR-内含子-反义方向，其中启动子是植物有效的35S启动 子。带有35S启动子的二元载体pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农 杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/TOPO进行限制性酶消化(见实施例 6B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含有 侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段和 150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵育 至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组混 合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。
D.测试表达dsRNA靶标之大肠杆菌抗棉铃象甲的实验室试验
基于植物的生物测定
用化学诱导表达dsRNA的细菌悬液喷洒整个植物，然后用所述植物 喂食CBW。它们在植物培养室中生长。通过将500毫升塑料瓶倒置于植 物上来罩住所述植物，瓶颈牢固的置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口， 覆盖上一密尼龙网用以通风，减少内部凝结水并防止幼虫逃走。将CBW 置于笼中每个处理过的植物上。用含pGXXX0XX或pGN29质粒的大肠杆 菌菌株AB301-105(DE3)悬液处理植物。将不同量的细菌施加给植物:例 如66、22和7单位，其中一个单位定义为600纳米波长光密度值是1的1 毫升细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1至 10毫升喷洒给植物。在此试验中每个处理使用一棵植物。对存活者数量进 行计数，记录每个存活者的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌菌株 AB301-105(DE3)悬液喷洒植物导致相比于pGN29对照昆虫死亡率显著增 加。这些实验显示在野生型或RNA酶III缺乏细菌表达系统中对应于昆虫 基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，其形式为显著增加昆虫死亡率和 存活幼虫生长/发育迟缓。从这些实验中还明显提供了通过应用喷雾制剂有 效保护植物/作物免受昆虫破坏的实例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶 标的双链RNA的细菌组成。
实施例7:赤拟谷盗(Tribolium castaneum，Red flour beetle，RFB)
A.克隆赤拟谷盗部分基因序列
从所有不同阶段的赤拟谷盗(赤拟谷盗；来源:Dr Lara Senior，Insect Investigations Ltd，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX， Wales，UK)中使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)按照使用说明分离高质量的总RNA。按照使 用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的 基因组DNA。使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明产生 cDNA。
为了分离包含TC001，TC002，TC010，TC014和TC015基因一部分 的cDNA序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了 Amplitaq Gold(Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明 进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-TC中给出。这些引物分 别用于各个PCR反应，其使用以下条件:95℃10分钟，然后是40个循环 的95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒，然后是72℃7分钟(TC001、 TC014、TC015)；95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、54℃1 分钟和72℃2分30秒，然后是72℃7分钟(TC010)；95℃10分钟，然后 是40个循环的95℃30秒、53℃1分钟和72℃1分，然后是72℃7分钟 (TC002)。在琼脂糖凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat. Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat. Nr.K2500 20，Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-TC中给出的各个SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。分别通过如表3-TC 中给出的各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.产生赤拟谷盗基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(C at.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-TC中给 出。PCR反应条件如下:95℃1分钟，然后是20个循环的95℃30秒、60℃30 秒(-0.5℃/循环)和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃30秒、50℃30 秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性T7反向 引物在使用如上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每 个靶基因反义模板的各个引物序列在表8-TC中给出。在琼脂糖凝胶上分 析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit， Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正 向和反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶 处理，通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA 有义链在表8-TC中给出。
C.将赤拟谷盗基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记物。使用含 attL入门克隆(见实施例7A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到每个靶基因的发夹构建物，其具有启动子- 有义-内含子-CmR-内含子-反义方向，其中启动子是植物有效的35S启动 子。带有35S启动子的二元载体pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农 杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/TOPO进行限制性酶消化(见实施例 7B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含有 侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段和 150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵育 至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组混 合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。
D.使用人工饲料测试dsRNA靶标抗赤拟谷盗幼虫活性的实验室试验
下文提供的实施例举例说明了以下发现，赤拟谷盗(RFB)幼虫易 感于经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA。
赤拟谷盗培养于Insect Investigations Ltd.(来源:Imperial College of Science，Technology and Medicine，Silwood Park，Berkshire，UK)。根据 公司SOP/251/01培养昆虫。简言之，所述甲虫居住于塑料罐或箱中。其具 有顶部开口用以通风。顶部装有网并用弹性带固定以防止逃脱。将幼虫饲 养培养基(面粉)放置于可饲养甲虫的容器中。在控温室中培养保藏的产 品甲虫群，条件为25±3℃，16:8小时的明亮:黑暗循环。
将靶标TC014的双链RNA(具有对应于SEQ ID NO 799的序列) 加入到面粉和乳粉(全麦粉:乳粉比为4:1)的混合物中，使之过夜干燥。 分别制备每个重复:将100微升10微克/微升dsRNA溶液(1毫克dsRNA) 加入到0.1克面粉/乳混合物。将干燥的混合物研磨成细粉。在培养皿(55 毫米直径)中维持昆虫，将双层滤纸呈线型放置。将经处理的饲料放置于 两个滤纸层之间。将10只1龄混合性别的幼虫放置于每个皿(重复)中。 每个处理进行4次重复。对照是Milli-Q水。定期进行评估(存活数)。在 试验过程中，测试条件是25-33℃和20-25％相对湿度，12:12小时的光照: 黑暗光周期。
相比于仅仅饲料对照，赤拟谷盗幼虫在经靶标TC014 dsRNA处理 人工饲料上随时间存活率显著降低，如图1-TC所示。
实施例8:桃蚜(Myzus persicae，Green peach aphid，GPA)
A.克隆桃蚜部分基因序列
从桃蚜若虫(桃蚜；来源:Dr Rachel Down，Insect & Pathogen Interactions，Central Science Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1 LZ， UK)中使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)按照使用说明分离高质量的总RNA。按照使 用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的 基因组DNA。使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明产生 cDNA。
为了分离包含MP001、MP002、MP010、MP016和MP027基因一 部分的cDNA序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了 Amplitaq Gold(Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明 进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-MP中给出。这些引物分 别用于各个PCR反应，其使用以下条件:对于MP001、MP002和MP016， 95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30 秒，然后是72℃7分钟；对于MP027，使用梯度降温程序:95℃10分钟， 然后是10个循环的95℃30秒、60℃40秒(每循环降低1℃)和72℃1分 10秒，然后是30个循环的95℃30秒、50℃40秒和72℃1分10秒，然后 是72℃7分钟；对于MP010，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30 秒、54℃1分钟和72℃3分，然后是72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析、 纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片 段，并将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)， 并测序。分别通过如表2-MP中给出的各个SEQ ID NO表示所得PCR产 物的序列，其指所述部分序列。分别通过如表3-MP中给出的各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.产生桃蚜基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-MP中给 出。按照如下条件进行梯度降温PCR反应:95℃1分钟，然后是20个循 环的95℃30秒、55℃30秒(对于MP001、MP002、MP016、MP027和 gfp)或者50℃30秒(对于MP010)并且每循环降低0.5℃和72℃1分钟， 然后是15个循环的95℃30秒、45℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10 分钟。使用特异性正向和特异性T7反向引物在使用如上述相同条件的 PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每个靶基因反义模板的各个引物 序列在表8-MP中给出。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR 纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正向和反向模板，以进行转录， 退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理，通过醋酸钠纯化，其按 照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA有义链在表8-MP中给出。
C.将桃蚜基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记。使用含 attL入门克隆(见实施例8A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到MP001，MP002，MP010，MP016和MP026 每个基因的发夹构建物，其具有启动子-有义-内含子-CmR-内含子-反义方 向，其中启动子是植物有效的35S启动子。带有35S启动子的二元载体 pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农杆菌。
对所有克隆进pCR8/GW/topo的靶标进行Alw44I限制性酶消化(见 实施例8B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen) 对含有侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化 片段和150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃ 孵育至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重 组混合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克 隆。发夹构建物的完整序列如下:
-MP001(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 1066中表示；
-MP002(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 1067中表示；
-MP010(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 1068中表示；
-MP016(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 1069中表示；
-MP027(有义-内含子-CmR-内含子-反义)在SEQ ID NO 1070中表示。
表9-MP提供了每个发夹构建物的完整序列。
D.使用液体人工饲料测试dsRNA靶标抗桃蚜活性的实验室试验
基于适于豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的饲料制备用于桃蚜的 液体人工饲料，如Febvay et al(1988)[Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum(Homoptera Aphididae)Can J Zool 66 2449-2453]所述，但是进行了 一些修改。按如下制备所述饲料的氨基酸成分:以毫克/100毫升计，丙 氨酸178.71，β-丙氨酸6.22，精氨酸244.9，天冬酰胺298.55，天冬氨酸 88.25，半胱氨酸29.59，谷氨酸149.36，谷氨酰胺445.61，甘氨酸166.56， 组氨酸136.02，异亮氨酸164.75，亮氨酸231.56，盐酸赖氨酸351.09，蛋 氨酸72.35，鸟氨酸(HCl)9.41，苯丙氨酸293，脯氨酸129.33，丝氨酸 124.28，苏氨酸127.16，色氨酸42.75，酪氨酸38.63，L-缬氨酸190.85。 除了酪氨酸之外所述氨基酸溶解于30毫升Milli-Q水，酪氨酸在加入到 氨基酸混合物之前首先溶解于数滴1M盐酸中。以如下5×浓缩储液的形 式制备饲料的维生素混合物成分:以毫克/升计，氨基苯甲酸100、抗坏 血酸1000、生物素1、泛酸钙50、氯化胆碱500、叶酸10、肌醇420、 烟酸100、盐酸吡哆醇25、核黄素5、盐酸硫胺25。将核黄素在50℃溶 解于1毫升水中，然后加入到维生素混合物储液。所述维生素混合物被 等分为每等份20毫升，保存于-20℃。将一等份维生素混合物加入到氨 基酸溶液。分别以下述量将蔗糖和MgSO4·7H2O加入混合物:20克和 242毫克。按如下制备痕量金属溶液:以毫克/100毫升计，CuSO4 5H2O 4.7，FeCl3 6H2O 44.5，MnCl2 4H2O 6.5，NaCl 25.4，ZnCl2 8.3。将10毫升的 痕量金属溶液和250毫克KH2PO4加入到饲料，加入Milli-Q水至液体饲 料终体积为100毫升。用1M KOH溶液将饲料pH调节到7。通过0.22微 米滤片(Millipore)将液体饲料过滤灭菌。
桃蚜(桃蚜；来源:Dr Rachel Down，Insect & Pathogen Interactions， Central Science Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1 LZ，UK)饲养于 受控环境室中带70微米网的铝框架笼中的4至6周龄油菜上(Brassica napus品种SW Oban，来源Nick Balaam，Sw Seed Ltd，49 North Road， Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)，饲养条件如下:23±2℃，60±5％ 相对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光周期。
生物测定开始之前的一天，从饲养笼中收集成虫并放置于培养皿中 新鲜摘下的油菜叶上，将其在昆虫室中放置过夜。第二天，选取1龄若虫 转移到饲养室。饲养室包括10只放置于小培养皿(直径3厘米)中的1 龄若虫，所述培养皿盖有单层薄的拉伸封口膜(parafilm M)，其上加有 50微升饲料。用第二层封口膜密封所述室，在与成虫培养相同的条件下孵 育。每隔一天更新带有dsRNA的饲料，在第8天(即生物测定开始后第8 天)评估昆虫的存活率。每个处理，同时建立5个生物测定饲养室(重复)。 将测试和对照(gfp)dsRNA溶液加入到饲料中至终浓度为2微克/微升。 所述饲养室保持在23±2℃，60±5％相对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光 周期。通过GraphPad Prism版本4进行Mann-Whitney检验，以确定靶 标27(MP027)和gfp dsRNA的中值之间是否有显著差异。
在所述生物测定中，使用饲养室将添加有靶标27(SEQ ID NO 1061) 完好裸dsRNA的液体人工饲料喂食给桃蚜若虫，导致死亡率显著增加， 如图1所示。对于靶标27、gfp dsRNA和仅仅饲料本身的处理，存活者平 均百分数分别是2、34和82。使用Mann-Whitney检验比较靶标027和 gfpdsRNA组，得到0.004的单尾P值，其显示靶标027的中值与gfp dsRNA 的预期较大中值有显著差异(P<0.05)。加有靶标27 dsRNA的液体饲料上 的桃蚜明显小于仅仅饲料或加有gfp dsRNA对照的饲料上饲养的桃蚜(数 据未显示)。
E.转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物上桃蚜(Myzus periscae)侵 害的实验室试验
产生转基因植物
用浸花法(Clough and Bent(1998)Plant Journal 16:735-743)转化 拟南芥。将植物的空气中部分在含下列物质的溶液中孵育数秒，所述溶液 含有5％蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1 Rif细胞以及0.03％的表面活性剂Silwet L-77。 接种后，用透明塑料覆盖植物16个小时以保持湿润。为了增加转化效率， 一周后重复所述步骤。随种子成熟停止浇水，收获干燥种子，冷处理两天。 灭菌后，将种子置于含卡那霉素的培养基中以选择转化植物。
转移所选择的植物到泥土用以最优化的产生T2种子。
生物测定
通过使分离的T2种子在合适选择培养基上萌发来选择转基因拟南 芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们转移到新鲜人工培养 基或泥土，使得它们在最优条件下生长。测试整个转基因植物对桃蚜若虫 的抗性，显示(1)显著抵抗摄食若虫对植物的损害，(2)增加若虫的死亡 率，和/或(3)降低存活若虫的重量(或者任何其它异常的昆虫发育)。
实施例9.褐飞虱(Nilaparvata lugens，Brown plant hopper，BPH)
A.克隆褐飞虱部分基因
使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明从褐飞虱(来源: Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)高 质量的总RNA中产生cDNA。
为了分离包含NL001、NL002、NL003、NL004、NL005、NL006、 NL007、NL008、NL009、NL010、NL011、NL012、NL013、NL014、NL015、 NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因一部分的cDNA 序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了Amplitaq Gold (Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-NL中给出。这些引物分 别用于各个PCR反应，其使用以下条件:对于NL001，95℃5分钟，然后 是40个循环的95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分钟； 对于NL002，95℃3分钟，然后是40个循环的95℃30秒、55℃1分钟和 72℃1分钟，然后是72℃10分钟；对于NL003，95℃3分钟，然后是40 个循环的95℃30秒、61℃1分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分钟；对 于NL004，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、51℃1分钟和72℃1 分钟；对于NL005，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、54℃1 分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分钟；对于NL006，95℃10分钟，然 后是40个循环的95℃30秒、55℃1分钟和72℃3分30秒，然后是72℃10 分钟；对于NL007，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、54℃1 分钟和72℃1分15秒钟，然后是72℃10分钟；对于NL008和NL014，95℃10 分钟，然后是40个循环的95℃30秒、53℃1分钟和72℃1分钟，然后是 72℃10分钟；对于NL009、NL011、NL012和NL019，95℃10分钟，然 后是40个循环的95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分 钟；对于NL010，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、54℃1分 钟和72℃2分30秒钟，然后是72℃10分钟；对于NL013，95℃10分钟， 然后是40个循环的95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分10秒钟，然后是 72℃10分钟；对于NL015和NL016，95℃10分钟，然后是40个循环的 95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分40秒，然后是72℃10分钟；对于NL018， 95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分35 秒钟，然后是72℃10分钟；对于NL021、NL022和NL027，95℃10分钟， 然后是40个循环的95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分45秒，然后是72℃10 分钟。在琼脂糖凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)所得PCR片段，并将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat. Nr.K2500 20，Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-NL中给出的各个SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。分别通过如表3-NL 中给出的各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.通过EST序列克隆褐飞虱NL023基因的部分序列
使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明从褐飞虱(来源: Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)高 质量的总RNA中产生cDNA。
从褐飞虱cDNA中扩增部分cDNA序列NL023，其对应于公共数据 库GenBank中的褐飞虱EST序列，登录号CAH65679.2。为了分离包含 NL023基因部分的cDNA序列，按照制造商的说明进行使用基于EST的 特异性引物的一系列PCR反应，其使用了PerfectShotTM ExTaq(Cat N°， RR005A，Takara Bio Inc.)。
对于NL023，在两个独立的PCR反应中使用特异性引物 oGBKW002和oGBKW003(在本文分别由SEQ ID NO 1157和SEQ ID NO 1158表示)，其条件如下:95℃3分钟，然后是30个循环的95℃30 秒、56℃30秒和72℃2分钟，然后是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析、 纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片 段，并将其克隆入pCR4-topo载体(Cat N°K4575-40，Invitrogen)，并测 序。本文中由SEQ ID NO 1111表示对两个PCR产物测序所得的一致序列， 其指NL023基因的部分序列。本文中由SEQ ID NO 1112表示相应的部分 氨基酸序列。
C.产生褐飞虱基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-NL中给 出。PCR反应条件如下:对于NL001和NL002，94℃4分钟，然后是35 个循环的94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟；对于 NL003，94℃4分钟，然后是35个循环的94℃30秒、66℃30秒和72℃1 分钟，然后是72℃10分钟；对于NL004、NL006、NL008、NL009、NL010 和NL019，95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、54℃30秒和72℃1 分钟，然后是72℃10分钟；对于NL005和NL016，95℃4分钟，然后是 35个循环的95℃30秒、57℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟；对 于NL007和NL014，95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、51℃30 秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟；对于NL011、NL012和NL022， 95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、53℃30秒和72℃1分钟，然 后是72℃10分钟；对于NL013、NL015、NL018和NL021，95℃4分钟， 然后是35个循环的95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10 分钟；对于NL023和NL027，95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、 52℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性 T7反向引物在使用如上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用 于扩增每个靶基因反义模板的各个引物序列在表8-NL中给出。在琼脂糖 凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)进行纯化。混合所产生的T7正 向和反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶 处理，通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行，但进行如下修改:RNA 沉淀在70％乙醇中洗两次。所得每个靶基因的dsRNA有义链在表8-NL 中给出。
用于针对绿色荧光蛋白(gfp)对照的使用T7引物的PCR反应的模 板DNA是质粒pPD96.12(the Fire Lab， http://genome-www.stanford.edu/group/fire/)，其含有被3个合成内含子隔 开的野生型gfp编码序列。使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat N°P1700，Promega)合成双链RNA。在两个独立的PCR反 应中产生最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有 与T7启动子方向不同的靶序列。对于gfp，使用特异性T7正向引物 oGAU183和特异性反向引物oGAU182(本文中分别由SEQ ID NO 236和 SEQ ID NO 237表示)在PCR反应中产生有义T7模板，其条件如下:95℃4 分钟，然后是35个循环的95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，然后是72℃10 分钟。使用特异性正向引物oGAU181和特异性T7反向引物oGAU184(本 文中分别由SEQ ID NO238和SEQ ID NO 239表示)在与上述相同条件的 PCR反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并 通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106， Qiagen)进行纯化。混合所产生的T7正向和反向模板，以进行转录，退 火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶处理，通过醋酸钠纯化，其按照 制造商说明进行，但进行如下修改:RNA沉淀在70％乙醇中洗两次。本 文中，所得dsRNA的有义链由SEQ ID NO 235表示。
D.使用液体人工饲料筛选dsRNA靶标抗褐飞虱活性的实验室试验
如Koyama(1988)[Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppers and leafhoppers(Homoptera Delphacidaeand Deltocephalidae)on a holidic diet JARQ 22 20-27]所述制备用于褐飞虱的 液体人工饲料(MMD-1)，但改变了饲料蔗糖成分的终浓度:使用14.4％ (重量/体积)。将饲料成分制成为独立的浓缩物:10×矿物质储液(保 存于4℃)，2×氨基酸储液(保存于-20℃)和10×维生素储液(保存于 -20℃)。生物测定临开始时混合所述储液成分至4/3×浓度，以允许用测 试dsRNA溶液(4×浓度)进行稀释，调节pH至6.5，过滤灭菌并分装 为约500微升等分。
褐飞虱饲养于受控环境室中2-3月龄水稻(Oryza sativa cv Taichung Native 1)植物上:27±2℃，80％相对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光周 期。饲养室包含10只1龄或2龄若虫，其置于盖有单层薄拉伸封口膜 (parafilm M)的小培养皿(直径3厘米)中，所述封口膜上加有50微升 饲料。用第二层封口膜密封所述室，在与成虫培养相同的条件下孵育。每 隔一天更新带有dsRNA的饲料，每天评估昆虫的存活率。每个处理，同 时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp)dsRNA溶液加 入到饲料中至终浓度为2毫克/毫升。所述饲养室保存在27±2℃，80％相 对湿度，16:8小时的明亮:黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模 型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0)比较组之 间的存活率。
如四个独立的生物测定中所示，使用饲养室用含完好裸dsRNA的液 体人工饲料喂食褐飞虱导致若虫死亡率显著增加(图1(a)-(d)-NL； 表10-NL(a)-(d))(Durham University)。这些结果证明，对应于不同 必需BPH基因的dsRNA显示出对褐飞虱的显著毒性。
在这些生物测定中，gfp dsRNA对BPH存活的影响与仅仅喂食饲料 的存活率没有显著差异。
表10-NL(a)-(d)显示褐飞虱在含有2毫克/毫升(终浓度)下述 靶标的人工饲料上的存活之总结；在表10-NL(a)中:NL002、NL003、 NL005、NL010；在表10-NL(b)中:NL009、NL016；在表10-NL(c) 中:NL014、NL018；和表10-NL(d)中:NL013、NL015、NL021。在 存活分析栏中，RNAi的作用如下表示:+＝相比于gfp dsRNA对照存活率 显著下降(α<0.05)；-＝相比于gfp dsRNA对照存活率没有显著差异。使 用时序检验比较存活曲线(在仅仅饲料和添加了测试dsRNA的饲料、gfp dsRNA和测试ds RNA、以及仅仅饲料和gfp dsRNA之间)。
E.使用人工饲料针对抗褐飞虱活性在不同浓度下筛选dsRNA的实验室试 验
将50微升添加了不同浓度靶标NL002 dsRNA(即1、0.2、0.08和 0.04毫克/毫升，终浓度)的液体人工饲料施加到褐飞虱饲养室。带有dsRNA 的饲料每隔一天更新一次，每天评估昆虫存活。每个处理，同时建立5个 生物测定饲养室(重复)。所述饲养室保存在27±2℃，80％相对湿度，16: 8小时的明亮:黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模型对昆虫存活 数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0)比较组之间的存活。
喂食添加有不同浓度完好裸靶标NL002 dsRNA的液体人工饲料导 致在低至0.04毫克dsRNA/毫升饲料的终浓度下BPH死亡率显著高于仅仅 喂食饲料的存活，如图2-NL和表11-NL所示。表11-NL总结了添加了1、 0.2、0.08和0.04毫克/毫升(终浓度)靶标NL002的人工饲料喂食试验中 褐飞虱的存活。在存活分析栏中，RNAi的作用显示如下:+＝相比于仅仅 饲料对照存活率显著下降(α<0.05)；-＝相比于仅仅饲料对照没有显著差 异。使用时序检验比较存活曲线。
实施例10:二化螟(Chilo suppressalis，Rice striped stem borer)
A.通过家族PCR克隆二化螟基因部分序列
从4个不同幼虫阶段的二化螟中使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说 明分离高质量的总RNA。按照使用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700， Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。使用市售试剂盒 (SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville， Maryland，USA)按照使用说明产生cDNA。
为了分离包含CS001、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、 CS011、CS013、CS014，、CS015、CS016和CS018基因一部分的cDNA 序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了Amplitaq Gold (Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-CS中给出。这些引物分别 用于各个PCR反应，其使用以下条件:95℃10分钟，然后是40个循环 的95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。在琼脂糖 凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen) 所得PCR片段，并将其克隆入pCR4/topo载体(Cat.Nr.K2500 20， Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-CS中给出的各个SEQ ID NO表示 所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。分别通过如表3-CS中给出的 各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.产生二化螟基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-CS中给 出。PCR反应条件如下:95℃4分钟，然后是35个循环的95℃30秒、55℃30 秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性T7反向 引物在使用与上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每 个靶基因反义模板的各个引物序列在表8-CS中给出。在琼脂糖凝胶上分 析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit， Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正 向和反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶 处理，通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA 有义链在表8-CS中给出。
C.将二化螟基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记物。使用含 attL入门克隆(见实施例10A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTMII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到每个靶基因的发夹构建物，其具有启动子- 有义-内含子-CmR-内含子-反义方向，其中启动子是植物有效的35S启动 子。带有35S启动子的二元载体pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农 杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/topo进行限制性酶消化(见实施例 10B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含 有侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段 和150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵 育至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组 混合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。 D.使用人工饲料测试dsRNA靶标抗二化螟幼虫活性的实验室试验
二化螟(来源:Syngenta，Stein，Switzerland)维持在基于Kamano 和Sato，1985(Handbook of Insect Rearing Volumes I & II P Singh and RF Moore，eds，Elsevier Science Publishers，Amsterdam and New York，1985， pp448)所述经修改的人工饲料上。简言之，一升饲料的制备如下:将 20克琼脂加入到980毫升Milli-Q水中并高压灭菌；使琼脂溶液冷却至 约55℃，加入剩余成分并完全混合:40克玉米粉(Polenta)、20克纤 维素、30克蔗糖、30克酪蛋白、20克麦芽(烘烤)、8克Wesson盐混 合物、12克Vanderzant维生素混合物、1.8克抗坏血酸、1.6克尼泊金 (对羟基苯甲酸甲酯)、0.3克金霉素、0.4克胆固醇和0.6克L-半胱氨 酸。将饲料冷却至约45℃然后倒入饲养盘或杯。使饲料进入水平层流柜。 从饲养有成虫的笼中移出带有昆虫所产卵的稻叶片，将其固定在饲养杯 或盘的固体饲料上。使卵孵化，新生幼虫用于生物测定和昆虫培养物的 维持。在试验和饲养中，条件是28±2℃，80±5％相对湿度，16:8小时 的光照:黑暗光周期。
相同的人工饲料用于生物测定，但是在这种情况下，将所述饲料平 均的倒入24孔板中，每个孔含有1毫升饲料。一旦饲料设置好了，就将测 试制剂施加到饲料表面(2平方厘米)，比率为50微升的1微克/微升靶标 dsRNA。使所述dsRNA溶液干燥，将2只1龄幼虫放置于每个孔中。7 天后，将幼虫转移到多孔板中新鲜处理的饲料上。在第14天(即生物测定 开始后14天)，记录存活和死亡昆虫的数目，并检查是否异常。每个处理 共测试24只幼虫。
进行一个替代性生物测定，其中用处理过的稻叶喂食二化螟新生幼 虫。将籼稻品种台中在来一号(Indica rice，Taichung native1)的小叶片 浸于含1微克/微升靶标dsRNA的0.05％Triton X-100溶液中，使之干燥， 将每片置于含凝胶化2％琼脂的24孔板的一个孔中。将两只新生幼虫从饲 养盘转移到每个dsRNA处理的叶片(每个处理24只幼虫)。在4和8天 后，将所述幼虫转移到新鲜处理的稻叶片。在第4、8和12天评估存活和 死亡昆虫的数目，还对任何异常进行记录。
实施例11:小菜蛾(Plutella xylostella，Diamondback moth)
A.克隆小菜蛾的部分序列
从所有不同幼虫阶段的小菜蛾(小菜蛾；来源:Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX， Wales，UK)中使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)按照使用说明分离高质量的总RNA。按照使 用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的 基因组DNA。使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明产生 cDNA。
为了分离包含PX001、PX009、PX010、PX015、PX016基因一部 分的cDNA序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其中使用了 Amplitaq Gold(Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明 进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-PX中给出。这些引物分别 用于各个PCR反应，其使用以下条件:95℃10分钟，然后是40个循环的 95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒，然后是72℃7分钟(对于PX001， PX009，PX015，PX016)；:95℃10分钟，然后是40个循环的95℃30秒、 54℃1分钟和72℃2分30秒，然后是72℃7分钟(对于PX010)。在琼脂 糖凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen) 所得PCR片段，并将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr.K2500 20， Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-PX中给出的各个SEQ ID NO表示 所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。分别通过如表3-PX中给出的 各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.产生小菜蛾基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-PX中给 出。PCR反应条件如下:95℃1分钟，然后是20个循环的95℃30秒、60℃30 秒(-0.5℃/循环)和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃30秒、50℃30 秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性T7反向 引物在使用与上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每 个靶基因反义模板的各个引物序列在表8-PX中给出。在琼脂糖凝胶上分 析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit， Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正 向和反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶 处理，通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA 有义链在表8-PX中给出。
C.将小菜蛾基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记。使用含 attL入门克隆(见实施例11A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到每个靶基因的发夹构建物，其具有启动子- 有义-内含子-CmR-内含子-反义方向，其中启动子是植物有效的35S启动 子。带有35S启动子的二元载体pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农 杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/topo进行限制性酶消化(见实施例 11B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含 有侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段 和150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵 育至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组 混合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。 D.使用人工饲料测试dsRNA靶标抗小菜蛾幼虫活性的实验室试验
小菜蛾维持在Insect Investigations Ltd.(来源:Newcastle University，Newcastle-upon-Tyne，UK)。所述昆虫饲养于卷心菜叶上。 选择1龄混合性别的幼虫(约1日龄)用于此试验。昆虫维持在Eppendorf 管中(1.5毫升容积)。将按照制造商说明制备的市售小菜蛾饲料(Bio-Serv， NJ，USA)放置于每个管的盖上(0.25毫升容积，8毫米直径)。在仍是液 体时，所述饲料较为平滑以移去多余的部分，并产生平的表面。
一旦所述饲料固化，就将测试制剂施加到饲料表面，比率为每个重 复25微升未稀释制剂(1微克/微升dsRNA靶标)。使得测试制剂干燥， 每个管中放置一只1龄幼虫。将所述幼虫放置于盖中饲料的表面，然后将 管小心的闭合。将所述管倒置保存，使得每只幼虫保持在管盖上饲料的表 面。一周两次将所述幼虫转移到带有新鲜饲料的新Eppendorf管。在试验 的头两周提供给幼虫经处理的饲料，之后提供未处理的饲料。
在总共38天中，一周两次进行评估，在38天时所有幼虫都死亡了。 在每次评估中，对死亡或存活进行评估并且检查其异常。对于每个处理， 进行40个单幼虫重复。在试验中，测试条件是23至26℃，50至65％相 对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。
实施例12:美洲蟋蟀(Acheta domesticus，House cricket)
A.克隆美洲蟋蟀基因部分序列
从所有不同幼虫阶段的美洲蟋蟀(美洲蟋蟀；来源:Dr.Lara Senior， Insect Investigations Ltd.，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX，Wales，UK)中使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明分离高质量的总 RNA。按照使用说明通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA 制备物中的基因组DNA。使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶， Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)按照使用说明产 生cDNA。
为了分离包含AD001、AD002、AD009、AD015和AD016基因一 部分的cDNA序列，进行了使用简并引物的一系列PCR反应，其使用了 Amplitaq Gold(Cat.Nr N8080240，Applied Biosystems)并按照使用说明 进行。
用于扩增每个基因的简并引物序列在表2-AD中给出。这些引物分 别用于各个PCR反应，其使用以下条件:95℃10分钟，然后是40个循 环的95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒，然后是72℃7分钟。在琼 脂糖凝胶上分析、纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)所得PCR片段，并将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr. K2500 20，Invitrogen)，并测序。分别通过如表2-AD中给出的各个SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，其指所述部分序列。分别通过如表3-AD 中给出的各个SEQ ID NO表示相应的部分氨基酸序列。
B.产生美洲蟋蟀基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。在两个独立的PCR反应中产生 最初两个独立的单5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有与T7启 动子方向不同的靶序列。
对于每个靶基因，使用特异性T7正向和特异性反向引物产生有义 T7模板。用于扩增每个靶序列有义模板的各个引物的序列在表8-AD中给 出。PCR反应条件如下:95℃1分钟，然后是20个循环的95℃30秒、60℃30 秒(-0.5℃/循环)和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃30秒、50℃30 秒和72℃1分钟，然后是72℃10分钟。使用特异性正向和特异性T7反向 引物在使用如上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。用于扩增每 个靶基因反义模板的各个引物序列在表8-AD中给出。在琼脂糖凝胶上分 析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit， Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。混合所产生的T7正 向和反向模板，以进行转录，退火所得RNA链，进行DNA酶和RNA酶 处理，通过醋酸钠纯化，其按照制造商说明进行。所得每个靶基因的dsRNA 有义链在表8-AD中给出。
C.将美洲蟋蟀基因重组进植物载体pK7GWIWG2D(II)
由于RNA干扰机制通过dsRNA片段起作用，以反义和有义方向克 隆如上文所选择的靶基因的靶核苷酸序列(其被内含子-CmR-内含子分隔 开)以形成dsRNA发夹构建物，其中CmR是氯霉素抗性标记物。使用含 attL入门克隆(见实施例12A)和含attR终点载体(＝pK7GWIWG2D(II)) 之间的LR重组反应产生这些发夹构建物。植物载体pK7GWIWG2D(II) 根据材料转移协议获得自VIB/Plant Systems Biology。按照制造商的说明， 使用LR ClonaseTM II酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)进行LR 重组反应。这些克隆实验得到每个靶基因的发夹构建物，其具有启动子- 有义-内含子-CmR-内含子-反义方向，其中启动子是植物有效的35S启动 子。带有35S启动子的二元载体pK7GWIWG2D(II)适于转化进根癌农 杆菌。
对含有不同靶标的pCR8/GW/topo进行限制性酶消化(见实施例 12B)。使用Qiaquick Gel Extraction Kit(Cat.Nr.28706，Qiagen)对含 有侧翼是attL位点的目的基因之条带进行纯化。将150纳克量的纯化片段 和150纳克pK7GWIWG2D(II)与LR clonase II酶放在一起，在25℃孵 育至少1个小时。在蛋白酶K溶液处理之后(37℃10分钟)，将全部重组 混合物转化进Top10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选择阳性克隆。
D.使用人工饲料测试dsRNA靶标抗美洲蟋蟀幼虫活性的实验室试验
美洲蟋蟀维持在Insect Investigations Ltd.(来源:Blades Biological Ltd.，Kent，UK)。所述昆虫饲养于麸颗粒和卷心菜叶上。选择相同大小不 大于5天的混合性别若虫用于此试验。将双链RNA和基于小麦的颗粒状 啮齿类动物饲料(大鼠和小鼠标准饲料，B&K Universal Ltd.，Grimston， Aldbrough，Hull，UK)混合。所述饲料BK001P含有下述成分，以重量降 序排列:小麦、大豆、麸皮、大麦、颗粒状粘合剂、啮齿动物5种维生素、 混合脂、磷酸二钙、mould carb。细细研磨颗粒状啮齿动物饲料，在微波 炉进行热处理以使得任何酶成分失活，然后混合。所有啮齿动物饲料取自 同一批次以保持一致性。将研磨过的饲料和dsRNA完全混合，形成相同 重量的小颗粒，将其在室温过夜干燥。
将靶标和gfp对照的双链RNA样品以10微克/微升的浓度施加，比 例为1克研磨过的饲料加1毫升dsRNA溶液，由此得到施加率为10毫克 dsRNA/克颗粒。每周更换颗粒。在试验的前三周给昆虫提供处理过的颗粒。 之后提供未处理的颗粒。昆虫维持在有盖的塑料容器中(9厘米直径，4.5 厘米深)，每个容器十只。每个容器中含有一个处理过的诱饵颗粒和一个 水源(潮湿棉球)，上述两者各自置于独立的小型称重船型皿(weigh boat) 中。水在本实验中无限制地更新。
以一周两次的间隔进行评估，两次评估之间不超过4天，直至所有 对照昆虫或者死亡或者蜕皮至成虫期(84天)。在每次评估中，对死亡或 存活进行评估并且检查其异常。从第46天开始，一旦开始蜕皮至成虫，评 估所有昆虫(存活和死亡的)是若虫还是成虫。在试验第55天对存活的昆 虫称重。每个处理进行4个重复。在试验中，测试条件是25至33℃，20 至25％相对湿度，12:12小时的光照:黑暗光周期。

























































































































































































表10-NL(a)

1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
  x2    P值 Sig.Dif.2 食物对： NL002 29.06 <0.0001 是 NL003 39.59 <0.0001 是 NL005 29.55 <0.0001 是 NL010 21.04 <0.0001 是 gfp dsRNA对： NL002 15.09 0.0001 是 NL003 22.87 <0.0001 是 NL005 15.12 <0.0001    是 NL010 8838 0.0029 是 食物对gfp dsRNA 4.030 0.0447(～0.05) 否
2α<0.05
表10-NL(b)

1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
  x2        P值 Sig.Dif.2 食物对： NL009 11.98 0.0005 是 NL016 8.98 0.0027 是 gfp dsRNA对： NL009 13.69 0.0002 是 NL016 11.37 0.0007 是 食物对gfp dsRNA 0.03317 0.8555 否
2α<0.05
表10-NL(c)

1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
  x2        P值 Sig.Dif.2 食物对： NL014 8.088 0.0045 是 NL018 10.47 0.0012 是 gfp dsRNA对： NL014 14.55 0.0001 是 NL018 17.64 <0.0001 是 食物对gfp dsRNA 0.6548 0.4184 否
2α<0.05
表10-NL(d)

1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
  x2      P值 Sig.Dif.2 食物对： NL013 15.73 <0.0001 是 NL015 3944 <0.0001 是 NL021 12.75 0，0004 是 gfp dsRNA对： NL013 16.42 <0.0001 是 NL015 39.15 <0.0001 是       NL021      14.1         0，0002    是 食物对gfp dsRNA 0.1031 0.7481 否
2α<0.05
表11-NL

1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
  x2        P值 Sig.Dif.2 食物对： NL002 1μg/μl 57.53 <0.0001 是 NL002 0.2μg/μl 7454 <0.0001 是 NL002 0.08μg/μl 64 <0.0001 是 NL002 0.04μg/μl 39.49 <0.0001 是
2α<0.05