技术领域
[0001] 本
发明涉及冬虫草的培育工艺，具体而言，本发明涉及到利用天然或人工饲养鳞翅目活体虫蛹作为冬虫夏草
真菌孢子代寄主培育冬虫夏草的工艺，属于人工用冬虫夏草真菌感染活体虫蛹进行培育冬虫夏草的
生物工程技术领域。
背景技术
[0002] 冬虫夏草是一种传统的名贵滋补中药材，属于真菌
门，子囊菌纲，肉座菌目，麦
角菌科，虫草属。药理学现代研究结果中，冬虫夏草含有虫
草酸约7%，
碳水化合物28.9%，脂肪约8.4%，
蛋白质约25%，脂肪中82.2%为不饱和
脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、生物
碱等，有调节免疫系统功能、抗
肿瘤、抗疲劳等多种功效。
[0003] 冬虫夏草在过去多为野生，随着现代社会对冬虫夏草需求的增多，野生冬虫夏草已远远不能满足人们的需要，人工培育冬虫夏草技术孕育而生。
[0004] 目前，国内外人工培育冬虫夏草的技术多为以下几种：
[0005] 一、采用生物
发酵工程培育冬虫夏草菌丝体：
[0006] 1.用深层发酵工程培育冬虫夏草菌丝体；
[0007] 2.用固体发酵工程培育冬虫夏草菌丝体。
[0008] 二、采用
农作物果实与生化
试剂及其他农副产品组成的合成培养基培育冬虫草子实体。
[0009] 三、采用干燥蛹体培育冬虫草子实体。
[0010] 四、采用活体桑蛹、活体柞蛹培育虫草
复合体。该技术接种时采用的接种方法为内置式注射菌种，即将将液体菌种注射在活体虫蛹体内，需要在活体虫蛹头部扎孔，技术含量高，一般技术人员很难接种成功。而且活体虫蛹头部被扎孔受伤后会在一天内死去并腐烂变质，所以接种后需要将
温度控制在18℃以下培养，操作难度很大。采用内置式接种方式其接种效率低，一人一天（8小时）只能接种480—500个活体虫蛹。综上所述，利用该技术培育活体桑蛹、柞蛹虫草可操作性不强，无法实施规模化生产。
发明内容
[0011] 本发明的目的是提供一种培育活体蛹化冬虫草的工艺来解决
现有技术问题，具体而言，是提供一整套利用天然活体鳞翅目虫蛹或人工饲养的活体鳞翅目虫蛹实施规模化生产蛹化冬虫草的技术。
[0012] 本发明解决问题采用的技术方案是：
[0013] 培育活体蛹化冬虫草的工艺，包括以下步骤
[0014] 一、培育活体蛹化冬虫草菌种
[0015] （1）培养活体蛹化冬虫草母本菌种
[0016] a采集野生冬虫草菌株，利用有性克隆技术获得冬虫草母本孢子；
[0017] b挑取单孢繁殖复壮母本原生菌种，经过变温培养、驯化、提纯，最终获得母本菌种，恒温储存备用；
[0018] （3）培养用于感染活体蛹化冬虫草的再生母种
[0019] 将母本菌种接种至琼脂培养基上，18℃-20℃恒温暗光培养8-10天，菌丝布满表面呈金黄色即成再生母种。
[0020] （4）培养用于感染活体虫蛹的蛹化冬虫草液体菌种
[0021] 将再生母种接于液体菌种培养液中，18℃-20℃范围内静止培养72小时，通
氧浮动培养48小时，当圆球状微粒菌球充满液体培养基停止通氧，经检验、分析、提纯后即可储存备用。
[0022] 二、准备寄主虫蛹
[0023] 选择健壮、丰满的鳞翅目活体虫蛹作为蛹化冬虫草虫草菌的寄主虫蛹；并对寄主虫蛹进行消毒处理，处理方法为（1）紫外线或臭氧灭菌30分钟，（2）75%酒精灭菌2-3分钟；
[0024] 三、虫蛹接种
[0025] 在无菌环境中一次性喷雾接种，即将液体菌种喷洒至活体虫蛹体表，使每个虫蛹体表均沾上数个虫草菌菌球即可。
[0026] 四、活体蛹化冬虫草培养
[0027] （1）染菌期培养，在暗光下，温度保持在18℃-19℃，湿度保持在50%-55%，早晚各通
风10-15分钟，活体虫蛹在28-32天生命体征消失，45-55天体内被虫草菌完全侵染，活体虫蛹形成僵硬的菌核，染菌期结束。
[0028] (2)转色期培养，在200勒克斯光线下每天照射10-12小时，温度保持在18℃-20℃，湿度保持在55%-60%，早晚各
通风15-20分钟，培养8-12天，虫蛹体表呈金黄色，头部或间节部位出现米粒状物，转色期培养阶段结束；
[0029] (3)出座期培养，分为前期、中期和后期培养三个阶段；
[0030] 前期培养阶段，在自然散射光线照射下，温度保持18℃-19℃湿度保持55%-60%，早晚各通风20-25分钟培养8-12天，子座长到1.8-2.2cm，前期培养束；
[0031] 中期培养阶段，在自然散射光线照射下，温度保持在18℃-19℃，湿度保持在60%-70%，早晚各通风25-30分钟，培养8-12天，子座长到3.8-4.2cm，中期培养管理阶段结束。
[0032] 后期培养阶段，在自然散射光线照射下，温度保持18℃-19℃，湿度保持80%-85%，早晚各通风35-40分钟，培养8-12天，子座长到4.8-5.2cm，顶端膨大呈椭圆形，外表出现粉末状物，色泽金黄，后期培养管理阶段结束；将成熟后的子座收集保存。
[0033] 琼脂培养基中各组分的重量体积比为：
葡萄糖：蛋白胨：
硫酸镁：
磷酸二氢
钾：孟加拉红：
链霉素：琼脂：蒸馏水=10：5：0.5：1：3.3：30：20：1000。
[0034] 液体菌种培养液中各组分的重量体积比为：葡萄糖：蛋白胨：玉米粉：
酵母粉：磷酸二氢钾：
硫酸镁：维生素B1：水=20：10：20：5：10：0.5：0.1：1000。
[0035] 液体菌种培养基中各组分的重量体积比为：去皮土豆200、
蔗糖20、磷酸二氢钾3、硫酸镁1.5、维生素B10.1、
土壤浸出液100、水900，PH值自然。
[0036] 所述土壤浸出液的PH值为7-8。其中土壤浸出液制备时采用的土壤为天然土壤，即无污染、如
农药残留，满足上述条件的土壤浸出液均可用于本发明中液体菌种的培养。
[0037] 虫蛹接种过程中接种比例为100g活体虫蛹接种5ml液体菌种。接种前，液体菌种需要用蒸馏水进行稀释。
[0038] 所述寄主虫蛹为天然鳞翅目活体虫蛹或人工饲养的鳞翅目活体虫蛹。
[0039] 本发明的有益效果：本发明技术采用直接在活体虫蛹上喷洒液体菌种的方式进行接种，其可操作性强，效率高。同时，因接种时没有对活体虫蛹产生伤害，所以虫蛹的成活率高，且接种后培养温度可以控制在18℃以上，操作难度大大降低。用本发明技术培育的蛹化冬虫草，其各种有效成分的含量均与天然冬虫夏草相当，是天然冬虫夏草最佳的替代产品，完全可以替代天然冬虫夏草，生产加工各种虫草类药品和保健产品。
具体实施方式
[0041] 培育活体蛹化冬虫草的工艺，包括以下步骤
[0042] 一、培育活体蛹化冬虫草菌种
[0043] （1）培养活体蛹化冬虫草母本菌种
[0044] a采集野生冬虫草菌株，利用有性克隆技术获得冬虫草母本孢子。
[0045] b挑取单孢繁殖复壮母本原生菌种，经过变温培养、驯化、提纯，最终获得活体蛹化冬虫草母本菌种，恒温储存备用。该母本菌种培养过程采用现有技术进行培养。
[0046]
申请人于2000年7月份、9月份先后前往青海榆树、吉林长白山采集了野生冬虫夏草菌株和北冬虫夏草菌株，经检验，确定这两种菌株均属于子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科拟青霉虫菌株，取其孢子交叉培养，反复驯化，最终制成母本菌种传宗接代至今。
[0047] 其中母本菌种的琼脂培养基配方：
[0048] 蔗糖30g、蛋白胨10g、酵母膏1.5g、磷酸二氢钾1.2g、硫酸镁0.5g、
氯化钾0.5g、
硝酸钾0.4g、蛋黄粉0.5g、蛋清粉0.5g、琼脂20g、水1000ml，PH值自然。
[0049] 将水、蛋清粉、蛋黄粉煮汁，取其汁液同蔗糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、硝酸钾、琼脂、同煮溶解，趁热装管→封口→灭菌→摆斜面→冷却→
凝固，得到琼脂培养基。
[0050] 母本菌种的培养方法：在上述琼脂培养基上接种，置18℃-20℃恒温暗光培养8-10天，当菌丝布满琼脂培养基表面呈金黄色即成母本菌种。母本菌种的接种方式与现有技术相同。
[0051] （2）培养用于感染活体蛹化冬虫草的再生母种
[0052] 再生母种的琼脂培养基配方：
[0053] 葡萄糖10g、蛋白胨5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、孟加拉红3.3g、链霉素30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。琼脂培养基的制备方法与现有技术相同。
[0054] 再生母种培养方法：
[0055] 常规方法制备再生母种，是用接种铲、接种钩从母本种试管中取出带菌丝的琼脂培养基（大约1立方毫米）置于待接试管琼脂培养基表面，置18℃—20℃恒温暗光环境中培养8—10天，菌丝布满培养基表面即成再生母种。而本发明实施例中采用非常规方法进行培养，是用接种针从母本菌种试管中挑取琼脂培养基上面的菌丝，然后将接种针插入待接平面琼脂培养基中间约1毫米深处，轻轻划线，取出接种针，封膜培养，18℃—20℃恒温暗光培养8—10天，菌丝布满表面呈金黄色即成再生母种。实验证明，用这种方法制备的再生母种，菌丝活
力强，接于活体虫蛹体表后，发菌迅速，转色快，子座生长旺盛。
[0056] （3）培养液体菌种
[0057] 液体菌种培养液配方：
[0058] 葡萄糖20g、蛋白胨10g、玉米粉20g、酵母粉5g、磷酸二氢钾10g、硫酸镁0.5g、维生素B10.1g（为方便配制，实际配制时可以采用含有等量维生素B1的维生素B1片即可）、水1000ml。液体菌种培养液的制备方法与现有技术相同。液体菌种培养方法：
[0059] 在无菌条件下将母种接入1000ml广口烧瓶（每瓶培养液装量为700ml）中，在20℃环境中静止培养72小时，通氧浮动培养48小时，当圆球状微粒菌球充满液体，培养液停止通氧，经检验、分析、提纯后即可储存备用。
[0060] 二、准备寄主虫蛹
[0061] 选择健壮、丰满的鳞翅目活体虫蛹作为蛹化冬虫草虫草菌的寄主虫蛹；并对寄主虫蛹进行消毒处理，本实施中采用臭氧灭菌30分钟的消毒方法，实际上还可以采用紫外线灭菌30分钟或75%酒精灭菌2-3分钟的方法进行消毒。所述鳞翅目活体虫蛹为天然鳞翅目活体虫蛹或人工饲养的鳞翅目活体虫蛹。
[0062] 三、虫蛹接种
[0063] 在无菌环境中一次性喷雾接种，即在无菌环境中将液体菌种喷洒在经消毒后的活体虫蛹上进行接种。接种比例为，100g活体虫蛹接种5ml液体菌种。接种前，液体菌种需要稀释，5ml液体菌种加100ml无菌水混合均匀后，均匀喷洒到100g活体虫蛹上。实际上，也可以将活体虫蛹直接放置在稀释后的液体菌种内再捞出，使活体虫蛹沾上液体菌种即可。
[0064] 其中，在接种时，要注意以下细节，（1）接种环境绝对无霉菌；（2）接种工具绝对无霉菌；（3）接种人员绝对不带霉菌；（4）喷洒器具出雾水圆孔直径大于液体菌种菌球直径。
[0065] 因接种时没有对活体虫蛹产生伤害，所以虫蛹的成活率高，且接种后培养温度可以控制在18℃以上，操作难度大大降低。最重要的是，该方法对操作工人的技术要求不高，方便操作，且接种效率大大提高，可以实现冬虫夏草的规模化生产，满足市场对冬虫夏草的需求。
[0066] 四、活体蛹化冬虫草培养
[0067] （1）染菌期培养，在暗光下，温度保持在18℃-19℃，湿度保持在50%，早晚各通风10分钟，活体虫蛹在28天生命体征消失，50天体内被虫草菌完全侵染，活体虫蛹形成僵硬的菌核，染菌期结束。
[0068] (2)转色期培养，在200勒克斯光线下每天照射10小时，温度保持在20℃，湿度保持在60%，早晚各通风20分钟，培养10天，虫蛹体表呈金黄色，头部或间节部位出现米粒状物，转色期培养阶段结束；
[0069] (3)出座期培养，分为前期、中期和后期培养三个阶段；
[0070] 前期培养阶段，在自然散射光线照射下，温度保持18℃-19℃湿度保持60%，早晚各通风25分钟培养9天，子座长到2cm，前期培养束；
[0071] 中期培养阶段，在自然散射光线照射下，温度保持在18℃-19℃，湿度保持在70%，早晚各通风30分钟，培养10天，子座长到3.8cm，中期培养管理阶段结束。
[0072] 后期培养阶段，在自然散射光线照射下，温度保持18℃-19℃，湿度保持80%，早晚各通风3分钟，培养12天，子座长到5cm，顶端膨大呈椭圆形，外表出现粉末状物，色泽金黄，后期培养管理阶段结束，将成熟后的子座收集保存。整个生长周期的培养时间为91天，一般情况下，完成活体蛹化冬虫草一个生长周期的培养时间为90-100天之间。
[0073] 在实施活体蛹化冬虫草栽培实验中，申请人每次都提前两天选择10组生命体征旺盛、体态丰满健壮的鳞翅目虫蛹，每组100个，共1000个，接种30天左右，1000个虫蛹生命体征全部消失，50天左右虫蛹体内被虫草菌完全侵染，再经过40天培养，最后共有970个出座并成熟，成功率为97%。
[0074] 实施例2
[0075] 本实施例中母本菌种、再生母种、液体菌种的培养方法及过程与实施例1中相同，但液体菌种培养液的配方与实施例1中不同，具体的培养液配方为去皮土豆200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B10.1g、土壤浸出液100ml、水900ml，PH值自然。
其中土壤浸出液通过现有技术制备得到，土壤浸出液的PH值范围控制在7-8，制备时采用的土壤为天然土壤，即无污染、如农药残留，满足上述条件的土壤浸出液均可用于本发明中液体菌种的培养。菌种培养液的制备方法与现有技术相同，其中土豆去皮切片，置2500ml水中煮，待水
蒸发至1000ml以下，过滤土豆液倒入1000ml烧杯中，再将配方中的蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等放入土豆、土壤
混合液中加热，至蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1完全溶解即可
装瓶、冷却、接种。准备虫蛹过程、虫蛹接种过程、及虫草培养过程与实施例1中相同，仅步骤四中虫草培养过程中光照、温度、湿度、通风时间、培养时间与实施例1中有所差别，具体差别如下所示：
[0076] 染菌期培养，暗光，温度18-19℃，湿度50%，早晚各通风10分钟，30天时生命体征消失，培养48天。
[0077] 转色期培养，200lux照射12h，温度20℃，湿度55%，早晚各通风10分钟，培养12天。
[0078] 出座前期培养，自然光，温度18℃，湿度55%，早晚各通风20分钟，培养12天，子座长到2cm。
[0079] 出座中期培养，自然光，温度18℃，湿度60%，早晚各通风25分钟，培养10天，子座长到4cm。
[0080] 出座后期培养，自然光，温度19℃，湿度80%，早晚各通风40分钟，培养12天，子座长到5cm，培养过程结束。整个生长周期的培养时间为94天，成功率95%。
[0081] 实施例3-6
[0082] 仅步骤四中虫草培养过程中光照、温度、湿度、通风时间、培养时间与实施例1中有所差别，其余培养条件与实施1中相同。
[0083]
[0084]
[0085] 利用本发明技术培育出的活体蛹化冬虫草，其菌核坚硬饱满，子座色泽金黄，与天然虫草基本相同。经多年临床实验证明，对
高血压、心脏病、消化系统及神经系统等多种疾
