苏云金芽孢杆菌CryET33和CryET34组合物及其使用
专利汇可以提供苏云金芽孢杆菌CryET33和CryET34组合物及其使用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了含新型晶体 蛋白质 的苏 云 金芽孢杆菌，所述蛋白质呈现抗鞘翅目昆虫，包括红色面粉甲虫幼体和日本甲虫幼体(Popilliajaponica)的 杀虫活性 。还公开了被命名为cryET33和cryET34的新 苏云金芽孢杆菌 晶体毒素基因，它们编码鞘翅目-毒素晶体蛋白质，CryET33(29-kDa)晶体蛋白质，而cryET34基因编码14-kDa CryET34晶体蛋白质。CryET33和CryET34晶体蛋白质对红色面粉甲虫幼体和日本甲虫幼体是有毒的。还公开了制造和使用含本发明新型核酸序列的转基因细胞。，下面是苏云金芽孢杆菌CryET33和CryET34组合物及其使用专利的具体信息内容。
1.一种苏云金芽孢杆菌多肽组合物，包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽组合物，其中所述多肽分离自苏云金芽孢杆菌 EG10327，EG11402或EG11403，它们分别为NRRL B-21365，NRRL B-21366或NRRL B-21367。
3.权利要求2的多肽组合物，其中所述多肽通过SDS-PAGE测定为约 29kDa或约14kDa。
4.一种纯化的核酸区段，编码包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的 多肽。
5.权利要求4的核酸区段，其中所述区段编码对棉铃象鼻虫，日本甲 虫或红色面粉甲虫有杀虫活性的一种δ内毒素。
6.权利要求5的核酸区段，进一步限定为图1A-1C。
7.权利要求4的核酸区段，进一步限定为含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸序列，或其互补序列，或在严谨条件下与SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：2序列杂交的且编码显示出杀虫活性的蛋白的序列，或图 1A-1C的核酸序列或其互补序列，或在严谨条件下与图1A-1C的序列杂 交，且编码显示出杀虫活性的蛋白的序列。
8.权利要求5的核酸区段，进一步限定为一种RNA区段。
9.权利要求4的核酸区段，其含编码约267氨基酸长度的晶体蛋白或 肽的cryET33基因，和编码约126氨基酸长度的晶体蛋白或肽的cryET34 基因。
10.权利要求4的核酸区段，进一步包含重组载体。
11.权利要求10的核酸区段，其中所述核酸区段与启动子以可操作的 方式连接，所述启动子表达所述核酸区段。
12.含权利要求10的核酸区段的重组宿主细胞。
13.权利要求12的重组宿主细胞，进一步限定为原核细胞。
14.权利要求13的重组宿主细胞，进一步限定为细菌细胞。
15.权利要求14的重组宿主细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌，苏 云金芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，或假单孢菌的细胞。
16.权利要求15的重组宿主细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌 NRRL B-21364，苏云金芽孢杆菌NRRL B21366，或苏云金芽孢杆菌 NRRL B-21367。
17.权利要求12的重组宿主细胞，进一步限定为真核细胞。
18.权利要求17的重组宿主细胞，进一步限定为植物细胞。
19.权利要求18的重组宿主细胞，其中所述植物细胞是玉米，小麦， 草坪草，蔬菜，果树，或观赏植物细胞。
20.权利要求12的重组宿主细胞，其中所述核酸区段用重组载体引入 细胞。
21.权利要求12的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达所述核酸区 段以产生包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽。
22.使用编码晶体蛋白的权利要求4的核酸区段的方法，包含的步骤 有：
(a)制备重组载体，其中所述核酸区段位于启动子控制下；
(b)引入所述重组载体到宿主细胞；
(c)在使所述晶体蛋白表达的有效条件下培养所述宿主细胞；和
(d)收集所述表达的晶体蛋白。
23.检测编码包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列多肽的 核酸序列的方法，包含的步骤有：
(a)获得被怀疑编码SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的多肽的样品核 酸；
(b)在使基本上互补的核酸在严谨条件下杂交的有效条件下，用所 述样品核酸与编码所述多肽的分离的核酸区段接触；和
(c)检测由此形成的杂交的互补核酸。
24.权利要求23的方法，其中编码所述多肽的分离核酸区段包含一个 可检测的标记，所述标记足以检测如此形成的杂交的互补核酸。
25.一种核酸检测试剂盒，其在适当的容器装置中，包含SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：2的核酸区段或其互补序列，或者包含在严谨条件下与具 有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列杂交的核酸区段或其互补序列，所 述试剂盒还包含检测试剂。
26.与包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽结合的 被纯化的抗体。
27.检测生物学样品中包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序 列的多肽的方法，包括步骤有：
(a)获得被怀疑含有一种多肽的生物学样品；
(b)在有效形成复合物的条件下，用所述样品与结合所述包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的抗体接触；和
(c)检测如此形成的复合物。
28.一种免疫检测试剂盒，其包含在适当的容器装置中的，结合包含 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列的多肽的抗体，和免疫检测试剂。
29.产生包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列多肽的苏云 金芽孢杆菌细胞。
30.权利要求29的苏云金芽孢杆菌细胞，其中所述苏云金芽孢杆菌细 胞是NRRL B-21366，或NRRL B-21367细胞。
31.具有NRRL保藏号B-21366的苏云金芽孢杆菌细胞。
32.具有NRRL保藏号B-21367的苏云金芽孢杆菌细胞。
33.含1％到50％重量的包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸 序列的多肽的组合物。
34.含包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列多肽的组合 物，其制备过程包括步骤：
(a)在产生包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列多肽 的有效条件下，培养苏云金芽孢杆菌NRRL B-21365，NRRL B-21366，或NRRL B-21367细胞；和
(b)从所述细胞获得所述多肽。
35.权利要求34的组合物，其中步骤b进一步包括获得所述多肽，其 量在1％和50％重量之间。
36.制备一种多肽的方法，包括：
(a)在产生包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多 肽的有效条件下，培养苏云金芽孢杆菌NRRL B-21365，NRRL B-21366，或NRRL B-21367细胞；和
(b)从所述细胞获得所述多肽。
37.权利要求33的组合物，它通过权利要求36的方法制备。
38.一种用作探针或引物的分离的核酸区段，由SEQ ID NO：9或 SEQ ID NO：10组成。
39.检测编码鞘翅目-毒素晶体蛋白的核酸序列的方法，其包括以下 步骤：
(a)获得被怀疑编码鞘翅目-毒素晶体蛋白的样品核酸；
(b)在使互补核酸在严谨条件下杂交的有效条件下，使所述样品核 酸与权利要求38的核酸区段接触；和
(c)检测由此形成的杂交的互补核酸。
40.权利要求39的方法，其中所述核酸区段含有足以使所形成的杂 交的互补核酸被检测的可检测标记。
41.一种核酸检测试剂盒，其包含在适当的容器装置中的，权利要求 38的核酸区段，以及检测试剂。
1.1 发明领域
本发明一般涉及分子生物学领域。更具体地说，某些实施方案 涉及包括细菌品种的DNA区段和蛋白质的组合物和方法。更具体地 说，本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中编 码鞘翅目-毒素晶体蛋白质的新型cryET33和cryET34基因。制造 和使用这些DNA区段，制造和使用编码人工修饰的Cry蛋白质之 DNA片段，以及天然的和合成的蛋白质的各种方法被公开。例如， DNA区段作为诊断探针和生产蛋白质的模板，以及在各种免疫学和 诊断应用中蛋白质，融合蛋白载体和肽的使用。被公开的还有制造 和使用含本文公开的DNA区段之转基因植物细胞发育过程中的核酸 片段。
1.2 相关领域描述
1.2.1 苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质
苏云金芽孢杆菌的独特特点之一是其在孢子形成时产生晶体蛋白 质，这些蛋白质对某些昆虫的目和种是十分有毒的。苏云金芽孢杆菌的 许多不同菌株已显示出能产生杀虫的晶体蛋白质。已有市售的包括产生 对鳞翅目和双翅目昆虫有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株之组合物，并 且由于其对特定目标昆虫特别有毒却对植物和其他非目标有机体无害而 被用做环保性杀虫剂。
在过去10年中苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质的杀虫活性的机制已 被广泛研究。业已显示，这种晶体蛋白质只有在所述昆虫对其进行消 化之后才是有毒的。在所述昆虫的中肠内的碱性pH和蛋白酶溶解所 述蛋白质，由此使对所述昆虫有毒的成分释放。这些有毒的成分破坏 中肠细胞，使所述昆虫停止进食，并最终使昆虫死亡。因此，苏云金 芽孢杆菌已被证明在处理各种昆虫害虫中是有效的和环境上安全的杀 虫剂。
如等(1989)所描述的，大多数杀虫苏云金芽孢杆菌菌株有 抗鳞翅目即毛虫的活性。其他苏云金芽孢杆菌菌株有抗双翅目即蝇和蚊 或既抗鳞翅目又抗双翅目昆虫的杀虫活性。近年来，已报道有些苏云金 芽孢杆菌产生对鞘翅目昆虫即甲虫是有毒的晶体蛋白质(Krieg等， 1983；Sick等，1990；Lambert等1992)。
1.2.2 晶体蛋白质的遗传学
已从苏云金芽孢杆菌的几个菌株中克隆了编码晶体蛋白质的数个基 因。等(1989)的综述讨论了1990年以前鉴定的苏云金芽孢杆菌 中的基因和蛋白质，并提出了已被传统上应用于苏云金芽孢杆菌基因和 蛋白质的命名和分类方案。cryI基因编码鳞翅目-有毒的CryI蛋白质。 cryII基因编码对鳞翅目和双翅目均有毒的CryII蛋白质。CryIII基因 编码对鞘翅目有毒的CryIII蛋白质，而cryIV基因编码对双翅目有毒的 CryIV蛋白质。
最近，一种新的命名方案被提出，它根据DNA序列同源性而非根据 昆虫特异性对所述cry基因做系统的分类。这个分类方案在表1中给 出：
表1
修改的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素命名法A
a选编
自：http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/inde x.html
1.2.3 对鞘翅目昆虫有毒的晶体蛋白质的鉴定
在报道首次分离出鳞翅目-有毒的苏云金芽孢杆菌菌株(Kreig等 1983；1984)时，细菌晶体蛋白质作为杀虫剂的用途得到扩展。据报道 这种被称为苏云金芽孢杆菌拟步行变种(var.tenebrionis)的菌种 (美国专利号4,766,203中描述的，本文特引用作为参考)对鞘翅目 昆虫Agelastica alni(兰色桤木叶甲虫)和Leptinotarsa decemlineata(科罗拉多马铃薯甲虫)的幼体是有毒的。
美国专利号4,766,203(本文特引用作为参考)涉及在拟步行苏 云金芽孢杆菌中鉴定出的一种65-70千道尔顿(kDa)杀虫晶体蛋白质 (见Berhnard，1986)。Sekar等(1987)报道了克隆和表征拟步行苏 云金芽孢杆菌对鞘翅目有毒的晶体蛋白质基因。所述多肽的预期大小 (由该基因序列推出)是73kDa，而分离到的蛋白质主要含65-kDa成 分。Hofte等(1987)也报道了带有与Sekar等(1987)报道相一致基 因序列的拟步行苏云金芽孢杆菌之克隆基因的DNA序列。
McPherson等(1988)公开了拟步行苏云金芽孢杆菌的克隆昆虫控 制基因的DNA序列；该序列与Sekar等(1987)报道的相一致。储存所 述克隆基因的E.coli细胞和荧光假单孢菌细胞被发现对科罗拉多马铃薯 甲虫幼体是有毒的。
日期为1991年五月三十日的国际专利申请公开号WO91/07481描述 了产生高产量的与原先由低产亲本菌株所产生相同的杀虫蛋白质的苏云 金芽孢杆菌突变株。已公开了对鞘翅目有毒的拟步行苏云金芽孢杆菌的 突变株。
Herrnstadt等(1986)报道了被称为苏云金芽孢杆菌圣地亚哥变 种的一种对鞘翅目有毒的菌株能产生一种对某些鞘翅目昆虫有毒的 64kDa晶体蛋白质，所述鞘翅目昆虫包括Pyrrhalta Luteola(榆木叶甲 虫)；Anthonomus gradis(棉铃象鼻虫)，Leptinotarsa decemlineata(科罗拉多马铃薯甲虫)，Osiorhynchus sulcatus(黑色葡 萄树象鼻虫)，Tenebrio moliter(麦片蠕虫)，Haltica zombzcina和 Diabrotica undecimpunctata(西方斑点黄瓜甲虫)。
Herrnstadt等(1987)所报道并在美国专利号4,771,131中公 开了圣地亚哥苏云金芽孢杆菌鞘翅目毒素基因的DNA序列。圣地亚哥苏 云金芽孢杆菌毒素基因的序列与Sekar等(1987)报道的拟步行苏云金 芽孢杆菌对鞘翅目有毒的克隆基因是一致的。根据各种鉴别测定，Krieg 等(1987)证明了圣地亚哥苏云金芽孢杆菌与拟步行苏云金芽孢杆菌是 一致的。
另一苏云金芽孢杆菌菌株，EG2158由Donovan等(1988)报道并 在美国专利号5,024,837中被描述。EG2158产生73kDa CryC晶体蛋 白质，它对鞘翅目昆虫是杀虫的。其DNA序列与Sekar等(1987)报道 的拟步行苏云金芽孢杆菌毒素克隆基因是一致的。这种鞘翅目毒素基因 被Hfte等(1989)称为cryIIIA基因。在该菌株中还观察到两个较次 要的蛋白质30-和29-kDa，但未被进一步表征(Donovan等，1988)。
美国专利号5,024,837还描述了杂交苏云金芽孢杆菌变种 kerstaki菌株，其表现出抗鳞翅目和鞘翅目昆虫的活性。美国专利号 4,797,279(与EP0221024对应)公开了一种用质粒转化的杂交苏云 金芽孢杆菌，其中一种质粒来自含对鳞翅目有毒的晶体蛋白质编码基因 的苏云金芽孢杆菌kurstaki变种而另一质粒来自含对鞘翅目有毒的晶 体蛋白质编码基因的拟步行苏云金芽孢杆菌。所述杂交的苏云金芽孢杆 菌菌株产生由kurstaki苏云金芽孢杆菌和拟步行苏云金芽孢杆菌所产生 的相应蛋白质均有的晶体蛋白质特征。美国专利号4,910,016(与 EP0303379对应)公开了被鉴定为苏云金芽孢杆菌MT104的苏云金芽孢 杆菌分离株，其具有对鞘翅目和鳞翅目的杀虫活性。
欧洲专利申请公开号0318143公开了一种来自拟步行苏云金芽孢杆 菌的完整的，部分修饰的基因和含该基因的能指导对鞘翅目昆虫有毒蛋 白质表达的重组载体，并且欧洲专利申请公开号0324254公开了苏云金 芽孢杆菌A30；这是一种对鞘翅目昆虫，包括科罗拉多马铃薯甲虫幼 体，玉米根蠕虫幼体和棉铃象鼻虫有杀虫活性的菌株。
美国专利号4,999,192(与EP0328383对应)公开了对科罗拉多 马铃薯甲虫幼体有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌PS40D1。通过血清型检 测，该菌株还被鉴定为血清变种8a8b，morrisoni。美国专利号5， 006,336(与EP0346114对应)描述了被称为PS122D3，鉴定为血清型 变种8a8b，morrisoni并表现出对科罗拉多马铃薯甲虫幼体杀虫活性的 苏云金芽孢杆菌分离株。美国专利号4,966,765(与EP0330342对 应)公开了苏云金芽孢杆菌菌株PS86B1(血清型检测被鉴定为血清型变 种tolworthi)，其具有对科罗拉多马铃薯甲虫的杀虫活性。
Sick等(1990)报道了cryIIIB基因的核酸序列及其编码的对鞘 翅目有毒的蛋白质，但是通过血清型检测，所述苏云金芽孢杆菌源株仅 被鉴定为亚种tolworthi。Sick等1991年2月26日被授予的美国专利 号4,966,155(与EP0337604对应)公开了从鞘翅目活性苏云金芽孢 杆菌43F获得的苏云金芽孢杆菌毒素基因，并且所述基因序列表现出与 cryIIIB基因相一致。据报道苏云金芽孢杆菌43F有抗科罗拉多马铃薯 甲虫和leptinotarsa texana活性。
欧洲专利申请公开号0382990公开了两个苏云金芽孢杆菌菌株， btPGS1208和btPGS1245，它们分别产生74-和129-kDa的晶体蛋白质， 其呈现对科罗拉多马铃薯甲虫幼体的杀虫活性。据报道产生所述74-kDa 蛋白质的毒素基因的DNA序列似乎与Sick等(1990)的cryIIIB基因 有关。
PCT国际专利申请公开号WO 90/13651公开了含编码81kDa蛋白质 的毒素基因的苏云金芽孢杆菌菌株，所述蛋白质据说对鳞翅目和鞘翅目 昆虫均有毒性。美国专利号5,055,293公开了将侧孢芽孢杆菌用于玉 米根蠕虫(Diabtotica)昆虫的控制。
2.发明概述
与现有技术形成明显的对照，本发明新型对鞘翅目有活性的CryET33 和CryET34晶体蛋白质以及编码这些蛋白质的新型DNA序列代表了苏云 金芽孢杆菌晶体蛋白质的一个新类别，并且与前面提到的文献中所描述 的任何菌株没有序列同源性。本文公开并要求保护的苏云金芽孢杆菌分 离株代表着第一个显示出对鞘翅目有毒性的kurstaki苏云金芽孢杆菌菌 株。本发明苏云金芽孢杆菌菌株包含新型cry基因，所述基因表达具有 抗鞘翅目如Popillia和Tribolium属的昆虫杀虫活性的蛋白质毒素。
本发明的一个方面涉及新型核酸片段，所述片段包含两个鞘翅目毒素 δ内毒素基因，它们具有图1A，图1B和图1C中描绘的核苷酸碱基序列 和推出的氨基酸序列。此后，这些基因被称之为cryET33(SEQ ID NO：1) 和cryET34(SEQ ID NO：2)。cryET33基因含图1A，图1B和图1C中显 示的从核苷酸碱基136延伸到939的编码区，而cryET34基因含图1A， 图1B和图1C中显示的从核苷酸碱基969延伸到1349的编码区。
本发明的另一方面涉及新型cryET33和cryET34基因编码的杀虫蛋白 质。推出的由从核苷酸碱基136到936的cryET33基因编码的CryET33 蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：3)在图1A，图1B和图1C中给出。推 出的CryET34蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：4)(由从核苷酸碱基 969到1346的cryET34基因编码)也在图1A，图1B和图1C中给出。 所述蛋白质呈现出抗鞘翅目特别是棉铃象鼻虫，红色面粉甲虫 (Tribolium castaneum)和日本甲虫(Popillia japonica)的杀虫活 性。
本发明的另一方面涉及天然产生的野生型苏云金芽孢杆菌细菌菌株 EG10327的生物学纯培养物，所述菌株于1994年12月14日保藏在北方 地区研究实验室(NRRL)的农业研究培养物保藏所(the Agricultural Research Culture Colection，Northern Regional Research Laboratory)，其保藏号为NRRL B-21365。苏云金芽孢杆菌EG 10327 在下文5.1-5.3段中给予描述。苏云金芽孢杆菌EG10327是天然产生的 苏云金芽孢杆菌菌株，其含有与本发明的cryET33和cryET34基因相关 或相一致的基因。EG10327产生29-kDa和14-kDa杀虫蛋白质，它们与 本文公开的CryET33和CryET34蛋白质相关或相一致。
本发明的另一方面涉及含新型cryET33和cryET34基因之一或两者 的重组载体，涉及用此类重组载体转化的重组宿主细胞和如此转化的重 组细菌的生物学纯培养物。在优选实施方案中，所述细菌优选是苏云金 芽孢杆菌如实施例8中描述的重组菌株EG11402(于1994年12月14 日保藏在NRRL，保藏号B-21366)和实施例7中描述的重组菌株 EG11403(于1994年12月14日保藏在NRRL，保藏号B-21367)。本发 明的另一优选实施方案中，所述细菌优选是E.coli，如重组菌株 EG11460(于1994年12月14日保藏在NRRL，保藏号B-21364)。按照 布达佩斯条约的条款，保藏在NRRL的全部菌株被保藏在专利培养物保 藏所，并获得符合国际保藏BP/4表的存活状况报告。
2.1 CRYET33和CRYET34 DNA和RNA区段
本发明还涉及可从实际上任何来源分离出的DNA和RNA区段，所述 DNA区段游离于总基因组DNA并编码本文公开的新型肽。编码这些肽品 种的DNA和RNA区段证明可编码蛋白质，多肽，亚单位，功能域，以及 晶体蛋白质相关的或其他非相关的基因产物的类似物。此外，用本领域 技术人员熟知的方法，可完全体外合成这些DNA和RNA区段。
cryET33基因包含图1A，图1B和图1C中给出的核苷酸碱基序 列。cryET33基因(SEQ ID NO：1)编码含图1A，图1B和图1C中给出 的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的29kDa CryET33蛋白质。cryET34基 因(SEQ ID NO：2)编码含图1A，图1B和图1C给出的氨基酸序列 (SEQ ID NO：4)的14kDa CryET34蛋白质。
本文所使用的术语“DNA区段”指游离于一个具体品种总基因组 DNA的分离出的DNA分子。因此，编码一个晶体蛋白质或肽的一个DNA 区段是指含晶体蛋白质编码序列且从获得该DNA区段之品种的总基因组 DNA分离出来或游离于所述品种总基因组DNA的被纯化的一个DNA区 段，所述总基因组DNA，举例来说，是革兰氏阳性细菌属，芽孢杆菌， 特别是，称为苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌品种的基因组。包括在术语 “DNA区段”之内的是DNA区段和此类区段的较小片段，还包括重组载 体，例如质粒，粘粒，噬菌粒，噬菌体等。
同样，包含一种分离的或纯化的晶体蛋白质编码基因的DNA区段是 指这样一种DNA序列即：除肽编码序列之外还可包括含某些其他元件如 基本上脱离其他天然存在的基因或蛋白质编码序列而分离出的调节序 列。在此方面，所述术语“基因”简单说来是指功能蛋白质-，多肽-或 肽-编码单位。如本领域人员所能理解的，此功能术语既包括基因组序 列，操纵子序列也包括表达(或可适合于表达)蛋白质，多肽或肽的较 小工程化基因区段。
“基本上脱离其他编码序列而分离出的”意指目的基因(在此情 况，是一种编码细菌晶体蛋白质的基因)构成所述DNA区段之编码区的 有意义部分，并且所述DNA区段不含天然产生的编码DNA之大部分如大 的染色体片段或其他功能基因或操纵子编码区。当然，这是指原初分离 的DNA区段，并且不包括后来通过人工加入到区段上的基因，重组基 因，合成的接头，或编码区。
在具体的实施方案中，本发明涉及分离出的DNA片段和结合有编码 Cry肽品种之DNA序列的重组载体，所述肽品种在其氨基酸序列内包括 了基本上如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中给出的氨基酸序列。
术语“基本上如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中给出的序列” 意指基本上对应于SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列的一部分并含相 当少的与这些序列当中任何序列的氨基酸不一致或生物学功能上不等价 的氨基酸。术语“生物学功能不等价”是本领域众所周知的并在本文进 一步详细定义(例如参见描述性实施方案)。因此，有约70％和约80％之 间，或更优选约81％和约90％之间或甚至更优选约91％和约99％之间氨基 酸序列一致性或功能等价于SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸的 序列就是“基本上如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中给出的”序列。
还应理解氨基酸和核酸序列可包括附加的残基，如附加的N-或C- 末端氨基酸或5’或3’序列，并且也基本上如本文公开的序列之一所给 出的，只要所述序列满足上面给出的标准，包括在涉及蛋白质表达之处 保持生物学蛋白质活性。附加末端序列特别应用在核酸序列上，例如可 包括所述编码区的5’或3’部分之侧翼的各种非编码序列或可包括各种 间隔序列，即已知出现在基因内部的内含子。
本发明核酸序列区段，不管其本身编码序列的长度如何，可与其他 DNA序列如启动子，多腺苷酸信号，附加的限制酶位点，多克隆位点， 其他编码区段等相结合，以至其全长变化很大。因此期望几乎任何长度 的核酸片段均可被使用，优选的总长度以便于在预期重组DNA方案中制 备并使用为限。例如核酸片段可制备成包括编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中公开的肽序列的短连续区段或可制备成与编码SEQ ID NO： 3或SEQ ID NO：4中公开的任何肽的DNA序列(并特别与SEQ ID NO： 1或SEQ ID NO：2中公开的那些DNA区段)一致或互补。例如DNA序列 如约18个核苷酸，和直到约10,000个，约5,000个，约3,000个， 约2,000个，约1,000个，约500个，约200个，约100个，约50 个和约14个碱基对长度(包括全部中间长度)也被认为是有用的。
不难理解，在上下文中“中间长度”意指引用范围之间的任何长 度，如18，19，20，21，22，23等；30，31，32等；50，51，52，53 等；100，101，102，103等；150，151，152，153等；包括200-500； 500-1,000；1,000-2,000；2,000-3,000；3,000-5,000之全部 整数；和达到和包括约5200核苷酸等的序列。
还应理解本发明不限于编码本发明肽的特定核酸序列，或编码SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的氨基酸序列特定核酸序列，包括那些在 SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中特别公开的DNA序列。因此，重组载 体和分离的DNA区段可以不同方式包括肽编码区本身，包括所述基本编 码区中经过选择性改变或修饰的编码区，或它们可编码仍包括这些肽编 码区的较大多肽，或可编码有变异氨基酸序列的生物学功能等价的蛋白 质或肽。
本发明DNA区段包含生物学功能等价肽。此类序列可由已知天然发 生的核酸序列内密码子的简并性和功能等价性的结果所引起并由此编码 蛋白质。另外，功能等价的蛋白质或肽可通过应用重组DNA技术而产 生，在应用中所述蛋白质结构的改变可根据被改变氨基酸的性质方面的 考虑而被工程化。通过应用定点突变技术可引入人为设计的改变，例如 给蛋白质的抗原性引入一些改进或检测突变子以检查分子水平的活性。
若需要的话，实验人员也可制备融合蛋白和肽，例如为纯化或免疫 检测之目的，在所述肽编码区与其他有所需功能的蛋白质或肽位于同一 表达单位内(例如可分别通过亲和层析和酶标编码区而被纯化的蛋白 质)。
重组载体构成本发明的另一方面。特别有用的载体被期望是其中所 述DNA区段之编码部分(无论编码全长蛋白质还是较小的肽)处于启动 子控制之下的那些载体。所述启动子可以是与编码本发明肽的基因自然 结合形式的启动子，比如可以通过分离位于与本文公开之组合物相连的 编码区段或外显子上游的5’非编码序列来获得(例如用重组克隆和/或 PCRTM技术)。
2.2 CRYET33和CRYET34 DNA区段作为杂交探针和引物
除了用于指导本发明晶体蛋白质或肽的表达外，本文讨论的核酸序 列还有各种其他用途。例如，它们在核酸杂交实施方案中还可用做探针 或引物。由此，期望包含如下序列区域的核酸区段将发现是特别有用 的，即所述序列区域由与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的14个核苷 酸长的连续DNA区段有序列相同或互补的至少14个核苷酸长度的连续序 列组成。较长的连续一致或互补序列例如那些约20，30，40，50， 100，200，500，1000，2000，5000bp等(包括所有中间长度和直到并 包括全长5200碱基对)在某些实施方案中也将是有用的。
这些核酸探针与晶体蛋白质编码序列特异性杂交的能力将使其在检 测给定样品中存在的互补序列是有用的。然而，展望其他用途，包括用 所述序列信息制备突变种的引物，或用在制备其他遗传构造的引物。
含由与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的DNA序列一致或互补的 10-14，15-20，30，50或甚至100-200核苷酸等连续核苷酸片段组成的 序列区域的核酸分子被特别期望作为杂交探针用于例如Southern和 Northern印迹。较小的片段将一般发现用于杂交实施方案中，其中所述 连续互补区域的长度可有不同，如在约10-14和约100或200核苷酸之 间，但在希望按照长互补序列检测时，可使用较大的连续互补区段。
当然，通过其他技术例如通过机械切割或通过限制酶消化也可获得 片段。例如小的核酸区段或片段可容易通过直接由化学法合成来制备， 如用自动寡核苷酸合成仪所通常实践的那样。获得片段的方法还包括应 用核酸再生技术如美国专利4,683,195和4,683,202(本文引用为 参考)PCRTM技术，将被筛选序列引入产生重组子用的重组载体以及分子 生物学领域技术人员所熟知的其他重组DNA技术。
因此，本发明核苷酸序列可因其能有选择的与DNA片段的互补区形 成双链分子而得到应用。根据所预期的应用，实验人员会期望利用不同 的杂交条件达到不同程度的对靶序列的探针选择性。对于要求高选择性 的应用，实验人员一般期望利用相对严谨的条件形成杂交，例如选择相 对低的盐和/或高的温度条件，如提供约50℃到约70℃的温度，约 0.02M到约0.05M NaCl的条件此类选择条件容错性小，若有的话，是 探针和模板或靶链之间的错配，因而适合于分离编码晶体蛋白质的DNA 区段。通过杂交检测DNA区段是本领域技术人员所熟知的，并且美国专 利4,965,188和5,176,995(本文引用为参考)中的是杂交分析方 法的示例。如Maloy等1993，Segal1976；Prokop，1991；和Kuby，1991 的教科书中所见到的指导方法是十分适合的。
当然，对某些应用来说，例如在期望利用与基本模板杂交的突变引 物链制备突变子时或寻求从相关品种，功能等价物分离编码晶体蛋白质 的序列等时，一般需要较低严谨的杂交条件以形成杂合双链。在这些情 况下，实验人员可能希望利用如约0.15M到约0.9M盐，温度范围从约 20℃到约55℃的条件。参考对照杂交，杂交品种由此可容易被鉴定为阳 性。在任何情况下，一般认为通过加入增量的甲醛(甲醛与增加温度一 样起稳定所述杂交双链的作用)可使条件更加严谨。因此，杂交条件可 易于掌握，因而一般是根据不同期望结果进行选择的一种方法。
在某些实施方案中，结合适当的方法，如一种标记，来使用本发明 核酸序列对鉴定杂交将是有利的。在本领域中有各种已知适合的指示剂 方法，包括荧光，放射性，酶或其他配体，如亲和素/生物素，它们能给 出可检测的信号。在优选实施方案中，实验人员更可能期望使用荧光标 记或酶标，如脲酶，碱性磷酸酶或过氧化物酶代替放射性或其他环境不 良试剂。在酶标的情况，比色指示剂底物已知能被利用来提供一种人眼 或分光光度法可见的方法，以鉴定与含互补核酸的样品的特异性杂交。
一般说，设想本文描述的杂交探针作为在溶液杂交试剂以及用固相 的实施方案中的试剂均是有用的。在牵涉固相的实施方案中，检测DNA (或RNA)被吸附或亲合固定到一种筛选基质或表面。然后，将这种固 定的单链化核酸与筛选探针在需要的条件下进行杂交。所述筛选条件将 取决于以所需具体标准为基础的具体环境(例如取决于G+C含量，靶核 酸的类型，核酸的来源，杂交探针的大小等)。在洗涤杂交的表面以除 去非特异性结合的探针分子后，通过所述标记的方法检测特异性杂交， 或甚至进行定量。
2.3 重组载体和晶体蛋白质表达
在其他实施方案中，期望通过定位一种重组或异源启动子控制下的 编码DNA区段而获得某些优点。如本文使用的，重组或异源启动子意指 正常情况下不与其天然环境中编码晶体蛋白质或肽的DNA区段结合的启 动子。这类启动子可包括正常情况下与其他基因结合的启动子，和/或从 任何细菌，病毒，真核生物，或植物细胞分离的启动子。天然状态下， 使用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞型，有机体，或甚至动物 中的表达是重要的。结合使用启动子或细胞型用于蛋白质表达是分子生 物学领域技术人员的常识，例如，参见Sambrook等1989。使用的启动子 可以是组成型的，或可诱导的，并能够在适当条件下使用以指导被引入 的DNA区段的高水平表达，如有利于大规模生产重组蛋白质或肽的情 况。所期望的用于高水平表达的适当启动子系统包括，但不限于Pichia 表达载体系统(Pharmacia LKB Biotechnology)。
将表达实施方案与制备重组蛋白质和肽联系起来，期望较长的DNA 区段将是最常使用的，而编码完整肽序列的DNA区段是最优选的。然 而，认为使用短的DNA区段指导晶体肽或抗原决定基核心区域的表达 (如可用于产生抗晶体蛋白质抗体)也属于本发明范围之内。编码从约 8到约50氨基酸长度，或更优选从约8到约30氨基酸长度，甚或更优 选从约8到约20氨基酸长度的肽抗原的DNA区段被认为是十分有用的。 这类肽抗原决定基可以是含来自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4连续氨 基酸序列的氨基酸序列。
2.4 晶体蛋白质转基因和转基因植物
还有另一方面，本发明提供产生转基因植物的方法，所述转基因植 物表达编码本发明的新型晶体蛋白质的核酸区段。产生转基因植物的过 程是本领域众所周知的。一般说，所述方法包括用含可操作连接到编码 苏云金芽孢杆菌CryET33或CryET34晶体蛋白质之编码区的启动子之 DNA区段转化适当宿主细胞。这样的编码区一般被可操作连接到转录终 止区，由此所述启动子能驱动所述编码区在细胞中的转录，并因此使细 胞能在体内产生所述重组蛋白质。另外，在需要控制，调节，或减少具 体重组晶体蛋白质在具体转基因细胞中表达量的情况下，本发明还提供 晶体蛋白质反意mRNA的表达。使用反意mRNA作为控制或减少细胞中给 定目的蛋白质量的方法是本领域所熟知的。
本发明的另一方面包括表达编码本文公开的一个或一个以上新型多 肽组合物之基因或基因区段的转基因植物。如本文所使用的术语“转基 因植物”意指已经掺入了DNA序列的植物，包括但不限于可能非正常存 在的基因，没有正常转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序 列，或希望引入到非转化植物中的任何其他基因或DNA序列如可正常存 在于非转化植物但需要遗传工程化或已改变了表达的基因。
期望在某些情况下本发明的转基因植物基因组将通过稳定引入一个 或多个cryET33或cryET34转基因(不管是天然的，合成修饰的，或突 变的)而被扩增。在某些情况下，一个以上的转基因将被引入到转化的 宿主植物细胞的基因组中。这种情况就是一个以上编码晶体蛋白质的 DNA区段被掺入到此植物基因组中时的情况。在某些情况下，可能需要 有一，二，三，四甚或更多的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质(天然的或重 组工程化的)被掺入或在所述转化的转基因植物中被稳定表达。
例如优选的可被引入的基因包括细菌来源的编码晶体蛋白质的DNA 序列，并特别是从芽孢杆菌种类获得的一个或多个本文描述的序列。十 分优选的核酸序列是从苏云金芽孢杆菌获得的那些序列，或为降低或增 强此类转化宿主细胞中的晶体蛋白质杀虫活性而被遗传工程化的任何序 列。
转化植物细胞和制备转基因细胞系的方法是本领域众所周知的， 并在本文给予讨论。当然，用于转化此类细胞的载体，质粒，粘粒， YACs(酵母人工染色体)和DNA区段一般将包含操纵子，基因，或本发 明的基因衍生序列(或天然或人工合成获得的)和特别是那些编码所公 开的晶体蛋白质的序列。这些DNA构建体进一步包括如启动子，增强 子，多接头，甚或对所期望的具体目的基因有正或负调节活性的基因序 列结构。所述DNA区段或基因可编码天然的或修饰的晶体蛋白质，所述 蛋白质将在产生的重组细胞，包括真核和原核细胞中表达，和/或对再 生植物有改进表型的影响。
通过将编码一个或多个对鞘翅目昆虫有毒的CryET33和/或 CryET34晶体蛋白质的转基因DNA区段掺入此类植物，这种转基因植物 可能对增加单子叶或双子叶植物的杀虫抗性来说是合乎需要的。特别优 选的植物包括草坪草，小麦，蔬菜，观赏植物，果树等。
在相关方面，本发明还包括由转化植物产生的种子，从此类种子 产生的后代，以及按照上述过程产生的原初转基因植物后代产生的种 子。此类后代和种子将含稳定结合到其基因组中编码晶体蛋白质的转基 因，并且此类后代植株将以孟德尔方式继承通过引入稳定的转基因而提 供的特征。已将编码一个或多个CryET33和/或CryET34晶体蛋白质或 多肽的转基因DNA区段掺入其基因组中的全部转基因植物是本发明的内 容。
2.5 定点诱变
定点诱变在通过基础DNA上的专一诱变制备各个肽或生物功能等价 蛋白质或肽方面是一种有用的技术。例如结合一个或多个前述方案，所 述技术进一步通过将一个或多个核苷酸序列的改变引入所述DNA提供便 利制备和检测序列突变的能力。定点诱变容许通过使用编码所需突变的 DNA序列的专一寡核苷酸序列以及足量的邻近核苷酸产生突变，以提供 足够大的引物序列和序列的复杂性而在被截断的缺失接头的两端形成稳 定的双链。一般说，约13或约14或约16或约17直到并包括约18或约 19或约20，或约21，22，23，24，25，26，27，28，29甚或约30，40 或约50等核苷酸长度的引物是优选的，在所述被改变的序列接头的两端 带有约5到10个残基。
一般说来，如各种出版物所例举的，定点诱变技术是本领域众所周 知的。如将被认识到的，所述技术一般利用既以单链又以双链形式存在 的噬菌体载体。定点诱变中使用的典型载体包括如M13噬菌体载体。这 些噬菌体易于购买到，而且它们的用途一般是本领域专业人员所熟知 的。在定点诱变中常规使用的还有双链质粒，这种诱变排除了目的基因 从质粒转移到噬菌体的步骤。
一般来说，本文所依照的定点诱变是通过首先获得单链载体或双链 载体的两条链的解链部分，在其序列内该部分包括了编码需要的多肽之 DNA序列。一般通过合成方法制备载有所需要的突变序列的寡核苷酸引 物。然后将该引物与单链载体一起退火，并在DNA聚合酶如大肠杆菌聚 合酶I Klenow片段的作用下，完成载有突变链的合成反应。因此，形成 一种异源双链，其中一条链编码原始非突变序列，而第二条链载有所需 要的突变。然后用这种异源双链转化适当的细胞，如大肠杆菌细胞，并 筛选其中包含载有突变序列形式的重组载体之克隆。
用定点诱变制备被筛选编码肽之DNA区段的序列变体被提供作为生 产有潜在用途品种的一种方法，而这不意味是对获得肽和编码它们的 DNA序列之序列变体的其他方式的限制。
2.6 CRYET33和CRYET34抗体组合物及制作方法
在具体实施方案中，发明者期望使用与本文公开的晶体蛋白质结合 的单克隆或多克隆抗体。制备和表征抗体的方法是本领域众所周知的 (例如参见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；本文引用为参考)。产生单克隆抗体(mAbs)的方法 一般沿着与制备多克隆抗体同样的路线开始。简言之，通过用与本发明 有关的免疫原组合物免疫动物制备多克隆抗体，并收集被免疫动物的抗 血清。可使用宽范围的动物品种生产抗血清。一般，用于生产抗血清的 动物是兔，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠或山羊。由于兔的血体积相对大， 优先选择兔生产多克隆抗体。
如本领域众所周知的，一种给定的组合物其免疫原性可有不同。因 此，常有必要强化所述宿主的免疫系统，如通过将肽或多肽免疫原与一 种载体偶联可达到的那样。典型的并优选的载体是匙孔嘁血蓝蛋白(KLH) 和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白，小鼠血清白蛋白或兔 血清白蛋白也可被用做载体。将多肽偶联到载体蛋白质的方法是本领域 众所周知的并包括戊二醛，间-maleimidobencoyl-N-羟琥珀酰亚胺酯， 碳二亚胺和双-二氮化联苯胺。
还是本领域众所周知的，一种具体的免疫原组合物的免疫原性可通 过使用所述免疫反应的非特异性刺激剂(称为佐剂)而被增强。举例型 的并优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(一种含被杀死的结核杆菌的免疫反 应非特异性刺激剂)，不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
生产多克隆抗体中使用的免疫原组合物的量随免疫中使用的免疫原 以及动物的性质而有不同。施用所述免疫原可使用各种途径(皮下，肌 内，皮内，静脉内和腹膜内)。通过在免疫后的各个阶段点采集被免疫 动物的血样可监测多克隆抗体的生产。也可给予第二次(增强)注射。 重复进行增强和滴定过程直到达到合适的滴度。当获得需要的免疫原性 水平时，可对免疫动物采血并分离和储存血清，和/或将所述动物用于生 产mAbs。
通过使用众所周知的技术可容易制备mAbs，如美国专利4,196, 265中例举的(本文引用为参考)。一般说，这种技术包括用选出的免 疫原组合物，例如纯化的或部分纯化的晶体蛋白质，多肽或肽，免疫合 适的动物。以一种有效刺激抗体生成细胞的方式施用所述免疫组合物。 啮齿类如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，也可使用兔，绵羊或蛙细 胞。使用大鼠可提供某些优点(Goding，1986，60-61页)，但小鼠是优 选的，BALB/c小鼠是最优选的，因为这是常规使用的并一般给出较高百 分比的稳定融合。
免疫之后，有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细 胞)，被选做用于所述生成mAb的方法。这些细胞可从活检脾脏，扁桃 体或淋巴结，或从外周血样获得。脾细胞和外周血细胞是优选的，前者 是因为它们是处于分裂的浆母细胞阶段之产抗体细胞的丰富来源，而后 者是因为外周血易于操作。通常，一组选定的动物被免疫并移出有最高 抗体滴度的动物脾脏并通过用注射器匀浆脾脏而获得脾淋巴细胞。一 般，一只免疫小鼠的脾脏含约5 X 107到2 X 108淋巴细胞。
然后将来自免疫动物的产抗体B淋巴细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞 (一般是与免疫动物同种的细胞)融合。适合于在产生杂交瘤的融合方 法中使用的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，有高融合效果的，和酶 缺陷的，这些使它们在某种只支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择 性培养基中不能生长。
许多杂交瘤细胞的任何一种可被使用，如本领域专业技术人员所熟 知的(Goding，1986年65-66页，Campbell 1984年75-83页)。例如 免疫动物是小鼠的情况，可使用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653， NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG 1.7 和S194/5XX0 Bul；大鼠的情况，可使用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3， IR983F和4B210；和U-266，GM-1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729- 6在与人细胞融合时都是有用的。
一种优选的鼠杂交瘤细胞是NS-1杂交瘤细胞系(也称为P3-NS-1- Ag4-1)，通过从NIGMS人类遗传学突变细胞保藏所索要细胞系保藏号 GM3573可方便获得该细胞系。可使用的另一小鼠骨髓瘤细胞是8氮鸟嘌 呤抗性小鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。
用于产抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞产生杂交的方法通常包 括将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1比率混合，尽管当一种试剂或促进细胞 膜融合的试剂(化学或电的)存在时，所述比率可分别从约20:1改变 到约1:1。使用仙台病毒的融合方法已有描述(Koheler和 Milstein，1975；1976)，也可用使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v) PEG，(Gefter等，1977)的融合方法。使用电诱导融合的方法也是适 合的(Goding，1986，71-74页)。
融合方法通常以低频率(约1 X 10-6至1 X 10-8)产生可存活的杂交。 然而，这并不成为问题，因为通过在一种选择性培养基中培养能从亲 本、未融合的细胞(特别是正常时会连续无限分裂的骨髓瘤细胞)区分 出可存活的融合杂交。所述选择性培养基一般是含阻断所述组织培养中 核苷酸的从头合成之试剂的那种培养基。典型并优选的试剂是氨基喋 呤，氨甲喋呤，和氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶的从 头合成，而氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。在使用氨基喋呤或氨甲喋呤时， 所述培养基补充以次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。在 使用氮丝氨酸时，所述培养基被补充以次黄嘌呤。
优选的选择培养基是HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞能在 HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞的所述补救途径的关键酶是缺损的，例如 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，因而它们不能存活。所述B细胞能 进行这个途径，但它们在培养中的寿命有限并且一般在约两周内死亡。 因此，只有在选择性培养基中存活的细胞是从杂交瘤和B细胞形成的那 些杂交细胞。
这种培养提供了一个杂交瘤细胞群，特异性杂交瘤从该细胞群选 出。一般说，通过微量滴定板中单克隆稀释培养细胞，随后通过检测各 个克隆上清(约两到三周后)的期望活性来进行杂交瘤的筛选。这种测 定应该是敏感的，简单的和快速的，如放射免疫测定，酶免疫测定，细 胞毒测定，空斑测定，斑点免疫结合测定等。
然后将选出的杂交瘤做系列稀释并克隆成各个产抗体细胞系，然后 克隆可被无限繁殖以提供mAbs。可在两个途径中利用这些细胞系产生 mAb。可注射(通常进入腹膜腔)所述杂交瘤进入为原始融合而提供的体 细胞和杂交瘤细胞所用类型的组织相容性动物。被注射的动物生出肿 瘤，所述肿瘤分泌由融合细胞杂交产生的特异性单克隆抗体。然后放出 所述动物的体液，如血清或腹水以提供高浓度的mAbs。也可体外培养各 个细胞系，其中mAbs被自然分泌到从中可被容易以高浓度收获的培养基 中。若需要的话，用过滤、离心和各种层析方法如HPLC或亲和层析可进 一步纯化由前述两法任何之一产生的mAbs。
2.7 ELISAs和免疫沉淀
ELISAa可结合本发明一起使用。在ELISA测定中，掺入了晶体蛋 白质抗原序列的蛋白质或肽被固定化在筛选表面上，优选展现蛋白质亲 和性的表面如聚苯乙烯微滴定板的孔。洗涤以除去不完全吸收的物质 后，最好用已知对所述检测抗血清在抗原上是中性的已知非特异性蛋白 质如牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白或乳粉溶液结合或包被测定板孔。这 样使得封闭了固定化表面的非特异性吸收部位，因而降低了由于抗血清 的非特异性结合到所述表面而引起的本底。
在结合抗原物质到所述孔之后，用非活性物质包被以降低本底，并 洗涤以除去未结合的物质，使所述固定化的表面与所述抗血清或待测临 床或生物学提取物接触，在某种程度上引导免疫复合物(抗原/抗体)的 形成。这种条件优选包括用如BSA，牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲生 理盐水(PBS)/的稀释液稀释所述抗血清。这些加入的试剂还易于 帮助减低非特异性本底。然后将分层的抗血清培养约2到约4小时，温 度优选按从约25℃到约27℃的顺序。培养之后，洗涤抗血清接触的表面 以便除去非免疫复合物物质。优选的洗涤方法包括用如PBS/吐温或硼 酸溶液洗涤。
所述检测样品与结合的抗原之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤 后，通过使对第一抗体有特异性的第二抗体经受同样处理可测定免疫复 合物的出现甚至测定其量。为提供检测方法，优选结合有酶的第二抗 体，在其与适当的显色底物一起温孵时产生颜色显影。因此，例如需要 使抗血清结合表面与脲酶或过氧化物酶偶联的抗人IgG接触并温孵一段 时间，并且在有利于发生免疫复合物形成的条件下进行(例如，在室 温，含PBS溶液如PBS吐温R中温孵约2小时)。
与第二酶标抗体一起温孵后，洗涤以除去未结合物质，标记的量通 过与生色底物如脲和溴甲酚紫或2，2’-联氮基-2-(3-乙基-笨噻唑啉)- 6-磺酸(ABTS)和过氧化氢，在过氧化物酶作为酶标记的情况下一起温孵 进行定量测定。然后通过检测颜色生成的程度，例如用可见光谱分光光 度计完成定量测定。
本发明的抗晶体蛋白质抗体对通过免疫沉淀分离其他晶体蛋白质抗 原特别有用。免疫沉淀法包括从一种复合混合物分离靶抗原成分，并用 于鉴别或分离微量蛋白质。为了分离膜蛋白质必须使细胞溶解成乳化微 团。因为其他试剂如胆盐在酸性pH或在二价阳离子存在时发生沉淀，故 优选非离子盐。
在另外可选实施方案中，本发明抗体对邻接的两个并列抗原是十分有用 的。这对加强抗原的局部化集中特别有用，例如酶-底物对。
2.8 蛋白质印迹法
本发明组合物将在免疫印迹或蛋白质印迹分析中很有用处。抗肽抗 体可被用做鉴别固定化到固体支持基质，如消化纤维素，尼龙或其结合 物上的蛋白质的高亲和力初级试剂。结合免疫沉淀法，随后进行凝胶电 泳，这些试剂可用做单步骤试剂在检测抗原时用，在该抗原检测中使用 的针对所述抗原的次级试剂引起反背景。这在被研究的抗原是免疫球蛋 白(排除结合细菌细胞壁成分使用的免疫球蛋白)特别有用。被研究的 抗原与所述检测试剂交叉反应，或它们以与交叉反应信号相同的分子量 进行迁移。
与蛋白质印迹结合使用的免疫学为基础的检测方法包括针对在这方 面被认为有特殊用处之抗毒素部分的酶，放射标记，或荧光标记的第二 抗体。
2.9 晶体蛋白质筛选和检测试剂盒
本发明探讨了筛选推测含晶体蛋白质多肽或晶体蛋白质相关多肽样 品的方法和试剂盒，或产这类多肽的细胞。一种试剂盒可含本发明的一 种或多种抗体，并也可含检测样品与本发明抗体间相互作用的试剂。所 提供的试剂可以是放射，荧光或酶标记的。所述试剂盒含已知能与一种 核酸或本发明抗体结合或发生反应的放射标记试剂。
所述试剂盒的试剂可被提供为液体溶液，可附着到固体支持物上或 可作为干粉。当所述试剂以液体溶液形式被提供时，优选液体溶液是水 溶液。当被提供的试剂被附着到一种固体支持物上时，优选固体支持物 可以是层析基质，多孔检测板，或显微镜玻片。当所提供的试剂是干粉 时，通过加入适当的溶剂(可提供)可重新配制所述干粉。
还有进一步的实施方案，本发明涉及免疫检测方法和相应的试剂 盒。建议本发明晶体蛋白质或肽可被用于检测与其发生反应的抗体，或 另选方案，按本发明制备的抗体可被用于检测晶体蛋白质或晶体蛋白质 相关的含抗原决定基的肽。一般说，这些方法包括首先获得被怀疑含有 这类蛋白质肽或抗体的样品，根据具体情况，在促使形成免疫复合物的 条件下，使所述样品与本发明的抗体或肽接触，然后检测所述免疫复合 物的存在。
一般说免疫复合物形成的检测是本领域众所周知的并通过应用许多 方法可完成检测。例如，本发明探讨了用ELISA，RIA，免疫印迹(例如 斑点印迹)，间接免疫荧光技术等。通过使用标记，如放射标记或酶标 (如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶等)一般将检测到免疫复合物的形 成。当然，通过使用第二结合配体如第二抗体或生物素/亲和素配体结合 方案(如本领域所知的)可发现另外的优点。
为测定之目的，建议根据具体情况，可利用被被怀疑含要待测晶体 蛋白质或肽或晶体蛋白质相关肽或抗体的实际上任何样品。期望此类实 施方案可应用在抗原或抗体样品滴定，应用在筛选杂交瘤等。在相关实 施方案中，本发明期望制备可被用于检测样品中晶体蛋白质或相关肽和/ 或抗体的试剂盒。样品可包括细胞，细胞上清液，细胞提取物，酶片 段，蛋白质提取物，或其他被怀疑含晶体蛋白质或肽的无细胞组合物。 一般说，本发明的试剂盒将包括适当的晶体蛋白质，肽或直接针对此类 蛋白质或肽的抗体，以及含这种抗体或抗原和试剂的免疫检测试剂和方 法。所述免疫检测试剂一般包括与抗体或抗原结合的一种标记，或与第 二结合配体结合的标记。例举的配体可包括直接针对有结合标记的第一 抗体或抗原或生物素或亲和素(或链霉亲和素)配体的第二抗体。当 然，如上所述，许多例举的标记在本领域是已知的并且所有配体可与本 发明结合使用。
容器一般包括抗体，抗原或检测试剂可置于其内的试管，并优选适 合分份的试管。本发明试剂盒一般还将包括一种方法，用于边缘密闭以 便上市销售的含所述抗体，抗原和试剂的容器。这类容器可包括注射或 吹塑成型的塑料容器，所需要使用的试管被保持在所述容器中。
2.10 抗原决定基核心序列
本发明还针对游离于全细胞和其他肽的蛋白质或肽组合物，所述组 合物包含一种被纯化的蛋白质或肽与一个或多个抗晶体蛋白质抗体发生 免疫学交叉反应，所述蛋白质或肽。特别是，本发明涉及从Cry蛋白质 或肽获得的抗原决定基核心序列。
本文所使用的术语“掺入与一个或多个抗晶体蛋白质抗体起免疫学 交叉反应的一个或多个抗原决定基”是指一种肽或蛋白质抗原，其包括 类似于位于晶体蛋白质或肽内的抗原决定基之一级，二级或三级结构。 类似性的水平一般将达到这样的程度即：直接针对所述晶体蛋白质或多 肽的单克隆或多克隆抗体也将结合到所述交叉反应性肽或蛋白质抗原 上，与其进行反应或否则与其识别。有各种免疫测试方法可与此类抗体 结合使用，如蛋白质印迹，ELISA，RIA等，所有这些方法是本领域专业 技术人员所熟知的。
适合在疫苗中使用的Cry免疫显性抗原决定基和/或其功能类似物 的鉴定是一种相对简单的事情。例如，可利用Hopp的方法，如美国专利 4,554,101中所论述的，此处引用为参考，该专利论述了以亲水性为 依据从氨基酸序列鉴定和制备抗原决定基。数篇其他的文章描述了所述 方法，并且以此为基础的软件还被使用以鉴别抗原决定基核心序列(例 如参见Jameson和Wolf 1988；Wolf等1988；美国专利号4,544， 101)。然后，通过应用肽合成或重组技术可容易掺入这些“抗原决定基 核心序列”的氨基酸序列到肽中。
与本发明结合使用的优选肽一般将是属于约8到约20个氨基酸长 度的一类，并优选约8到15个氨基酸序列长度。在某些情况下，例如在 制备免疫学检测的被检物时，建议较小的抗原晶体蛋白质衍生的肽将提 供些优点。例举的优点包括容易制备和纯化，相对低的成本和生产可重 复性提高，和有利的生物学分布。
建议通过制备合成肽可实现本发明的特殊优点，所述合成肽包括修 饰的和/或延伸的抗原决定基/免疫原性核心序列，所述序列导致针对晶 体蛋白质，特别是Cry和Cry相关序列的“通用”抗原决定基肽。在本 文的具体方面，这些抗原决定基核心序列被鉴定为具体的多肽抗原亲水 区。建议这些亲水区代表那些最有可能增强T细胞或B细胞的刺激作 用，并由此引出特异性抗体之产生的区域。
本文使用的抗原决定基核心序列是相对短的氨基酸片段，该片段与 本文公开的晶体蛋白质导向抗体上的抗原结合部位“互补”，因而将结 合到这个部位。应能理解在本公开的上下文中，术语“互补”指呈现彼 此吸引力的氨基酸或多肽。因此，本发明的某些抗原决定基核心序列可 从使用上根据其与相应蛋白质指导的抗血清竞争或可取代所需蛋白质抗 原的结合部位的能力进行定义。
一般说，不认为所述多肽抗原的大小特别关键，只要其至少大到足 以携带被识别的核心序列或几个序列即可。本公开所预期的最小有用核 心序列一般属于约8个氨基酸长度的那一类，优选10到20氨基酸长度 那一类的序列。因此，这种大小在需要时可以大一些，只要其含基本抗 原决定基核心序列即可。
抗原决定基核心序列的鉴定方法是本领域专业人员所知道的，例如 美国专利4,554,101中描述的(本文引用为参考)其论述了根据亲水 性鉴别和制备氨基酸序列的抗原决定基。而且，有许多现成的计算机程 序可在预测蛋白质的抗原部位中使用(参见Jameson和Wolf，1988；Wolf 等，1988)。计算机化的肽序列分析程序(例如DNAStarR软件， DNAStar公司，Madison，WI)对设计本公开的合成肽也可以是有用的。
抗原决定基序列或在序列内部包含一种抗原的决定基之肽的合成用 常规合成技术如固相法容易实现(例如通过使用市售的肽合成仪如 Applied Biosystems Model 430A肽合成仪)。然后，以此方式合成的 肽抗原可被分份成预定的量并以常规方式储存，如在水溶液中或(甚至 更优选)根据使用情况以粉末或冻干状态储存。
一般说，由于肽的相对稳定性，它们可容易以水溶液的形式储存 相当长的时间，若需要的话例如在实际上任何水溶液中无可察觉的降 解或抗原活性的损失直到六个月以上。然而，在期望持久的含水储存 时，一般将需要包括含缓冲液如Tris或磷酸盐缓冲液的试剂以维持 pH约7.0到约7.5。而且，可能需要包括抑制微生物生长的试剂如叠 氮钠或硫柳汞。为在水合状态下持久的水合储存，将需要储存在约4 ℃溶液中，或更优选在冷冻储存。当然，在冷冻或粉末状态下保藏所 述多肽时，它们可实际上例如被称量分份无限期储存，可在临用前用 预定量的水(优选蒸馏水)或缓冲液使其再水合。
2.11 生物学功能等价物
在本发明肽和编码这些肽之DNA区段的构件中可进行修饰和改变并 仍得到编码具有所需要特性的蛋白质或肽功能的分子。下面讨论基于改 变蛋白质的氨基酸以产生等价物，甚或改进的第二代分子的讨论。在本 发明的具体实施方案中，期望被诱变的晶体蛋白质对增加所述蛋白质的 杀虫活性，从而增加植物细胞中重组转基因的杀虫活性和/或表达是有用 的。按照表2中给出的密码子，通过改变所述DNA序列的密码子可完成 所述氨基酸的改变。
表2
例如蛋白质结构中的某些氨基酸可被替换成其他氨基酸而无相互作 用结合能力的可察觉到的损失，例如抗体的抗原结合区或底物分子上的 结合部位。正是由于蛋白质的相互作用能力和性质定义了蛋白质的生物 学功能活性，能在蛋白质序列中(当然还有其基础DNA编码序列)产生 某些氨基酸的替代，而仍得到有类似性质的蛋白质。因此发明者期望在 所公开的组合物之肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中可制造各种改 变而没有其生物学用途或活性的可见损失。
在制造这类改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在 赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性一般是本领域所了解的 (Kyte和Doolittle，1982，本文引用为参考)。人们接受氨基酸的相对 亲水特性对产生的蛋白质的二级结构有影响，后者依次又规定了所述蛋 白质与其他分子例如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等的相互作用。
每一种氨基酸根据其疏水性和电荷特性业已被指定了一个亲水指数 (Kyte和Doolittle，1982)，这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨 酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸 (+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨 酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯 氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(- 3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精 氨酸(-4.5)。
就本领域所知某些氨基酸可被有类似亲水指数或分数的其他氨基酸 替换而仍产生有类似生物学活性的蛋白质，即仍得到一个生物学功能上 等价的蛋白质。在制作这些改变时，优选亲水指数在±2以内的氨基酸 替换，特别优选在±1以内的亲水指数并甚至特别优选在±0.5以内的亲 水指数。
本领域还了解类似的氨基酸替换可以疏水性为基础有效进行。本文 引用为参考的美国专利4,554,101指出由于受到其紧邻氨基酸疏水性 的控制，一个蛋白质的最大局部平均疏水性与该蛋白质的生物学性质相 互关连。
如美国专利4,554,101中详述的，下面疏水性值已被指定给氨基 酸残基：精氨酸(+3，0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷 氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺 (+0.2)；甘氨酸；(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)； 丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(- 1.3)缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸 (-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
据了解一种氨基酸可被替换成有类似疏水值的另一种氨基酸仍得到 生物学等价，并特别是免疫学等价的蛋白质。在这类改变中，优选那些 具有疏水值是±2以内，特别优选在±1以内并甚至是更特别优选±0.5 以内的那些氨基酸替换。
综上所述，氨基酸替换因此以氨基酸侧链取代基的相对类似性为基 础，例如其疏水性，亲水性，电荷，大小等。将前述特性都纳入考虑的 替换实例是本领域专业人员众所周知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨 酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸， 亮氨酸和异亮氨酸。
2.12 作为杀虫剂的晶体蛋白质组合物以及使用方法
发明者期望本文公开的晶体蛋白质组合物将找到作为局部和/或整 体应用到田间作物，覆盖草，水果和蔬菜，以及观赏植物的杀虫剂的特 殊用途。在优选实施方案中，生物杀虫组合物包括表达本文公开的新型 晶体蛋白质之细菌细胞的一种油状可流动悬浮液。所述细胞优选是苏云 金芽孢杆菌EG10327细胞，然而，表达本文公开的新型核酸区段并产生 晶体蛋白质的任何细菌宿主细胞被认为是有用的，如苏云金芽孢杆菌，巨 大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，或假单孢菌属的种类。
在另一重要的实施方案中，生物杀虫组合物包括水喷洒的细粒。这 种细粒包含表达本文公开的新型晶体蛋白质的细菌细胞。优选的细菌细 胞是苏云金芽孢杆菌EG10327细胞，然而，如用本文公开的DNA区段转 化并表达所述晶体蛋白质的苏云金芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆 菌，E.coli，或Spp假单孢菌.细菌细胞也被认为是有用的。
在第三个重要的实施方案中，所述生物杀虫组合物包括可渗湿的粉 末，粉尘，小球，或胶体浓缩物。这种粉末包括表达本文公开的新型晶 体蛋白质的细菌细胞。优选的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌EG10327细 胞，然而，如用本文公开的DNA区段转化并表达所述晶体蛋白质的苏云 金芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，或假单孢菌属的 种类.细菌细胞也被认为是有用的。可配制这种干燥形式的杀虫组合物 以在渗湿时立即溶解开，或另外可选择溶解于一种控制释放，缓和释 放，或其他时间依赖性的形式中。
在第四个重要的实施方案中，生物杀虫组合物包括一种细菌细胞 的水悬浮液，如上面描述的那些表达所述晶体蛋白质的悬浮液。此类水 悬浮液可被提供作为一种用前稀释的浓缩储存液，或可选择作为一种稀 释好的即用型溶液。
就这些包括使用细菌细胞的方法来说，含所述晶体蛋白质基因的 细胞宿主可被培养在任何方便的营养培养基中，其中DNA结构提供一种 选择性优点，为选择性培养基做准备以使基本上全部或全部所述细胞保 留苏云金芽孢杆菌基因。然后，可结合常规方法收获这些细胞。或者， 在收获前处理所述细胞。
当杀虫组合物包含表达目的蛋白质的完整苏云金芽孢杆菌细胞 时，这种细菌可配制成各种方式。通过与各种惰性物质如无机物质(叶 硅酸盐，碳酸盐，硫酸盐，磷酸盐等)或植物物质(粉碎的玉米芯，稻 壳，胡桃壳等)混合，可将它们用做可湿性粉末，颗粒或粉尘。所述制 剂可包括扩散剂-黏附剂(spreader-sticker)佐剂，稳定剂，其他杀 虫性添加剂或表面活化剂。液体制剂可以是水为基础的或非水并以泡沫 应用的，悬浮液，可乳化的浓缩物等。所述成分可包括流变学试剂，表 面活化剂，分散剂或聚合物。
或者，通过天然或重组细菌体外表达系统可制备所述新型CryET33 和/或CryET34蛋白质，可以是包括来自SEQ ID NO：3或4的5-50 个，或5-150个氨基酸长的序列的肽，并分离供随后田间应用。所述 肽的含量优选为1-50％。在配制成活性杀虫制剂前，这种蛋白质可以 是粗细胞裂解物，悬浮液，溶胶等或可另选择被纯化，精制，缓冲，和 /或进一步加工的形式。同样，在某些情况下，需要 从表达所述晶体蛋白质的细菌培养物分离晶体和/或孢子并用此类晶体和 /或孢子的溶液，悬浮液，或溶胶制剂作为所述活性生物杀虫组合物。
无论应用的方法如何，活性成分的剂量按有效杀虫剂量使用，所述 剂量将根据如下因素，例如要被控制的具体鞘翅目昆虫，要被处理的具 体植物或作物，环境条件，和所述杀虫活性的组合物之方法，比率和量 而有不同。
所述杀虫组合物可通过配制带有所需农业可接受的载体的细菌细 胞，晶体和/或孢子悬液，或用分离的蛋白质来制造。所述组合物可在施 用前以适当方法如真空冻干，冷冻干燥，脱水干燥或在一种水合载体， 培养基或适合的稀释剂如生理盐水或其他缓冲液中配制成。配制成的组 合物可以是粉尘或颗粒物质形式，或在油(蔬菜或矿物油)中的悬浮 液，或水或油/水乳剂，或如可湿性粉末，或与任何其他供农业使用的载 体物质结合的形式。适合的载体物质可是固体或液体并是本领域众所周 知的。术语“农业可接受的载体”包含杀虫剂制剂技术中常规使用的全 部佐剂，例如惰性成分，分散剂，表面活性剂，增粘剂结合剂等；这些 都是杀虫剂制剂领域专业人员众所周知的。所述制剂可与一种或多种固 体和/或液体佐剂混合并通过各种方法制备，例如通过使用常规制剂技术 均匀混合，搅拌和/或研磨含适当佐剂的杀虫组合物。
通过常规方法，优选通过喷洒将本发明杀虫组合物应用到靶鞘翅目 昆虫的环境中，一般被应用到要被保护的植物或作物的叶上。杀虫剂应 用的强度和时间将根据专门针对要被处理的具体昆虫或作物的条件以及 环境条件来设置。活性成分对载体的比率将自然取决于所述杀虫组合物 的化学性质，溶解度和稳定性以及所期望的具体制剂。
其他应用技术，例如撒粉，喷淋，湿渍，土壤灌注，种子涂被，秧 苗涂被，喷雾，吹气，蒙雾，雾化等亦是可实施的并在某些情况下是需 要的，例如对付引起根和茎的昆虫疫病的昆虫或用于精致的植被或观赏 植物。这些应用方法亦是本领域专业人员所熟知的。
本发明的杀虫组合物可单独或结合其他化合物(包括但不限于其 他杀虫剂)在本发明方法中使用。本发明的方法还可用于与其他处理方 法如表面活性剂，去污剂，聚合物或定时释放制剂结合使用。本发明的 杀虫组合物可配制为整体或局部使用。
为用于环境，整体或叶片应用的杀虫组合物的浓度将依据具体组 合物，应用方法，环境条件，以及杀虫活性而有很大差别。一般说，生 物杀虫组合物将以至少约1％重量百分比浓度的应用配方存在并可是直 到和包括约99％重量百分比。所述组合物的干燥制剂可从所述组合物重 量的约1％到约99％或以上，而液体制剂一般可含约重量的1％到约99％，y 优选1％到50％，或以上的活性成分。包含全细菌细胞的制剂一般将含 每毫克约104到约107个细胞。
需要时，所述杀虫制剂可被施用到一个或多个应用中的具体植株 或目标区域，典型的每公顷田间作物应用比率范围在约50克到约500 克活性成分，或从约500克到约1000克，或从约1000克到约5000克 或以上的活性成分。
3.附图简述
附图是本说明书的一部分并被包括在内以进一步证明本发明的某 些方面。通过结合本文描述的具体实施方案的详述，参考一个或多个附 图可更好的理解本发明。
图1A，图1B和图1C显示cryET33基因(SEQ ID NO：1)和 cryET34基因(SEQ ID NO：2)的核苷酸碱基序列，和推导的CryET33 蛋白质(SEQ ID NO：3)和CryET34蛋白质(SEQ ID NO：4)氨基酸 序列。
图2显示pEG246的限制酶图谱。箭头指出cryET33基因(SEQ ID NO：1)和cryET34基因(SEQ ID NO：2)的位置和方向。PEG246在 E.coli中是有功能的(因为它衍生于pBR322)并且是青霉素抗性的 (AmpR)。限制性内切酶切点的缩写如下：R＝EcoRI，B＝BamHI。图2还 显示的是一千碱基(1kb)大小的标记。
图3与图2对应并基于和图2相同的标尺显示pEG1246限制酶图 谱。箭头指出cryET 33基因(SEQ ID NO：1)和cryET 34基因(SEQ ID NO：2)的位置和方向。PEG1246衍生于质粒pEG 246(图2)并含 芽孢杆菌属种类的质粒，插入到pEG246BamHI位点的pNN101(它表达对 氯霉素抗性[CamR]和四环素抗性[TetR])。pEG1246在大肠杆菌和苏云金 芽孢杆菌中都是有功能的。缩写与图2中的显示相同。
4.解释性实施方案的描述
4.1 本发明的一些优点
苏云金芽孢杆菌EG10327是一种天然存在的菌株，它呈现抗鞘翅目 昆虫包括棉铃象鼻虫，红色面粉甲虫幼体(Tribolium castaneum)和日 本甲虫幼体(Popillia japonica)的杀虫活性。苏云金芽孢杆菌 EG2158含对鞘翅目有毒的晶体蛋白质基因，类似于(或相同于) EG10327的晶体蛋白质基因。两种新型晶体毒素基因(称为cryET33和 cryET34)从EG2158克隆而来。所述cryET33基因编码29kDaCryET33晶 体蛋白质，而所述cryET34基因编码14kDa的CryET34晶体蛋白质。 CryET33和CryET34晶体蛋白质对红色面粉甲虫幼体，棉铃象鼻虫幼体 和日本甲虫幼体是有毒的。
4.2 定义
下面词和短语有如下所述的意义。
表达：细胞内过程的集合，包括由一种编码DNA分子如结构基因进 行的转录和翻译以产生一种多肽。
启动子：在提供结构基因表达控制元件的一个或或一组DNA序列上 的识别部位，并且RNA聚合酶与其专一性结合并起始所述基因的RNA合 成(转录)。
再生：从一个植物细胞(例如植物的原生质体或外植体)生长出一 个植物的过程。
结构基因：表达产生一种多肽的基因。
转化：引入外源DNA序列(例如一个载体，一个重组DNA分子)进 入细胞或原生质体的过程，在其中该外源DNA被整合到染色体中或能自 主复制。
转化细胞：一种细胞，其DNA已由于引入外源DNA分子进入该细胞 而被改变。
转基因细胞：从转化细胞衍生或再生的或从转基因细胞衍生的任何 细胞。例举的转基因细胞包括从转化植物细胞衍生的植物愈伤组织和如 叶，根，茎的具体细胞，例如从转基因植物获得的体细胞，或生殖细胞 (精子)。
转基因植物：从一个转化植物细胞或原生质体衍生的一株植物或其 后代，其中所述植物DNA含原先在同株的天然的非转基因植物中并不存 在的被引入的外源DNA分子。术语“转基因植物”和“转化植物”在本 领域中有时被用做同义词以定义其DNA含外源DNA分子的植物。然而， 更科学的修正认为是指从转化植物细胞或原生质体获得的再生植株或愈 伤组织作为转基因植物，并且本文将遵循这种用法。
载体：一种能在宿主细胞中复制的DNA分子和/或另一DNA区段可 与其通过操作连接以产生所附区段的复制的DNA分子。质粒是一种载体 实例。
4.3 探针和引物
另一方面，本发明提供的DNA序列资料容许制备有与本文公开中所 选多核苷酸基因序列进行特异性杂交的能力之相对短的DNA(或RNA)序 列。在这些方面，根据被选晶体蛋白质基因序列例如SEQ ID NO：1或 SEQ ID NO：2中给出的序列方面的考虑制备一个适当长度的核酸探针。 此类DNA和核酸探针与晶体蛋白质编码基因序列的特异性杂交能力为其 提供了在各种实施方案中的具体实用性。十分重要的是，所述探针可被 用于各种检验以测定一个给定实施例中互补序列的存在。
在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有好处的。使用PCRTM技 术，用本发明多核苷酸设计此类引物的序列以用于测定，扩增或诱变来 自苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白质基因的限定区段。通过PCRTM，使用此类 引物也可扩增其他品种来源的相关晶体蛋白质基因的区段。
为提供符合本发明的某些优点，用于杂交研究或检测的优选核酸序 列包括与至少14到30左右长的晶体蛋白质编码序列之核苷酸区段互补 的序列，如在SEQ ID No：1或SEQ ID NO：2中给出的序列。至少14 个核苷酸长度的大小有助于保证所述区段将有足够的长度形成稳定的并 具选择性的双链分子。然而为增加杂交物的稳定性和选择性，并由此增 强了所获得的特异性杂交分子的质量和水平，含区段互补序列大于14个 碱基长度的分子一般是优选的。一般将优选设计含14到20个核苷酸基 因互补区段的核酸分子，甚或如果需要会更长。例如通过化学法直接合 成所述片段，通过应用核酸再生技术如美国专利4,683,195和4， 683,202(本文引用为参考)的PCRTM技术，或通过从含适当插入片段和 适合的限制位点剪接选出的DNA片段可容易制备此类片段。
4.4 表达载体
本发明期望一种含本发明多核苷酸的表达载体。因此，在一个实施 方案中，表达载体是一种分离的并纯化的含操作连接到编码本发明多肽 之编码区的DNA分子，该编码区被操作连接到转录终止区，由此所述启 动子驱动所述编码区的转录。
本文所用的术语“操作连接”意指一个启动子以通过该启动子控制 和调节所述编码区转录的方式被连接到一个编码区。操作连接一个启动 子到一个编码区的方法是本领域众所周知的。
在一个优选实施方案中，编码本发明晶体蛋白质之DNA的重组子表 达优选是在芽孢杆菌宿主细胞中。优选的宿主细胞包括苏云金芽孢杆菌， 巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，以及相关的芽孢杆菌，而苏云金芽孢杆菌 宿主细胞是特别优选的。在细菌中有功能的启动子是本领域众所周知 的。芽孢杆菌晶体蛋白质的一个实例和优选的启动子包括包含cryET33 和cryET34基因启动子在内的任何已知晶体蛋白质基因启动子。或者， 通过人工可工程化诱变的或重组的晶体蛋白质编码基因启动子并用于促 进本文公开的新型基因区段的表达。
在一个可选实施方案中，使用一种转化的革兰氏阴性细菌如大肠杆 菌或假单孢菌属种类宿主细胞进行编码本发明晶体蛋白质的DNA之表 达。在大肠杆菌和其他革兰氏阴性宿主细胞中行使高水平表达目标多肽 功能的启动子也是本领域众所周知的。
本发明的表达载体被用于转化植物时，选择在植株中有驱动表达能 力的启动子。在植株中行使功能的启动子也是本领域众所周知的。在植 株中表达所述多肽有用的是那些被描述为可诱导的，病毒的，合成的， 组成型的启动子(Poszkowski等，1989；Odell等1985)，和时间调节 的，空间调节的，和时空调节的启动子(Chau等1989)。
还筛选了启动子将转化植物细胞或转基因植物转录能力指向编码区 的能力。结构基因可通过植物组织中的各种启动子来驱动。启动子可能 是接近组成型的，如CaMV35S启动子，或影响双子叶或单子叶植物的组 织特异性或发育特异性启动子。
在所述启动子是接近组成型的启动子如CaMV35S时，在各种被转化 植物组织中发现多肽表达的增加(例如，愈伤组织，叶，种子和根)。 或者，通过使用含组织特异性启动子的植物整合载体可使转化作用指向 特定的植物组织。
一个例举的组织特异性启动子是凝集素启动子，它对种子组织是特 异的。大豆种子的凝集素蛋白由单基因(Le1)编码，该基因只在种子成 熟期间表达并占种子总mRNA的约2％到5％。凝集素基因和种子特异性启 动子已被完全鉴定并用于指导转基因烟草植株中的种子的特异性表达 (Vodkin等1983：Lindstrom等，1990)。
含编码目的多肽编码区的一种表达载体被工程化在所述凝集素启动 子的控制下并且使用例如原生质体转化法(Dhir等，1991)将该载体引 入到植株中。所述多肽的表达被特异的指向所述转基因植物的种子。
组织特异性启动子转化的植物细胞所产生的本发明转基因植物可与 用不同组织特异性启动子转化的植物细胞发育来的第二种转基因植物杂 交以产生表现出在多于一个特异性组织中的转化作用。
例举的组织特异性启动子是玉米蔗糖合成酶1(Yang等1990)， 玉米乙醇脱氢酶1(Vogel等，1989)，玉米光捕获复合物 (Simpson，1986)，玉米热休克蛋白(Odell等，1985)，豌豆小亚单 位RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等1983)，Ti质粒甘露 碱合成酶(Langridge等，1989)，矮牵牛苷查尔酮异构酶(Van Tunen 等，1988)，大豆甘氨酸丰富蛋白酶1(Keller等，1989)，CaMV35s 转录本(Odell等，1985)和马铃薯patatin(Wenzler等，1989)。优 选的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子和S-E9小亚单位RuBP 羧化酶启动子。
选择哪个表达载体以及最终多肽编码区操作连接到哪个启动子直接 取决于所需要的功能性质，例如蛋白质表达的位置和时间以及要被转化 的宿主细胞。这些在构建重组DNA分子领域中固有的限制是众所周知 的。然而，在实践本发明中有用的载体能指导其所操作连接的多肽编码 区的表达。
在高等植物中对基因表达有用的典型载体是本领域众所周知的，并 包括从曾被描述的根癌土壤杆菌之根癌诱导质粒(Ti)(Rogers等， 1987)衍生的载体。然而，数个其他植物整合载体系统被认为在植物起 作用，包括曾被描述的pCaMVCN转移控制载体(Fromm等，1985)。质 粒pCaMVCN(购自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括花椰菜花叶病毒 CaMV35S启动子。
在优选实施方案中，用于表达所述多肽的载体包括一种在植物细胞 中有效的筛选标记，优选药物抗性筛选标记。一个优选的药物抗性标记 是其表达导致卡那霉素抗性的基因，即曾有描述的含胭脂碱合成酶启动 子的Tn5新霉素磷酸转移酶II(nptII)和胭脂碱合成酶3’-非翻译区 的嵌合基因(Roger等，1988)。
RNA聚合酶转录一个编码DNA序列通过一个聚腺苷酸出现的部位。 一般说，位于聚腺苷酸部位数百个碱基对下游的DNA序列起终止转录的 作用。那些DNA序列在此处被认为是转录终止区。那些区域是被转录的 RNA(mRNA)充分聚腺苷酸化所必需的。
制备表达载体的方法是本领域众所周知的。用于转化植物的表达 (转化载体)和制造这些载体的方法在美国专利号4,971,908，4， 940,835，4,769,061和4,757,011中有描述(其在此公开引用为 参考)。那些载体可被修饰以包含本发明的编码序列。
各种方法已被开发出以通过互补粘性末端或平头末端操作连接DNA 到载体中。例如，可加入互补同聚物尾到要被插入的DNA区段中并加入 到所述载体DNA。然后通过互补同聚物尾部之间的氢键使所述载体与DNA 区段结合起来以形成重组DNA分子。
编码有能力给细胞提供杀虫活性的多肽之编码区优选是CryET33或 CryET34苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质编码基因。在优选实施方案中，这 种多肽有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列，或那些序 列的功能等价物。按照这个实施方案，还优选包含SEQ ID NO：1的DNA 序列或SEQ ID NO：2的DNA序列之编码区。
4.5 新型晶体蛋白质的特性
本发明提供定义了全部或部分苏云金芽孢杆菌CryET33或CryET34 晶体蛋白质的新型多肽。
在一个优选实施方案中，本发明公开并要求保护一个分离和纯化的 CryET33蛋白质。所述CryET33蛋白质包含一个267氨基酸序列，并有 计算分子量为29,216Da。CryET33计算的等电点常数(pI)等于 4.78。所述CryET33蛋白质的氨基酸组成在表3中给出。
表3
CryET33的氨基酸组成
氨基酸 残基号 总％ 氨基酸 残基号 总％
Ala 14 (5.2) Leu 12 (4.5)
Arg 5 (1.9) Lys 14 (5.2)
Asn 22 (8.2) Met 3 (1.1)
Asp 12 (4.5) Phe 11 (4.1)
Cys 2 (0.7) Pro 12 (4.5)
Gln 7 (2.6) Ser 22 (8.2)
Glu 15 (5.6) Thr 39 (14.5)
Gly 18 (6.7) Trp 2 (0.7)
His 3 (1.1) Tyr 14 (5.2)
Ile 17 (6.3) Val 23 (8.6)
酸性氨基酸 (Asp+Glu) 27 (10.0)
碱性氨基酸 (Arg+Lys) 19 (7.1)
芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 27 (10.0)
疏水氨基酸 (芳香族氨基酸+Iie+Leu+Met+Val) 82 (30.5)
在另一实施方案中，本发明公开并要求保护一个分离和纯化的 CryET34蛋白质。所述CryET34蛋白质包含一个126氨基酸序列，并有 计算分子量为14,182Da。CryET34的计算等电点常数(pI)是4.26。 所述CryET34蛋白质的氨基酸组成在表4中给出。
表4
CryET34的氨基酸组成
氨基酸 残基号 总％ 氨基酸 残基号 总％
Ala 5 (3.9) Leu 4 (3.1)
Arg 2 (1.6) Lys 8 (6.3)
Asn 6 (4.7) Met 2 (1.6)
Asp 11 (8.7) Phe 4 (3.1)
Cys 2 (1.6) Pro 8 (6.3)
Gln 4 (3.1) Ser 9 (7.1)
Glu 7 (5.5) Thr 13 (10.2)
Gly 11 (8.7) Trp 3 (2.4)
His 1 (0.8) Tyr 11 (8.7)
Ile 8 (6.3) Val 7 (5.5)
酸性氨基酸 (Asp+Glu) 18 (14.2)
碱性氨基酸 (Arg+Lys) 10 (7.9)
芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 18 (14.2)
疏水氨基酸 (芳香族氨基酸+Iie+Leu+Met+Val) 39 (30.7)
4.6 新型蛋白质的命名
本发明已任意指定名称CryET33和CryET34给本发明的新型蛋白 质。同样，对编码这些多肽的新型核苷酸分别任意指定名称为cryET33 和cryET34。根据修改的晶体蛋白质内毒素(表1)命名法，正式指定的 基因和蛋白质名称将由苏云金芽孢杆菌命名委员会指定(为系统分类苏 云金芽孢杆菌晶体蛋白质而形成)。本发明人期望本发明任意指定的名 称将由对这些序列的官方命名来取代。
4.7 转化的宿主细胞和转基因植物
用含晶体蛋白质编码基因区段的一个或多个表达载体转化细菌，酵 母，植物细胞或整体植株的方法和组合物是本说明书的进一步内容。从 这样的转化过程获得的转基因细菌，酵母细胞，植物细胞或植株或从这 类转基因植物而来的后代和种子也是本发明的进一步实施方案。
转化细菌和酵母细胞的方法是本领域众所周知的。一般说，转化方 法类似于转化其他细菌或酵母如大肠杆菌或啤酒酵母所使用的众所周知 的方法。植物细胞的DNA转化方法包括土壤杆菌介导的植物转化，原生 质转化，基因转移进入花粉，注射进入生殖器，注射进入成熟胚和粒子 轰击法。这些方法的每一种都有其独特的优点和缺点。因此，引入基因 到具体植物植株中的一个具体方法对另一种植物植株可能不一定是最有 效的，但对一个具体植物植株是有用的方法则是众所周知的。
将转化DNA区段引入到细胞中有许多方法，但不是所有的方法都适 合于传递DNA给植物细胞。适当的方法被认为包括DNA能被引入细胞的 实际上任何方法，如通过土壤杆菌感染，DNA的直接传递例如通过PEG- 介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993)，通过干燥/抑制介导的 DNA吸收，通过电穿孔，通过用碳化硅纤维搅拌，通过加速DNA包被的 粒子等。在某些实施方案中，优选加速方法和例如包括微粒轰击法等。
将DNA引入到细胞中的技术是本领域专业人员所熟知的。传递基因 进入细胞的四种通用方法已有描述：(1)化学方法(Graham和wan der Eb，1973；Zatloukal等1992)；(2)物理方法如显微注射法 (Capecchi，1980)，电穿孔法(Wang和Nermann，1982；Fromm等， 1985；美国专利号5,384,253)和基因枪法(Johnston和 Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等， 1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受体介导机制法 (Curiel等，1991；1992；Wagner等1992)。
4.7.1 电穿孔法
对各种动物和植物细胞应用短促，高压脉冲导致在原生质膜中形成 纳米大小的孔。通过这些孔或作为伴随孔关闭而膜成分之再分配的结果 DNA被直接吸入细胞质。电穿孔可以是十分有效的并既可被用于克隆基 因的瞬时表达又可被用于建立携带整合有目的基因拷贝的细胞系。与磷 酸钙介导的转染和原生质体融合相比，电穿孔法常常产生携带一个(或 至少数个)整合拷贝的外源DNA的细胞系。
通过电穿孔的方法引入DNA是本领域专业人员众所周知的。在这个 方法中，某些降解细胞壁的酶，如降解果胶酶被利用使靶受体细胞比未 受处理的细胞更容易通过电穿孔法转化。或者，通过机械损伤使受体细 胞更易于转化。为通过电穿孔有效进行转化，可利用易碎组织，如细胞 的悬浮培养，胚生愈伤组织，或另选方案，可直接转化未成熟胚或其他 活体组织。通过使选择的细胞接触降解果胶酶(果胶酶)或有控制的机 械性损伤而使所选细胞的细胞壁部分降解。然后，此类细胞将作为电穿 孔(可在此阶段进行)转移DNA的受体，然后通过适当的挑选或筛选方 法根据新掺入的DNA的性质鉴定转化细胞。
4.7.2 微粒轰击法
将转化DNA区段传递给植物细胞的更优越的方法是微粒轰击法。在 这个方法中，可用核酸包被粒子并通过推进力传递进入细胞。例举的粒 子包括含钨，金，铂等的粒子。
微粒轰击法的优点除了其是能再现稳定转化单子叶植物的有效方法 之外还是其既不需要分离原生质体(Cristou等1988)又不需要对土壤 杆菌的感染有易感性。通过加速法传递DNA到玉米细胞中的方法的一个 解释性实施方案是Biolistics粒子传递系统，该系统被用于推进用DNA 包被的粒子或细胞通过筛子，如一个不锈钢或Nytex筛，到达用悬液中 培养的玉米细胞覆盖的滤器表面。所述筛子分散所述粒子以至其不是以 大的聚集物传递给受体细胞。发射装置和要被轰击的细胞之间的筛子间 隔被认为能降低发射物聚集的大小并可通过减少由于太大的发射物给受 体细胞造成的损伤而产生较高频率的转化。
对轰击法来说，悬液中的细胞优选集中在滤器或固体培养基上。或 者，未成熟的胚或其他靶细胞可被分布在固体培养基上。将要被轰击的 细胞放置在大的射弹终止板以下适当的距离。若需要的话，在加速装置 和要被轰击的细胞之间也可放置一个或多个筛子。通过使用本文描述的 技术，可获得直到1000或更多的瞬时表达一个标记基因的细胞灶。轰击 后48小时表达外源基因产物的一个细胞灶中的细胞数目通常在1到10 和平均1到3的范围。
在轰击转化中，可使轰击前培养条件和轰击参数最佳化以产生最大 数目的稳定转化子。在该技术中轰击的物理和生物学参数都是重要的。 物理因素是涉及操作DNA/微弹沉淀物方面的因素或影响大的或微小射弹 射程和速度方面的因素。生物学因素包括涉及轰击前和刚结束时对细胞 的操作，渗透调节靶细胞以帮助缓解轰击所伴随的损伤，还有转化DNA 的性质，如线性DNA或完整超螺旋质粒。轰击前处理被认为对未成熟胚 成功转化是十分重要的。
因此，考虑实验者可能希望在小规模研究中调整所述轰击的参数以 充分优化所述条件。实验者可能特别希望调整物理参数如空隙的距离， 射程，组织距离，以及氦气压。实验者也可能通过修改影响受体细胞生 理状态的条件使损伤还原因素(TRFs)最小化并因此可影响转化和整合 的效率。例如，渗透状态，组织水合情况以及受体细胞的次级培养阶段 或细胞周期可被调整以使转化最优化。根据本发明，其他常规调整的实 施方法将是本领域专业人员所熟悉的。
4.7.3 土壤杆菌-介导的转移
土壤杆菌-介导的转移是引入基因到植物细胞中的广泛应用性系 统，因为所述DNA可被引入到整体植物组织中，由此跳过从原生质体再 生一个完整的植株的需要。使用土壤杆菌-介导的整合有载体的植物以引 入DNA到植物细胞中是本领域众所周知的。例如，参见曾有描述的方法 (Fraley等，1985；Rogers等，1987)。而且，Ti-DNA的整合是导致 较少重排的一种相对精确的过程。通过边界序列限定要被转移的DNA区 域，而且，插入的DNA通常被插入到如(Spielmann等，1986； Jorgensen等，1987)描述的植物基因组中。
现代土壤杆菌转化载体能在大肠杆菌以及土壤杆菌中复制，使得能 如(Klee等，1985)描述的那样方便操作。而且，最近的土壤杆菌介导 的基因转移载体方面的技术进展已改进了基因和限制位点在所述载体中 的排列以便利构建能表达各种多肽编码基因的载体。被描述的载体 (Roger等1987)在启动子的侧翼有方便的多接头区并有直接表达插入 的多肽编码基因所需要的多腺苷酸部位，并且适合本目的。此外，既含 装备好的(armed)又含解除装备的(disarmed)Ti基因的土壤杆菌可 被用于所述转化。在那些土壤杆菌介导的转化是有效的植物植株中，由 于所述基因转移的易行和明确的性质，该方法是可选的方法。
叶脊和其他组织如子叶和胚轴的土壤杆菌介导的转化似乎限于土壤 杆菌自然感染的植物。土壤杆菌介导的转化在双子叶植物中最有效。少 数单子叶植物似乎是土壤杆菌天然宿主，尽管用如(Bytebier等1987) 描述的土壤杆菌载体在芦笋中已产生出转基因植物。因此，商业上重要 的谷类作物如水稻，玉米和小麦通常必须用不同选择方法转化。然而， 如上所述，用土壤杆菌也可完成芦笋的转化(例如，见Bytebier等 1987)。
用土壤杆菌转化方法转化的转基因植物在一条染色体上一般含一个 单基因。此类转基因植物可被认为是被加入基因的杂合子。然而，由于 词“杂合子”的使用通常暗示着在一对染色体的第二条染色体上同一座 位存在着互补的基因，并且在含如此的一个加入基因的植物中没有该基 因，这种植物的更准确的名称是独立分离子(independent segregant)，因为加入的，外源基因在有丝分裂和减数分裂期间独立分 离。
更优选的是被加入的结构基因是纯合的转基因植物；即含两个加入 的基因(一个基因在一对染色体的每个染色体上同一座位)的转基因植 物。通过有性交配(自体)含一个单加入基因的独立分离转基因植物， 使所产生的某些种子发芽和分析所产生的结果植株相对于对照组(天 然，非转基因的)或独立分离子转基因植物而增强的羧化酶活性，可获 得纯合的转基因植物。
应能理解两组不同的转基因植株也可交配以产生含两个独立分离的 被加入外源基因的后代。适当后代的自体繁殖可产生对两个被加入的， 编码目的多肽之外源基因是纯合的植株。与亲本回交并与非转基因植物 异型杂交也可被考虑。
4.7.4 其他转化方法
用基于磷酸钙沉淀，聚乙二醇处理，电穿孔，和这些处理方法的结 合可完成植物原生质体的转化(例如，参见Potrykus等，1985；lorz 等1985；Fromm等，1986；Uchimiya等1986；Callis等，1987； Marcotte等，1988)。
将这些系统应用到不同的植物植株取决于从原生质体产生具体植物 植株的能力。从原生质体再生稻谷类的解释性方法已有描述(Fujimura 等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等， 1986)。
为转化从原生质体不能成功再生的植物植株，可使用引入DNA到完 整细胞中的其他方法。例如从未成熟胚或外植体可实现稻谷类的再生， 如(Vasil，1988)描述的。此外，可使用“粒子枪”或高速微弹技术。 (Vasil，1992)
使用后一种技术，在小的金属粒子表面，DNA被携带通过细胞壁并 进入细胞质，如(Klein等，1987；Klein等，1988；McCabe等， 1988)描述的。所述金属粒子穿透通过数层细胞并因此使组织外植体内 的细胞转化。
4.8 产生昆虫抗性转基因植物的方法
通过用含重组cryET33和/或cryET34基因区段转化适当的宿主细 胞，如植物细胞，被编码的晶体蛋白质(即有抗鞘翅目杀虫活性的细菌 晶体蛋白质或多肽)的表达可导致昆虫抗性植物的形成。
作为实施例，使用如粒子轰击法(Maddock等，1991；Vaxil等， 1992)可利用含苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质编码区和适当选择标记的表 达载体转化胚胎植物细胞，如小麦或玉米细胞以传递包被在微弹上的 DNA进入所述受体细胞。然后从被转化的表达杀虫蛋白质的胚胎愈伤组 织再生转基因植物。
用本领域所知的其他细胞转化法，如土壤杆菌介导的DNA转移 (Fraley等，1983)也可完成转基因植物的形成。或者，通过直接DNA 转移进入花粉(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988)，通过 DNA注射进入植物生殖器(Pena等，1987)，或通过直接注射DNA基因 进入未成熟胚随后通过脱水干燥胚胎的再水化(Neuhaus等，1987； Benbrook等1986)可将DNA引入植物。
从单个植物原生质体转化子或从各种转化的外植块再生，发育和培 养植物是本领域众所周知的(Weissbach和Weissbach，1988)。该再生 和生长过程一般包括筛选转化细胞的步骤，培养那些个性化细胞通过通 常的胚胎发育阶段到生根的幼小植物阶段。转基因胚胎和种子同样被再 生。此后，得到的转基因生根的苗被栽种在适当的植物生长培养基如土 壤中。
从叶的外植块发育或再生含编码土壤杆菌产生的目的多肽之外来外 源基因的植物可通过本领域众所周知的方法如(Horsch等，1985)来完 成。在该方法中，转化子被培养在有选择试剂存在并在诱导被转化植物 植株中苗的再生之培养基中，如(Fraley等，1983)描述的。
这种方法一般在两到四个月内产生苗，然后那些苗被转移到含选择 性试剂和抗生素的适当诱导根培养基以防止细菌生长。然后将在选择性 试剂存在下生根以形成幼小植物的苗转移到土壤或使产生根的其他培养 基。这些方法依据所用的具体植物而有不同，这些不同是本领域众所周 知的。
所述再生的植物优选是自花受粉的以提供纯合转基因植物(如前所 述)。此外，使从所述再生植物获得的花粉与农业上重要的种子生长植 物(优选近交系)杂交。相反，来自那些重要品系植物的花粉被用于再 生植物的授粉。使用本领域技术人员所熟知的方法栽培含所需要多肽的 本发明转基因植物。
因此，本发明转基因植物具有被增加了数量的编码区(例如cry基 因)，所述编码区编码Cry目的多肽。一种优选的转基因植物是独立分 离子并能将该基因及其活性遗传给其后代。更优选的转基因植物是所述 基因是纯合的，并将该基因传递给其有性交配的所有子代。转基因植物 来源的种子可被种植在田间或温室，并且所生成的性别成熟的转基因植 物自花受粉以产生真正的育种植株。从这些植株而来的后代成为真正的 育种品系，作为实施例，在环境条件范围(优选在田间)这些品系被评 估增加的抗鞘翅目昆虫的杀虫能力。发明者期望本发明在创建商业目的 的转基因植物，包括各种覆盖草，小麦，玉米，水稻，大麦，燕麦，各 种观赏植物和蔬菜以及许多坚果和水果树或植物方面找到具体应用。
5.实施例
下面实施例被包括在内以证明本发明的优选实施方案。本领域专业 人员应能意识到所述实施例所遵循的在实施例中公开的技术代表了由发 明者发现的技术，以在本发明的实践中发挥良好作用，因而可被认为构 成了其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应能意识 到在被公开的所述具体实施方案中可做出许多改变并仍得到同样或类似 的结果而并不偏离本发明宗旨和范围。
5.1 实施例1-苏云金芽孢杆菌EG10327的分离
从遍及美国和国外一般性谷物保藏所各种来源获得作物灰尘样品。 所述作物灰尘样品被处理并散布在琼脂平板上以分离单个芽孢杆菌类型 的菌落，如美国专利5,264,364中描述的。
克隆的cryIIIA基因，正式名称为苏云金芽孢杆菌EG2158株的 cryC基因，在Donovan等，(1988)中有描述，而克隆的cryIIIB2基 因，正式名称为苏云金芽孢杆菌EG4961株的cryIIIC基因，在Donovan 等，(1992)中有描述，在菌落杂交方法中它们被作为探针使用。如 Donovan等，1988中描述的，CryIIIA基因探针由放射活性标记的 2.0kb HindIII-Xbal DNA限制片段组成。如Donovan等，1992中描述 的，CryIIIB2基因探针由放射活性标记的2.4kb SspI DNA限制片段组 成。菌落杂交方法如美国专利5,264,364中描述的进行。
用放射性标记的cryIIIA和cryIIIB2探针探察来自各个地区的五 十四个作物灰尘样品的约43,000个芽孢杆菌型菌落。来自希腊的一个 作物灰尘样品含约100个自然产生的与所述cryIIIA和cryIIIB2探针 杂交的芽孢杆菌型菌落。对这些自然存在的野生型菌落中的数个进行的 分析表明它们是相同的苏云金芽孢杆菌菌落，并且一个被命名为 EG10327的菌落被选用做进一步研究。苏云金芽孢杆菌菌株EG 10327于 1994年12月14日按照布达佩斯条约以保藏号NRRL B-21365由NRRL保 藏。
随后用所述放射性标记的cryIIIA和cryIIIB2探针还筛选了来自 各个地区的105个作物灰尘样品的约84,000芽孢杆菌型菌落，但没有 成功鉴定出含新的cryIII型基因的任何其他菌株。
苏云金芽孢杆菌被发现对鞘翅目昆虫的幼体，红色面粉甲虫，棉铃 象鼻虫和日本甲虫有显著杀虫活性。在所使用的检测条件下，菌株 EG10327对南方玉米根蠕虫科罗拉多马铃薯甲虫没有可检测到的杀虫活 性。从菌株EG 10327分离到一个命名为“截断的cryIIIA”的基因。截 断的cryIIIA基因被发现与所述cryIIIA基因(如Donovan等，1998 中描述的cryC基因)的前三分之二是一致的，但不含所述cryIIIA的最 后三分之一。若有的话，菌株EG10327之截断的cryIIIA基因产生很少 的杀虫蛋白质并且没有被进一步鉴定。
5.2 实施例2-EG10327的鞭毛血清型的评估
为表征菌株EG10327，进行了数项研究。一项研究被进行以表征其 鞭毛血清型。这些数据被提供于下。
法国巴黎巴斯德研究所的M.-M.Lecadet博士的实验室中测定了 EG10327菌株的鞭毛血清型。按照H.de Barjac(1981)描述的方法测定 了EG10327的血清型并发现它是苏云金芽孢杆菌的kurstaki株 (H3a，3b，3c)。先前描述的含CryIII相关基因的苏云金芽孢杆菌菌株 被发现有血清型morrisoni(菌株EG2158含CryIIIA)；血清型 tolworhi(含CryIIIB菌株EG2838)；和血清型kumamotoensis(含 CryIIIB2的EG4961菌株)(Rupair等，1991)。EG10327代表显示对鞘 翅目昆虫有毒的第一个苏云金芽孢杆菌kurstaki菌株。
5.3 实施例3--EG10327晶体蛋白质的评估
菌株EG10327通过对其产生的晶体蛋白质的表征而得到进一步评 估。通过在DSG孢子形成培养基[0.8％(重量/体积)Difco营养肉汤， 0.5％(重量/体积)葡萄糖，10mM磷酸氢二钾，10mM磷酸二氢钾， 1mMCa(NO3)2，0.5mM硫酸镁，10μM氯化锰，10μM硫酸铁]中培养 EG10327进行这些研究。然后通过离心和悬浮于去离子水中收获含孢子 和晶体蛋白质的孢子形成培养物。通过在100℃温孵溶解缓冲液[0.14M Tris pH8.0，2％(重量/体积)十二烷基磺酸钠(SDS)，5％(体积/体 积)2-巯基乙醇，10％(体积/体积)甘油和0.1％(重量/体积)溴酚兰] 中的EG10327孢子和晶体悬浮液5分钟而从其中溶解晶体蛋白质。
通过丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGA分析)使溶解的晶体蛋白质按 大小分级分离。在按大小分级分离后，通过用考马斯染料染色观察所述 蛋白质。SDS-PAGE分析显示从形成孢子的EG10327培养物中溶解了一个 约29kDa的主要晶体蛋白质(下文称为CryET33蛋白质)和一个约 14kDa的主要晶体蛋白质(下文称为CryET34蛋白质)。
通过如下测定它们的NH2末端的氨基酸序列进一步表征了EG10327 的29kDa CryET33蛋白质和14kDa CryET34蛋白质。将孢子形成 GE10327培养物与溶解缓冲液一起温孵并通过SDS-PAGE分析丙烯酰胺凝 胶使溶解的晶体蛋白质按大小分级分离。通过标准电印迹技术使所述蛋 白质从所述凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上。通过用考马斯染料染色观察 电印迹到滤膜上的CryET33蛋白质和CryET34蛋白质。用刀片切下含 CryET33蛋白质和CryET34蛋白质的滤膜部分。以此方式得到印迹到分 开的硝酸纤维素滤膜片上纯化蛋白质形式的CryET33蛋白和CryET34蛋 白。
对包含在硝酸纤维素滤膜片上的纯化的CryET33和CryET34实施标 准的自动Edman降解法以测定每个蛋白质的NH2末端氨基酸序列。
发现EG10327的CryET33蛋白质NH2末端序列是：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
GlyIleIleAsnIleGlnAspGluIleAsnAsnTyrMetLysGluValTyrGlyAlaThr
(SEQ ID NO：5)
发现EG 10327的CryET34蛋白质NH2末端序列是：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ThrValTyrAsnValThrPheThrIleLysPheTyrAsnGluGlyGluTrpGlyGlyPro
(Ala) (Asn)
(SEQ ID NO：6)
列于CryET34蛋白质序列下圆括号内的氨基酸残基表示可在 CryET34蛋白质指明位置存在的潜在可选氨基酸。由于使用自动Edman降 解法测定蛋白质氨基酸序列存在的内在不确定性，可选氨基酸是可能的。
应用计算机算法(Korn和Queen，1984)以使CryET33和CryET34 蛋白质的N末端序列与发明者注意到的全部苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质 的氨基酸序列比较，其中包括已在科学出版物，国际专利申请，或授予 专利中所发表的全部苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质序列。已发表序列的晶 体蛋白质连同出版物出处的列表在表5中给出。
表5
出版物中描述的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质
晶体蛋白质 参考来源
CrylA(a) J.Biol.Chem.，260:6264-6272
Cry1A(b) DNA，5:305-314
Cry1A(c) Gene，36:289-300
Cry1B Nucl.AcidsRes.，16:4168-4169
Cry1C Nucl.AcidsRes.，16:6240
Cry1Cb Appl.Environ.Micro.，59:1131-1137
Cry1C(b) Nucl.AcidsRes.，18:7443
Cry1D Nucl.AcidsRes.，18:5545
Cry1E EPO 358 557 A2
Cry1F J.Bacteriol.，173:3966-3976
Cry1G FEBS，293:25-28
CryV WO 90/13651
Cry2A J.Biol.Chem.，263:561-567
Cry2B J.Bacteriol.，171:965-974
Cry2C FEMS Microbiol.Lett.，81:31-36
Cry3A Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84:7036-7040
Cry3B Nucl.Acids Res.，18:1305
Cry3B2 Appl.Environ.Microbiol.，58:3921-3927
Cry3B3 U.S.5,378,625
晶体蛋白质 参考来源
Cry3C Appl.Environ.Microbiol.，58:2536-2542
Cry3D Gene，110:131-132
Cry4A Nucl.AcidsRes.，15:7195
Cry4B EPO 308,199
Cry4C J.Bacteriol.，166:801-811
Cry4D J.Bacteriol.，170:4732，1988
Cry5 Molec.Micro.，6:1211-1217
Cry33AkD WO 94/13785
Cry33BkD WO 94/13785
Cry34kD J.Bacteriol.，174:549-557
Cry40kD J.Bacteriol.，174:549-557
Cry201T635 WO 95/02693
Cry517 J.Gen.Micro.，138:55-62
Crya7A021 EPO 256,553B1
CryAB78ORF1 WO 94/21795
CryAB780RF2 WO 94/21795
CryAB78100kD WO 94/21795
Crybtpgs1208 EPO 382 990
Crybtpgs1245 EPO 382 990
Crybts02618A WO 94/05771
CryBuibui WO 93/03154
CryET4 U.S.5,322,687
CryET5 U.S.5,322,687
CryGei87 EPO 238,441
CryHD511 U.S.5,286,486
CryHD867 U.S.6,286,486
CryIPL U.S.5,231,008
CryMITS JP 6000084
CryPS17A WO 92/19739
CryPS17B U.S.5,350,576 and U.S.5,424,410
晶体蛋白质 参考来源
CryP16 WO 95/00639
CryP18 WO 95/00639
CryP66 WO 95/00639
CryPS33F2 WO 92/19739and U.S.5,424,410
CryPS40D1 U.S.5,273,746
CryPS43F WO 93/04587
CryPS 50Ca WO 93/04587and EPO 498,537A2
CryPS 50Cb WO 93/15206
Cryps52A1 U.S.4,849,217
CryPS63B WO 92/19739
CryPS69D1 U.S.5,424,410
Cryps71M3 WO 95/02694
CryPS80JJ1 WO 94/16079
CryPS81IA U.S.5,273,746
CryPS81IA2 EPO 405 810
Cryps81A2 EPO 401 979
CryPS81IB WO 93/14641
CryPS81IB2 U.S.5,273,746
Cryps81f U.S.5,045,469
Cryps81gg U.S.5,273,746
Cryps81rr1 EPO 401 979
Cryps86A1 U.S.5,468,636
CryX FEBS Lett.，336:79-82
CryXenA24 WO 95/00647
CrycytA Nucl.Acids Res.，13:8207-8217
没有发现EG10327的CryET34蛋白质的N末端序列与表5中鉴定的 任何已知苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质是同源的。
5.4 实施例4--EG2159CryET33晶体蛋白质的表征
先前已确定EG2159的68kDaCryIIIA蛋白质(在Donovan等 1988中称为CryC蛋白质)对科罗拉多马铃薯甲虫是有毒的，但在该菌 株中没有鉴定出对鳞翅目昆虫或双翅目昆虫有活性的蛋白质。
通过从EG2158(在Donovan等，1988中描述的)清除150Mda质 粒而从苏云金芽孢杆菌菌株EG2158衍生出菌株EG2159。除EG2159失去 了EG2158中存在的150Mda质粒外，EG2159与EG2158是一致的。由 EG2159产生的两种晶体蛋白质之一，68kDa CryIIIA蛋白质被分离并且 其编码基因被克隆并测序。这些结果先前由发明者(Donovan等1988) 描述过。一种次要的蛋白质，EG2159的29kDa蛋白质，尚未被进一步表 征。
本实施例描述了这个苏云金芽孢杆菌EG 2159的29kDa CryET33晶 体蛋白质之表征。
5.4.1 从EG2159分离晶体蛋白质
通过将含孢子加晶体蛋白质的EG2159孢子形成培养物悬浮于溶解 缓冲液80℃持续3分钟溶解EG2159的晶体蛋白质。通过SDS-PAGE按大 小分级分离被溶解的晶体蛋白质并通过用考马斯染料染色观察SDS-PAGE 凝胶中的蛋白质。用刀片从SDS-PAGE凝胶切出含29kDa蛋白质的凝胶切 片并通过标准电洗脱法从所述凝胶切片分离所述蛋白质。这些实验产生 苏云金芽孢杆菌菌株EG2159的CryET33晶体蛋白质纯化制剂。
5.4.2 29kDa蛋白质NH2末端测序
通过自动Edman降解法测定所述纯化的CryET33蛋白质的NH2末端 氨基酸序列。测出的29kDa蛋白质NH2末端部分的氨基酸序列是：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
MetGlyIleIleAsnIleGlnAspGluIleAsn---
TyrMetLysGluValTyrGlyAla
(SEQ ID NO：7) (SEQ ID NO：8)
位置12处的虚线(---)表示对于EG2159的CryET33蛋白质该氨基酸残 基不能确定。
5.4.3 结果
比较EG10327的CryET33蛋白质序列(SEQ ID NO：5)和在 EG2159(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8)中观察到的先前未表征的 29kDa蛋白质(Donovan等，1988)之NH2末端序列表明除了EG2159的 CryET33蛋白质中存在起始甲硫氨酸(Met)残基外，EG2159的29kDa蛋 白质的NH2末端与EG10327的CryET33蛋白质是一致的。
5.5 实施例5--从EG2158分离含CRY ET33和CRY ET34基因的DNA片 段
如上所述，EG2159菌株是从EG2158菌株衍生的。因此，EG2158 含与CryET33蛋白质一致的基因，下文称为cryET33基因，与EG2159菌 株一样。为克隆cryET33基因，使用反向遗传学方法。合成编码 CryET33蛋白质NH2末端的氨基酸1到11的33聚体寡核苷酸探针(命名 为WD68)。WD68的序列是：
5’-ATGGGAATTATTAATATTCAAGATGAAATTAAT-3’(SEQ ID NO：9)
在下述Southern杂交实验中WD68被用做探针以期鉴定来自含 cryET33基因的EG2158之DNA片段，其中CryET33基因编码29kDa CryET33蛋白质。通过标准溶菌酶/酚法从EG2158提取总DNA。用DNA限 制酶HindIII和EcoRI消化被提取的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳按大 小分级分离被消化的DNA。用先前描述的方法从凝胶将所述DNA片段印迹 到硝酸纤维素滤膜(Southern，1975)，并与已用T4激酶和[γ-32P]ATP 放射性标记的寡核苷酸WD68一起温孵。没有发现与WD68探针特异性杂 交的来自EG2158的独特DNA限制片段。
然后用不同的方法鉴定含所述cryET33基因的DNA限制片段。合成 编码所述CryET33蛋白质NH2末端氨基酸1到19的56聚体寡核苷酸探 针(命名为WD73)。所述WD73的序列是：
5’-ATGGGAATTATTAATATTCAAGATGAAATTAATNNNTATATGAAAGAAGTATATGG- 3’
(SEQ ID NO：10)
与WD73的氨基酸12相应的三个N代表三个次黄嘌呤核苷酸。次黄嘌呤 核苷酸残基被用在此位以编码所述CryET33蛋白质NH2末端序列中位置 12的相应未知氨基酸。次黄嘌呤核苷酸被认为是中性核苷酸，并既不促 进也不阻碍DNA链的结合。用T4激酶和[γ-32P]ATP放射标记WD73并将 其用于探察含EG2158总DNA的按大小分级分离之HindIII和EcoRI限 制片段的硝酸纤维素滤膜。WD73与EG2158DNA的约7.9kbHindIII片段 和约5.2kb的EcoRI片段特异性杂交。
5.6 实施例6--从ET2158克隆CRYET33和CRYET34
为分离前实施例中描述的5.2kbEcoRI片段，通过连接来自EG2158 菌株的按大小筛选的DNA EcoRI限制片段到大肠杆菌载体PBR322中构建 EG2158菌株的质粒库。这个方法包括通过细胞裂解随后酚提取DNA，首 先从EG2158菌株获得总DNA，然后用EcoRI限制酶消化总DNA，通过琼 脂糖凝胶电泳所述被消化的DNA，切下含大小约为4.0到6.0kb范围的 EcoRI DNA片段的凝胶切片，并从所述琼脂糖凝胶切片电洗脱按大小筛 选的EcoRI限制酶片段。这些片段与大肠杆菌质粒载体pBR322混合，该 载体亦被EcoRI消化过。所述pBR322载体携带有AmpR基因并且所述载 体在大肠杆菌中复制。将T4 DNA连接酶和ATP加入到按大小筛选的来自 EG2158菌株之DNA的限制片段与消化过的pBR322载体的混合物，以使 所述pBR322载体与EG2158限制片段连接。
然后如下转化所述质粒库进入大肠杆菌细胞(一种无cryET33和 cryET34目的基因的宿主生物)。连接后，将所述DNA混合物与AmpS大 肠杆菌宿主菌株，HB101，一起培养，该菌株已被用标准氯化钙法制成感 受态。大肠杆菌HB101被用做宿主菌株是因为这些细胞易于用质粒转化 并因为HB101天然状态不含苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质的基因。由于 pBR322有AmpR，获得重组质粒的所有宿主细胞是AmpR。用重组质粒转化 宿主细胞后，散布细胞在含Amp的琼脂培养基上。37℃培养过夜后，在 含Amp琼脂上长出数千大肠杆菌菌落，并然后将这些菌落印迹到硝酸纤 维素滤膜上供随后探测用。
然后在容许探针与那些被转化的含EG2158菌株之5.2kb EcoRI DNA片段的宿主菌落进行特异性结合的条件下，使用放射标记的寡核苷 酸WD73作为DNA探针。有数个大肠杆菌菌落与所述WD73探针特异性杂 交。一个WD73杂交菌落(被命名为大肠杆菌EG11460)被进一步研究。 大肠杆菌EG 11460含重组质粒(命名为pEG246)，其由pBR322加约 5.2kb的来自EG2158菌株之EcoRI限制插入片段组成。图2给出 pEG246的限制酶图谱。按照布达佩斯条约的条款含pEG246的大肠杆菌 菌株EG11460已被保藏在农业研究培养物保藏所，北方地区研究实验室 (NRRL)，其保藏号为NRRL B-21364。
用标准的Sanger双脱氧法测定被克隆的pEG246之5.2kbEcoRI片段 的约三分之一核苷酸碱基序列。测序显示所述5.2kb片段含两个邻近的编 码蛋白质的开放阅读框，并特别是含两个新型晶体毒素基因。上游的开 放阅读框(命名为cryET33)编码蛋白质的NH2末端序列与菌株EG2159和 EG10327的29kDa之CryET33蛋白质的NH2末端序列相匹配。下游基因(命 名为cryET34)编码蛋白质的氨基酸序列与测定的EG10327之14kDa CryET34蛋白质NH2末端氨基酸序列相匹配。这些新基因的DNA序列明显不 同于列于表5的苏云金芽孢杆菌已知晶体毒素基因的序列。
cryET33基因的DNA序列(SEQ ID NO：1)和推出的由cryET33基 因编码的CryET33蛋白质的氨基酸序列在图1A，图1B，和图1C中给 出。所述cryET33基因的蛋白质编码部分(SEQ ID NO：1)由开始于位 置136和终止于位置936的核苷酸所限定。如从所述cryET33基因 (SEQ ID NO：1)所推导的，所述CryET33蛋白质(SEQ ID NO：3)的 大小是29,216Da(267个氨基酸)。图1A，图1B，和图1C中还给出 的是cryET34基因DNA序列(SEQ ID NO：2)和推导的由cryET34基因 编码的CryET34蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。所述cryET34基 因的蛋白质编码部分(SEQ ID NO：2)由开始于位置969和终止于位置 1345的核苷酸所限定。如从所述cryET34基因(SEQ ID NO：2)所推导 的所述CryET34蛋白质(SEQ ID NO：4)的大小是14，182Da(126个 氨基酸)。
计算机算法(Korn和Queen，1984；Altschul等1990)被用于将 cryET33和cryET34基因的DNA序列以及所推导的CryET33和CryET34 蛋白质氨基酸序列与发明者所注意到的全部苏云金芽孢杆菌cry基因和 晶体蛋白质的序列(实施例3，5.3段描述的以及表5中列出的)比较并 与基因组序列数据库(国家基因组资源中心，Santa Fe，NM)中的全部基 因和蛋白质序列比较。所述cryET34基因序列(SEQ ID NO：2)和推导 的CryET34蛋白质序列(SEQ ID NO：4)没有发现与各自任何已知基因 或蛋白质相关。所述cryET33基因序列(SEQ ID NO：1)被发现仅与一 个已知基因有序列一致性且该序列一致性十分低。所述cryET33基因序 列(801个核苷酸)与Brown和Whiteley(1992)描述的苏云金芽孢杆 菌thompsoni亚种基因的序列(1,020个核苷酸)38％是一致的。所述 CryET33蛋白质的推导序列(SEQ ID NO：3)被发现仅与一已知蛋白质 有序列一致性，并且所述一致性非常低。CryET33蛋白质的完整氨基酸 序列(267个氨基酸)被发现与Brown和Whiteley，1992描述的对鳞翅 目幼虫有毒的蛋白质，苏云金芽孢杆菌thompsoni亚种晶体蛋白质(340 个氨基酸)的完整氨基酸序列27％是一致的。
对cryET33基因紧邻上游的DNA序列(图1A，图1B，和图1C核苷 酸1到135)检索其与晶体蛋白质基因的所有已知上游DNA序列之同源 性以及与基因组序列库中所有已知基因的DNA序列(表5)的同源性。 基因编码区上游紧邻之DNA序列常含表达相应基因的启动子。这项研究 没有导致发现同源性。
5.7 实施例7--重组CRYET33和CRYET34基因的表达
经验表明被克隆的苏云金芽孢杆菌晶体毒素基因在大肠杆菌中表达 不好，但常在重组苏云金芽孢杆菌菌株中高表达。含cryET33和 cryET34基因(图2)的pEG246能在大肠杆菌中复制，但不能在苏云金 芽孢杆菌中复制。为获得含cryET33和cryET34基因和能在苏云金芽孢 杆菌中复制的质粒，如下所述将芽孢杆菌属种类的质粒插入到pEG246 中。
用BamHI消化能在苏云金芽孢杆菌中复制并提供氯霉素抗性 (CamR)和四环素抗性(TetR)的芽孢杆菌属种类的质粒pNN101 (Norton等，1985)并将消化好的质粒与已用BamHI消化的质粒 pEG246混合。用T4连接酶加ATP连接两质粒。然后用所述连接混合物 转化感受态大肠杆菌DH5 α细胞。与所述质粒混合物一起温孵后，将所 述细胞置于含四环素的琼脂平板上。预期已吸收了由pNN101与pEG246 连接组成的质粒的细胞将是TetR。在培养约20小时后在含四环素琼脂平 板上长出数个TetR大肠杆菌菌落。
从一个TetR菌落分离出质粒DNA。用BamHI消化所述质粒并通过琼 脂糖凝胶进行电泳。该被命名为pEG1246的质粒由分别对应于质粒 pNN101和pEG 246的5.8kb和9.6kb的两个BamHI DNA片段组成。 PEG1246的限制酶图谱在图3中给出。
然后通过使用先前描述的方法(Macaluso和Mettus1991)通过电 穿孔用pEG1246转化苏云金芽孢杆菌菌株EG10368。未转化的EG10368 宿主细胞是晶体阴性(Cry-)和CamS。电穿孔后，转化混合物被散布到 含氯霉素的琼脂培养基上并在30℃培养约16小时。pEG1246转化的细胞 是CamR。一只CamR菌落(被命名为苏云金芽孢杆菌菌株EG11403)含与 pEG1246一致的限制酶谱的质粒。
在含氯霉素的DSG孢子形成培养基中22℃到25℃培养菌株 EG11403的细胞直到形成孢子并发生细胞裂解(4-5天)。显微镜检查显 示EG11403菌株形成孢子的培养物含孢子和小的自由浮动的纺锤状和不 规则形状的晶体。所述晶体类似于用EG10327菌株形成孢子培养物所观 察到的晶体。
来自EG11403菌株的孢子，晶体和细胞碎片通过离心收集起来。用 去离子水洗离心沉淀物一次并重悬浮所述沉淀物于去离子水中。
所述EG11403悬浮液中的晶体蛋白质通过溶解和SDS-PAGE分析给 予表征。SDS-PAGE分析显示EG11403菌株产生29kDa和14kDa两种主要 蛋白质。如所预期的，EG11403菌株的29kDa和14kDa蛋白质分别与 EG10327产生的29kDaCryET33蛋白质和14kDaCryET34蛋白质大小一 致。根据布达佩斯条约条款，EG11403菌株于1994年12月14日被保藏 在农业研究培养物保藏所，北方地区研究实验室(NRRL)，保藏号为 NRRL B-21367。
编码EG11403的29kDa CryET33蛋白质的基因是cryET33基因， 而编码EG11403的14kDa CryET34蛋白质之基因是cryET34基因。苏云 金芽孢杆菌菌株EG11403和EG10327产生约等量的CryET33蛋白质。相 反，苏云金芽孢杆菌菌株EG2158产生CryET33蛋白质的量约是菌株 EG11403或菌株EG10327的1/10。
5.8 实施例8--含CRYIIIB3，CRYET33和CRYET34的苏云金芽孢杆菌 EG11402
先前显示命名为CryIIIB3的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质对日本甲 虫的幼体是有毒的(美国专利号5,264,364)。在下面实施例中，所 述CryET33和CryET34蛋白质被发现对棉铃象鼻虫，和日本甲虫幼体是 有毒的。所述Cry3B3蛋白质与所述CryET33蛋白质或与所述CryET34 蛋白质均无氨基酸序列同源性。在试图产生有增强日本甲虫毒性的菌株 时，所述cry3B3，cryET33和cryET34基因被如下结合在一个菌株中。
菌株EG10364是一种含cryIIIB3基因的野生型苏云金芽孢杆菌菌 株。EG10364产生日本甲虫幼体毒性的Cry3B3蛋白质。含cryET33和 cryET34基因的pEG1246(图3)被用于电穿孔转化EG10364以产生菌株 EG11402。EG11402除其也含有pEG1246(载有克隆的cryET33和 cryET34基因)外与EG10364是一致的并且因而是CamR。
在室温，菌株EG11402被培养在加氯霉素的DSG孢子形成培养基 中直到孢子形成并发生细胞裂解(4-5天)。晶体蛋白质从形成孢子的 EG11402培养物溶解，并且溶解的蛋白质通过SDS-PAGE按大小被分级分 离。该分析显示菌株EG11402产生三种晶体蛋白质：与所述CryIIIB3蛋 白质相应的一种70kDa晶体蛋白质，与所述CryET33蛋白质相应的 29kDa晶体蛋白质，和与所述CryET34蛋白质相应的14kDa晶体蛋白 质。SDS-PAGE分析显示除了无氯霉素外，在与EG11402相同条件下培养 的菌株EG10364产生与EG11402类似数量的70kDaCryIIIB3蛋白质。 按照布达佩斯条约的条款，菌株EG11402于1994年12月14日被保藏在 农业研究培养物保藏所，北方地区研究实验室(NRRL)，保藏号为NRRL B-21366。
5.9 实施例9--CRYET33和CRYET34对日本甲虫幼体的毒性
测定了三个苏云金芽孢杆菌菌株对日本甲虫幼体(Popillia japonica)的毒性：(1)产生所述CryET33和CryET34晶体蛋白质的 菌株EG10327；(2)产生所述Cry3B3晶体蛋白质的菌株EG10364；和 (3)产生所述CryET33，CryET34和Cry3B3晶体蛋白质的菌株 EG11402。
在室温，DSG孢子形成培养基中培养菌株EG10327，EG10364和 EG11402直到形成孢子和发生细胞裂解(4-5天)。对EG11402，所述培养 基中含5微克/毫升氯霉素。通过离心浓缩发酵肉汤并且含孢子，晶体蛋白 质和细胞碎片的沉淀物被冷冻干燥成粉末或被悬浮于去离子水中以产生水 悬浮液。冷冻干燥粉末和所述悬浮液中Cry3B3和CryET33晶体蛋白质的量 用SDS-PAGE技术和痕量考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的光密度计以纯化并 定量的Cry3A蛋白质为标准进行定量。通过肉眼观察考马斯染色的SDS- PAGE凝胶估计所述CryET34蛋白质的量。该观察表明所述CryET34蛋白质 的量大致等于菌株EG10327和EG11402中CryET34蛋白质的量。
日本甲虫幼体的生物检测方法进行如下。每个待测菌株冻干粉被悬 浮在一种稀释剂(含0.005％Triton 的水溶液)中并掺入100毫 升先前描述的(Ladd，1986)昆虫食品为基础的热(50-60℃)液体人工 食品中。使所述混合物固化在培养皿中，然后将所述被固化食品的19毫 米直径塞放入5/8盎司塑料杯中。每杯放入一只日本甲虫幼体，用一个 盖罩住所述杯子并在25℃保持14天，然后记录死亡率。一式两份16只 幼体进行该项研究。
该毒性测试的结果在下表6中给出，其中杀虫活性被报告为死亡幼体的百分 数，以对照死亡数修正死亡百分率，所述对照是仅掺入到所述食品塞中的稀释剂。
表6
CRYET33，CRYET34和CRY3B3对日本甲虫幼体的活性
菌株 存在的蛋白质 蛋白质剂量 昆虫死亡率
EG10327 CryET33 ～4,000ppm 95％
CryET34 NDa
EG10364 Cry3B3 500ppm 38％
EG11402 Cry3B3 560ppm 58％
CryET33 ～1,000ppm
CryET34 ND
ND，未测定
表6中给出的结果证明所述CryET33和CryET34蛋白质对日本甲虫 幼体有明显毒性。产生所述CryET33和CryET34蛋白质的EG10327对日 本甲虫幼体是有毒的。产生所述Cry3B3蛋白质的EG10364对日本甲虫幼 体也是有毒的。当cryET33和cryET34基因被加入到EG10364(导致除 Cry3B3蛋白质外还产生CryET33和CryET34蛋白质的EG11402)时，观 察到对日本甲虫幼体的毒性增强。
5.10 实施例10--CRYET33和CRTET34对红色面粉甲虫幼体的毒性
测定四只苏云金芽孢杆菌菌株对红色面粉甲虫幼体(Tribolium castaneum)的毒性：(1)产生CryET33和CryET34晶体蛋白质的 EG10327；(2)产生Cry3B3晶体蛋白质的EG10364；(3)产生CryET33 和CryET34晶体蛋白质的EG11403；和(4)产生Cry3B3，CryET33和 CryET34晶体蛋白质的EG11402。所述四只菌株被培养在DSG培养基中直 到孢子形成和细胞裂解发生，如实施例9中的描述制备水悬浮液或冻干 粉。通过施用已知数量的每种菌株制剂到人工食品并将所述食品饲喂红 色面粉甲虫幼体来测定各菌株对红色面粉甲虫幼体的毒性。
该毒性测试结果在表7中给出，其中杀虫活性被报告为昆虫死亡率百分数， 用对照死亡修正所述百分死亡率，所述对照是仅掺入到所述食品中的稀释剂。
表7
CRYET33，CRYET34和CRY3B3蛋白质对红色面粉甲虫幼体的毒性
菌株 蛋白质 蛋白质剂量 昆虫死亡率
EG10327 CryET33 ～2,000ppm 100％
CryET34 NDa
EG10364 Cry3B3 448ppm 74％
EG11402 Cry3B3 448ppm 97％
CryET33 ～2,000ppm
CryET34 ND
EG11403 CryET33 ～2,000ppm 39％
CryET34 ND
ND，未测定
表7给出的结果证明CryET33和CryET34蛋白质对红色面粉甲虫幼 体有明显水平的毒性。自然存在的产CryET33和CryET34蛋白质的菌株 EG10327对红色面粉甲虫幼体是十分有毒的。产生Cry3B3蛋白质的 EG10364对红色面粉甲虫幼体是有毒的。产生CryET33和CryET34蛋白 质的EG11403对红色面粉甲虫幼体是有毒的。当cryET33和cryET34基 因被加入到EG10364(产生EG11402)时，在产生CryET33，CryET34和 Cry3B3蛋白质的所得菌株中观察到对红色面粉甲虫幼体的毒性增强。 5.11 实施例11--CRYET33和CRYET34对棉铃象鼻虫幼体的毒性
如上述培养产生CryET33和CryET34蛋白质的EG11403。所述蛋白 质晶体被洗涤溶解于碳酸盐缓冲液中，透析并过滤通过一个0.2U的 acrodisc。然后通过加入已知数量的所述蛋白质到人工食品并饲喂所述食 品给棉铃象鼻虫幼体来测定所述溶解的蛋白质的毒性。该毒性测试结果被 显示如下，其中杀虫活性被报告为(1)死亡百分率，用缓冲液对照，根 据对照死亡修正所述死亡率；或(2)百分死亡率+未发育超过第一虫龄的 幼虫百分率，用缓冲液对照，根据对照死亡再次修正所述死亡率。
表8和表9中给出的结果证明CryET33和CryET34蛋白质对棉铃象 鼻虫有明显水平的毒性。
表8
(1)棉铃象鼻虫死亡百分率
微克/毫升 ％死亡率
40 50
20 46.67
10 11.76
5 6.67
2.5 0
1.25 6.67
0.31 0
0.08 10
表9
(2)死亡百分率+第一虫龄
微克/毫升 ％死亡率+第一虫龄
40 100
20 93.33
10 64.71
5 40
2.5 11.11
1.25 6.67
0.31 5.88
0.08 10
本文所公开的和要求保护的全部组合物和方法均可按本说明书的教 导不需过多的实验就可制造和实施。当本发明的组合物和方法以优选实 施方案的形式描述时，本领域技术人员显然清楚对本文描述的组合物， 方法以及方法的步骤或步骤次序可做修改而不偏离本发明的概念，实质 和范围。更具体的说，显然，某些化学和生理上相关的试剂可用做本文 描述的试剂代用品而又达到同样或类似的结果。本领域技术人员所知的 全部此类代用品和修饰方法均被认为属于如所附权利要求限定的本发明 的实质，范围和概念之内。因此，应被授予专利的独占权利如下面权利 要求书所述。
1.发明背景
本申请是基于1996年九月二十四日提交的美国专利序列号 08/718,905的申请之延续部分，其全部内容特在此引用作为参考以符 合其完整性。
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1991年10月8日授予的美国专利号5,055,294。
1991年10月15日授予的美国专利号5,128,130。
1991年10月15日授予的美国专利号5,176,995。
1991年10月15日授予的美国专利号5,187,091。
1993年11月23日授予的美国专利号5,264,364。
1994年2月15日授予的美国专利号5,286,486。
1995年1月24日授予的美国专利号5,384,253。
1995年8月15日授予的美国专利号5,441,884。
1989年3月22日公开的欧洲专利号0308199。
1989年5月31日公开的欧洲专利号0318143。
1989年7月19日公开的欧洲专利号0324254。
1990年8月22日公开的欧洲专利号0382990。
1990年11月15日公开的国际专利申请公开号WO90/13651。
1991年5月30日公开的国际专利申请公开号WO91/07481。
1991年7月25日公开的国际专利申请公开号WO91/10725。
1991年10月31日公开的国际专利申请公开号WO91/16433。
1993年2月18日公开的国际专利申请公开号WO93/03154。
1994年6月23日公开的国际专利申请公开号WO94/13785。
1994年7月21日公开的国际专利申请公开号WO94/16079。
1995年1月26日公开的国际专利申请公开号WO95/02693。
1995年3月9日公开的国际专利申请公开号WO95/06730。
1995年11月16日公开的国际专利申请公开号WO95/30752。
1995年11月16日公开的国际专利申请公开号WO95/30753。
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7.序列表
(1)一般资料
(i)申请人
(A)名称：ECOGEN公司
(B)街：2005 Cabot Boulevard West
(C)城市：Langhorne
(D)州：宾西法尼亚
(E)国家：美国
(F)邮编(ZIP)：19047-3032
(ii)发明题目：苏云金芽孢杆菌CRYET33和CRYET34组合物
及其使用
(iii)序列号：10
(iv)计算机可读形式：
(iii)序列号：10
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Rel ease #1.0，版本号1.30(EPO)
(vi)先前申请资料：
(A)申请号：US 08/718,905
(B)提交日期：1996年9月24日
(2)SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
(A)长度：807碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
ATGGGAATTA TTAATATCCA AGATGAAATT AATAATTACA TGAAAGAGGT ATATGGTGCA 60
ACAACTGTTA AAAGCACATA CGATCCCTCA TTCAAAGTAT TTAATGAATC TGTGACACCC 120
CAATTCACTG AAATTCCAAC AGAACCTGTA AATAATCAAT TAACTACAAA AAGAGTAGAT 180
AATACGGGTA GTTACCCAGT AGAAAGTACT GTATCGTTCA CATGGACGGA AACCCATACA 240
GAAACAAGTG CAGTAACTGA GGGAGTGAAA GCCGGCACCT CAATAAGTAC TAAACAATCT 300
TTTAAATTTG GTTTTGTTAA CTCTGATGTT ACTTTAACGG TATCAGCAGA ATATAATTAT 360
AGTACAACAA ATACAACTAC AACAACAGAA ACACACACCT GGTCAGATTC AACAAAAGTA 420
ACTATTCCTC CCAAAACTTA TGTGGAGGCT GCATACATTA TCCAAAATGG AACATATAAT 480
GTTCCGGTTA ATGTAGAATG TGATATGAGT GGAACTTTAT TTTGTAGAGG GTATAGAGAT 540
GGTGCGCTTA TTGCAGCAGT TTATGTTTCT GTAGCGGATT TAGCAGATTA CAATCCAAAT 600
TTAAATCTTA CAAATAAAGG GGATGGAATT GCTCACTTTA AAGGTTCGGG TTTTATAGAG 660
GGTGCACAAG GCTTGCGAAG CATTATTCAG GTTACAGAAT ATCCACTAGA TGATAATAAA 720
GGTCGCTCGA CACCAATAAC TTATTTAATA AATGGTTCAT TAGCACCAAA TGTTACATTA 780
AAAAATAGCA ACATAAAATT TTTAATAA 807
(2)SEQ ID NO：2资料：
(i)序列特征：
(A)长度：381碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
ATGACAGTAT ATAACGCAAC TTTCACCATT AATTTCTATA ATGAAGGAGA ATGGGGGGGG 60
CCAGAACCAT ATGGTTATAT AAAAGCATAT CTTACAAATC CAGATCATGA TTTTGAAATT 120
TGGAAACAAG ATGATTGGGG GAAAAGTACT CCTGAGAGAA GTACTTATAC GCAAACGATT 180
AAAATAAGTA GCGACACTGG TTCCCCTATA AACCAAATGT GTTTTTATGG TGATGTGAAA 240
GAATACGACG TAGGAAATGC AGATGATATT CTCGCTTATC CAAGTCAAAA AGTATGCAGT 300
ACACCTGGTG TAACAGTACG ACTTGATGGC GATGAGAAAG GTTCTTATGT GACAATTAAG 360
TATTCCTTGA CTCCAGCATA A 381
(2)SEQ ID NO：3资料：
(i)序列特征：
(A)长度：267氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Met Gly Ile Ile Asn Ile Gln Asp Glu Ile Asn Asn Tyr Met Lys Glu
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ala Thr Thr Val Lys Ser Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Lys
20 25 30
Val Phe Asn Glu Ser Val Thr Pro Gln Phe Thr Glu Ile Pro Thr Glu
35 40 45
Pro Val Asn Asn Gln Leu Thr Thr Lys Arg Val Asp Asn Thr Gly Ser
50 55 60
Tyr Pro Val Glu Ser Thr Val Ser Phe Thr Trp Thr Glu Thr His Thr
65 70 75 80
Glu Thr Ser Ala Val Thr Glu Gly Val Lys Ala Gly Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Lys Gln Ser Phe Lys Phe Gly Phe Val Asn Ser Asp Val Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ala Glu Tyr Asn Tyr Ser Thr Thr Asn Thr Thr Thr Thr
115 120 125
Thr Glu Thr His Thr Trp Ser Asp Ser Thr Lys Val Thr Ile Pro Pro
130 135 140
Lys Thr Tyr Val Glu Ala Ala Tyr Ile Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Asn
145 150 155 160
Val Pro Val Asn Val Glu Cys Asp Met Ser Gly Thr Leu Phe Cys Arg
165 170 175
Gly Tyr Arg Asp Gly Ala Leu Ile Ala Ala Val Tyr Val Ser Val Ala
180 185 190
Asp Leu Ala Asp Tyr Asn Pro Asn Leu Asn Leu Thr Asn Lys Gly Asp
195 200 205
Gly Ile Ala His Phe Lys Gly Ser Gly Phe Ile Glu Gly Ala Gln Gly
210 215 220
Leu Arg Ser Ile Ile Gln Val Thr Glu Tyr Pro Leu Asp Asp Asn Lys
225 230 235 240
Gly Arg Ser Thr Pro Ile Thr Tyr Leu Ile Asn Gly Ser Leu Ala Pro
245 250 255
Asn Val Thr Leu Lys Asn Ser Asn Ile Lys Phe
260 265
(2)SEQ ID NO：4资料：
(i)序列特征：
(A)长度：126氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Met Thr Val Tyr Asn Ala Thr Phe Thr Ile Asn Phe Tyr Asn Glu Gly
1 5 10 15
Glu Trp Gly Gly Pro Glu Pro Tyr Gly Tyr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr
20 25 30
Asn Pro Asp His Asp Phe Glu Ile Trp Lys Gln Asp Asp Trp Gly Lys
35 40 45
Ser Thr Pro Glu Arg Ser Thr Tyr Thr Gln Thr Ile Lys Ile Ser Ser
50 55 60
Asp Thr Gly Ser Pro Ile Asn Gln Met Cys Phe Tyr Gly Asp Val Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Asp Val Gly Asn Ala Asp Asp Ile Leu Ala Tyr Pro Ser Gln
85 90 95
Lys Val Cys Ser Thr Pro Gly Val Thr Val Arg Leu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Lys Gly Ser Tyr Val Thr Ile Lys Tyr Ser Leu Thr Pro Ala
115 120 125
(2)SEQ ID NO：5资料：
(i)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Gly Ile Ile Asn Ile Gln Asp Glu Ile Asn Asn Tyr Met Lys Glu Val
1 5 10 15
Tyr Gly Ala Thr
20
(2)SEQ ID NO：6资料：
(i)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Thr Val Tyr Asn Val Thr Phe Thr Ile Lys Phe Tyr Asn Glu Gly Glu
1 5 10 15
Trp Gly Gly Pro
20
(2)SEQ ID NO：7资料：
(i)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Met Gly Ile Ile Asn Ile Gln Asp Gln Ile Asn
1 5 10
(2)SEQ ID NO：8资料：
(i)序列特征：
(A)长度：8氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Tyr Met Lys Glu Val Tyr Gly Ala
1 5
(2)SEQ ID NO：9资料：
(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
ATGGGAATTA TTAATATTCA AGATGAAATT AAT
(2)SEQ ID NO：10资料：
(i)序列特征：
(A)长度：56碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线形
(ix)特点：
(A)名称/关键字：modified_base
(B)位置：34...36
(C)其他资料：/mod_base＝OTHER
/note＝″N＝Inosine″
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
ATGGGAATTA TTAATATTCA AGATGAAATT AATNNNTATA TGAAAGAAGT ATATGG
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