树突细胞免疫受体（DCIR）介导的人类CD8+T细胞的交叉敏化
阅读：69发布：2020-12-29
专利汇可以提供树突细胞免疫受体（DCIR）介导的人类CD8+T细胞的交叉敏化专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了包含含有ITIM基序的DC免疫受体（DCIR）以介导有效的交叉呈递的免疫刺激组合物和方法。本 发明 人 评价了通过各种凝集素受体将 抗原 靶向至树突细胞（DC）产生的人类CD8+T细胞应答。通过包括离体产生的DC、 皮肤 分离的郎格汉斯细胞和血液mDC和pDC的所有人类DC亚群单一暴露于低剂量的抗DCIR抗原结合物引发了抗原特异性CD8+T细胞免疫。当抗原样、FluMP、MART-1、病毒（HIV gag）等经DCIR被递送至DC时，与通过游离抗原或结合至对照mAb的抗原诱导的或经另一种凝集素受体DC-SIGN递送的那些相比，观察到了增强的特异性CD8+T细胞应答。Toll样受体（TLR）7/8激动剂的加入增强了DCIR介导的交叉呈递以及交叉敏化。因此，经过人类DCIR受体的抗原靶向允许特异性CD8+T细胞免疫的活化。，下面是树突细胞免疫受体（DCIR）介导的人类CD8+T细胞的交叉敏化专利的具体信息内容。
1.一种在人类或动物受试者中用于产生免疫应答、用于预防、治疗或其任意组合的免疫刺激组合物，该组合物包含：
负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的一种或多种抗树突细胞
（DC）特异性抗体或其片段，其中所述抗原肽代表与针对需要该免疫应答、预防、治疗或其任意组合的疾病或病症牵连或相关的一种或多种抗原的一个或多个表位；
至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂；和
药学上可接受的载体，其中所述结合物和激动剂各自以一定的量被包含，所述量使得各自与另一种联合，在需要免疫刺激的人类或动物受试者中，对于产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自：
激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗
4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗DC特异性抗体或片段选自特异性结合于树突
细胞免疫受体（DCIR）、MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
4.权利要求1的组合物，其中所述抗DC特异性抗体是选自ATCC登记号PTA10246或
PTA10247的抗DCIR抗体。
5.权利要求1的组合物，其中所述抗原肽包含人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物，所述人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物选自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶、HIV肽链（Hipo5）、PSA四聚体、HIVgag衍生的p24-PLA HIV gag p24（gag）和其他HIV成分、肝炎病毒抗原、流感病毒抗原和肽，所述流感病毒抗原和肽选自血细胞凝集素、神经氨酸酶、来自H1N1流感毒株的甲型流感血细胞凝集素HA-1、HLA-A201-FluMP（58-66）肽四聚体和禽流感（HA5-1）、来自热纤维梭菌的锚定结构域、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、轮状病毒抗原、细胞肥大病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、狂犬病病毒抗原或其组合和修饰。
6.权利要求1的组合物，其中所述抗原肽为癌症肽，所述癌症肽选自肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原包含来自以下的抗原：白血病和淋巴瘤、神经肿瘤例如星型细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分的癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
7.权利要求6的组合物，其中所述肿瘤相关抗原选自CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。
8.权利要求1的组合物，其中所述抗DC特异性抗体是人源化的。
9.权利要求1的组合物，其中通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射给予人类或动物受试者所述组合物，其中所述注射选自皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射和静脉内注射。
10.一种疫苗，所述疫苗包含：
负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的一种或多种抗树突细胞
（DC）特异性抗体或其片段；
至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，其中所述TLR激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂；和
一种或多种任选的药学上可接受的载体和佐剂，其中所述抗体和激动剂各自以一定的量被包含，所述量使得各自与另一种联合，在人类或动物受试者中，对于产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。
11.权利要求10的疫苗，其中所述疫苗包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗
4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
12.权利要求10的疫苗，其中所述抗DC特异性抗体或片段选自特异性结合于树突
细胞免疫受体（DCIR）、MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
13.权利要求10的疫苗，其中所述抗DC特异性抗体是选自ATCC登记号PTA 10246或
PTA 10247的抗DCIR抗体。
14.权利要求10的疫苗，其中所述抗原肽包含人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物，所述人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物选自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶、HIV肽链（Hipo5）、PSA四聚体、HIVgag衍生的p24-PLA HIV gag p24（gag）和其他HIV成分、肝炎病毒抗原、流感病毒抗原和肽，所述流感病毒抗原和肽选自血细胞凝集素、神经氨酸酶、来自H1N1流感毒株的甲型流感血细胞凝集素HA-1、HLA-A201-FluMP（58-66）肽四聚体和禽流感（HA5-1）、来自热纤维梭菌的锚定结构域、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、轮状病毒抗原、细胞肥大病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、狂犬病病毒抗原或其组合和修饰。
15.权利要求10的疫苗，其中所述抗原肽为包含肿瘤相关抗原的癌症肽，所述肿瘤相关抗原选自CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。
16.权利要求10的疫苗，其中所述抗DC特异性抗体是人源化的。
17.权利要求10的疫苗，其中通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射给予人类或动物受试者所述组合物。
18.一种用于通过抗原呈递细胞（APC）增加抗原呈递效力的方法，所述方法包括：
分离和纯化一种或多种抗树突细胞（DC）特异性抗体或其片段；
将一种或多种天然或工程抗原肽负载或化学偶联到所述DC特异性抗体以形成抗
体-抗原结合物；
向结合物中加入至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂；以及
使APC与结合物和TLR激动剂接触，其中加工和呈递所述抗体-抗原复合物用于T细
胞识别。
19.权利要求18的方法，所述方法进一步包括以下任选的步骤：
在与抗原呈递细胞接触之前，向抗体-抗原结合物和TLR激动剂中加入一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰；以及
测量一种或多种试剂的水平，所述一种或多种试剂选自IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13，其中所述一种或多种试剂的水平变化指示抗原呈递细胞的抗原呈递效力的增加。
20.权利要求18的方法，其中所述APC包括树突细胞（DC）。
21.权利要求18的方法，其中所述抗DC特异性抗体或片段选自特异性结合于树突
细胞免疫受体（DCIR）、MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
22.权利要求18的方法，其中所述抗DC特异性抗体是选自ATCC登记号PTA 10246或
PTA 10247的抗DCIR抗体。
23.权利要求18的方法，其中所述抗原肽包含人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物，所述人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物选自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶、HIV肽链（Hipo5）、PSA四聚体、HIVgag衍生的p24-PLA HIV gag p24（gag）和其他HIV成分、肝炎病毒抗原、流感病毒抗原和肽，所述流感病毒抗原和肽选自血细胞凝集素、神经氨酸酶、来自H1N1流感毒株的甲型流感血细胞凝集素HA-1、HLA-A201-FluMP（58-66）肽四聚体和禽流感（HA5-1）、来自热纤维梭菌的锚定结构域、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、轮状病毒抗原、细胞肥大病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、狂犬病病毒抗原或其组合和修饰。
24.权利要求18的方法，其中所述抗原肽为包括肿瘤相关抗原的癌症肽，所述肿瘤相关抗原选自CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。
25.权利要求18的方法，其中所述抗DC特异性抗体是人源化的。
26.一种疫苗，所述疫苗包含：
抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段；
至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂；和
一种或多种任选的药学上可接受的载体和佐剂，其中所述结合物和激动剂各自以一定的量被包含，所述量使得各自与另一种联合，在需要其的人类或动物受试者中针对一种或多种疾病或病症产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。
27.权利要求26的疫苗，其中所述疫苗适合用于在人类受试者中针对一种或多种疾病或病症进行治疗、预防或其组合，所述一种或多种疾病或病症选自流感、HIV、癌症及其任意组合。
28.权利要求26的疫苗，其中所述一种或多种抗原肽为包括SEQ IDNO:1的FluMP肽。
29.权利要求26的疫苗，其中所述一种或多种抗原肽为包括SEQ IDNO:2的MART-1肽。
30.权利要求26的疫苗，其中所述一种或多种抗原肽为包括SEQ IDNO:3的HIV gagp24肽。
31.权利要求26的疫苗，其中所述疫苗包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗
4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
32.权利要求26的疫苗，其中所述疫苗进一步包含任选的抗DC特异性抗体或其片段，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHCI类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
33.一种用于在人类受试者中针对一种或多种疾病或病症进行治疗、预防或其组合的方法，所述方法包括以下步骤：
鉴别针对一种或多种疾病或病症需要该治疗、预防或其组合的人类受试者；并且
给予疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：
抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段，其中所述抗原肽代表与针对需要该预防、治疗或两者的一种或多种疾病或病症牵连或相关的一种或多种抗原的一个或多个表位；
至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂；和
一种或多种任选的药学上可接受的载体和佐剂，其中所述结合物和激动剂各自以一定的量被包含，所述量使得各自与另一种联合，在人类受试者中针对一种或多种疾病或病症产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效地。
34.权利要求33的方法，其中所述一种或多种疾病或病症选自流感、癌症、HIV，或其任意组合。
35.权利要求34的方法，其中所述癌症选自白血病和淋巴瘤、神经肿瘤例如星型细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分的癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
36.权利要求33的方法，其中所述一种或多种抗原肽为包括SEQ IDNO:1的FluMP肽。
37.权利要求33的方法，其中所述一种或多种抗原肽为包括SEQ IDNO:2的MART-1肽。
38.权利要求33的方法，其中所述一种或多种抗原肽为包括SEQ IDNO:3的HIV gagp24肽。
39.权利要求33的方法，其中所述疫苗包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗
4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
40.权利要求33的方法，其中所述疫苗进一步包含任选的抗DC特异性抗体或其片段，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHCI类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
41.权利要求33的方法，其中通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射给予人类受试者所述疫苗。
42.一种用于增加在人类受试者中一种或多种树突细胞（DC）的抗原呈递效力的方法，所述方法包括步骤：
分离一种或多种来自人类的DC；
将分离的DC暴露于活化量的组合物或疫苗从而形成活化的DC复合物，所述组合物或疫苗包含：
抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段；
至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂；
和药学上可接受的载体；以及
再引入活化的DC复合物至人类受试者。
43.权利要求42的方法，所述方法进一步包括测量选自以下的一种或多种试剂水平的任选步骤：IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13，其中所述一种或多种试剂的水平变化指示一种或多种DC效力的增加。
44.权利要求42的方法，所述方法进一步包括在暴露DC之前向结合物和TLR激动剂中加入选自以下的一种或多种任选的试剂的步骤：激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
45.权利要求42的方法，所述方法进一步包括加入一种或多种任选的抗DC特异性抗体或其片段的步骤，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
46.权利要求42的方法，其中所述抗原肽包括一种或多种人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物、一种或多种癌症肽和肿瘤相关抗原，或两者。
47.一种通过活化一种或多种树突细胞（DC）向人类受试者提供免疫刺激用于针对一种或多种病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物、寄生虫病和过敏性疾病进行预防、治疗或其组合的方法，所述方法包括步骤：
鉴别针对一种或多种病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物、寄生虫病和过敏性疾病需要免疫刺激用于预防、治疗或其组合的人类受试者；
从人类受试者分离一种或多种DC；
将分离的DC暴露于活化量的组合物或疫苗从而形成活化的DC复合物，所述组合物或疫苗包含抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段，至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，和药学上可接受的载体；以及
再引入活化的DC复合物至所述人类受试者。
48.权利要求47的方法，所述方法进一步包括测量一种或多种试剂的水平的任选步骤，所述一种或多种试剂选自IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13，其中所述一种或多种试剂的水平变化指示免疫刺激。
49.权利要求47的方法，所述方法进一步包括在暴露DC之前向结合物和TLR激动剂
中加入选自以下一种或多种任选的试剂的步骤：激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
50.权利要求47的方法，所述方法进一步包括加入一种或多种任选的抗DC特异性抗体或其片段的步骤，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
51.权利要求47的方法，其中所述抗原肽包括细菌抗原，所述细菌抗原选自百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原成分、白喉细菌抗原、白喉毒素或类毒素、其他白喉细菌抗原成分、破伤风细菌抗原、破伤风毒素或类毒素、其他破伤风细菌抗原成分、链球菌细菌抗原、革兰氏阴性杆菌细菌抗原、结核分支杆菌细菌抗原、分支菌酸、热休克蛋白65（HSP 65）、幽门螺杆菌细菌抗原成分；肺炎球菌细菌抗原、流感嗜血杆菌细菌抗原、炭疽细菌抗原和立克次体细菌抗原。
52.权利要求47的方法，其中所述抗原肽包括真菌抗原，所述真菌抗原选自念珠菌真菌抗原成分、组织胞浆菌真菌抗原、隐球菌真菌抗原、球孢子菌真菌抗原和癣真菌抗原。
53.权利要求47的方法，其中所述抗原肽包括原生动物和寄生虫抗原，所述原生动物和寄生虫抗原选自恶性疟原虫抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、红内期抗原pf155/RESA、弓形虫、血吸虫抗原、硕大利什曼原虫和其他利什曼原虫抗原以及克氏锥虫抗原。
54.权利要求47的方法，其中所述抗原肽包括与自身免疫疾病、过敏症和移植排
斥有关的抗原，所述自身免疫疾病、过敏症和移植排斥选自糖尿病（diabetes）、糖尿病（diabetes mellitus）、关节炎，多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎、银屑病、干燥综合征、斑秃、由于节肢动物叮咬反应引起的过敏反应、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双边进展性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征，特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、克罗恩病，格雷夫斯眼病、肉状瘤病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。
55.权利要求47的方法，其中所述抗原肽包括与过敏性疾病有关的抗原，所述与过敏性疾病有关的抗原选自日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原、动物源性抗原、尘螨抗原、猫科动物抗原、组织相容性抗原和青霉素及其他治疗性药物。
56.权利要求47的方法，其中所述DC特异性抗体是人源化的。
树突细胞免疫受体（DCIR）介导的人类CD8+T细胞的交叉敏
化
[0001] 发明技术领域
[0002] 本发明一般而言涉及免疫学领域，更具体地，涉及经人类树突细胞免疫受体（DCIR）靶向介导有效的交叉呈递的抗原。
[0003] 发明背景
[0004] 不限定本发明的范围，结合免疫刺激方法和组合物，包括疫苗和在抗原呈递中增加的有效性来描述本发明的背景。
[0005] 在2008年授予Noelle等人的第7,387,271号美国专利中教导了免疫刺激组合的一个实例。Noelle的发明公开了适合于给予需要免疫治疗的人类受试者的免疫刺激组合物，该免疫刺激组合物包含：至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，至少一种直接结合CD40的CD40激动剂和药学上可接受的载体。在Noelle的发明中描述的TLR激动剂和CD40激动剂各自以一定量存在，该量使得在与另一种联合时，它们在给予需要免疫治疗的人类受试者后，在对抗原的免疫应答方面产生协同增加是有效的。
[0006] 第20080267984号美国专利公开（Banchereau等人，2008）公开了用于在免疫细胞上靶向LOX-1受体的组合物和方法以及用于抗LOX-1抗体的用途。Banchereau的发明包括用于靶向和使用抗人类LOX-1单克隆抗体（mAbs）的新的组合物和方法，并表征了它们的生物学功能。所述抗LOX-1mAbs及其片段对于免疫细胞的靶向、表征和活化是有用的。 [0007] 第20080241170号美国专利公开（Zurawski和Banchereau，2008）包括组合物和使用DCIR特异性抗体或其片段增加抗原呈递效力的方法，将抗原附着于DCIR特异性抗体或其片段形成抗体-抗原复合物，其中抗原被已经与抗体-抗原复合物接触的树突细胞处理并呈递。
[0008] 最后，由Delucia提交的第20080241139号美国专利公开中，公开了一种佐剂组合，该佐剂组合包括微生物TLR激动剂、CD40或4-1BB激动 剂，和任选地抗原，及其在细胞免疫中用于诱导协同增加的用途。简要地，该申请据报道教导了包含至少一种微生物TLR激动剂如全病毒、细菌或酵母菌或其部分例如膜、原生质球、胞质体或菌蜕，CD40或4-1BB激动剂和任选地抗原的佐剂组合，其中公开了全部三部分可以是单独的或包含相同的重组微生物或病毒。还提供了这些免疫佐剂用于治疗各种慢性疾病如癌症和HIV感染的用途。 [0009] 本发明人先前已描述了包含附着于树突细胞的抗原的疫苗。第20100135994号美国专利公开（Banchereau等人，2009）公开了基于将最大化的Gag和Nef靶向至树突细胞的HIV疫苗。抗原呈递细胞的抗原呈递效力通过以下方式来提高：分离和纯化DC特异性抗体或其片段，其中工程Gag抗原附着于所述DC特异性抗体或其片段上形成抗体-抗原复合物，其中所述Gag抗原通过消除一个或多个蛋白水解位点而不容易受到蛋白降解的影响；并且在加工并呈递抗体-抗原复合物用于T细胞识别的条件下接触所述抗原呈递细胞。所述抗原呈递细胞包括树突细胞，并且DC特异性抗体或其片段结合于Coherin/锚定对的一半，或DC特异性抗体或其片段结合于Coherin/锚定对的一半并且工程Gag抗原结合于Coherin/锚定对的互补的一半以形成复合物。发明人在第20110081343号美国专利公开（Banchereau等人，2009）中还描述了使用高亲和性抗朗格汉斯单克隆抗体和伴随其的融合蛋白来靶向和递送抗原至朗格汉斯（Langerhans）细胞用于抗原呈递的组合物和方法。 发明内容
[0010] 本发明描述了免疫刺激组合物和方法，所述免疫刺激组合物包含含有ITIM基序的DC免疫受体（DCIR）以介导有效的交叉呈递。在本发明初级的实施方案中提供了在人类或动物受试者中用于产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合的免疫刺激组合物，该组合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的一种或多种抗树突细胞（DC）特异性抗体或其片段，其中所述抗原肽代表与针对需要该免疫应答、预防、治疗或其任意组合的疾病或病症牵连或相关的一种或多种抗原的一个或多个表位，至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，和药学上可接受的载体，其中所述结合物和激动剂各自以一定的量被包 含，所述量使得各自与另一种联合，在需要免疫刺激的人类或动物受试者中对于产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。如本文所描述的组合物可以任选地包含选自以下的试剂：激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
[0011] 一方面，抗DC特异性抗体或片段选自特异性结合于树突细胞免疫受体（DCIR）、MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。另一方面，抗DC特异性抗体是选自ATCC登记号PTA 10246或PTA10247的抗DCIR抗体。另一方面，DCIR包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAM）。 [0012] 用于本发明的组合物中的抗原肽包含人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物，所述人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物选自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶、HIV肽链（Hipo5）、PSA（KLQCVDLHV）四聚体（SEQ ID NO:10）、HIVgag衍生的p24-PLA HIVgag p24（gag）和其他HIV成分、肝炎病毒抗原、流感病毒抗原和肽，所述流感病毒抗原和肽选自血细胞凝集素、神经氨酸酶、来自H1N1流感毒株的甲型流感血细胞凝集素HA-1、HLA-A201-FluMP（58-66）肽（GILGFVFTL）四聚体（SEQ ID NO:1）和禽流感（HA5-1）、来自热纤维梭菌（C.thermocellum）的锚定结构域、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、轮状病毒抗原、细胞肥大病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、狂犬病病毒抗原或其组合和修饰。抗原肽还可以包含癌症肽并且选自肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原包含来自以下疾病的的抗原：白血病和淋巴瘤、神经肿瘤例如星型细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或唇癌、鼻咽癌、 咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分的癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。肿瘤相关抗原选自CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。
[0013] 在另一方面，DC特异性抗体是人源化的并且通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射（皮下、静脉内、腹膜内、肌内或静脉内）给予人类或动物受试者所述组合物。 [0014] 在一种实施方案中本发明描述了一种疫苗，所述疫苗包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的一种或多种抗树突细胞（DC）特异性抗体或其片段，至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，和一种或多种任选的药学上可接受的载体和佐剂，其中所述抗体和激动剂各自以一定的量被包含，所述的量使得各自与另一种联合，在人类或动物受试者中对于产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。本发明的疫苗包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。 [0015] 一方面，抗DC特异性抗体或片段选自特异性结合于树突细胞免疫受体（DCIR）、MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、 DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。另一方面，抗DC特异性抗体是选自ATCC登记号PTA 10246或PTA10247的抗DCIR抗体。另一方面，抗原肽包含人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物，所述人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物选自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶、HIV肽链（Hipo5）、PSA（KLQCVDLHV）四聚体（SEQ ID NO:10）、HIVgag衍生的p24-PLA HIVgag p24（gag）和其他HIV成分、肝炎病毒抗原、流感病毒抗原和肽，所述流感病毒抗原和肽选自血细胞凝集素、神经氨酸酶、来自H1N1流感毒株的甲型流感血细胞凝集素HA-1、HLA-A201-FluMP（58-66）肽（GILGFVFTL）四聚体（SEQ ID NO:1）和禽流感（HA5-1）、来自热纤维梭菌的锚定结构域、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、轮状病毒抗原、细胞肥大病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、狂犬病病毒抗原或其组合和修饰。在另一方面，抗原肽为包含肿瘤相关抗原的癌症肽，所述肿瘤相关抗原选自CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和
12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。在疫苗组合物的特定方面，DC特异性抗体是人源化的并且通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射给予人类或动物受试者所述组合物。
12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。在疫苗组合物的特定方面，DC特异性抗体是人源化的并且通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射给予人类或动物受试者所述组合物。
[0016] 在另一种实施方案中本发明公开了一种用于通过抗原呈递细胞增加抗原呈递效力的方法，所述方法包括：（i）分离和纯化一种或多种树突细胞（DC）特异性抗体或其片段，（ii）将一种或多种天然或工程抗原肽负载或化学偶联到DC特异性抗体以形成抗体-抗原结合物，（iii）向结合物 中加入至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，以及（iv）使抗原呈递细胞与结合物和TLR激动剂接触，其中加工并呈递所述抗体-抗原复合物用于T细胞识别。 [0017] 上述方法包括以下任选的步骤：（i）在与抗原呈递细胞接触之前，向抗体-抗原结合物和TLR激动剂中加入一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰，以及（ii）测量一种或多种试剂的水平，所述一种或多种试剂选自IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13，其中所述一种或多种试剂的水平变化指示抗原呈递细胞的抗原呈递效力的增加。
[0018] 一方面，抗原呈递细胞包括树突细胞（DC）。另一方面，抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于树突细胞免疫受体（DCIR）、MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。另一方面，抗DC特异性抗体是选自ATCC登记号PTA 10246或PTA 10247的抗DCIR抗体。另一方面，抗原肽包含人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物，所述人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物选自gag、pol和env基因、Nef蛋白、反转录酶、HIV肽链（Hipo5）、PSA（KLQCVDLHV）四聚体（SEQID NO:10）、HIVgag衍生的p24-PLA HIV gag p24（gag）和其他HIV成分、肝炎病毒抗原、流感病毒抗原和肽，所述流感病毒抗原和肽选自血细胞凝集素、神经氨酸酶、来自H1N1流感毒株的甲型流感血细胞凝集素HA-1、HLA-A201-FluMP（58-66）肽（GILGFVFTL）四聚体（SEQ ID NO:1）和禽流感（HA5-1）、来自热纤维梭菌的锚定结构域、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、轮状病毒抗原、细胞肥大病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、狂犬病病毒抗原或其组合和修饰，或癌症肽，所述癌症肽包括肿瘤相关抗原，所 述肿瘤相关抗原选自CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和12，MUC（粘蛋白）（如MUC-1、MUC-2等）、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART（黑色素瘤抗原）、MARCO-MART、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D，Pmel 17（gp100），GnT-V内含子V序列（N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列）、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原（PSA）、PRAME（黑色素瘤抗原）、β-连环蛋白、MUM-1-B（黑色素瘤普遍存在的突变基因产物）、GAGE（黑色素瘤抗原）1、BAGE（黑色素瘤抗原）2-10、c-ERB2（Her2/neu）、EBNA（爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原）1-6、gp75、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、p53、肺抗性蛋白（LPR）、Bcl-2和Ki-67。在特定的方面，DC特异性抗体是人源化的。 [0019] 另一个实施方案描述了包含抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物的疫苗，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段，至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，和一种或多种任选的药学上可接受的载体和佐剂，其中所述结合物和激动剂各自以一定的量被包含，所述量使得各自与另一种联合，在需要其的人类或动物受试者中针对一种或多种疾病或病症产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。上文中描述的疫苗适合用于针对在人类受试者中一种或多种疾病或病症的治疗、预防或其组合，所述一种或多种疾病或病症选自流感、HIV、癌症及其任意组合。在上文中描述的疫苗的相关方面，所述一种或多种抗原肽为FluMP肽（SEQ ID NO:1）、包括SEQ ID NO:2的MART-1肽，以及HIVgagp24肽（SEQ ID NO:3）。 [0020] 一方面，疫苗包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。另一方面，疫苗进一步包含任选的抗DC特异性抗体或其片段，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、 CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
[0021] 本发明进一步公开了用于在人类受试者中针对一种或多种疾病或病症治疗、预防或其组合的方法，所述方法包括步骤：鉴别针对一种或多种疾病或病症需要该治疗、预防或其组合的人类受试者，并且给予疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：（i）抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段，其中所述抗原肽代表与针对需要预防、治疗或两者的一种或多种疾病或病症牵连或相关的一种或多种抗原的一个或多个表位，（ii）至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，以及（iii）一种或多种任选的药学上可接受的载体和佐剂，其中所述结合物和激动剂各自以一定的量被包含，所述量使得各自与另一种联合，在人类受试者中针对一种或多种疾病或病症产生免疫应答，用于预防、治疗或其任意组合是有效的。
[0022] 由在上文中公开的方法治疗的一种或多种疾病或病症包括流感、癌症、HIV，或其任意组合，其中所述癌症选自白血病和淋巴瘤、神经肿瘤例如星型细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分的癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
[0023] 一方面，疫苗包含一种或多种任选的试剂，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。另一方面，通过口服途径、鼻腔途径、局部地或注射给予人类受试者所述疫苗。另一方面，疫苗进一步包含任选的抗DC特异性抗体或其片段，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHC I类、MHC II 类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。在上文方法中描述的疫苗的相关方面，所述一种或多种抗原肽为FluMP肽（SEQ ID NO:1）、包括SEQ ID NO:2的MART-1肽，以及HIV gagp24肽（SEQ ID NO:3）。
[0024] 本发明还提供了一种用于增加在人类受试者中一种或多种树突细胞（DC）的抗原呈递效力的方法，所述方法包括步骤：从人类分离一种或多种DC，将分离的DC暴露于活化量的组合物或疫苗从而形成活化的DC复合物，所述组合物或疫苗包含抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段，至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，以及药学上可接受的载体，并且再引入活化的DC复合物至人类受试者。所述方法进一步包括测量一种或多种试剂的水平的任选步骤，所述一种或多种试剂选自IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13，其中所述一种或多种试剂的水平变化指示一种或多种DC效力的增加，以及在暴露于DC之前向结合物和TLR激动剂中加入一种或多种任选的试剂的步骤，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。
[0025] 一方面，所述方法进一步包括加入一种或多种抗DC特异性抗体或其片段的步骤，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。所述方法的另一方 面，抗原肽包括人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原和基因产物、一种或多种癌症肽和肿瘤相关抗原，或两者。
[0026] 本发明进一步提供了通过活化一种或多种树突细胞（DC）向人类受试者提供免疫刺激用于针对一种或多种病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物、寄生虫病和过敏性疾病进行预防、治疗或其组合的方法，所述方法包括步骤：（i）鉴别针对病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物、寄生虫病和过敏性疾病需要免疫刺激用于预防、治疗或其组合的人类受试者，（ii）从人类受试者分离一种或多种DC，（iii）将分离的DC暴露于活化量的组合物或疫苗从而形成活化的DC复合物，所述组合物或疫苗包含抗树突细胞免疫受体（DCIR）单克隆抗体结合物，其中所述结合物包含负载一种或多种抗原肽或与一种或多种抗原肽化学偶联的DCIR单克隆抗体或其片段，至少一种Toll样受体（TLR）激动剂，所述Toll样受体激动剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8激动剂，和药学上可接受的载体，以及（iv）再引入活化的DC复合物至人类受试者。所述免疫刺激方法进一步包括测量一种或多种试剂的水平的任选的步骤，所述一种或多种试剂选自IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13，其中所述一种或多种试剂的水平变化指示免疫刺激。
[0027] 一方面，所述方法进一步包括在暴露DC之前向结合物和TLR激动剂中加入一种或多种任选的试剂的步骤，所述试剂选自激动性抗CD40抗体、激动性抗CD40抗体片段、CD40配体（CD40L）多肽、CD40L多肽片段、抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗体片段、4-1BB配体多肽、4-1BB配体多肽片段、IFN-γ、TNF-α、1型细胞因子、2型细胞因子或其组合和修饰。 [0028] 另一方面，所述方法进一步包括加入一种或多种任选的抗DC特异性抗体或其片段的步骤，所述抗DC特异性抗体或其片段选自特异性结合于MHC I类、MHC II类、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin）、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fcγ受体、LOX-1和ASPGR的抗体。
[0029] 抗原肽可以包括细菌抗原，所述细菌抗原选自百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌 抗原成分、白喉细菌抗原、白喉毒素或类毒素、其他白喉细菌抗原成分、破伤风细菌抗原、破伤风毒素或类毒素、其他破伤风细菌抗原成分、链球菌细菌抗原、革兰氏阴性杆菌细菌抗原、结核分支杆菌细菌抗原、分支菌酸、热休克蛋白65（HSP 65）、幽门螺杆菌细菌抗原成分；肺炎球菌细菌抗原、流感嗜血杆菌细菌抗原、炭疽细菌抗原和立克次体细菌抗原，真菌抗原，所述真菌抗原选自念珠菌真菌抗原成分、组织胞浆菌真菌抗原、隐球菌真菌抗原、球孢子菌真菌抗原和癣真菌抗原，原生动物和寄生虫抗原，所述原生动物和寄生虫抗原选自恶性疟原虫抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、红内期抗原pf155/RESA、弓形虫、血吸虫抗原、硕大利什曼原虫和其他利什曼原虫抗原以及克氏锥虫抗原，与自身免疫疾病、过敏症和移植排斥有关的抗原，所述自身免疫疾病、过敏症和移植排斥选自糖尿病（diabetes）、糖尿病（diabetes mellitus）、关节炎，多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎、银屑病、干燥综合征、斑秃、由于节肢动物叮咬反应引起的过敏反应、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双边进展性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征，特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、克罗恩病，格雷夫斯眼病、肉状瘤病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化，以及与过敏性疾病有关的抗原，所述与过敏性疾病有关的抗原选自日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原、动物源性抗原、尘螨抗原、猫科动物抗原、组织相容性抗原和青霉素及其他治疗性药物。又一方面，DC特异性抗体是人源化的。附图说明
[0030] 为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参照附图对本发明进行详细说明，其中：
[0031] 图1A-1D显示了DCIR的细胞分布：（图1A）在外周血单核细胞上DCIR表达的流式细胞术分析。循环单核细胞用10μg/ml抗DCIR单克隆抗体（mAb）随后用结合PE的山羊抗小鼠IgG染色。将细胞与结合FITC 的抗CD19、抗CD4、抗CD8（用于淋巴细胞）、抗CD16、抗CD56（用于NK细胞）、抗CD14mAb（用于单核细胞）或与抗CD11c、抗HLA-DR和抗CD123mAb（用于pDC或mDC）培养，并通过流式细胞术分析。呈现的数据代表对三个不同的供体进行+的三个独立的运行，（图1B）通过流式细胞术在皮肤衍生的DC亚群：表皮LC、真皮CD1aDC+
和真皮CD14DC上的DCIR表达分析，（图1C）用抗DCIR染色人表皮细胞膜片并通过荧光显+ + +
微法分析，显示了在HLA-DRLC上DCIR的表达，（图1D）在CD34 衍生的DC亚群CD1aLC和+
CD14DC上通过流式细胞术的DCIR表达分析；
和真皮CD14DC上的DCIR表达分析，（图1C）用抗DCIR染色人表皮细胞膜片并通过荧光显+ + +
微法分析，显示了在HLA-DRLC上DCIR的表达，（图1D）在CD34 衍生的DC亚群CD1aLC和+
CD14DC上通过流式细胞术的DCIR表达分析；
[0032] 图2A显示了I：交联到靶抗原FluMP的小鼠IgG1的图，II-III：结合到coh.抗原（FluMP II或MART-1III）的嵌合的mAb(IgG4).doc的图，IV-V：嵌合融合mAb IgG4抗原（HIV gag MART-1IV或p24V）的图；
[0033] 图2B和2C显示了通过抗DCIR结合物mAb的FluMP蛋白的交叉呈递：（图2B）通+过与化学交联的抗DCIR-FluMP、交联的对照IgG-FluMP蛋白或游离FluMP培养的CD1aLC的+
FluMP到CD8T细胞增强的交叉呈递。点阵图显示HLA-A201-FluMP (58-66)肽四聚体-阳+
性CD8T细胞的比例。数据代表三个独立的研究，（图2C）显示随着交联mAb-FluMP构建体+
或游离FluMP的浓度下降，FluMP特异性CD8T细胞对靶点响应的百分比。图表显示重复试验的平均值；
FluMP到CD8T细胞增强的交叉呈递。点阵图显示HLA-A201-FluMP (58-66)肽四聚体-阳+
性CD8T细胞的比例。数据代表三个独立的研究，（图2C）显示随着交联mAb-FluMP构建体+
或游离FluMP的浓度下降，FluMP特异性CD8T细胞对靶点响应的百分比。图表显示重复试验的平均值；
[0034] 图2D和2E显示靶向蛋白进入DCIR mAb的工程和表征：（图2D）小鼠抗DCIR mAb的SDS-PAGE还原凝胶（克隆9E8和24A5），融合到锚定结构域（mAb.Doc）的嵌合的小鼠/人抗DCIR(IgG4)和对照IgG4。融合到黏结蛋白结构域（coh.FluMP和coh.MART-1）的FluMP和MART-1，和融合蛋白抗DCIR-p24及对照IgG4-p24。凝胶用考马斯蓝染色。蛋白的分子量显示在图的左侧，（图2E）抗DCI R.doc-coh.FluMP复合物mAb至单核细胞衍生的DC的结合分析。第6天用50nM生物素化的抗DCIR-FluMP和对照IgG4-FluMP结合物mAb处理未成熟的GM-IL4DC。用结合藻红蛋白的链霉亲和素检测复合物。抗DCI R.doc-coh.FluMP复合物mAb结合DC（黑色直方图），而各自的对照结合物mAb不结合至DC（灰色直方图）； [0035] 图2F代表HLA-A201-FluMP复合物在非脉冲的或用50nM靶向DCIR的FluMP脉+冲的CD34 衍生的DC上（对照DC，灰色直方图）的染色。用5μg/ml抗CD40mAb（12E12，贝勒研究院；BIIR）活化细胞并在24h 后用标记PE的四聚体化的抗HLA-A201-FluMP Fab (M1D12)50染色；
[0036] 图2G显示了通过自体的HLA-A201+CD34+衍生的LC的FluMP到CD8+T细胞的交叉呈+ +递，所述自体的HLA-A201CD34 衍生的LC与8nM（上图）或0.8nM（下图）的抗DCIR.doc-coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP结合物mAb培养。点阵图显示10天后HLA-A201-FluMP +
(58-66)肽四聚体-阳性CD8T细胞的比例；
(58-66)肽四聚体-阳性CD8T细胞的比例；
[0037] 图2H是由DC诱导的HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体-阳性CD8+T细胞比例的图+示，所述DC用与自体的CD8T细胞清洗并培养10天的8nM抗DCIR.doc-coh.FluMP或对照IgG2a.doc-coh.FluMP结合物mAb脉冲18h。图形显示了HLA-A201-FluMP(58-66)四聚+
体-阳性CD8T细胞的比例，平均值±sd,N=3；
体-阳性CD8T细胞的比例，平均值±sd,N=3；
[0038] 图3A和3B显示了DCIR允许由LC的蛋白的交叉呈递：（图3A）来自HLA-A201+供体的皮肤衍生的LC用8nM抗DCIR.doc-coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP结合+
物mAb各自靶向，用CD40L成熟并用自体的CD8T细胞共培养。10天后，通过特异性
+
HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体染色来评价CD8T细胞增殖。数据代表用来自两个不同供体的细胞进行的两个独立实验，（图3B）通过Luminex在通过用抗DCIR.doc-coh.FluMP或+
IgG4.doc-coh.FluMP结合物mAb靶向的自体皮肤LC增殖10天的CD8T细胞培养上清液中测量的IFN-γ水平。图显示平均值±sd,N=3；
物mAb各自靶向，用CD40L成熟并用自体的CD8T细胞共培养。10天后，通过特异性
+
HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体染色来评价CD8T细胞增殖。数据代表用来自两个不同供体的细胞进行的两个独立实验，（图3B）通过Luminex在通过用抗DCIR.doc-coh.FluMP或+
IgG4.doc-coh.FluMP结合物mAb靶向的自体皮肤LC增殖10天的CD8T细胞培养上清液中测量的IFN-γ水平。图显示平均值±sd,N=3；
[0039] 图4A至4C显示了DCIR是全血DC亚群的总体靶点：（图4A）来自HLA-A201供体的血液衍生的mDC用8nM、0.8nM或80pM的抗DCIR.doc-coh.FluMP（克隆24A5）、IgG4.+doc-coh.FluMP结合物mAb或游离coh.FluMP各自靶向，用CD40L成熟，并用自体的CD8T+
细胞共培养。10天后，通过特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体染色来评价CD8T细胞增殖。数据代表三个独立的研究，（图4B）来自HLA-A201供体的血液衍生的pDC用8nM、
0.8nM或80pM的抗DCIR.doc-coh.FluMP(克隆24A5)、IgG4.doc-coh.FluMP或游离coh.+
FluMP各自靶向，用CD40L成熟，并用自体的CD8T细胞共培养。10天后，通过特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体染色来评价T细胞增殖。数据代表三个独立的研究，（图4C）+
由8nM DCIR.doc-coh.FluMP结合物mAb靶向的mDC或pDC诱导的FluMP特异性CD8T细
胞的百分比。图形显示了使用DCIR mAb p=0.02的2个不同克隆的3个独立研究的结果； [0040] 图5A至5D显示了由抗-DCIR融合mAb的Mart-1和HIV gag p24蛋白的交叉敏化：
+
（图5A）纯化来自HLA-A201 供体的皮肤衍生的LC并用自体纯化的T细胞在30nM抗DCIR.doc-coh.MART-1或IgG4.doc-coh.MART-1结合物mAb的存在下培养10天。用CD40L活化+
DC。用特异性HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体测量MART-1特异性CD8T细胞增殖；（图
5B）使用抗DCIR-MART-1或IgG4-MART-1(25nM)融合蛋白靶向单核细胞衍生的IFN-αDC。
+
用CD40L活化DC并用幼稚自体CD8T细胞培养DC。10天后，用负载来自MART-1蛋白的肽的新的DC或用未负载的DC作为对照重新刺激细胞24h。图显示了响应特异性MART-1肽+
群（peptide cluster）共同表达IFN-γ和CD107a的敏化的CD8T细胞的百分比，（图5C）+ +
CD34 衍生的LC用DCIR-MART-1或对照IgG4-MART-1融合蛋白靶向并用幼稚CD8T细胞培养9天。图形显示在培养结束时通过流式细胞术分析的共同表达粒酶B和穿孔蛋白的细胞+
的百分比，（图5D）使用抗DCIR-p24或对照IgG4-p24(25nM)融合蛋白靶向CD34 衍生的LC。
+
用CD40L活化DC并用幼稚自体CD8T细胞培养DC。在两次连续的刺激后，分选增殖的细胞并用新的LC和HIV gag p24蛋白重新刺激24h以通过Luminex评价IFN-γ分泌。没有蛋白的细胞作为对照。数值为重复记录的平均值。数据代表两个独立的研究；
细胞共培养。10天后，通过特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体染色来评价CD8T细胞增殖。数据代表三个独立的研究，（图4B）来自HLA-A201供体的血液衍生的pDC用8nM、
0.8nM或80pM的抗DCIR.doc-coh.FluMP(克隆24A5)、IgG4.doc-coh.FluMP或游离coh.+
FluMP各自靶向，用CD40L成熟，并用自体的CD8T细胞共培养。10天后，通过特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体染色来评价T细胞增殖。数据代表三个独立的研究，（图4C）+
由8nM DCIR.doc-coh.FluMP结合物mAb靶向的mDC或pDC诱导的FluMP特异性CD8T细
胞的百分比。图形显示了使用DCIR mAb p=0.02的2个不同克隆的3个独立研究的结果； [0040] 图5A至5D显示了由抗-DCIR融合mAb的Mart-1和HIV gag p24蛋白的交叉敏化：
+
（图5A）纯化来自HLA-A201 供体的皮肤衍生的LC并用自体纯化的T细胞在30nM抗DCIR.doc-coh.MART-1或IgG4.doc-coh.MART-1结合物mAb的存在下培养10天。用CD40L活化+
DC。用特异性HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体测量MART-1特异性CD8T细胞增殖；（图
5B）使用抗DCIR-MART-1或IgG4-MART-1(25nM)融合蛋白靶向单核细胞衍生的IFN-αDC。
+
用CD40L活化DC并用幼稚自体CD8T细胞培养DC。10天后，用负载来自MART-1蛋白的肽的新的DC或用未负载的DC作为对照重新刺激细胞24h。图显示了响应特异性MART-1肽+
群（peptide cluster）共同表达IFN-γ和CD107a的敏化的CD8T细胞的百分比，（图5C）+ +
CD34 衍生的LC用DCIR-MART-1或对照IgG4-MART-1融合蛋白靶向并用幼稚CD8T细胞培养9天。图形显示在培养结束时通过流式细胞术分析的共同表达粒酶B和穿孔蛋白的细胞+
的百分比，（图5D）使用抗DCIR-p24或对照IgG4-p24(25nM)融合蛋白靶向CD34 衍生的LC。
+
用CD40L活化DC并用幼稚自体CD8T细胞培养DC。在两次连续的刺激后，分选增殖的细胞并用新的LC和HIV gag p24蛋白重新刺激24h以通过Luminex评价IFN-γ分泌。没有蛋白的细胞作为对照。数值为重复记录的平均值。数据代表两个独立的研究；
[0041] 图6A至6C显示了TLR7/8信号增强了通过mDC的DCIR介导的次级CD8+T细胞应+答：（图6A）来自HLA-A201 供体的血液衍生的mDC用12nM、2nM或200pM的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb靶向，用TLR3TLR4或TLR7/8激动剂（Poly I:C、LPS或CL075）活化并+
且用自体的CD8T细胞共同培养10天。图形显示了对于每个量的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb用特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体测量的和用检测的每个DC激活剂测+
量的FluMP特异性CD8T细胞的百分比。使用未激活的DC作为对照（分别为未激活(--)、TLR7/8-(◆)TLR3-(*)、TLR4-(○)、激动剂；CL075、Poly I:C和LPS）。数据代表用四个不同供体的四个独立的实验。图形显示了平均值±s.d,N=3；（图6B）显示了来自HLA-A201+供体的血液衍生的mDC用8nM的抗DCIR.doc-coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP复合物mAb靶向，用TLR7/8-、TLR3-、TLR4-激动剂（分别为CL075、Poly I:C和LPS）中的任何一个活化，+
并用自体的CD8T细胞共同培养10天。图形显示了用特异性HLA-A201-FluMP(58-66) 四+
聚体测量的FluMP特异性CD8T细胞的百分比。图形中显示的条件为：未激活；CL0751μg/ml；Poly I:C 10μg/ml；LPS 50ng/ml。图形显示了平均值±s.d,N=3，（图6C）与在6B中相同的研究。图形显示了用特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体测量的FluMP特异性+
CD8T细胞的平均百分比。图形中显示的条件为：未激活；CL075-0.2μg/ml和2μg/ml；
PolyI:C-5μg/ml和25μg/ml；LPS-10ng/ml和100ng/ml；
且用自体的CD8T细胞共同培养10天。图形显示了对于每个量的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb用特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体测量的和用检测的每个DC激活剂测+
量的FluMP特异性CD8T细胞的百分比。使用未激活的DC作为对照（分别为未激活(--)、TLR7/8-(◆)TLR3-(*)、TLR4-(○)、激动剂；CL075、Poly I:C和LPS）。数据代表用四个不同供体的四个独立的实验。图形显示了平均值±s.d,N=3；（图6B）显示了来自HLA-A201+供体的血液衍生的mDC用8nM的抗DCIR.doc-coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP复合物mAb靶向，用TLR7/8-、TLR3-、TLR4-激动剂（分别为CL075、Poly I:C和LPS）中的任何一个活化，+
并用自体的CD8T细胞共同培养10天。图形显示了用特异性HLA-A201-FluMP(58-66) 四+
聚体测量的FluMP特异性CD8T细胞的百分比。图形中显示的条件为：未激活；CL0751μg/ml；Poly I:C 10μg/ml；LPS 50ng/ml。图形显示了平均值±s.d,N=3，（图6C）与在6B中相同的研究。图形显示了用特异性HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体测量的FluMP特异性+
CD8T细胞的平均百分比。图形中显示的条件为：未激活；CL075-0.2μg/ml和2μg/ml；
PolyI:C-5μg/ml和25μg/ml；LPS-10ng/ml和100ng/ml；
[0042] 图7A至7G显示了TLR7/8信号增强了通过mDC的DCIR介导的初级CD8+T细+
胞应答：（图7A）来自HLA-A201 供体的IFNα-DC用17nM的抗DCIR-MART-1或对照
IgG4-MART-1融合蛋白靶向，用CD40L(100ng/ml)、CL075(1μg/ml)、Poly I:C(5μg/ml)+
或LPS(50ng/ml)中的任一个活化并用自体的幼稚CD8T细胞共同培养10天。用特异性+
HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体测量MART-1特异性CD8T细胞的增殖。数据为用两个+
不同的供体的两个独立的实验，（图7B）来自HLA-A201 供体的血液衍生的mDC用30nM的抗DCIR-MART-1融合蛋白或抗DCIR-p24靶向，用CD40L或TLR7/8-激动剂活化，并用自体+
的幼稚CD8T细胞共同培养10天。上图显示了通过用抗DCIR-MART-1融合蛋白培养的、并用CD40L或TLR7/8-激动剂活化的纯化的血液mDC扩增的HLA-A201-MART-1(26-35)肽+
四聚体阳性CD8T细胞的比例。下图显示了由用抗DCIR-p24融合蛋白靶向的、并用CD40L或TLR7/8-激动剂活化的纯化的血液mDC扩增的HLA-A201-HIV gag p24(151-159)肽四+
聚体阳性CD8T细胞的比例。数据为用两个不同供体的两个独立的研究，（图7C）显示了细胞内效应分子粒酶B和穿孔蛋白的表达通过流式细胞术在由用10nM的抗DCIR-MART-1或IgG4-MART-1融合蛋白靶向的IFNα-DC敏化的、并用CD40L、CL075或CD40L和CL075+
的组合活化的CD8T细胞上进行评估。在抗原特异性MART-1(26-35)阳性细胞上的
表达通过用相应的HLA-A201四聚体共同染色来分析。数据代表两个独立的研究，（图
7D）显示了在用抗DCIR-MART-1靶向的DC、对照IgG4-MART-1或无抗原增殖后，用特异+
性HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体测量的MART-1特异性CD8T细胞的频率，所述抗
DCIR-MART-1靶向的DC、对照IgG4-MART-1或无抗原是由CD40L、TLR7/8配体或CD40L和TLR7/8配体的组合活化的。每个点代表一个单独的研究，（图7E）上图：IFNα-DC用17nM的抗DCIR-MART-1或对照IgG4-MART-1融合蛋白靶向，用 CD40L(100ng/ml)、CL075(1μg/+
ml)、Poly I:C(10μg/ml)或LPS(50ng/ml)活化并用自体幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，用15聚体重叠的来自MART-1蛋白的肽负载的新的DC重新刺激细胞。点显示了在莫+
能菌素（monensin）的存在下，通过CD8T细胞在5h的刺激后胞质内的IFN-γ的水平。下图：使用抗DCIR-p24或对照IgG4-p24融合蛋白作为模式抗原，（图7F）IFNα-DC用113nM的抗DCIR-MART-1融合蛋白靶向，用CD40L(100ng/ml)或CL075(1μg/ml)活化，并用自体+
幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，用15聚体重叠的来自MART-1蛋白的肽负载的新的DC重新刺激细胞。24h后在培养上清液中通过Luminex测量IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、TNF-α和IL-12p40的水平。图形显示了平均值±s.d，N=3，（图7G）IFNα-DC用10nM的抗DCIR-MART-1融合蛋白靶向，用CD40L(100ng/ml)或CL075(1μg/ml)或CD40L和CL075+
的组合活化，并用自体幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，用15聚体重叠的来自MART-1蛋白的肽负载的新的DC或用未负载的DC重新刺激细胞。点显示了在莫能菌素的存在下，通+
过CD8T细胞在5h的刺激后胞质内的IFN-γ和TNF-α的水平；
胞应答：（图7A）来自HLA-A201 供体的IFNα-DC用17nM的抗DCIR-MART-1或对照
IgG4-MART-1融合蛋白靶向，用CD40L(100ng/ml)、CL075(1μg/ml)、Poly I:C(5μg/ml)+
或LPS(50ng/ml)中的任一个活化并用自体的幼稚CD8T细胞共同培养10天。用特异性+
HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体测量MART-1特异性CD8T细胞的增殖。数据为用两个+
不同的供体的两个独立的实验，（图7B）来自HLA-A201 供体的血液衍生的mDC用30nM的抗DCIR-MART-1融合蛋白或抗DCIR-p24靶向，用CD40L或TLR7/8-激动剂活化，并用自体+
的幼稚CD8T细胞共同培养10天。上图显示了通过用抗DCIR-MART-1融合蛋白培养的、并用CD40L或TLR7/8-激动剂活化的纯化的血液mDC扩增的HLA-A201-MART-1(26-35)肽+
四聚体阳性CD8T细胞的比例。下图显示了由用抗DCIR-p24融合蛋白靶向的、并用CD40L或TLR7/8-激动剂活化的纯化的血液mDC扩增的HLA-A201-HIV gag p24(151-159)肽四+
聚体阳性CD8T细胞的比例。数据为用两个不同供体的两个独立的研究，（图7C）显示了细胞内效应分子粒酶B和穿孔蛋白的表达通过流式细胞术在由用10nM的抗DCIR-MART-1或IgG4-MART-1融合蛋白靶向的IFNα-DC敏化的、并用CD40L、CL075或CD40L和CL075+
的组合活化的CD8T细胞上进行评估。在抗原特异性MART-1(26-35)阳性细胞上的
表达通过用相应的HLA-A201四聚体共同染色来分析。数据代表两个独立的研究，（图
7D）显示了在用抗DCIR-MART-1靶向的DC、对照IgG4-MART-1或无抗原增殖后，用特异+
性HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体测量的MART-1特异性CD8T细胞的频率，所述抗
DCIR-MART-1靶向的DC、对照IgG4-MART-1或无抗原是由CD40L、TLR7/8配体或CD40L和TLR7/8配体的组合活化的。每个点代表一个单独的研究，（图7E）上图：IFNα-DC用17nM的抗DCIR-MART-1或对照IgG4-MART-1融合蛋白靶向，用 CD40L(100ng/ml)、CL075(1μg/+
ml)、Poly I:C(10μg/ml)或LPS(50ng/ml)活化并用自体幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，用15聚体重叠的来自MART-1蛋白的肽负载的新的DC重新刺激细胞。点显示了在莫+
能菌素（monensin）的存在下，通过CD8T细胞在5h的刺激后胞质内的IFN-γ的水平。下图：使用抗DCIR-p24或对照IgG4-p24融合蛋白作为模式抗原，（图7F）IFNα-DC用113nM的抗DCIR-MART-1融合蛋白靶向，用CD40L(100ng/ml)或CL075(1μg/ml)活化，并用自体+
幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，用15聚体重叠的来自MART-1蛋白的肽负载的新的DC重新刺激细胞。24h后在培养上清液中通过Luminex测量IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、TNF-α和IL-12p40的水平。图形显示了平均值±s.d，N=3，（图7G）IFNα-DC用10nM的抗DCIR-MART-1融合蛋白靶向，用CD40L(100ng/ml)或CL075(1μg/ml)或CD40L和CL075+
的组合活化，并用自体幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，用15聚体重叠的来自MART-1蛋白的肽负载的新的DC或用未负载的DC重新刺激细胞。点显示了在莫能菌素的存在下，通+
过CD8T细胞在5h的刺激后胞质内的IFN-γ和TNF-α的水平；
[0043] 图8A至8C显示了抗DCIR抗体未递送抑制信号到人类DC：（图8A和8B）示例性的+流式细胞术数据显示了在存在或不存在CD40L下CD86在DCIR连接的或对照CD1aLC的表面上的表达，（图8C）关于IL-6的Luminex试验在来自DCIR或对照连接的皮肤DC亚群的上清液上进行，所述DCIR或对照连接的皮肤DC亚群用CD40L或TLR7/8-激动剂活化24h。
显示了两个独立研究中的一个；以及
显示了两个独立研究中的一个；以及
[0044] 图9A至9D显示了DCIR连接不抑制CD8+T细胞敏化：（图9A）与对照DC相比，在存3 +
在或不存在CD40激活下，由[H]-胸苷掺入确定的DCIR连接的DC诱导了同种异体的CD8T细胞增殖的类似水平。图形显示了平均值±s.d,N=3，（图9B）在由DCIR连接的DC（蓝线）+
或对照DC（红线）敏化的同种异体的CD8T细胞上的PD-1、CTLA-4或CD28的表达的流式细+
胞术分析，（图9C）图形显示了通过活化的CD8T细胞的细胞因子分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α+
和IL-10的水平，所述活化的CD8T细胞是通过同种异体的DCIR连接的DC或对照DC敏化的。响应于抗CD3/CD28磁珠刺激测量细胞因子并在24h后通过Luminex分析，（图9D）效+
应分子的表达：在MART-1特异性CD8T细胞上通过流式细胞术评价的粒酶A、粒酶B和穿孔+
蛋白（右图），所述MART-1特异性CD8T细胞 是通过DCIR连接或对照MART-1肽负载的LC来敏化的。数据代表三个独立的研究。
在或不存在CD40激活下，由[H]-胸苷掺入确定的DCIR连接的DC诱导了同种异体的CD8T细胞增殖的类似水平。图形显示了平均值±s.d,N=3，（图9B）在由DCIR连接的DC（蓝线）+
或对照DC（红线）敏化的同种异体的CD8T细胞上的PD-1、CTLA-4或CD28的表达的流式细+
胞术分析，（图9C）图形显示了通过活化的CD8T细胞的细胞因子分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α+
和IL-10的水平，所述活化的CD8T细胞是通过同种异体的DCIR连接的DC或对照DC敏化的。响应于抗CD3/CD28磁珠刺激测量细胞因子并在24h后通过Luminex分析，（图9D）效+
应分子的表达：在MART-1特异性CD8T细胞上通过流式细胞术评价的粒酶A、粒酶B和穿孔+
蛋白（右图），所述MART-1特异性CD8T细胞 是通过DCIR连接或对照MART-1肽负载的LC来敏化的。数据代表三个独立的研究。
[0045] 发明描述
[0046] 尽管在下文中详细讨论了本发明的不同实施方案的制备和使用，应该认识到，本发明提供了多种可实施的发明构思，所述发明构思能在多种特定的环境下实施。在此讨论的特定实施方案仅仅是用于制备及使用本发明的具体方式的说明，而不限制本发明的范围。
[0047] 为了便于理解本发明，在下文定义了多个术语。在此定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员一般所理解的含义。术语如“一个（a）”，“一个（an）”及“该（the）”不是仅指单个的实体，而是包括其具体实例可以用于说明的大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方式，然而其使用不限制本发明，除非在权利要求中指出。
[0048] 本发明还包括抗体（或者“Ab”）或其片段的变体和其他改变，例如抗CD40融合蛋白（抗体与术语“免疫球蛋白”可交换地使用）。如本文中所使用的，术语“抗体或其片段”包括完整的抗体或者抗体的片段，例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc、及单链的Fv片段（ScFv）或者能特异性地结合于例如CD40的任意生物学上有效的免疫球蛋白片段。来自人类或者是人源化抗体在人类中具有降低的免疫原性或者没有免疫原性，并且与非人类的抗体相比，具有更低数量的免疫原性表位或者没有免疫原性表位。一般地选择在人类中具有降低水平的免疫原性，或者没有免疫原性的抗体及其片段。
[0049] 如本文中所使用的，术语“Ag”或者“抗原”指能够结合于免疫球蛋白分子的抗原结合区域，或者能够引发免疫应答的物质，所述的免疫应答如通过将抗原呈递到主要组织相容性抗原（MHC）细胞蛋白的T细胞介导的免疫应答。如本文中所使用的，“抗原”包括但不限于抗原决定簇、半抗原及免疫原，所述的免疫原可以是肽、小分子、碳水化合物、脂类、核酸或其组合。熟练的免疫学者能够认识到，当讨论处理从而呈递到T细胞上的抗原时，术语“抗原”是指由MHC呈递到T细胞受体上的T细胞表位的抗原的那些部分（例如肽的片段）。在B细胞介导的免疫应答的环境下，以对“抗原”特异性的抗体的形式使用时，结合到抗体（轻链和重链）的可变区的互补决定区的抗原的部分，该结合部分可以是线性的或者三维的表位。在本发明的环境下，术语抗原在两个环境下使用，即，抗体对于蛋白质抗原（CD40）是特异性的， 但还携带一个或多个用于由MHC呈递到T细胞上的肽表位。在某些情况下，将本发明的疫苗或者融合蛋白所递送的抗原内在化，并在呈递之前通过抗原呈递细胞进行加工，例如通过切割所述抗体或者融合蛋白的一个或多个部分。
[0050] 如本文中所使用的，术语“结合物（conjugate）”是指具有一个或多个靶向性结构域的蛋白质，例如抗体，以及至少一个抗原，例如小肽或蛋白质。这些结合物包括通过重组方法产生的那些例如融合蛋白，通过化学方法例如通过化学偶联如偶联到巯基基团产生的那些，以及通过任何其它方法产生的那些，借此将一种或多种抗体靶向性结构域和至少一种抗原直接或间接地通过接头连接到靶向试剂。接头的一个实例是黏结蛋白-锚定(coh-doc)对、生物素-亲和素（biotin-avidin）对、通过Zn结合的组氨酸标签等。 [0051] 与本发明一起使用的病毒抗原的实例包括但不限于，例如HIV、HCV、CMV、腺病毒、逆转录病毒、微小核糖核酸病毒等。逆转录病毒抗原的非限制性实例例如来自人类免疫缺陷病毒（HIV）抗原的逆转录病毒抗原，例如gag、pol和env基因的基因产物、Nef蛋白、逆转录酶和其他HIV成分；肝炎病毒抗原例如乙型肝炎病毒的S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒的前S抗原，和其他肝炎，例如甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，病毒成分例如丙型肝炎病毒RNA；流感病毒抗原例如血细胞凝集素和神经氨酸苷酶和其他流感病毒成分；麻疹病毒抗原如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒成分；风疹病毒抗原如蛋白E1和E2以及其他风疹病毒成分；轮状病毒抗原如VP7sc和其他轮状病毒成分；巨细胞病毒抗原如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原如RSV融合蛋白、M2蛋白和其他呼吸道合胞病毒抗原成分；单纯疱疹病毒抗原例如即刻早期蛋白、糖蛋白D和其他单纯疱疹病毒抗原成分；水痘带状疱疹病毒抗原如gpI、gpII和其他水痘带状疱疹病毒抗原成分；日本脑炎病毒抗原如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80%E和其他日本脑炎病毒抗原成分；狂犬病病毒抗原如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白和其他狂犬病病毒抗原成分。另外的病毒抗原的实例见Fundamental Virology,Second Edition,eds.Fields,B.N.and Knipe,D.M.(Raven Press,New York,1991)。至少一种病毒抗原可以是来自以下病毒的肽：腺病毒、逆转录病毒、微小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒、冠状病毒、囊膜病毒、黄病毒（flavirvirus）、棒状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、痘病毒、 嗜肝DNA病毒或海绵状病毒。在某些特定的、非限制性的实例中，至少一种病毒抗原为从HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、脊髓灰质炎、天花、风疹；呼吸道合胞、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感、和/或感冒病毒中的至少一种中获得的肽。
[0052] 与本文中公开的DCIR一起使用的细菌抗原包括，但不限于，例如细菌抗原如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原成分；白喉细菌抗原如白喉毒素或类毒素和其他白喉细菌抗原成分；破伤风细菌抗原如破伤风毒素或类毒素和其他破伤风细菌抗原成分；链球菌细菌抗原如M蛋白和其他链球菌细菌抗原成分；革兰氏阴性杆菌细菌抗原如脂多糖和其他革兰氏阴性细菌抗原成分，结核分支杆菌细菌抗原如分支菌酸、热休克蛋白65（HSP 65）、30kDa主要分泌性蛋白、抗原85A和其他分支杆菌抗原成分；幽门螺杆菌细菌抗原成分；肺炎球菌细菌抗原如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多糖和其他肺炎球菌细菌抗原成分；流感嗜血杆菌细菌抗原如荚膜多糖和其他流感嗜血杆菌细菌抗原成分；炭疽细菌抗原如炭疽保护性抗原和其他炭疽细菌抗原成分；立克次氏体细菌抗原如rompA和其他立克次氏体细菌抗原成分。本文所述细菌抗原还包括任何其他细菌、分枝杆菌、支原体、立克次氏体或衣原体抗原。部分或全部的病原体也可以是：流感嗜血杆菌、恶性疟原虫、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、淋球菌、血清型伤寒沙门氏菌、志贺氏杆菌、霍乱弧菌、登革热、脑炎、日本脑炎、莱姆病、鼠疫杆菌、西尼罗河病毒、黄热病、兔热病、肝炎（病毒性、细菌性）、RSV（呼吸道合胞病毒）、HPIV 1和HPIV3、腺病毒、天花、过敏和癌症。
[0053] 与本发明的组合物和方法一起使用的真菌抗原包括，但不限于，例如，念珠菌真菌抗原成分；组织胞浆菌真菌抗原如热休克蛋白60（HSP 60）和其他组织胞浆菌真菌抗原成分；隐球菌真菌抗原如荚膜多糖和其他隐球菌真菌抗原成分；球孢子菌真菌抗原如小球抗原和其他球孢子菌真菌抗原成分；和癣真菌抗原如发癣菌素和其他球孢子菌真菌抗原成分。
[0054] 原生动物和其他寄生虫抗原的实例包括，但不限于，例如，恶性疟原虫抗原如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、红内期抗原pf155/RESA和其他疟原虫抗原成分；弓形虫抗原如SAG-1、p30和其他弓形虫抗原成分；血吸虫抗原如谷胱甘肽-S-转移酶、 副肌球蛋白和其他血吸虫抗原成分；硕大利什曼原虫和其他利什曼原虫抗原如gp 63、脂磷聚糖及其相关蛋白和其他利什曼原虫抗原成分；和克氏锥虫抗原，如75-77kDa抗原、56k Da抗原和其他锥虫抗原成分。
[0055] 在细胞表面用于递送的靶抗原包括表现肿瘤抗原特性的那些，通常来源于肿瘤组织细胞的细胞表面、细胞质、细胞核、细胞器等。本发明的抗体部分的肿瘤靶点的实例包括，但不限于，血液癌症，如白血病和淋巴瘤，神经肿瘤如星型细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤如胃或结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖肿瘤如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分的癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。 [0056] 使用本发明可以被单独或结合递送至免疫细胞用于抗原呈递的抗原的实例包括肿瘤蛋白，例如，突变的癌基因；与肿瘤相关的病毒蛋白；以及肿瘤粘蛋白和糖脂。该抗原可以是与肿瘤相关的病毒蛋白，可以是来自上面提到的病毒种类的那些。某些抗原可以是表现肿瘤特性的（通常不被肿瘤前体细胞表达的一个亚群是蛋白质），或可以是通常在肿瘤前体细胞中表达但具有肿瘤的突变特性的蛋白质。其他抗原包括具有改变的活性或亚细胞分布的正常蛋白质的突变变体，例如，引起基因突变的肿瘤抗原。
[0057] 在自身免疫性疾病、过敏症和移植排斥中涉及的抗原可以被用于本发明的组合物和方法。例如，在本发明中可以使用在以下自身免疫性疾病或病症中的任何一种或多种中涉及的抗原：糖尿病（diabetes）、糖尿病（diabetesmellitus）、关节炎（包括风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎）、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎（包括过敏性皮炎和湿疹性皮炎）、银屑病、干燥综合征、包括继发于干燥综合征的干燥性角结膜炎、斑秃、由于节肢动物叮咬反应的过敏反应、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤性红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双边进展性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征，特发性 口炎性腹泻、扁平苔藓、克罗恩病，格雷夫斯眼病、肉状瘤病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。在自身免疫性疾病中涉及的抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶65（GAD 65）、天然DNA、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体成分、甲状腺球蛋白和促甲状腺激素（TSH）受体。 [0058] 在过敏症中涉及的抗原的实例包括花粉抗原例如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原，动物源性抗原如尘螨抗原和猫科动物抗原，组织相容性抗原和青霉素及其他治疗性药物。在移植排斥中涉及的抗原的实例包括要移植于移植接受者的移植物例如心脏、肺、肝脏、胰腺、肾脏的抗原成分和神经移植物成分。抗原可以是在治疗自身免疫性疾病中有用的变构肽配体。
[0059] 如本文中所使用的，术语“抗原肽（antigenic peptide）”指由B-细胞或者T-细胞特异性地识别的多肽抗原的那部分。B细胞通过抗体的产生对外来的抗原决定簇作出应答，而T-淋巴细胞是介导细胞免疫。因此，抗原肽是被抗体所识别的抗原的那些部分，或者在MHC的环境下，是被T-细胞受体所识别的抗原的那些部分。
[0060] 如本文中所使用的，术语“表位”指能特异性地结合到免疫球蛋白，或者由主要组织相容性复合体（MHC）蛋白（如I类或者II类）呈递到T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇一般地是5-30个氨基酸长的短肽，其适合MHC分子的沟槽，所述的MHC分子向T细胞受体呈递某些氨基酸侧基，并在沟槽中具有某些其他残基，例如由于沟槽、肽的侧基和T细胞受体的荷质比特征。一般来说，当解离常数是1mM、100nM或者甚至10nM时，抗体特异性地结合于抗原。
[0061] 如本文所使用的，术语“载体（vector）”在两个不同的环境下使用。当使用术语“载体”关于疫苗时，载体用于描述用于指导或者递送疫苗的抗原部分的非抗原部分。例如，可以将抗体或者其片段连接到引发免疫应答的抗原上，或者与该抗原形成融合蛋白。对于细胞疫苗来说，递送和/或呈递抗原的载体是抗原呈递细胞，其由加载了抗原的细胞进行递送。在特定的情况下，细胞载体自身也可以加工抗原，并将其呈递到T细胞，并且激发抗原特异性的免疫应答。当在核酸的环境下使用时，“载体”指构建体，所述的构建体能够在宿主细胞中递送，并且优选地能够表达一个或多个感兴趣的基因或者多核苷酸序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或者RNA表 达载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或者RNA表达载体、包裹在脂质体和特定的真核细胞如生产细胞（producer cell）中的DNA或者RNA表达载体。
[0062] 如本文中所使用的，术语“稳定的”和“不稳定的”当其指蛋白时，用于描述保持其三维结构和/或活性（稳定的），或立刻或随时间失去其三维结构和/或活性（不稳定的）的肽或蛋白质。如本文中所使用的，术语“不溶的”指那些蛋白当其在细胞中产生时（例如在真核或者原核细胞中，或者在体外表达的重组蛋白），在不使用变性条件或者变性剂（例如分别地热或者化学变性剂）的情况下在溶液中不可溶。发现在本文中教导的抗体或其片段及接头将具有所述的肽的抗体融合蛋白从不可溶和/或不稳定转化成稳定和/或可溶的蛋白。另一个稳定性与不稳定性的实例是，在同样的溶液中测量时，蛋白的结构域具有稳定的构型时，其具有比蛋白的不稳定结构域更高的熔化温度（Tm）。当在同样的溶液中测量时，如果Tm的差为至少约2℃，一个结构域与另一个结构域相比是稳定的，所述的差更优选地为约4℃，再更优选地为约7℃，又更优选地为约10℃，还更优选地为约15℃，再更优选地为约20℃，还再优选地为约25℃，以及最优选地为约30℃。
[0063] 如本文中所使用的，“多核苷酸”或者“核酸”指单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的链（包括天然核苷酸的已知类似物）。双链的核酸序列包括互补的序列。所述的多核苷酸序列可以编码免疫球蛋白的可变区和/或恒定区，所述的免疫球蛋白的可变区和/或恒定区与一个或多个接头形成融合蛋白。在本发明的应用中，可以将多克隆位点（MCS）设计成为抗体的重链和/或轻链的羧基末端的位置，从而使得能在接头之间框内插入所表达的肽。如本文中所使用的，术语“经分离的多核苷酸”指来自基因组、cDNA、或者来自合成的多核苷酸或其一些组合。由于其来源，所述的“经分离的多核苷酸”（1）其与在自然中发现该“经分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或者部分不相关；（2）其可操作地连接到在自然中不与之连接的多核苷酸；或者（3）在自然中不以更大的序列的一部分存在。本领域技术人员能够意识到，可以使用本领域中已知的技术在核酸的水平上进行操作，从而设计和完成载体，所述本领域中已知的技术如John Wiley和Sons在Current Protocolsin Molecular Biology,2007中教导的那些，其相关的部分通过引用并入本文。简略地说，可以使用聚合酶链式反应、寡核苷酸的酶促插入（enzymaticinsertion）或者载体中的聚合酶链式反应片段插入编码的核酸序列，所述的载体可以是表达载体。为了便于在抗体的轻链、重链或者轻链和重链两者的 羧基末端插入插入物，可以用抗体序列按顺序设计多克隆位点（MCS）。
[0064] 如本文中所使用的，术语“多肽”指氨基酸的聚合物，而不指产物的特定长度；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义之内。此术语也不表示或者排除所述多肽的表达后修饰，所述多肽的表达后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。定义中所包括的例如，含有一个或多个氨基酸类似物的多肽（包括，例如非天然氨基酸等等），具有取代连接键的多肽以及其他本领域中已知的修饰，所述的修饰可以是天然产生的和非天然产生的。术语“结构域”或者“多肽结构域”指在天然构型下，折叠成单个球形域的多肽序列，其可以显示出分离的（discrete）结合或者功能性能。
[0065] 多肽或者氨基酸序列“得自”指定的核酸序列，指具有与该序列中编码的多肽相同的氨基酸序列的多肽或其部分，其中所述的部分由至少3-5个氨基酸构成，优选地由至少4-7个氨基酸构成，更优选地由至少8-10个氨基酸构成，以及还更优选地由至少11-15个氨基酸构成；或者所述的多肽与该序列中编码的多肽在免疫上是可识别的。该术语还包括从所指定的核酸序列表达的多肽。
[0066] 如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”指任意的材料，所述的材料当与本发明的免疫球蛋白（Ig）融合蛋白结合时，使得所述的Ig能保持生物活性，并且一般地与受试者的免疫系统不反应。实例包括，但不限于标准的药物载体如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液，及不同类型的润湿剂。可以在本发明中使用特定的稀释剂，例如，对于气雾剂或者肠胃外给药，所述的稀释剂可以是磷酸盐缓冲盐水，或者生理（0.85%）盐水。 [0067] 树突细胞（DC）在启动和控制适应性免疫应答的强度和质量中起到关键的作用1,2。DC解码和整合这些信号并递送这些信息至适应性免疫系统的细胞。DC由亚群组成，其具有
3-5
专门的以及共享的功能 。微生物可以通过多种模式识别受体（PRR）直接活化DC，所述模
6 7
式识别受体例如Toll样受体（TLR）、细胞表面C型凝集素受体（CLR）和胞质内NOD样受
8，9 10
体（NLR） 。在人类中，某些CLR区分DC亚群与表达BDCA2 的类浆细胞DC（pDC）、表达
11 12
Langerin 的朗格汉斯细胞（LC）以及表达DC-SIGN 的间质DC。其他C型凝集素在其他细
7
胞型上表达，所述其他细胞型包括内皮细胞和中性粒细胞。CLR，例如DC-SIGN，可以充当大量微生物的锚并允许它们的内在化。此外，CLR也充当在DC和其他细胞型之间的粘附分子，
12,13
所述其他细胞型包括内皮细胞、T细胞和中性粒细胞 。DEC-205/CD205，一种未知 功能的凝集素，已在小鼠中广泛地研究了其吞噬配体的能力。通过DEC-205在不存在DC激活时
14,15
将抗原靶向至小鼠DC导致耐受性诱导 。相反，在存在DC激活时（CD40和TLR3激动剂）
14,16
靶向抗原导致产生针对多种抗原的免疫 。多数研究证明针对经DEC-205递送的抗原的+ +
CD4T细胞应答或初级CD8T细胞应答的诱导已被限于转基因小鼠OT-I/II系统。
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专门的以及共享的功能 。微生物可以通过多种模式识别受体（PRR）直接活化DC，所述模
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式识别受体例如Toll样受体（TLR）、细胞表面C型凝集素受体（CLR）和胞质内NOD样受
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体（NLR） 。在人类中，某些CLR区分DC亚群与表达BDCA2 的类浆细胞DC（pDC）、表达
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Langerin 的朗格汉斯细胞（LC）以及表达DC-SIGN 的间质DC。其他C型凝集素在其他细
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胞型上表达，所述其他细胞型包括内皮细胞和中性粒细胞。CLR，例如DC-SIGN，可以充当大量微生物的锚并允许它们的内在化。此外，CLR也充当在DC和其他细胞型之间的粘附分子，
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所述其他细胞型包括内皮细胞、T细胞和中性粒细胞 。DEC-205/CD205，一种未知 功能的凝集素，已在小鼠中广泛地研究了其吞噬配体的能力。通过DEC-205在不存在DC激活时
14,15
将抗原靶向至小鼠DC导致耐受性诱导 。相反，在存在DC激活时（CD40和TLR3激动剂）
14,16
靶向抗原导致产生针对多种抗原的免疫 。多数研究证明针对经DEC-205递送的抗原的+ +
CD4T细胞应答或初级CD8T细胞应答的诱导已被限于转基因小鼠OT-I/II系统。
[0068] 抗原已被通过其他表面分子靶向至小鼠DC，所述其他表面分子包括LOX-1（结合于17 18 19 20 21
HSP70 的II型C型凝集素受体）、甘露糖受体 、Dectin-1 、Dectin-2 、CD40 、Langerin
22 23 24
、Gb3（志贺毒素 的受体）、DEC-205 和CLEC9A，所述CLEC9A最近被描述从而在小鼠中+ 25,26,27
敏化幼稚CD8T细胞 。通过在不同鼠科动物DC亚群上表达的受体靶向抗原导致不同
28,29 30
的功能性结果 。将抗原靶向至人类DC抗DC-SIGN与KLH 的结合物、抗DEC-205与HIV
31 32
gag 的结合物和抗甘露糖受体与人绒毛膜促性腺激素（hCGb） 的结合物已显示分别被呈+ +
递/交叉呈递至血液CD4 和CD8T细胞或至T细胞克隆。
HSP70 的II型C型凝集素受体）、甘露糖受体 、Dectin-1 、Dectin-2 、CD40 、Langerin
22 23 24
、Gb3（志贺毒素 的受体）、DEC-205 和CLEC9A，所述CLEC9A最近被描述从而在小鼠中+ 25,26,27
敏化幼稚CD8T细胞 。通过在不同鼠科动物DC亚群上表达的受体靶向抗原导致不同
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的功能性结果 。将抗原靶向至人类DC抗DC-SIGN与KLH 的结合物、抗DEC-205与HIV
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gag 的结合物和抗甘露糖受体与人绒毛膜促性腺激素（hCGb） 的结合物已显示分别被呈+ +
递/交叉呈递至血液CD4 和CD8T细胞或至T细胞克隆。
[0069] 本发明人重点研究凝集素DCIR33，所述凝集素DCIR在不同类型的DC，包括来自血液的DC上广泛表达。事实上，DCIR最初被描述为在血液单核细胞、B细胞、中性粒细胞、粒细34
胞和真皮DC但不是LC上表达，最近也发现在pDC上表达 。功能上它可以充当HIV的受体
35
。人类基因组仅编码单一的DCIR基因而小鼠基因组显示四种DCIR样基因DCIR2、DCIR3、DCIR4和DCAR1。DCIR和DCAR在它们的胞外域中共享大量的序列同源性，然而，DCAR与免疫受体家族基于酪氨酸的具有活化基序（ITAM）的FcRγ链相关，然而，DCIR含有免疫受体
36
基于酪氨酸的抑制基序（ITIM），所述ITIM募集（recruit）SHP-1和SHP-2磷酸酯酶 。对于小鼠DCAR的人类同系物迄今还未被识别。
胞和真皮DC但不是LC上表达，最近也发现在pDC上表达 。功能上它可以充当HIV的受体
35
。人类基因组仅编码单一的DCIR基因而小鼠基因组显示四种DCIR样基因DCIR2、DCIR3、DCIR4和DCAR1。DCIR和DCAR在它们的胞外域中共享大量的序列同源性，然而，DCAR与免疫受体家族基于酪氨酸的具有活化基序（ITAM）的FcRγ链相关，然而，DCIR含有免疫受体
36
基于酪氨酸的抑制基序（ITIM），所述ITIM募集（recruit）SHP-1和SHP-2磷酸酯酶 。对于小鼠DCAR的人类同系物迄今还未被识别。
[0070] 本发明报道了通过抗DCIR结合物mAb向大范围的DC亚群成功地递送抗原，允许+人类CD8T细胞的交叉呈递和交叉敏化。DCIR特异性抗体的实例包括（登记号：PTA 10246和PTA 10247，先前在第20080241170号和第20080206262号的美国专利公开中描述），相关的部分，包括序列通过引用并入本文。
[0071] DC亚群：CD34+衍生的DC在体外由CD34+-HPC产生，所述CD34+-HPC从给予G-CSF以调动前体细胞的健康志愿者的血液中分离。在Yssel’s培养基（Irvine Scientific,CA）6
中以0.5x10 细胞/ml培养HPC 9天，所述Yssel’s 培养基补充有5%自体血清、50μM β-巯基乙醇、1%L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、GM-CSF（50ng/ml;Berlex）、Flt3-L（100ng/ml;R&D）和TNF-α（10ng/ml;R&D）。在培养的第5天更换培养基和细胞因子。然后分选DCs、CD1a+CD14--LCs和CD1a-CD14+DCs的亚群，得到纯度为95-99%。通过在补充具有GM-CSF(100ng/ml;Immunex Corp.)和IL-4(25ng/ml R&D)的10%胎牛血清（FBS）的RPMI中培养单核细胞5天，或在补充具有GM-CSF(100ng/ml;Immunex Corp.)和IFN-α2b(500U/ml;Intron A;Schering-Plough)的10%胎牛血清（FBS）的RPMI中培养单核细胞3天产生+ + -
单核细胞衍生的DC。从新鲜的PBMC中分选mDC和pDC分别为Lin-HLA-DRCD11cCD123 和- + - +
LinHLA-DRCD11cCD123。
中以0.5x10 细胞/ml培养HPC 9天，所述Yssel’s 培养基补充有5%自体血清、50μM β-巯基乙醇、1%L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、GM-CSF（50ng/ml;Berlex）、Flt3-L（100ng/ml;R&D）和TNF-α（10ng/ml;R&D）。在培养的第5天更换培养基和细胞因子。然后分选DCs、CD1a+CD14--LCs和CD1a-CD14+DCs的亚群，得到纯度为95-99%。通过在补充具有GM-CSF(100ng/ml;Immunex Corp.)和IL-4(25ng/ml R&D)的10%胎牛血清（FBS）的RPMI中培养单核细胞5天，或在补充具有GM-CSF(100ng/ml;Immunex Corp.)和IFN-α2b(500U/ml;Intron A;Schering-Plough)的10%胎牛血清（FBS）的RPMI中培养单核细胞3天产生+ + -
单核细胞衍生的DC。从新鲜的PBMC中分选mDC和pDC分别为Lin-HLA-DRCD11cCD123 和- + - +
LinHLA-DRCD11cCD123。
[0072] 从正常人类皮肤样本中纯化表皮LC、真皮CD1a+DC和真皮CD14+DC。在4°C下在细菌蛋白酶分散酶2型中培养样本18h，然后在37°C下培养2h。然后分离表皮和真皮片，切成小片（~1-10mm）并置于补充10%FBS的RPMI1640中。2天后，收集转移至培养基的细胞并进一步使用密度为1.077g/dl的聚蔗糖-泛影酸（Ficoll-diatrizoate）丰富。在用抗CD1a FITC(DAKO)和抗CD14APC mAbs(Invitrogen)染色后通过细胞分选纯化DC。所有的草案均经机构审查委员会审查并通过。
[0073] 在DC/T细胞共培养物中抗原特异性T细胞的扩增：为了评价DC在呈递FluMP-或+MART-1-衍生的抗原中的功能，本发明人使用来自HLA-A201 供体的DC。在指示的浓度下用+
结合物mAb培养细胞。用抗原脉冲的DC以DC/T比为1:20下培养协同纯化的CD8T细胞。24h
49
后向培养物中加入CD40L(100ng/ml;R&D)以增强DC 的交叉呈递。在37°C下培养共培养物8-10天。在第3天以10U/ml加入IL-2。如果指示，用TLR激动剂：LPS (10、50或200ng/ml;Invivogen),Poly I:C(5、10或25μg/ml)或噻唑喹啉化合物CL075(0.2、1或2μg/ml;Invivogen)活化DC。分别使用HLA-A201-FluMP(58-66)肽(GILGFVFTL)(SEQ ID NO:1)、HLA-A201-MART-1(26-35)肽(ELAGIGILTV)(SEQ ID NO:2)和HLA-A201-p24(151-155)肽(TLNAWVKVV)(SEQ ID NO:3)-四聚体(Beckman Coulter)评估FluMP-、MART-1-和HIV gag + +
p24-特异性CD8T细胞的扩增。对于向多重CD8T细胞特异性表位交叉敏化的评价，用抗+ +
DCIR-p24或IgG4-p24融合mAb培养CD34 衍生的DC，并用标记CFSE的CD8T细胞以DC/T比为1:30培养。用CD40L(100ng/ml)活化抗原脉冲的DC。在两次连续的刺激后，分选CFSE 低增殖细胞并用负载HIV gag p24蛋白（2μg/ml）的新鲜DC重新刺激24h。在培养上清液中通过Luminex测量分泌的IFN-γ。供选择地，mDC或IFN-αDC用抗DCIR-MART-1或+
IgG4-MART-1融合蛋白靶向，按照指示活化并用幼稚CD8T细胞培养10天。细胞内IFN-γ的生成以及在指示时CD107a(BDBiosciences)的调动，在用新鲜的自体DC重新刺激5h后测量，所述自体DC在蛋白转运抑制剂莫能菌素(GolgiStop；BD Biosciences)的存在下用来自MART-1蛋白(2.5μM)的重叠肽的15个氨基酸负载。在40h后在上清液中通过Luminex测量IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13的分泌。
结合物mAb培养细胞。用抗原脉冲的DC以DC/T比为1:20下培养协同纯化的CD8T细胞。24h
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后向培养物中加入CD40L(100ng/ml;R&D)以增强DC 的交叉呈递。在37°C下培养共培养物8-10天。在第3天以10U/ml加入IL-2。如果指示，用TLR激动剂：LPS (10、50或200ng/ml;Invivogen),Poly I:C(5、10或25μg/ml)或噻唑喹啉化合物CL075(0.2、1或2μg/ml;Invivogen)活化DC。分别使用HLA-A201-FluMP(58-66)肽(GILGFVFTL)(SEQ ID NO:1)、HLA-A201-MART-1(26-35)肽(ELAGIGILTV)(SEQ ID NO:2)和HLA-A201-p24(151-155)肽(TLNAWVKVV)(SEQ ID NO:3)-四聚体(Beckman Coulter)评估FluMP-、MART-1-和HIV gag + +
p24-特异性CD8T细胞的扩增。对于向多重CD8T细胞特异性表位交叉敏化的评价，用抗+ +
DCIR-p24或IgG4-p24融合mAb培养CD34 衍生的DC，并用标记CFSE的CD8T细胞以DC/T比为1:30培养。用CD40L(100ng/ml)活化抗原脉冲的DC。在两次连续的刺激后，分选CFSE 低增殖细胞并用负载HIV gag p24蛋白（2μg/ml）的新鲜DC重新刺激24h。在培养上清液中通过Luminex测量分泌的IFN-γ。供选择地，mDC或IFN-αDC用抗DCIR-MART-1或+
IgG4-MART-1融合蛋白靶向，按照指示活化并用幼稚CD8T细胞培养10天。细胞内IFN-γ的生成以及在指示时CD107a(BDBiosciences)的调动，在用新鲜的自体DC重新刺激5h后测量，所述自体DC在蛋白转运抑制剂莫能菌素(GolgiStop；BD Biosciences)的存在下用来自MART-1蛋白(2.5μM)的重叠肽的15个氨基酸负载。在40h后在上清液中通过Luminex测量IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-4、IL-5和IL-13的分泌。
[0074] 本发明另外的方法包括本文以下提供的抗DCIR mAb的产生和重组DCIR的生成、嵌合小鼠/人IgG4重组mAb的克隆和表达、对APC的DCIR表达分析、对DC表型和功能的+DCIR信号效应、融合蛋白mAb的克隆和生成、对DC的肽MHC复合物检测、CD8T细胞的纯化和通过化学连接的抗DCIR mAb的FluMP蛋白的交叉呈递的详细说明。
[0075] 抗DCIR mAb的产生和重组DCIR的生成：小鼠mAb通过传统的细胞融合技术产生。简要地说，6周龄的BALB/c鼠用20μg的受体胞外域.hIgGFc融合蛋白与Ribi佐剂腹膜内免疫，然后10天和15天后用20μg抗原加强免疫。3个月后，在取出脾脏之前的3天再次对小鼠加强免疫。供选择的，在30-40天中每3-4天用1-10μg溶解于Ribi佐剂中的抗原注射小鼠足垫。来自脾脏的B细胞或淋巴结细胞使用传统技术用SP2/O-Ag14细51 33
胞 融合。与单独的融合伴侣或与融合到AP 的受体胞外域对比，针对受体胞外域融合蛋白使用ELISA筛选杂交瘤上清液。然后使用暂时转染编码全长受体cDNA的表达质粒的HEK293F细胞通过流式细胞术筛选阳性孔。选择的杂交瘤为单细胞克隆的并在CELLine烧瓶(Intergra)中扩增。杂交瘤上清液与等体积的1.5M甘氨酸、3M NaCl、1x PBS、pH7.8(结合缓冲液)混合并用MabSelect树脂(eBiosciences)滚磨(800μl/5ml上清液)。清洗树脂并用0.1M甘氨酸，pH2.7洗脱。接着用2MTris中和，mAb相对于PBS透析。抗DCIR抗体AB8-26.9E8.1E3(HS854)，保藏编号PTA-10246，保存于美国模式培养物保藏所(ATCC)或抗DCIR抗体保藏编号PTA10247，保藏日期2009年7月30日。
胞 融合。与单独的融合伴侣或与融合到AP 的受体胞外域对比，针对受体胞外域融合蛋白使用ELISA筛选杂交瘤上清液。然后使用暂时转染编码全长受体cDNA的表达质粒的HEK293F细胞通过流式细胞术筛选阳性孔。选择的杂交瘤为单细胞克隆的并在CELLine烧瓶(Intergra)中扩增。杂交瘤上清液与等体积的1.5M甘氨酸、3M NaCl、1x PBS、pH7.8(结合缓冲液)混合并用MabSelect树脂(eBiosciences)滚磨(800μl/5ml上清液)。清洗树脂并用0.1M甘氨酸，pH2.7洗脱。接着用2MTris中和，mAb相对于PBS透析。抗DCIR抗体AB8-26.9E8.1E3(HS854)，保藏编号PTA-10246，保存于美国模式培养物保藏所(ATCC)或抗DCIR抗体保藏编号PTA10247，保藏日期2009年7月30日。
[0076] cDNA克 隆 和 嵌 合 小 鼠/ 人 重 组IgG4mAb 的 表 达。 从 杂 交 瘤 细胞 (RNeasykit,Qiagen) 制 备 总 RNA 并 用 于 cDNA 合 成 和 PCR(SMART RACE kit,BDBiosciences)，所述PCR使用提供的5’引物和基因特异性3’引物mIgGκ(5’ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3’)(SEQ ID NO:4)和mIgG1 (5’gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3’)(SEQ ID NO:5)。然后克隆PCR产物(pCR2.1TAkit,Invitrogen)并通过DNA测序进行表征。使用小鼠重（H）和轻（L）链可变（V）区cDNA的衍生的序列，将特异性引物用于PCR放大信号肽和V区，同时将用于克隆的侧翼限制性位点掺入到编码下游人IgGκ或IgG4H区的表达载体。所述用于表达嵌合mVκ-hIgGκ的载体通过扩增侧翼为Xho I和NotI位点的残基401-731(gi|63101937|)构建，并将其插入载体pIRE7A-DsRed2(BD Biosciences)的Xho I–Not I间隔。使用PCR从起始密码子扩增mAb Vκ区，附加Nhe I或Spe I位点然后CACC，至区域编码（如gi|76779294|的残基126），附加Xho I位点。然后PCR片段克隆至上述载体的Nhe I–Not I间隔。对照hIgG4H载体相当于具有7A29P和L236E取代的gi|19684072|的残基12-1473，其稳定二硫键并取消残留的FcR相互作38
用 ，插入pIRE7A-DsRed2(BD Biosciences)的Bgl II和Not I位点之间，同时加入序列
5’-gctagctgattaattaa-3’(SEQ ID NO:6)而不是终止密码子。使用PCR从起始密码子扩增mAb VH区，附加CACC然后Bgl II位点，至编码gi|19684072|的残基473的区域。然后将PCR片段克隆至上述载体的Bgl II–Apa I间隔。使用mSLAM前导区嵌合的mVH-hIgG4序列的载体通过插入序列5’ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc3’(SEQ ID NO:7)至上述载体的Nhe I–Apa I间隔来构建。使用PCR扩增在预测的成熟N-末端密码子和mVH区的末端之间的间隔，同时附加5’tcgtacgga3’。用Bsi WI和Apa I消化的片段插入上述载体的相应位点。侧翼为近端的Nhe I位点和接着终止密码子的远端的Not I位点的抗原编码序列插入到每个H链载体的Nhe I-Pac I-Not I间隔。锚定(Doc)由具有近端的Nhe I位点和远端的Not I位点的gi|40671|热纤维梭菌（C.thermocellum）CelD残基1923-2150编码。
HIV gag p24由具有近端的Nhe I位点和来自gi|125489020|残基60-75的序列和远端的TM
Not I位点的gi|77416878|残基133-363编码。使用FreeStyle 293或CHO-S表达系统(Invitrogen)根据制造商的方案（分别为1mg总质粒DNA与1.3ml 293Fectin试剂或1mg总质粒DNA与1ml FREESTYLE MAX试剂/L的转染）生成重组抗体。共同转染编码H和L链的等量的载体。培养转染的细胞3天，然后收获培养上清液并用添加的0.5%青霉素/链霉素（Biosource）更换培养基并继续培养2天。通过过滤使集合的上清液澄清，负载到1ml TM
HiTrapMabSelect 柱上，用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，用2mM Tris中和然后相对 PBS用++ ++
Ca /Mg 透析。在280nm处通过吸光度定量蛋白。
用 ，插入pIRE7A-DsRed2(BD Biosciences)的Bgl II和Not I位点之间，同时加入序列
5’-gctagctgattaattaa-3’(SEQ ID NO:6)而不是终止密码子。使用PCR从起始密码子扩增mAb VH区，附加CACC然后Bgl II位点，至编码gi|19684072|的残基473的区域。然后将PCR片段克隆至上述载体的Bgl II–Apa I间隔。使用mSLAM前导区嵌合的mVH-hIgG4序列的载体通过插入序列5’ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc3’(SEQ ID NO:7)至上述载体的Nhe I–Apa I间隔来构建。使用PCR扩增在预测的成熟N-末端密码子和mVH区的末端之间的间隔，同时附加5’tcgtacgga3’。用Bsi WI和Apa I消化的片段插入上述载体的相应位点。侧翼为近端的Nhe I位点和接着终止密码子的远端的Not I位点的抗原编码序列插入到每个H链载体的Nhe I-Pac I-Not I间隔。锚定(Doc)由具有近端的Nhe I位点和远端的Not I位点的gi|40671|热纤维梭菌（C.thermocellum）CelD残基1923-2150编码。
HIV gag p24由具有近端的Nhe I位点和来自gi|125489020|残基60-75的序列和远端的TM
Not I位点的gi|77416878|残基133-363编码。使用FreeStyle 293或CHO-S表达系统(Invitrogen)根据制造商的方案（分别为1mg总质粒DNA与1.3ml 293Fectin试剂或1mg总质粒DNA与1ml FREESTYLE MAX试剂/L的转染）生成重组抗体。共同转染编码H和L链的等量的载体。培养转染的细胞3天，然后收获培养上清液并用添加的0.5%青霉素/链霉素（Biosource）更换培养基并继续培养2天。通过过滤使集合的上清液澄清，负载到1ml TM
HiTrapMabSelect 柱上，用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，用2mM Tris中和然后相对 PBS用++ ++
Ca /Mg 透析。在280nm处通过吸光度定量蛋白。
[0077] DCIR表达分析：在PBMC、体外产生的或皮肤衍生的DC上评估DCIR表达。用抗DCIR mAb（按照在补充的方法中描述的产生）或小鼠IgG1(BD)双重染色细胞，清洗，然后用结合PE的山羊抗小鼠IgG(BD Pharmingen)染色，然后清洗并用FITC或结合APC的抗CD3、抗CD19、抗CD11c、抗HLA-DR、抗CD11c、抗CD123、抗CD56、抗CD16、(BD Pharmingen)抗CD1a(DAKO)或抗CD14(Invitrogen)mAb培养。按照在补充的方法中的详细描述对表皮片染色以评价在未成熟的LC上的DCIR表达。
[0078] 对于在未成熟的LC上的DCIR表达，将表皮片切至大约10平方毫米并置于4%的多聚甲醛中30min。在PBS中清洗片并用Background Buster(Innovex)封闭30min。然后用0.5μg纯化的小鼠抗DCIR（克隆9E8）或对照IgG1培养表皮片过夜，用PBS/0.05%皂素清洗两次并用次级山羊抗小鼠IgG-Alexa568(Molecular Probes)(1:500稀释)培养1h。用DAPI(Invitrogen;Molecular Probes)以1:5000对细胞核染色，接着用抗HLA-DR-FITC培养2h。用PBS冲洗片并将其装在Vectamount(Vector Laboratories)中。所有的抗体用CytoQ稀释剂和封闭(Innovex)中稀释并且全部在4°C下伴随恒定的轻微搅动培养。用Olympus Planapo 20/0.7，Coolsnap HQ照相机拍照，并用Metamorph软件分析。 [0079] 对DC功能的DCIR信号效应：在存在或不存在CD40L(R&D;100ng/ml)或
LPS(Invivogen;50ng/ml)的情况下在抗DCIR(克隆24A5或9E8)或同种型对照涂覆
+
的板中培养CD34 衍生的DC。24h后，收获细胞并对表面表型染色。分泌的细胞因子用multiplex bead assay(Luminex)分析。对于全基因信号分析从正常人皮肤纯化的
6
0.5x10 表皮细胞以5μg/ml在可溶的、交联的或板涂覆的形式中暴露于抗DCIR（克隆
24A5或9E8）、抗CD40（克隆12E12），或者与IgG1同种型匹配的对照24h。从200ng的总RNA中获得双链的cDNA，并根据制造商的说明在体外转录后进行扩增和标记步骤。根据Illumina(Ambion,Inc,Austin,TX)推荐的样品标记程序将1.5μg扩增的生物素标记的cRNA杂交到Illumina Sentrix Hu6BeadChips。BeadChips由50聚体的寡核苷酸探针组成，所述50聚体的寡核苷酸探针附着于在玻璃载玻片的表面上代表48,687个探针的微孔内的
3-μm小珠。在Illumina BeadStation500上扫描载玻片并使用Beadstudio软件评价荧光+
杂交信号。为了研究DCIR信号对于同种异体CD8T细胞敏化的效果，在用抗DCIR mAb或IgG1对照 （10μg/ml）涂覆的板中以DC：T的比值为1:20，在存在或不存在CD40L的情况下+ 3
用同种异体的幼稚CD8T细胞培养LC。在6天培养的最后12h期间通过测量[H]-胸苷掺+ 低
入分析T细胞增殖响应。在CD3/CD28mAb刺激后分析增殖的CD8T细胞（CFSE ）的表型和+ +
细胞因子分泌模式。为了研究DCIR信号对自体的CD8T细胞敏化的效果，CD34 衍生的DC亚群用HLA-A201-限制的MART-1(26-35)肽负载，并在可溶形式的抗DCIR mAb或IgG1对照+
（10μg/ml）和CD40L的存在下与幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，收获细胞并通过特异+
性四聚体分析MART-1特异性CD8T细胞的频率，并分析效应分子粒酶A(BD Pharmingen)、粒酶B(eBiosciences)和穿孔蛋白(Fitzgerald)的表达。
LPS(Invivogen;50ng/ml)的情况下在抗DCIR(克隆24A5或9E8)或同种型对照涂覆
+
的板中培养CD34 衍生的DC。24h后，收获细胞并对表面表型染色。分泌的细胞因子用multiplex bead assay(Luminex)分析。对于全基因信号分析从正常人皮肤纯化的
6
0.5x10 表皮细胞以5μg/ml在可溶的、交联的或板涂覆的形式中暴露于抗DCIR（克隆
24A5或9E8）、抗CD40（克隆12E12），或者与IgG1同种型匹配的对照24h。从200ng的总RNA中获得双链的cDNA，并根据制造商的说明在体外转录后进行扩增和标记步骤。根据Illumina(Ambion,Inc,Austin,TX)推荐的样品标记程序将1.5μg扩增的生物素标记的cRNA杂交到Illumina Sentrix Hu6BeadChips。BeadChips由50聚体的寡核苷酸探针组成，所述50聚体的寡核苷酸探针附着于在玻璃载玻片的表面上代表48,687个探针的微孔内的
3-μm小珠。在Illumina BeadStation500上扫描载玻片并使用Beadstudio软件评价荧光+
杂交信号。为了研究DCIR信号对于同种异体CD8T细胞敏化的效果，在用抗DCIR mAb或IgG1对照 （10μg/ml）涂覆的板中以DC：T的比值为1:20，在存在或不存在CD40L的情况下+ 3
用同种异体的幼稚CD8T细胞培养LC。在6天培养的最后12h期间通过测量[H]-胸苷掺+ 低
入分析T细胞增殖响应。在CD3/CD28mAb刺激后分析增殖的CD8T细胞（CFSE ）的表型和+ +
细胞因子分泌模式。为了研究DCIR信号对自体的CD8T细胞敏化的效果，CD34 衍生的DC亚群用HLA-A201-限制的MART-1(26-35)肽负载，并在可溶形式的抗DCIR mAb或IgG1对照+
（10μg/ml）和CD40L的存在下与幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，收获细胞并通过特异+
性四聚体分析MART-1特异性CD8T细胞的频率，并分析效应分子粒酶A(BD Pharmingen)、粒酶B(eBiosciences)和穿孔蛋白(Fitzgerald)的表达。
[0080] 融合蛋白mAb的克隆和生成：使用磺基琥珀酰亚胺基6-[3’(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SPDP;Pierce)根据制造商的方案将FluMP化学交联于mAb。将嵌合的小鼠/人重组mAb抗DCIR和对照IgG4与rAb H链框内融合至~9.5kDA锚定结构域。全部FluMP，其含有免疫显性的HLA-A201-限制的FluMP(58-66)肽(GILGFVFTL)(SEQ ID NO:1)，和编码来自黑色素瘤MART-1抗原的免疫显性HLA-A201-限制的MART-1(26-35)肽(ELAGIGILTV)(SEQ ID NO:2)的序列与周围天然的MART-1残基：DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP(SEQ ID NO:8)，各自被融合至~17.5kDa黏结蛋白结构域并在大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)或T7Express(NEB)中表达。通过混合rAb.Doc融合蛋白与2摩尔当量的黏结蛋白.抗原融合蛋白形成重组mAb(rAb)抗原结合物。锚定和黏结蛋白结构域自身结合形成稳定的[rAb.doc-coh.抗原]结合物（如在Flamar等人中描述的）。将嵌合的rAb抗DCIR或IgG4对照抗体融合至HIV gag p24
52
蛋白 或融合至重组形式的MART-1蛋白的一部分。所使用的抗DCIR-MART-1(克隆9E8)融合蛋白具有以下附于H链C-末端的肽单元[各单元侧翼为AS残基]：具有T672N取代的溶纤维素拟杆菌（Bacteroides cellulosolvens）多纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[gb|AAT79550.1|]残基651-677；MART-1|gb|BC014423.1|残基1-38；gb|AAT79550.1|残基1175-1199；MART-1残基78-118。对于mAb-FluMP结合物的细胞表面染色，使用EZ-连接NHS-SS-PEO4-生物素（Pierce）根据制造商的程序使coh.FluMP生物素化。在冰上用10μg/ml rAb.doc-coh.FluMP.生物素复合物对单核细胞衍生的DC染色20min。使用结合PE的链霉亲和 素(1:200;BD Biosciences)检测细胞表面结合并通过流式细胞术分析。 [0081] 对DC的肽MHC复合物检测：来自HLA-A201+供体的CD34+衍生的DC与50nM DCIR.doc-coh.FluMP结合物或游离coh.FluMP融合蛋白在补充10%人血清、50ng/ml GM-CSF和
10ng/ml TNF-α的培养基中培养。2h后加入5μg/ml抗CD40mAb(12E12,BIIR)。24h后使
53
用结合PE的四聚体化的M1D12单克隆抗体 通过流式细胞术评价细胞的FluMP(58-66)肽(GILGFVFTL)-HLA-A201复合物。
52
蛋白 或融合至重组形式的MART-1蛋白的一部分。所使用的抗DCIR-MART-1(克隆9E8)融合蛋白具有以下附于H链C-末端的肽单元[各单元侧翼为AS残基]：具有T672N取代的溶纤维素拟杆菌（Bacteroides cellulosolvens）多纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[gb|AAT79550.1|]残基651-677；MART-1|gb|BC014423.1|残基1-38；gb|AAT79550.1|残基1175-1199；MART-1残基78-118。对于mAb-FluMP结合物的细胞表面染色，使用EZ-连接NHS-SS-PEO4-生物素（Pierce）根据制造商的程序使coh.FluMP生物素化。在冰上用10μg/ml rAb.doc-coh.FluMP.生物素复合物对单核细胞衍生的DC染色20min。使用结合PE的链霉亲和 素(1:200;BD Biosciences)检测细胞表面结合并通过流式细胞术分析。 [0081] 对DC的肽MHC复合物检测：来自HLA-A201+供体的CD34+衍生的DC与50nM DCIR.doc-coh.FluMP结合物或游离coh.FluMP融合蛋白在补充10%人血清、50ng/ml GM-CSF和
10ng/ml TNF-α的培养基中培养。2h后加入5μg/ml抗CD40mAb(12E12,BIIR)。24h后使
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用结合PE的四聚体化的M1D12单克隆抗体 通过流式细胞术评价细胞的FluMP(58-66)肽(GILGFVFTL)-HLA-A201复合物。
[0082] CD8+T细胞的纯化：使用CD14、CD19、CD16、CD56和CD4磁性珠从PBMC中否定+ + +地选择CD8T细胞，或使用幼稚CD8T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)纯化CD8T细+ + + + +
胞。在一些实验中，幼稚CD8T细胞被分选作为CD8CCR7CD45RA 以及记忆CD8T细胞
+ - -
被分选作为CD8CCR7CD45RA。在指示处，用5μM羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE;Invitrogen)标记细胞。
胞。在一些实验中，幼稚CD8T细胞被分选作为CD8CCR7CD45RA 以及记忆CD8T细胞
+ - -
被分选作为CD8CCR7CD45RA。在指示处，用5μM羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE;Invitrogen)标记细胞。
[0083] 通过化学连接的抗DCIR mAb的FluMP蛋白的交叉呈递：来自HLA-A201+供体的+ +CD34 衍生的LC与纯化的CD8T细胞和增加浓度的抗DCIR-FluMP或包括IgG1-FluMP和游离FluMP蛋白的对照一起培养8天。当单独递送时，通过用FluMP(58-66)特异性HLA-A201+
四聚体染色评估，FluMP诱导非常有限的FluMP特异性CD8T细胞扩增（图2B）。IgG1-FluMP
54
比游离FluMP蛋白更加有效，表明Fc介导的摄取 。在图2C中示出的剂量滴定曲线显示抗DCIR-FluMP比对照IgG1-FluMP或游离FluMP用至少小于50倍的抗原引起响应，因此证明实际的抗原靶向。注意用抗DCIR-FluMP观察到的游离抗原从未诱导高频率的FluMP特+
异性CD8T细胞（图2C）。
四聚体染色评估，FluMP诱导非常有限的FluMP特异性CD8T细胞扩增（图2B）。IgG1-FluMP
54
比游离FluMP蛋白更加有效，表明Fc介导的摄取 。在图2C中示出的剂量滴定曲线显示抗DCIR-FluMP比对照IgG1-FluMP或游离FluMP用至少小于50倍的抗原引起响应，因此证明实际的抗原靶向。注意用抗DCIR-FluMP观察到的游离抗原从未诱导高频率的FluMP特+
异性CD8T细胞（图2C）。
[0084] 表1显示了CD80、CD86、CD40、ICOS-L、HLA-ABC和HLA-DR在CD1a+LC的表面上的+平均荧光表达，所述CD1aLC在存在或不存在CD40L的情况下用抗DCIR或同种型对照刺激+ +
24h。图2B显示了由CD1aLC扩增的HLA-A201-FluMP(58-66)肽四聚体-阳性CD8T细胞+
的比例，所述CD1aLC用交联的抗DCIR-FluMP、交联的对照IgG-FluMP蛋白或游离FluMP培+
养。图2C显示了FluMP特异性CD8T细胞应答下降浓度的交联的mAb-FluMP构建物或游离FluMP的百分比。图2D显示了用于该研究的小鼠的SDS-PAGE-还原凝胶和嵌合的抗DCIR mAb，以及蛋白抗原。图2E显示了抗DCIR.doc-coh.FluMP结合物mAb结合至单核细胞衍生+
的DC的表面。图8A显示了CD86在CD1aLCs(S3A)表面表达的流式细胞术分析以及通过 +
Luminex由皮肤分离的DC的IL-6分泌(LCs、真皮CD1aDCs和真皮CD14+DCs)（图8B），所述皮肤分离的DC在存在或不存在CD40L的情况下用抗DCIR或同种型对照刺激24h。数据显示抗DCIR抗体不改变培养的DC的表型，也不抑制CD40-或CL075-诱导的激活。图8C显示仅CD40连接而不是DCIR连接通过表皮皮肤细胞诱导总体的激活基因信号，所述表皮皮肤细胞暴露于可溶的、交联的或板涂覆形式的mAb。图9A显示抗DCIR抗体不改变由同种+
异体的CD1aLC引发的幼稚T细胞的增殖。图9B和9C显示抗DCIR抗体的添加不改变表型+ +
（PD-1、CTLA-4和CD28）和由同种异体的DC活化的幼稚CD8CD45RAT细胞的细胞因子分泌（IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-10）。图9D显示了用特异性四聚体通过流式细胞术分析并通过效应分子（粒酶A、粒酶B和穿孔蛋白）的水平分析的抗DCIR抗体不改变MART-1肽负载+
的DC敏化MART-1特异性效应子CD8T细胞的能力。
24h。图2B显示了由CD1aLC扩增的HLA-A201-FluMP(58-66)肽四聚体-阳性CD8T细胞+
的比例，所述CD1aLC用交联的抗DCIR-FluMP、交联的对照IgG-FluMP蛋白或游离FluMP培+
养。图2C显示了FluMP特异性CD8T细胞应答下降浓度的交联的mAb-FluMP构建物或游离FluMP的百分比。图2D显示了用于该研究的小鼠的SDS-PAGE-还原凝胶和嵌合的抗DCIR mAb，以及蛋白抗原。图2E显示了抗DCIR.doc-coh.FluMP结合物mAb结合至单核细胞衍生+
的DC的表面。图8A显示了CD86在CD1aLCs(S3A)表面表达的流式细胞术分析以及通过 +
Luminex由皮肤分离的DC的IL-6分泌(LCs、真皮CD1aDCs和真皮CD14+DCs)（图8B），所述皮肤分离的DC在存在或不存在CD40L的情况下用抗DCIR或同种型对照刺激24h。数据显示抗DCIR抗体不改变培养的DC的表型，也不抑制CD40-或CL075-诱导的激活。图8C显示仅CD40连接而不是DCIR连接通过表皮皮肤细胞诱导总体的激活基因信号，所述表皮皮肤细胞暴露于可溶的、交联的或板涂覆形式的mAb。图9A显示抗DCIR抗体不改变由同种+
异体的CD1aLC引发的幼稚T细胞的增殖。图9B和9C显示抗DCIR抗体的添加不改变表型+ +
（PD-1、CTLA-4和CD28）和由同种异体的DC活化的幼稚CD8CD45RAT细胞的细胞因子分泌（IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-10）。图9D显示了用特异性四聚体通过流式细胞术分析并通过效应分子（粒酶A、粒酶B和穿孔蛋白）的水平分析的抗DCIR抗体不改变MART-1肽负载+
的DC敏化MART-1特异性效应子CD8T细胞的能力。
[0085] 表1：CD80、CD86、CD40、ICOS-L、HLA-ABC和HLA-DR在CD1a+LC的表面上的平均荧+光表达，所述CD1aLC在存在或不存在CD40L的情况下用抗DCIR或同种型对照刺激24h。 [0086]
[0087] DCIR由单核细胞、B细胞和全部的DC亚群表达：贯穿该研究，使用两个单克隆抗DCIR克隆：9E8和24A5。通过表面等离子体共振分析评估证实为高亲和性的（分别为~850pM和~560pM）这些。贯穿本研究它们显示了可比较的PBMC染色（图1A）并产生了可比较的功能结果。
[0088] 如由HLA-DR表达所表明的，发现DCIR由全部的循环APC表达。这些APC包括CD14+单核细胞（CD14+CD16-和CD14+CD16+亚群）、LIN-HLA-DR+CD11c+血液髓系（blood myeloid）DC（mDC）、LIN-HLA-DR+CD11c-CD123+类浆细胞DC（pDC）和在CD19+B淋巴细胞上。在CD3+T细胞（图1A）或CD16+和CD56+NK细胞（未显示）上未检测到DCIR。DCIR在纯化的表皮LC、真皮CD14-CD1a+和真皮CD14+CD1a-DC上表达（图1B）。表皮片的免疫荧光分析进一步确认了DCIR在HLA-DR+LC上的原位表达（图1C）。DCIR在CD1a+LC和CD14+间质DC上表达，所述 CD14+间质DC在体外通过培养CD34+造血祖细胞（HPC）与GM-CSF、FLT3-L和TNF-α的组合9天37（图1D），以及在用GM-CSF和IL-4、或用GM-CSF和I型IFN培养的单核细胞衍生的DC上（未显示）产生。
[0089] 因此，本发明的结果证实了在单核细胞、B细胞、真皮DC、mDC和pDC33 34上DCIR表达的早期发现，并进一步显示了其在皮肤LC上的表达。
[0090] 通过抗DCIR结合物的FluMP蛋白的交叉呈递：使用化学偶联到抗DCIR抗体的FluMP蛋白进行的研究（图2A，构建物I）证明当连接至抗原时，DCIR允许免疫显性的HLA-A201限制的FluMP (58-66)肽的交叉呈递（图2B和2C）。这指引我们基于重组抗DCIR（或对照IgG4抗体）和FluMP构建融合蛋白，但这些不能有效地从转染的HEK293F细胞分泌。因此我们设计了基于在黏结蛋白（cohesin）和锚定蛋白(dockerin)之间的高亲和力相互作用(~30pM)的策略，所述黏结蛋白和锚定蛋白是来自热纤维梭菌（Clostridium thermocellum）(Flamar等人)的纤维体的两种蛋白。mAb.锚定融合蛋白（mAb.doc）（图2A构建物II和2D）由转染的哺乳动物细胞容易地分泌并在蛋白A亲和柱上纯化。对照hIgG4H和重组抗DCIR抗体各自携带S229P和L236E取代基，所述取代基稳定了二硫键并取消了残38
余的FcR相互作用 。FluMP在大肠杆菌中产生作为可溶的黏结蛋白（Cohesin）融合蛋白（coh.FluMP）（图2A构建物II和2D）。靶向结合物在被递送至DC之前通过培养等摩尔量的mAb.doc和coh.FluMP15分钟产生。重组抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb（实箭头）结合于人类单核细胞衍生的DC的表面，而对照结合物IgG4-FluMP（空箭头）不结合细胞（图
2E）。
余的FcR相互作用 。FluMP在大肠杆菌中产生作为可溶的黏结蛋白（Cohesin）融合蛋白（coh.FluMP）（图2A构建物II和2D）。靶向结合物在被递送至DC之前通过培养等摩尔量的mAb.doc和coh.FluMP15分钟产生。重组抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb（实箭头）结合于人类单核细胞衍生的DC的表面，而对照结合物IgG4-FluMP（空箭头）不结合细胞（图
2E）。
[0091] 为了确定重组抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb是否由DC加工和呈递，用50nM+结合物mAb培养来自HLA-A201 供体的DC 24h，并用检测结合于HLA-A201的FluMP(58-66)肽的单克隆抗体（M1D12）染色。暴露于抗DCIR-FluMP结合物mAb的DC在它们的表面（黑色直方图）显示HLA-A201-FluMP(58-66)肽复合物（图2F）。
[0092] 为了评价抗原至纯化的CD8+T细胞的呈递，以两种浓度(8nM和0.8nM)向+ +
CD34-HPC-衍生的LC提供重组结合物mAb。在8nM下，在诱导FluMP特异性CD8T细胞的扩增方面，抗DCIR.doc-coh.FluMP比IgG4.doc-coh.FluMP（10.5%四聚体阳性细胞vs.0.9%）更加有效（图2G，上图）。通过DCIR靶向的效力在更低的结合物mAb浓度（0.8nM）下被 证实，其中对照结合物mAb几乎不交叉呈递（2.8%vs.0.2%阳性细胞）（图2G，下图）。当将DC+
暴露于结合物mAb (8nM)仅18h并在用CD8T细胞(4.12±2.13%vs.0.05±0.02%四聚体
阳性细胞)培养之前清洗时，进一步示出了DCIR靶向抗原至DC的能力(FIG.2H)。
CD34-HPC-衍生的LC提供重组结合物mAb。在8nM下，在诱导FluMP特异性CD8T细胞的扩增方面，抗DCIR.doc-coh.FluMP比IgG4.doc-coh.FluMP（10.5%四聚体阳性细胞vs.0.9%）更加有效（图2G，上图）。通过DCIR靶向的效力在更低的结合物mAb浓度（0.8nM）下被 证实，其中对照结合物mAb几乎不交叉呈递（2.8%vs.0.2%阳性细胞）（图2G，下图）。当将DC+
暴露于结合物mAb (8nM)仅18h并在用CD8T细胞(4.12±2.13%vs.0.05±0.02%四聚体
阳性细胞)培养之前清洗时，进一步示出了DCIR靶向抗原至DC的能力(FIG.2H)。
[0093] 因此，通过DCIR靶向递送抗原到离体产生的DC允许蛋白至CD8+T细胞的有效交叉呈递。
[0094] 抗DCIR结合物允许通过皮肤朗格汉斯细胞血液mDC和血液pDC交叉呈递蛋白。由于这些融合蛋白打算被用作疫苗，我们评价了这些构建物是否会被从皮肤或血液分离的人3
类DC亚群交叉呈递。因此，将8nM的重组抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物加入5x10 分选的+ 5 +
表皮HLA-A201LC和1x10 纯化的血液CD8T细胞的培养物中10天（图3）。这导致了当与+
IgG4对照复合物mAb相比时(3.4%vs.0.7%)由DCIR靶向的LC的FluMP特异性CD8T细胞的扩增。针对凝集素的游离coh.FluMP(1%)或复合物如果发生的话，非常微弱地交叉呈递，所述凝集素不被LC，即DC-SIGN.doc-coh.FluMP(0.6%)（图3A）表达。针对朗格汉斯特异+
蛋白，即朗格汉斯细胞特异性凝集素的抗体抗原复合物诱导了由LC的FluMP特异性CD8T+
细胞的扩增(8.2%)。四聚体特异性CD8T细胞（图3A）的扩增与在培养物上清液中测量的IFN-γ的水平相关（图3B）。
类DC亚群交叉呈递。因此，将8nM的重组抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物加入5x10 分选的+ 5 +
表皮HLA-A201LC和1x10 纯化的血液CD8T细胞的培养物中10天（图3）。这导致了当与+
IgG4对照复合物mAb相比时(3.4%vs.0.7%)由DCIR靶向的LC的FluMP特异性CD8T细胞的扩增。针对凝集素的游离coh.FluMP(1%)或复合物如果发生的话，非常微弱地交叉呈递，所述凝集素不被LC，即DC-SIGN.doc-coh.FluMP(0.6%)（图3A）表达。针对朗格汉斯特异+
蛋白，即朗格汉斯细胞特异性凝集素的抗体抗原复合物诱导了由LC的FluMP特异性CD8T+
细胞的扩增(8.2%)。四聚体特异性CD8T细胞（图3A）的扩增与在培养物上清液中测量的IFN-γ的水平相关（图3B）。
[0095] 血液DC、CD11c+mDC和BDCA2+pDC的两种亚群都表达DCIR（图1A）。因此，测试从39 5
相同的细胞净化样品 纯化的mDC和pDC交叉呈递FluMP通过DCIR递送的能力。用1x10+
自体的CD8T细胞和减少浓度的游离coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP结合物或抗DCIR
3
coh.FluMP结合物培养5x10DC。
相同的细胞净化样品 纯化的mDC和pDC交叉呈递FluMP通过DCIR递送的能力。用1x10+
自体的CD8T细胞和减少浓度的游离coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP结合物或抗DCIR
3
coh.FluMP结合物培养5x10DC。
[0096] 抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb（图4A）有效地靶向FluMP至mDC，因为低至80pM的浓度产生1.8%四聚体阳性细胞。仅在8nM下Coh.FluMP自身和对照IgG4.doc-coh.+
FluMP结合物能够诱导抗原特异性CD8T细胞的扩增。
FluMP结合物能够诱导抗原特异性CD8T细胞的扩增。
[0097] 在浓度为8nM下，pDC也能够交叉呈递三种形式的重组FluMP。在0.8nM和80pM下，抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb允许FluMP抗原的交叉呈递，而不交叉呈递游离coh.FluMP或IgG4.doc-coh.FluMP结合物（图4B）。当与pDC对比时，用8nM的抗DCIR.doc-coh.+FluMP复合物mAb靶向的mDC能够诱导更强健的FluMP特异性CD8T细胞的扩增（如 用特+
异性FluMP特异性CD8T四聚体测量的）（图4C）（p=0.02）。
异性FluMP特异性CD8T四聚体测量的）（图4C）（p=0.02）。
[0098] 总之，这些数据表明抗DCIR mAb有效地靶向蛋白用于由皮肤朗格汉斯细胞、血液mDC和pDC的交叉呈递。
[0099] MART-1和HIV gag蛋白由抗DCIR结合物的交叉敏化：本发明人进一步测试了+DCIR是否会允许幼稚CD8T细胞的交叉敏化，该测试使用：i）融合至10聚体MART-1(26-35)HLA-A201限制的肽（EAAGIGILTV）的抗DCIR.锚定蛋白和黏结蛋白（图2A，III）（SEQ ID NO:9）；ii）直接融合至MART-1重组蛋白的抗DCIR（图2A，IV）或直接融合至HIV gagp24蛋白的抗DCIR（图2A，V）。用30nM抗DCIR.doc-coh.MART-1或IgG4.doc-coh.MART-1复+ +
合物mAb将表皮HLA-A201LC与自体的T细胞培养。10天后，MART-1(26-35)-HLA-A201 四+
聚体的结合表明抗DCI R.doc-coh.MART-1复合物mAb允许皮肤衍生的LC敏化CD8T细胞+
并扩增MART-1特异性CD8T细胞（图5A）。
合物mAb将表皮HLA-A201LC与自体的T细胞培养。10天后，MART-1(26-35)-HLA-A201 四+
聚体的结合表明抗DCI R.doc-coh.MART-1复合物mAb允许皮肤衍生的LC敏化CD8T细胞+
并扩增MART-1特异性CD8T细胞（图5A）。
[0100] 抗DCIR-MART-1融合蛋白的成功表达（图2A，IV）允许我们进一步评价向MART-1蛋白的其它表位的交叉敏化。因此，将DC暴露于抗DCIR-MART-1或IgG4-MART-1融合蛋白+或暴露于无抗原，用CD40L活化并用自体的纯化的幼稚CD8T细胞培养。10天后，用负载来自MART-1蛋白的单个肽簇的DC或用未负载的DC重新刺激细胞5h。测量CD107a，一种细胞毒活性测定的标记物至细胞表面的调动，以及胞质内的IFN-γ的表达以评价特异性CTL+
响应。抗DCIR-MART-1融合蛋白诱导MART-1特异性CD8T细胞至来自MART-1蛋白的簇1、簇4和簇5的肽的扩增（图5B）。用DCIR-MART-1融合蛋白靶向DC诱导表达高水平的效应+
分子粒酶B和穿孔蛋白的CD8T细胞的扩增（图5C）。
响应。抗DCIR-MART-1融合蛋白诱导MART-1特异性CD8T细胞至来自MART-1蛋白的簇1、簇4和簇5的肽的扩增（图5B）。用DCIR-MART-1融合蛋白靶向DC诱导表达高水平的效应+
分子粒酶B和穿孔蛋白的CD8T细胞的扩增（图5C）。
[0101] 抗DCIR-p24和IgG4-p24融合蛋白（图2A，V）也从HEK293F细胞很好的分泌。因+此，用CFSE标记来自健康个体的纯化的幼稚CD8T细胞并用DC和这些融合蛋白中的任一低 +
个，或无蛋白通过两个连续7天的培养敏化。分选增殖的CFSE CD8T细胞并用负载HIV gag +
p24(p24)蛋白的DC重新激发。响应于p24激发，用抗DCIR-p24融合蛋白敏化的CD8T细胞（黑色条）能够分泌IFN-γ，而对照融合蛋白没有（灰色条）（图5D）。这表明通过抗DCIR-p24+
融合蛋白的幼稚CD8T细胞的特异性敏化。
个，或无蛋白通过两个连续7天的培养敏化。分选增殖的CFSE CD8T细胞并用负载HIV gag +
p24(p24)蛋白的DC重新激发。响应于p24激发，用抗DCIR-p24融合蛋白敏化的CD8T细胞（黑色条）能够分泌IFN-γ，而对照融合蛋白没有（灰色条）（图5D）。这表明通过抗DCIR-p24+
融合蛋白的幼稚CD8T细胞的特异性敏化。
[0102] 本发明的研究结果证明通过DCIR靶向抗原允许敏化对自身和非自身抗原特异性+的CD8T细胞。
[0103] TLR7/8激动剂增强DCIR介导的交叉呈递：由于TLR引发活化了DC，我们分析了+TLR配体是否会增强由用抗DCIR复合物靶向的mDC诱导的抗原特异性CD8T细胞应答。用增加量的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb和TLR3(Poly I:C;5μg/ml)、TLR4(LPS;50ng/
5 + 3
ml)或TLR7/8(CL075;1μg/ml)的激动剂及1x10 自体的纯化的CD8T细胞培养5x10 纯化+
的血液HLA-A201mDC。在8-10天后使用HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体测量特异性FluMP +
CD8T细胞应答。在低浓度的靶向复合物(2nM和0.2nM)下TLR3激动剂(Poly I:C)增强FluMP特异性响应，而通过TLR4的激活则没有。发现TLR7/8激动剂(CL075)在扩增FluMP+
特异性CD8T细胞方面是最有效的（图6A）。对于全部测试浓度下的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物观察到了CL075增强的响应，并且所述CL075增强的响应依赖于mAb靶向复合物的存在（图6A和6B）。Poly I:C的浓度从5μg/ml增加至25μg/ml，或LPS的浓度从50ng/ml增加至200ng/ml没有显著增强响应于DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb的抗原特异性+
CD8T细胞的扩增。然而，TLR3激活比TLR4激活导致了更高的FluMP特异性响应（图6C）。
0.2μg/ml的低浓度的TLR7/8激动剂足够增强FluMP特异性响应（图6C）。当除了TLR激动剂外加入可溶的CD40L时没有看到显著的协同作用（未显示）。
5 + 3
ml)或TLR7/8(CL075;1μg/ml)的激动剂及1x10 自体的纯化的CD8T细胞培养5x10 纯化+
的血液HLA-A201mDC。在8-10天后使用HLA-A201-FluMP(58-66)四聚体测量特异性FluMP +
CD8T细胞应答。在低浓度的靶向复合物(2nM和0.2nM)下TLR3激动剂(Poly I:C)增强FluMP特异性响应，而通过TLR4的激活则没有。发现TLR7/8激动剂(CL075)在扩增FluMP+
特异性CD8T细胞方面是最有效的（图6A）。对于全部测试浓度下的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物观察到了CL075增强的响应，并且所述CL075增强的响应依赖于mAb靶向复合物的存在（图6A和6B）。Poly I:C的浓度从5μg/ml增加至25μg/ml，或LPS的浓度从50ng/ml增加至200ng/ml没有显著增强响应于DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb的抗原特异性+
CD8T细胞的扩增。然而，TLR3激活比TLR4激活导致了更高的FluMP特异性响应（图6C）。
0.2μg/ml的低浓度的TLR7/8激动剂足够增强FluMP特异性响应（图6C）。当除了TLR激动剂外加入可溶的CD40L时没有看到显著的协同作用（未显示）。
[0104] 对于测试的激活剂的每个检测浓度或组合，对抗DCIR.doc-coh.FluMP的FluMP特异性响应常常比由对照IgG4.doc-coh.FluMP（图6B和6C）或游离coh.FluMP（未显示）诱导的那些显著更高。因此，TLR7/8激活增强了由mDC的蛋白抗原的DCIR依赖性交叉呈递。 [0105] TLR7/8激动剂增强了DCIR介导的交叉敏化：本发明人进一步考查了TLR7/8配体+是否也会增强DCIR介导的初级CD8T细胞应答。用抗DCIR-MART-1或IgG4-MART-1融合+
蛋白培养血液HLA-A201mDC（图2A，构建物IV）。DC用CD40L、TLR3-L、TLR4-L或TLR7/8-L+
活化并与纯化的CFSE标记的幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，使用特异性四聚体评价低 +
MART-1(26-35)-HLA-A2限制的CFSE CD8T细胞的扩增（图7A）。TLR7/8活化的DC诱导了+
最高的MART-1特异性CD8T细胞的扩增(0.18%)（图7A）。在第二个实验中使用血液mDC和单一剂量的抗DCIR-MART-1或抗DCIR-p24融合蛋白（图2A，构建物IV和V）与TLR7/8+
激动剂而不是CD40L一起，诱导MART-1和结合CD8T细胞的HIV gagp24-HLA-A201四聚体的扩增（0.18%vs.0.01%和0.15%vs.0.01%）（图 7B）。然而与次级响应不同，通过CD40和TLR7/8两者共同发信号导致了协同效应和与CD40L或TLR7/8激动剂单独相比更大的结合+
四聚体的CD8T细胞的扩增(0.3%vs.0.37%vs.0.83%)（图7C和7D）。因此，TLR7/8激动剂+
增强抗原特异性CD8T细胞的交叉敏化和交叉呈递。
蛋白培养血液HLA-A201mDC（图2A，构建物IV）。DC用CD40L、TLR3-L、TLR4-L或TLR7/8-L+
活化并与纯化的CFSE标记的幼稚CD8T细胞共同培养。10天后，使用特异性四聚体评价低 +
MART-1(26-35)-HLA-A2限制的CFSE CD8T细胞的扩增（图7A）。TLR7/8活化的DC诱导了+
最高的MART-1特异性CD8T细胞的扩增(0.18%)（图7A）。在第二个实验中使用血液mDC和单一剂量的抗DCIR-MART-1或抗DCIR-p24融合蛋白（图2A，构建物IV和V）与TLR7/8+
激动剂而不是CD40L一起，诱导MART-1和结合CD8T细胞的HIV gagp24-HLA-A201四聚体的扩增（0.18%vs.0.01%和0.15%vs.0.01%）（图 7B）。然而与次级响应不同，通过CD40和TLR7/8两者共同发信号导致了协同效应和与CD40L或TLR7/8激动剂单独相比更大的结合+
四聚体的CD8T细胞的扩增(0.3%vs.0.37%vs.0.83%)（图7C和7D）。因此，TLR7/8激动剂+
增强抗原特异性CD8T细胞的交叉敏化和交叉呈递。
[0106] TLR7/8配体增加CTL效应分子并减少2型细胞因子的生成：设计下一组研究以确定在DCIR靶向期间的TLR7/8引发是否会改变所引起的响应的质量。因此，用未激活的自体+的HLA-A201mDC和抗DCIR-MART-1融合蛋白，或单独用CD40L或CL075，或用CD40L+CL075+
培养幼稚CD8T细胞。10天后，用HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体和粒酶B或穿孔蛋白特异性mAb对细胞染色。与每个激活剂单独相比，CD40L和TLR7/8激动剂的组合诱导更高的+
由扩增的CD8T细胞的效应分子粒酶B（图7C，左图）和穿孔蛋白（图7C，右图）的表达。 [0107] 响应于负载来自MART-1蛋白的肽的自体DC特异性再刺激，与CD40L-、Poly I:C-或LPS-条件的DC相比，由用抗DCIR-MART-1融合蛋白和TLR7/8激动剂靶向的DC敏+
化的CD8T细胞表达更高量的IFN-γ（图7E，上图）。第二模型抗原，HIV gag p24，使得我+
们进一步证实了TLR7/8配体对敏化的CD8T细胞的质量的效果。因此，响应于负载来自HIV gagp24蛋白的15种氨基酸重叠肽的自体DC的特异性再刺激，由抗DCIR-p24融合蛋白靶向+
的DC敏化并用TLR7/8激动剂活化的CD8T细胞与CD40L-、Poly I:C-或LPS-活化的DC相比表达更高量的IFN-γ（图7E，下图）。如所预期的，当抗原通过DCIR递送时，与通过对照IgG4mAb递送相比，胞质内IFN-γ的水平更高（图7E）。有趣的是，响应于负载MART-1肽的+
DC的再激活，根据它们是否最初暴露于CD40L-或CL075-引发的DC，DCIR敏化的CD8T细+
胞产生不同组的细胞因子（图7F）。当CD40L-成熟的IFN-αDC诱导幼稚CD8T细胞表达高+
量的2型细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）时，TLR7/8-暴露的DC培养幼稚CD8T细胞从而优先分泌具有显著减少量的IL-4、IL-5和IL-13的IFN-γ和TNF-α（图7F）。此外，与每种激活剂单独相比，如由细胞内染色所观察的，响应于衍生自MART-1蛋白的15种氨基酸重+
叠肽的再刺激，TLR7/8和CD40L的组合诱导IFN-γ和TNF-α-生产的CD8T细胞的最稳健的扩增（图7G）。因此，通过增强IFN-γ分泌和减少2型细胞因子分泌，TLR7/8-激活改变+
了由DCIR靶向的mDC的初级CD8T细胞应答的质量。
培养幼稚CD8T细胞。10天后，用HLA-A201-MART-1(26-35)四聚体和粒酶B或穿孔蛋白特异性mAb对细胞染色。与每个激活剂单独相比，CD40L和TLR7/8激动剂的组合诱导更高的+
由扩增的CD8T细胞的效应分子粒酶B（图7C，左图）和穿孔蛋白（图7C，右图）的表达。 [0107] 响应于负载来自MART-1蛋白的肽的自体DC特异性再刺激，与CD40L-、Poly I:C-或LPS-条件的DC相比，由用抗DCIR-MART-1融合蛋白和TLR7/8激动剂靶向的DC敏+
化的CD8T细胞表达更高量的IFN-γ（图7E，上图）。第二模型抗原，HIV gag p24，使得我+
们进一步证实了TLR7/8配体对敏化的CD8T细胞的质量的效果。因此，响应于负载来自HIV gagp24蛋白的15种氨基酸重叠肽的自体DC的特异性再刺激，由抗DCIR-p24融合蛋白靶向+
的DC敏化并用TLR7/8激动剂活化的CD8T细胞与CD40L-、Poly I:C-或LPS-活化的DC相比表达更高量的IFN-γ（图7E，下图）。如所预期的，当抗原通过DCIR递送时，与通过对照IgG4mAb递送相比，胞质内IFN-γ的水平更高（图7E）。有趣的是，响应于负载MART-1肽的+
DC的再激活，根据它们是否最初暴露于CD40L-或CL075-引发的DC，DCIR敏化的CD8T细+
胞产生不同组的细胞因子（图7F）。当CD40L-成熟的IFN-αDC诱导幼稚CD8T细胞表达高+
量的2型细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）时，TLR7/8-暴露的DC培养幼稚CD8T细胞从而优先分泌具有显著减少量的IL-4、IL-5和IL-13的IFN-γ和TNF-α（图7F）。此外，与每种激活剂单独相比，如由细胞内染色所观察的，响应于衍生自MART-1蛋白的15种氨基酸重+
叠肽的再刺激，TLR7/8和CD40L的组合诱导IFN-γ和TNF-α-生产的CD8T细胞的最稳健的扩增（图7G）。因此，通过增强IFN-γ分泌和减少2型细胞因子分泌，TLR7/8-激活改变+
了由DCIR靶向的mDC的初级CD8T细胞应答的质量。
[0108] 上文中提出的研究是在DCIR的连接，一种表达ITIM基序的表面凝集素将导致DC的减活化作用或阻止DC的活化作用的前提下开始的。如先前所述的，DCIR以高密度在血33 33
液单核细胞上表达并以低水平在B细胞上表达 。按照早先的免疫组织化学数据 ，DCIR+
也以高密度在纯化的真皮CD14DC上表达。然而，与这些数据不符，发现在它们纯化后DCIR在表皮朗格汉斯细胞上表达，以及也在完整的表皮片上表达。关于LC的两项研究的差异是+ 37
吸引人的，因为用通过培养CD34HPC与GM-CSF和TNF-α 在体外产生的LC也观察到DCIR
40 34
表达。我们，以及其他人，也发现DCIR以高密度在血液髓系DC 和血液类浆细胞DC 上表达。因此，DCIR被血液和皮肤DC的全部人类DC亚群表达。
液单核细胞上表达并以低水平在B细胞上表达 。按照早先的免疫组织化学数据 ，DCIR+
也以高密度在纯化的真皮CD14DC上表达。然而，与这些数据不符，发现在它们纯化后DCIR在表皮朗格汉斯细胞上表达，以及也在完整的表皮片上表达。关于LC的两项研究的差异是+ 37
吸引人的，因为用通过培养CD34HPC与GM-CSF和TNF-α 在体外产生的LC也观察到DCIR
40 34
表达。我们，以及其他人，也发现DCIR以高密度在血液髓系DC 和血液类浆细胞DC 上表达。因此，DCIR被血液和皮肤DC的全部人类DC亚群表达。
[0109] 如通过CD80、CD83和CD86的表达或细胞因子（例如IL-6、IL-12）的分泌所测量的，使DCIR与12种不同的抗DCIR抗体结合既不抑制也不增强DC激活。DCIR交联既不增强也+ +不抑制DC介导的CD4 和CD8T细胞的增殖。此外，如由微阵列分析所评价的，与CD40相反，DCIR的连接不显示通过分离的表皮细胞激活基因标记（数据未显示）。然而，DCIR的抑制作用的证据已被记录在dcir缺陷的小鼠，所述dcir缺陷的小鼠显示对胶原诱导的关节炎加+ 41
重的反应，伴随增加数量的活化的DC和活化的CD4T细胞 。然而应当注意的是小鼠和人类在DCIR基因复合物的水平上相当不同，因为小鼠基因组编码四个DCIR样分子：DCIR-2、DCIR-3、DCIR-4和DCAR-1，而人类基因组编码单一的一个。供选择的解释包括我们已经生成的mAb不能提供负信号，或我们的抗体与迄今未经确认的小鼠活化受体DCAR的人类相似物的交叉反应的可能性。另一个可能性可能是DCIR的抑制信号在除了DC的细胞，即单核
34
细胞或B细胞中递送36。在人类中，最近的研究 证明通过pDC的TLR9诱导的IFN-γ生
40
成的轻微抑制，而不影响共同刺激分子的表达，并且减少通过TLR8活化的mDC 的IL-12和
10 42
TNF-α的生成。最后，如对于其他凝集素例如BDCA-2 和DCAL-2 所证明的，依赖于细胞
43
环境，ITIM有时可以刺激而不是抑制细胞激活 。
重的反应，伴随增加数量的活化的DC和活化的CD4T细胞 。然而应当注意的是小鼠和人类在DCIR基因复合物的水平上相当不同，因为小鼠基因组编码四个DCIR样分子：DCIR-2、DCIR-3、DCIR-4和DCAR-1，而人类基因组编码单一的一个。供选择的解释包括我们已经生成的mAb不能提供负信号，或我们的抗体与迄今未经确认的小鼠活化受体DCAR的人类相似物的交叉反应的可能性。另一个可能性可能是DCIR的抑制信号在除了DC的细胞，即单核
34
细胞或B细胞中递送36。在人类中，最近的研究 证明通过pDC的TLR9诱导的IFN-γ生
40
成的轻微抑制，而不影响共同刺激分子的表达，并且减少通过TLR8活化的mDC 的IL-12和
10 42
TNF-α的生成。最后，如对于其他凝集素例如BDCA-2 和DCAL-2 所证明的，依赖于细胞
43
环境，ITIM有时可以刺激而不是抑制细胞激活 。
[0110] 发现通过受体DCIR递送的抗原被有效地交叉呈递至记忆T细胞。低至80pM浓度+的抗DCIR.doc-coh.FluMP复合物mAb足以诱导显著的FluMP特异性CD8T细胞的扩增。这
16
代表了固有抗原呈递能力的大约100倍的增强。这种效果已在早期用DEC-205 的融合蛋白的鼠科动物研究进 行报道。引人注目的发现是发现全部测试的DC亚群通过DCIR融合蛋+ 33,34
白靶向并诱导特异性的CD8T细胞应答。事实上，与先前的研究 不一致的是，抗DCIR能+
够有效地递送抗原至血液pDC以及表皮朗格汉斯细胞，并允许特异性CD8T细胞应答的发+ +
育。抗原通过DCIR递送不仅允许记忆FluMP特异性CD8T细胞的扩增，而且导致幼稚CD8T针对黑色素瘤分化抗原MART-1和HIV gag p24蛋白的敏化。此外，DCIR介导的响应是广泛的并且对于MART-1蛋白的多重表位是特异性的。最近发现对于DCIR2的单克隆抗体优+ + 28
先靶向小鼠的CD8-DCIR2 亚群，导致了优先诱导MHC II类限制的CD4T细胞 的再激活。
+ 34
同样地，显示抗DCIR靶向KLH至人类pDC因此允许KLH特异性CD4T细胞系 的增殖。本+
发明证明了DCIR也是建立并再活化抗原特异性CD8T细胞应答的强有力的手段。包括皮肤朗格汉斯细胞、血液mDC和pDC的全部DC对于通过DCIR递送的抗原的交叉呈递是有效的。所有的这些数据一起表明通过DCIR，如DEC-205的抗原递送可以导致诱导MHC I类和MHC II类两者限制的免疫响应。
16
代表了固有抗原呈递能力的大约100倍的增强。这种效果已在早期用DEC-205 的融合蛋白的鼠科动物研究进 行报道。引人注目的发现是发现全部测试的DC亚群通过DCIR融合蛋+ 33,34
白靶向并诱导特异性的CD8T细胞应答。事实上，与先前的研究 不一致的是，抗DCIR能+
够有效地递送抗原至血液pDC以及表皮朗格汉斯细胞，并允许特异性CD8T细胞应答的发+ +
育。抗原通过DCIR递送不仅允许记忆FluMP特异性CD8T细胞的扩增，而且导致幼稚CD8T针对黑色素瘤分化抗原MART-1和HIV gag p24蛋白的敏化。此外，DCIR介导的响应是广泛的并且对于MART-1蛋白的多重表位是特异性的。最近发现对于DCIR2的单克隆抗体优+ + 28
先靶向小鼠的CD8-DCIR2 亚群，导致了优先诱导MHC II类限制的CD4T细胞 的再激活。
+ 34
同样地，显示抗DCIR靶向KLH至人类pDC因此允许KLH特异性CD4T细胞系 的增殖。本+
发明证明了DCIR也是建立并再活化抗原特异性CD8T细胞应答的强有力的手段。包括皮肤朗格汉斯细胞、血液mDC和pDC的全部DC对于通过DCIR递送的抗原的交叉呈递是有效的。所有的这些数据一起表明通过DCIR，如DEC-205的抗原递送可以导致诱导MHC I类和MHC II类两者限制的免疫响应。
[0111] 由于未来的疫苗将可能由这些靶向的抗原与佐剂一起组成，我们也研究了微生物（TLR）刺激是否将改善DCIR介导的通过mDC的抗原交叉呈递。在全部这些测试的激活剂中，TLR7/8激动剂证明在该过程中最有效并在初级和次级应答中，特别是在初级应答的情+况下，当被与CD40信号一起递送时，诱导最高的抗原特异性效应物CD8T细胞的增殖。除了+
放大特异性CD8T细胞应答外，TLR7/8引发也通过促进IFN-γ和效应分子如粒酶A、粒酶+
B和穿孔蛋白的高表达来影响诱导的T细胞的质量。此外，当用CD40L敏化的CD8T细胞活化DCIR靶向的IFN-αDC以产生高量的2型（IL-4、IL-5和IL-13）细胞因子时，TLR7/8激动剂改变了向1型响应的平衡，这与提高的促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的生成有关，并显著减少了IL-4、IL-5和IL-13的水平。
放大特异性CD8T细胞应答外，TLR7/8引发也通过促进IFN-γ和效应分子如粒酶A、粒酶+
B和穿孔蛋白的高表达来影响诱导的T细胞的质量。此外，当用CD40L敏化的CD8T细胞活化DCIR靶向的IFN-αDC以产生高量的2型（IL-4、IL-5和IL-13）细胞因子时，TLR7/8激动剂改变了向1型响应的平衡，这与提高的促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的生成有关，并显著减少了IL-4、IL-5和IL-13的水平。
[0112] 我们的发现是根据先前的将增强的基于蛋白的疫苗诱导的T细胞应答归因于44,45
TLR7/8引发 的观察结果。在非人类灵长类模型SIV中，与TLR7/8配体一起递送的蛋+
白抗原促进Th1应答的诱导，以及多功能CD8T细胞增强的和持久的扩增。这些同时产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞，相对于HIV进展者在HIV非进展者中是充足的，并与长期保护有关。因此，将TLR7/8激动剂与基于靶向蛋白的疫苗结合将对于治疗慢性疾病是 有+
利的，在所述慢性疾病中CD8T细胞介导效应子功能。
TLR7/8引发 的观察结果。在非人类灵长类模型SIV中，与TLR7/8配体一起递送的蛋+
白抗原促进Th1应答的诱导，以及多功能CD8T细胞增强的和持久的扩增。这些同时产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞，相对于HIV进展者在HIV非进展者中是充足的，并与长期保护有关。因此，将TLR7/8激动剂与基于靶向蛋白的疫苗结合将对于治疗慢性疾病是 有+
利的，在所述慢性疾病中CD8T细胞介导效应子功能。
[0113] 在本发明的环境下，不能排除我们使用的TLR激动剂也对CD8+T细胞具有直接的+效果。如一些研究先前所证实的，对CD4T细胞的直接TLR引发可以诱导共同刺激分子的上
46，47 44
调并调节它们的增殖 。然而，已证明当抗原融合至佐剂中而不是单独递送 时，诱导最+ 48
有效的多功能CD8T细胞应答，该发现可能解释在用NY-ESO和局部TLR7激动剂 接种的+
黑色素瘤患者中CD8T细胞应答的缺乏。因此，我们拥有的数据支持结合TLR激动剂至靶向抗原疫苗例如DCIR的方法，作为直接递送抗原和佐剂至DC的最有效的方法。然而需要更多的研究正式对哪种激活剂或激活剂的组合以及哪种疫苗制剂将在体内产生最有效的、+
长期持久的CD8T细胞应答做出结论。
46，47 44
调并调节它们的增殖 。然而，已证明当抗原融合至佐剂中而不是单独递送 时，诱导最+ 48
有效的多功能CD8T细胞应答，该发现可能解释在用NY-ESO和局部TLR7激动剂 接种的+
黑色素瘤患者中CD8T细胞应答的缺乏。因此，我们拥有的数据支持结合TLR激动剂至靶向抗原疫苗例如DCIR的方法，作为直接递送抗原和佐剂至DC的最有效的方法。然而需要更多的研究正式对哪种激活剂或激活剂的组合以及哪种疫苗制剂将在体内产生最有效的、+
长期持久的CD8T细胞应答做出结论。
[0114] 总之，通过DCIR将临床相关抗原靶向至各种DC亚群将允许诱导强细胞毒性的+CD8T细胞应答，这对于预防和治疗慢性疾病是必要的。
[0116] 应当理解的是本文描述的特定实施方案以解释说明的方式提供，而非作为本发明的限制。可以在不同的实施方案中采用本发明的主要特征，而不背离本发明的范围。本领域技术人员应认识到，或者能够确定使用不超过常规的试验，本文描述的具体过程的多个等价物。该等价物被认为在本发明的范围内，并由权利要求所覆盖。
[0117] 在本说明书中所提到的全部出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。全部的出版物及专利申请通过引用并入本文，其引用的程度相当于明确地及单独地指出各个单独的出版物或者专利申请被通过引用并入。
[0118] 词语“一个（a）”或者”一个（an）”的使用当与术语“包括”在权利要求和/或说明书中一起使用时，其可能表示“一”，然而其也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或者多于一个”的意思一致。虽然披露支持指仅可选方案以及“和/或”的定义，术语“或者”在权利要求中的使用用于表示“和/或”，除非明确地指出其仅指可供选择的或者可选的方案是互相排斥的。在本申请中，术语“约”用于表示数值包括对于所采用以测定该数值的设备、方法误差的固有的变化，或者在研究的受试者中存在的 变化。
[0119] 如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含（comprising）”（及包含的任意形式如“包含（comprise）”和“包含（comprises）”），“具有（having）”（及具有的任意形式，如“具有（have）”和“具有（has）”），包括（including）（及包括的任意形式如“包括（includes）”和“包括（include）”）或者“含有（containing）”（及含有的任意形式如“含有（contains）”和“含有（contain）”）为包括的或者开放式的，并不排除额外的，未列出的要素或者方法步骤。
[0120] 在此使用的术语“或其组合”指在该术语前所列出的项目的全部排列组合。例如，“A、B、C或其组合”意图包括A、B、C、AB、AC、BC或者ABC的至少一种，以及如果顺序在特定环境下重要的话，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或者CAB。继续此例子，含有一个或者多个项目或者术语的重复的组合也特别地包括在内，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员理解典型地对于以任意组合的项目或者术语，没有数目的限制，除非上下文中明显表示的。
[0121] 在此公开并讨论的全部的组合物和/或方法可以依照本发明在不过度的实验下制备和执行。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施方案的形式进行了描述，对于本领域技术人员显而易见的是，可以对在此描述的组合物和/或方法进行变化，以及在所述方法的步骤或者步骤的顺序进行变化，而同时不悖离本发明的原理，精神以及范围。认为所有这些对于本领域技术人员而言显而易见的类似替代和修改是在本发明由所附权利要求所限定的精神、范围及原理之内的。
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