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新型杀昆虫蛋白及其使用方法

阅读:755发布:2020-09-18

专利汇可以提供新型杀昆虫蛋白及其使用方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于防治 害虫 的组合物和方法。所述方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列转化 生物 体。具体地讲,所述核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的 植物 和 微生物 。因此,本发明提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和 种子 。组合物是细菌物种的杀昆虫核酸和蛋白。所述序列可用于构建表达载体以用于后续转化到所关注的生物体中,用作分离其他同源(或部分同源)基因的探针。所述杀昆虫蛋白可用于防治、抑制生长或杀灭鳞翅目(lepidopteran)、鞘翅目(coleopteran)、 双翅目 (dipteran)、 真菌 、半翅目(hemipteran)和 线虫 害虫群体,以及用于产生具有杀昆虫活性的组合物。,下面是新型杀昆虫蛋白及其使用方法专利的具体信息内容。

1.一种编码PIP-1多肽的分离的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽是口服活性的。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽具有对于半翅目
(Hemiptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
4.根据权利要求1、2或3所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽具有对于蝽科
(Pentatomidae)昆虫害虫的杀昆虫活性。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽具有对于鳞
翅目(Lepidoptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的分离的核酸分子,其中所述核酸分子来自绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株。
7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的分离的核酸分子,其中所述绿针假单胞菌
(Pseudomonas chlororaphis)菌株包含与SEQ ID NO:216具有至少约96.9%同一性的16S核糖体DNA。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的分离的核酸分子,其中所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株是以登录号NRRLB-50613保藏的SS44C4。
9.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的基酸基序。
10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽还包含如由SEQ ID NO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第64-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
11.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含与SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
12.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽还包含如由SEQ ID NO:213的第64-79位、SEQ ID NO:213的第149-159位以及SEQ ID NO:213的第171-183位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
13.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第8位
处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu
或Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位
处的Xaa是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;
第27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是
Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第
42位处的Xaa是Phe或Tyr;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly
或Asp;第49位处的Xaa是Phe或Tyr;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位处的Xaa
是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第77位处
的Xaa是Phe或Tyr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第
105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln
或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处
的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第
127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa
是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第
142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、
Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160
位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp
或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的
Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第174位处的Xaa是Ile、Val或
Met;第175位处的Xaa是Val或Ile;第180位处的Xaa是Met或Leu;第191位处的Xaa
是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第200位处的Xaa是Asn或Ser;第203位
处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位处的Xaa是Gly或Asp;
第209位处的Xaa是Leu或Val;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser
或Lys;第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位
处的Xaa是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;
第232位处的Xaa是Ala、Thr或Glu;以及第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位
处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第265位处的Xaa是Asn或Asp;
以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28个氨
基酸。
14.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第3位
处的Xaa是Ile或Thr;第6位处的Xaa是Glu或Gly;第8位处的Xaa是Ser、Gly或Asn;
第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;第21位处的Xaa是
Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa是Gln或Ala;第25
位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处的Xaa是Leu、Thr或
Ala;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;第36位处的
Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第42位处的Xaa是Phe或Tyr;
第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly或Asp;第49
位处的Xaa是Phe、Tyr或Leu;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位处的Xaa是Tyr或
Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第66位处的Xaa是
Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa
是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位
处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或
Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位
处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或
Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa
是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第
151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是
Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166
位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys
或Ala;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第
173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;
第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu、Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn或Tyr;第200位处的Xaa
是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位
处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;
第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;第222位处的Xaa是Thr
或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa是Ser或Gly;第229位
处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位处的Xaa是Ala、Thr或
Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;
第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第259位处的
Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28个氨基
酸。
15.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含(SEQ ID NO:213)的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro、Thr或Ser;
第3位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser;第6位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala;
第8位处的Xaa是Ser、Gly、Asn、Thr或Gln;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第21位处的Xaa是Lys、Ser、Asn、Arg、Thr或Gln;第22位处的Xaa是Ser、Lys、Arg或Thr;第24位处的Xaa是Gln、Gly、Asn或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第27位处的Xaa是Leu、Thr、Ala、Ser、Ile、Val或Met;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala、Ile、Leu、Val或Met;第35位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Val或Met;第36位处的Xaa是Ala、Ser、Thr、Val、Ile或Leu;第38位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第42位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第49位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第53位处的Xaa是Ser、Gly、Ala或Thr;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr;第63位处的Xaa是Gln、Lys、Asn或Arg;第66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met、Val、Leu或Ile;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;
第107位处的Xaa是Thr、Ile、Ser、Leu或Val;第108位处的Xaa是Gln、Thr、Ser或Asn;
第110位处的Xaa是Arg、Leu、Lys、Ile、Val或Met;第120位处的Xaa是Lys、Arg、Gln或Asn;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr、Glu、Ser或Asp;第125位
处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Lys、Ser或Arg;
第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Arg或Lys;第
137位处的Xaa是Asp、Gly、Glu或Ala;第141位处的Xaa是Val、Ile或Leu;第142位处
的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、
Thr、Val、Leu、Met或Ser;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;
第163位处的Xaa是Asn、Asp、Glu或Gln;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的
Xaa是Gln、Glu、Asp或Asn;第167位处的Xaa是Leu、Met、Ile、Val;第168位处的Xaa是Thr、Lys、Ala、Ser、Arg或Gly;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第
179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu;Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第
183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn、Tyr、
Gln或Trp;第200位处的Xaa是Asn、Ser、Thr或Gln;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第
204位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly;第206位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第209位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是
Asn、Arg、Gln或Lys;第221位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg;第222位处的Xaa是Thr、Arg、Ser或Lys;第226位处的Xaa是Asp、Pro、Glu或Gln;第228位处的Xaa是Ser或
Gly;第229位处的Xaa是Lys、Asn、Arg或Gln;第231位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met;
第232位处的Xaa是Ala、Thr、Ser、Gly、Asp或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、GlV、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu;第254位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第258位处的Xaa是Ser、Arg、Thr或Lys;第259位处的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu;以及第266位处的Xaa是Asp、Asn、Gln或Glu;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28
个氨基酸。
16.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的多核苷酸、或其片段或互补序列。
17.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段。
18.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子在严格条件下杂交至SEQ ID NO:1的多核苷酸。
19.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的多核苷酸。
20.一种植物或其子代,包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18或19所述的分离的核酸分子。
21.一种用根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19所述的分离的核酸分子稳定转化的植物或其子代。
22.根据权利要求20或21所述的植物,其中所述植物是单子叶植物。
23.根据权利要求20或21所述的植物,其中所述植物是双子叶植物。
24.根据权利要求20或21所述的植物,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草植物细胞。
25.根据权利要求20、21、22、23或24所述的植物,还具有一种或多种另外的转基因性状。
26.根据权利要求25所述的植物,其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗
性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性或胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量以及耐旱性。
27.一种表达盒,包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18或19所述的分离的核酸分子,其中所述核酸有效连接至引导所述PIP-1多肽的表达的一个或多个异源调控序列
28.一种植物,包含根据权利要求27所述的表达盒。
29.一种植物细胞,包含根据权利要求27所述的表达盒。
30.一种重组生物细胞,包含根据权利要求27所述的表达盒。
31.根据权利要求20、21、22、23、24、25或26所述的植物或其子代的种子或谷粒,其中所述种子或谷粒包含所述分离的核酸分子。
32.根据权利要求31所述的种子,其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
33.根据权利要求32所述的种子,其中所述一种或多种种子处理剂选自除草剂、杀昆
虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂、萌发增强剂、植物生长调节剂、杀细菌剂和线虫剂。
34.一种来源于根据权利要求20、21、22、23、24、25或26所述的植物的组织或种子的生物样品。
35.一种重组微生物,包含根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18或19所述的分离的核酸分子。
36.根据权利要求35所述的微生物,其中所述微生物选自细菌、杆状病毒、藻类和真
菌。
37.根据权利要求36所述的微生物,其中所述细菌选自芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞
菌(Pseudomonas)、棍状杆菌(Clavibacter)、根瘤菌(Rhizobium)以及大肠杆菌(E.coli)。
38.一种用于产生具有杀昆虫活性的多肽的方法,包括在编码所述多肽的所述核酸分
子表达的条件下培养根据权利要求35、36或37所述的微生物。
39.一种用于在植物中表达PIP-1多肽的方法,包括如下步骤:
(a)在所述植物细胞中插入核酸序列,所述核酸序列在5′至3′方向上包含有效连接
的重组双链DNA分子,其中所述重组双链DNA分子包含
(i)在所述植物细胞中起作用的启动子;
(ii)编码如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中所示的PIP-1多肽的核酸分子;以及
(iii)在所述植物的所述细胞中起作用而使转录终止的3′非翻译多核苷酸;
(b)获得包含步骤(a)的所述核酸序列的转化植物细胞;以及
(c)由所述转化的植物细胞产生能够表达所述PIP-1多肽的植物。
40.一种通过根据权利要求39所述的方法产生的植物。
41.通过根据权利要求40所述的植物产生的种子或谷粒。
42.根据权利要求40所述的植物,还具有一种或多种另外的转基因性状。
43.根据权利要求42所述的植物,其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗
性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
44.根据权利要求40、42或43所述的植物,其中所述植物是单子叶植物。
45.根据权利要求40、42或43所述的植物,其中所述植物是双子叶植物。
46.一种分离的PIP-1多肽。
47.根据权利要求46所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽是口服活性的。
48.根据权利要求46或47所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对于半
翅目(Hemiptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
49.根据权利要求46、47或48所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对
于蝽科(Pentatomidae)昆虫害虫的杀昆虫活性。
50.根据权利要求49所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对于选自如
下的昆虫的杀昆虫活性:稻绿蝽(Nezara viridula)、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、璧蝽(Piezodorus guildini)、褐臭蝽(Euschistus servus)、喜绿蝽(Acrosternum hilare)、大豆褐椿(Euschistus heros)、Euschistus tristigmus、喜绿蝽(Acrosternum hilare)、Dichelops furcatus、Dichelops melacanthus、Bagrada hilaris、筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)、Scaptocoris castanea、谷实夜蛾(Helicoverpa zea Boddie)、大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)以及黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
51.根据权利要求46、47、48、49或50所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽
具有对于鳞翅目(Lepidoptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
52.根据权利要求46、47、48、49、50或51所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽由绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株产生。
53.根据权利要求52所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽由含有与SEQ
ID NO:216具有至少约96.9%同一性的16S核糖体DNA的绿针假单胞菌(Pseudomonas
chlororaphis)菌株产生。
54.根据权利要求52所述的分离的PIP-1多肽,其中所述绿针假单胞菌(Pseudomonas
chlororaphis)菌株是以登录号NRRLB-50613保藏的SS44C4。
55.根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53或54所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
56.根据权利要求55所述的分离的PIP-1多肽,还包含如由SEQ ID NO:213的第
149-159位和SEQ ID NO:213的第64-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
57.根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包括与SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
58.根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序,并且其中所述PIP-1多肽与SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列具有至少80%的同一性。
59.根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第8位处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处
的Xaa是Leu或Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或
Arg;第24位处的Xaa是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是
Ser或Asn;第27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位
处的Xaa是Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg
或Ser;第42位处的Xaa是Phe或Tyr;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的
Xaa是Gly或Asp;第49位处的Xaa是Phe或Tyr;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58
位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;
第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或
Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa
是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第
121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn
或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135
位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val
或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的
Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或
Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa
是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第
167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第174位处的Xaa是
Ile、Val或Met;第175位处的Xaa是Val或Ile;第180位处的Xaa是Met或Leu;第191
位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第200位处的Xaa是Asn或
Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位处的Xaa
是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位
处的Xaa是Ser或Lys;第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或
Glu;第228位处的Xaa是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa
是Ile或Val;第232位处的Xaa是Ala、Thr或Glu;以及第251位处的Xaa是Gly、Ser或
Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第265位处的Xaa
是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺
失1至28个氨基酸。
60.根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第3位处的Xaa是Ile或Thr;第6位处的Xaa是Glu或Gly;第8位处的Xaa是
Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;第
21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa
是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处
的Xaa是Leu、Thr或Ala;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第42位处
的Xaa是Phe或Tyr;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly或Asp;第49位处的Xaa是Phe、Tyr或Leu;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58
位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;
第66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第
97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或
Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位处的Xaa
是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第
123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa是Ser、
Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第
137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是Gly或
Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的
Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;
第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa
是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;第168位
处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第
179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu、Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第
183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn或Tyr;
第200位处的Xaa是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是
Thr或Ala;第206位处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第213位处
的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;
第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa
是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位
处的Xaa是Ala、Thr或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、GlV、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或
Arg;第259位处的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺
失1至28个氨基酸。
61.根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro、Thr或Ser;第3位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser;第6位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala;第8位处的Xaa是Ser、Gly、Asn、Thr或Gln;第19位处的Xaa是Asp、Glu或
Cys;第20位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第21位处的Xaa是Lys、Ser、Asn、Arg、Thr或Gln;第22位处的Xaa是Ser、Lys、Arg或Thr;第24位处的Xaa是Gln、Gly、Asn或Ala;
第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第27位处的Xaa
是Leu、Thr、Ala、Ser、Ile、Val或Met;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala、Ile、Leu、Val或Met;
第35位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Val或Met;第36位处的Xaa是Ala、Ser、Thr、Val、Ile或Leu;第38位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第42位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第49位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第
53位处的Xaa是Ser、Gly、Ala或Thr;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是
Ala、Ser、Gly或Thr;第63位处的Xaa是Gln、Lys、Asn或Arg;第66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met、Val、Leu或Ile;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是
Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr、Ile、Ser、Leu或Val;第108位处的Xaa是Gln、Thr、Ser或Asn;第110位处的Xaa是Arg、Leu、Lys、Ile、Val或Met;第120位处的Xaa是Lys、Arg、Gln或Asn;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr、Glu、Ser或Asp;
第125位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Lys、Ser或Arg;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Arg或Lys;第137位处的Xaa是Asp、Gly、Glu或Ala;第141位处的Xaa是Val、Ile或Leu;
第142位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的
Xaa是Ile、Thr、Val、Leu、Met或Ser;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是
Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp、Glu或Gln;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第
166位处的Xaa是Gln、Glu、Asp或Asn;第167位处的Xaa是Leu、Met、Ile、Val;第168位处的Xaa是Thr、Lys、Ala、Ser、Arg或Gly;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu;Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;
第183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn、Tyr、
Gln或Trp;第200位处的Xaa是Asn、Ser、Thr或Gln;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第
204位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly;第206位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第209位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是
Asn、Arg、Gln或Lys;第221位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg;第222位处的Xaa是Thr、Arg、Ser或Lys;第226位处的Xaa是Asp、Pro、Glu或Gln;第228位处的Xaa是Ser或
Gly;第229位处的Xaa是Lys、Asn、Arg或Gln;第231位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met;
第232位处的Xaa是Ala、Thr、Ser、Gly、Asp或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu;第254位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第258位处的Xaa是Ser、Arg、Thr或Lys;第259位处的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu;以及第266位处的Xaa是Asp、Asn、Gln或Glu;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28
个氨基酸。
62.根据权利要求55所述的分离的PIP-1多肽,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其
片段。
63.根据权利要求55所述的分离的PIP-1多肽,基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸序列
组成。
64.根据权利要求55所述的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽由SEQ ID NO:1
的多核苷酸编码。
65.根据权利要求46所述的分离的PIP-1多肽,具有选自如下的一个或多个特性:
a)如由SEQ ID NO:213的第64-79位表示的氨基酸基序;
b)如由SEQ ID NO:213的第149-159位表示的氨基酸基序;
c)如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序;
e)对于半翅目(Hemiptera)昆虫害虫的杀昆虫活性;
f)对于鳞翅目(Lepidoptera)昆虫害虫的杀昆虫活性;
g)口服活性;以及
h)约15kD至约35kD之间的计算分子量。
66.一种能够表达根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
61、62、63、64或65所述的分离的PIP-1多肽的植物。
67.根据权利要求66所述的植物,其中所述植物是单子叶植物。
68.根据权利要求66所述的植物,其中所述植物是双子叶植物。
69.根据权利要求66所述的植物,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
70.根据权利要求66、67、68、69或70所述的植物,其中所述植物表达一种或多种另外的转基因性状。
71.根据权利要求70所述的植物,其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗
性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、和抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
72.一种组合物,包含杀昆虫有效量的根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、
55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的分离的PIP-1多肽。
73.根据权利要求72所述的组合物,还包含农业上适用的载体。
74.根据权利要求73所述的组合物,其中所述载体选自散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。
75.根据权利要求72、73或74所述的组合物,还包含一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。
76.根据权利要求75所述的组合物,其中所述一种或多种杀昆虫剂是杀虫蛋白。
77.根据权利要求76所述的组合物,其中所述一种或多种杀虫蛋白选自Cry1蛋白、
Cry2蛋白、Cry3蛋白、Cry4蛋白、Cry5蛋白、Cry6蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry9蛋白、Cry15蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry32蛋白、Cry34蛋白、Cry35蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry43蛋白、Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry55蛋白、Cry二元毒素、Cyt蛋白、VIP毒素、SIP蛋白、杀昆虫脂肪酶、杀昆虫几丁质酶以及蛇毒蛋白。
78.一种用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的
根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的分离的PIP-1多肽接触
79.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的根
据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的重组PIP-1多肽接触。
80.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述抗性昆虫
害虫群体与杀昆虫有效量的根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、61、62、63、64或65所述的分离的PIP-1多肽接触。
81.一种防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述群体与杀昆虫
有效量的根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的分离的PIP-1多肽接触,其中所述杀虫蛋白选自Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、Cry9c、eCry3.1Ab和CBI-Bt。
82.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在所述植物或其细胞中表达根
据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的分离的PIP-1多肽。
83.一种以登录号NRRLB-50613保藏的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌
株SS44C4的生物纯培养物。
84.一种从绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株分离具有杀昆虫活性的
多肽的方法,包括
a)从细菌分离株获得蛋白细胞裂解物;
b)筛查所述蛋白细胞裂解物的杀昆虫活性;以及
c)从所述蛋白细胞裂解物分离杀昆虫蛋白。
85.一种SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:6的所述多肽的分离的受体。
86.根据权利要求85所述的分离的受体,其中所述受体分离自半翅目(Hemiptera)。
87.一种鉴定生物样品中的PIP-1多肽的方法,包括使所述生物样品与根据权利要求
85或86所述的受体接触。
88.一种分离的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体特异性地结合根据权利要求
46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的PIP-1多肽。
89.一种检测生物样品中的PIP-1多肽的方法,包括使所述蛋白与根据权利要求88所
述的抗体接触。
90.一种分离生物样品中的PIP-1多肽的方法,包括使所述蛋白与根据权利要求88所
述的抗体接触。
91.一种防治转基因植物中的鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫
侵染并提供昆虫抗性治理的方法,包括在所述植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。
92.根据权利要求91所述的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目
(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有杀昆虫性的根据权利要求46、47、48、
49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的PIP-1多肽。
93.根据权利要求92所述的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目
(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
94.一种降低鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫出现对在所述植
物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治所述昆虫物种的方法,包括表达对所述昆虫物种具有杀昆虫性的根据权利要求46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64或65所述的PIP-1A多肽,同时联合表达与所述PIP-1A多肽相比具有不同作用模式的所述昆虫物种的杀昆虫蛋白。
95.一种有效的鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫抗性治理
的方法,包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目
(Hemiptera)昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑制生长或杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白包括根据权利要求46、47、48、49、
50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的PIP-1多肽以及Cry蛋白。
96.一种用于获得表达对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有
杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述昆虫测定结合数据表明,在此类昆虫中,根据权利要求46、47、48、
49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65所述的PIP-1多肽不与Cry蛋白的结合位点竞争。
97.一种植物或其子代,包含SEQ ID NO:3的所述分离的核酸分子。
98.一种用SEQ ID NO:3的所述分离的核酸分子稳定转化的植物或其子代。
99.根据权利要求97或98所述的植物或其子代,其中所述植物是单子叶植物。
100.根据权利要求97或98所述的植物或其子代,其中所述植物是双子叶植物。
101.根据权利要求97或98所述的植物或其子代,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
102.根据权利要求97、98、99、100或101所述的植物或其子代,还具有一种或多种另外的转基因性状。
103.一种表达盒,包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:331的所述分离的核酸分子,其中
所述核酸有效连接至引导SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的所述多肽的表达的一个或多个调控序列。
104.一种植物,包含根据权利要求103所述的表达盒。
105.一种植物细胞,包含根据权利要求103所述的表达盒。
106.一种根据权利要求97、98、99、100、101或102所述的植物的种子或谷粒,其中所述种子或谷粒包含SEQ ID NO:3的所述分离的核酸分子。
107.根据权利要求106所述的种子,其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种
子。
108.一种用于在植物中表达杀昆虫蛋白的方法,包括
(a)在所述植物细胞中插入核酸序列,所述核酸序列在5′至3′方向上包含有效连接
的重组双链DNA分子,其中所述重组双链DNA分子包含
(i)在所述植物细胞中起作用的启动子;
(ii)编码SEQ ID NO:4的所述蛋白的核酸分子;以及
(iii)在所述植物的所述细胞中起作用而使转录终止的3′非翻译多核苷酸;
(b)获得包含所述步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞;以及
(c)由所述转化的植物细胞产生能够表达SEQ ID NO:4的所述蛋白的植物。
109.一种通过根据权利要求108所述的方法产生的植物。
110.根据权利要求109所述的植物的种子或谷粒。
111.根据权利要求108所述的方法,其中所述植物还具有一种或多种另外的转基因性
状。
112.一种能够表达SEQ ID NO:4的分离的蛋白的植物。
113.一种用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的
SEQ ID NO:4的分离蛋白接触。
114.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的
SEQ ID NO:4的分离蛋白接触。
115.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫
群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:4的分离蛋白接触。
116.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在所述植物或其细胞中表达
SEQ ID NO:4的分离的杀昆虫蛋白。
117.一种编码杀昆虫蛋白的分离的核酸分子,所述杀昆虫蛋白包括与SEQ ID NO:6的
所述氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
118.根据权利要求117所述的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白是口服活性的。
119.根据权利要求117或118所述的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白具有对于
半翅目(Hemiptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
120.根据权利要求119所述的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白具有对于蝽科
(Pentatomidae)昆虫害虫的杀昆虫活性。
121.根据权利要求117、118、119或120所述的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白
具有对于鳞翅目(Lepidoptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
122.根据权利要求117、118、119、120或121所述的分离的核酸分子,其中所述核酸分子由嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)菌株产生。
123.根据权利要求117所述的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白包含如由SEQ ID
NO:6的第171-183位或SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
124.根据权利要求123所述的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白还包含如由SEQ
ID NO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第69-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
125.一种分离的杀昆虫蛋白,包括与SEQ ID NO:6的所述氨基酸序列具有至少80%同
一性的多肽。
126.根据权利要求125所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白是口服活性
的。
127.根据权利要求125或126所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白具有对
于半翅目(Hemiptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
128.根据权利要求127所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白具有对于蝽科
(Pentatomidae)昆虫害虫的杀昆虫活性。
129.根据权利要求125、126、127或128所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋
白具有对于鳞翅目(Lepidoptera)昆虫害虫的杀昆虫活性。
130.根据权利要求125、126、127、128或129所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述核酸分子由嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)菌株产生。
131.根据权利要求125所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白包含如由SEQ
ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
132.根据权利要求131所述的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白还包含如由
SEQ ID NO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第69-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
133.一种植物或其子代,包含根据权利要求117、118、119、120、121、122、123或124所述的分离的核酸分子。
134.一种用根据权利要求117、118、119、120、121、122、123或124所述的分离的核酸分子稳定转化的植物或其子代。
135.根据权利要求133或134所述的植物或其子代,其中所述植物是单子叶植物。
136.根据权利要求133或134所述的植物或其子代,其中所述植物是双子叶植物。
137.根据权利要求133或134所述的植物或其子代,其中所述植物选自大麦、玉米、燕
麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草植物细胞。
138.根据权利要求133、134、135、136或137所述的植物或其子代,还具有一种或多种另外的转基因性状。
139.一种表达盒,包含根据权利要求117、118、119、120、121、122、123或124所述的编码所述杀昆虫蛋白的所述分离的核酸分子,其中所述核酸有效连接至引导所述杀昆虫蛋白的表达的一个或多个调控序列。
140.一种植物,包含根据权利要求139所述的表达盒。
141.一种植物细胞,包含根据权利要求139所述的表达盒。
142.根据权利要求133、134、135、136、137或138所述的植物的种子或谷粒,其中所述种子或谷粒包含所述分离的核酸分子。
143.根据权利要求142所述的种子,其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种
子。
144.一种用于在植物中表达杀昆虫蛋白的方法,包括
(a)在所述植物细胞中插入核酸序列,所述核酸序列在5′至3′方向上包含有效连接
的重组双链DNA分子,其中所述重组双链DNA分子包含
(i)在所述植物细胞中起作用的启动子;
(ii)编码根据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的杀昆虫蛋白的核酸分子;以及
(iii)在所述植物的所述细胞中起作用而使转录终止的3′非翻译多核苷酸;
(b)获得包含所述步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞;以及
(c)由所述转化的植物细胞产生能够表达所述杀昆虫蛋白的植物。
145.一种通过根据权利要求144所述的方法产生的植物。
146.根据权利要求145所述的植物的种子或谷粒。
147.根据权利要求144所述的方法,其中所述植物还具有一种或多种另外的转基因性
状。
148.一种能够表达根据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的分离的杀昆虫蛋白的植物。
149.一种用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的
根据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的分离的杀昆虫蛋白接触。
150.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的根
据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的分离的杀昆虫蛋白接触。
151.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫
群体与杀虫有效量的根据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的分离的蛋白接触。
152.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在所述植物或其细胞中表达根
据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的分离的杀虫蛋白。
153.一种防治转基因植物中的鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫
侵染并提供昆虫抗性治理的方法,包括在所述植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有杀昆虫性的根据权利要求125、126、127、128、129、130、131或
132所述的杀昆虫蛋白。
154.根据权利要求153所述的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目
(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
155.一种降低鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫物种出现对在所
述植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治所述昆虫物种的方法,包括表达对所述昆虫物种具有杀昆虫性的根据权利要求125、126、127、128、129、130、131或132所述的第一杀昆虫蛋白,同时联合表达与所述第一杀昆虫蛋白相比具有不同作用模式的对所述昆虫物种具有杀昆虫性的第二杀昆虫蛋白。
156.一种有效的鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫抗性治理
的方法,包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目
(Hemiptera)昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑制生长或杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括根据权利要求125、126、
127、128、129、130、131或132所述的杀昆虫蛋白并且所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括Cry蛋白。
157.一种用于获得表达对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具
有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述昆虫测定结合数据表明,在所述昆虫中,根据权利要求125、126、
127、128、129、130、131或132所述的杀昆虫蛋白不与Cry蛋白的结合位点竞争。
158.一种防治转基因植物中的鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆
虫侵染并提供昆虫抗性治理的方法,包括在所述植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包含SEQ ID NO:4的所述氨基酸序列,并对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有杀昆虫性。
159.根据权利要求158所述的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目
(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
160.一种降低鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫出现对在所述植
物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治所述昆虫物种的方法,包括表达对所述昆虫物种具有杀昆虫性的SEQ ID NO:4的所述杀昆虫蛋白,同时联合表达与SEQ ID NO:4的所述蛋白相比具有不同作用模式的对所述昆虫物种具有杀昆虫性的杀昆虫蛋白。
161.一种有效的鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫抗性治理
的方法,包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目
(Hemiptera)昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑制生长或杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括SEQ ID NO:4的所述杀昆虫蛋白并且所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括Cry蛋白。
162.一种用于获得表达对鳞翅目(Lepidoptera)和/或半翅目(Hemiptera)昆虫具有
杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述昆虫测定结合数据表明,在所述昆虫中,SEQ ID NO:4的所述杀昆虫蛋白不与Cry蛋白的结合位点竞争。

说明书全文

新型杀昆虫蛋白及其使用方法

[0001] 对以电子方式提交的序列表的引用
[0002] 创建于2013年6月25日、大小为459千字节的文件名为“4208PCT_sequence_listing.txt”的序列表以计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一
部分,并且全文以引用的方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新型基因。这些杀虫蛋白以及编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂并且可用于产生转基因抗虫害植物

背景技术

[0004] 使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治,可提供具有环境友好性和商业吸引的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言,生物杀
虫剂的使用造成的污染和环境危害的险较低,并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀
昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外,生物杀虫剂的生产成本往往较低,因
此能提高众多作物的经济产量。
[0005] 已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些种对于一系列昆虫害虫具有杀虫活性,这些昆虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目
(Hemiptera)害虫以及其他害虫。苏金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)和日本
金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。昆
虫致病性也被认为是由幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形
芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的菌株引起的。微生物杀昆虫剂,
特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂,在农业上作为害虫化学防治的替代方
案已起到重要的作用。
[0006] 最近,已通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白,开发出了昆虫抗性增强的作物。例如,已对玉米和花植物进行遗传工程改造以产生从Bt的菌株
分离的杀虫蛋白。这些经遗传工程改造的作物目前在农业中广泛应用,给农场主提供了替
代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在
商业上十分成功,但它们对仅仅较窄范围的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。在一些情况
中,昆虫可产生对不同杀昆虫化合物的抗性,这就有必要鉴定替代生物防治剂来进行害虫
防治。
[0007] 因此,仍然需要对于昆虫害虫具有不同范围杀昆虫活性的新杀虫蛋白,例如对于鳞翅目和半翅目的多种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白,所述多种昆虫包括但不限于属于蝽科
(Pentatomidae)、龟蝽科(Plataspidae)和土蝽科(Cydnidae)的种。此外,仍然需要对于
多种对现有杀虫剂已产生抗性的昆虫害虫具有活性的生物杀虫剂。

发明内容

[0008] 提供了将杀虫活性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的载体以及含有所述
载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列以及那些多肽的抗体。核酸序列可用于DNA
构建体或表达盒中,该DNA构建体或表达盒用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和
表达。核苷酸或基酸序列可以为设计用于在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表
达的合成序列。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。
[0009] 具体地讲,提供了分离的或重组的核酸分子,所述核酸分子编码假单胞菌(Pseudomonas)杀昆虫蛋白-1(PIP-1)多肽,所述多肽包含氨基酸置换、氨基酸缺失、氨基
酸插入和其片段以及它们的组合。此外,涵盖与PIP-1多肽对应的氨基酸序列。提供了分
离的或重组的核酸分子,所述核酸分子能够编码SEQ ID NO:2、101、102、103、104、105、106、
107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、
126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、
145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、249、
250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、
269、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、
316、317、318、319、320、321、322、323、324和325的PIP-1多肽以及氨基酸置换、氨基酸缺失、氨基酸插入和其片段以及它们的组合。在一些实施例中,示例性PIP-1多肽包含以SEQ
ID NO:2、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、
118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、
137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、
212、213、214、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、
261、262、263、264、265、266、267、268和269示出的序列以及氨基酸置换、氨基酸缺失、氨基酸插入和其片段以及它们的组合。
[0010] 还提供了以SEQ ID NO:1、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、
182、183、184、185、186、197、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、
201、202、203、205、207、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、
234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、270、271、272、273、274、275、276、277、
278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296和
297示出的核酸序列以及其编码PIP-1多肽的变体和片段。
[0011] 在一些实施例中,示例性核酸分子包含以SEQ ID NO:152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、188、189、190、191、192、193、194、195、
196、197、198、199、200、201、202、203、205、207、220、221、222、223、224、225、226、227、228、
229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243和244示出的序列以及其编码PIP-1多肽的变体和片段,以及其编码PIP-1多肽的变体和片段。还涵盖与所述
实施例的核酸序列互补或杂交至所述实施例的序列的核酸序列。
[0012] 提供了用于产生多肽以及使用那些多肽防治、抑制生长或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、半翅目和/或双翅目害虫的方法。所述实施例的转基因植物表达本文所公开的杀
虫序列中的一者或多者。在各种实施例中,转基因植物还包含用于获得昆虫抗性的一个或
多个另外的基因,例如,用于防治鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫害虫的一个或多个另外的
基因。本领域技术人员应当理解,转基因植物可包含赋予所关注的农艺性状的任何基因。
[0013] 还包括用于检测样品中的所述实施例的核酸和多肽的方法。提供了用于检测PIP-1多肽的存在或检测样品中编码PIP-1多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。用于检
测编码PIP-1多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒可包含核酸探针,所述核酸探针包含编码
PIP-1多肽的核苷酸序列的至少20个连续核苷酸或其互补序列。用于检测PIP-1多肽的存
在的试剂盒可包含特异性结合PIP-1多肽的抗体。所述试剂盒连同执行检测预期因子的方
法所需的所有试剂和对照样品以及使用说明一起提供。
[0014] 所述实施例的组合物和方法可用于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含所述生物体的组合物对农业用途而言是理想的。所述实施例的组合物也
可用于产生具有杀虫活性的改变或改善的蛋白质,或可用于检测产物或生物体中PIP-1多
肽或核酸的存在。
[0015] 本发明涵盖以下实施例:
[0016] 1.一种编码PIP-1多肽的分离的核酸分子。
[0017] 2.实施例1的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽是口服活性的。
[0018] 3.实施例1或2的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽具有对于半翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0019] 4.实施例1、2或3的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽具有对于蝽科昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0020] 5.实施例1、2、3或4的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽具有对于鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0021] 6.实施例1、2、3、4或5的分离的核酸分子,其中所述核酸分子来自绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株。
[0022] 7.实施例1、2、3、4、5或6的分离的核酸分子,其中所述绿针假单胞菌菌株包含与SEQ ID NO:216具有至少约96.9%同一性的16S核糖体DNA。
[0023] 8.实施例1、2、3、4、5、6或7的分离的核酸分子,其中所述绿针假单胞菌菌株是以登录号NRRLB-50613保藏的SS44C4。
[0024] 9.实施例1、2、3、4、5、6、7或8的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
[0025] 10.实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽还包含如由SEQ ID NO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第64-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
[0026] 11.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
[0027] 12.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽还包含如由SEQ ID NO:213的第64-79位、SEQ ID NO:213的第149-159位以及SEQ IDNO:213的第171-183位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
[0028] 13.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第8位处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;
第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa
是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处
的Xaa是Leu、Thr或Ala;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;
第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第42位处的Xaa
是Phe或Tyr;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly或Asp;第49
位处的Xaa是Phe或Tyr;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;
第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第77位处的Xaa是Phe
或Tyr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa
是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位
处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或
Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa
是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或
Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是
Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150
位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr
或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位
处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;
第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第174位处的Xaa是Ile、Val或Met;第175位处
的Xaa是Val或Ile;第180位处的Xaa是Met或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第
194位处的Xaa是Gly或Ala;第200位处的Xaa是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或
Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa
是Leu或Val;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;第222位
处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa是Ser或
Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位处的Xaa
是Ala、Thr或Glu;以及第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或
Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第265位处的Xaa是Asn或Asp;以及第266位处的
Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28个氨基酸。
[0029] 14.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第3位处的Xaa是Ile或Thr;第6位处的Xaa是Glu或Gly;第8位处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位
处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser
或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa是Gln或Ala;第25位处的
Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第
28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;第36位处的Xaa是
Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第42位处的Xaa是Phe或Tyr;第
43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly或Asp;第49位
处的Xaa是Phe、Tyr或Leu;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位处的Xaa是Tyr或
Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第66位处的Xaa是
Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第89位处的
Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa
是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位
处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或
Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位
处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或
Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa
是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第
151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是
Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166
位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys
或Ala;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的
Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第
173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;
第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位
处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178
位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第179位处的Xaa
是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu、Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第183位处的Xaa是
Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn或Tyr;第200位处的Xaa
是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位
处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;
第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;第222位处的Xaa是Thr
或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa是Ser或Gly;第229位
处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位处的Xaa是Ala、Thr或
Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;
第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第259位处的
Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn或Asp;以
及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28个氨基
酸。
[0030] 15.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含(SEQ ID NO:213)的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro、Thr或Ser;第3位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser;第6位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala;第8
位处的Xaa是Ser、Gly、Asn、Thr或Gln;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的
Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第21位处的Xaa是Lys、Ser、Asn、Arg、Thr或Gln;第22位处
的Xaa是Ser、Lys、Arg或Thr;第24位处的Xaa是Gln、Gly、Asn或Ala;第25位处的Xaa
是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第27位处的Xaa是Leu、Thr、Ala、
Ser、Ile、Val或Met;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala、Ile、Leu、Val或Met;第35位处的Xaa
是Phe、Leu、Ile、Val或Met;第36位处的Xaa是Ala、Ser、Thr、Val、Ile或Leu;第38位
处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第42位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、
Val或Met;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly、
Asp、Ala或Glu;第49位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第53位处的Xaa
是Ser、Gly、Ala或Thr;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala、Ser、Gly
或Thr;第63位处的Xaa是Gln、Lys、Asn或Arg;第66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、
Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第89
位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met、Val、Leu或Ile;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;
第107位处的Xaa是Thr、Ile、Ser、Leu或Val;第108位处的Xaa是Gln、Thr、Ser或Asn;
第110位处的Xaa是Arg、Leu、Lys、Ile、Val或Met;第120位处的Xaa是Lys、Arg、Gln或
Asn;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr、Glu、Ser或Asp;第125位
处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Lys、Ser或Arg;
第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Arg或Lys;第
137位处的Xaa是Asp、Gly、Glu或Ala;第141位处的Xaa是Val、Ile或Leu;第142位处
的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、
Thr、Val、Leu、Met或Ser;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg、
Ser、Gln、Lys或Thr;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;
第163位处的Xaa是Asn、Asp、Glu或Gln;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的
Xaa是Gln、Glu、Asp或Asn;第167位处的Xaa是Leu、Met、Ile、Val;第168位处的Xaa是
Thr、Lys、Ala、Ser、Arg或Gly;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met
或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第
179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是
Met、Leu;Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、yal、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第
183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn、Tyr、
Gln或Trp;第200位处的Xaa是Asn、Ser、Thr或Gln;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第
204位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly;第206位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第209
位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是
Asn、Arg、Gln或Lys;第221位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg;第222位处的Xaa是Thr、
Arg、Ser或Lys;第226位处的Xaa是Asp、Pro、Glu或Gln;第228位处的Xaa是Ser或
Gly;第229位处的Xaa是Lys、Asn、Arg或Gln;第231位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met;
第232位处的Xaa是Ala、Thr、Ser、Gly、Asp或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、
Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的
Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu;第254位处的Xaa是
Ser、Asn、Thr或Gln;第258位处的Xaa是Ser、Arg、Thr或Lys;第259位处的Xaa是Phe、
Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu;以及
第266位处的Xaa是Asp、Asn、Gln或Glu;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28
个氨基酸。
[0031] 16.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的多核苷酸、或其片段或互补序列。
[0032] 17.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的分离的核酸分子,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段。
[0033] 18.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子在严格条件下杂交至SEQ ID NO:1的多核苷酸。
[0034] 19.实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的多核苷酸。
[0035] 20.一种植物或其子代,包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的分离的核酸分子。
[0036] 21.一种用实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的分离的核酸分子稳定转化的植物或其子代。
[0037] 22.实施例20或21的植物,其中所述植物是单子叶植物。
[0038] 23.实施例20或21的植物,其中所述植物是双子叶植物。
[0039] 24.实施例20或21的植物,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草植物细胞。
[0040] 25.实施例20、21、22、23或24的植物,还具有一种或多种另外的转基因性状。
[0041] 26.实施例25的植物,其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性或胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量以及耐旱性。
[0042] 27.一种表达盒,包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的分离的核酸分子,其中所述核酸有效连接至引导PIP-1多肽的表达的一个或多个调控序列。
[0043] 28.一种植物,包含实施例27的表达盒。
[0044] 29.一种植物细胞,包含实施例27的表达盒。
[0045] 30.一种重组微生物细胞,包含实施例27的表达盒。
[0046] 31.实施例20、21、22、23、24、25或26的植物或其子代的种子或谷粒,其中所述种子或谷粒包含分离的核酸分子。
[0047] 32.实施例31的种子,其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
[0048] 33.实施例32的种子,其中所述一种或多种种子处理剂选自除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂、萌发增强剂、植物生长调节剂、杀细菌剂和杀线虫剂
[0049] 34.一种来源于实施例20、21、22、23、24、25或26的植物的组织或种子的生物样品。
[0050] 35.一种重组微生物,包含实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的分离的核酸分子。
[0051] 36.实施例35的微生物,其中所述微生物选自细菌、杆状病毒、藻类和真菌。
[0052] 37.实施例36的微生物,其中所述细菌选自芽孢杆菌、假单胞菌、棍状杆菌(Clavibacter)、根瘤菌(Rhizobium)以及大肠杆菌(E.coli)。
[0053] 38.一种用于产生具有杀昆虫活性的多肽的方法,包括在编码所述多肽的核酸分子表达的条件下培养实施例35、36或37的微生物。
[0054] 39.一种用于在植物中表达PIP-1多肽的方法,包括如下步骤:
[0055] (a)在植物细胞中插入核酸序列,所述核酸序列在5′至3′方向上包含有效连接的重组双链DNA分子,其中所述重组双链DNA分子包含
[0056] (i)在植物细胞中起作用的启动子;
[0057] (ii)编码如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中所示的PIP-1多肽的核酸分子;以及
[0058] (iii)在植物的细胞中起作用而使转录终止的3′非翻译多核苷酸;
[0059] (b)获得包含步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞;以及
[0060] (c)由所述转化的植物细胞产生能够表达PIP-1多肽的植物。
[0061] 40.一种通过实施例39的方法产生的植物。
[0062] 41.通过实施例40的植物产生的种子或谷粒。
[0063] 42.实施例40的植物,还具有一种或多种另外的转基因性状。
[0064] 43.实施例42的植物,其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
[0065] 44.实施例40、42或43的植物,其中所述植物是单子叶植物。
[0066] 45.实施例40、42或43的植物,其中所述植物是双子叶植物。
[0067] 46.一种分离的PIP-1多肽。
[0068] 47.实施例46的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽是口服活性的。
[0069] 48.实施例46或47的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对于半翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0070] 49.实施例46、47或48的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对于蝽科昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0071] 50.实施例49的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对于选自如下的昆虫的杀昆虫活性:稻绿蝽(Nezara viridula)、荼翅蝽(Halyomorpha halys)、璧蝽
(Piezodorus guildini)、褐臭蝽(Euschistus servus)、喜绿蝽(Acrosternum hilare)、
大豆褐椿(Euschistus heros)、Euschistus tristigmus、喜绿蝽(Acrosternum hilare)、
Dichelops furcatus、Dichelops melacanthus、Bagrada hilaris、筛豆龟蝽(Megacopta
cribraria)、Scaptocoris castanea、谷实夜蛾(Helicoverpa zea Boddie)、大豆尺夜蛾
(Pseudoplusia includens Walker)以及黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
[0072] 51.实施例46、47、48、49或50的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽具有对于鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0073] 52.实施例46、47、48、49、50或51的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽由绿针假单胞菌菌株产生。
[0074] 53.实施例52的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽由含有与SEQ ID NO:216具有至少约96.9%同一性的16S核糖体DNA的绿针假单胞菌菌株产生。
[0075] 54.实施例52的分离的PIP-1多肽,其中所述绿针假单胞菌菌株是以登录号NRRLB-50613保藏的SS44C4。
[0076] 55.实施例46、47、48、49、50、51、52、53或54的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
[0077] 56.实施例55的分离的PIP-1多肽,还包含如由SEQ ID NO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第64-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
[0078] 57.实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
[0079] 58.实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序,并且其中所述PIP-1多肽与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性。
[0080] 59.实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含(SEQ ID NO:211)的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第8位处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处
的Xaa是Leu或Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或
Arg;第24位处的Xaa是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是
Ser或Asn;第27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位
处的Xaa是Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg
或Ser;第42位处的Xaa是Phe或Tyr;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的
Xaa是Gly或Asp;第49位处的Xaa是Phe或Tyr;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58
位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;
第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或
Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa
是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第
121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn
或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135
位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val
或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的
Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或
Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa
是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第
167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第174位处的Xaa是
Ile、Val或Met;第175位处的Xaa是Val或Ile;第180位处的Xaa是Met或Leu;第191
位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第200位处的Xaa是Asn或
Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位处的Xaa
是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位
处的Xaa是Ser或Lys;第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或
Glu;第228位处的Xaa是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa
是Ile或Val;第232位处的Xaa是Ala、Thr或Glu;以及第251位处的Xaa是Gly、Ser或
Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第265位处的Xaa
是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺
失1至28个氨基酸。
[0081] 60.实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第3位处的Xaa是Ile或Thr;第6位处的Xaa是Glu或Gly;第8位处的Xaa是Ser、
Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;第21位
处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa是Gln
或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处的Xaa
是Leu、Thr或Ala;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;
第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第42位处的Xaa
是Phe或Tyr;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是
Gly或Asp;第49位处的Xaa是Phe、Tyr或Leu;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位
处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第
66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe或
Tyr;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;
第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;
第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg
或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处
的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr
或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位
处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;
第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa
是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第
162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是
Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处
的Xaa是Thr、Lys或Ala;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或
Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met
或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第
179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是
Met、Leu、Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第
183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn或Tyr;
第200位处的Xaa是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是
Thr或Ala;第206位处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第213位处
的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;
第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa
是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位
处的Xaa是Ala、Thr或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、
Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa
是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或
Arg;第259位处的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa
是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺
失1至28个氨基酸。
[0082] 61.实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro、Thr或Ser;第3位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser;第6位处的Xaa是Glu、Gly、Asp
或Ala;第8位处的Xaa是Ser、Gly、Asn、Thr或Gln;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;
第20位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第21位处的Xaa是Lys、Ser、Asn、Arg、Thr或
Gln;第22位处的Xaa是Ser、Lys、Arg或Thr;第24位处的Xaa是Gln、Gly、Asn或Ala;第
25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第27位处的Xaa是
Leu、Thr、Ala、Ser、Ile、Val或Met;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala、Ile、Leu、Val或Met;第
35位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Val或Met;第36位处的Xaa是Ala、Ser、Thr、Val、Ile或
Leu;第38位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第42位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、
Leu、Ile、Val或Met;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa
是Gly、Asp、Ala或Glu;第49位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第53位
处的Xaa是Ser、Gly、Ala或Thr;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala、
Ser、Gly或Thr;第63位处的Xaa是Gln、Lys、Asn或Arg;第66位处的Xaa是Trp、Tyr、
Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或
Met;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;
第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met、Val、Leu或Ile;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln
或Asn;第107位处的Xaa是Thr、Ile、Ser、Leu或Val;第108位处的Xaa是Gln、Thr、Ser
或Asn;第110位处的Xaa是Arg、Leu、Lys、Ile、Val或Met;第120位处的Xaa是Lys、Arg、
Gln或Asn;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr、Glu、Ser或Asp;第
125位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Lys、Ser
或Arg;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Arg或
Lys;第137位处的Xaa是Asp、Gly、Glu或Ala;第141位处的Xaa是Val、Ile或Leu;第
142位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa
是Ile、Thr、Val、Leu、Met或Ser;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是
Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser
或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp、Glu或Gln;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166
位处的Xaa是Gln、Glu、Asp或Asn;第167位处的Xaa是Leu、Met、Ile、Val;第168位处的
Xaa是Thr、Lys、Ala、Ser、Arg或Gly;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、
Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;
第179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa
是Met、Leu;Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第
183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn、Tyr、
Gln或Trp;第200位处的Xaa是Asn、Ser、Thr或Gln;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第
204位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly;第206位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第209
位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是
Asn、Arg、Gln或Lys;第221位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg;第222位处的Xaa是Thr、
Arg、Ser或Lys;第226位处的Xaa是Asp、Pro、Glu或Gln;第228位处的Xaa是Ser或
Gly;第229位处的Xaa是Lys、Asn、Arg或Gln;第231位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met;
第232位处的Xaa是Ala、Thr、Ser、Gly、Asp或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、
Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的
Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu;第254位处的Xaa是
Ser、Asn、Thr或Gln;第258位处的Xaa是Ser、Arg、Thr或Lys;第259位处的Xaa是Phe、
Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu;以及
第266位处的Xaa是Asp、Asn、Gln或Glu;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28
个氨基酸。
[0083] 62.实施例55的分离的PIP-1多肽,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段。
[0084] 63.实施例55的分离的PIP-1多肽,基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
[0085] 64.实施例55的分离的PIP-1多肽,其中所述PIP-1多肽由SEQ ID NO:1的多核苷酸编码。
[0086] 65.实施例46的分离的PIP-1多肽,具有选自如下的一个或多个特性:
[0087] a)如由SEQ ID NO:213的第64-79位表示的氨基酸基序;
[0088] b)如由SEQ ID NO:213的第149-159位表示的氨基酸基序;
[0089] c)如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序;
[0090] e)对于半翅目昆虫害虫的杀昆虫活性;
[0091] f)对于鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性;
[0092] g)口服活性;以及
[0093] h)约15kD至约35kD之间的计算分子量。
[0094] 66.一种能够表达实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的分离的PIP-1多肽的植物。
[0095] 67.实施例66的植物,其中所述植物是单子叶植物。
[0096] 68.实施例66的植物,其中所述植物是双子叶植物。
[0097] 69.实施例66的植物,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
[0098] 70.实施例66、67、68、69或70的植物,其中所述植物表达一种或多种另外的转基因性状。
[0099] 71.实施例70的植物,其中所述一种或多种另外的转基因性状选自昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度、增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、和抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
[0100] 72.一种组合物,包含杀昆虫有效量的实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的分离的PIP-1多肽。
[0101] 73.实施例72的组合物,还包含农业上适用的载体。
[0102] 74.实施例73的组合物,其中所述载体选自散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。
[0103] 75.实施例72、73或74的组合物,还包含一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。
[0104] 76.实施例75的组合物,其中所述一种或多种杀昆虫剂是杀虫蛋白。
[0105] 77.实施例76的组合物,其中所述一种或多种杀虫蛋白选自Cry1蛋白、Cry2蛋白、Cry3蛋白、Cry4蛋白、Cry5蛋白、Cry6蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry9蛋白、Cry15
蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry32蛋白、Cry34蛋白、Cry35蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋
白、Cry43蛋白、Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry55蛋白、Cry二元毒素、Cyt蛋白、VIP毒素、
SIP蛋白、杀昆虫脂肪酶、杀昆虫几丁质酶以及蛇毒蛋白。
[0106] 78.一种用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的分离的PIP-1多肽接触
[0107] 79.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的重组PIP-1多肽接触。
[0108] 80.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述抗性昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64或65的分离的PIP-1多肽接触。
[0109] 81.一种防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述群体与杀昆虫有效量的实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或
65的分离的PIP-1多肽接触,其中所述杀虫蛋白选自Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1Ac、
Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、Cry9c、eCry3.1Ab和CBI-Bt。
[0110] 82.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在植物或其细胞中表达实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的分离的PIP-1多肽。
[0111] 83.一种以登录号NRRLB-50613保藏的绿针假单胞菌菌株SS44C4的生物纯培养物。
[0112] 84.一种从绿针假单胞菌菌株分离具有杀昆虫活性的多肽的方法,包括
[0113] a)从细菌分离株获得蛋白细胞裂解物;
[0114] b)筛查蛋白细胞裂解物的杀昆虫活性;以及
[0115] c)从蛋白细胞裂解物分离杀昆虫蛋白。
[0116] 85.一种SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:6的多肽的分离的受体。
[0117] 86.实施例85的分离的受体,其中所述受体分离自半翅目。
[0118] 87.一种鉴定生物样品中的PIP-1多肽的方法,包括使所述生物样品与实施例85或86的受体接触。
[0119] 88.一种分离的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体特异性地结合实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的PIP-1多肽。
[0120] 89.一种检测生物样品中的PIP-1多肽的方法,包括使所述蛋白与实施例88的抗体接触。
[0121] 90.一种分离生物样品中的PIP-1多肽的方法,包括使所述蛋白与实施例88的抗体接触。
[0122] 91.一种防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并提供昆虫抗性治理的方法,包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。
[0123] 92.实施例91的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、
62、63、64或65的PIP-1多肽。
[0124] 93.实施例92的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
[0125] 94.一种降低鳞翅目和/或半翅目昆虫出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法,包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的实施例
46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的PIP-1A多肽,同时联合表达与PIP-1A多肽相比具有不同作用模式的昆虫物种的杀昆虫蛋白。
[0126] 95.一种有效的鳞翅目和/或半翅目昆虫抗性治理的方式,包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑制生长或杀
灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白包括实
施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的PIP-1多肽以及Cry蛋白。
[0127] 96.一种用于获得表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述昆
虫测定结合数据表明,在此类昆虫中,实施例46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、61、62、63、64或65的PIP-1多肽不与Cry蛋白的结合位点竞争。
[0128] 97.一种植物或其子代,包含SEQ ID NO:3的分离的核酸分子。
[0129] 98.一种用SEQ ID NO:3的分离的核酸分子稳定转化的植物或其子代。
[0130] 99.实施例97或98的植物或其子代,其中所述植物是单子叶植物。
[0131] 100.实施例97或98的植物或其子代,其中所述植物是双子叶植物。
[0132] 101.实施例97或98的植物或其子代,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草。
[0133] 102.实施例97、98、99、100或101的植物或其子代,还具有一种或多种另外的转基因性状。
[0134] 103.一种表达盒,包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:331的分离的核酸分子,其中所述核酸有效连接至引导SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:332的多
肽的表达的一个或多个调控序列
[0135] 104.一种植物,包含实施例103的表达盒。
[0136] 105.一种植物细胞,包含实施例103的表达盒。
[0137] 106.一种实施例97、98、99、100、101或102的植物的种子或谷粒,其中所述种子或谷粒包含SEQ ID NO:3的分离的核酸分子。
[0138] 107.实施例106的种子,其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
[0139] 108.一种用于在植物中表达杀昆虫蛋白的方法,包括
[0140] (a)在植物细胞中插入核酸序列,所述核酸序列在5′至3′方向上包含有效连接的重组双链DNA分子,其中所述重组双链DNA分子包含
[0141] (i)在植物细胞中起作用的启动子;
[0142] (ii)编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的蛋白的核酸分子;以及
[0143] (iii)在植物的细胞中起作用而使转录终止的3′非翻译多核苷酸;
[0144] (b)获得包含步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞;以及
[0145] (c)由所述转化的植物细胞产生能够表达SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的蛋白的植物。
[0146] 109.一种通过实施例108的方法产生的植物。
[0147] 110.实施例109的植物的种子或谷粒。
[0148] 111.实施例108的方法,其中所述植物还具有一种或多种另外的转基因性状。
[0149] 112.一种能够表达SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的分离的蛋白的植物。
[0150] 113.一种用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:4的分离的蛋白接触。
[0151] 114.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的分离的蛋白接触。
[0152] 115.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的分离的蛋白接触。
[0153] 116.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在植物或其细胞中表达SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的分离的杀昆虫蛋白。
[0154] 117.一种编码杀昆虫蛋白的分离的核酸分子,所述杀昆虫蛋白包括与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
[0155] 118.实施例117的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白是口服活性的。
[0156] 119.实施例117或118的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白具有对于半翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0157] 120.实施例119的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白具有对于蝽科昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0158] 121.实施例117、118、119或120的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白具有对于鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0159] 122.实施例117、118、119、120或121的分离的核酸分子,其中所述核酸分子由嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)菌株产生。
[0160] 123.实施例117的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白包含如由SEQ ID NO:6的第171-183位或SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
[0161] 124.实施例123的分离的核酸分子,其中所述杀昆虫蛋白还包含如由SEQ ID NO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第69-79位表示的任何一个或多个氨基酸基序。
[0162] 125.一种分离的杀昆虫蛋白,包括与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽。
[0163] 126.实施例125的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白是口服活性的。
[0164] 127.实施例125或126的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白具有对于半翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0165] 128.实施例127的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白具有对于蝽科昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0166] 129.实施例125、126、127或128的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白具有对于鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性。
[0167] 130.实施例125、126、127、128或129的分离的杀昆虫蛋白,其中所述核酸分子由嗜虫假单胞菌菌株产生。
[0168] 131.实施例125的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸基序。
[0169] 132.实施例131的分离的杀昆虫蛋白,其中所述杀昆虫蛋白还包含如由SEQ IDNO:213的第149-159位和SEQ ID NO:213的第69-79位表示的任何一个或多个氨基酸基
序。
[0170] 133.一种植物或其子代,包含实施例117、118、119、120、121、122、123或124的分离的核酸分子。
[0171] 134.一种用实施例117、118、119、120、121、122、123或124的分离的核酸分子稳定转化的植物或其子代。
[0172] 135.实施例133或134的植物或其子代,其中所述植物是单子叶植物。
[0173] 136.实施例133或134的植物或其子代,其中所述植物是双子叶植物。
[0174] 137.实施例133或134的植物或其子代,其中所述植物选自大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、草坪草、甘蔗、小麦、苜蓿、香蕉、西兰花、菜豆、卷心菜、卡诺拉油菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘、棉花、葫芦、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、烟草、观赏番茄、灌木、坚果、鹰嘴豆、木豆、粟、蛇麻子以及牧草植物细胞。
[0175] 138.实施例133、134、135、136或137的植物或其子代,还具有一种或多种另外的转基因性状。
[0176] 139.一种表达盒,包含实施例117、118、119、120、121、122、123或124的编码杀昆虫蛋白的分离的核酸分子,其中所述核酸有效连接至引导杀昆虫蛋白的表达的一个或多个调控序列。
[0177] 140.一种植物,包含实施例139的表达盒。
[0178] 141.一种植物细胞,包含实施例139的表达盒。
[0179] 142.实施例133、134、135、136、137或138的植物的种子或谷粒,其中所述种子或谷粒包含分离的核酸分子。
[0180] 143.实施例142的种子,其中已将一种或多种种子处理剂施加于所述种子。
[0181] 144.一种用于在植物中表达杀昆虫蛋白的方法,包括
[0182] (a)在植物细胞中插入核酸序列,所述核酸序列在5′至3′方向上包含有效连接的重组双链DNA分子,其中所述重组双链DNA分子包含
[0183] (i)在植物细胞中起作用的启动子;
[0184] (ii)编码实施例125、126、127、128、129、130、131或132的杀昆虫蛋白的核酸分子;以及
[0185] (iii)在植物的细胞中起作用而使转录终止的3′非翻译多核苷酸;
[0186] (b)获得包含步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞;以及
[0187] (c)由所述转化的植物细胞产生能够表达杀昆虫蛋白的植物。
[0188] 145.一种通过实施例144的方法产生的植物。
[0189] 146.实施例145的植物的种子或谷粒。
[0190] 147.实施例144的方法,其中所述植物还具有一种或多种另外的转基因性状。
[0191] 148.一种能够表达实施例125、126、127、128、129、130、131或132的分离的杀昆虫蛋白的植物。
[0192] 149.一种用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的实施例125、126、127、128、129、130、131或132的分离的杀昆虫蛋白接触。
[0193] 150.一种抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使所述昆虫害虫与杀昆虫有效量的实施例125、126、127、128、129、130、131或132的分离的杀昆虫蛋白接触。
[0194] 151.一种用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使所述昆虫害虫群体与杀虫有效量的实施例125、126、127、128、129、130、131或132的分离的蛋白接
触。
[0195] 152.一种用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在植物或其细胞中表达实施例125、126、127、128、129、130、131或132的分离的杀虫蛋白。
[0196] 153.一种防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并提供昆虫抗性治理的方法,包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白,其中所述
至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的实施例125、
126、127、128、129、130、131或132的杀昆虫蛋白。
[0197] 154.实施例153的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
[0198] 155.一种降低鳞翅目和/或半翅目昆虫物种出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法,包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的
实施例125、126、127、128、129、130、131或132的第一杀昆虫蛋白,同时联合表达与第一杀昆虫蛋白相比具有不同作用模式的对昆虫物种具有杀昆虫性的第二杀昆虫蛋白。
[0199] 156.一种有效的鳞翅目和/或半翅目昆虫抗性治理的方式,包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑制生长或杀
灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包
括实施例125、126、127、128、129、130、131或132的杀昆虫蛋白并且所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包括Cry蛋白。
[0200] 157.一种用于获得表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述
昆虫测定结合数据表明,在所述昆虫中,实施例125、126、127、128、129、130、131或132的杀昆虫蛋白不与Cry蛋白的结合位点竞争。
[0201] 158.一种防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并提供昆虫抗性治理的方法,包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白,其中所述
至少两种杀昆虫蛋白之一包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列,对鳞翅目和/或半翅目昆虫具
有杀昆虫性。
[0202] 159.实施例158的方法,其中所述至少两种杀昆虫蛋白之一包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的Cry蛋白。
[0203] 160.一种降低鳞翅目和/或半翅目昆虫物种出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法,包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的
SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的杀昆虫蛋白,同时联合表达与SEQ ID NO:4或SEQ ID
NO:332的蛋白相比具有不同作用模式的对昆虫物种具有杀昆虫性的杀昆虫蛋白。
[0204] 161.一种有效的鳞翅目和/或半翅目昆虫抗性治理的方式,包括以高水平在转基因植物中共表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑制生长或杀
灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包
括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的杀昆虫蛋白并且所述两种或更多种杀昆虫蛋白之一包
括Cry蛋白。
[0205] 162.一种用于获得表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述
昆虫测定结合数据表明,在所述昆虫中,SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的杀昆虫蛋白不与
Cry蛋白的结合位点竞争。
附图说明
[0206] 图1示出了PIP-1A(SEQ ID NO:2);活性杀昆虫蛋白直系同源物PSEEN3174(SEQID NO:6)和PIP-1B(SEQ ID NO:4);和非活性同源物AECFG_592740(SEQ ID NO:12);
Pput_1063(SEQ ID NO:8);和Pput_1064(SEQ ID NO:10)的比对。基序[SEQ ID NO:2的
第64-79位氨基酸(基序1)、SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸(基序2)、SEQ ID NO:
2的第171-183位氨基酸(基序3)和SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸(基序4)]在
PIP-1A序列中以粗体和下划线指示。所选β-折叠的预测二级结构用序列上方的“B”指
示。
[0207] 图2示出了使用简并寡核苷酸进行的一般性的拼接和拯救PCR诱变策略而在PIP-1A蛋白的多个位置处产生部分或完全饱和的氨基酸置换。
[0208] 图3A-3C示出了绿针假单胞菌菌株SS44C416S核糖体DNA(SEQ ID NO:216)与嗜虫假单胞菌L4816S核糖体DNA(SEQ ID NO:217)的比对,它们具有96.8%的同一性。序列
之间的差异以粗体和下划线指示。
[0209] 图4示出了在SEQ ID NO:2的第240-249位残基(基序4)处具有多个氨基酸置换的PIP-1A多肽变体的草盲蝽杀昆虫活性筛查的结果。杀昆虫活性以0至8进行评分,其
中8为最大活性。
[0210] 图5示出了PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PIP-1B(SEQ ID NO:4)、PIP-1C(SEQ ID NO:332)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)的序列比对。
[0211] 发明详述
[0212] 应当理解,本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、属和试剂,因为这些可有所变化。还应当理解,本文所用的术语是仅出于描述特定实施例的目的,而并非旨在限制本发明的范围。
[0213] 除非上下文另外明确规定,否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此,例如,提及“一个细胞”包括多个此类细胞,并且提及“该蛋白”包括提及一种或多种蛋白以及本领域技术人员已知的其等同物,等等。除非另外明确指明,否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相
同含义。
[0214] 本发明涉及用于防治害虫的组合物和方法。所述方法涉及用编码PIP-1多肽的核酸序列转化生物体。具体地讲,所述实施例的核酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和
微生物。因此,提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是细菌物种
的杀虫核酸和蛋白。所述核酸序列可用于构建表达载体以供后续转化进所关注的生物体,
用作分离其他同源(或部分同源)基因的探针,以及用于通过本领域已知的方法诸如定点
诱变、结构域交换或DNA改组产生改变的PIP-1多肽。PIP-1多肽可用于防治、抑制生长或
杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫害虫群体,以及用于产生具有杀虫活性的组合物。所关注的昆虫害虫包括但不限于椿象和其他相关昆虫的总科,包括但不限于属于
蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽、璧蝽、褐臭蝽、喜绿蝽、大豆褐椿、Euschistus tristigmus、喜绿蝽、Dichelops furcatus、Dichelops melacanthus和Bagrada hilaris(菘蝽))、龟蝽科(筛
豆龟蝽-豆圆蝽(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-根椿象)的物种,
以及鳞翅目物种,包括但不限于:菱纹背蛾,例如谷实夜蛾;大豆尺蠖,例如大豆尺夜蛾以
及黎豆毛虫,例如黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)。
[0215] 所谓“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”意指对于一种或多种害虫(包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目或线虫的成员)具有致毒活性的毒素,或与此类蛋白同源的蛋白。杀虫蛋白已从生物体分离,所述生物体包括例如芽孢杆菌属物种、假单胞菌属物种、发
光杆菌属物种(Photorhabdus sp.)、致病杆菌属物种(Xenorhabdus sp.)、双酶梭菌
(Clostridium bifermentans)以及日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀
虫蛋白包括但不限于:来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白,诸如PSEEN3174(Monalysin,
(2011)PLoS Pathogens,7:1-13(Monalysin,2011年,《公共科学图书馆病原学》,第7卷,第
1-13页));来自生防假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前的荧光
假 单 胞菌 )的 杀 昆 虫蛋 白 (Pechy-Tarr,(2008)Environmental Microbiology10:
2368-2386:GenBank Accession No.EU400157(Pechy-Tarr,2008年,《环境微生物学》,第
10卷,第2368-2386页,GenBank登录号EU400157));来自台湾假单胞菌(Pseudomonas
Taiwanensis) 的 杀 昆 虫 蛋 白 (Liu,et al.,(2010)J.Agric.Food Chem.58:
12343-12349(Liu等人,2010年,《农业与食品化学杂志》,第58卷,第12343-12349页))以
及来自类产假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcligenes)的杀昆虫蛋白(Zhang,et al.,
(2009)Annals of Microbiology 59:45-50(Zhang等人,2009年,《微生物学年报》,第59
卷,第45-50页)和Li,et al.,(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.89:159-168(Li等
人,2007年,《植物细胞、组织和器官培养》,第89卷,第159-168页));来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe,et al.,(2010)The Open Toxinology
Journal 3:101-118(Hinchliffe等人,2010年,《开放毒素学杂志》,第3卷,第101-118页)和Morgan,et al.,(2001)Applied and Envir.Micro.67:2062-2069(Morgan等人,2001
年,《应用与环境微生物学》,第67卷,第2062-2069页))、美国专利No.6,048,838和美国专利No.6,379,946;以及δ-内毒素,包括但不限于δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、
Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51和Cry55类别以及苏云金芽孢杆菌溶细胞Cyt1和Cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员包括但
不限于Cry1Aa1(登录号M11250)、Cry1Aa2(登录号M10917)、Cry1Aa3(登录号D00348)、
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EU121521)、Cry55Aa2(登录号AAE33526)。
[0216] δ-内毒素的例子还包括但不限于美国专利No.5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白;美国专利No.8,304,604和8,304,605的DIG-3或DIG-11毒素(Cry蛋白诸如Cry1A
的α-螺旋1和/或α-螺旋2变体的N端缺失);美国专利申请序列号10/525,318的
Cry1B;美国专利No.6,033,874的Cry1C;美国专利No.5,188,960、6,218,188的Cry1F;
美国专利No.7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体);Cry2蛋白,诸如
美国专利No.7,064,249的Cry2Ab蛋白);Cry3A蛋白,包括但不限于通过融合至少两种
不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白
(eHIP)(美国专利申请公布No.2010/0017914);Cry4蛋白;Cry5蛋白;Cry6蛋白;美国专
利 No.7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499 和 7,462,760的Cry8蛋白;Cry9蛋白,诸如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员;
Naimov,et al.,(2008)Applied and Environmental Microbiology74:7145-7151(Naimov 等人,2008年,《应用与环境微生物学》,第74卷,第7145-7151页)的Cry15蛋白;美国专利No.6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白;美国专利No.6,248,535、
6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107 和 7,504,229 的 CryET33 和 CryET34 蛋
白;美国专利公布No.2006/0191034、2012/0278954和PCT公布No.WO 2012/139004的
CryET33和CryET34同源物;美国专利No.6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1
蛋白;Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素;TIC901或相关毒素;US 2008/0295207的
TIC807;PCT US 2006/033867 的 ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128;
美国专利No.8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038;US7,923,602的AXMI-031、
AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049;WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021;WO
2005/038032的AXMI-010;WO 2005/021585的AXMI-003;US 2004/0250311的AXMI-008;US
2004/0216186的AXMI-006;US 2004/0210965的AXMI-007;US 2004/0210964的AXMI-009;
US 2004/0197917 的 AXMI-014;US 2004/0197916 的 AXMI-004;WO 2006/119457 的
AXMI-028和AXMI-029;WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、
AXMI-014和AXMI-004;美国专利No.8,084,416的AXMI-150;US20110023184的AXMI-205;
US 2011/0263488 的 AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、
AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063
和AXMI-064;US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白;WO 2011/103248的AXMI221Z、
AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z;WO11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、
AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231;美国专利No.8,334,431的
AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163 和 AXMI-184;US 2010/0298211 的 AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045;US20090144852的AXMI-066和AXMI-076;美国
专利No.8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189;
US 2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、
AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137;美国专利
No.8,319,019的Cry蛋白,诸如具有经修饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A;以及美国专
利申请公布No.2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和
Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见,lifesci.sussex.ac.uk/
home/Neil_Crickmore/Bt/(可使用“www”前缀在万维网访问)的Crickmore,et al.,
“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”(2011)(Crickmore等人,“苏云金芽孢杆菌毒素命名”,2011年))。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述,参见
van Frannkenhuyzen,(2009)J.Invert.Path.101:1-16(van Frannkenhuyzen,2009年,《无脊椎动物病理学杂志》,第101卷,第1-16页))。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领
域技术人员熟知的,并且包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的Cry转基因植物已取得监管批准(参见,Sanahuja,(2011)
Plant Biotech Journal9:283-300(Sanahuja,2011年,《植物生物技术杂志》,第9卷,第
283-300页)和cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database(可使用“www”
前缀在万维网上访问)的CERA(2010)GM Crop Database Center for Environmental Risk
Assessment(CERA),ILSI Research Foundation,Washington D.C.(CERA(2010)转基因作
数据库,环境风险评估中心(CERA),国际生命科学学院研究基金,华盛顿))。本领域技术
人员熟知的不止一种杀虫蛋白也可在植物中表达,诸如Vip3Ab&Cry1Fa(US2012/0317682)、
Cry1BE&Cry1F(US2012/0311746)、Cry1CA&Cry1AB(US2012/0311745)、
Cry1F&CryCa(US2012/0317681)、Cry1DA&Cry1BE(US2012/0331590)、
Cry1DA&Cry1Fa(US2012/0331589)、Cry1AB&Cry1BE(US2012/0324606)、 以 及
Cry1Fa&Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US2012/0324605)。杀虫蛋白还包括杀昆虫脂肪酶,包括
美国专利No.7,491,869的脂酰基水解酶和诸如来自链霉菌属(Streptomyces)的胆固醇
化酶(Purcell et al.(1993)Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413(Purcell等
人,1993年,《生物化学与生物物理研究通讯》,第15卷,第1406-1413页))。杀虫蛋白还
包括美国专利No.5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020
的VIP(植物性杀昆虫蛋白)毒素等等。其他VIP蛋白是本领域技术人员熟知的(参见,
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html(可使用“www”前缀在万维网
上访问))。杀虫蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白,可得自诸如致病杆菌属、发光杆菌属和
类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的生物体(参见,美国专利No.7,491,698和8,084,418)。
一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性,并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立
毒素的活性。“独立”TC蛋白(来自例如发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒
性可通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强。有三种主要
类型的TC蛋白。如本文所提及的,A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白
B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强A类蛋白的毒性。A类蛋白的例子是TcbA、TcdA、XptA1
和XptA2。B类蛋白的例子是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的例子是TccC、
XptC1Xb和XptB1Wi。杀虫蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于
lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利No.8,334,366)。
[0217] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含从本文所公开的全长核酸序列推断出的氨基酸序列以及因使用替代的下游起始位点或因产生具有杀虫活性的较短蛋白的加工而短于全
长序列的氨基酸序列。加工可在蛋白表达后在生物体中进行或在蛋白摄食后在害虫中进
行。
[0218] 因此,本文提供了编码赋予杀虫活性的多肽的新型的分离的或重组的核酸序列。还提供了PIP-1多肽的氨基酸序列。由这些PIP-1多肽基因翻译所得的蛋白允许细胞防治
或杀灭对其摄食的害虫。
[0219] 细菌菌株
[0220] 本发明的一个方面涉及能够表达PIP-1多肽的细菌菌株。在一些实施例中,所述细菌菌株是绿针假单胞菌菌株。在一些实施例中,所述细菌菌株是绿针假单胞菌菌株
SS44C4的生物纯培养物,其以登录号NRRLB-50613于2011年12月1日保藏于农业研究菌种
保藏中心(NRRL),1815North University Street,Peoria,Illinois 61604(伊利诺州皮奥
里亚北方大学街道1815号,邮编61604)(nrrl.ncaur.usda.gov,可使用“www”前缀在万维
网上访问)。该保藏物将按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款维
持。这些保藏物仅为便利于本领域技术人员而保存,并非承认保藏物是在35 U.S.C.§112
下所要求的。在本申请待决期间,专利商标局首长和当请求时由该首长决定授权的人可以
取得这种保藏物。在本申请的任何权利要求被授权后,申请人将依照37 C.F.R.§1.808
使农业研究菌种保藏中心(NRRL),1815 North University Street,Peoria,Illinois
61604(伊利诺州皮奥里亚北方大学街道1815号,邮编61604)的保藏物的样品可供公众获
取。该保藏物将在作为一家公共保藏单位的NRRL保藏单位维持30年时间,或在最近请求
后5年,或持续至本专利的有效期限,选其长者,并且如果在这个时间期间它变得无活力的
话将予以更换。一旦专利授权,该保藏物将不可撤回地和无限制或者无条件地可供公众获
取。另外,申请人已经满足37 C.F.R.§§1,801-1,809的全部要求,包括提供该样品在保
藏时有活力的指示。申请人没有权力放弃法律对生物材料转移或其商业运输所规定的任何
限制。申请人不豁免对他们在本专利下被授予的权利的任何侵犯。但是,应当理解,保藏物
的可获取性不构成许可在损害政府法令所授予的专利权的情况下实施本发明。
[0221] 在一些实施例中,所述细菌菌株是具有16S核糖体DNA的绿针假单胞菌菌株的生物纯培养物,所述16S核糖体DNA与SEQ ID NO:216相比具有至少约96.9%、97%、97.1%、
97.2%、97.3%、97.4%、97.5%、97.6%、97.7%、97.8%、97.9%、98%、98.1%、98.2%、
98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、
99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的序列同一性。
[0222] 核酸分子及其变体和片段
[0223] 本发明的另一个方面涉及包含编码PIP-1多肽和多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离的或重组的核酸分子,以及足以用作鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白的核
酸分子的杂交探针的核酸分子。如本文所用,术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例如,
重组DNA、cDNA、基因组DNA、质体DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如,mRNA)以及使用核苷
酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的,但优选的是双链
DNA。
[0224] “分离的”核酸分子(或DNA)在本文用来指不再处于其天然环境中,例如处于体外的核酸序列(或DNA)。“重组的”核酸分子(或DNA)在本文用来指处于重组细菌或植物宿
主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中,“分离的”或“重组的”核酸不含在该核
酸的来源生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′
端的序列)(优选蛋白质编码序列)。出于本发明的目的,“分离的”或“重组的”在用来指
核酸分子时排除分离的染色体。例如,在各种实施例中,编码PIP-1多肽的重组核酸分子可
含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中
天然处于该核酸分子的旁侧的核酸序列。
[0225] 在一些实施例中,与天然或基因组核酸序列相比,编码PIP-1多肽的分离的核酸分子在核酸序列中具有一个或多个改变。在一些实施例中,天然或基因组核酸序列中的改
变包括但不限于:因遗传密码简并性而导致的核酸序列中的改变;与天然或基因组序列相
比,因氨基酸置换、插入、缺失和/或添加而导致的核酸序列中的改变;一个或多个内含子
的移除;一个或多个上游或下游调控区的缺失;以及与基因组核酸序列相关联的5’和/或
3’非翻译区的缺失。在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是非基因组序列。
[0226] 设想了编码PIP-1多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。此类多核苷酸在有效连接至合适的启动子、转录终止和/或多聚腺苷酸化序列时可用于在宿主细胞中产生PIP-1多肽。
此类多核苷酸也可用作分离编码PIP-1多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸
的探针。
[0227] 编码PIP-1多肽或相关蛋白的一种多核苷酸来源是绿针假单胞菌菌株,该菌株含有编码SEQ ID NO:2的PIP-1A多肽的SEQ ID NO:1的PIP-1A多核苷酸。该多核苷酸序
列分离自绿针假单胞菌宿主并且因此适用于在其他细菌宿主中表达编码的PIP-1A多肽。
例如,SEQ ID NO:1可用来在包括但不限于如下的细菌宿主中表达PIP-1A蛋白:农杆菌属
(Agrobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、沙
门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属和根瘤菌属细菌宿主细胞。所述多核苷酸也可用作分
离编码PIP-1多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。此类探针可用来鉴
定来源于假单胞菌或其他细菌菌株的同源或基本上同源的多核苷酸。
[0228] 编码PIP-1多肽的多核苷酸也可根据PIP-1多肽序列从头合成。可通过使用遗传密码从PIP-1多肽序列推断出多核苷酸基因的序列。计算机程序诸如
TM
“BackTranslate”(GCG 软件包,加利福尼亚州圣地亚哥的阿赛乐德公司(Acclerys,Inc.
San Diego,Calif.))可用来将肽序列转换为编码该肽的相应核苷酸序列。可用来获得相应
核苷酸编码序列的PIP-1多肽序列的例子包括但不限于SEQ ID NO:2的PIP-1多肽序列。
此外,本发明的合成PIP-1多核苷酸序列可被设计成使得它们将在植物中表达。美国专利
No.5,500,365描述了用于合成植物基因以改善由该合成基因编码的蛋白的表达水平的方
法。该方法涉及对外源转基因的结构基因序列进行修饰,使其被植物更有效地转录、加工、
翻译和表达。在植物中充分表达的基因的特征包括消除可引起基因转录物的编码区中非期
望的内含子剪接或多聚腺苷酸化的序列,同时基本上保留杀昆虫蛋白的毒性部分的氨基酸
序列。用于获得单子叶植物中转基因的增强表达的类似方法在美国专利No.5,689,052中
有所公开。
[0229] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:331示出的序列的多核苷酸以及其变体、片段和互补序列。所谓“互补序
列”意指与给定的核酸序列充分地互补使得其可杂交至该给定的核酸序列从而形成稳定双
链的核酸序列。在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有以SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:3或SEQ ID NO:331示出的序列的核酸分子。由这些核酸序列编码的杀昆虫蛋白的
相应氨基酸序列以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:332示出。
[0230] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸,所述多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有
至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有杀虫活性。在一些实施例中,编码PIP-1
多肽的核酸分子是具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸,所述多肽包含与SEQ ID NO:2
的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有杀虫活性。在一些实
施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸,所述多肽
包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有
杀虫活性。在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有编码多肽的核苷酸序列的
多核苷酸,所述多肽包含与SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序
列,其中所述多肽具有杀虫活性。
[0231] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用,“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”是指与天然或基因组核酸序列相比在核酸序
列中具有一个或多个改变的核酸分子。在一些实施例中,天然或基因组核酸分子的改变包
括但不限于:因遗传密码简并性而导致的核酸序列中的改变;为在植物中表达而对核酸序
列进行的密码子优化;与天然或基因组序列相比,为了引入至少一个氨基酸置换、插入、缺
失和/或添加而发生的核酸序列中的改变;一个或多个与基因组核酸序列相关联的内含子
的移除;一个或多个异源内含子的插入;一个或多个与基因组核酸序列相关联的上游或下
游调控区的缺失;一个或多个异源上游或下游调控区的插入;与基因组核酸序列相关联的
5’和/或3’非翻译区的缺失;异源5’和/或3’非翻译区的插入;以及多聚腺苷酸化位点
的修饰。在一些实施例中,非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中,非基因组核酸分子
是合成核酸序列。
[0232] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述PIP-1多肽具有与SEQ ID NO:2相
比的至少一个氨基酸改变并且所述PIP-1多肽具有杀虫活性。
[0233] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述PIP-1多肽具有与SEQ ID NO:4相
比的至少一个氨基酸改变并且所述PIP-1多肽具有杀虫活性。
[0234] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,其包含与SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述PIP-1多肽具有与SEQ ID NO:
332相比的至少一个氨基酸改变并且所述PIP-1多肽具有杀虫活性。
[0235] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,具有1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60或61个氨基酸置换。
[0236] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列,与SEQ ID NO:4的相应位置处的天然氨基酸相比,具有1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60或61个氨基酸置换。
[0237] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽包含SEQ IDNO:332的氨基酸序列,与SEQ ID NO:332的相应位置处的天然氨基酸相比,具有1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60或61个氨基酸置换。
[0238] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽包含SEQ IDNO:211的氨基酸序列,与SEQ ID NO:211的相应位置处的天然氨基酸相比,在由Xaa表示的
位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
[0239] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽包含SEQ IDNO:212的氨基酸序列,与SEQ ID NO:212的相应位置处的天然氨基酸相比,在由Xaa表示的
位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
[0240] 在一些实施例中,非基因组核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽包含SEQ IDNO:213的氨基酸序列,与SEQ ID NO:213的相应位置处的天然氨基酸相比,在由Xaa表示的
位置处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
[0241] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有编码包含(SEQ ID NO:211)的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第8位
处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu
或Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位
处的Xaa是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;
第27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是
Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第
42位处的Xaa是Phe或Tyr;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly
或Asp;第49位处的Xaa是Phe或Tyr;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位处的Xaa
是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第77位处
的Xaa是Phe或Tyr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第
105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln
或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处
的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第
127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa
是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第
142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、
Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160
位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp
或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的
Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第174位处的Xaa是Ile、Val或
Met;第175位处的Xaa是Val或Ile;第180位处的Xaa是Met或Leu;第191位处的Xaa
是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第200位处的Xaa是Asn或Ser;第203位
处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位处的Xaa是Gly或Asp;
第209位处的Xaa是Leu或Val;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser
或Lys;第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位
处的Xaa是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;
第232位处的Xaa是Ala、Thr或Glu;以及第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位
处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第265位处的Xaa是Asn或Asp;
以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28个氨
基酸。
[0242] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO:212序列的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第3
位处的Xaa是Ile或Thr;第6位处的Xaa是Glu或Gly;第8位处的Xaa是Ser、Gly或
Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;第21位处的Xaa
是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa是Gln或Ala;
第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处的Xaa是Leu、
Thr或Ala;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;第36位处
的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第42位处的Xaa是Phe或
Tyr;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly或Asp;
第49位处的Xaa是Phe、Tyr或Leu;第53位处的Xaa是Ser或Gly;第58位处的Xaa是
Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是Gln或Lys;第66位处的
Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第89
位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位
处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;
第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa
是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;
第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa
是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位
处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或
Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的
Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;
第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是
Thr、Lys或Ala;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178
位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第179位处的Xaa
是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu、Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第183位处的Xaa是
Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn或Tyr;第200位处的Xaa
是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位
处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;
第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;第222位处的Xaa是Thr
或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa是Ser或Gly;第229位
处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位处的Xaa是Ala、Thr或
Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;
第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第259位处的
Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn或Asp;以
及第266位处的Xaa是Asp或Asn;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28个氨基
酸。
[0243] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸分子是具有编码包含SEQ ID NO:213序列的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸,其中第2位处的Xaa是Pro、Thr或Ser;
第3位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser;第6位处的Xaa是Glu、Gly、Asp或Ala;
第8位处的Xaa是Ser、Gly、Asn、Thr或Gln;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位
处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第21位处的Xaa是Lys、Ser、Asn、Arg、Thr或Gln;第22
位处的Xaa是Ser、Lys、Arg或Thr;第24位处的Xaa是Gln、Gly、Asn或Ala;第25位处的
Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第27位处的Xaa是Leu、Thr、
Ala、Ser、Ile、Val或Met;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala、Ile、Leu、Val或Met;第35位处的
Xaa是Phe、Leu、Ile、Val或Met;第36位处的Xaa是Ala、Ser、Thr、Val、Ile或Leu;第38
位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第42位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly、
Asp、Ala或Glu;第49位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第53位处的Xaa
是Ser、Gly、Ala或Thr;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala、Ser、Gly
或Thr;第63位处的Xaa是Gln、Lys、Asn或Arg;第66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、
Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第89
位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met、Val、Leu或Ile;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;
第107位处的Xaa是Thr、Ile、Ser、Leu或Val;第108位处的Xaa是Gln、Thr、Ser或Asn;
第110位处的Xaa是Arg、Leu、Lys、Ile、Val或Met;第120位处的Xaa是Lys、Arg、Gln或
Asn;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr、Glu、Ser或Asp;第125位
处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Lys、Ser或Arg;
第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Gln、Arg或Lys;第
137位处的Xaa是Asp、Gly、Glu或Ala;第141位处的Xaa是Val、Ile或Leu;第142位处
的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、
Thr、Val、Leu、Met或Ser;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg、
Ser、Gln、Lys或Thr;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;
第163位处的Xaa是Asn、Asp、Glu或Gln;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的
Xaa是Gln、Glu、Asp或Asn;第167位处的Xaa是Leu、Met、Ile、Val;第168位处的Xaa是
Thr、Lys、Ala、Ser、Arg或Gly;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、Ile、Met
或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、A1a、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第
179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是
Met、Leu;Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或His;第
183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn、Tyr、
Gln或Trp;第200位处的Xaa是Asn、Ser、Thr或Gln;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第
204位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly;第206位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第209
位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第213位处的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是
Asn、Arg、Gln或Lys;第221位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg;第222位处的Xaa是Thr、
Arg、Ser或Lys;第226位处的Xaa是Asp、Pro、Glu或Gln;第228位处的Xaa是Ser或
Gly;第229位处的Xaa是Lys、Asn、Arg或Gln;第231位处的Xaa是Ile、Val、Leu或Met;
第232位处的Xaa是Ala、Thr、Ser、Gly、Asp或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、
Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的
Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pr0、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu;第254位处的Xaa是
Ser、Asn、Thr或Gln;第258位处的Xaa是Ser、Arg、Thr或Lys;第259位处的Xaa是Phe、
Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn、Asp、Gln或Glu;以及
第266位处的Xaa是Asp、Asn、Gln或Glu;并且其中任选地从所述多肽的N端缺失1至28
个氨基酸。
[0244] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽具有编码包含选自如下的一个或多个氨基酸基序的多肽的核苷酸序列:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基
酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:212的第64-79位氨基酸、或SEQ ID
NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第
149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159
位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183位氨基
酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基酸,以
及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第240-249位氨基酸、SEQ
ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249位氨基酸。在一些实
施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,所述PIP-1多肽具有编码包含如由SEQ ID NO:213
的第171-183位表示的氨基酸的多肽的核苷酸序列,其中SEQ ID NO:213的第171-183位
处的至少一个氨基酸不与SEQ ID NO:6的第171-183位处的氨基酸相同。
[0245] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:4示出的氨基酸序列具有至
少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%或更大的同一性的氨基酸序列,并且其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第
64-79位氨基酸、SEQ ID NO:212的第64-79位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第64-79位氨
基酸,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸,iii)SEQ ID
NO:2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:212的第
171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基酸,以及iv)SEQ ID NO:2的第
240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:212的第240-249
位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249位氨基酸。
[0246] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:4示出的氨基酸序列具有至少
80%同一性的氨基酸序列,并且其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:i)
SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:212的
第64-79位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID NO:2的第149-159
位氨基酸、SEQ ID NO:211的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基
酸、或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、
SEQ ID NO:211的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或SEQ ID
NO:213的第171-183位氨基酸,以及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:
211的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的
第240-249位氨基酸。
[0247] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的同一性的氨基酸序列,并且其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:
i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:
212的第64-79位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID NO:2的第
149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159
位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨
基酸、SEQ ID NO:211的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或
SEQ ID NO:213的第171-183位氨基酸,以及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ
ID NO:211的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:
213的第240-249位氨基酸。
[0248] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且
其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基
酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:212的第64-79位氨基酸、或SEQ ID
NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第
149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159
位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183位氨基
酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基酸,以
及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第240-249位氨基酸、SEQ
ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249位氨基酸。
[0249] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的同一性的氨基酸序列,并且其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:
i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID
NO:2的第149-159位氨基酸或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2
的第171-183位氨基酸或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基酸,以及iv)SEQ ID NO:2的
第240-249位氨基酸或SEQ ID NO:213的第240-249位氨基酸。
[0250] 在一些实施例中,所述核酸分子编码PIP-1多肽,具有编码多肽的核苷酸序列,所述多肽包含与以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且
其中所述多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基
酸或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸或SEQ
ID NO:213的第149-159位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸或SEQ ID NO:
213的第171-183位氨基酸,以及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸或SEQ ID NO:
213的第240-249位氨基酸。
[0251] 在一些实施例中,示例性核酸分子编码SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、
126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、
145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、249、
250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、
269、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、
316、317、318、319、320、321、322、323、324和325的PIP-1多肽以及氨基酸置换、氨基酸缺失、氨基酸插入和其片段以及它们的组合。
[0252] 在一些实施例中,示例性核酸分子编码SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、
126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、
145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、249、
250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268和
269的PIP-1多肽以及氨基酸置换、缺失、插入和其片段以及它们的组合。
[0253] 在一些实施例中,示例性核酸分子包含以SEQ ID NO:152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、188、189、190、191、192、193、194、195、
196、197、198、199、200、201、202、203、205、207、220、221、222、223、224、225、226、227、228、
229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、270、271、272、
273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、
292、293、294、295、296和297示出的序列以及其编码PIP-1多肽的变体和片段。
[0254] 在一些实施例中,示例性核酸分子包含以SEQ ID NO:152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、188、189、190、191、192、193、194、195、
196、197、198、199、200、201、202、203、205、207、220、221、222、223、224、225、226、227、228、
229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243和244示出的序列以及其编码PIP-1多肽的变体和片段。
[0255] 在一些实施例中,所述核酸分子编码表7、表9、表12、表15、表16、表17和/或表19的PIP-1多肽、其氨基酸置换以及其缺失和/或插入的组合。
[0256] 还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子,所述转录和/或翻译产物随后被剪接而最终产生功能性PIP-1多肽。剪接可在体外或体内完成,并且可涉及顺式或反式剪
接。供剪接的底物可以是多核苷酸(例如,RNA转录物)或多肽。多核苷酸顺式剪接的例
子是将插入编码序列中的内含子移除并且将两个旁侧外显子区剪接而产生PIP-1多肽编
码序列的情形。反式剪接的例子将是通过如下方式加密多核苷酸的情形:将编码序列分成
两个或更多个片段,所述两个或更多个片段可单独地转录,然后剪接而形成全长杀虫编码
序列。可引入构建体中的剪接增强子序列的使用可有利于多肽顺式或反式剪接方式的剪接
(美国专利No.6,365,377和6,531,316)。因此,在一些实施例中,所述多核苷酸不直接编码
全长PIP-1多肽,而是编码PIP-1多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及
剪接的机制来表达功能性PIP-1多肽,其中剪接可在多核苷酸(例如,内含子/外显子)和
/或多肽(例如,内含肽/外显肽)水平发生。这可用于例如控制杀虫活性的表达,因为功
能性杀虫多肽将仅在如下情况下表达:所有必需的片段在容许剪接过程产生功能性产物的
环境中表达。又如,在多核苷酸中引入一个或多个插入序列可有利于与低同源性多核苷酸
的重组;插入序列使用内含子或内含肽有利于移除间插序列,从而恢复所编码变体的功能。
[0257] 作为这些编码PIP-1多肽的核酸序列的片段的核酸分子也被所述实施例涵盖。所谓“片段”意指编码PIP-1多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码PIP-1多
肽的生物活性部分,或可以是在使用下文所公开的方法时可用作杂交探针或PCR引物的片
段。作为编码PIP-1多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、
500、600或700个连续核苷酸或最多至存在于编码本文所公开的PIP-1多肽的全长核酸序
列中的核苷酸的数量,具体取决于预期应用。所谓“连续”核苷酸意指彼此紧邻的核苷酸残
基。所述实施例的核酸序列的片段将编码保留PIP-1多肽的生物活性并从而保留杀昆虫活
性的蛋白片段。如本文所用,术语“杀虫活性”是指某生物体或物质(例如蛋白质)的可以
通过害虫在取食和暴露达适当时长后害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫排斥性和害虫其他
行为和身体的变化(但不限于通过这些方面)进行测量的活性。因此,具有杀虫活性的生物
体或物质不利地影响害虫适合度的至少一个可测量参数。例如,“杀虫蛋白”是本身显示杀
虫活性或者与其他蛋白质组合而显示杀虫活性的蛋白质。如本文所用,术语“杀昆虫活性”
是指某生物体或物质(例如蛋白质)的可以通过昆虫在取食和暴露达适当时长后昆虫死亡
率、昆虫体重减轻、昆虫排斥性和昆虫其他行为和身体的变化(但不限于通过这些方面)进
行测量的活性。因此,具有杀昆虫活性的生物体或物质不利地影响昆虫适合度的至少一个
可测量参数。例如,“杀昆虫蛋白”是本身显示杀昆虫活性或者与其他蛋白质组合而显示杀
昆虫活性的蛋白质。
[0258] 如本文所用,术语“杀虫有效量”表示某物质或者生物体的当在害虫的环境中存在时具有杀虫活性的量。对于每种物质或者生物体,杀虫有效量是针对在指定环境中受影响
的每种害虫凭经验确定。类似地,当害虫是昆虫害虫时,“杀昆虫有效量”可用来指“杀虫有效量”。
[0259] 所谓“保留活性”意指与全长PIP-1A多肽(SEQ ID NO:2)相比,PIP-1A多肽具有至少约10%、至少约30%、至少约50%、至少约70%、80%、90%、95%或更高的杀昆虫活
性。在一个实施例中,杀昆虫活性是对于鳞翅目物种而言的。在另一个实施例中,杀昆虫活
性是对于半翅目物种而言的。
[0260] 在一些实施例中,编码PIP-1多肽的核酸序列的编码蛋白生物活性部分的片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸或最多至存在于所述实施例的全长PIP-1多肽中的氨基酸的总数。在一些实施例中,所述片段是例如通过
蛋白水解、起始密码子的插入、编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随终止密码子的插
入或者通过终止密码子在编码序列中的插入,相对于SEQ ID NO:2、3或4或其变体的至少
约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个氨基酸的N端或C端截短。在一些实施例中,本文所涵盖的片段是例如通过蛋白水解或者通过编码序列
中起始密码子的插入,相对于SEQ ID NO:2、3或4或其变体的N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或更多个氨基酸的移除所产生的。
[0261] 在一些实施例中,PIP-1多肽是由与SEQ ID NO:1、3或5的核酸序列充分相同的核酸序列所编码的。所谓“充分相同”意指使用本文所述的比对程序之一使用标准参数与参
考序列进行比较时氨基酸或核酸序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。在一些实施例中,序列同源性同一性是针对编码PIP-1多肽的多核苷酸的全长序列或针对PIP-1多肽的全长序列而言的。在一些实施例
中,PIP-1多肽具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:6相比至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。本领域技术人员将会认识到,可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调
整这些值以确定两条核酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。为了确定两条氨基酸序列或
两条核酸的同一性百分比,对序列进行了最佳比较目的的比对。这两条序列之间的同一性
百分比是序列所共有的相同位置的数量的函数(即,同一性百分比=相同位置的数量/位
置(例如,重叠的位置)的总数×100)。在一个实施例中,这两条序列长度相同。在另一
个实施例中,所述比较跨越参考序列整体(例如,跨越SEQ ID NO:1、331或3整体或者跨越
SEQ ID NO:2、332或4之一的整体)进行。两条序列之间的同一性百分比可使用类似于下
文所述的那些的技术在允许或不允许空位的情况下确定。在计算同一性百分比中,通常对
准确的匹配进行计数。
[0262] 可以使用数学算法完成两条序列之间同一性百分比的确定。用于比较两条序列的数学算法的非限制性例子是Karlin and Altschul,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:
2264(Karlin和Altschul,1990年,《美国国家科学院院刊》,第87卷,第2264页)的算法,
其在Karlin and Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(Karlin和
Altschul,1993年,《美国国家科学院院刊》,第90卷,第5873-5877页)中作了修正。此类
算法并入了Altschul,et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403(Altschul等人,1990年,《分
子生物学杂志》,第215卷,第403页)的BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸搜索可以
用BLASTN程序、得分=100、字长=12来进行,以获得与杀虫样核酸分子同源的核酸序列。
BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分=50、字长=3来进行,以获得与杀虫蛋白分
子同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对,可如Altschul et al.(1997)
Nucleic Acids Res.25:,3389(Altschul等人,1997年,《核酸研究》,第25卷,第3389页)中所描述采用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者,可使用PSI-Blast来进行迭代
索,该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul等人,(1997)(出处同上)。当采用
BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时,可使用各个程序(例如,BLASTX和BLASTN)的
默认参数。还可以以手动方式通过检查来进行比对。
[0263] 用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是ClustalW算法(Higgins,etal.,(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680(Higgins等人,1994年,《核酸研究》,第22卷,第4673-4680页))。ClustalW对序列进行比较并对氨基酸或DNA序列整体进行比对,
从而可提供整条氨基酸序列的序列保守性相关的数据。ClustalW算法用于若干可商购获
得的DNA/氨基酸分析软件包,诸如Vector NTI程序包(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰
公司(Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif.))的ALIGNX模块。在用ClustalW对
氨基酸序列进行比对之后,可评估氨基酸同一性百分比。可用于ClustalW比对的分析的软
TM TM
件程序的非限制性例子是GENEDOC 。GENEDOC (Karl Nicholas)允许评估多个蛋白质之
间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子
是Myers and Miller,(1988)CABIOS 4:11-17(Myers和Miller,1988年,《计算机在生物
科学中的应用》,第4卷,第11-17页)的算法。此类算法并入了ALIGN程序(版本2.0),其
是GCG Wisconsin Genetics软件包版本10(得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路
9685号的Accelrys公司(Accelrys,Inc.,9685Scranton Rd.,San Diego,Calif.,USA))的一部分。当采用ALIGN程序比较氨基酸序列时,可使用PAM120加权残基表(weight residue
table)、空位长度罚分12和空位罚分4。
[0264] 用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Needleman and Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453(Needleman和Wunsch,1970年,《分子生物学杂志》,第
48卷,第3期,第443-453页)的算法,其使用GAP版本10软件利用下列默认参数确定序
列同一性或相似性:核酸序列的同一性%和相似性%使用GAP权重50和长度权重3以及
nwsgapdna.cmpii打分矩阵;氨基酸序列的同一性%或相似性%使用GAP权重8和长度权
重2以及BLOSUM62打分程序。也可使用等同程序。所谓“等同程序”意指任何这样的序列
比较程序,其对于任何两条所考虑的序列,相比于GAP版本10所产生的相应的比对,能产生
出具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。
[0265] 所述实施例还涵盖编码PIP-1多肽的变体的核酸分子。PIP-1多肽编码核酸序列的“变体”包括编码本文公开的PIP-1多肽但由于遗传密码的简并性而保守地差异的那些
序列以及与上文所讨论充分相同的那些序列。天然存在的等位基因变体可用公知的分子生
物学技术进行鉴定,诸如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体核酸
序列也包括合成而得的核酸序列,其例如通过使用定点诱变而产生,但仍然编码所公开的
PIP-1多肽,如下文所讨论。
[0266] 本发明提供编码任何本文所公开的PIP-1多肽的分离的或重组的多核苷酸。本领域普通技术人员将易于理解,由于遗传密码的简并性,存在大量编码本发明PIP-1多肽
的核苷酸序列。表1是提供每个氨基酸的同义密码子的密码子表。例如,密码子AGA、AGG、
CGA、CGC、CGG和CGU全部都编码氨基酸精氨酸。因此,在本发明核酸中由某密码子指定为
精氨酸的每个位置处,该密码子可更改为上述任何相应的密码子,而不改变所编码的多肽。
应当理解,RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。
[0267] 表1
[0268]丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU
半胱氨酸 Cys C UGC UGU
天冬氨酸 Asp D GAC GAU
谷氨酸 Glu E GAA GAG
苯丙氨酸 Phe F UUC UUU
[0269]甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU
组氨酸 His H CAC CAU
异亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU
赖氨酸 Lys K AAA AAG
亮氨酸 Leu L UUAUUG CUA CUC CUG CUU
甲硫氨酸 Met M AUG
天冬酰胺 Asn N AAC AAU
脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU
谷氨酰胺 Gln Q CAA CAG
精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG GU
丝氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
苏氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU
缬氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU
色氨酸 Trp W UGG
酪氨酸 Tyr Y UAC UAU
[0270] 技术人员还将理解,可通过核酸序列的突变引入变化,从而引起所编码的PIP-1多肽的氨基酸序列的变化,而不改变蛋白的生物活性。因此,可通过将一个或多个核苷酸置
换、添加或缺失引入本文所公开的相应核酸序列中来形成变体核酸分子,使得一个或多个
氨基酸置换、添加或缺失被引入所编码的蛋白中。可通过标准技术,诸如定点诱变和PCR介
导的诱变来引入突变。此类变体核酸序列也被本发明涵盖。
[0271] 或者,可通过沿着所有或部分的编码序列随机地引入突变,诸如通过饱和诱变来制得变体核酸序列,并且可筛查所得突变体赋予杀虫活性的能力以鉴定保留活性的突变
体。诱变后,可以重组方式表达所编码的蛋白,并且可使用标准测定法技术确定该蛋白的活
性。
[0272] 除如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法以外,本发明的多核苷酸及其片段任选地用作多种重组和递归重组反应的底物,即,为了产生具有所需特性的额外
杀虫多肽同源物及其片段。多种此类反应是已知的,包括发明人及其同事开发的那些。用
于产生本文所列任何核酸的变体的方法包括将此类多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递
归重组,从而形成变体多核苷酸的文库,所述方法也是本发明的实施例,所产生的文库、包
含所述文库的细胞以及由此类方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外,此类方法任
选地包括当此类递归重组在体外或体内完成时,基于杀虫活性从此类文库选择变体多核苷
酸。
[0273] 多种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)可供使用并且已在本领域中充分描述。这些程序可单独和/或组合使用以产生核酸或核酸组的一个或多个变体,以及所编
码的蛋白的变体。这些程序单独地和共同地提供产生多样化的核酸和核酸组(包括例如核
酸文库)的稳固、广泛适用的方法,可用于例如核酸、蛋白、通路、细胞和/或生物体的工程
改造或快速进化而具有新的和/或改善的特性。
[0274] 虽然为清楚起见在后续讨论过程中进行了区分和分类,但应当理解,这些技术通常不是互相排斥的。事实上,所述各种方法可单独或组合使用、并行或连续使用,以获得多
样的序列变体。
[0275] 任何本文所述的多样性产生程序的结果可以是产生一条或多条核酸,可对所述一条或多条核酸进行选择或筛选而得到具有或赋予所需特性的核酸或者编码具有或赋予所
需特性的蛋白的核酸。在通过本文的一种或多种方法或者可供技术人员使用的其他方法进
行多样化后,可针对所需活性或特性例如杀虫活性或在所需pH下的此类活性等等,来选择
产生的任何核酸。这可包括鉴定任何活性,所述活性可通过本领域的任何测定法以例如自
动化或可自动化的格式进行检测,参见例如下文杀昆虫活性的筛查的讨论。多种相关(或
甚至不相关)特性可由操作人员自行决定是连续地还是并行地评价。
[0276] 用于产生经修饰的核酸序列例如编码具有杀虫活性的多肽或其片段的核酸序列的多种多样性产生程序的描述可见于下列出版物及其中引用的参考文献:Soong,et al.,
(2000)Nat Genet 25(4):436-439(Soong等人,2000年,《自然-遗传学》,第25卷,第4期,第436-439页);Stemmer,et al.,(1999)Tumor Targeting 4:1-4(Stemmer等人,1999年,《肿瘤靶向》,第4卷,第1-4页);Ness et al.(1999)Nat Biotechnol 17:893-896(Ness
等人,1999年,《自然-生物技术》,第17卷,第893-896页);Chang et al.(1999)Nat
Biotechnol 17:793-797(Chang等人,1999年,《自然-生物技术》,第17卷,第793-797
页 );Minshull and Stemmer,(1999)Curr Opin Chem Biol 3:284-290(Minshull 和
Stemmer,1999年,《化学生物学新见》,第3卷,第284-290页);Christians,et al.,
(1999)Nat Biotechnol17:259-264(Christians等人,1999年,《自然-生物技术》,第17
卷,第259-264页);Crameri,et al.,(1998)Nature 391:288-291(Crameri等人,1998
年,《自然》,第391卷,第288-291页);Crameri,et al.,(1997)Nat Biotechnol 15:
436-438(Crameri等人,1997年,《自然-生物技术》,第15卷,第436-438页);Zhang,et
al.,(1997)PNAS USA 94:4504-4509(Zhang等人,1997年,《美国国家科学院院刊》,第94卷,第4504-4509页);Patten,et al.,(1997)Curr Opin Biotechnol 8:724-733(Patten
等人,1997年,《生物技术新见》,第8卷,第724-733页);Crameri,et al.,(1996)Nat
Med 2:100-103(Crameri等人,1996年,《自然-医学》,第2卷,第100-103页);Crameri,et al.,(1996)Nat Biotechnol 14:315-319(Crameri等人,1996年,《自然-生物技术》,第14卷,第315-319页);Gates,et al.,(1996)J Mol Biol 255:373-386(Gates等人,
1996年,《分子生物学杂志》,第255卷,第373-386页);Stemmer,(1996)“Sexual PCR
and Assembly PCR”In:The Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers,New
York.pp.447-457(Stemmer,1996年,“有性PCR和装配PCR”,载于:《分子生物学百科全
书》,纽约VCH出版社,第447-457页);Crameri and Stemmer,(1995)BioTechniques 18:
194-195(Crameri和Stemmer,1995年,《生物技术》,第18卷,第194-195页);Stemmer,
et al.,(1995)Gene,164:49-53(Stemmer等人,1995年,《基因》,第164卷,第49-53页);
Stemmer,(1995)Science 270:1510(Stemmer,1995年,《科学》,第270卷,第1510页);
Stemmer,(1995)Bio/Technology13:549-553(Stemmer,1995年,《生物/技术》,第13卷,第
549-553页);Stemmer,(1994)Nature 370:389-391(Stemmer,1994年,《自然》,第370卷,第389-391页)以及Stemmer,(1994)PNAS USA91:10747-10751(Stemmer,1994年,《美国
国家科学院院刊》,第91卷,第10747-10751页)。
[0277] 产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(Ling,et al.,(1997)Anal Biochem254(2):157-178(Ling等人,1997年,《分析生物化学》,第254卷,第2期,第157-178页);
Dale,et al.,(1996)Methods Mol Biol 57:369-374(Dale等人,1996年,《分子生物学
方法》,第57卷,第369-374页);Smith,(1985)Ann Rev Genet 19:423-462(Smith,1985
年,《遗传学年评》,第19卷,第423-462页);Botstein and Shortle,(1985)Science229:
1193-1201(Botstein和Shortle,1985年,《科学》,第229卷,第1193-1201页);Carter,
(1986)Biochem J 237:1-7(Carter,1986年,《生物化学杂志》,第237卷,第1-7页)以
及 Kunkel,(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”in
Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein and Lilley,eds.,Springer Verlag,
Berlin)(Kunkel,1987年,“寡核苷酸定点诱变的效率”,载于《核酸与分子生物学》,
Eckstein和Lilley编辑,柏林施普林格出版社));使用含尿嘧啶的模板进行的诱变
(Kunkel,(1985)PNAS USA 82:488-492(Kunkel,1985年,《美国国家科学院院刊》,第82
卷,第488-492 页 );Kunkel,et al.,(1987)Methods Enzymol154:367-382(Kunkel 等
人,1987年,《酶学方法》,第154卷,第367-382页)以及Bass,et al.,(1988)Science
242:240-245(Bass等人,1988年,《科学》,第242卷,第240-245页));寡核苷酸定点诱
变 (Zoller and Smith,(1983)Methods Enzymol 100:468-500(Zoller 和 Smith,1983
年,《酶学方法》,第100卷,第468-500页);Zoller and Smith,(1987)Methods Enzymol
154:329-350(Zoller和Smith,1987年,《酶学方法》,第154卷,第329-350页);Zoller
and Smith,(1982)Nucleic Acids Res 10:6487-6500(Zoller和Smith,1982年,《核酸研
究》,第10卷,第6487-6500页));硫代磷酸修饰的DNA诱变(Taylor,et al.,(1985)Nucl
Acids Res13:8749-8764(Taylor等人,1985年,《核酸研究》,第13卷,第8749-8764页);
Taylor,et al.,(1985)Nucl Acids Res 13:8765-8787(1985)(Taylor等人,1985年,《核酸研究》,第13卷,第8765-8787页(1985));Nakamaye and Eckstein(1986)Nucl Acids Res
14:9679-9698(Nakamaye和Eckstein,1986年,《核酸研究》,第14卷,第9679-9698页);
Sayers,et al.,(1988)Nucl Acids Res 16:791-802(Sayers等人,1988年,《核酸研究》,第
16卷,第791-802页)以及Sayers,et al.,(1988)Nucl Acids Res 16:803-814(Sayers
等人,1988年,《核酸研究》,第16卷,第803-814页));使用带空位的双螺旋DNA进行的
诱变(Kramer,et al.,(1984)Nucl Acids Res 12:9441-9456(Kramer等人,1984年,《核
酸研究》,第12卷,第9441-9456页);Kramer and Fritz,(1987)Methods Enzymol 154:
350-367(Kramer和Fritz,1987年,《酶学方法》,第154卷,第350-367页);Kramer,et al.,(1988)Nucl Acids Res 16:7207(Kramer等人,1988年,《核酸研究》,第16卷,第7207页)以及Fritz,et al.,(1988)Nucl Acids Res16:6987-6999(Fritz等人,1988年,《核酸研
究》,第16卷,第6987-6999页))。
[0278] 另外 的 合适 方 法包 括 点错 配 修复 (Kramer,et al.,(1984)Cell 38:879-887(Kramer等人,1984年,《细胞》,第38卷,第879-887页))、使用修复缺陷型宿
主菌株进行的诱变(Carter,et al.,(1985)Nucl Acids Res 13:4431-4443(Carter等
人,1985年,《核酸研究》,第13卷,第4431-4443页)以及Carter,(1987)Methods in
Enzymol 154:382-403(Carter,1987年,《酶学方法》,第154卷,第382-403页))、缺失
诱变(Eghtedarzadeh and Henikoff,(1986)Nucl Acids Res 14:5115(Eghtedarzadeh
和Henikoff,1986年,《核酸研究》,第14卷,第5115页))、限制选择和限制纯化(Wells,
et al.,(1986)Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423(Wells等人,1986年,《伦敦皇家
学会哲学汇刊A辑》,第317卷,第415-423页))、通过全基因合成进行的诱变(Nambiar,
et al.,(1984)Science223:1299-1301(Nambiar等 人,1984 年,《科 学》,第223 卷,第
1299-1301页);Sakamar and Khorana,(1988)Nucl Acids Res 14:6361-6372(Sakamar和
Khorana,1988年,《核酸研究》,第14卷,第6361-6372页);Wells,et al.,(1985)Gene 34:
315-323(Wells等人,1985年,《基因》,第34卷,第315-323页)以及 et al.,
(1985)Nucl Acids Res 13:3305-3316( 等人,1985年,《核酸研究》,第13卷,
第3305-3316页))、双链断裂修复(Mandecki,(1986)PNAS USA,83:7177-7181(Mandecki,
1986年,《美国国家科学院院刊》,第83卷,第7177-7181页)以及Arnold,(1993)Curr Opin Biotech 4:450-455(Arnold,1993年,《生物技术新见》,第4卷,第450-455页))。关于上述方法中许多方法的另外细节可见于Methods Enzymol Volume 154(《酶学方法》,第154
卷),该文献也描述了各种诱变方法故障排除问题的有用对照。
[0279] 有关各种多样性产生方法的另外细节可见于下列美国专利、PCT公布和申请以及EPO公布:美国专利No.5,723,323、美国专利No.5,763,192、美国专利No.5,814,476、
美国专利No.5,817,483、美国专利No.5,824,514、美国专利No.5,976,862、美国专利
No.5,605,793、美国专利No.5,811,238、美国专利No.5,830,721、美国专利No.5,834,252、
美国专利No.5,837,458、WO 1995/22625、WO 1996/33207、WO 1997/20078、WO1997/35966、WO 1999/41402、WO 1999/41383、WO 1999/41369、WO1999/41368、EP 752008、EP 0932670、WO 1999/23107、WO 1999/21979、WO 1998/31837、WO 1998/27230、WO 1998/27230、
WO 2000/00632、WO2000/09679、WO 1998/42832、WO 1999/29902、WO 1998/41653、
WO1998/41622、WO 1998/42727、WO 2000/18906、WO 2000/04190、WO2000/42561、WO
2000/42559、WO 2000/42560、WO 2001/23401和PCT/US01/06775。
[0280] 所述实施例的核苷酸序列也可用于从其他生物体,尤其是其他细菌,尤其是假单胞菌物种且更尤其是绿针假单胞菌菌株分离相应的序列。这样,可使用诸如PCR、杂交等之
类的方法,对这类序列基于其与本文给出的序列的序列同一性来进行鉴定。所述实施例涵
盖基于序列与本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而选择的序列。这类序列包括为
所公开的序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”指衍生自共同祖先基因并且由于
物种形成而存在于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和/或其所编码的蛋白质序列如本
文其他地方所定义的具有实质性的同一性时,存在于不同物种中的基因被认为是直系同源
物。直系同源物的功能在各种物种中常常是高度保守的。
[0281] 在PCR方法中,可设计寡核苷酸引物用于PCR反应,以从提取自任何所关注生物体的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公
知的,在以下文献中有公开:Sambrook,et al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)(Sambrook等人,1989年,《分子克隆:实验室手册》,第2版,冷泉港实验室出版社,纽约普莱恩维
尤),下文称“Sambrook”。还可参见Innis,et al.,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)(Innis等人编辑,1990年,
《PCR方案:方法和应用指导》,学术出版社,纽约);Innis and Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)(Innis和Gelfand编辑,1995年,《PCR策略》,学
术出版社,纽约);以及Innis and Gelfand,eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic
Press,New York)(Innis和Gelfand编辑,1999年,《PCR方法手册》,学术出版社,纽约)。
已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因
特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0282] 为了从细菌保藏物中鉴定潜在的PIP-1多肽,可使用用PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PSEEN3174(SEQ ID NO:6)、PIP-1B(SEQ ID NO:4)和PIP-1C(SEQ ID NO:332)蛋白作为抗
原生成的抗体,利用蛋白质印迹和/或ELISA方法筛选细菌细胞裂解物。该类型的测定法
可以高通量方式进行。可通过各种技术诸如基于抗体的蛋白纯化和鉴定,进一步分析阳性
样品。生成抗体的方法是本领域熟知的,如下文所讨论。
[0283] 或者,可使用基于质谱的蛋白鉴定方法,用文献(Patterson,(1998),10(22):1-24,Current Protocol in Molecular Biology published by John Wiley&Son
Inc(Patterson,1998年,第10卷,第22期,第1-24页,《现代分子生物学实验手册》,由约翰·威利父子出版公司出版))中的方案鉴定PIP-1A(SEQ ID NO:2)的同源物。具体而言,使
用基于LC-MS/MS的蛋白鉴定方法将给定细胞裂解物或富含所需分子量的样品(从PIP-1A
蛋白的相关分子量条带的SDS-PAGE凝胶切离)的MS数据与PIP-1A(SEQ ID NO:2)及其同
源物的序列信息相关联。肽序列中的任何匹配均指示样品中有可能具有同源蛋白。可使用
另外的技术(蛋白纯化和分子生物学)分离蛋白并鉴定同源物的序列。
[0284] 在杂交方法中,可使用所有或部分的杀虫核酸序列筛选cDNA或基因组文库。此类cDNA和基因组文库的构建方法是本领域公知的并且公开于Sambrook和Russell,(2001)
(出处同上)。所谓的杂交探针可为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸,
并且可标记有可检测的基团诸如32P或任何其他可检测的标记物,诸如其他放射性同位
素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可通过标记基于本文所公开的已知PIP-1多肽编码核酸序
列的合成寡核苷酸,来制备用于杂交的探针。另外还可使用在核酸序列或所编码的氨基酸
序列中的保守核苷酸或氨基酸残基的基础上设计的简并引物。该探针通常包含这样的核酸
序列区域:该区域在严格条件下杂交于编码本发明PIP-1多肽的核酸序列或其片段或变体
的至少约12、至少约25、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核苷酸。制备用于杂交的探针的方法是本领域公知的并且公开于Sambrook和Russell,(2001)(出处同上),
该文献以引用方式并入本文。
[0285] 例如,编码本文所公开的PIP-1多肽的整个核酸序列或者其一个或多个部分可用作能够特异性杂交于编码PIP-1多肽样序列的相应核酸序列和信使RNA的探针。为实现在
多种条件下的特异性杂交,这类探针包括独特的序列,并且优选地长为至少约10个核苷酸
或长为至少约20个核苷酸。这种探针可用于通过PCR从选定的生物体扩增相应的杀虫序
列。这个技术可用于从所需生物体分离另外的编码序列,或者用作诊断测定法以确定编码
序列在生物体中的存在。杂交技术包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬斑或菌落;参见例如
Sambrook,et al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(Sambrook等人,1989年,《分子克隆:实验室手册》,第2版,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港)。
[0286] 这类序列的杂交可以在严格条件下进行。所谓“严格条件”或者“严格杂交条件”意指探针将与其靶标序列杂交的程度将可检测地大于与其他序列杂交的程度(例如比背
景大至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的,并且将在不同环境下不同。通过控制杂
交和/或洗涤条件的严格性,可以鉴定与探针100%互补的靶标序列(同源探测)。或者,可
以调节严格性条件以允许序列中的一些错配,从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。
一般来讲,探针长度小于约1000个核苷酸,优选地长度小于500个核苷酸。
[0287] 通常,严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子,通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐),pH为7.0至8.3,对短探针(例如,10至50个核苷酸)而言温度
至少约30℃,对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严
格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下
用30%至35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交,并在50℃至
55℃下在1×至2×SSC(20×SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等
严格性条件包括在40%至45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.5×至
1×SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50%甲酰胺、1M NaCl、1%
SDS中在37℃下杂交和在0.1×SSC中在60℃至65℃下洗涤。任选地,洗涤缓冲液可包含
约0.1%至约1%SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时,一般约4至约12小时。
[0288] 特异性通常决定于杂交后的洗涤,关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体,可根据Meinkoth and Wahl,(1984)Anal.Biochem.138:
267-284(Meinkoth和Wahl,1984年,《分析生物化学》,第138卷,第267-284页)的公式估
计Tm:Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M为单价阳离
子的摩尔浓度,%GC为DNA中嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比,%form为杂交
溶液中甲酰胺的百分比,L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50%的互补靶标序列
与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1%的错配,Tm降低约
1℃;因此,可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如,如果寻求具有≥90%同一性的序列,则可将Tm降低10℃。一般来讲,将严格条件选择为比特定
序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而,极端严格
条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤;适度严格条件可以采
用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤;低严格条件可以采用比热解
链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。利用该公式,杂交和洗涤组成
以及所需的Tm,普通技术人员应当理解,杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到
了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液),则优选
增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见于Tijssen,(1993)
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with
Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2(Elsevier,N.Y.)(Tijssen,1993年,《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针的杂交》,第I部分,第2章,爱思唯尔出版社,纽约);
以及Ausubel,et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter
2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)(Ausubel等人编辑,1995年,
《现代分子生物学实验手册》,第2章,格林出版与威立国际科学,纽约)。参见Sambrook,
et al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(Sambrook等人,1989年,《分子克隆:实验室手册》,第2版,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港)。
[0289] 蛋白及其变体和片段
[0290] 假单胞菌杀昆虫蛋白-1(PIP-1)多肽也被本发明涵盖。所谓“假单胞菌杀昆虫蛋白-1”、“PIP-1多肽”或“PIP-1蛋白”意指这样的多肽,其与SEQ ID NO:2的蛋白相比(且包括SEQ ID NO:2的蛋白)保留对于鳞翅目和/或半翅目的一种或多种昆虫害虫的杀昆虫
活性,并且与SEQ ID NO:2的蛋白充分同源且包括SEQ ID NO:2的蛋白。设想了多种PIP-1
多肽。编码PIP-1多肽或相关蛋白的一种多肽来源是绿针假单胞菌菌株,该菌株含有编码
SEQ ID NO:2的PIP-1多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸。
[0291] 如本文所用,术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括包含五个或更多个氨基酸的任何分子。本领域熟知的是,蛋白、肽或多肽分子可进行修饰,包括翻译后修饰,诸如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此,如本文所用,术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物或非生物过程修饰的任何蛋白。术语“氨基酸”是指所有天然存在的
L-氨基酸。
[0292] “重组蛋白”用来指不再处于其天然环境中,例如处于体外或者处于重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白。基本上不含细胞物质的PIP-1多肽包括具有少于约30%、20%、10%
或5%或更少(以干重计)的非杀虫蛋白(本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白制备物。
[0293] “片段”或“生物活性部分”包括包含与PIP-1多肽充分相同的氨基酸序列并且表现出杀昆虫活性的多肽片段。“片段”或“生物活性部分”包括包含与以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:6(包括但不限于SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:208)示出的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列并且表现出杀昆虫活性的多
肽片段。PIP-1多肽的生物活性部分可以是长为例如10、25、50、100、150、200、250个或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术制备并且可评价其杀昆虫活性。如
此处所用,片段包含PIP-1多肽的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中,片段包含SEQ
ID NO:2或SEQ ID NO:4的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中,片段包含SEQ ID NO:
2的至少8个连续氨基酸。在一些实施例中,片段包含SEQ ID NO:4的至少8个连续氨基
酸。然而,所述实施例涵盖其他片段,诸如蛋白中大于约10、20、30、50、100、150、200、250个或更多个氨基酸的任何片段。
[0294] 在一些实施例中,所述片段是例如通过蛋白水解、通过起始密码子的插入、通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随起始密码子的插入和/或终止密码子的插入,相对
于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其变体的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、25个或更多个氨基酸的N端和/或C端截短。在一些实施例中,本文所涵盖的片段是例如通过蛋白质水解或通过起始密码子的插入、通过编码缺失氨基酸的密
码子的缺失同时伴随起始密码子的插入,相对于SEQ ID NO:2或4或其变体(例如,SEQ ID
NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:330)的N端1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 个或更多个氨基酸的移除所产生的。在具体实施例中,蛋白水解裂解位点在SEQ ID NO:2或
其变体的Ser34与Asn35之间。在一些实施例中,截短发生于SEQ ID NO:2的最开始34个
氨基酸,从而由SEQ ID NO:2的第35-271位氨基酸产生PIP-1多肽。本领域熟知的是,可
对编码截短PIP-1多肽的多核苷酸进行工程改造以在N端添加起始密码子,诸如ATG,其编
码甲硫氨酸或甲硫氨酸接着是丙氨酸。本领域还熟知的是,根据PIP-1多肽在何种宿主中
表达,甲硫氨酸可被部分或完全加工去除。
[0295] 在一些实施例中,还提供了SEQ ID NO:2或4的片段、生物活性部分,包括但不限于SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、
117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、
136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、
211、212、213、214、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、
260、261、262、263、264、265、266、267、268和269以及其氨基酸置换、缺失和/或插入,并且其可用于操作本发明的方法。
[0296] 所谓变体意指与亲本氨基酸序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的蛋白或多肽。在一些实施例中,PIP-1多肽在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的全长上具有至少
约60%、65%、约70%、75%、至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些实施例中,PIP-1多肽在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的全长上具有至少约80%、81%、82%、83%、
84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或
99%同一性。
[0297] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有杀昆虫活性。在一
些实施例中,PIP-1多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:332或SEQ ID NO:4的氨基酸序
列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有杀昆虫活性。在一些实施例中,
PIP-1多肽包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中所
述多肽具有杀昆虫活性。
[0298] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第8位处的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或
Cys;第20位处的Xaa是Leu或Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa
是Ser、Lys或Arg;第24位处的Xaa是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26
位处的Xaa是Ser或Asn;第27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第30位处的Xaa是Ala或
Ile;第35位处的Xaa是Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa
是Asn、Arg或Ser;第42位处的Xaa是Phe或Tyr;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;
第48位处的Xaa是Gly或Asp;第49位处的Xaa是Phe或Tyr;第53位处的Xaa是Ser
或Gly;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa
是Gln或Lys;第77位处的Xaa是Phe或Tyr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处
的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第
108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、
Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处
的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly
或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处
的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa是Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第
147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是
Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163
位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln
或Glu;第167位处的Xaa是Leu或Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第174位
处的Xaa是Ile、Val或Met;第175位处的Xaa是Val或Ile;第180位处的Xaa是Met或
Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第200位处的Xaa是
Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr或Ala;第206位处
的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第
221位处的Xaa是Ser或Lys;第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、
Pro或Glu;第228位处的Xaa是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处
的Xaa是Ile或Val;第232位处的Xaa是Ala、Thr或Glu;以及第251位处的Xaa是Gly、
Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或Arg;第265位处
的Xaa是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;以及氨基酸缺失、氨基酸插入和
其片段,以及它们的组合。
[0299] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,在由SEQ ID NO:211中的Xaa表示的残基处具有任何组
合的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、
53、54、55、56、57、58、59、60或61个氨基酸置换。
[0300] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,在由SEQ ID NO:211中的Xaa表示的残基处具有任何组
合的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个氨基酸置换。
[0301] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro或Thr;第3位处的Xaa是Ile或Thr;第6位处的Xaa是Glu或Gly;第8位处
的Xaa是Ser、Gly或Asn;第19位处的Xaa是Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu或
Val;第21位处的Xaa是Lys、Ser或Asn;第22位处的Xaa是Ser、Lys或Arg;第24位处
的Xaa是Gln或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser或Asn;第
27位处的Xaa是Leu、Thr或Ala;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、Thr、Val、Gly、Ala、
Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala或Ile;第35位处的Xaa
是Phe或Leu;第36位处的Xaa是Ala、Ser或Val;第38位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第
42位处的Xaa是Phe或Tyr;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、
Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48
位处的Xaa是Gly或Asp;第49位处的Xaa是Phe、Tyr或Leu;第53位处的Xaa是Ser或
Gly;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;第60位处的Xaa是Ala或Ser;第63位处的Xaa是
G1n或Lys;第66位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处
的Xaa是Phe或Tyr;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、Val、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met或Val;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第105位处的Xaa
是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr或Ile;第108位处的Xaa是Gln或Thr;第110位
处的Xaa是Arg或Leu;第120位处的Xaa是Lys、Arg或Gln;第121位处的Xaa是Thr或
Ser;第123位处的Xaa是Thr或Glu;第125位处的Xaa是Asn或Ser;第127位处的Xaa
是Ser、Asn、Thr或Lys;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、Asn或
Lys;第137位处的Xaa是Asp或Gly;第141位处的Xaa是Val或Ile;第142位处的Xaa
是Gly或Asp;第144位处的Xaa是Asp或Glu;第147位处的Xaa是Ile、Thr或Val;第
150位处的Xaa是Ser或Thr;第151位处的Xaa是Asn、Arg或Ser;第160位处的Xaa是
Thr或Ser;第162位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp或Glu;第164
位处的Xaa是Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln或Glu;第167位处的Xaa是Leu或
Met;第168位处的Xaa是Thr、Lys或Ala;第171位处的Xaa是Gly、Leu、Gln、Met、Cys、
Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位处的Xaa是Gln、
Ile、Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、Phe、Ile、Ser或Lys;第179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处
的Xaa是Met、Leu、Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa是Tyr、Phe、Met或
His;第183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第
191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195位处的Xaa是Asn或
Tyr;第200位处的Xaa是Asn或Ser;第203位处的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa
是Thr或Ala;第206位处的Xaa是Gly或Asp;第209位处的Xaa是Leu或Val;第213位
处的Xaa是Tyr或Phe;第220位处的Xaa是Asn或Arg;第221位处的Xaa是Ser或Lys;
第222位处的Xaa是Thr或Arg;第226位处的Xaa是Asp、Pro或Glu;第228位处的Xaa
是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys或Asn;第231位处的Xaa是Ile或Val;第232位
处的Xaa是Ala、Thr或Glu;第240位处的Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、
Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa
是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是GlV、Ser或Glu;第254位处的Xaa是Ser或Asn;第258位处的Xaa是Ser或
Arg;第259位处的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa
是Asn或Asp;以及第266位处的Xaa是Asp或Asn;以及氨基酸缺失、氨基酸插入和其片
段,以及它们的组合。
[0302] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,在由SEQ ID NO:212中的Xaa表示的残基处具有任何组
合的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、
53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、
78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或89个氨基酸置换。
[0303] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,在由SEQ ID NO:212中的Xaa表示的残基处具有任何组
合的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个氨基酸置换。
[0304] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列,其中第2位处的Xaa是Pro、Thr或Ser;第3位处的Xaa是Ile、Thr、Leu、Val、Met或Ser;第6位处的Xaa
是Glu、Gly、Asp或Ala;第8位处的Xaa是Ser、Gly、Asn、Thr或Gln;第19位处的Xaa是
Asp、Glu或Cys;第20位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第21位处的Xaa是Lys、Ser、
Asn、Arg、Thr或Gln;第22位处的Xaa是Ser、Lys、Arg或Thr;第24位处的Xaa是Gln、
Gly、Asn或Ala;第25位处的Xaa是Gly或Ala;第26位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;
第27位处的Xaa是Leu、Thr、Ala、Ser、Ile、Val或Met;第28位处的Xaa是Arg、Ser、Lys、
Thr、Val、Gly、Ala、Met、Asp、Trp、Pro、Leu、His、Cys或Gln;第30位处的Xaa是Ala、Ile、Leu、Val或Met;第35位处的Xaa是Phe、Leu、Ile、Val或Met;第36位处的Xaa是Ala、
Ser、Thr、Val、Ile或Leu;第38位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第42位处
的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第43位处的Xaa是Pro、Met、Gly、Gln、Ser、Thr、Arg、Val、Leu、Lys、Asp、Ala、Asn、Phe、Trp、Glu或Cys;第46位处的Xaa是Arg、Lys或His;第48位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第49位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、
Ile、Val或Met;第53位处的Xaa是Ser、Gly、Ala或Thr;第58位处的Xaa是Tyr或Phe;
第60位处的Xaa是Ala、Ser、Gly或Thr;第63位处的Xaa是Gln、Lys、Asn或Arg;第66
位处的Xaa是Trp、Tyr、Phe、Arg、Lys、His、Ile、Val或Ser;第77位处的Xaa是Phe、Tyr、Trp、Leu、Ile、Val或Met;第89位处的Xaa是Pro、Leu、Gly、Arg、Thr、Ser、Met、Ala、Ile、Asn、yal、Cys或Lys;第93位处的Xaa是Tyr、Cys、Trp、Val、Asp、Asn、Ile、Leu、Met、Phe、Ala或Thr;第97位处的Xaa是Met、Val、Leu或Ile;第98位处的Xaa是Asp或Glu;第
105位处的Xaa是Gln或Asn;第107位处的Xaa是Thr、Ile、Ser、Leu或Val;第108位处
的Xaa是Gln、Thr、Ser或Asn;第110位处的Xaa是Arg、Leu、Lys、Ile、Val或Met;第120
位处的Xaa是Lys、Arg、Gln或Asn;第121位处的Xaa是Thr或Ser;第123位处的Xaa是
Thr、Glu、Ser或Asp;第125位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr;第127位处的Xaa是Ser、
Asn、Thr、Gln、Lys、Ser或Arg;第134位处的Xaa是Gly或Ala;第135位处的Xaa是Ser、
Asn、Thr、Gln、Arg或Lys;第137位处的Xaa是Asp、Gly、Glu或Ala;第141位处的Xaa是
Val、Ile或Leu;第142位处的Xaa是Gly、Asp、Ala或Glu;第144位处的Xaa是Asp或Glu;
第147位处的Xaa是Ile、Thr、Val、Leu、Met或Ser;第150位处的Xaa是Ser或Thr;第
151位处的Xaa是Asn、Arg、Ser、Gln、Lys或Thr;第160位处的Xaa是Thr或Ser;第162
位处的Xaa是Ser或Thr;第163位处的Xaa是Asn、Asp、Glu或Gln;第164位处的Xaa是
Ser或Thr;第166位处的Xaa是Gln、Glu、Asp或Asn;第167位处的Xaa是Leu、Met、Ile、
Val;第168位处的Xaa是Thr、Lys、Ala、Ser、Arg或Gly;第171位处的Xaa是Gly、Leu、
Gln、Met、Cys、Asn、Asp、Ser或Ala;第172位处的Xaa是Thr、Gly、His、Phe、Glu、Arg、Ser、Asn、Ile、Trp、Lys、Gln、Cys、Val、Ala或Met;第173位处的Xaa是Phe、Gly、His、Leu、Ala、Arg、Asn、Cys、Lys、Trp、Thr、Ser、Tyr或Met;第174位处的Xaa是Ile、Val、Gly、Arg、Asn、Ala、Gln、Met、Cys、Leu、Phe、Tyr、Lys、Glu、Ser、His或Thr;第175位处的Xaa是Val、Ile、Ala、Cys、Glu、Lys、Leu或Met;第176位处的Xaa是Tyr、Met、Phe、Leu或Cys;第177位
处的Xaa是Gln、Ile、Met或Pro;第178位处的Xaa是Val、Cys、Thr、Pro、Ala、Met、Gln、
Phe、Ile、Ser或Lys;第179位处的Xaa是Val、Phe、Thr、Ile、Cys、Leu、Met、Ser、Ala或Gln;第180位处的Xaa是Met、Leu;Pro、Trp、Asn、Tyr、Gly、Gln、Ala、Val、Phe、Ile、Cys或Ser;第181位处的Xaa是Val、Ala、Leu、Trp、Cys、Thr、Ile或Lys;第182位处的Xaa
是Tyr、Phe、Met或His;第183位处的Xaa是Ala、Met、Val、Thr、Asp、Gly、Cys、Ile、Phe、Ser、Gln或Leu;第191位处的Xaa是Arg或Lys;第194位处的Xaa是Gly或Ala;第195
位处的Xaa是Asn、Tyr、Gln或Trp;第200位处的Xaa是Asn、Ser、Thr或Gln;第203位处
的Xaa是Asn或Gln;第204位处的Xaa是Thr、Ala、Ser或Gly;第206位处的Xaa是Gly、
Asp、Ala或Glu;第209位处的Xaa是Leu、Val、Ile或Met;第23位处的Xaa是Tyr或Phe;
第220位处的Xaa是Asn、Arg、Gln或Lys;第221位处的Xaa是Ser、Lys、Thr或Arg;第
222位处的Xaa是Thr、Arg、Ser或Lys;第226位处的Xaa是Asp、Pro、Glu或Gln;第228
位处的Xaa是Ser或Gly;第229位处的Xaa是Lys、Asn、Arg或Gln;第231位处的Xaa是
Ile、Val、Leu或Met;第232位处的Xaa是Ala、Thr、Ser、Gly、Asp或Glu;第240位处的
Xaa是Gln、Arg、Ala、Val、Glu、Met、Gly、Asp、Trp、Asn、Thr、Ile、Ser、Phe、His、Cys或Leu;
第241位处的Xaa是Arg、Lys、Glu、Gln、Ser、Ile、Val、Asp、Tyr、Met、Asn、His、Pro、Gly、Leu、Phe、Thr、Ala或Cys;第242位处的Xaa是Asn、Ala、Arg、Lys、His、Ser、Cys、Glu、Pro、Trp、Gln、Thr、Phe、Tyr、Met、Asp、Gly、Leu或Val;第243位处的Xaa是Val、Leu、Ala、Thr、Gly、Cys、Ile、Ser或Met;第244位处的Xaa是Leu、Val、Phe、Ile、Met、Gln、Cys、Trp或Ala;第245位处的Xaa是Met、Ala、Arg、Asp、Glu、Leu、Pro、Ser、Trp、Gly、Val、Lys、Phe、Cys、Thr、His、Ile、Gln、Tyr或Asn;第246位处的Xaa是Glu、Asp、Tyr、Gly、Arg、Val、Ala、Trp、Gln、Ser、Asn、Ile、Leu、Met、Cys、Pro、His、Phe、Thr或Lys;第247位处的Xaa是Asn、Leu、Asp、Tyr、Ala、Phe、His、Arg、Lys、Gln、Gly、Val、Ile、Ser、Glu、Pro、Met、Trp、Thr或Cys;第248位处的Xaa是Tyr、Val、Thr、Glu、Phe、Ser、His、Cys、Leu、Trp、Ile、Asp、Gly或Ala;第249位处的Xaa是Asn、Lys、Val、Gly、Met、Asp、Cys、Phe、Arg、Glu、Trp、Tyr、Ser、Ile、Thr、Pro、Leu、Ala、His或Gln;第251位处的Xaa是Gly、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu;
第254位处的Xaa是Ser、Asn、Thr或Gln;第258位处的Xaa是Ser、Arg、Thr或Lys;第
259位处的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Leu、Val、Ile或His;第265位处的Xaa是Asn、
Asp、Gln或Glu;以及第266位处的Xaa是Asp、Asn、Gln或Glu;以及氨基酸缺失、氨基酸
插入和其片段,以及它们的组合。
[0305] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,在由SEQ ID NO:213中的Xaa表示的残基处具有任何组
合的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、
53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、
78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或89个氨基酸置换。
[0306] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列,与SEQ ID NO:2的相应位置处的天然氨基酸相比,在由SEQ ID NO:213中的Xaa表示的残基处具有任何组
合的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54个氨基酸置换。
[0307] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含选自如下的一个或多个氨基酸基序:i)SEQ IDNO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:212的第64-79
位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸表示的氨基酸基序,ii)SEQ ID NO:2的第
149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159
位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸表示的氨基酸基序,iii)SEQ ID NO:
2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:212的第
171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基酸表示的氨基酸基序,以及iv)
SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:
212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249位氨基酸表示的氨基酸基序。
在一些实施例中,PIP-1多肽包含如由SEQ ID NO:213的第171-183位表示的氨基酸,其中
SEQ ID NO:213的第171-183位处的至少一个氨基酸不与SEQ ID NO:6的第171-183位处
的氨基酸相同。
[0308] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含与以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:332或SEQ IDNO:4示出的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且包含选自如下的一个或
多个氨基酸基序:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基
酸、SEQ ID NO:212的第64-79位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸表示的
氨基酸基序,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第149-159位氨
基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸表
示的氨基酸基序,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183
位氨基酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基
酸表示的氨基酸基序,以及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第
240-249位氨基酸、SEQ ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249
位氨基酸表示的氨基酸基序。
[0309] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含与以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:332或SEQ IDNO:4示出的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且包含选自如下的一个或
多个氨基酸基序:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基
酸、SEQ ID NO:212的第64-79位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第64-79位氨基酸表示的
氨基酸基序,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211的第149-159位氨
基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第149-159位氨基酸表
示的氨基酸基序,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183
位氨基酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基
酸表示的氨基酸基序,以及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第
240-249位氨基酸、SEQ ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249
位氨基酸。
[0310] 在一些实施例中,所述氨基酸基序由如下表示:i)SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:211的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:212的第64-79位氨基酸、或SEQ
ID NO:213的第64-79位氨基酸,ii)SEQ ID NO:2的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:211
的第149-159位氨基酸、SEQ ID NO:212的第149-159位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第
149-159位氨基酸,iii)SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、SEQ ID NO:211的第171-183
位氨基酸、SEQ ID NO:212的第171-183位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第171-183位氨基
酸,以及iv)SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸、SEQ ID NO:211的第240-249位氨基酸、
SEQ ID NO:212的第240-249位氨基酸、或SEQ ID NO:213的第240-249位氨基酸,所述氨
基酸基序可任选地具有基序内的一个或多个氨基酸的缺失、基序内的一个或多个氨基酸的
插入、或它们的组合。
[0311] 在一些实施例中,示例性PIP-1多肽由以SEQ ID NO:152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、188、189、190、191、192、193、194、195、
196、197、198、199、200、201、202、203、205、207、220、221、222、223、224、225、226、227、228、
229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、270、271、272、
273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、
292、293、294、295、296和297示出的多核苷酸序列以及其编码PIP-1多肽的变体和片段编
码。
[0312] 在一些实施例中,示例性核酸分子包含以SEQ ID NO:152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、188、189、190、191、192、193、194、195、
196、197、198、199、200、201、202、203、205、207、220、221、222、223、224、225、226、227、228、
229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243和244示出的序列以及其编码PIP-1多肽的变体和片段。
[0313] 在一些实施例中,PIP-1多肽包括这样的变体,其中作为蛋白水解裂解位点一部分的氨基酸变为另一种氨基酸以消除或改变该位点处的蛋白水解裂解。在一些实施例中,蛋
白水解裂解通过昆虫肠道中的蛋白酶进行。在其他实施例中,蛋白水解裂解通过转基因植
物中的植物蛋白酶进行。
[0314] 在一些实施例中,示例性PIP-1多肽是表7、表9、表12、表15、表16、表17和/或表19中所示的多肽以及其氨基酸置换及缺失和/或其插入和片段的组合。
[0315] 在一些实施例中,PIP-1多肽不具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中,PIP-1多肽不具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
[0316] 在一些实施例中,PIP-1多肽的计算分子量在约15kD与约35kD之间、约19kD与约35kD之间、约2lkD与约35kD之间、约23kD与约35kD之间、约25kD与约32kD之间、约
27kD与约32kD之间、约28kD与约32kD之间、约29kD与约32kD之间、约30kD与约31kD或
约30.5kD之间。
[0317] 在一些实施例中,PIP-1多肽具有改良的物理性质。如本文所用,术语“物理性质”是指适用于描述蛋白的物理化学特性的任何参数。如本文所用,“所关注的物理性质”
和“所关注的性质”可互换使用,是指正研究和/或改良的蛋白的物理性质。物理性质的
例子包括但不限于蛋白表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白表面上的净疏水性和疏水残
基分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可电离基团的总数、表面张力、蛋白大小及
其在溶液中的分布、熔融温度、热容和第二维里系数。物理性质的例子还包括但不限于溶
解度、折叠性、稳定性和消化性。在一些实施例中,AfIP-1A多肽增强了蛋白水解片段在昆
虫肠道中的消化性。由模拟胃液来消化的模型是本领域技术人员已知的(Fuchs,R.L.and
J.D.Astwood.Food Technology 50:83-88,1996(Fuchs,R.L.和J.D.Astwood,《食品 技
术》,第50卷,第83-88页,1996年);Astwood,J.D.,et al Nature Biotechnology 14:
1269-1273,1996(Astwood,J.D.等人,《自然-生物技术》,第14卷,第1269-1273页,1996年);Fu TJ et al.J.Agric Food Chem.50:7154-7160,2002(Fu TJ等人,《农业与食品化
学杂志》,第50卷,第7154-7160页,2002年))。
[0318] 在一些实施例中,PIP-1多肽由在严格条件下杂交于SEQ ID NO:1或3的核酸分子的核酸分子编码。变体包括因诱变而氨基酸序列有差异的多肽。本发明所涵盖的变体蛋
白具有生物活性,即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性(即杀虫活性)。所谓“保留
活性”意指变体将具有天然蛋白的至少约30%、至少约50%、至少约70%或至少约80%的
杀昆虫活性。在一些实施例中,变体可具有相比于天然蛋白改善的活性。
[0319] 细菌基因常常在开放阅读框起点附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常,在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致产生功能蛋白。这些起始密码子可包括ATG
密码子。例如,SEQ ID NO:215表示由SEQ ID NO:1编码的替代起始位点蛋白。然而,细菌
诸如芽孢杆菌物种也将密码子GTG识别为起始密码子,并且在GTG密码子处起始翻译的蛋
白在第一位氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下,细菌系统中的翻译可在TTG密码子处
起始,但在此情形下TTG编码甲硫氨酸。此外,通常不能先验确定这些密码子中的哪些是细
菌中天然使用的。因此,应当理解,使用替代甲硫氨酸密码子之一也可导致产生杀虫蛋白。
这些杀虫蛋白涵盖于本发明中并且可在本发明的方法中使用。应当理解,当在植物中表达
时,为实现正确翻译,有必要将替代起始密码子更改为ATG。
[0320] 在另一个方面,PIP-1多肽可被表达为具有间插序列的前体蛋白,所述间插序列催化多步的翻译后蛋白剪接。蛋白剪接涉及从多肽切除间插序列,同时伴随旁侧序列的连
接,从而产生新的多肽(Chong,et al.,(1996)J.Biol.Chem.271:22159-22168(Chong等
人,1996年,《生物化学杂志》,第271卷,第22159-22168页))。该间插序列或蛋白剪接
元件称为内含肽,其通过三个协调一致的反应在N端和C端剪接连接点处催化其自身的切
除:N端半胱氨酸或丝氨酸的酰基重排;两个末端之间的酯交换反应以形成支链酯或硫酯
中间体,以及肽键断裂同时伴随内含肽C端天冬酰胺的环化,使内含肽得以释放(Evans,
et al.,(2000)J.Biol.Chem.275:9091-9094(Evans等人,2000年,《生物化学杂志》,第275卷,第9091-9094页)。蛋白剪接机制的阐明产生了多种基于内含肽的应用(Comb等人,
美国专利No.5,496,714;Comb等人,美国专利No.5,834,247;Camarero and Muir,(1999)
J.Amer.Chem.Soc.121:5597-5598(Camarero和Muir,1999年,《美国化学会志》,第121卷,第5597-5598页);Chong,et al.,(1997)Gene 192:271-281(Chong等人,1997年,《基因》,第192卷,第271-281页);Chong,et al.,(1998)Nucleic Acids Res.26:5109-5115(Chong等人,1998年,《核酸研究》,第26卷,第5109-5115页);Chong,et al.,(1998)J.Biol.
Chem.273:10567-10577(Chong等人,1998年,《生物化学杂志》,第273卷,第10567-10577页);Cotton,et al.,(1999)J.Am.Chem.Soc.121:1100-1101(Cotton等人,1999年,《美
国化学会志》,第121卷,第1100-1101页);Evans,et al.,(1999)J.Biol.Chem.274:
18359-18363(Evans等人,1999年,《生物化学杂志》,第274卷,第18359-18363页);Evans,et al.,(1999)J.Biol.Chem.274:3923-3926(Evans等人,1999年,《生物化学杂志》,第
274卷,第3923-3926页);Evans,et al.,(1998)Protein Sci.7:2256-2264(Evans 等
人,1998年,《蛋白质科学》,第7卷,第2256-2264页);Evans,et al.,(2000)J.Biol.
Chem.275:9091-9094(Evans等人,2000年,《生物化学杂志》,第275卷,第9091-9094页);
Iwai and Pluckthun,(1999)FEBS Lett.459:166-172(Iwai 和 Pluckthun,1999 年,《欧洲生化学会联合会快报》,第459卷,第166-172页);Mathys,et al.,(1999)Gene 231:
1-13(Mathys等人,1999年,《基因》,第231卷,第1-13页);Mills,et al.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3543-3548(Mills等人,1998年,《美国国家科学院院刊》,第95卷,第3543-3548页);Muir,et al.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6705-6710(Muir等
人,1998年,《美国国家科学院院刊》,第95卷,第6705-6710页);Otomo,et al.,(1999)Biochemistry 38:16040-16044(Otomo等人,1999年,《生物化学》,第38卷,第16040-16044页);Otomo,et al.,(1999)J.Biolmol.NMR 14:105-114(Otomo等人,1999年,《生物分子核磁共振杂志》,第14卷,第105-114页);Scott,et al.,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
96:13638-13643(Scott等人,1999年,《美国国家科学院院刊》,第96卷,第13638-13643
页 );Severinov and Muir,(1998)J.Biol.Chem.273:16205-16209(Severinov 和 Muir,
1998年,《生物化学杂志》,第273卷,第16205-16209页);Shingledecker,et al.,(1998)Gene 207:187-195(Shingledecker等人,1998年,《基因》,第207卷,第187-195页);
Southworth,et al.,(1998)EMBO J.17:918-926(Southworth等人,1998年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第17卷,第918-926页);Southworth,et al.,(1999)Biotechniques 27:
110-120(Southworth等人,1999年,《生物技术》,第27卷,第110-120页);Wood,et al.,(1999)Nat.Biotechnol.17:889-892(Wood等人,1999年,《自然-生物技术》,第17卷,
第889-892页);Wu,et al.,(1998a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:9226-9231(Wu等人,
1998a,《美国国家科学院院刊》,第95卷,第9226-9231页);Wu,et al.,(1998b)Biochim Biophys Acta 1387:422-432(Wu等人,1998b,《生物化学与生物物理学报》,第1387卷,第
422-432页);Xu,et al.,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:388-393(Xu等人,1999年,《美国国家科学院院刊》,第96卷,第388-393页);Yamazaki,et al.,(1998)J.Am.Chem.
Soc.120:5591-5592(Yamazaki等人,1998年,《美国化学会志》,第120卷,第5591-5592
页))。有关内含肽在植物转基因中的应用,参见Yang,J,et al.,(Transgene Res 15:
583-593(2006))(Yang,J等人,《转基因研究》,第15卷,第583-593页,2006年))和Evans,et al.,(Annu.Rev.Plant Biol.56:375-392,(2005))(Evans等人,《植物生物学年评》,第
56卷,第375-392页,2005年))。
[0321] 在另一个方面,PIP-1多肽可由两个单独的基因编码,其中前体蛋白的内含肽来自这两个基因,称为断裂型内含肽,并且前体的这两个部分通过肽键形成而连接在一起。该
肽键形成通过内含肽介导的反式剪接而实现。为此,包含这两个单独基因的第一和第二表
达盒还编码能够介导蛋白反式剪接的内含肽。通过反式剪接,由第一和第二片段编码的蛋
白和多肽可通过肽键形成而连接在一起。反式剪接内含肽可选自包括真核生物、古细菌和
真细菌的不同生物体的核仁和细胞器基因组。可使用的内含肽在neb.com/neb/inteins.
html(可使用“www”前缀在万维网上访问)处列出。编码内含肽的核苷酸序列可断裂成分
别编码内含肽5′和3′部分的5′和3′部分。可使内含肽剪接不需要的序列部分(例
如,归巢内切核酸酶域)缺失。内含肽编码序列断裂成使得5′和3′部分能够反式剪接。
为了选择内含肽编码序列的合适断裂位点,可遵循Southworth,et al.,(1998)EMBO J.17:
918-926(Southworth等人,1998年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第17卷,第918-926页)
公布的考虑因素。在构建第一和第二表达盒中,将5′内含肽编码序列连接至编码PIP-1多
肽的N端部分的第一片段的3′端,并且将3′内含肽编码序列连接至编码PIP-1多肽的C
端部分的第二片段的5′端。
[0322] 一般来讲,可使用任何断裂型内含肽(包括任何天然存在的或人工断裂的断裂型内含肽)来设计反式剪接伴侣。若干天然存在的断裂型内含肽是已知的,例如:集胞藻
属物种(Synechocystis sp.)PCC6803的DnaE基因的断裂型内含肽(参见Wu,et al.,
(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(16):9226-31(Wu等人,1998年,《美国国家科学院院
刊》,第95卷,第16期,第9226-9231页)和Evans,et al.,(2000)J Biol Chem 275(13):
9091-4(Evans等人,2000年,《生物化学杂志》,第275卷,第13期,第9091-9094页))和来
自点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的DnaE基因的断裂型内含肽(参见Iwai,et al.,
(2006)FEBS Lett 580(7):1853-8(Iwai等人,2006年,《欧洲生化学会联合会快报》,第
580卷,第7期,第1853-1858页))。已在实验室中将非断裂型内含肽人工断裂而形成新
的断裂型内含肽,例如:人工断裂型Ssp DnaB内含肽(参见,Wu,et al.,(1998)Biochim
Biophys Acta 1387:422-32(Wu等人,1998年,《生物化学与生物物理学报》,第1387卷,
第422-432页))和断裂型Sce VMA内含肽(参见,Brenzel,et al.,(2006)Biochemistry
45(6):1571-8(Brenzel等人,2006年,《生物化学》,第45卷,第6期,第1571-1578页))
以及人工断裂型真菌微型内含肽(参见,Elleuche,et al.,(2007)Biochem Biophys Res
Commun 355(3):830-4(Elleuche等人,2007年,《生物化学与生物物理研究通讯》,第355
卷,第3期,第830-834页))。还有可供使用的载入已知内含肽的内含肽数据库(参见,
例如可在如下找到的在线数据库:bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/
Inteinstable.html(可使用“www”前缀在万维网上访问))。
[0323] 天然存在的非断裂型内含肽可具有内切核酸酶或其他酶活性,这些酶活性通常可在设计人工断裂的断裂型内含肽时被移除。此类微型内含肽或最小化的断裂型内含肽是
本领域熟知的,并且长度通常少于200个氨基酸残基(参见,Wu,et al.,(1998)Biochim
Biophys Acta 1387:422-32(Wu等人,1998年,《生物化学与生物物理学报》,第1387卷,第
422-432页))。合适的断裂型内含肽可具有添加至其结构上的其他实现纯化的多肽元件,
前提条件是此类元件不会抑制断裂型内含肽的剪接或者以允许其在剪接之前被移除的方
式添加。已报道了使用包含如下域的蛋白进行的蛋白剪接:细菌内含肽样(BIL)域(参见,
Amitai,et al.,(2003)Mol Microbiol 47:61-73(Amitai等人,2003年,《分子微生物学》,第47卷,第61-73页))和刺猬蛋白(Hog)自动加工域(后者与内含肽组合,此时称为Hog/
内含肽超家族或HINT家族(参见,Dassa,et al.,(2004)J Biol Chem.279 32001-7(Dassa
等人,2004年,《生物化学杂志》,第279卷,第32001-32007页)),并且诸如这些的域也可
用来制备人工断裂型内含肽。具体地讲,可通过分子生物学方法修饰此类家族的非剪接成
员以在此类相关物质中引入或恢复剪接活性。最近的研究证实,当使N端断裂型内含肽组
分与自然界中并非作为其“伴侣”存在的C端断裂型内含肽组分反应时,可观察到剪接。例
如,采用与“天然”剪接伴侣具有少至30%至50%同源性的伴侣时,观察到了剪接(参见,
Dassa,et al.,(2007)Biochemistry 46(1):322-30(Dassa等人,2007年,《生物化学》,第
46卷,第1期,第322-330页))。已表明,相异的断裂型内含肽伴侣的其他此类混合物彼此
无反应(参见,Brenzel,et al.,2006 Biochemistry 45(6):1571-8(Brenzel等人,2006
年,《生物化学》,第45卷,第6期,第1571-1578页))。然而,在相关领域技术人员能力范围内的是,使用常规方法且不必运用独创性技术就可确定具体的一对多肽是否能够彼此相连
而提供功能性内含肽。
[0324] 在另一个方面,PIP-1多肽是环状排列的变体。在某些实施例中,PIP-1多肽是SEQID NO:2、4、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、
117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、
136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、
211、212、213、214、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、
260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、298、299、300、301、302、303、304、305、306、
307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和
332的多肽的环状排列的变体。在某些实施例中,PIP-1多肽是SEQ ID NO:2、4、101、102、
103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、
122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、
141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、
246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、
265、266、267、268、269和332的多肽的环状排列的变体。
[0325] 重组DNA方法的开发使得可以研究序列转座对蛋白折叠、结构和功能的影响。用于形成新序列的方法类似于天然存在的蛋白对的与其氨基酸序列的线性重构相关的方法
(Cunningham,et al.,(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:3218-3222(Cunningham 等
人,1979年,《美国国家科学院院刊》,第76卷,第3218-3222页);Teather and Erfle,
(1990)J.Bacteriol.172:3837-3841(Teather和Erfle,1990年,《细菌学杂志》,第172卷,第3837-3841页);Schimming,et al.,(1992)Eur.J.Biochem.204:13-19(Schimming等人,
1992年,《欧洲生物化学杂志》,第204卷,第13-19页);Yamiuchi and Minamikawa,(1991)FEBS Lett.260:127-130(Yamiuchi 和Minamikawa,1991年,《欧洲生化学会联合会快报》,第260卷,第127-130页);MacGregor,et al.,(1996)FEBS Lett.378:263-266(MacGregor
等人,1996年,《欧洲生化学会联合会快报》,第378卷,第263-266页))。该类型重排首次体外应用于蛋白由Goldenberg and Creighton(J.Mol.Biol.165:407-413,1983(Goldenberg
和Creighton,《分子生物学杂志》,第165卷,第407-413页,1983年))描述。在形成环状
排列的变体中,在初始序列的内部位点(断点)处选择新的N端,从该断点开始,该新序列
具有与初始序列相同顺序的氨基酸,直到其到达处于或接近初始C端的氨基酸。此时,该
新序列直接地或通过序列的另外部分(接头)连接至处于或接近初始N端的氨基酸,并且
该新序列继续采用与初始序列相同的序列,直到其到达处于或接近初始序列断点位点N端
的氨基酸的点,该残基形成该链的新C端。接头的氨基酸序列长度可根据经验选择或在结
构信息指导下选择或通过使用这两种方法的组合选择。当没有可供使用的结构信息时,可
使用如下设计来制备小系列的接头以用于测试,该设计的长度是变化的以跨越0至
的范围并且该设计的序列被选择为符合表面暴露(亲水性,Hopp and Woods,(1983)Mol.
Immunol.20:483-489(Hopp和Woods,1983年,《分子免疫学》,第20卷,第483-489页);Kyte and Doolittle,(1982)J.Mol.Biol.157:105-132(Kyte和Doolittle,1982年,《分子生物
学杂志》,第157卷,第105-132页);溶剂暴露表面区,Lee and Richards,(1971)J.Mol.
Biol.55:379-400(Lee和Richards,1971年,《分子生物学杂志》,第55卷,第379-400页))和采取所需构象而不扰乱杀虫多肽的构型的能力(构象柔性;Karplus and Schulz,(1985)
Naturwissenschaften72:212-213(Karplus和Schulz,1985年,《自然科学》,第72卷,第
212-213页)。假定每个残基平均平移2.0至 这意味着要测试的长度将在0至30个残
基之间,其中0至15个残基是优选的范围。此类经验系列的示例将是使用盒序列诸如重复n
次(其中n为1、2、3或4)的Gly-Gly-Gly-Ser来构建接头。本领域技术人员将认识到,存
在长度或组成有所差别且可用作接头的许多此类序列,首要考虑因素是它们既不能过长也
不能太短(参阅Sandhu,(1992)Critical Rev.Biotech.12:437-462(Sandhu,1992年,《生
物技术评论》,第12卷,第437-462页));如果它们太长,熵效应可能会破坏三维折叠的稳定性,并且也可能使折叠在动力学上不切实际,并且如果它们太短,它们可能会因为扭转或空
间应变而破坏分子的稳定性。蛋白结构信息分析方面的技术人员将认识到,使用链末端之
间的距离(限定为c-α之间的距离)可用来限定要使用的序列的长度,或至少用来限制
必须在接头经验选择中测试的可能性数量。他们还将认识到,有时情况是这样的:多肽链的
末端的位置在源自X射线衍射或核磁共振波谱数据的结构模型中不明确,并且当事实如此
时,该情况将因此需要加以考虑以便正确估计所需接头的长度。从位置明确的那些残基中
选择序列中邻近链末端的两个残基,并且使用其c-α碳之间的距离计算它们之间的接头
的近似长度。然后使用计算的长度作为指导,选择具有一定范围残基数量(使用每个残基
2至 来计算)的接头。这些接头可由初始序列组成,可视需要缩短或延长,并且当延长
时,可如上所述将另外的残基选择为柔性和亲水的;或任选地可使用一系列接头替代初始
序列,一个例子是上述的Gly-Gly-Gly-Ser盒方法;或任选地可使用初始序列和具有适当
总长度的新序列的组合。能够折叠成生物活性状态的杀虫多肽的序列可通过从初始多肽链
内适当选择开始(氨基端)和结束(羧基端)位置同时使用如上所述的接头序列来制备。
使用下述指南从序列的共同链段(称为断点区)内选择氨基端和羧基端。因此,通过从相同
断点区内选择氨基端和羧基端,产生了新型氨基酸序列。在许多情况下,新末端的选择将使
得羧基端的初始位置紧接在氨基端的初始位置之前。然而,本领域技术人员将认识到,在该
区域内任何位置处选择末端都可起作用,并且这些将有效地引起新序列的氨基或羧基部分
的缺失或添加。分子生物学的核心原则是,蛋白的一级氨基酸序列决定了折叠成表达其生
物功能所需的三维结构。使用单一蛋白晶体的X射线衍射或蛋白溶液的核磁共振波谱获得
并解读三维结构信息的方法是本领域技术人员已知的。与断点区鉴定相关的结构信息的例
子包括蛋白二级结构的定位和类型(α螺旋和3-10螺旋、平行和反平行β折叠、链反转和
以及环;Kabsch and Sander,(1983)Biopolymers 22:2577-2637(Kabsch和Sander,
1983年,《生物聚合物》,第22卷,第2577-2637页);氨基酸残基的溶剂暴露程度、残基彼
此相互作用的程度和类型(Chothia,(1984)Ann.Rev.Biochem.53:537-572(Chothia,1984
年,《生物化学年评》,第53卷,第537-572页))以及沿着多肽链的构象静态和动态分布
(Alber and Mathews,(1987)Methods Enzymol.154:511-533(Alber和Mathews,1987年,
《酶学方法》,第154卷,第511-533页))。在一些情况下,已知关于残基溶剂暴露的另外
信息;一个例子是有必要位于蛋白表面上的糖类的翻译后连接位点。当实验结构信息不可
用或不可能获得时,也可利用多种方法分析一级氨基酸序列以预测蛋白三级和二级结构、
溶剂可及性以及转角和环的出现。当直接结构方法不可行时,生物化学方法有时也可适用
于经验地确定表面暴露。例如,在限制性蛋白水解后使用断链位点的鉴定以推断表面暴露
(Gentile and Salvatore,(1993)Eur.J.Biochem.218:603-621(Gentile 和 Salvatore,
1993年,《欧洲生物化学杂志》,第218卷,第603-621页))。因此,使用实验得出的结构信
息或预测方法(例如,Srinivisan and Rose,(1995)Proteins:Struct.,Funct.&Genetics
22:81-99(Srinivisan和Rose,1995年,《蛋白质:结构、功能和遗传学》,第22卷,第81-99页))检查亲本氨基酸序列以根据它们对于二级和三级结构的维持是否不可或缺而将区域
分类。在已知涉及周期性二级结构(α螺旋和3-10螺旋、平行和反平行β折叠)的区域
内出现的序列是应当避开的区域。类似地,观察或预测到具有较低程度溶剂暴露的氨基酸
序列的区域更可能是蛋白的所谓疏水核的部分,并且对于氨基端和羧基端的选择也应当避
开。相比之下,已知或经预测在表面转角或环中的那些区域,特别是已知并非生物活性所需
的那些区域,是多肽链末端定位的优选位点。基于上述标准所优选的氨基酸序列的连续链
段被称为断点区。可基本上按照如下文献中所述的方法制备编码环状排列的PIP-1多肽
的多核苷酸,所述PIP-1多肽具有包含将初始C端和N端分隔开的接头区的新N端/C端:
Mullins,et al.,(1994)J.Am.Chem.Soc.116:5529-5533(Mullins等人,1994年,《美国化学会志》,第116卷,第5529-5533页)。使用聚合酶链反应(PCR)扩增的多个步骤来重排编
码蛋白一级氨基酸序列的DNA序列。可基于如下文献中所述的串联重复方法制备编码环状
排列的PIP-1多肽的多核苷酸,所述PIP-1多肽具有包含将初始C端和N端分隔开的接头
区的新N端/C端:Horlick,et al.,(1992)Protein Eng.5:427-431(Horlick等人,1992
年,《蛋白质工程》,第5卷,第427-431页)。使用串联重复的模板DNA进行新N端/C端基
因的聚合酶链反应(PCR)扩增。
[0326] 在另一个方面,提供了融合蛋白,所述融合蛋白在其氨基酸序列内包含构成PIP-1多肽的氨基酸序列,所述PIP-1多肽包括但不限于SEQ ID NO:2、4、101、102、103、104、105、
106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、
125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、
144、145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、
249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、
268、269、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、
315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和332的多肽。
[0327] 在一些实施例中,融合蛋白包含SEQ ID NO:2、4、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、
127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、
146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、249、250、
251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、
332的PIP-1多肽及其活性片段。
[0328] 在另一个方面,提供了融合蛋白,所述融合蛋白包含PIP-1多肽和第二杀虫多肽如Cry蛋白。用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员
已知的。编码PIP-1多肽的多核苷酸可融合到信号序列,所述信号序列将引导PIP-1多肽
定位于原核或真核细胞的特定区室和/或引导所述实施例的PIP-1多肽从原核或真核细胞
分泌。例如,在大肠杆菌中,可能希望引导蛋白表达于周质空间。PIP-1多肽可融合到其上
以引导多肽表达于细菌周质空间的信号序列或蛋白(或其片段)的例子包括但不限于pelB
信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌不耐热肠
毒素B亚基的信号序列、以及碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将引导蛋白的定位的融合
蛋白的若干载体可商购获得,诸如可购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的
pMAL系列载体(特别是pMAL-p系列)。在具体实施例中,PIP-1多肽可融合到pelB果胶酸
裂解酶信号序列以增加此类多肽在革兰氏阴性细菌中表达和纯化的效率(参见,美国专利
No.5,576,195和No.5,846,818)。植物质体转运肽/多肽融合体是本领域熟知的(参见,
美国专利No.7,193,133)。质外体转运肽诸如水稻或大麦α-淀粉酶分泌信号也是本领域
熟知的。质体转运肽通常融合到要靶向的多肽(例如,融合伴侣)的N端。在一个实施例
中,融合蛋白基本上由肽转运质体和要靶向的PIP-1多肽组成。在另一个实施例中,融合蛋
白包含肽转运质体和要靶向的多肽。在此类实施例中,质体转运肽优选地位于融合蛋白的N
端。然而,另外的氨基酸残基可处于质体转运肽的N端,前提条件是融合蛋白至少部分地靶
向质体。在具体实施例中,质体转运肽处于融合蛋白的N端一半处、N端三分之一处或N端
四分之一处。大多数或所有质体转运肽通常在插入质体后从融合蛋白裂解。由于特定的细
胞间状况或所使用的转运肽/融合伴侣的具体组合,裂解的位置在植物物种之间、在不同
植物发育期可略有差别。在一个实施例中,质体转运肽裂解是同源的,使得裂解位点在融合
蛋白群中是相同的。在另一个实施例中,质体转运肽是非同源的,使得裂解位点在融合蛋白
群中相差1-10个氨基酸。质体转运肽可以若干方法之一重组地融合到第二蛋白。例如,可
将限制性内切核酸酶识别位点引入转运肽的核苷酸序列中对应于其C末端的位置处,并且
可将该位点或相容位点设计在要靶向的蛋白的核苷酸序列中其N末端处。必须小心设计这
些位点以确保转运肽和第二蛋白的编码序列保持处于“框内”,从而允许所需融合蛋白的合
成。在一些情况下,当引入新限制位点时,可能优选的是将第二蛋白的起始子甲硫氨酸密码
子移除。两个亲本分子上限制性内切核酸酶识别位点的引入及其后续通过重组DNA技术进
行的连接可导致转运肽与第二蛋白之间添加一个或多个额外的氨基酸。只要转运肽裂解位
点保持可触及并且第二蛋白的功能不会受到在其N端处这些额外氨基酸的添加的影响,这
通常不会影响靶向活性。或者,本领域技术人员可使用基因合成(Stemmer,et al.,(1995)
Gene 164:49-53(Stemmer等人,1995年,《基因》,第164卷,第49-53页))或类似方法在
转运肽与第二蛋白(具有或不具有其起始子甲硫氨酸)之间形成精确裂解位点。此外,转
运肽融合体可有意地在裂解位点下游包含氨基酸。成熟蛋白N端的氨基酸可影响转运肽将
蛋白靶向质体的能力和/或蛋白输入后裂解的效率。这可取决于要靶向的蛋白。参见例如
Comai,et al.,(1988)J.Biol.Chem.263(29):15104-9(Comai等人,1988年,《生物化学杂志》,第263卷,第29期,第15104-15109页))。
[0329] 在一些实施例中,提供了融合蛋白,所述融合蛋白包含PIP-1多肽、杀虫蛋白诸如Cry蛋白、以及氨基酸接头。
[0330] 在一些实施例中,提供了由选自如下的式表示的融合蛋白:
[0331] R1-L-R2、R2-L-R1、R1-R2或R2-R1
[0332] 其中R1为PIP-1多肽,R2为与PIP-1多肽活性不同但互补的杀虫蛋白,包括但不1
限于Cry蛋白;提高PIP-1多肽溶解度和/或稳定性的多肽;或转运肽或前导序列。R多肽
2
直接地或通过接头区段融合到R多肽。术语“直接地”限定了多肽在无肽接头的情况下进
1 2
行连接的融合。因此,L表示R和R 两者均框内融合到其上的化学键或多肽区段,最常见
1 2 1
的是,L为R和R 通过酰胺键结合到其上的线性肽,所述酰胺键将R 的羧基端连接到L的
2 1 2
氨基端并将L的羧基端连接到R的氨基端。所谓“框内融合”意指R 与R 的阅读框之间没
有翻译终止或中断。连接基团(L)通常为长度介于1与500个氨基酸之间的多肽。连接两
个分子的接头优选地被设计为(1)允许这两个分子独立于彼此折叠和发挥作用,(2)没有
倾向形成可干扰这两个蛋白的功能域的有序二级结构,(3)具有极少可与功能蛋白域相互
1 2 1 2
作用的疏水或带电特性,以及(4)提供R与R 的位阻分离,使得R 和R 可同时与其在单个
细胞上的相应受体相互作用。通常,柔性蛋白区中的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。事实
上,包含Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的任何排列预计都将满足接头序列的以上标准。其
他中性氨基酸诸如Thr和Ala也可在接头序列中使用。另外的氨基酸也可包含在接头中,
这是由于可在接头序列中添加独特的限制性位点以有利于构建融合体。
[0333] 在一些实施例中,接头包含选自下式的序列:(Gly3Ser)n、(Gly4Ser)n、(Gly5Ser)n、(GlynSer)n或(AlaGlySer)n,其中n为整数。高度柔性的接头的一个例子是存在于丝状噬菌体例如噬菌体M13或fd的pIII蛋白内的富含(GlySer)的间隔区(Schaller等人,1975
年)。该区域提供了pIII表面蛋白两个域之间较长的柔性间隔区。还包括其中包含内切
肽酶识别序列的接头。对于分离融合体的各个组分以确定它们在体外是否正确折叠并具有
活性而言,此类裂解位点可能是有价值的。各种内切肽酶的例子包括但不限于纤溶酶、肠激
酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活物、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、圆斑蝰蛇毒蛋白酶、脯氨酸后裂解酶、V8蛋白酶、凝血酶和因子Xa。在一些实施例中,接头包含来自多基
因表达运载体(MGEV)的氨基酸EEKKN,其由如US 2007/0277263中所公开的液泡蛋白酶裂
解。在其他实施例中,来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区的肽接头区
段提供所连接的多肽之间的角度关系。尤其有用的是半胱氨酸被替换为丝氨酸的那些铰链
区。本发明的优选接头包含源自半胱氨酸已更换为丝氨酸的鼠IgG γ2b铰链区的序列。融
合蛋白不受到所采用的接头序列的形态、大小或数量的限制,并且接头的唯一要求是在功
能上其不会不利地干扰融合体的各个分子的折叠和功能。
[0334] 在另一个方面,提供了嵌合PIP-1多肽,所述PIP-1多肽通过连接最初编码来自不同物种的单独杀昆虫蛋白的基因的两个或更多个部分形成嵌合基因来产生。嵌合基因的翻
译得到了具有源自每个初始多肽的区域、基序或域的单个嵌合杀虫多肽。在某些实施例中,
嵌合蛋白包含任何组合的PIP-1A(SEQ ID NO:2)和直系同源物PSEEN3174(SEQ ID NO:6)、
PIP-1C(SEQ ID NO:332)以及PIP-1B(SEQ ID NO:4)的部分、基序或域。在某些实施例中,
嵌合杀昆虫多肽包括但不限于SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、
130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、
149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、249、250、251、252、253、
254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269和332的多肽。
[0335] 已经认识到,可通过各种方法改变DNA序列,并且这些改变可导致DNA序列编码的蛋白具有与野生型(或天然)杀虫蛋白所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这些蛋
白可以各种方式进行改变,所述方式包括一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和插
入,包括与SEQ ID NO:2或4相比,与包括但不限于SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、
107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、
126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、
145、146、147、148、149、150、151、204、206、208、211、212、213、214、245、246、247、248、249、
250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、
269和332相比,最多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50,约55、60、65、70、
75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155个或更多个氨基酸置换、缺失和/或插入或其组合。在一些实施例中,PIP-1多肽包含相对于SEQ ID NO:2的氨
基酸位置从PIP-1多肽N端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28个或更多个氨基酸的缺失。这类操纵的方法是本领域公知的。
例如,PIP-1多肽的氨基酸序列变体可通过在DNA中突变来制备。这也可通过若干形式的
诱变之一和/或在定向进化中完成。在一些方面,氨基酸序列中编码的变化基本上不会影
响蛋白的功能。这种变体将具有所需的杀虫活性。然而,应当理解,可通过对本发明组合物
使用此类技术,使PIP-1多肽赋予杀虫活性的能力提高。
[0336] 例如,可在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可从PIP-1多肽的野生型序列改变而不改变生物活性的残基。“保守氨基
酸置换”是氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基的氨基酸置换。具有类似侧链
的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括:具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖
氨酸、精氨酸、组氨酸);酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸);极性、带负电的残基及其酰胺(例如,天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺);不带电的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸);较小脂族、非极性或弱极性的残基(例如,丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸);非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸);较大脂族、非极性的残基(例如,甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸);β-支化的侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸);芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸);较大芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。
[0337] 氨基酸置换可在保留功能的非保守区中进行。一般来讲,此类置换不会对保守氨基酸残基或对位于保守基序内的氨基酸残基进行,其中此类残基是蛋白活性必需的。保守
的且可能是蛋白活性必需的残基的例子包括例如在相似或相关毒素与所述实施例的序列
的比对中所含的所有蛋白之间相同的残基(例如,在同源蛋白的比对中相同的残基)。保
守的但可允许保守氨基酸置换且仍然保留活性的残基的例子包括例如在相似或相关毒素
与所述实施例的序列的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守置换的残基(例如,在同源
蛋白的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守置换的残基)。然而,本领域技术人员应当
理解,功能性变体在保守残基中可具有较少保守或非保守的改变。有关不会影响所关注
蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到:Dayhoff,
et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,
Washington,D.C.(Dayhoff等人,1978年,《蛋白序列和结构图表集》,美国国家生物医学研究基金会,华盛顿特区),将该文献以引用方式并入本文。
[0338] 在进行此类改变时,可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在为蛋白赋予相互作用的生物功能方面的重要性是本领域中普遍理解的(Kyte and Doolittle,
(1982)J Mol Biol.157(1):105-32(Kyte和Doolittle,1982年,《分子生物学杂志》,第157卷,第1期,第105-132页))。公认的是,氨基酸的相对亲水性特征促成了所得蛋白的二级
结构,这继而限定了蛋白与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。
[0339] 本领域已知的是,某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或评分的其他氨基酸置换,并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白,即仍然获得生物功能方面等效的蛋白。基于
其疏水性和带电特性为每个氨基酸指定了亲水性指数(Kyte和Doolittle,同前)。这些
是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸
(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);
色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺
(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行此类
改变时,亲水性指数在+2内的氨基酸的置换是优选的,亲水性指数在+1内的那些是尤其优
选的,并且亲水性指数在+0.5内的那些甚至更是尤其优选的。
[0340] 本领域中还应当理解,可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利No.4,554,101陈述了如由其相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的最大局部平均亲水性与蛋
白的生物性质相关联。
[0341] 如美国专利No.4,554,101中详述,已为氨基酸残基指定下列亲水性值:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+0.1);谷氨酸(+3.0.+0.1);丝氨酸(+0.3);天
冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+0.1);丙
氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸
(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。
[0342] 或者,可对许多蛋白在氨基端或羧基端的蛋白序列进行改变,而基本上不影响活性。这可包括通过现代分子方法引入的插入、缺失或改变,所述现代分子方法诸如PCR,包括通过使PCR扩增中采用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白编码序列的
PCR扩增。或者,所添加的蛋白序列可包括全部蛋白编码序列,诸如本领域通常用于产生蛋
白融合体的那些。此类融合蛋白通常用于(1)增加所关注蛋白的表达,(2)引入结合域、酶
活性或表位以有利于蛋白纯化、蛋白检测或本领域已知的其他实验用途,(3)使蛋白的分泌
或翻译靶向亚细胞细胞器,诸如革兰氏阴性细菌的周质空间、植物的线粒体或叶绿体或者
真核细胞的内质网,后者通常导致蛋白的糖基化。
[0343] 在一些实施例中,PIP-1多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,其与SEQ ID NO:2的天然氨基酸相比,在选自SEQ ID NO:2的第2、3、6、8、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、
35、36、38、42、43、46、48、49、53、60、63、66、77、89、93、97、98、105、108、110、120、121、123、
125、127、134、135、137、141、142、144、147、150、151、160、162、163、164、166、167、168、171、
172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、194、195、200、203、204、209、213、
220、221、222、226、228、229、231、232、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、251、
254、258、259、265和266位的一个或多个残基处具有氨基酸置换。在具体实施例中,置换为丙氨酸在所列举的位置处置换天然氨基酸。还涵盖的是编码变体蛋白或多肽的核酸序列。
[0344] 本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖源自诱变和引起重组的程序诸如DNA改组的序列。采用此类程序时,一个或多个不同PIP-1多肽编码区可用于形成具有所需
性质的新PIP-1多肽。这样,从一组相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库,该相
关的序列多核苷酸包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内发生同源重组的序列
区。例如,使用该方法,可将编码所关注结构域的序列基序在杀虫基因和其他已知的杀虫
基因之间进行改组,以获得编码具有改善的所关注性质(诸如提高的杀昆虫活性)的蛋
白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer,(1994)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751(Stemmer,1994年,《美国国家科学院院刊》,第91卷,第10747-10751页);Stemmer,(1994)Nature 370:389-391(Stemmer,1994年,《自然》,第
370卷,第389-391页);Crameri,et al.,(1997)Nature Biotech.15:436-438(Crameri
等人,1997年,《自然生物技术》,第15卷,第436-438页);Moore,et al.,(1997)J.Mol.Biol.272:336-347(Moore等人,1997年,《分子生物学杂志》,第272卷,第336-347页);
Zhang,et al.,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509(Zhang 等 人,1997 年,
《美国国家科学院院刊》,第94卷,第4504-4509页);Crameri,et al.,(1998)Nature
391:288-291(Crameri等人,1998年,《自然》,第391卷,第288-291页)和美国专利
No.5,605,793和5,837,458。
[0345] 结构域交换或改组是用于产生改变的PIP-1多肽的另一种机制。结构域可在PIP-1多肽之间进行交换,从而产生具有改善的杀虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒
素。用于产生重组蛋白并测试其杀虫活性的方法是本领域熟知的(参见,例如Naimov,
et al.,(2001)Appl.Environ.Microbiol.67:5328-5330(Naimov等人,2001年,《应用与
环境微生物学》,第67卷,第5328-5330页);de Maagd,et al.,(1996)Appl.Environ.
Microbiol.62:1537-1543(de Maagd等人,1996年,《应用与环境微生物学》,第62卷,第
1537-1543页);Ge,et al.,(1991)J.Biol.Chem.266:17954-17958(Ge等人,1991年,《生物化学杂志》,第266卷,第17954-17958页);Schnepf,et al.,(1990)J.Biol.Chem.265:
20923-20930(Schnepf等人,1990年,《生物化学杂志》,第265卷,第20923-20930页);
Rang,et al.,91999)Appl.Environ.Microbiol.65:2918-2925(Rang等人,1999年,《应用与环境微生物学》,第65卷,第2918-2925页)。
[0346] DNA改组和定点诱变两者均用于限定具有杀虫活性的多肽序列。在实例8中,DNA改组用于通过存在于PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)中的多样性的重
组来产生活性变体的文库。本领域技术人员将能够使用与其他蛋白或功能测定法的比较来
进一步限定基序。可使用高通量筛选来测试这些基序的变异以确定具体残基的作用。若已
知若干基序,则可以限定功能蛋白的要求。对基序的了解允许技术人员设计不会影响功能
的序列变异。
[0347] 这项研究在实例9-11中实行。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的同源物的比对允许鉴定该家族的天然同源物间高度保守的残基(图1)。在实例9中,使用饱
和诱变在6个保守残基的每个处进行大多数或所有可能的置换,并测试这些置换。测试了
这些突变体的活性,并且鉴定了同源物间不存在的多种活性置换,从而提供了对这些残基
处的功能限制的理解。在实例10中,在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的比
对中,在最保守的区域间鉴定了四个基序。为了进一步表征对这些序列基序的功能限制,将
它们与一组三个不具有可检测杀昆虫活性的远源同源物进行比较(AECFG_592740(SEQ ID
NO:12)、Pput_1063(SEQ ID NO:8)和Pput_1064(SEQ ID NO:10)(图1)。这些同源物被认
为属于与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6相同的PFAM,因此很可能共用相同的
整体折叠。与来自这些远源同源物的这四个基序对应的序列被交换到PIP-1A骨架中。实
例10中所示的数据证实,这些基序受到相对严格的功能限制,因为来自远源同源物的大多
数基序交换导致功能丧失。在实例11中,通过对基序3和4中的所有残基进行饱和诱变,
进一步检测了对这些基序中的这两个基序的功能限制。
[0348] 抗体
[0349] 还涵盖对于所述实施例的PIP-1多肽或对于其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域熟知的(参见,例如Harlow and Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(Harlow和Lane,
1988年,《抗体:实验室手册》,冷泉港实验室,纽约冷泉港);美国专利No.4,196,265)。
[0350] 提供了用于在样品中检测PIP-1多肽的存在或检测编码PIP-1多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中,该试剂盒提供了基于抗体的试剂以用于检测组织样品
中PIP-1多肽的存在。在另一个实施例中,该试剂盒提供了可用于检测编码PIP-1多肽的
一个或多个多核苷酸的存在的标记核酸探针。该试剂盒连同执行检测方法的适当试剂和对
照以及试剂盒使用说明一起提供。
[0351] 受体鉴定和分离
[0352] 还涵盖对于所述实施例的PIP-1多肽或对于其变体或片段的受体。用于鉴定受体的方法是本领域熟知的(参见,Hofmann,et.al.,(1988)Eur.J.Biochem.173:
85-91(Hofmann等人,1988年,《欧洲生物化学杂志》,第173卷,第85-91页);Gill,et al.,(1995)J.Biol.Chem.27277-27282(Gill等人,1995年,《生物化学杂志》,第27277-27282
页)),可用于利用来自易感昆虫的刷状缘膜囊鉴定并分离识别PIP-1多肽的受体。除了所
引用的文献中列出的放射性标记方法以外,PIP-1多肽还可用荧光染料和其他常见标签诸
如链霉抗生物素蛋白进行标记。易感昆虫诸如大豆尺蠖和椿象的刷状缘膜囊(BBMV)可根
据参考文献中列出的方案制备,并且在SDS-PAGE凝胶上分离,并印迹在合适的膜上。可将
标记的PIP-1多肽与BBMV的印迹膜一起温育,并用标记的报告子鉴定标记的PIP-1多肽。
可通过N端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白鉴定方法检测与PIP-1多肽相互作用的蛋白
条带的身份(Patterson,(1998)10(22):1-24,Current Protocol in Molecular Biology
published by John Wiley&Son Inc(Patterson,1998年,第10卷,第22期,第1-24页,《现代分子生物学实验手册》,由约翰·威利父子出版公司出版))。一旦已鉴定蛋白,就可从易
感昆虫的基因组DNA或cDNA文库克隆相应基因,并且可直接用PIP-1多肽测量结合亲和
力。与PIP-1多肽作用而表现杀昆虫活性的受体功能可通过RNAi类型的基因敲除方法完
成验证(Rajagopal,et al.,(2002)J.Biol.Chem.277:46849-46851(Rajagopal等人,2002
年,《生物化学杂志》,第277卷,第46849-46851页))。
[0353] 核苷酸构建体、表达盒和载体
[0354] 本文中术语“核苷酸构建体”的使用无意于将所述实施例局限于包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到,核苷酸构建体,特别是由核糖核苷酸以及核糖
核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸,也可在本文公开的方法中应
用。所述实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这类构建体、分子和序列的所
有互补形式。此外,所述实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖所有可在所
述实施例的方法中应用以转化植物的核苷酸构建体、分子和序列,包括但不限于那些由脱
氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它们的组合所构成的核苷酸构建体、分子和序列。这种脱氧
核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。所述实施例的核苷
酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖所有形式的核苷酸构建体,包括但不限于单链形式、双
链形式、发夹结构、茎-环结构等。
[0355] 又一个实施例涉及转化的生物体,如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。转化的生物体包含所述实施例的DNA分子、含所述DNA分子的表达盒或者含所述表达盒的载体,它们可稳定掺入到转化的生物体的基因组中。
[0356] 所述实施例的序列在用于在所关注生物体中表达的DNA构建体中提供。如本文所用的“表达盒”意指包含有效连接至编码PIP-1多肽的多核苷酸的至少一个调控序列的DNA
构建体。如本文所用的术语“有效连接”指启动子与第二序列之间的功能性连接,其中启动
子序列起始并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般来讲,有效连接意指被连接的
核酸序列是连续的,并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话,是在相同的阅读框内。在
一些实施例中,表达盒包含5’和3’调控序列。在一些实施例中,表达盒包含异源调控序列。
如本文所用的术语“异源调控序列”指示调控序列不与编码PIPlA多肽的天然或基因组多
核苷酸相关联。在一些实施例中,表达盒包含来自植物的调控序列。该构建体可另外含有
至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者,所述额外基因可在多个DNA构建体上
提供。
[0357] 这种DNA构建体提供有多个限制位点,以使PIP-1多肽基因序列的插入处于调控区的转录调控之下。该DNA构建体可另外含有选择性标记基因。
[0358] 表达盒一般将在5′至3′转录方向上包含:转录和翻译起始区(即启动子)、所述实施例的DNA序列和在充当宿主的生物体中具有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。
转录起始区(即启动子)相对于宿主生物体和/或相对于所述实施例的序列可以是天然
的、类似的、外来的或者异源的。另外,启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。如本
文所用的术语“外来的”表示启动子在引入启动子的天然生物体中不存在。如果启动子相
对于所述实施例的序列是“外来的”或者“异源的”,则意指启动子不是有效连接的所述实施例的序列的天然或自然存在的启动子。如本文所用,嵌合基因包含与转录起始区有效连接
的编码序列,该转录起始区对于该编码序列是异源的。如果启动子是天然或自然的序列,则
所有效连接的序列的表达相比野生型表达被变更,这导致表型变更。
[0359] 在一些实施例中,表达盒还可包含转录增强子序列。如本文所用,术语“增强子”是指这样的DNA序列,所述DNA序列可以刺激启动子活性并且可以是启动子的固有元件或
经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。各种增强子是本领域已知的,包
括例如,植物中具有基因表达增强性质的内含子(美国专利申请公布No.2009/0144863,
泛素内含子(即,玉蜀黍泛素内含子1(参见例如,NCBI序列S94464))、omega增强子或
omega prime增强子(Gallie,et al.,(1989)Molecular Biology of RNA ed.Cech(Liss,
New York)237-256(Gallie等人,1989年,《RNA的分子生物学》,Cech编辑(纽约Liss))和
Gallie,et al.,(1987)Gene 60:217-25(Gallie等人,1987年,《基因》,第60卷,第217-225页))、CaMV35S增强子(参见例如,Benfey,et al.,(1990)EMBO J.9:1685-96(Benfey等
人,1990年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第9卷,第1685-1696页))并且也可使用美国专
利No.7,803,992的增强子,所述文献各自以引用方式并入。上面关于转录增强子的列表并
不意指是限制性的。任何适当的转录增强子都可用于所述实施例。
[0360] 终止区可以是对于转录起始区而言是天然的,可以对于有效连接的所关注DNA序列而言是天然的,可以对于植物宿主而言是天然的,或者可以衍自另一来源(即对于该启
动子、所关注序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。
[0361] 便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒,如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau,et al.,(1991)Mol.Gen.Genet.262:
141-144(Guerineau等人,1991年,《分子遗传学与普通遗传学》,第262卷,第141-144页);
Proudfoot,(1991)Cell 64:671-674(Proudfoot,1991年,《细胞》,第64卷,第671-674
页);Sanfacon,et al.,(1991)Genes Dev.5:141-149(Sanfacon等人,1991年,《基因和
发育》,第5卷,第141-149页);Mogen,et al.,(1990)Plant Cell 2:1261-1272(Mogen
等人,1990年,《植物细胞》,第2卷,第1261-1272页);Munroe,et al.,(1990)Gene 91:
151-158(Munroe等人,1990年,《基因》,第91卷,第151-158页);Ballas,et al.,(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903(Ballas等 人,1989年,《核 酸 研究》,第17卷,第
7891-7903页)以及Joshi,et al.,(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639(Joshi等人,
1987年,《核酸研究》,第15卷,第9627-9639页)。
[0362] 如适当,可将核酸进行优化以提高在宿主生物体中的表达。因此,如果宿主生物体是植物,则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主偏好的密码子
用法的讨论,参见例如Campbell and Gowri,(1990)Plant Physiol.92:1-11(Campbell和
Gowri,1990年,《植物生理学》,第92卷,第1-11页)。例如,尽管所述实施例的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达,但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双
子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性,因为这些偏好性已被证实不同(Murray et
al.(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498(Murray等人,1989年,《核酸研究》,第17卷,第
477-498页))。因此,特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得
出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子用法在Murray等人(出处同上)的表
4中列出。本领域可获得用于合成植物偏好基因的方法。参见例如美国专利No.5,380,831
和No.5,436,391、Murray,et al.,(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498(Murray等人,
1989年,《核酸研究》,第17卷,第477-498页)以及Liu H et al.Mol Bio Rep 37:677-684,
2010(Liu H等人,《分子生物学报道》,第37卷,第677-684页,2010年),所述文献以引用方式并入本文。玉蜀黍(Zea maize)密码子用法表也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/
showcodon.cgi?species=4577(可使用www前缀访问)。表2示出了玉蜀黍最佳密码
子分析(修改自Liu H et al.Mol Bio Rep 37:677-684,2010(Liu H等人,《分子生物学报
道》,第37卷,第677-684页,2010年))。
[0363] 表2
[0364]氨基 密码子 高 RSCU 低 RSCU 氨基 密码子 高 RSCU 低 RSCU
酸 计数 计数 酸 计数 计数
Phe UUU 115 0.04 2,301 1.22 Ala GCU 629 0.17 3,063 1.59
UUC* 5,269 1.96 1,485 0.78 GCC* 8,057 2.16 1,136 0.59
Ser UCU 176 0.13 2,498 1.48 GCA 369 0.1 2,872 1.49
UCC* 3,489 2.48 1,074 0.63 GCG* 5,835 1.57 630 0.33
UCA 104 0.07 2,610 1.54 Tyr UAU 71 0.04 1,632 1.22
UCG* 1,975 1.4 670 0.4 UAC* 3,841 1.96 1,041 0.78
AGU 77 0.05 1,788 1.06 His CAU 131 0.09 1,902 1.36
AGC* 2,617 1.86 1,514 0.89 CAC* 2,800 1.91 897 0.64
Leu UUA 10 0.01 1,326 0.79 Cys UGU 52 0.04 1,233 1.12
UUG 174 0.09 2,306 1.37 UGC* 2,291 1.96 963 0.88
CUU 223 0.11 2,396 1.43 Gln CAA 99 0.05 2,312 1.04
CUC* 5,979 3.08 1,109 0.66 CAG* 3,557 1.95 2,130 0.96
CUA 106 0.05 1,280 0.76 Arg CGU 153 0.12 751 0.74
CUG* 5,161 2.66 1,646 0.98 CGC* 4,278 3.25 466 0.46
Pro CCU 427 0.22 1,900 1.47 CGA 92 0.07 659 0.65
CCC* 3,035 1.59 601 0.47 CGG* 1,793 1.36 631 0.62
CCA 311 0.16 2,140 1.66 AGA 83 0.06 1,948 1.91
CCG* 3,846 2.02 513 0.4 AGG* 1,493 1.14 1,652 1.62
Ile AUU 138 0.09 2,388 1.3 Asn AAU 131 0.07 3,074 1.26
AUC* 4,380 2.85 1,353 0.74 AAC* 3,814 1.93 1,807 0.74
AUA 88 0.06 1,756 0.96 Lys AAA 130 0.05 3,215 0.98
Thr ACU 136 0.09 1,990 1.43 AAG* 5,047 1.95 3,340 1.02
ACC* 3,398 2.25 991 0.71 Asp GAU 312 0.09 4,217 1.38
ACA 133 0.09 2,075 1.5 GAC* 6,729 1.91 1,891 0.62
ACG* 2,378 1.57 495 0.36 Gly GGU 363 0.13 2,301 1.35
Val GUU 182 0.07 2,595 1.51 GGC* 7,842 2.91 1,282 0.75
GUC* 4,584 1.82 1,096 0.64 GGA 397 0.15 2,044 1.19
GUA 74 0.03 1,325 0.77 GGG* 2,186 0.81 1,215 0.71
GUG* 5,257 2.08 1,842 1.07 Glu GAA 193 0.06 4,080 1.1
GAG* 6,010 1.94 3,307 0.9
[0365] 使用卡方列联检验来比较密码子用法以鉴定最佳密码子。出现明显更频繁(P\0.01)的密码子用星号指示。
[0366] 大豆(Glycine max)密码子用法表在表3中示出并且也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N(可使用www前缀访
问)。
[0367] 表3
[0368]TTT F 21.2 (10493) TCT S 18.4 (9107)
TTC F 21.2 (10487) TCC S 12.9 (6409)
TTA L 9.2 (4545) TCA S 15.6 (7712)
TTG L 22.9 (11340) TCG S 4.8 (2397)
CTT L 23.9 (11829) CCT P 18.9 (9358)
CTC L 17.1 (8479) CCC P 10.1 (5010)
CTA L 8.5 (4216) CCA P 19.1 (9461)
CTG L 12.7 (6304) CCG P 4.7 (2312)
ATT I 25.1 (12411) ACT T 17.1 (8490)
ATC I 16.3 (8071) ACC T 14.3 (7100)
ATA I 12.9 (6386) ACA T 14.9 (7391)
ATG M 22.7 (11218) ACG T 4.3 (2147)
GTT V 26.1 (12911) GCT A 26.7 (13201)
GTC V 11.9 (5894) GCC A 16.2 (8026)
GTA V 7.7 (3803) GCA A 21.4 (10577)
GTG V 21.4 (10610) GCG A 6.3 (3123)
TAT Y 15.7 (7779) TGT C 8.1 (3995)
TAC Y 14.9 (7367) TGC C 8.0 (3980)
TAA * 0.9 (463) TGA * 1.0 (480)
TAG * 0.5 (263) TGG W 13.0 (6412)
CAT H 14.0 (6930) CGT R 6.6 (3291)
CAC H 11.6 (5759) CGC R 6.2 (3093)
CAA Q 20.5 (10162) CGA R 4.1 (2018)
CAG Q 16.2 (8038) CGG R 3.1 (1510)
AAT N 22.4 (11088) AGT S 12.6 (6237)
AAC N 22.8 (11284) AGC S 11.3 (5594)
AAA K 26.9 (13334) AGA R 14.8 (7337)
AAG K 35.9 (17797) AGG R 13.3 (6574)
GAT D 32.4 (16040) GGT G 20.9 (10353)
GAC D 20.4 (10097) GGC G 13.4 (6650)
GAA E 33.2 (16438) GGA G 22.3 (11022)
GAG E 33.2 (16426) GGG G 13.0 (6431)
[0369] 已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列:编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他
得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的
平均水平,这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。如本文所用的术语“宿主细
胞”指含有载体并支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如
大肠杆菌或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞,或者单子叶或者双子叶
植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个例子是玉蜀黍宿主细胞。当可能时,修饰序列以避
免预测的发夹二级mRNA结构。
[0370] 表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括:小核糖核酸病毒前导序列,例如,EMCV前导序列
(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein,et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:
6126-6130(Elroy-Stein等人,1989年,《美国国家科学院院刊》,第86卷,第6126-6130
页));马铃薯Y病毒组前导序列,例如,TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie,et al.,
(1995)Gene 165(2):233-238(Gallie等人,1995年,《基因》,第165卷,第2期,第233-238页))、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak,
et al.,(1991)Nature 353:90-94(Macejak等人,1991年,《自然》,第353卷,第90-94
页));来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling,et
al.,(1987)Nature 325:622-625(Jobling等人,1987年,《自然》,第325卷,第622-625
页));烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie,et al.,(1989)in Molecular Biology
of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256(Gallie等人,1989年,载于《RNA的分子
生物学》,Cech编辑(Liss,纽约),第237-256页))以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列
(MCMV)(Lommel,et al.,(1991)Virology 81:382-385(Lommel等人,1991年,《病毒学》,第81卷,第382-385页))。另参见Della-Cioppa,et al.,(1987)Plant Physiol.84:
965-968(Della-Cioppa等人,1987年,《植物生理学》,第84卷,第965-968页)。此类构建
体也可包含“信号序列”或“前导序列”以有利于肽共翻译转运或翻译后转运到特定细胞内
结构,诸如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。
[0371] 所谓“信号序列”意指已知或疑似引起跨越细胞膜的共翻译肽转运或翻译后肽转运的序列。在真核生物中,这通常涉及分泌到高尔基体中,产生一定程度的糖基化。细菌
的杀昆虫毒素通常被合成为原毒素,其在靶标害虫的肠道中被质子传递(protolytically)
激活(Chang,(1987)Methods Enzymol.153:507-516(Chang,1987年,《酶学方法》,第153卷,第507-516页))。在一些实施例中,信号序列位于天然序列内,或者可以来源于所述
实施例的序列。所谓“前导序列”意指在翻译时产生的氨基酸序列足以触发肽链共翻译转
运到亚细胞细胞器的任何序列。因此,这包括通过进入内质网、穿过液泡、质体(包括叶绿
体)、线粒体等而靶向转运和/或糖基化的前导序列。靶向叶绿体类囊体内腔区室的细胞
核编码蛋白质具有特征性的二连转运肽(bipartite transit peptide),其由基质靶向信
号肽和内腔靶向信号肽构成。基质靶向信息位于该转运肽的氨基近端部分。内腔靶向信
号肽位于该转运肽的羧基近端部分,其含有靶向内腔的所有信息。近年来高等植物叶绿
体的蛋白质组学研究成功鉴定了许多细胞核编码的内腔蛋白质(Kieselbach et al.FEBS
LETT 480:271-276,2000(Kieselbach等人,《欧洲生化学会联合会快报》,第480卷,第
271-276页,2000年);Peltier et al.Plant Cell 12:319-341,2000(Peltier等人,《植
物细胞》,第12卷,第319-341页,2000年);Bricker et al.Biochim.Biophys Acta 1503:
350-356,2001(Bricker等人,《生物化学与生物物理学报》,第1503卷,第350-356页,2001年)),其内腔靶向信号肽可潜在地根据本发明使用。Kieselbach et al.,Photosynthesis
Research,78:249-264,2003(Kieselbach等人,《光合作用研究》,第78卷,第249-264页,
2003年)报道了来自拟南芥(Arabidopsis)的约80种蛋白质以及菠菜和豌豆的同源蛋白
质。具体地讲,在此以引用方式并入本说明书的该出版物的表2公开了以其登录号标识的
85种叶绿体内腔蛋白质(还可参见美国专利申请公布2009/09044298)。此外,近来发表的
水稻基因组草图(Goff et al,Science 296:92-100,2002(Goff等人,《科学》,第296卷,第
92-100页,2002年))是可根据本发明使用的内腔靶向信号肽合适来源。
[0372] 合适的叶绿体转运肽(CTP)是本领域技术人员熟知的,包括嵌合CTP,所述嵌合CTP包含但不限于来自如下酶的CTP的N端结构域、中央结构域或C端结构域:水稻(Oryza
sativa)1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻可溶性淀粉合酶、水稻
NADP依赖型苹果酸酶、水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸缩酶2、水稻L-抗坏血酸过氧
化物酶5、水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米(Zea Mays)ssRUBISCO、玉米β-葡萄糖苷酶、玉
米苹果酸脱氢酶、玉米M型硫氧还蛋白(美国专利申请公布2012/0304336)。
[0373] 要靶向叶绿体的PIP-1多肽基因可优化用于在叶绿体中表达以考虑植物细胞核与该细胞器之间的密码子用法的差异。这样,可使用叶绿体偏好的密码子合成所关注的核
酸。参见例如,美国专利No.5,380,831,其以引用方式并入本文。
[0374] 在制备表达盒时,可对多个DNA片段进行操纵,以提供处于正确取向的DNA序列,且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的,可应用衔接子或接头将DNA片段
连接在一起,或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位
点等。出于这个目的,可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和颠换)。
[0375] 有多种启动子可用于所述实施例的实施。启动子可基于所需的结果来选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏好型启动子、诱导型启动子或其他启动子进行组合,以在
宿主生物体中表达。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO 1999/43838和
美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子;核
心CaMV 35S 启 动 子(Odell,et al.,(1985)Nature 313:810-812(Odell等 人,1985
年,《自然》,第313卷,第810-812页));水稻肌动蛋白(McElroy,et al.,(1990)Plant
Cell 2:163-171(McElroy等人,1990年,《植物细胞》,第2卷,第163-171页));泛素
(Christensen,et al.,(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632(Christensen等人,1989年,
《植物分子生物学》,第12卷,第619-632页)和Christensen,et al.,(1992)Plant Mol.
Biol.18:675-689(Christensen等人,1992年,《植物分子生物学》,第18卷,第675-689
页 ));pEMU(Last,et al.,(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588(Last等 人,1991 年,《理论与应用遗传学》,第81卷,第581-588页));MAS(Velten,et al.,(1984)EMBO J.3:
2723-2730(Velten等人,1984年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第3卷,第2723-2730页));
ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等等。其他的组成型启动子包括例如以下专利讨论的
那些:美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、
5,268,463、5,608,142和6,177,611。
[0376] 取决于所需的结果,可能有利的是从诱导型启动子表达基因。对于调节所述实施例的核苷酸序列在植物中的表达特别有意义的是损伤诱导启动子。这种损伤诱导启动
子可响应昆虫取食所引起的损害,包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan,(1990)
Ann.Rev.Phytopath.28:425-449(Ryan,1990年,《植物病理学年鉴》,第28卷,第425-449页);Duan,et al.,(1996)Nature Biotechnology 14:494-498(Duan等人,1996年,《自
然-生物技术》,第14卷,第494-498页));wun1和wun2(美国专利No.5,428,148);win1
和win2(Stanford,et al.,(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208(Stanford等人,1989年,
《分子遗传学与普通遗传学》,第215卷,第200-208页));系统素(McGurl,et al.,(1992)Science 225:1570-1573(McGurl等人,1992年,《科学》,第225卷,第1570-1573页));
WIP1(Rohmeier,et al.,(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792(Rohmeier等人,1993年,《植物分子生物学》,第22卷,第783-792页);Eckelkamp,et al.,(1993)FEBS Letters 323:
73-76(Eckelkamp等人,1993年,《欧洲生化学会联合会快报》,第323卷,第73-76页));MPI基因(Corderok,et al.,(1994)Plant J.6(2):141-150(Corderok等人,1994年,《植物杂志》,第6卷,第2期,第141-150页))等等,这些文献以引用方式并入本文。
[0377] 另外,病原体诱导启动子可在所述实施例的方法和核苷酸构建体中使用。这种病原体诱导型启动子包括那些来自致病相关蛋白(PR蛋白)的在病原体感染后被诱导的启动
子;例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如,Redolfi,et al.,(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254(Redolfi等人,1983年,《荷兰植物病理学杂
志》,第89卷,第245-254页);Uknes,et al.,(1992)Plant Cell 4:645-656(Uknes等人,
1992年,《植物细胞》,第4卷,第645-656页)以及Van Loon,(1985)Plant Mol.Virol.4:
111-116(Van Loon,1985年,《植物分子病毒学》,第4卷,第111-116页)。还可参见WO
1999/43819,该专利以引用的方式并入本文。
[0378] 在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如,Marineau,et al.,(1987)Plant Mol.Biol.9:335-342(Marineau等人,1987年,《植物分子生物学》,第9卷,第335-342页);Matton,et al.,(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions
2:325-331(Matton等人,1989年,《分子植物-微生物相互作用》,第2卷,第325-331页);
Somsisch,et al.,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427-2430(Somsisch等人,1986
年,《美国国家科学院院刊》,第83卷,第2427-2430页);Somsisch,et al.,(1988)Mol.
Gen.Genet.2:93-98(Somsisch等人,1988年,《分子遗传学与普通遗传学》,第2卷,第93-98页)以及Yang,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977(Yang,1996年,《美国
国家科学院院刊》,第93卷,第14972-14977页)。还可参见Chen,et al.,(1996)Plant
J.10:955-966(Chen等人,1996年,《植物杂志》,第10卷,第955-966页);Zhang,et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-2511(Zhang等人,1994年,《美国国家科学院
院刊》,第91卷,第2507-2511页);Warner,et al.,(1993)Plant J.3:191-201(Warner
等人,1993年,《植物杂志》,第3卷,第191-201页);Siebertz,et al.,(1989)Plant
Cell 1:961-968(Siebertz等人,1989年,《植物细胞》,第1卷,第961-968页);美国专利No.5,750,386(线虫诱导型)以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍PRms
基因的诱导型启动子,其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见例
如,Cordero,et al.,(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200(Cordero等人,1992年,《生理与分子植物病理学》,第41卷,第189-200页))。
[0379] 可将化学调控启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标,启动子可以是化学诱导型启动子,其中施用化学物质可诱导基因表达,或者是
化学阻抑型启动子,其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知
的,包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST
启动子(其通过用作萌前(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a
启动子(其通过水杨酸激活)。其他所关注的化学调控启动子包括类固醇响应启动子(参
见,例如,糖皮质素诱导型启动子,Schena,et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:
10421-10425(Schena等人,1991年,《美国国家科学院院刊》,第88卷,第10421-10425页)
和McNellis,et al.,(1998)Plant J.14(2):247-257(McNellis等人,1998年,《植物杂志》,第14卷,第2期,第247-257页))和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见,例如,
Gatz,et al.,(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237(Gatz等人,1991年,《分子遗传学与普通遗传学》,第227卷,第229-237页)以及美国专利No.5,814,618和5,789,156),上述文
献以引用的方式并入本文。
[0380] 组织偏好启动子可用来将增强型PIP-1多肽表达靶向特定的植物组织内。组织偏好启动子包括以下文献中讨论的那些启动子:Yamamoto,et al.,(1997)Plant
J.12(2)255-265(Yamamoto等人,1997年,《植物杂志》,第12卷,第2期,第255-265页);
Kawamata,et al.,(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803(Kawamata等人,1997年,
《植物细胞生理学》,第38卷,第7期,第792-803页);Hansen,et al.,(1997)Mol.Gen
Genet.254(3):337-343(Hansen等人,1997年,《分子遗传学与普通遗传学》,第254卷,第
3期,第337-343页);Russell,et al.,(1997)Transgenic Res.6(2):157-168(Russell
等人,1997年,《转基因研究》,第6卷,第2期,第157-168页);Rinehart,et al.,(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341(Rinehart等人,1996年,《植物生理学》,第112卷,第
3期,第1331-1341页);Van Camp,et al.,(1996)Plant Physiol.112(2):525-535(Van
Camp等人,1996年,《植物生理学》,第112卷,第2期,第525-535页);Canevascini,et
al.,(1996)Plant Physiol.112(2):513-524(Canevascini等人,1996年,《植物生理学》,第112卷,第2期,第513-524页);Yamamoto,et al.,(1994)Plant Cell Physiol.35(5):
773-778(Yamamoto等人,1994年,《植物细胞生理学》,第35卷,第5期,第773-778页);
Lam,(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196(Lam,1994年,《细胞分化研究结
果与问题》,第20卷,第181-196页);Orozco,et al.,(1993)Plant Mol Biol.23(6):
1129-1138(Orozco等人,1993年,《植物分子生物学》,第23卷,第6期,第1129-1138页);
Matsuoka,et al.,(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590(Matsuoka等人,
1993年,《美国国家科学院院刊》,第90卷,第20期,第9586-9590页)和Guevara-Garcia,
et al.,(1993)Plant J.4(3):495-505(Guevara-Garcia等人,1993年,《植物杂志》,第4卷,第3期,第495-505页)。如有必要,可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
[0381] 叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如,Yamamoto,et al.,(1997)PlantJ.12(2):255-265(Yamamoto等人,1997年,《植物杂志》,第12卷,第2期,第255-265
页);Kwon,et al.,(1994)Plant Physiol.105:357-67(Kwon等人,1994年,《植物生理
学》,第105卷,第357-367页);Yamamoto,et al.,(1994)Plant Cell Physiol.35(5):
773-778(Yamamoto等人,1994年,《植物细胞生理学》,第35卷,第5期,第773-778页);
Gotor,et al.,(1993)Plant J.3:509-18(Gotor等人,1993年,《植物杂志》,第3卷,第
509-518页);Orozco,et al.,(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138(Orozco等人,
1993年,《植物分子生物学》,第23卷,第6期,第1129-1138页)以及Matsuoka,et al.,
(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590(Matsuoka等人,1993年,《美国国家
科学院院刊》,第90卷,第20期,第9586-9590页)。
[0382] 根偏好启动子或者根特异性启动子是已知的,可选自许多可从文献得到的启动子,或者从各种相容的物种从头分离。参见例如,Hire,et al.,(1992)Plant Mol.
Biol.20(2):207-218(Hire等人,1992年,《植物分子生物学》,第20卷,第2期,第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因);Keller and Baumgartner,(1991)Plant Cell
3(10):1051-1061(Keller 和Baumgartner,1991年,《植物细胞》,第3卷,第10期,第
1051-1061页)(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件);Sanger,et al.,
(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443(Sanger等人,1990年,《植物分子生物学》,第14
卷,第3期,第433-443页)(根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子);
和Miao,et al.,(1991)Plant Cell 3(1):11-22(Miao等人,1991年,《植物细胞》,第3卷,第1期,第11-22页)(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆,该酶在大豆的根
和根瘤中表达)。还可参见,Bogusz,et al.,(1990)Plant Cell 2(7):633-641(Bogusz
等人,1990年,《植物细胞》,第2卷,第7期,第633-641页),其中描述了从来自固氮非豆
科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄
(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连
接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入进非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植
物百脉根(Lotus corniculatus)二者中,在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。
Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表
达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1):
69-76(《植物科学》,Limerick,第79卷,第1期,第69-76页))。他们得出结论认为,增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因
融合表明,编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃,且TR2′基因
在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激,这是与杀昆虫或杀幼虫基因一
起使用的特别理想的特性组合(参见EMBO J.8(2):343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》,
第8卷,第2期,第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了
相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster,et al.,(1995)
Plant Mol.Biol.29(4):759-772(Kuster等人,1995年,《植物分子生物学》,第29卷,第
4期,第759-772页))和rolB启动子(Capana,et al.,(1994)Plant Mol.Biol.25(4):
681-691(Capana等人,1994年,《植物分子生物学》,第25卷,第4期,第681-691页))。另
参见美国专利No.5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和
5,023,179。
[0383] “种子偏好的”启动子包括“种子特异性”启动子(那些启动子在种子发育期间活跃,例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些启动子在种子萌发期间活
跃)。参见Thompson,et al.,(1989)BioEssays 10:108(Thompson等人,1989年,《生物测定法》,第10卷,第108页),该文献以引用方式并入本文。这类种子偏好启动子包括但不限于
Cim1(细胞分裂素诱导信息);cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白);以及milps(肌醇-1-磷
酸合酶)(参见美国专利No.6,225,529,其以引用方式并入本文)。γ-玉米蛋白和Glb-1
是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物,种子特异性启动子包括但不限于Kunitz胰蛋白酶
抑制剂3(KTi3)(Jofuku,K.D.and Goldberg,R.B.Plant Cell 1:1079-1093,1989(Jofuku,K.D.和Goldberg,R.B.,《植物细胞》,第1卷,第1079-1093页,1989年))、菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等等。对于单子叶植物,种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、
27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。还可参见WO
2000/12733,其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好启动子;将这些专利和文献以引
用方式并入本文。在双子叶植物中,种子特异性启动子包括但不限于来自拟南芥的种皮启
动子pBAN;以及来自拟南芥的早期种子启动子p26、p63和p63tr(美国专利No.7,294,760
和7,847,153)。在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中表达的程度高于在至少
一种其他植物组织中表达的程度。一些组织偏好启动子几乎专门在特定组织中显示表达。
[0384] 如果需要低水平表达,则要使用弱启动子。一般来讲,如本文所用的术语“弱启动子”指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。所谓“低水平表达”意指处于约1/1000个
转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。或者,已经认识到术语
“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中而不在其他细胞中驱动表达从而造成总表达水平较低
的启动子。如启动子以不可接受的高水平驱动表达,则可缺失或者修饰启动子序列的一些
部分以降低表达水平。
[0385] 这种弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 1999/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他的组成型启动子包括例如以下专
利中公开的那些:美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、
5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611,所述专利以引用方式并入本文。
[0386] 以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于所述实施例。
[0387] 一般来讲,表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因被利用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因,如那些编
码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因,以及赋予对除草化
合物的抗性的基因,所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧
基乙酸(2,4-D)。合适的选择性标记基因的另外例子包括但不限于编码对如下物质的
抗性的基因:氯霉素(Herrera Estrella,et al.,(1983)EMBO J.2:987-992(Herrera
Estrella等人,1983年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第2卷,第987-992页);甲氨蝶呤
(Herrera Estrella,et al.,(1983)Nature 303:209-213(Herrera Estrella等人,1983
年,《自然》,第303卷,第209-213页)和Meijer,et al.,(1991)Plant Mol.Biol.16:
807-820(Meijer等人,1991年,《植物分子生物学》,第16卷,第807-820页));链霉素
(Jones,et al.,(1987)Mol.Gen.Genet.210:86-91(Jones等人,1987年,《分子遗传学与
普通遗传学》,第210卷,第86-91页));壮观霉素(Bretagne-Sagnard,et al.,(1996)
Transgenic Res.5:131-137(Bretagne-Sagnard等人,1996年,《转基因研究》,第5卷,第
131-137页));博来霉素(Hille,et al.,(1990)Plant Mol.Biol.7:171-176(Hille等
人,1990年,《植物分子生物学》,第7卷,第171-176页));磺酰胺(Guerineau,et al.,
(1990)Plant Mol.Biol.15:127-136(Guerineau等人,1990年,《植物分子生物学》,第15
卷,第127-136页));溴苯腈(Stalker,et al.,(1988)Science 242:419-423(Stalker
等人,1988年,《科 学》,第242卷,第419-423页));草甘 膦(Shaw,et al.,(1986)
Science 233:478-481(Shaw等人,1986年,《科学》,第233卷,第478-481页)和美国专
利申请序列号10/004,357和10/427,692);草胺膦(DeBlock,et al.,(1987)EMBO J.6:
2513-2518(DeBlock等人,1987年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第6卷,第2513-2518
页))。主要参见:Yarranton,(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511(Yarranton,1992年,《生物技术新见》,第3卷,第506-511页);Christopherson,et al.,(1992)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 89:6314-6318(Christopherson等人,1992年,《美国国家科学院院刊》,第
89卷,第6314-6318页);Yao,et al.,(1992)Cell 71:63-72(Yao等人,1992年,《细胞》,第71卷,第63-72页);Reznikoff,(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422(Reznikoff,1992
年,《分子微生物学》,第6卷,第2419-2422页);Barkley,et al.,(1980)The Operon,
pp.177-220(Barkley等人,1980年,《操纵子》,第177-220页);Hu,et al.,(1987)Cell 48:
555-566(Hu等人,1987年,《细胞》,第48卷,第555-566页);Brown,et al.,(1987)Cell
49:603-612(Brown等人,1987年,《细胞》,第49卷,第603-612页);Figge,et al.,(1988)Cell 52:713-722(Figge等人,1988年,《细胞》,第52卷,第713-722页);Deuschle,et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5400-5404(Deuschle等人,1989年,《美国国家
科学院院刊》,第86卷,第5400-5404页);Fuerst,et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:2549-2553(Fuerst等人,1989年,《美国国家科学院院刊》,第86卷,第2549-2553页);
Deuschle,et al.,(1990)Science 248:480-483(Deuschle等人,1990年,《科学》,第248卷,第480-483页);Gossen,(1993)博士论文,海德堡大学(University of Heidelberg);
Reines,et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1917-1921(Reines等人,1993年,
《美国国家科学院院刊》,第90卷,第1917-1921页);Labow,et al.,(1990)Mol.Cell.
Biol.10:3343-3356(Labow等人,1990年,《分子细胞生物学》,第10卷,第3343-3356页);
Zambretti,et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3952-3956(Zambretti等人,1992年,《美国国家科学院院刊》,第89卷,第3952-3956页);Baim,et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076(Baim等人,1991年,《美国国家科学院院刊》,第88卷,第
5072-5076页);Wyborski,et al.,(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653(Wyborski等
人,1991年,《核酸研究》,第19卷,第4647-4653页);Hillenand-Wissman,(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162(Hillenand-Wissman,1989年,《分子和结构生物学专题》,
第10卷,第143-162页);Degenkolb,et al.,(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:
1591-1595(Degenkolb等人,1991年,《抗微生物剂和化学治疗》,第35卷,第1591-1595
页);Kleinschnidt,et al.,(1988)Biochemistry 27:1094-1104(Kleinschnidt等 人,
1988年,《生物化学》,第27卷,第1094-1104页);Bonin,(1993)博士论文,海德堡大学;
Gossen,et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(Gossen等人,1992年,
《美国国家科学院院刊》,第89卷,第5547-5551页);Oliva,et al.,(1992)Antimicrob.
Agents Chemother.36:913-919(Oliva等人,1992年,《抗微生物剂和化学治疗》,第36
卷,第913-919页);Hlavka,et al.,(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology,
Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)(Hlavka等人,1985年,《实验药理学手册》,第78卷,斯普林格出版社,柏林)以及Gill,et al.,(1988)Nature 334:721-724(Gill等人,1988年,《自然》,第334卷,第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。
[0388] 以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因都可用于所述实施例。
[0389] 植物转化
[0390] 所述实施例的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以多核苷酸或者多肽序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或者多肽呈送到植物。所述实施例
的方法不依赖于将多核苷酸或者多肽引入植物中的具体方法,只要多核苷酸或多肽可进入
植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的,
包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。
[0391] “稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中,并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中,或者
将多肽引入植物中。所谓“植物”意指整株植物、植物器官(例如,叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可为分化的或未分化的(例如,愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。
[0392] 转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案,可以根据转化所指向的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)变动。将核苷酸序列引入到植物
细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法,包括微注射(Crossway,et al.,(1986)
Biotechniques 4:320-334(Crossway等人,1986年,《生物技术》,第4卷,第320-334页))、电穿 孔(Riggs,et al.,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606(Riggs等 人,
1986年,《美国国家科学院院刊》,第83卷,第5602-5606页))、农杆菌介导的转化(美国
专利No.5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski,et al.,(1984)EMBO J.3:
2717-2722(Paszkowski等人,1984年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第3卷,第2717-2722
页))以及弹道粒子加速法(参见例如美国专利No.4,945,050、5,879,918、5,886,244
和 5,932,782;Tomes,et al.,(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:
Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips,(Springer-Verlag,Berlin)(Tomes等
人,1995年,载于《植物细胞、组织和器官培养:基本方法》,Gamborg和Phillips编辑,施普林格,柏林)以及McCabe,et al.,(1988)Biotechnology 6:923-926(McCabe等人,1988年,《生物技术》,第6卷,第923-926页))和Lecl转化(WO 2000/28058)。对于马铃薯转化,
参见Tu,et al.,(1998)Plant Molecular Biology 37:829-838(Tu等人,1998年,《植物
分子生物学》,第37卷,第829-838页)以及Chong,et al.,(2000)Transgenic Research
9:71-78(Chong等人,2000年,《转基因研究》,第9卷,第71-78页)。另外的转化程序可见于Weissinger,et al.,(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477(Weissinger等人,1988年,《遗传学年评》,第22卷,第421-477页);Sanford,et al.,(1987)Particulate Science and Technology 5:27-37(Sanford等人,1987年,《颗粒科学与技术》,第5卷,第27-37页)(洋葱);Christou,et al.,(1988)Plant Physiol.87:671-674(Christou等人,1988年,《植物生理学》,第87卷,第671-674页)(大豆);McCabe,et al.,(1988)Bio/Technology 6:
923-926(McCabe等人,1988年,《生物/技术》,第6卷,第923-926页)(大豆);Finer and
McMullen,(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(Finer 和 McMullen,1991 年,
《体外细胞发育生物学》,第27P卷,第175-182页)(大豆);Singh,et al.,(1998)Theor.
Appl.Genet.96:319-324(Singh等人,1998年,《理论和应用遗传学》,第96卷,第319-324页)(大豆);Datta,et al.,(1990)Biotechnology 8:736-740(Datta等人,1990年,《生
物技术》,第8卷,第736-740页)(水稻);Klein,et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85:4305-4309(Klein等人,1988年,《美国国家科学院院刊》,第85卷,第4305-4309
页)(玉蜀黍);Klein,et al.,(1988)Biotechnology 6:559-563(Klein等人,1988年,
《生物技术》,第6卷,第559-563页)(玉蜀黍);美国专利No.5,240,855;5,322,783和
5,324,646;Klein,et al.,(1988)Plant Physiol.91:440-444(Klein等人,1988年,《植物生理学》,第91卷,第440-444页)(玉蜀黍);Fromm,et al.,(1990)Biotechnology 8:
833-839(Fromm等人,1990年,《生物技术》,第8卷,第833-839页)(玉蜀黍);Hooykaas-Van Slogteren,et al.,(1984)Nature(London)311:763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人,
1984年,《自然》(伦敦),第311卷,第763-764页);美国专利No.5,736,369(谷类);
Bytebier,et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(Bytebier等人,1987
年,《美国国家科学院院刊》,第84卷,第5345-5349页)(百合科);De Wet,et al.,(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman,et al.,(Longman,New York),pp.197-209(De Wet等人,1985年,载于《胚珠组织的实验操作》,Chapman等人编辑,(朗文出版社,纽约),第197-209页)(花粉);Kaeppler,et al.,(1990)Plant Cell Reports 9:415-418(Kaeppler等人,1990年,《植物细胞报道》,第9卷,第415-418页)和
Kaeppler,et al.,(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(Kaeppler等人,1992年,《理论与应用遗传学》,第84卷,第560-566页)(晶须介导的转化);D′Halluin,et al.,(1992)
Plant Cell 4:1495-1505(D′Halluin等人,1992年,《植物细胞》,第4卷,第1495-1505
页)(电穿孔);Li,et al.,(1993)Plant Cell Reports12:250-255(Li等人,1993年,《植物细胞报道》,第12卷,第250-255页)以及Christou and Ford,(1995)Annals of Botany
75:407-413(Christou和Ford,1995年,《植物学年鉴》,第75卷,第407-413页)(水稻);
Osjoda,et al.,(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(Osjoda等人,1996年,《自
然-生物技术》,第14卷,第745-750页)(玉蜀黍,经由根瘤农杆菌);所有这些文献均以
引用方式并入本文。
[0393] 在具体实施例中,所述实施例的序列可用多种瞬时转化方法提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入PIP-1多肽或其变体和片段,或者向植物中引
入PIP-1多肽转录物。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway,et al.,
(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185(Crossway等人,1986年,《分子遗传学与普通遗传学》,第202卷,第179-185页);Nomura,et al.,(1986)Plant Sci.44:53-58(Nomura等人,1986年,《植物科学》,第44卷,第53-58页);Hepler,et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:
2176-2180(Hepler等人,1994年,《美国国家科学院院刊》,第91卷,第2176-2180页)和
Hush,et al.,(1994)The Journal of Cell Science 107:775-784(Hush等人,1994年,《细胞科学杂志》,第107卷,第775-784页),所有这些文献都以引用方式并入本文。或者,可使用本领域已知的技术将PIP-1多肽多核苷酸瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系
统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此,从粒子结合的DNA可
发生转录,但其释放出来而整合进基因组中的频率则大大降低。这种方法包括使用包被有
聚乙基亚胺(PEI;Sigma #P3143)的粒子。
[0394] 用于在植物基因组中特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中,使用位点特异性重组系统,实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见,
例如,WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853,上述专利均以引用的方式并入本文。简而言之,可将所述实施例的多核苷酸包含在转移盒
中,该转移盒旁侧是两个不相同的重组位点。将转移盒引入其基因组中稳定掺入靶位点的
植物中,其中所述靶位点旁侧是两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提
供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基
因组中的特定染色体位置。
[0395] 植物转化载体可由实现植物转化所需的一个或多个DNA载体构成。例如,本领域通常的做法是采用由不止一个连续DNA区段构成的植物转化载体。这些载体在本领域中常
常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化,其中
完成有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性是相当大的,并且将功能分摊到单独的DNA
分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体,该质粒载体含有T-DNA转移所必需的顺式
作用序列(诸如左边界和右边界),经工程改造能在植物细胞中表达的选择性标记,以及
“所关注基因”(经工程改造能在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。还存在
于这种质粒载体上的是细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许有效转移入植物细胞
中并在其中表达的方式排列。例如,选择性标记基因和杀虫基因位于左边界和右边界之间。
通常第二质粒载体包含介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。按照本领域
中所理解的,该质粒通常包含允许植物细胞被农杆菌感染并通过在边界序列处的裂解以及
vir介导的DNA转移来转移DNA的毒力功能(Vir基因)(Hellens and Mullineaux,(2000)
Trends in Plant Science5:446-451(Hellens和Mullineaux,2000年,《植物科学趋势》,第
5卷,第446-451页))。数种类型的农杆菌菌株(例如,LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105
等)可用于植物转化。该第二质粒载体不是通过诸如微喷射、微注射、电穿孔、聚乙二醇等
等的其他方法转化植物所必需的。
[0396] 一般来讲,植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞(例如,不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等等)中,随后应用最大阈值水平的合
适选择物(取决于选择性标记基因)来从未转化细胞团块群中回收转化的植物细胞。在将
异源外来DNA整合入植物细胞中后,然后在培养基中应用最大阈值水平的合适选择物以杀
死未转化的细胞,并通过定期转移至新鲜培养基来分离和增殖从该选择处理中存活的推定
经转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择物进行攻击,可鉴定和增殖用所述质粒载
体转化的细胞。然后,分子和生物化学方法可用于证实存在整合到转基因植物的基因组中
的所关注异源基因。
[0397] 通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后,在放置于补充了最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后,已转化的细胞被分化成苗。然后将
所述苗转移到选择性生根培养基中,以恢复成生根的苗或小植株。然后将转基因小植株
生长成成熟的植株并产生可育种子(例如,Hiei,et al.,(1994)The Plant Journal 6:
271-282(Hiei等人,1994年,《植物杂志》,第6卷,第271-282页);Ishida,et al.,(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(Ishida等人,1996年,《自然-生物技术》,第14卷,
第745-750页))。通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。产生转
基因植物的技术和方法的一般描述可见于Ayres and Park,(1994)Critical Reviews in
Plant Science 13:219-239(Ayres和Park,1994年,《植物科学评论》,第13卷,第219-239页)和Bommineni and Jauhar,(1997)Maydica 42:107-120(Bommineni和Jauhar,1997
年,《Maydica》,第42卷,第107-120页)。由于被转化的材料包含许多细胞;在任何一片目标愈伤组织或组织或细胞群中都存在转化的和未转化的细胞。杀死未转化细胞并允许转化
细胞增殖的能力产生了经转化的植物培养物。通常,去除未转化细胞的能力是对快速恢复
经转化的植物细胞并成功产生转基因植物的限制。
[0398] 转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见,例如,McCormick,et al.,(1986)Plant Cell Reports 5:81-84(McCormick等人,1986年,《植物细胞报道》,第5卷,第81-84页)。然后可栽培这些植株并用同一转化株系或不同的株系进行授粉,并鉴定出具
有所需表型特征的组成型或者诱导型表达的所得杂交种。可培养两代或更多代以确保所需
表型特征的表达得到稳定保持和遗传,然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实
现。
[0399] 所述实施例的核苷酸序列可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而提供给植物。通常,这种方法涉及将所关注的核苷酸构建体掺入于病毒DNA或RNA分子内。已经认识到,
所述实施例的重组蛋白可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成,其以后可通过体内或体外
蛋白水解加工而产生所需PIP-1多肽。还认识到,这种包含所述实施例的PIP-1多肽的氨
基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的杀虫活性。这种病毒聚蛋白及其编码核
苷酸序列为所述实施例所涵盖。给植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码的蛋白质
的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本领域已知的。参见例如,美国专利No.5,889,191、
5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931,所述专利以引用方式并入本文。
[0400] 转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如,Svab,et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526-8530(Svab等人,1990年,《美国国家科学院院刊》,第87卷,第
8526-8530 页 );Svab and Maliga,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913-917(Svab
和Maliga,1993年,《美国国家科学院院刊》,第90卷,第913-917页);Svab and Maliga,(1993)EMBO J.12:601-606(Svab和Maliga,1993年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第12卷,第601-606页)。该方法依赖于粒子枪输送含选择性标记的DNA以及通过同源重组将DNA
靶向质体基因组。此外,质体转化可以通过细胞核编码和质体介导的RNA聚合酶的组织偏
好表达来反式激活沉默的质体携带的转基因而完成。这种系统已经在McBride,et al.,
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305(McBride等人,1994年,《美国国家科学院
院刊》,第91卷,第7301-7305页)中进行了报道。
[0401] 所述实施例还涉及所述实施例的转化植物的植物繁殖材料,包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶、以及根和苗的插条。
[0402] 所述实施例可用于转化任何植物物种,包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物的例子包括但不限于玉米、芸苔属(Brassica)物种(例如,甘蓝型油
菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)),特别是可用作种子油来源的那些芸苔
属物种;苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱
(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)、粟(例如,珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米
(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵
(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆
(Glycine max)、烟草、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、
木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas
comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、荼(Camellia sinensis)、香
蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium
guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、
腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus
amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
[0403] 蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属
(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏
植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus
rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)
和菊花。可应用于实施所述实施例的针叶树包括例如松树如火炬松(Pinus taeda)、沼泽
松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和蒙特利松
(Pinus radiata);花旗松(Pseudotsuga menziesii);西杉(Tsuga canadensis);北美
云杉(Picea glauca);红杉(Sequoia sempervirens);枞树(true firs)如枞(Abies
amabilis)和胶枞(Abies balsamea);以及松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯
加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。所述实施例的植物包括作物植物(例如玉米、
苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等),例如玉米和大豆植物。
[0404] 草坪草包括但不限于:一年生蓝草(Poa annua);一年生黑麦草(Loliummultiflorum);加拿大蓝草(Poa compressa);紫羊茅(Festuca rubra);细弱剪股
颖(Agrostis tenuis);匍匐翦股颖(Agrostis palustris);光穗草(Agropyron
desertorum);扁穗冰草(Agropyron cristatum);硬羊茅(Festuca longifolia);肯塔基
蓝草(Poa pratensis);果园草(Dactylis glomerata);多年生黑麦草(Lolium perenne);
紫羊茅(Festuca rubra);红顶草(Agrostis alba);粗茎蓝草(Poa trivialis);羊茅
(Festuca ovina);无芒雀麦草(Bromus inermis);高羊茅(Festuca arundinacea);梯牧
草(Phleum pratense);绒毛剪股颖(Agrostis canina);碱茅(Puccinellia distans);
西方冰草(Agropyron smithii);百慕达草(Cynodon spp.);圣奥古斯丁草(Stenotaphrum
secundatum);结缕草(Zoysia spp.);美洲雀稗(Paspalum notatum);地毯草(Axonopus
affinis);百足草(Eremochloa ophiuroides);狼尾草(Pennisetum clandesinum);海
滨雀稗(Paspalum vaginatum);蓝格兰马草(Bouteloua gracilis);野牛草(Buchloe
dactyloids);垂穗草(Bouteloua curtipendula)。
[0405] 所关注的植物包括谷物植物(提供所关注的种子)、油籽植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子,如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、粟等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括菜豆类和豌豆类。菜豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
[0406] 植物转化的评价
[0407] 在将异源外来DNA引入到植物细胞中以后,异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法如与整合基因有关的核酸、蛋白质和代谢物的分析来证实。
[0408] PCR分析是移种到土壤之前筛选早期转化细胞、组织或苗中掺入基因存在的快速方法(Sambrook and Russell,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(Sambrook和Russell,2001
年,《分子克隆:实验室手册》,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港))。使用对所关注基因或农杆菌属载体背景等特异的寡核苷酸引物进行PCR。
[0409] 植物转化可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实(Sambrook和Russell,(2001)(出处同上))。一般来讲,从转化体提取总DNA,用适当的限制性酶消化,在琼脂糖
凝胶中进行分级分离并且转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook
和Russell,(2001)(出处同上)),可以用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测所述膜或
“印迹”,以证实被引入的基因在植物基因组中的整合。
[0410] 在RNA印迹分析中,根据本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell,(2001)(出处同上)),从转化体的特定组织分离RNA,所述RNA在甲醛琼脂糖凝胶中进行分
级分离,并且印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域内已知的方法(Sambrook和Russell,
(2001)(出处同上)),使所述滤膜与源自杀虫基因的放射性探针杂交,来检测由杀虫基因
编码的RNA的表达。
[0411] 根据标准程序(Sambrook和Russell,(2001)(出处同上)),使用与存在于PIP-1多肽上的一个或多个表位结合的抗体,可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生化分析等,以
证实由杀虫基因编码的蛋白质的存在。
[0412] 转基因植物中性状的堆叠
[0413] 转基因植物可包含本文所公开的一个或多个杀昆虫多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠,从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列的堆叠的转
基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括
但不限于培育各自包含所关注多核苷酸的单独品系,用后续基因转化包含本文所公开的基
因的转基因植物,以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用,术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的两种或更多种性状(例如,两种性状均掺入核基因组中,一种性状掺
入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中,或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在
一个非限制性例子中,“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本文所用的性状
是指衍自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带
于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠,则所关注的
多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与所关注多核
苷酸同时引入,所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如,如果将要引入两条序列,则
可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过
相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中,可能期望引入会抑制所关注
多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物
中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多
核苷酸序列。参见,例如,WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853,上述专利均以引用的方式并入本文。
[0414] 在一些实施例中,编码单独的或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的本文所公开的PIP-1多肽的多核苷酸,可与一种或多种另外的投入性状(例如,除草剂抗性、真菌
抗性、病毒抗性或胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度等等)或产出性状(例如,增加
的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、抗旱性等等)堆叠。因此,可以使用多核苷酸实施例来提供具有灵活地且成
本有效地控制许多农艺学害虫的能力的改善的作物质量的完整农艺学包装
[0415] 可用于堆叠的转基因包括但不限于:
[0416] 1.赋予对昆虫或病害的抗性并编码以下各方面的转基因:
[0417] (A)植物抗病基因。植物防御往往由该植物中抗病基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用激活。可用克隆的抗性基因转化植物
品种,以工程构建出对特定的病原体株系有抗性的植物。参见例如Jones,et al.,(1994)
Science266:789(Jones等人,1994年,《科学》,第266卷,第789页)(抵抗番茄叶霉菌
(Cladosporium fulvum)的番茄Cf-9基因的克隆);Martin,et al.,(1993)Science 262:
1432(Martin等人,1993年,《科学》,第262卷,第1432页)(抵抗丁香假单胞菌番茄致病
变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的番茄Pto基因编码蛋白激酶);Mindrinos,et
al.,(1994)Cell 78:1089(Mindrinos 等人,1994年,《细胞》,第78卷,第1089页)(抵抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的拟南芥RSP2基因)、McDowell and Woffenden,
(2003)Trends Biotechnol.21(4):178-83(McDowell和Woffenden,2003年,《生物技术趋
势》,第21卷,第4期,第178-183页)以及Toyoda,et al.,(2002)Transgenic Res.11(6):
567-82(Toyoda等人,2002年,《转基因研究)》,第11卷,第6期,第567-582页)。抗病植
物是与野生型植物相比更能抵抗病原体的植物。
[0418] (B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或模拟其的合成多肽的基因。参见例如Geiser,et al.,(1986)Gene 48:109(Geiser等人,1986年,《基因》,第48卷,第109页),其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外,编码δ-内毒素基因的DNA分子
可购自马里兰州罗克维尔市(Rockville,Md.)的美国模式培养物保藏所,例如
登录号40098、67136、31995和31998。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他
非限制性例子在以下专利和专利申请中给出,并出于此目的据此以引用方式并入:美国专
利 No.5,188,960、5,689,052、5,880,275、5,986,177、6,023,013、6,060,594、6,063,597、
6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332、7,179,965、
7,208,474、7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、
7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、
7,772,465、7,790,846、7,858,849以及WO 1991/14778、WO 1999/31248、WO 2001/12731、
WO 1999/24581和WO 1997/40162。
[0419] 编码杀虫蛋白的基因也可堆叠,包括但不限于:来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白,诸如PSEEN3174(Monalysin,(2011)PLoS Pathogens,7:1-13(Monalysin,2011年,《公共科学图书馆病原学》,第7卷,第1-13页));来自生防假单胞菌菌株CHA0和Pf-5(之前
的荧光假单胞菌)的杀昆虫蛋白(Pechy-Tarr,(2008)Environmental Microbiology 10:
2368-2386:GenBank Accession No.EU400157(Pechy-Tarr,2008年,《环境微生物学》,第
10卷,第2368-2386页,GenBank登录号EU400157));来自台湾假单胞菌的杀昆虫蛋白
(Liu,et al.,(2010)J.Agric.Food Chem.58:12343-12349(Liu等人,2010年,《农业与食品化学杂志》,第58卷,第12343-12349页))以及来自类产碱假单胞菌的杀昆虫蛋白
(Zhang,et al.,(2009)Annals of Microbiology 59:45-50(Zhang等人,2009年,《微生物学年报》,第59卷,第45-50页)和Li,et al.,(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.89:
159-168(Li等人,2007年,《植物细胞、组织和器官培养》,第89卷,第159-168页));来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe,et al.,(2010)The Open
Toxinology Journal3:101-118(Hinchliffe等人,2010年,《开放毒素学杂志》,第3卷,第
101-118页)和Morgan,et al.,(2001)Applied and Envir.Micro.67:2062-2069(Morgan
等人,2001年,《应用与环境微生物学》,第67卷,第2062-2069页))、美国专利
No.6,048,838和美国专利No.6,379,946;以及δ-内毒素,包括但不限于δ-内毒素基因
的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry 28、Cry 29、Cry 30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry 46、Cry47、Cry49、Cry 51和Cry55类别以及苏云金芽孢杆菌溶细胞Cyt1和Cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋
白的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号M11250)、Cry1Aa2(登录号M10917)、Cry1Aa3(登
录号D00348)、Cry1Aa4(登录号X13535)、Cry1Aa5(登录号D17518)、Cry1Aa6(登录号
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AM237207)、Cry48Ab2(登录号AM237208)、Cry49Aa(登录号AJ841948)、Cry49Aa2(登录号
AM237201)、Cry49Aa3(登录号AM237203)、Cry49Aa4(登录号AM237204)、Cry49Ab1(登录号
AM237202)、Cry50Aa1(登录号AB253419)、Cry51Aa1(登录号DQ836184)、Cry52Aa1(登录号
EF613489)、Cry53Aa1(登录号EF633476)、Cry54Aa1(登录号EU339367)、Cry55Aa1(登录号
EU121521)、Cry55Aa2(登录号AAE33526)。
[0420] δ-内毒素的例子还包括但不限于美国专利No.5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白;美国专利No.8,304,604和8,304,605的DIG-3或DIG-11毒素(Cry蛋白诸如Cry1A
的α-螺旋1和/或α-螺旋2变体的N端缺失);美国专利申请序列号10/525,318的
Cry1B;美国专利No.6,033,874的Cry1C;美国专利No.5,188,960、6,218,188的Cry1F;
美国专利No.7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体);Cry2蛋白,诸
如美国专利No.7,064,249的Cry2Ab蛋白);Cry3A蛋白,包括但不限于通过融合至少
两种不同Cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫
蛋白(eHIP)(美国专利申请公布No.2010/0017914);Cry4蛋白;Cry5蛋白;Cry6蛋白;
美 国 专 利 No.7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499 和
7,462,760的Cry8蛋白;Cry9蛋白,诸如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F
家族的 成员;Naimov,et al.,(2008)Applied and Environmental Microbiology74:
7145-7151(Naimov等人,2008年,《应用与环境微生物学》,第74卷,第7145-7151页)
的Cry15蛋白;美国专利No.6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋
白;美国专利No.6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229
的CryET33和CryET34蛋白;美国专利公布No.2006/0191034、2012/0278954和PCT公布
No.WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物;美国专利No.6,083,499、6,548,291
和6,340,593的Cry35Ab1蛋白;Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素;TIC901或相关
毒素;US 2008/0295207的TIC807;PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、
TIC812、TIC127、TIC128;美国专利No.8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038;
US7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049;WO 2006/083891的AXMI-018、
AXMI-020 和 AXMI-021;WO 2005/038032 的 AXMI-010;WO 2005/021585 的 AXMI-003;US
2004/0250311的AXMI-008;US 2004/0216186的AXMI-006;US 2004/0210965的AXMI-007;
US 2004/0210964 的 AXMI-009;US 2004/0197917 的 AXMI-014;US 2004/0197916 的
AXMI-004;WO 2006/119457 的 AXMI-028 和 AXMI-029;WO 2004/074462 的 AXMI-007、
AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004;美 国 专 利 No.8,084,416
的 AXMI-150;US20110023184 的 AXMI-205;US 2011/0263488 的 AXMI-011、AXMI-012、
AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、
AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064;US 2010/0197592的AXMI-R1 和
相关蛋白;WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z;
WO11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231;美 国 专 利No.8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163 和
AXMI-184;US 2010/0298211 的 AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035 和 AXMI-045;
US20090144852的AXMI-066和AXMI-076;美国专利No.8,318,900的AXMI128、AXMI130、
AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189;US 2010/0005543的 AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137;美国专利No.8,319,019的Cry蛋白,诸如具有经修
饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A;以及美国专利申请公布No.2011/0064710的来自苏
云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是
本领域技术人员熟知的(参见,lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/(可使
用“www”前缀在万维网上访问)的Crickmore,et al.,“Bacillus thuringiensis toxin
nomenclature”(2011)(Crickmore等人,“苏云金芽孢杆菌毒素命名”,2011年))。Cry蛋
白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述,参见van Frannkenhuyzen,(2009)
J.Invert.Path.101:1-16(van Frannkenhuyzen,2009年,《无脊椎动物病理学杂志》,第101卷,第1-16页))。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的,并且包
括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和 CBI-Bt的Cry转基因植物已取得监管批准(参见,Sanahuja,(2011)Plant Biotech Journal9:
283-300(Sanahuja,2011年,《植物生物技术杂志》,第9卷,第283-300页)和cera-gmc.
org/index.php?action=gm_crop_database(可使用“www”前缀在万维网上访问)的
CERA(2010)GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment(CERA),
ILSI Research Foundation,Washington D.C.(CERA(2010)转基因作物数据库,环境
风险评估中心(CERA),国际生命科学学院研究基金,华盛顿特区))。本领域技术人员
熟知的不止一种杀虫蛋白也可在植物中表达,诸如Vip3Ab&Cry1Fa(US2012/0317682)、
Cry1BE&Cry1F(US2012/0311746)、Cry1CA&Cry1AB(US2012/0311745)、
Cry1F&CryCa(US2012/0317681)、Cry1DA&Cry1BE(US2012/0331590)、
Cry1DA&Cry1Fa(US2012/0331589)、Cry1AB&Cry1BE(US2012/0324606)、 以 及
Cry1Fa&Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US2012/0324605)。杀虫蛋白还包括杀昆虫脂肪酶,包括
美国专利No.7,491,869的脂酰基水解酶和诸如来自链霉菌属(Streptomyces)的胆固醇
氧化酶(Purcell et al.(1993)Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413(Purcell等
人,1993年,《生物化学与生物物理研究通讯》,第15卷,第1406-1413页))。杀虫蛋白还
包括美国专利No.5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020
的VIP(植物性杀昆虫蛋白)毒素等等。其他VIP蛋白是本领域技术人员熟知的(参见,
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html(可使用“www”前缀在万维网
上访问))。杀虫蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白,可得自诸如致病杆菌属、发光杆菌属和
类芽孢杆菌属的生物体(参见,美国专利No.7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有
“独立”杀昆虫活性,并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。“独
立”TC蛋白(来自例如发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性可通过源自不同
属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强。有三种主要类型的TC蛋白。如本
文所提及的,A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋
白C”)增强A类蛋白的毒性。A类蛋白的例子是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的
例子是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的例子是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀
虫蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突
变体(美国专利No.8,334,366)。
[0421] (C)编码昆虫特异性激素信息素,如蜕皮甾类和保幼激素,其变体、基于其的模拟物或者其拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见例如Hammock,et al.,(1990)Nature 344:
458(Hammock等人,1990年,《自然》,第344卷,第458页),其公开了以杆状病毒来表达克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)。
[0422] (D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸,所述昆虫特异性肽在表达时会扰乱受影响害虫的生理机能。例如参见以下文献的公开内容:Regan,(1994)J.Biol.Chem.269:
9(Regan,1994年,《生物化学杂志》,第269卷,第9页)(表达克隆产生出编码昆虫利尿激
素受体的DNA);Pratt,et al.,(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(Pratt等
人,1989年,《生物化学与生物物理研究通讯》,第163卷,第1243页)(在太平洋折翅蠊
(Diploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin));Chattopadhyay,et al.,
(2004)Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54(Chattopadhyay等人,2004年,
《微生物学评论》,第30卷,第1期,第33-54页);Zjawiony,(2004)J Nat Prod 67(2):
300-310(Zjawiony,2004年,《天然产物杂志》,第67卷,第2期,第300-310页);Carlini and Grossi-de-Sa(2002)Toxicon 40(11):1515-1539(Carlini 和 Grossi-de-Sa,2002
年,《毒素》,第40卷,第11期,第1515-1539页);Ussuf,et al.,(2001)Curr Sci.80(7):
847-853(Ussuf等人,2001年,《当代科学》,第80卷,第7期,第847-853页),以及
Vasconcelos and Oliveira(2004)Toxicon44(4):385-403(Vasconcelos和Oliveira,2004
年,《毒素》,第44卷,第4期,第385-403页)。还可参见授予Tomalski等人的美国专利
No.5,266,317,其公开了编码昆虫特异性毒素的基因。
[0423] (E)编码负责单萜烯、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素(phenylpropanoid)衍生物或者别的具有杀昆虫活性的非蛋白分子的超量积累的酶的多核苷酸。
[0424] (F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸;例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶,无论是天然的还是合成的。参见
以Scott等人的名义的PCT申请WO 1993/02197,其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基
因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可例如以登录号39637和67152
从 获得。另 参见Kramer,et al.,(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.23:
691(Kramer等人,1993年,《昆虫生物化学与分子生物学》,第23卷,第691页),其教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列,以及Kawalleck,et al.,(1993)Plant Molec.
Biol.21:673(Kawalleck等人,1993年,《植物分子生物学》,第21卷,第673页),其提供
了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列,以及美国专利No.6,563,020、7,145,060和
7,087,810。
[0425] (G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如,参见Botella,et al.,(1994)Plant Molec.Biol.24:757(Botella等人,1994年,《植物分子生物学》,第24卷,第757
页),其公开了绿豆调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列,以及Griess,et al.,(1994)Plant
Physiol.104:1467(Griess等人,1994年,《植物生理学》,第104卷,第1467页),其提供了玉蜀黍钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。
[0426] (H)编码疏水力矩肽的多核苷酸。参见PCT申请WO 1995/16776和美国专利No.5,580,852(公开了鲎抗菌肽的肽衍生物,其抑制真菌植物病原体),以及PCT申请WO
1995/18855和美国专利No.5,607,914(教导了合成的抗微生物肽,其赋予抗病性)。
[0427] (I)编码膜透性酶、通道离子载体或通道阻断剂的多核苷酸。例如参见,Jaynes,et al.,(1993)Plant Sci.89:43(Jaynes等人,1993年,《植物科学》,第89卷,第43页)
公开的异源表达天蚕杀菌肽-β裂解肽类似物以使转基因烟草植物能抵抗青枯假单胞菌
(Pseudomonas solanacearum)。
[0428] (J)编码病毒侵入性蛋白或从中衍生的复合毒素的基因。例如,病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累,可赋予对由该外壳蛋白基因衍生的病毒以及相关病毒所造成的
病毒感染和/或病害发展的抗性。参见Beachy,et al.,(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:
451(Beachy等人,1990年,《植物病理学年评》,第28卷,第451页)。外壳蛋白介导的抗性
已被赋予转化植物以抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条斑病毒、马铃薯X病毒、马
铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。
[0429] (K)编码昆虫特异性抗体或从中衍生的免疫毒素的基因。因此,靶向昆虫肠道中的关键代谢功能的抗体将会灭活受影响的酶,从而杀死昆虫。Cf.Taylor,
et al.,Abstract#497,SEVENTH INT ′ L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE
INTERACTIONS(Edinburgh,Scotland,1994)(Cf.Taylor等人,第497号摘要,《第七届分子
植物微生物国际交流会论文集》(苏格兰爱丁堡(Edinburgh,Scotland),1994年)(通过产
生单链抗体片段对转基因烟草进行酶促灭活)。
[0430] (L)编码病毒特异性抗体的基因。参见例如,Tavladoraki,et al.,(1993)Nature366:469(Tavladoraki等人,1993年,《自然》,第366卷,第469页),其显示表达重组抗体基因的转基因植物免于病毒攻击。
[0431] (M)编码在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此,真菌内切α-1,4-D-聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同型-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶
而有利于真菌定植和植物营养物释放。参见Lamb,et al.,(1992)Bio/Technology 10:
1436(Lamb等人,1992年,《生物/技术》,第10卷,第1436页)。Toubart,et al.,(1992)
Plant J.2:367(Toubart等人,1992年,《植物杂志》,第2卷,第367页)描述了编码菜豆多聚半乳糖醛酸内切酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。
[0432] (N)编码在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。例如,Logemann,etal.,(1992)Bio/Technology 10:305(Logemann等人,1992年,《生物/技术》,第10卷,第
305页)已表明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物对真菌病害的抗性提高。
[0433] (O)参与系统获得性抗性(SAR)响应的基因和/或发病相关基因。Briggs,(1995)Current Biology 5(2)((Briggs,1995年,《当代生物学》,第5卷,第2期)、Pieterse and Van Loon,(2004)Curr.Opin.Plant Bio.7(4):456-64(Pieterse 和 Van Loon,2004 年,
《植物生物学新见》,第7卷,第4期,第456-464页)以及Somssich,(2003)Cell 113(7):
815-6(Somssich,2003年,《细胞》,第113卷,第7期,第815-816页)。
[0434] (P) 抗 真 菌 基 因 (Cornelissen and Melchers,(1993)Pl.Physiol.101:709-712(Cornelissen和Melchers,1993年,《植物生理学》,第101卷,第709-712页);
Parijs,et al.,(1991)Planta 183:258-264(Pariis等人,1991年,《植物学》,第183
卷,第 258-264页 );以 及 Bushnell,et al.,(1998)Can.J.of Plant Path.20(2):
137-149(Bushnell等人,1998年,《加拿大植物病理学杂志》,第20卷,第2期,第137-149
页))。还可参见美国申请序列号09/950,933、11/619,645、11/657,710、11/748,994、
11/774,121以及美国专利No.6,891,085和7,306,946。用于作为抵抗真菌病原体的植物
防御反应的第一步而感知几丁质片段的LysM受体样激酶(US 2012/0110696)。
[0435] (Q)解毒基因,诸如串珠镰孢菌毒素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮以及它们的结构相关衍生物的解毒基因。例如,参见美国专利No.5,716,820、5,792,931、
5,798,255、5,846,812、6,083,736、6,538,177、6,388,171和6,812,380。
[0436] (R)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见美国专利No.7,205,453。
[0437] (S)防御素基因。参见WO 2003/000863以及美国专利No.6,911,577、6,855,865、6,777,592和7,238,781。
[0438] (T)赋予对线虫的抗性的基因。参见例如PCT申请No.WO1996/30517、PCT申 请 No.WO 1993/19181、WO 2003/033651 以 及 Urwin,et al.,(1998)Planta 204:
472-479(Urwin等人,1998年,《植物》,第204卷,第472-479页);Williamson,(1999)Curr Opin Plant Bio.2(4):327-31(Williamson,1999年,《植物生物学新见》,第2卷,第4期,第327-331页);美国专利No.6,284,948和7,301,069及miR164基因(WO 2012/058266)。
[0439] (U)赋予对疫霉根腐病的抗性的基因,诸如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见例如,Shoemaker,et al.,Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean,Plant Genome IV Conference,San Diego,Calif.(1995)(Shoemaker等人,大豆中的疫霉根腐病抗性基因作图,第四届植物基因组会议,加利福尼亚州圣地亚
哥,1995年)。
[0440] (V)赋予对褐茎腐病的抗性的基因,诸如美国专利No.5,689,035中所述,该专利出于此目的以引用方式并入。
[0441] (W)赋予对炭疽菌(Colletotrichum)的抗性的基因,诸如美国专利申请公布US2009/0035765中所述,该专利出于此目的以引用方式并入。这包括可用作单基因座转换的
Rcg基因座。
[0442] 2.赋予对除草剂的抗性的转基因,例如:
[0443] (A)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂诸如咪唑啉酮或磺酰脲的抗性的多核苷酸。这个类别的示例性基因编码突变的ALS酶和AHAS酶,例如分别由Lee,et al.,
(1988)EMBO J.7:1241(Lee等人,1988年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第7卷,第1241页)和Miki,et al.,(1990)Theor.Appl.Genet.80:449(Miki等人,1990年,《理论与应用遗传学》,第80卷,第449页)所述。还可参见美国专利No.5,605,011、5,013,659、5,141,870、
5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824;美国专利申请序列号11/683,737以及国际专利公布WO 1996/33270。
[0444] (B)编码对如下的抗性的蛋白的多核苷酸:草甘磷(抗性分别由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予)和其他膦酰基化合物如
草丁膦(草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)
草胺膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸(proprionic acid)和环
己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见例如授予Shah等人的美国专利
No.4,940,835,其公开了EPSPS形式的能赋予草甘膦抗性的核苷酸序列。授予Barry等人的
美国专利No.5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利No.6,566,587、
6,338,961、6,248,876 B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、
5,312,910、5,188,642、5,094,945、4,940,835、5,866,775、6,225,114 B1、6,130,366、
5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE 37,287 E 和
5,491,288,以及国际专利公布EP1173580、WO 2001/66704、EP 1173581和EP 1173582,这
些专利出于此目的以引用方式并入本文。还将草甘膦抗性赋予能表达编码草甘膦氧化还原
酶的基因的植物,如美国专利No.5,776,760和5,463,175中更完全地描述,这些专利出于
此目的以引用方式并入本文。另外,可以通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因
向植物赋予草甘磷抗性。参见例如美国专利No.7,462,481、7,405,074以及美国专利公布
No.US 2008/0234130)。编码突变的aroA基因的DNA分子可以以 登录号39256获
得,该突变基因的核苷酸序列在授予Comai的美国专利No.4,769,061中公开。授予Kumada
等人的欧洲专利申请No.0 333 033和授予Goodman等人的美国专利No.4,975,374公开了
赋予对除草剂(诸如L-草胺膦)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。草胺膦乙酰
转移酶基因的核苷酸序列在授予Leemans等人的欧洲专利No.0 242 246和0 242 236,De
Greef,et al.,(1989)Bio/Technology7:61(De Greef等人,1989年,《生物/技术》,第7卷,第61页)中提供,其描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物
的产生。还可参见美国专利No.5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、
5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616以及5,879,903,这些专利出于此目的以引
用方式并入本文。示例性的赋予对苯氧基丙酸和环己酮(诸如烯禾啶和氟吡甲禾灵)的抗
性的基因是Marshall,et al.,(1992)Theor.Appl.Genet.83:435(Marshall等人,1992年,《理论与应用遗传学》,第83卷,第435页)所述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。
[0445] (C)编码对如下的抗性的蛋白的多核苷酸:抑制光合作用的除草剂,诸如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。Przibilla,et al.,(1991)Plant Cell 3:
169(Przibilla等人,1991年,《植物细胞》,第3卷,第169页)描述了用编码突变的psbA基
因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在授予Stalker的美国
专利No.4,810,648中公开,含有这些基因的DNA分子可以以 登录号53435、67441
和67442获得。Hayes,et al.,(1992)Biochem.J.285:173(Hayes等人,1992年,《生物化
学杂志》,第285卷,第173页)描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
[0446] (D)编码对乙酰羟酸合酶的抗性的蛋白的多核苷酸,该乙酰羟酸合酶已被发现能使表达这种酶的植物抵抗多种类型的除草剂,其已被引入到多种植物中(参见例如
Hattori,et al.,(1995)Mol Gen Genet.246:419(Hattori等人,1995年,《分子遗传学与普通遗传学》,第246卷,第419页))。赋予对除草剂的抗性的其他基因包括:编码大鼠细胞色
素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota,et al.,
(1994)Plant Physiol106:17(Shiota等人,1994年,《植物生理学》,第106卷,第17页)),编码谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(Aono,et al.,(1995)Plant Cell Physiol
36:1687(Aono等人,1995年,《植物细胞生理学》,第36卷,第1687页)),以及编码各种磷酸转移酶的基因(Datta,et al.,(1992)Plant Mol Biol 20:619(Datta等人,1992年,《植物分子生物学》,第20卷,第619页))。
[0447] (E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸,原卟啉原氧化酶是产生叶绿素所需的。所述protox酶充当多种除草化合物的靶标。这些除草剂还
抑制所存在的所有不同植物物种的生长,造成它们全部毁灭。能抵抗这些除草剂的含有改
变的protox活性的植物的开发在美国专利No.6,288,306 B1、6,282,837 B1、和5,767,373
以及国际专利公布WO 2001/12825中有所描述。
[0448] (F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧苯氧
基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂诸如喹禾灵))除草剂的耐受性。在植物中实现除草
剂耐受性的aad-1基因自身首次公开于WO 2005/107437(还可参见US 2009/0093366)。
aad-12基因,源自代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans),其编码芳氧基链烷酸酯双加氧
酶(AAD-12)蛋白,通过使若干具有芳氧基链烷酸酯部分的除草剂(包括苯氧基生长素(例
如,2,4-D、MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如,氟草烟、绿草定))失活而赋予对2,4-二氯
苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。
[0449] (G)编码美国专利申请公布2003/0135879中公开的用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸;
[0450] (H)编码美国专利No.4,810,648中公开的用于赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子;
[0451] (I)编码Misawa,et al.,(1993)Plant J.4:833-840(Misawa等人,1993年,《植物杂志》,第4卷,第833-840页)以及Misawa,et al.,(1994)Plant J.6:481-489(Misawa
等人,1994年,《植物杂志》,第6卷,第481-489页)中所述的实现达草灭耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子。
[0452] 3.赋予或促成谷粒特性改变的转基因,所述特性例如:
[0453] (A)脂肪酸改变,例如,通过以下方式改变:
[0454] (1)下调硬脂酰-ACP以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon,et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2624(Knultzon等人,1992年,《美国国家科学院院刊》,第89卷,第2624页)和WO 1999/64579(改变玉米中脂质分布的基因);
[0455] (2)通过FAD-2基因修饰使油酸升高和/或通过FAD-3基因修饰使亚麻酸减少(参见美国专利No.6,063,947、6,323,392、6,372,965和WO 1993/11245);
[0456] (3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量,诸如WO 2001/12800;
[0457] (4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superall、mi1ps以及各种Ipa基因诸如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如,参见WO 2002/42424、WO 1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、WO 2003/011015、美国专利No.6,423,886、6,197,561、6,825,397以及美国专利申请公布
No.US 2003/0079247、US 2003/0204870以及Rivera-Madrid,et al.,(1995)Proc.Natl.
Acad.Sci.92:5620-5624(Rivera-Madrid等人,1995年,《美国国家科学院院刊》,第92卷,第5620-5624页)。
[0458] (5)编码如下的基因:产生长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶(美国专利No.8,058,571和8,338,152)、降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利No.8,063,269)、
改善ω-3脂肪酸分布的报春花Δ6去饱和酶。
[0459] (6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白,具体地讲,在产生转基因植物和调节种子贮藏化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮藏蛋白)水平的方法中使用的以
及在调节植物种子大小、种子数量、种子重量、根长和叶片大小的方法中使用的脂质代谢蛋
白(LMP)(EP 2404499)。
[0460] (7)改变高水平表达糖诱导2(HSI2)蛋白在植物中的表达以提高或降低HSI2在植物中的表达。提高HSI2的表达会增加油含量,而降低HSI2的表达会降低脱落酸敏感性和
/或增强抗旱性(US 2012/0066794)。
[0461] (8)细胞色素b5(Cb5)单独表达或与FAD2一起表达以调节植物种子中的油含量,尤其是增加ω-3脂肪酸的水平并提高ω-6与ω-3脂肪酸的比率(美国专利申请公布
No.2011/0191904)。
[0462] (9)编码用于调节糖代谢的wrinkledl样多肽的核酸分子(美国专利No.8,217,223)。
[0463] (B)磷含量改变,例如,通过以下方式改变:
[0464] (1)引入植酸酶编码基因将增强肌醇六磷酸的分解,从而给转化植物增加更多的游离磷酸盐。例如,参见Van Hartingsveldt,et al.,(1993)Gene 127:87(Van
Hartingsveldt等人,1993年,《基因》,第127卷,第87页),其公开了黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因的核苷酸序列。
[0465] (2)调节降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉蜀黍中,这例如可通过以下方式来实现:将与一种或多种等位基因如LPA等位基因(在以低水平植酸为特征的玉蜀黍突变株
中鉴定到)相关的DNA进行克隆并再引入,如WO 2005/113778中所述,和/或改变肌醇
激酶活性,如WO 2002/059324、US 2003/0009011、WO 2003/027243、US 2003/0079247、WO
1999/05298、美国专利No.6,197,561、美国专利No.6,291,224、美国专利No.6,391,348、WO
2002/059324、US 2003/0079247、WO 1998/45448、WO 1999/55882、WO 2001/04147中所述。
[0466] (C)碳水化合物改变,例如通过改变能影响淀粉的分支模式的酶的基因,或者通过改变能改变硫氧还蛋白的基因诸如NTR和/或TRX(参见美国专利No.6,531,648,其出
于此目的以引用方式并入本文)和/或γ玉米蛋白敲除或突变体诸如cs27或TUSC27或
en27(参见美国专利No.6,858,778以及US 2005/0160488、US 2005/0204418;这些专利出
于此目的以引用方式并入本文)来实现。参见Shiroza,et al.,(1988)J.Bacteriol.170:
810(Shiroza等人,1988年,《细菌学杂志》,第170卷,第810页)(链球菌(Streptococcus)
突变型果糖基转移酶基因的核苷酸序列),Steinmetz,et al.,(1985)Mol.Gen.Genet.200:
220(Steinmetz等人,1985年,《分子遗传学与普通遗传学》,第200卷,第220页)(枯草
芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列),Pen,et al.,(1992)
Bio/Technology 10:292(Pen等人,1992年,《生物/技术》,第10卷,第292页)(表达地衣
芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产),Elliot,et al.,
(1993)Plant Molec.Biol.21:515(Elliot等人,1993年,《植物分子生物学》,第21卷,第
515页)(番茄转化酶基因的核苷酸序列), et al.,(1993)J.Biol.Chem.268:
22480( 等人,1993年,《生物化学杂志》,第268卷,第22480页)(大麦α-淀
粉酶基因的定点诱变)以及Fisher,et al.,(1993)Plant Physiol.102:1045(Fisher
等人,1993年,《植物生理学》,第102卷,第1045页)(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶II),WO
1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-表异构酶、Fragile 1和2、Ref1、HCHL、C4H改善消
化性和/或淀粉提取),美国专利No.6,232,529(通过改变淀粉水平(AGP)来生产高油种子
的方法)。本文提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀
粉含量和/或组成。
[0467] (D)抗氧化物含量或组成改变,如生育酚或生育三烯醇的改变。例如,参见涉及抗氧化物水平操纵的美国专利No.6,787,683、US 2004/0034886和WO 2000/68393以及通过
改变尿黑酸牻牛儿基牻牛儿基转移酶(hggt)的WO 2003/082899。
[0468] (E)必需种子氨基酸改变。例如,参见美国专利No.6,127,600(提高种子中的必需氨基酸的积累的方法)、美国专利No.6,080,913(提高种子中的必需氨基酸的积累的
二元方法)、美国专利No.5,990,389(高赖氨酸)、WO 1999/40209(改变种子中的氨基酸
组成)、WO 1999/29882(改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利No.5,850,016(改
变种子中的氨基酸组成)、WO 1998/20133(必需氨基酸的水平提高的蛋白质)、美国
专利No.5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利No.5,885,801(高苏氨酸)、美国专利
No.6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利No.6,459,019(赖氨酸和苏氨酸提高)、
美国专利No.6,441,274(植物色氨酸合酶β亚单位)、美国专利No.6,346,403(甲硫氨酸
代谢酶)、美国专利No.5,939,599(高硫)、美国专利No.5,912,414(甲硫氨酸提高)、WO
1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO 1998/45458(必需氨基酸的百分比更高的工程
种子蛋白)、WO 1998/42831(赖氨酸提高)、美国专利No.5,633,436(含硫氨基酸含量提
高)、美国专利No.5,559,223(具有确定的结构、含有可编程的必需氨基酸水平的合成贮藏
蛋白,用来改进植物的营养价值)、WO 1996/01905(苏氨酸提高)、WO 1995/15392(赖氨酸
提高)、US 2003/0163838、US 2003/0150014、US 2004/0068767、美国专利No.6,803,498、
WO 2001/79516。
[0469] 4.控制雄性不育的基因:
[0470] 有几种方法可用来赋予遗传性雄性不育,诸如基因组内单独位置处的多个赋予雄性不育的突变基因,如授予Brar等人的美国专利No.4,654,465和4,727,219中公开,以及
染色体易位,如Patterson在美国专利No.3,861,709和3,710,511中所描述。除这些方法
以外,Albertsen等人的美国专利No.5,432,068描述了核雄性不育的系统,其包括:鉴定对
于雄性能育性关键的基因;沉默这个对于雄性能育性关键的天然基因;从该必要的雄性能
育性基因除去天然启动子并将其用诱导型启动子代替;将这个经遗传工程改造的基因插回
植物中;从而产生雄性不育的植物,因为该诱导型启动子不“打开”而导致该雄性能育性基
因不被转录。通过诱导(或“开启”)启动子,其继而允许赋予雄性能育性的基因被转录,来
恢复能育性。
[0471] (A)在绒毡层特异性启动子的控制下和在施加化学物质N-Ac-PPT的情况下引入脱乙酰酶基因(WO 01/29237)。
[0472] (B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956、WO 1992/13957)。
[0473] (C)引入芽孢杆菌RNA酶(barnase)和芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)基因(Paul,et al.,(1992)Plant Mol.Biol.19:611-622(Paul等人,1992年,《植物分子生物
学》,第19卷,第611-622页))。
[0474] 核雄性和雌性不育系统以及基因的另外的例子,还可参见美国专利No.5,859,341、6,297,426、5,478,369、5,824,524、5,850,014、和6,265,640;所有这些专利据此以引用方式并入。
[0475] 5.能产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因。
[0476] 这包括引入可用于FLP/FRT系统的FRT位点和/或可用于Cre/Loxp系统的Lox位点。例如,参见Lyznik,et al.,(2003)Plant Cell Rep 21:925-932(Lyznik等人,2003年,《植物细胞报道》,第21卷,第925-932页)和WO 1999/25821,所述文献据此以引用方
式并入。其他可使用的系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser,et al.,(1991)Vicki
Chandler,The Maize Handbook ch.118(Springer-Verlag 1994)(Maeser等人,1991年,
Vicki Chandler,《玉蜀黍手册》,第118章(斯普林格出版社,1994年))、大肠杆菌的Pin
重组酶(Enomoto等人,1983年)以及pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人,1992年)。
[0477] 6.影响非生物胁迫抗性的基因
[0478] 包括但不限于开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性和抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。
[0479] (A)例如参见WO 2000/73475,其中通过改变苹果酸盐而改变水利用效率;美 国 专 利 No.5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、
6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、
WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO
2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521;
[0480] (B)WO 199938977,其描述了能有效减轻严寒、高盐和干旱对植物的不利作用以及赋予植物表型以其他有利作用的基因,包括CBF基因和转录因子;
[0481] (C)US 2004/0148654和WO 2001/36596,其中植物中的脱落酸被改变,导致植物表型改善,诸如产量增加和/或对非生物胁迫的耐受性提高;
[0482] (D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利No.7,531,723和6,992,237,其中细胞分裂素表达经修饰,产生具有增强的胁迫耐受性诸如耐旱性和/或增加的产量的植
物。另参见WO2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利No.6,084,153、WO
200164898、美国专利No.6,177,275和美国专利No.6,107,547(增强氮利用和改变氮响应
度)。
[0483] (E)有关乙烯改变,参见US 2004/0128719、US 2003/0166197和WO2000/32761;
[0484] (F)有关非生物胁迫的植物转录因子或转录调节因子,参见例如US2004/0098764或US 2004/0078852;
[0485] (G)增加液泡焦磷酸酶的表达的基因,诸如实现产量增加的AVP1(美国专利No.8,058,515);编码如下多肽的核酸:HSFA4或HSFA5(A4或A5类的热休克因子)多肽、寡
肽转运蛋白(OPT4样)多肽;plastochron2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关的同源盒1
样(WOX1样)多肽(美国专利申请公布No.US2011/0283420);
[0486] (H)编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸的下调以调节程序性细胞死亡(美国专利No.8,058,510)使活力增强;
[0487] (I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利公布No.US2011/0277181);
[0488] (J)编码用于调节发育、调节对胁迫的响应以及调节胁迫耐受性的ACC合成酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利公布No.US20100287669)。
[0489] (K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予抗旱性的蛋白的多核苷酸(WO2012/058528)。
[0490] (L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公布No.2012/0272352)。
[0491] (M)实现胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白(美国专利No.8,338,661)。
[0492] (N)SAL1编码基因中的突变增强了胁迫耐受性,包括增强的抗旱性(美国专利申请公布No.2010/0257633)。
[0493] (O)编码选自如下的多肽的核酸序列的表达:GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽和YTP多肽,增强了产量相关性状(美国专利申请公布No.2011/0061133)。
[0494] (P)调节编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸在植物中的表达,以增强植物中的产量相关性状,尤其是增加种子产量(美国专利申请公布No.2010/0024067)。
[0495] 可将其他影响植物生长和农艺性状(诸如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的基因和转录因子引入或渐渗到植物中,参见如WO1997/49811(LHY)、
WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美 国专 利NO.6,573,430(TFL)、美 国专 利
No.6,713,663(FT)、WO 1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO
2000/44918(VRN2)、WO 1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美 国
专利No.6,794,560、美国专利No.6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)以及WO
2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。
[0496] 7.赋予增加的产量的基因
[0497] (A)由1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶样多肽(ACCDP)编码核酸所转化的转基因作物,其中该核酸序列在作物中的表达导致与植物的野生型品种相比,植物根生长增加和/
或产量增加,和/或对环境胁迫的耐受性增强(美国专利No.8,097,769)。
[0498] (B)使用种子偏好启动子过表达玉蜀黍锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)已显示出能增强植物生长、增加籽粒数量和单株植物的总籽粒重量(US 2012/0079623)。
[0499] (C)玉蜀黍侧生器官边界(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDP1)的组成型过表达已显示出能增加籽粒数量和单株植物的总籽粒重量(2012/0079622)。
[0500] (D)通过调节编码VIM1(甲基化变体1)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素响应因子)多肽的核酸在植物中的表达来增
强植物中的产量相关性状(WO 2012/038893)。
[0501] (E)调节编码Ste20样多肽或其同源物的核酸在植物中的表达得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)。
[0502] (F)编码用于改变植物根构型的二磷酸核苷激酶(NDK)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公布No.2009/0064373)。
[0503] 8.赋予植物消化性的基因。
[0504] (A)通过调节木聚糖合酶的表达来改变存在于植物细胞壁中的木聚糖的水平(US8,173,866)。
[0505] 在一些实施例中,堆叠的性状可为已取得监管批准的性状或事件,包括但不限于表4A-表4F中的事件。
[0506] 表4A Triticum aestivum小麦
[0507]
[0508] 表4B Glycine max L.大豆
[0509]
[0510]
[0511] 表4C Medicago sativa苜蓿
[0512]
[0513] 表4D Oryza sativa水稻
[0514]
[0515]
[0516] 表4E Helianthus annuus向日葵
[0517]
[0518] 表4F Zea mays L.玉蜀黍
[0519]
[0520]
[0521]
[0522] 表4F,续表Zea mays L.玉蜀黍
[0523]
[0524]
[0525] 表4F,续表Zea mays L.玉蜀黍
[0526]
[0527]
[0528] 表4F,续表Zea mays L.玉蜀黍
[0529]
[0530]
[0531] 表4F,续表Zea mays L.玉蜀黍
[0532]
[0533] 其他监管批准的事件是本领域技术人员熟知的并且可见于环境风险评估中心(cera-gmc.org/?action=gm_crop_database,可使用www前缀对其进行访问)和
国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of
Agri-Biotech Applications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp,可使用www
前缀对其进行访问)。
[0534] 基因沉默
[0535] 在一些实施例中,堆叠性状可为所关注的一种或多种多核苷酸的沉默形式,从而导致一种或多种靶标害虫多肽的抑制。在一些实施例中,所述沉默通过使用抑制DNA构建
体而实现。
[0536] 在一些实施例中,PIP-1、PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PSEEN3174(SEQ ID NO:6)、PIP-1C(SEQ ID NO:332)以及PIP-1B(SEQ ID NO:4)多肽或其片段或变体中的一者或多者
可与如上文所述的编码具有杀昆虫活性或农艺性状的一种或多种多肽的一种或多种多核
苷酸堆叠,并且任选地还可包含使如下文讨论的一种或多种靶多核苷酸发生基因沉默的一
种或多种多核苷酸。
[0537] “抑制DNA构建体”是这样的重组DNA构建体,其在转化或稳定整合到植物的基因组中时导致植物中靶基因的“沉默”。靶基因对于植物可为内源的或转基因的。如本文相对
于靶基因所用的“沉默”一般是指由靶基因表达的mRNA或蛋白/酶的水平和/或酶活性或
蛋白功能的水平的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下降、减小、抑制、消除和防止。“沉默”或“基因沉默”并不规定机制,并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。
[0538] 抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域,并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的所有或部分核酸序列。根据将要采用的方法,该区域可与所关注
的基因的所有或部分有义链(或反义链)100%相同或少于100%相同(例如,至少50%相
同或51%与100%相同之间的任何整数)。
[0539] 抑制DNA构建体是本领域熟知的,易于在选择所关注的靶基因后即进行构建,并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑
制构建体、产生双链RNA的构建体,以及更一般地,RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体
诸如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
[0540] “反义抑制”是指能够抑制靶蛋白的表达的反义RNA转录物的产生。
[0541] “反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补,并且能阻断靶分离核酸片段的表达的RNA转录物(美国专利No.5,107,065)。反义RNA的互补性可存在于特定
基因转录物的任何部分,即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或者编码序列。
[0542] “共抑制”是指能够抑制靶蛋白的表达的有义RNA转录物的产生。“有义”RNA是指包括mRNA并且可在细胞内或者在体外被翻译成蛋白质的RNA转录物。之前已通过集中于
在有义取向上与天然mRNA具有同源性的核酸序列的过表达,使得所有与过表达序列具有
同源性的RNA减少,而设计了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret,et al.(1998)Plant
J.16:651-659(Vaucheret等人,1998年,《植物杂志》,第16卷,第651-659页)和Gura,
(2000)Nature 404:804-808(Gura,2000年,《自然》,第404卷,第804-808页))。
[0543] 另一种变型描述了植物病毒序列用于指导近端mRNA编码序列的抑制的用途(PCT公布WO 1998/36083)。
[0544] 最近的研究已描述了“发夹”结构的用途,所述“发夹”结构掺入了互补取向的全部或部分mRNA编码序列,从而使所表达的RNA产生可能的“茎-环”结构(PCT公布No.WO
1999/53050)。在这种情况下,茎由与相对于启动子在有义或反义取向上插入的所关注基
因相对应的多核苷酸形成,并且环由所关注基因的在构建体中不具有互补序列的一些多核
苷酸形成。这增加了恢复的转基因植物中共抑制或沉默的频率。有关发夹抑制的综述,参
见Wesley,et al.,(2003)Methods in Molecular Biology,Plant Functional Genomics:
Methods and Protocols 236:273-286(Wesley等人,2003年,《分子生物学、植物功能基因组学方面的方法:方法和方案》,第236卷,第273-286页)。
[0545] 其中茎由至少30个来自待抑制的基因的核苷酸形成并且环由随机的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(WO 1999/61632)。
[0546] 也已经描述了多聚T和多聚A序列用于建立茎-环结构中的茎的用途(WO2002/00894)。
[0547] 又一种变型包括,使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。已经证实,用这样的重组DNA片段制备的转基因生物体具有降低水平的由形成环的核苷酸片段编
码的蛋白,如PCT公布No.WO 2002/00904所述。
[0548] RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性的转录后基因沉默的过程(Fire,et al.,(1998)Nature 391:806(Fire等人,1998年,《自然》,第391卷,第
806页))。植物中的对应过程通常称作转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默,并且在真菌
中也称作压抑(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因的表达的
进化上保守的细胞防御机制,并且通常由不同的植物区系和门共有(Fire,et al.,(1999)
Trends Genet.15:358(Fire等人,1999年,《遗传学趋势》,第15卷,第358页))。这种防
止外来基因表达的保护可能是响应于双链RNA(dsRNA)的生成而逐渐形成,所述双链RNA源
自病毒感染,或源自通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应而将转座
子元件随机整合到宿主基因组中。dsRNA在细胞中的存在会通过有待充分表征的机制触发
RNAi反应。
[0549] 长dsRNA在细胞中的存在会刺激称作切丁酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切丁酶参与使dsRNA变成称作短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段的加工(Berstein,
et al.,(2001)Nature 409:363(Berstein等人,2001年,《自然》,第409卷,第363页))。
由切丁酶活性得到的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸,并且包含约19碱
基对的双链体(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188(Elbashir等人,2001年,《基因与发育》,第15卷,第188页))。切丁酶也涉及从参与翻译控制的保守结构的前体RNA
中切除21-和22-核苷酸的时序小RNA(stRNA)(Hutvagner,et al.,(2001)Science 293:
834(Hutvagner等人,2001年,《科学》,第293卷,第834页))。RNAi反应也表征了通常称
作RNA诱导的沉默复合物(RISC)的内切核酸酶复合物,其介导与siRNA双链体的反义链
具有序列互补性的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在与siRNA双链体的反义链互补
的区域的中间(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188(Elbashir等人,2001年,《基因与发育》,第15卷,第188页))。另外,RNA干扰也可以涉及小RNA(例如,miRNA)介导
的基因沉默,推测是通过调节染色质结构的细胞机制,从而阻止靶基因序列的转录(参见
例如,Allshire,(2002)Science 297:1818-1819(Allshire,2002年,《科学》,第297卷,第
1818-1819页);Volpe,et al.,(2002)Science 297:1833-1837(Volpe等人,2002年,《科学》,第297卷,第1833-1837页);Jenuwein,(2002)Science 297:2215-2218(Jenuwein,
2002年,《科学》,第297卷,第2215-2218页);以及Hall,et al.,(2002)Science297:
2232-2237(Hall等人,2002年,《科学》,第297卷,第2232-2237页))。这样,本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物的相互作用或通过与特定基因序列的相互作用而介导基因
沉默,其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平的基因沉默。
[0550] 还提供了使由沉默元件产生的RNAi增加的方法和组合物。在此类实施例中,所述方法和组合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸,所述第一多核苷酸包含有效连接至在
植物细胞中有活性的启动子的靶标害虫序列沉默元件;所述第二多核苷酸包含有效连接至
在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件,所述抑制增强元件包含靶标害虫序列或其
活性变体或片段。沉默元件与抑制增强元件的联合表达使得由沉默元件产生的抑制性RNA
的扩增相对于仅沉默元件单独表达可实现的扩增增加。除增强特定RNAi物质本身的扩增
之外,所述方法和组合物还允许产生不同种群的RNAi物质,其可增强干扰靶基因表达的效
力。因此,当在植物细胞中结合沉默元件表达抑制增强元件时,所述方法和组合物可允许整
个植物系统性产生RNAi;与仅由单独的沉默元件构建体观察到的相比产生更大量的RNAi;
并且改善将RNAi载入植物韧皮部,因而通过RNAi方法对进食韧皮部的昆虫提供更好的防
治。因此,各种方法和组合物提供了将抑制性RNA递送至靶生物体的改善方法。参见例如
US 2009/0188008。
[0551] 如本文所用,“抑制增强元件”包含多核苷酸,所述多核苷酸包含待抑制的靶序列或其活性片段或变体。已认识到,抑制增强元件无需与靶序列相同,相反,抑制增强元件可
以包含靶序列的变体,只要抑制增强元件与靶序列具有足够的序列同一性,从而允许与仅
使用沉默元件表达可获得的相比,由沉默元件产生的RNAi的水平提高。类似地,抑制增强
元件可包含靶序列的片段,其中片段具有足够长度从而允许与仅使用沉默元件表达可获得
的相比,由沉默元件产生的RNAi的水平提高。
[0552] 已认识到,可采用来自相同靶序列或来自不同靶序列或来自相同靶序列的不同区域的多个抑制增强元件。例如,所采用的抑制增强元件可以包含源自靶序列的不同区域的
靶序列片段(即,源自3′UTR、编码序列、内含子和/或5′UTR)。此外,如本文别处所述,
抑制增强元件可包含在表达盒中,并且在具体实施例中,抑制增强元件是在相同或不同的
DNA载体或构建体上作为沉默元件。抑制增强元件可以有效连接至本文公开的启动子。已
认识到,抑制增强元件可以组成型表达,或者,它可以通过使用在本文别处讨论的各种诱导
型、组织偏好或发育调节性启动子以阶段特异性的方式产生。
[0553] 在具体实施例中,采用沉默元件和抑制增强元件两者时,RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在其他实施例中,与沉默元件构建体单独表达所观察到的相比,本发明的植
物或植物部分改善了将RNAi载入植物韧皮部,因而通过RNAi方法对进食韧皮部的昆虫提
供更好的防治。在具体实施例中,本发明的植物、植物部分和植物细胞的特征还可以是,允
许能增强干扰靶基因表达效力的多样性的RNAi物质的产生。
[0554] 在具体实施例中,与沉默元件单独表达时所实现的水平相比,沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部的抑制性RNA的浓
度。
[0555] 如本文所用,“抑制性RNA水平增加”包括,与合适的对照植物相比,在具有联合表达的植物中产生的RNAi的水平的任何统计学上显著的增加。例如,植物、植物部分或植
物细胞中RNAi水平增加可包括,与合适的对照相比,植物、植物部分、植物细胞或韧皮部
中的RNAi水平增加至少约1%、约1%-5%、约5%-10%、约10%-20%、约20%-30%、
约30%-40%、约40%-50%、约50%-60%、约60-70%、约70%-80%、约80%-90%、约
90%-100%或更高。在其他实施例中,植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平增
加可包括,与合适的对照相比,植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平增加至少
约1倍、约1倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30倍、约30倍-40倍、约40
倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80倍-90倍、约90倍-100
倍或更高。用于防治椿象和草盲蝽的沉默元件与抑制增强元件的联合表达的例子可见于US
2011/0301223和US 2009/0192117。
[0556] 一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子来下调昆虫害虫物种中靶基因的表达。WO 2007/074405描述了抑制无脊椎害虫(包括科罗拉多马铃薯甲虫)中的靶基因
的表达的方法。WO 2005/110068描述了作为防治昆虫侵染的一种方式而抑制无脊椎害虫
(尤其包括西方玉米根虫)中的靶基因的表达的方法。此外,WO 2009/091864描述了用于
抑制来自昆虫害虫物种(包括来自草盲蝽属的害虫)的靶基因的组合物和方法。核酸分
子,包括用于靶向空泡型ATP酶H亚基的RNAi,可用于防治鞘翅目害虫群体和侵染,如美国
专利申请公布2012/0198586中所述。WO 2012/055982描述了抑制或下调编码如下蛋白的
靶基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA):昆虫核糖体蛋白,诸如核糖体蛋白L19、核糖体
蛋白L40或核糖体蛋白S27A;昆虫蛋白酶体亚基,诸如Rpn6蛋白、Pros 25、Rpn2蛋白、蛋
白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白;COPI囊泡的昆虫β-外被体、COPI囊泡的γ-外被
体、COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体;昆虫四次跨膜蛋白2A(Tetraspanine 2A)
蛋白,其是推定的跨膜结构域蛋白;属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白,诸如肌动蛋白5C;昆虫
泛素-5E蛋白;昆虫Sec23蛋白,其是参与胞内蛋白质转运的GTP酶激活物;昆虫皱缩蛋白
(crinkled protein),其是参与肌动活动(motor activity)的非常规肌球蛋白;昆虫歪脖
蛋白,其参与细胞核选择性mRNA剪接的调节;昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白;以及昆虫
Tbp-1,诸如Tat结合蛋白。美国专利申请公布2012/029750和2012/0322660描述了干扰核
糖核酸(RNA或双链RNA),其在被昆虫害虫物种摄入后起下调所述昆虫害虫中靶基因的表
达的作用,其中所述RNA包含至少一个沉默元件,其中所述沉默元件为双链RNA区域,所述
双链RNA区域包含退火的互补链,其中的一条链包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分
互补的核苷酸序列或由其组成。美国专利申请公布2012/0164205描述了用于抑制无脊椎
害虫的干扰双链核糖核酸的可能靶标,包括:Chd3同源序列、β微管蛋白同源序列、40kDa
V-ATP酶同源序列、EFlα同源序列、26S蛋白酶体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物水
解酶同源序列、依赖溶胀的氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、
Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖基化因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质
酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼
激素酯酶同源物、以及α微管蛋白同源序列。
[0557] 杀虫防治的用途
[0558] 将包含所述实施例的核酸序列或其变体的菌株用于杀虫剂控制或用于将其他生物体工程改造为杀虫剂的一般方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,039,523
和EP 0480762A2。
[0559] 可选择已知会占领一种或者多种所关注作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞
争,提供表达PIP-1多肽的基因的稳定维持和表达,并且理想的是,提供对该杀虫剂的改善
保护使其不受环境降解和失活。
[0560] 这种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别要关注的是微生物,诸如细菌,例如产碱菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆
菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属
(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、农杆菌属、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳
酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠
菌属(Leuconostoc)和产碱菌属,真菌尤其是酵母如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌
属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、
红酵母(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别要关注的是植物圈细菌物
种如粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas
fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、
农杆菌属(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油
菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产
碱杆菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮
菌(Azotobacter vinelandii),以及植物圈酵母物种诸如深红类酵母菌(Rhodotorula
rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、
浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母
(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母
(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、维
罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pollulans)。
特别要关注的是有色素微生物。特别值得关注的宿主生物体包括酵母诸如红酵母属物种
(Rhodotorula spp.)、短梗霉属物种、酵母菌属物种(诸如酿酒酵母)、掷孢酵母属物种,叶
面生物体诸如假单胞菌属物种(诸如绿假单胞菌(P.aerugmosa)、荧光假单胞菌、绿针假
单胞菌)、欧文氏菌属物种和黄杆菌属物种(Flavobacterium spp.)、以及其他此类生物体,
包括根瘤农杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等等。
[0561] 可将编码所述实施例的PIP-1多肽的基因引入到植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)中,以将PIP-1多肽递送到潜在的靶标害虫。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或革
兰氏阴性细菌。
[0562] 根定殖细菌例如可通过本领域已知的方法从所关注的植物分离。具体而言,可从植物的根分离出定殖根的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株(参见例如,Handelsman,
et al.,(1991)Appl.Environ.Microbiol.56:713-718(Handelsman等人,1991年,《应用和环境微生物学》,第56卷,第713-718页))。可通过本领域已知的标准方法将编码所述实施
例的PIP-1多肽的基因引入到定殖根的蜡状芽孢杆菌中。
[0563] 可通过电转化手段将编码PIP-1多肽的基因引入到例如定殖根的芽孢杆菌属中。具体而言,可将编码PIP-1多肽的基因克隆到穿梭载体如pHT3101中(Lerecius,et al.,
(1989)FEMS Microbiol.Letts.60:211-218(Lerecius等人,1989年,《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》,第60卷,第211-218页))。含有特定PIP-1多肽基因的编码序列的穿
梭载体pHT3101可例如通过电穿孔手段转化到定殖根的芽孢杆菌属中(Lerecius,et al.,
(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60:211-218(Lerecius等人,1989年,《欧洲微生物学会联合
会微生物学快报》,第60卷,第211-218页))。
[0564] 可设计表达系统,使得PIP-1多肽被分泌到革兰氏阴性细菌(诸如大肠杆菌)的细胞质之外。使PIP-1多肽分泌的优点是:(1)避免所表达的PIP-1多肽的潜在细胞毒性
效应;和(2)改进PIP-1多肽的纯化效率,包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白质回
收和纯化效率和降低每单位蛋白质的回收和纯化时间和/或成本。
[0565] 可例如通过将适当的大肠杆菌信号肽与PIP-1多肽的氨基末端融合,使PIP-1多肽在大肠杆菌中分泌。被大肠杆菌识别的信号肽可存在于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白
质,例如OmpA蛋白(Ghrayeb,et al.,(1984)EMBO J,3:2437-2442(Ghrayeb等人,1984
年,《欧洲分子生物学组织杂志》,第3卷,第2437-2442页))。OmpA是大肠杆菌外膜的主
要蛋白质,因此它的信号肽据认为在转移过程中有效。另外,在加工前不需要对OmpA信
号肽进行修饰,而其他信号肽例如脂蛋白信号肽则需要(Duffaud,et al.,(1987)Meth.
Enzymol.153:492(Duffaud等人,1987年,《酶学方法》,第153卷,第492页))。
[0566] 可在细菌宿主中发酵所述实施例的PIP-1多肽,并且将所得的细菌加工并以与Bt菌株已被用作杀昆虫喷雾剂相同的方式用作微生物喷雾剂。在PIP-1多肽从芽孢杆菌分
泌的情况中,用本领域已知的程序将分泌信号移除或者突变。这种突变和/或缺失能防止
PIP-1多肽在发酵过程中分泌到生长培养基中。PIP-1多肽保持在细胞内,然后将细胞进行
加工以得到包囊的PIP-1多肽。任何合适的微生物都可用于这个目的。已用假单胞菌属将
Bt毒素表达为包囊蛋白,并且将所得的细胞进行加工并作为杀昆虫剂喷施(Gaertner,et
al.,(1993),in:Advanced Engineered Pesticides,ed.Kim(Gaertner等人,1993年,载于《高级工程化杀虫剂》,Kim编辑))。
[0567] 或者,通过将异源基因引入细胞宿主中来产生PIP-1多肽。异源基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在当将细胞施用于靶标害虫的环
境时能延长该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒
性。然后可按照常规技术配制这些天然包囊的PIP-1多肽以便施用于靶标害虫的寄生环
境,例如土壤、水和植物的叶。参见例如EPA 0192319,以及其中引用的参考文献。
[0568] 杀虫组合物
[0569] 在一些实施例中,活性成分可以组合物的形式施用,并且可以同时或相继地与其他化合物一起施用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保
护剂、表面活性剂洗涤剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或定时释放或可生物降解的载体制剂,其允许在单次施用所述制剂后对靶区域进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化
学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或几种这些制剂的混合物,如果需要,与在配制领域中惯常使用的其他农业
上可接受的载体、表面活性剂或促进施用的助剂一起使用。合适的载体和助剂可以是固体
或者液体,并对应于通常用于配制技术的物质,例如天然或者再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂粘合剂或者肥料。同样地,可将所述制剂制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”,以允许靶标害虫摄食或摄取所述杀虫制剂。
[0570] 施用活性成分或农业化学组合物(包含至少一种由细菌菌株产生的PIP-1多肽)的方法包括叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用率取决于相应害虫侵染的强
度。
[0571] 可以将组合物配制成散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等,并且可以通过常规方法,例如包含所述多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备所述组合物。在包含至少一种此类杀虫多肽的所有这些组合物中,所述多肽可以约1重量%到约99重量%的浓度存在。
[0572] 可通过本发明的方法在给定区域内杀死鳞翅目、双翅目、异翅目(heteropteran)、线虫、半翅目或鞘翅目害虫或减少其数目,或者可将本发明的方法预防性地应用于环境区
域以防止被易感害虫侵染。优选地,害虫摄取杀虫有效量的多肽,或与杀虫有效量的多肽接
触。所谓“杀虫有效量”意指这样的杀虫剂的量,所述量能够引起至少一个害虫死亡,或者
明显减少害虫生长、取食或正常的生理发育。该量将随下列因素而变化:例如,待防治的具
体的靶标害虫,待处理的具体的环境、地点、植物、作物或农业场所,环境条件,以及施用杀虫有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性和数量。所述制剂还可以随气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或害虫侵染的严重程度而变化。
[0573] 可通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬液或者分离的蛋白质组分与所需的农业上可接受的载体配制在一起来制备所述的杀虫剂组合物。在施用前,可以合适的方法例如冻
干、冷冻干燥、干燥,或者在水性载体、介质或合适稀释剂例如盐水或其他的缓冲液中配制
所述组合物。配制的组合物可以为粉尘或颗粒材料的形式,或者在油(植物或矿物油)中
的悬浮液的形式,或者水或油/水乳剂的形式,或者作为可湿性粉剂,或者与适合于农业应
用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体,并且是本领域熟知的。
术语“农业上可接受的载体”包括通常用于杀虫剂配制技术的所有助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等;这些对于杀虫剂配制领域的技术人员来说是熟知的。所述
制剂可以与一种或多种固体或液体助剂相混合,并且可以通过多种方法来制备,例如通过
使用常规配制技术将杀虫组合物与合适的助剂一起均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的
制剂和施用方法描述于美国专利No.6,468,523中,其以引用方式并入本文。还可以用一种
或多种化学组合物来处理植物,这些化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真
菌剂。示例性的化学组合物包括:果实/蔬菜类除草剂:莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆(Gowan公司)、百草枯、炔苯酰草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、三嗪茚草胺(Indaziflam);果实/蔬菜类杀昆虫剂:涕灭威、转苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriengiensis)、甲威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、乙基多杀菌素(Spinoteram)、杀铃脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(Cyanopyrafen)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、乙基多杀菌素、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑膦(Forthiazate)、苯线磷、硫线磷、吡丙醚、苯丁氧化物、噻螨酮(Hexthiazox)、灭多威、4-[[(6-氯吡
啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮;果实/蔬菜类杀真菌剂:多菌灵、
百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、三乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸恶咪唑、赛座灭、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺;谷类除草剂:异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酯、禾草灵、氟虫腈、精恶唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘甲磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲基二磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻磺隆、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、三甲苯草酮、吡咯磺隆(Pyroxasulfon);谷类杀真菌剂:多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯;谷类杀昆虫剂:乐果、λ-氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、毒死蜱、甲胺磷、乙酰甲胺磷(Oxidemethon-methyl)、抗蚜威、甲硫威;玉蜀黍除草剂:
莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲吩草胺、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮、嘧啶肟草醚、噻酮磺隆、氟噻草胺、吡咯磺隆;玉蜀黍杀昆虫剂:克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀铃脲(Triflumoron)、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯;玉蜀黍杀真菌剂:种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯;水稻除草剂:丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草丹、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、恶嗪草酮、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔恶草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、恶草酮(Oxadiazone)、精恶唑禾草灵、吡丙醚;水稻杀昆虫剂:二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威;水稻杀
真菌剂:甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺;棉花除草剂:敌草隆、氟草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、氟草敏、二甲戊灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆;棉花杀昆虫剂:
乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氟氯氰菊酯、多杀菌素、硫双威、Y-氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、γ-氟氯氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双
威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹;棉花杀真菌剂:土菌灵、甲霜灵、五氯硝基苯;大豆除草剂:甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊灵、得杀草、草铵膦;大豆杀昆虫剂:λ-氟氯氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫双威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟
乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰
菊酯;大豆杀真菌剂:嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑;甜菜除草剂:氯草敏、甜菜安、甜菜呋、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵;甜菜杀昆虫剂:吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯
虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威;卡诺拉油菜除草剂:二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草;卡诺拉油菜杀真菌剂:嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、咪鲜胺、乙烯菌核利;卡诺拉油菜杀昆虫剂:克百威、有机磷酸酯类、除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯(tau-Fluvaleriate)、乙虫腈、多杀菌素、乙基多杀菌素、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二
氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。
[0574] 在一些实施例中,除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异恶唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧草硫醚、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆、嗪草酮、喹禾灵、S-异丙甲草胺、环嗪酮(Hexazinne)或它们的组合。
[0575] 在一些实施例中,杀昆虫剂是高效氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、杀线威或它们的组合。
[0576] 杀虫和杀昆虫活性
[0577] “害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、壁虱等等。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫:鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目(orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目
(Trichoptera)等,特别是鳞翅目和半翅目。
[0578] 本领域技术人员会认识到,并不是所有的化合物都对所有的害虫同等有效。所述实施例的化合物显示出对昆虫害虫的活性,这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、
森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害
虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。
[0579] 鳞翅目的幼虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的行军虫、地蚕、尺蠖和实夜蛾Spodoptera frugiperda JE Smith(秋夜蛾);S.exigua Hübner(甜菜夜蛾);S.litura
Fabricius(烟草地蚕,簇毛虫);Mamestra configurata Walker(披肩粘虫);M.brassicae
Linnaeus(甘蓝夜蛾);Agrotis ipsilon Hufnagel(黑地蚕);A.orthogonia Morrison(西
部地蚕);A.subterranea Fabricius(粒肤地蚕);Alabama argillacea Hübner(棉叶
虫);Trichoplusiani Hübner(卷心菜尺蠖);Pseudoplusia includens Walker(大豆尺
蠖);Anticarsia gemmatalis Hübner(黎豆毛虫);Hypena scabra Fabricius(苜蓿绿叶
蛾);Heliothis virescens Fabricius(烟青虫);Pseudaletia unipuncta Haworth(行军
虫);Athetis mindara Barnes and McDunnough(粗皮地蚕);Euxoa messoria Harris(暗
缘地蚕);Earias insulana Boisduval(刺棉铃虫);E.vittella Fabricius(翠纹金刚
钻);Helicoverpa armigera Hübner(美洲螟蛉);H.zea Boddie(玉米穗虫或棉铃虫);
Melanchra picta Harris(斑马纹夜蛾);Egira(Xylomyges)cutialis Grote(柑橘地老
虎);螟蛾科(Pyralidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、梢斑螟和斑蛾Ostrinia nubilalis
Hübner(欧洲玉米螟);Amyelois transitella Walker(脐橙螟蛾);Anagasta kuehniella
Zeller(地 中 海 粉 蛾 );Cadra cautella Walker( 杏 仁 蛾);Chilo suppressalis
Walker(水稻螟虫);C.partellus(高粱钻心虫);Corcyra cephalonica Stainton(米
蛾);Crambus caliginosellus Clemens(玉米根网虫);C.teterrellus Zincken(蓝草
网虫);Cnaphalocrocis medinalis Guenée(稻卷叶虫);Desmia funeralis Hübner(葡
萄卷叶虫);Diaphania hyalinata Linnaeus(甜瓜虫);D.nitidalis Stoll(泡菜虫);
Diatraea grandiosella Dyar(西南玉米钻心虫),D.saccharalis Fabricius(甘蔗钻
心虫);Eoreuma loftini Dyar(墨西哥水稻钻心虫);Ephestia elutella Hübner(烟草
(可可)蛾);Galleria mellonella Linnaeus(大蜡蛾);Herpetogramma licarsisalis
Walker(草 地 网 虫 );Homoeosoma electellum Hulst( 向 日 葵 蛾);Elasmopalpus
lignosellus Zeller(小玉米茎钻心虫);Achroia grisella Fabricius(小蜡螟);
Loxostege sticticalis Linnaeus(甜菜网虫);Orthaga thyrisalis Walker(茶树网
蛾);Maruca testulalis Geyer(豆荚钻心虫);Plodia interpunctella Hübner(印度
谷蛾);Scirpophaga incertulas Walker(黄茎钻心虫);Udea rubigalis Guenée(芹
菜叶虫);以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫Acleris
gloverana Walsingham(西部黑头蚜虫);A.variana Fernald(东部黑头蚜虫);Archips
argyrospila Walker(果树卷叶虫);A.rosana Linnaeus(欧洲卷叶虫);以及其他黄卷
蛾属(Archips)物种:Adoxophyes orana Fischer von (棉褐带卷蛾);
Cochylis hospes Walsingham(条纹向日葵螟);Cydia latiferreana Walsingham(榛树
虫);C.pomonella Linnaeus(苹果蠹蛾);Platynota flavedana Clemens(杂色卷叶蛾);
P.stultana Walsingham(杂食卷叶蛾);Lobesia botrana Denis&Schiffermüller(欧洲
葡萄藤蛾);Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller(苹果芽小卷叶蛾);Endopiza
viteana Clemens(葡萄浆果蛾);Eupoecilia ambiguella Hübner(葡萄树蛾);Bonagota
salubricola Meyrick(巴西苹果卷叶蛾);Grapholita molesta Busck(东方果实蛾);
Suleima helianthana Riley(向日葵芽蛾);条卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.);色卷蛾
属物种(Choristoneura spp.)。
[0580] 鳞翅目中选择的其他农艺学害虫包括但不限于Alsophila pometaria Harris(秋尺蠖);Anarsia lineatella Zeller(桃树枝钻心虫);Anisota senatoria J.E.Smit(橙
色条纹橡树虫);Antheraea pernyi Guérin-Méneville(中国橡树柞蚕蛾);Bombyx mori
Linnaeus(蚕 );Bucculatrix thurberiella Busck( 棉 叶 潜 蛾);Colias eurytheme
Boisduval(苜蓿毛虫);Datana integerrima Grote&Robinson(胡桃毛虫);Dendrolimus
sibiricus Tschetwerikov(西伯利亚丝蛾),Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺
蠖);Erannis tiliaria Harris(椴树尺蠖);Euproctis chrysorrhoea Linnaeus(褐
尾蛾);Harrisina americana Guérin-Méneville(葡萄叶雕叶虫);Hemileuca oliviae
Cockrell(牧场毛虫);Hyphantria cunea Drury(秋天网虫);Keiferia lycopersicetla
Walsingham(番茄蛲虫);Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst(东部铁杉尺蠖);
L.fiscellaria lugubrosa Hulst(西部铁杉尺蠖);Leucoma salicis Linnaeus(缎
蛾);Lymantria dispar Linnaeus(舞毒蛾);Manduca quinquemaculata Haworth(五点
天蛾,番茄天蛾幼虫);M.sexta Haworth(番茄天蛾幼虫,烟草天蛾幼虫);Operophtera
brumata Linnaeus(冬蛾);Paleacrita vernata Peck(春尺蠖);Papilio cresphontes
Cramer(巨燕尾蝶,桔凤蝶(orange dog));Phryganidia californica Packard(加州橡树
虫);Phyllocnistis citrella Stainton(柑橘潜叶虫);Phyllonorycter blancardella
Fabricius(斑点幕形潜叶虫);Pieris brassicae Linnaeus(大白蝴蝶);P.rapae
Linnaeus(小白蝴蝶);P.napi Linnaeus(绿脉纹白蝴蝶);Platyptilia carduidactyla
Riley(朝鲜蓟羽蛾);Plutella xylostella Linnaeus(菱纹背蛾);Pectinophora
gossyptetla Saunders(粉色螟蛉);Pontia protodice Boisduval&Leconte)(南方菜青
虫);Sabulodes aegrotata Guenée(杂食尺蠖);Schizura concinna J.E.Smith(红驼
背毛虫);Sitotroga cerealella Olivier(安古木瓦谷蛾);Thaumetopoea pityocampa
Schiffermuller(松树列队毛虫);Tineola bisselliella Hummel(结网衣蛾);Tuta
absoluta Meyrick(番茄斑潜蝇);Yponomeuta padella Linnaeus(巢蛾);Heliothis
subfiexa Guenée;天幕毛虫属物种(Malacosoma spp.)和毒蛾属物种(Orgyia spp)。
[0581] 值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体,其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于:Anthonomus grandis
Boheman(棉籽象鼻虫);Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel(稻水象鼻虫);Sitophilus
granarius Linnaeus(谷 象 鼻 虫 );S.oryzae Linnaeus( 米 象 );Hypera punctata
Fabricius(车轴草叶象);Cylindrocopturus adspersus LeConte(向日葵茎象鼻虫);
Smicronyx fulvus LeConte(红向日葵籽象鼻虫);S.sordidus LeConte(灰向日葵籽象鼻
虫);Sphenophorus maidis Chittenden(玉蜀黍喙甲));叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、
黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲和潜叶虫(包括但不限于:Leptinotarsa decemlineata Say(科罗拉多马铃薯甲虫);Diabrotica virgifera virgifera LeConte(西方玉米
根虫);D.barberi Smith&Lawrence(北方玉米 根虫);D.undecimpunctata howardi
Barber(南方玉米根虫);Chaetocnema pulicaria Melsheimer(玉米跳甲);Phyllotreta
cruciferae Goeze(玉米跳甲);Colaspis brunnea Fabricius(葡萄肖叶甲);Oulema
melanopus Linnaeus(谷叶甲虫);Zygogramma exclamationis Fabricius(向日葵叶
甲));来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于:Epilachna varivestis
Mulsant(墨西哥豆瓢虫));来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫(包括但
不限于:Popillia japonica Newman(日本甲虫);Cyclocephala borealis Arrow(北
方隐金龟子,白蚧螬);C.immaculata Olivier(南方隐金龟子,白蚧螬);Rhizotrogus
majalis Razoumowsky(欧洲金龟子);Phyllophaga crinita Burmeister(白蛴螬);
Ligyrus gibbosus De Geer(胡萝卜金龟);来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮
蠹(carpet beetle);来自叩头虫科(Elateridae)的铁线虫、伪金针虫属物种(Eleodes
spp.)、金针虫属物种(Melanotus spp.);宽胸叩头虫属物种(Conoderus spp.);丘胸
叩甲属物种(Limonius spp.);细胸叩甲属物种(Agriotes spp.);旱地金针虫属物种
(Ctenicera spp.);Aeolus属物种;来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫以及来自拟步甲
科(Tenebrionidae)的甲虫。
[0582] 双翅目的成体和未成熟体是值得关注的,包括潜叶虫Agromyza parvicornisLoew(玉米斑潜叶虫);摇蚊(包括但不限于:Contarinia sorghicola Coquillett(高粱摇
蚊);Mayetiola destructor Say(黑森蝇);Sitodiplosis mosellana Géhin(小麦摇蚊);
Neolasioptera murtfeldtiana Felt(向日葵籽摇蚊));果蝇(实蝇科(Tephritidae))、
Oscinella frit Linnaeus(果蝇);蛆(包括但不限于:Delia platura Meigen(玉米种
蝇);D.coarctata Fallen(麦种蝇);以及其他地种蝇属物种(Delia spp.):Meromyza
americana Fitch(麦秆蝇);Musca domestica Linnaeus(家蝇类);Fannia canicularis
Linnaeus,F.femoralis Stein(小家厕蝇);Stomoxys calcitrans Linnaeus(厩蝇类);面
蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属物种(Chrysomya spp.);伏蝇属物种(Phormia spp.);和其他蝇类
(muscoid fly)害虫、马蝇类虻属物种(Tabanus spp.);肤蝇类胃蝇属物种(Gastrophilus
spp.);狂蝇属物种(Oestrus spp.);牛蝇类皮蝇属物种(Hypoderna spp.);鹿蝇类斑
虻属物种(Chrysops spp.);Melophagus ovinus Linnaeus(虱蝇类);和其他短角亚目
(Brachycera)、蚊类伊蚊属物种(Aedes spp.);按蚊属物种(Anopheles spp.);库蚊属物
种(Culex spp.);黑蝇类原蚋属物种(Prosimulium spp.);蚋属物种(Simulium spp.);
蠓、沙蝇、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
[0583] 作为所关注昆虫包括的为半翅目和同翅目的成体和幼虫,例如但不限于来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜;来自盲蝽科(Miridae)的植食蝽;来自蝉科(Cicadidae)的
蝉;来自叶蝉科(Cicadellidae)的叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.);来自菱飞
虱科(Cixiidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、圆飞虱科(Issidae)
以及稻虱科(Delphacidae)的飞虱;来自角蝉科(Membracidae)的角蝉;来自木虱科
(Psyllidae)的木虱;来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱;来自蚜科(Aphididae)的蚜
虫;来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤蚜;来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧;
链介壳虫科(Asterolecanidae)、软介壳虫科(Coccidae)、洋红蚧科(Dactylopiidae)、
盾介壳虫科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(ortheziidae)、刺葵
介壳虫科(Phoenicococcidae)以及硕介壳虫科(Margarodidae)的介壳虫;来自网蝽科
(Tingidae)的网蝽;来自蝽科的椿象;麦长蝽;土长蝽属物种(Blissus spp.);以及来自长
蝽科(Lygaeidae)的其他长蝽(seed bug);来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉;来自缘蝽科
(Coreidae)的南瓜缘蝽以及来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的红蝽和棉蝽象。
[0584] 来自同翅目的在农业上重要的成员还包括但不限于:Acyrthisiphon pisumHarris(豌豆蚜虫);Aphis craccivora Koch(豇豆蚜虫);A.fabae Scopoli(黑豆蚜
虫);A.gossypii Glover(棉花蚜虫,甜瓜蚜虫);A.maidiradicis Forbes(玉米根蚜虫);
A.pomi De Geer(苹果蚜虫);A.spiraecola Patch(绣线菊蚜虫);Aulacorthum solani
Kaltenbach(茄无网蚜);Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓蚜虫);Diuraphis
noxia Kurdjumov/Mordvilko(俄罗斯小麦蚜虫);Dysaphis plantaginea Paaserini(红
苹 果蚜 虫 );Eriosoma lanigerum Hausmann(苹 果 绵 蚜);Brevicoryne brassicae
Linnaeus(卷心菜蚜虫);Hyalopterus pruni Geoffroy(桃大尾蚜);Lipaphis erysimi
Kaltenbach(萝卜蚜);Metopolophium dirrhodum Walker(麦长管蚜);Macrosiphum
euphorbiae Thomas(马铃薯长管蚜);Myzus persicae Sulzer(桃-马铃薯蚜虫,绿桃
蚜虫);Nasonovia ribisnigri Mosley(莴苣蚜虫);瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)
(根蚜和瘿蚜);Rhopalosiphum maidis Fitch(玉米叶蚜虫);R.padi Linnaeus(禾谷缢
管蚜);Schizaphis graminum Rondani(麦二叉蚜);Sipha flava Forbes(黄色甘蔗蚜
虫);Sitobion avenae Fabricius(麦长管蚜);Therioaphis maculata Buckton(斑点苜
蓿蚜);Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe(黑色柑橘蚜虫);和T.citricida
Kirkaldy(褐色柑橘蚜虫);球蚜属物种(Adelges spp.)(球蚜类);Phylloxera
devastatrix Pergande(长山核桃根瘤蚜);Bemisia tabaci Gennadius(烟草粉虱,甘薯
粉虱);B.argentifolii Bellows&Perring)(银叶粉虱);Dialeurodes citri Ashmead(柑
桔粉虱);Trialeurodes abutiloneus(纹翅粉虱)和T.vaporariorum Westwood(温室粉
虱);Empoasca fabae Harris(马铃薯叶蝉);Laodelphax striatellus Fallen(灰飞虱);
Macrolestes quadrilineatus Forbes(紫莞叶蝉);Nephotettix cinticeps Uhler(绿叶
蝉);N.nigropictus (水稻叶蝉);Nilaparvata lugens (褐飞虱);Peregrinus
maidis Ashmead(玉米飞虱);Sogatella furcifera Horvath(白背飞虱);Sogatodes
orizicola Muir(水稻飞虱);Typhlocyba pomaria McAtee(苹果白叶蝉);葡萄斑叶蝉
属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄斑叶蝉);Magicicada septendecim Linnaeus(周期
蝉);Icerya purchasi Maskell(吹绵蚧);Quadraspidiotus perniciosus Comstock(梨
园蚧);Planococcus citri Risso(柑橘粉蚧);粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他
的粉蚧系群);Cacopsylla pyricola Foerster(梨木虱);Trioza diospyri Ashmead(柿
木虱)。
[0585] 来自半翅目的所关注的在农业上重要的物种包括但不限于:Acrosternum hilareSay(绿蝽象);Anasa tristis De Geer(南瓜缘蝽);Blissus leucopterus leucopterus
Say(麦 长 蝽);Corythuca gossypii Fabriciu(棉 花 网 蝽);Cyrtopeltis modesta
Distant(番 茄 蝽 );Dysdercus suturellus ( 棉 蝽);Euschistus
servus Say(褐椿象);E.variolarius Palisot de Beauvois(一斑蝽象);长蝽属物种
(Graptostethus spp.)(长蝽系群(complex of seed bugs));Leptoglossus corculus
Say(松叶根蝽);Lygus lineolaris Palisot de Beauvois(牧草盲蝽);L.Hesperus
Knight(西 方 牧 草 盲 蝽);L.pratensis Linnaeus(牧 草 盲 蝽);L.rugulipennis
Poppius(欧洲牧草盲蝽);Lygocoris pabulinus Linnaeus(长绿盲蝽);Nezara viridula
Linnaeus(南方绿蝽);Oebalus pugnax Fabricius(稻蝽象);Oncopeltus fasciatus
Dallas(大马利筋蝽);Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)。
[0586] 此外,实施例可有效对抗例如如下半翅目昆虫:Calocoris norvegicusGmelin(草莓蝽);Orthops campestris Linnaeus;Plesiocoris rugicollis Fallen(苹
盲蝽);Cyrtopeltis modestus Distant(番茄蝽);Cyrtopeltis notatus Distant(烟草
小盲蝽);Spanagonicus albofasciatus Reuter(白斑盲蝽);Diaphnocoris chlorionis
Say(皂荚蝽);Labopidicola allii Knight(洋葱蝽);Pseudatomoscelis seriatus
Reuter(棉盲蝽);Adelphocoris rapidus Say(苜蓿褐盲蝽);Poecilocapsus lineatus
Fabricius(四线盲蝽);拟麦长蝽(Nysius ericae Schilling)(假麦长蝽);茶黄蓟马
(Nysius raphanus Howard)(假麦长蝽);Nezara viridula Linnaeus(南方绿蝽);扁盾
蝽属物种(Eurygaster spp.);缘蝽属物种(Coreidae spp.);红蝽属物种(Pyrrhocoridae
spp.);谷蛾属物种(Tinidae spp.);负子蝽属物种(Blostomatidae spp.);猎蝽属物种
(Reduviidae spp.);以及臭蝽属物种(Cimicidae spp)。
[0587] 另外,包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫,诸如Aceria tosichellaKeifer(小麦卷叶螨)Petrobia latens Müller(褐色小麦螨);叶螨科(Tetranychidae)
的蜘蛛螨和红螨,Panonychus ulmi Koch(欧洲红螨);Tetranychus urticae Koch(二
斑蜘蛛螨);(T.mcdanieli McGregor(迈叶螨);T.cinnabarinus Boisduval(红蜘蛛
螨);T.turkestani Ugarov&Nikolski(草莓蜘蛛螨);细须螨科(Tenuipalpidae)的扁
平螨类、Brevipalpus lewisi McGregor(桔短须螨);瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨
和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨,即表皮螨科(Epidermoptidae)
的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨,硬蜱科
(Ixodidae)的蜱类。Ixodes scapularis Say(鹿蜱);I.holocyclus Neumann(澳洲寄生
蜱);Dermacentor variabilis Say(美洲犬蜱);Amblyomma americanum Linnaeus(美洲
钝眼蜱);以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒
螨和疥螨。
[0588] 缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫是值得关注的,诸如Lepisma saccharinaLinnaeus(蠹虫);Thermobia domestica Packard(小灶衣鱼)。
[0589] 所涵盖的其他节肢害虫包括:蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛,诸如Loxoscelesreclusa Gertsch&Mulaik(褐色隐士蜘蛛);和Latrodectus mactans Fabricius(黑寡妇
蜘蛛);和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类诸如Scutigera coleoptrata Linnaeus(蚰
蜒)。
[0590] 所关注的昆虫害虫包括椿象和其他相关昆虫的总科,包括但不限于属于蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽、璧蝽、褐臭蝽、喜绿蝽、大豆褐椿、Euschistus trtsttgmus、喜绿蝽、
Dichelops furcatus、Dichelops melacanthus和Bagrada hilaris(菘蝽))、龟蝽科(筛
豆龟蝽-豆圆蝽)和土蝽科(Scaptocoris castanea-根椿象)的物种;以及鳞翅目物种,
包括但不限于:菱纹背蛾,例如谷实夜蛾;大豆尺蠖,例如大豆尺夜蛾;以及黎豆毛虫,例如黎豆夜蛾。
[0591] 用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如,Czapla and Lang,(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485(Czapla和Lang,1990年,《经济昆虫学杂志》,第83卷,
第2480-2485页);Andrews,et al.,(1988)Biochem.J.252:199-206(Andrews等人,1988
年,《生物化学杂志》,第252卷,第199-206页);Marrone,et al.,(1985)J.of Economic Entomology78:290-293(Marrone等人,1985年,《经济昆虫学杂志》,第78卷,第290-293
页)以及美国专利No.5,743,477,所有这些文献全文以引用方式并入本文。一般来讲,将蛋
白混合并用于摄食测定。参见例如Marrone,et al.,(1985)J.of Economic Entomology78:
290-293(Marrone等人,1985年,《经济昆虫学杂志》,第78卷,第290-293页)。此类测定法可包括将植物与一种或多种害虫接触以及测定植物存活和/或促使害虫死亡的能力。
[0592] 线虫包括寄生线虫诸如根结、孢囊和根腐线虫,包括孢囊线虫属物种(Heteroderaspp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫属物种(Globodera spp.);
特别是孢囊线虫的成员,包括但不限于大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆
孢囊线虫);甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)(甜菜孢囊线虫);禾谷异皮线虫
(Heterodera avenae)(禾谷孢囊线虫);以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)
和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯孢囊线虫)。根腐线虫包括短体线虫属物种
(Pratylenchus spp.)。
[0593] 种子处理剂
[0594] 为了保护并提高产率产量和性状技术,种子处理剂选项可提供另外的作物计划灵活性以及对于昆虫、杂草和病害的经济有效的防治。可用包含化学或生物除草剂、除草
剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物,对种子材料进行处理,
通常进行表面处理。这些化合物通常与在配制领域中惯常使用的其他载体、表面活性剂
或促进施用的助剂一起配制。包衣可以通过用液体制剂浸渍繁殖材料或通过用混合的湿
或干制剂涂覆来实施。可用作种子处理剂的各种类型化合物的例子在由英国农作物保护
委员会(British Crop Production Council)出版的The Pesticide Manual:A World
Compendium,C.D.S.Tomlin Ed.(《杀虫剂手册:世界纲要》,C.D.S.Tomlin编辑)中提供,
该文献据此以引用方式并入。
[0595] 可用于作物种子上的一些种子处理剂包括但不限于如下的一种或多种:脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、杀草强、氧环唑、固氮螺菌、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌中的一种或多种)、慢生根瘤菌属物种(bradyrhizobium
spp.)(包括甜菜慢生根瘤菌、加那利慢生根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、大
豆慢生根瘤菌、辽宁慢生根瘤菌、地瓜慢生根瘤菌和/或圆明园慢生根瘤菌中的一种或多
种)、克菌丹、萎锈灵、壳聚糖、噻虫胺、铜、氰虫酰胺、苯醚甲环唑、土菌灵(etidiazole)、氟虫腈、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮(isoflavenoids)、脂壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、腈菌唑、PCNB、戊苯吡菌胺、青霉属、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯虫酰胺、S-异丙甲草胺、皂草苷、环苯吡菌胺、TCMTB、戊唑醇、噻苯哒唑、噻虫嗪、硫双威、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。PCNB种子包衣是指EPA注册号
00293500419,含有五氯硝基苯和依得利。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。
[0596] 可测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪种种子处理剂选项和施用速率可补充此类品种和转基因性状以提高产量。例如,具有良好产量潜力但存在丝黑穗
病易感性的品种可受益于提供防丝黑穗病的保护的种子处理剂的使用,具有良好产量潜力
但存在胞囊线虫易感性的品种可受益于提供防胞囊线虫的保护的种子处理剂的使用,以此
类推。同样地,涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂所赋予的第二
作用模式,涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂和增强植物对该
除草剂的抗性的安全剂,等等。此外,由种子处理剂的适当使用所引起的良好根系建成和提
早出苗可使得在与种子处理剂结合时包含特定性状的一个品种或多个品种更有效地使用
氮、抵御干旱的能力更佳、以及产量潜力总体增加。
[0597] 用于抑制生长或杀灭昆虫害虫并防治昆虫群体的方法
[0598] 在一些实施例中,提供了用于抑制生长或杀灭昆虫害虫的方法,包括使昆虫害虫与杀昆虫有效量的分离的PIP-1多肽接触。在一些实施例中,提供了用于抑制生长或杀灭
昆虫害虫的方法,包括使昆虫害虫与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:6的分离的杀虫蛋白或其
变体接触。
[0599] 在一些实施例中,提供了用于防治昆虫害虫群体的方法,包括使昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的分离的PIP-1多肽接触。在一些实施例中,提供了用于防治昆虫害虫群体
的方法,包括使昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:6的分离的杀虫蛋白或其变体
接触。如本文所用,所谓“防治害虫群体”或“防治害虫”意指使害虫造成的损害受到限制
的对害虫的任何效应。防治害虫包括但不限于以一定方式杀灭害虫、抑制害虫发育、改变害
虫繁殖力或生长,使得害虫对植物造成的损害减轻,减少所产生后代的数量,产生适应力
弱的害虫,产生易受捕食者攻击的害虫,或阻止害虫啃食植物。
[0600] 在一些实施例中,提供了用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使昆虫害虫群体与杀昆虫有效量的分离的PIP-1多肽接触。在一些实施例中,提供了
用于防治对杀虫蛋白具有抗性的昆虫害虫群体的方法,包括使昆虫害虫群体与杀昆虫有效
量的SEQ ID NO:6的分离的杀虫蛋白或其变体接触。
[0601] 在一些实施例中,提供了用于保护植物免受昆虫害虫影响的方法,包括在植物或其细胞中表达分离的PIP-1多肽。在一些实施例中,提供了用于保护植物免受昆虫害虫影
响的方法,包括在植物或其细胞中表达SEQ ID NO:6的分离的杀虫蛋白或其变体。
[0602] 昆虫抗性治理(IRM)策略
[0603] 已证实,苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达是防治农业上重要的昆虫害虫的有效手段(Perlak等人,1990年;1993年)。然而,昆虫已进化成能抵抗在
转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素。此类抗性如果广泛分布的话将明显限制
包含编码此类苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。
[0604] 增加转基因杀昆虫剂抵抗靶标害虫的效力并且同时降低具有杀昆虫剂抗性的害虫的发育的一种方法是,提供非转基因(即,非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作
物/玉米)以与产生对于靶标害虫有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美
国环境保护局(United States Environmental Protection Agency)(epa.gov/oppbppdl/
biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm,可使用www前缀对其进行访问)公布了
与产生对于靶标害虫有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。此外,全国玉米
种植者协会(National Corn Growers Association)在其网站上:(ncga.com/insect-res
istance-management-fact-sheet-bt-corn,可使用www前缀对其进行访问)也提供了有关
庇护所要求的类似指南。由于庇护区域内的昆虫所造成的损失,较大的庇护所可降低总产
量。
[0605] 增加转基因杀昆虫剂抵抗靶标害虫的效力并且同时降低具有杀昆虫剂抗性的害虫的发育的另一种方法将是,具有能有效抵抗昆虫害虫群体并通过不同作用模式显示其效
应的杀昆虫基因的库。
[0606] 在植物中表达对相同的昆虫物种具有毒性的两种或更多种杀昆虫组合物(每种杀昆虫剂以有效水平表达)将是实现控制抗性发展的另一种方法。这是基于这样的原理:
相比仅一种作用模式,抵抗两种单独作用模式的抗性的进化更加不可能。Roush例如概括
了双重毒素策略,也称为“金字塔堆砌”或“堆叠”,以用于管理杀昆虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353:777-1786(皇家学会,《伦敦皇家学
会哲学汇刊B辑》,1998年,第353卷,第777-1786页))。均能有效抵抗靶标害虫且具有很
少或没有交叉抗性的两种不同蛋白的堆叠或金字塔堆砌可允许使用较小的庇护所。美国环
境保护局要求所种植的非Bt玉米的结构庇护所(一般5%)显著小于单一性状产品(一
般20%)。存在提供庇护所的IRM效应的多种方法,包括田间中的多种几何种植模式和包
装好(in-bag)的种子混合物,如Roush进一步讨论。
[0607] 在一些实施例中,本发明的PIP-1多肽可用作与其他杀虫蛋白组合(即,金字塔堆砌)的昆虫抗性治理策略,所述其他杀虫蛋白包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属物种或发
光杆菌属物种杀昆虫蛋白等等。
[0608] 提供了防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染的方法,所述方法促进了昆虫抗性治理,包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。
[0609] 在一些实施例中,防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法,杀昆虫蛋白中的至少一种包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性
的PIP-1多肽。
[0610] 在一些实施例中,防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法,杀昆虫蛋白中的至少一种包括对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性
的SEQ ID NO:6的蛋白或其变体。
[0611] 在一些实施例中,防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法,包括在转基因植物中表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性且具
有不同作用模式的PIP-1多肽和Cry蛋白。
[0612] 在一些实施例中,防治转基因植物中的鳞翅目和/或半翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法,包括在转基因植物中表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性且具
有不同作用模式的SEQ ID NO:6的蛋白或其变体以及Cry蛋白。
[0613] 还提供了降低鳞翅目和/或半翅目昆虫出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法,包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的
PIP-1多肽,同时联合表达具有不同作用模式的昆虫物种的第二杀昆虫蛋白。
[0614] 还提供了降低鳞翅目和/或半翅目昆虫出现对在植物中表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的可能性以防治昆虫物种的方法,包括表达对昆虫物种具有杀昆虫性的SEQ
ID NO:6的蛋白或其变体,同时联合表达具有不同作用模式的昆虫物种的第二杀昆虫蛋白。
[0615] 还提供了用于转基因植物的有效的鳞翅目和/或半翅目昆虫抗性治理的方式,包括以高水平在植物中共表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有毒性但各自表现出实现其抑
制生长或杀灭活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两种或更多种杀昆虫
蛋白包括PIP-1多肽和Cry蛋白。还提供了用于转基因植物的有效的鳞翅目和/或半翅目
昆虫抗性治理的方式,包括以高水平在植物中共表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有毒性
但各自表现出实现其抑制生长或活性的不同模式的两种或更多种杀昆虫蛋白,其中所述两
种或更多种杀昆虫蛋白包括SEQ ID NO:6的蛋白或其变体以及Cry蛋白。
[0616] 此外,提供了用于获得表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所
述昆虫测定结合数据表明,在此类昆虫中,PIP-1多肽不与Cry蛋白的结合位点竞争。此外,
提供了用于获得表达对鳞翅目和/或半翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商
业化的监管批准的方法,包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤,所述昆虫测定结
合数据表明,在此类昆虫中,SEQ ID NO:6的蛋白或其变体不与Cry蛋白的结合位点竞争。
[0617] 用于增加植物产量的方法
[0618] 提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文所公开的杀虫多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞,以及在被害虫侵染的田间使该植物或其种子生
长,其中所述多肽对所述害虫具有杀虫活性。在一些实施例中,所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫害虫具有杀虫活性,并且所述田间被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫害虫侵染。
[0619] 如本文所定义的,植物的“产量”是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。所谓“生物质”意指任何被测量的植物产品。生物质产生的增加是被测量植物产品的产量上
的任何改善。增加植物产量具有若干商业应用。例如,增加植物叶片生物质可以增加用于
人或动物消费的叶菜类的产量。另外,增加叶片生物质可以用于增加植物衍生的药用或工
业产品的生产。产量的增加可以包括任何统计学上显著的增加,包括但不限于与不表达杀
虫序列的植物相比,产量增加至少1%、增加至少3%、增加至少5%、增加至少10%、增加至少20%、增加至少30%、增加至少50%、增加至少70%、增加至少100%或增加更多。
[0620] 在具体方法中,植物产量由于表达本文所公开的PIP-1多肽的植物对害虫的抗性增强而增加。PIP-1多肽的表达导致害虫侵染或采食植物的能力降低,从而提高植物产量。
[0621] 以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
[0622] 实验
[0623] 实例1:来自菌株SS44C4的对草盲蝽有活性的杀昆虫蛋白的鉴定
[0624] 按照如下方式通过蛋白纯化、N端氨基酸测序、PCR克隆,从绿针假单胞菌菌株SS44C4鉴定草盲蝽活性蛋白PIP-1A:
[0625] 从在胰酶大豆培养基(胰蛋白胨17g/L、大豆粉酶消化物3g/L、右旋糖2.5g/L、氯化钠5g/L、K2HPO42.5g/L)中生长并在30℃下培养过夜的SS44C4的细胞裂解物观察对草
盲蝽(豆荚草盲蝽(Lygus hesperus))的杀昆虫活性。该杀昆虫活性表现出热和蛋白酶敏
感性,表明是蛋白质性质。
[0626] 使用在96孔生物测定板(BD FalconTM353910)的每孔中与昆虫饲料(Bio-ServF9644B)混合的细胞裂解物样品进行草盲蝽(豆荚草盲蝽)生物测定。将可变数量的豆荚
草盲蝽二龄若虫(2至7只)放入96孔板的每孔中。将该测定在25℃下运行四天,然后对
昆虫死亡率和昆虫生长迟缓进行评分。针对这些昆虫测定了一系列浓度的纯化蛋白样品,
并计算了50%死亡率(LC50)或50%个体受抑制(IC50)的浓度。PIP-1A的草盲蝽生物测
定结果示于表5中。
[0627] 使用西格玛细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号NA2110-KT,Sigma-Aldrich,PO Box 14508,St.Louis,MO 63178(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司第14508
号信箱,邮编63178))根据制造商使用说明来提取基因组DNA。使用NanoDrop分光光
度 计 (Thermo Scientific,3411Silverside Road,Bancroft Building,Suite 100,
Wilmington,DE 19810(特拉华州威尔明顿银边路3411号班克罗夫特大厦100室的热电
科技公司,邮编19810))测定DNA浓度,并用无菌水将基因组DNA稀释到40ng/μl。通过
将如下物质组合来设置25μl PCR反应:80ng基因组DNA、2μl(5μM)16S核糖体DNA引
物TACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:209)和AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO:210)、1μl
TM TM
10cmM dNTP、1x Phusion HF缓冲液以及1单位Phusion 高保真DNA聚合酶(新英格兰
生物实验室,目录号M0530L,240County Road,Ipswich,MA 01938-2723(马萨诸塞州伊普
斯威奇乡村路240号,邮编01938-2723))。将PCR反应在具有下列程序的MJ Research
PTC-200热循环仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.,1000Alfred Nobel Drive,Hercules,
California,94547,USA(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯阿尔弗雷德诺贝尔大道1000号的
伯乐实验室公司,邮编94547))中运行:96℃1分钟;96℃15秒、52℃2分钟和72℃2分
钟,进行30个循环;72℃10分钟;以及保持于4℃。使用 DNA纯化试剂盒(目
录号28104, Inc.,27220Turnberry Lane,Valencia,CA91355(加利福尼亚州
瓦伦西亚特恩贝里径27220号的凯杰公司,邮编91355))来纯化PCR产物。对纯化的PCR
样品进行DNA测序,并将所得的16S核糖体DNA序列针对NCBI数据库进行BLAST搜索,结
果表明SS44C4是绿针假单胞菌菌株。绿针假单胞菌菌株SS44C4以登录号NRRLB-50613于
2011年1月12日保藏于农业研究菌种保藏中心(NRRL),1815North University Street,
Peoria,Illinois 61604(伊利诺州皮奥里亚北方大学街道1815号,邮编61604)(nrrl.
ncaur.usda.gov,可使用“www”前缀在万维网上访问)。
[0628] 在用PBS缓冲液重悬后,将在LB肉汤中在30℃下生长的SS44C4的单菌落的过夜培养物的细胞沉淀物以约20,000psi在弗氏压碎器中进行单程裂解。将裂解产物
离心,并且保留可溶性部分并在4℃下保存过夜以允许不溶性绿针菌素产物沉淀。将
剩余的上清液顺序地过滤通过25μm、8μm、5μm、1.2μm和0.45μm过滤器以移除大
多数的晶体材料。将可溶细胞裂解物调节至1.2M硫酸铵,并上样于适当尺寸的乙醚柱
(ToyopearlTMEther-650S,Tosoh Bioscience LLC,3604Horizon Drive,Suite 100,King of Prussia,PA 19406(宾夕法尼亚州普鲁士王市地平线大道3604号100室的东曹生物科学公
司,邮编19406))。以1.2M硫酸铵至0.6M硫酸铵的线性梯度在15个柱体积内运行。然后
经由旋转浓缩仪浓缩包含所关注的蛋白的洗脱峰级分。接着使用7000MWCO ZebaTM脱盐柱
(Thermo Fisher Scientific Inc.,747Meridian Rd,Rockford,IL 61101(伊利诺伊州罗
克福德子午线路747号的赛默飞世尔科技公司,邮编61101))将浓缩物缓冲液更换成25mM
Tris pH 8以移除硫酸铵。然后将浓缩和脱盐的蛋白上样于MonoQTM柱(目录号17-5166-01,
通用电气医疗集团(GE Healthcare))。通过施加0至400mMNaCl的线性梯度来实现最佳洗
脱和纯度。
[0629] 对来自MonoQTM纯化的活性级分合并液进行N端测序。将蛋白合并液在SDS-PAGE上运行,转移到PVDF膜,并用CoomassieTM蓝色染料染色。膜上存在四个条带。所有均通过
N端测序成功鉴定,每个条带只有单条序列。将两个蛋白条带的N端氨基酸序列针对NCBI
数据库进行BLAST搜索,并且来自嗜虫假单胞菌的基因组序列的假定蛋白(PSEEN3174)
(Vodovar,N et al.(2006)Nat.Biotechnol.24(6),673-679(Vodovar,N等人,2006年,《自然-生物技术》,第24卷,第6期,第673-679页))被鉴定为同源性匹配(图1)。使用引物
ATACATATGACGATCAAGGAAGAGCTG(SEQ ID NO:13)和TTGGATCCTCAATAACGGCGATGAGGATCGTTG
TAG(SEQ ID NO:14),通过PCR克隆PSEEN3174基因。针对SS44C4基因组DNA制备物执行
采用克隆引物(SEQ ID NO:13和14)的PCR,并分离预期分子量的条带。
[0630] 对所得PCR产物进行DNA测序,并与来自胶体内消化的MS/MS光谱结合,表明该基因产物具有SEQ ID NO:1的DNA序列,该DNA序列编码本文指定为“PIP-1A”的蛋白,该蛋
白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。PSEEN3174基因具有以SEQ ID NO:5示出的DNA序
列,并编码具有以SEQ ID NO:6示出的氨基酸序列的氨基酸序列。使用PIP-1A(SEQ ID NO:
2)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)序列信息,通过来自能源部联合基因组研究所(Department
of Energy Joint Genomic Institute)网站(jgi.doe.gov/,可使用“www”前缀在万维
网上访问)的BLAST搜索,来鉴定另一个同源基因SPBB_340380(注释为来自瘤额大小蠹
(Dendroctonus frontalis)细菌群落的假定蛋白)。通过使用PSEEN3174(SEQ ID NO:5)
密码子用法的蛋白序列的回译来产生SPBB_340380编码序列,并合成该基因。SPBB_340380
编码序列具有以SEQ ID NO:3示出的DNA序列,并编码本文指定为“PIP-1B”的氨基酸序
列,所述PIP-1B具有以SEQ ID NO:4示出的氨基酸序列。
[0631] 实例2:PIP-1A、PSEEN3174和PIP-1B的大肠杆菌表达
[0632] 将 这 三种 编 码 序 列PIP-1A(SEQ ID NO:1)、PSEEN3174(SEQ ID NO:5) 和PIP-1B(SEQ ID NO:3)亚克隆到具有添加至麦芽糖结合蛋白的6xHis标签的大肠杆菌表
TM
达载体pMAL (New England Biolabs,240County Road,Ipswich,MA 01938-2723(马萨
诸塞州伊普斯威奇乡村路240号的新英格兰生物实验室,邮编01938-2723))中,并转化
到大肠杆菌中以用于重组蛋白表达。将用表达构建体转化的大肠杆菌细胞在羧苄青霉素
选择下于37℃生长过夜,然后接种到新鲜2XYT培养基(1∶250)并进一步生长到OD600
为约0.8。然后加入IPTG,并将细胞在37℃下进一步再生长6小时或转移到16℃进行过
夜生长以诱导蛋白表达。通过直链淀粉树脂(New England Biolabs,240County Road,
Ipswich,MA 01938-2723(马萨诸塞州伊普斯威奇乡村路240号的新英格兰生物实验室,邮
编01938-2723))或Ni-NTA琼脂糖(目录号K950-01,Invitrogen,3175Staley Road,Grand
Island,NY 14072(纽约州格兰德岛斯特利路3175号的英杰公司,邮编14072))根据制造
商方案纯化大肠杆菌所表达的蛋白。
[0633] 实例3:用纯化蛋白进行的鳞翅目和鞘翅目测定
[0634] 对细胞裂解物进行杀昆虫活性生物测定筛选以评价杀昆虫蛋白对各种鳞翅目物种(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、黑地蚕(Agrotis
ipsilon)、秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)和黎
豆毛虫(Anticarsia gemmatalis))、鞘翅目物种(西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)
的效应。
[0635] 对96孔板装置中包含细菌菌株的细胞裂解物的人工饲料进行鳞翅目取食测定。以1∶2细胞裂解物与饲料混合物的比率,将细胞裂解物与鳞翅目特异性人工饲料掺混
在一起。每孔放入新生幼虫,随意饲喂取食5天。对于诸如发育迟缓和/或死亡的幼虫
反应,结果表示为阳性。如果幼虫与饲喂只加入上述缓冲液的食物的阴性对照相似,则结
果表示为阴性。在欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、黑
地蚕(Agrotis ipsilon)、秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(Pseudoplusia
includens)和黎豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)上测定细胞裂解物。针对这些昆虫测定
了一系列浓度的纯化蛋白样品,并计算了50%死亡率(LC50)或50%个体受抑制(IC50)的
浓度。PIP-1A和PSEEN3174的杀昆虫活性示于表5中。
[0636] 表5
[0637]
[0638]
[0639] 对包含细菌菌株的细胞裂解物的人工饲料进行鞘翅目取食测定。以1∶5细胞裂解物与饲料混合物的比率,将细胞裂解物与鞘翅目特异性人工饲料掺混在一起。每孔放入
西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)新生幼虫,随意饲喂取食5天。对于诸如发育迟缓
和/或死亡的幼虫反应,结果表示为阳性。如果幼虫与饲喂只加入上述缓冲液的食物的阴
性对照相似,则结果表示为阴性。针对这些昆虫测定了一系列浓度的纯化蛋白样品,并计算
了50%死亡率(LC50)或50%个体受抑制(IC50)的浓度。PIP-1A和PSEEN3174的结果示
于表5中。
[0640] 实例4:用纯化蛋白进行的蚜虫口服取食测定
[0641] 使用如(Li,et al.,(2011)Journal of Invertebrate Pathology 107:69-78(Li等人,2011年,《无脊椎动物病理学杂志》,第107卷,第69-78页))所述的膜取食测定法
评估在PBS pH 7.4中配制的PIP-1A和PSEEN3174的毒性。简而言之,将单独的蛋白与如
Febvay,et al.,((1988),Can.J.Zool.66:2449-2453)(Febvay等人,1988年,《加拿大动物学杂志》,第66卷,第2449-2453页)所述的经过滤灭菌的完全人工饲料混合,达到最多至
1250微克/毫升的终浓度。将该饲料(100μl)放置在横跨3cm细胞培养板紧紧牵拉的拉
封口膜上,该板一侧上有1cm孔。施加第二层拉伸封口膜以形成通过1cm孔暴露于蚜虫的
饲料薄膜。将约30只二龄豌豆蚜或桃蚜转移到每个板,并且对于每种毒素有三个平行样。
相同数量的蚜虫仅以饲料为食,作为对照处理。所有板在24℃下以18∶6光照:黑暗的光
周期进行温育。每24小时对死亡率进行评分,并移除死亡蚜虫。每3天更换一次人工饲料。
通过单因素方差分析,对数据进行分析。PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ ID NO:
6)的结果示于表5中。
[0642] 实例5:用纯化蛋白进行的南方绿椿(Nezara viridula)和茶翅椿(Halyomorphahaly)生物测定
[0643] 将40μl的细胞裂解物样品与360μl的饲料(Bio-Serv F9644B)混合。将10至15只刚蜕皮的各龄若虫放入用潮湿 滤纸(100mm直径)作内衬的聚苯乙烯培养
皿(100mm×20mm)中。该生物测定在25℃下温育四天。对该生物测定的昆虫死亡率和生长
迟缓进行评分。为了生成IC50或LC50数据,针对昆虫测定一系列浓度的纯化蛋白,50%昆
虫受到严重损害的浓度是IC50并且50%昆虫死亡的浓度是LC50。PIP-1A(SEQ ID NO:2)
和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)的结果示于表5中。
[0644] 实例6:用纯化蛋白进行的科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)生物测定
[0645] 将20μl的细胞裂解物样品与75μl的改良的鞘翅目饲料(Bio-Serv F9800B)在96孔生物测定板(BD FalconTM 353910)的每孔中混合并使之固化。每孔中放入单只新生
幼虫并且用麦拉片覆盖物将板密封。在麦拉片片材中打孔并将板在25℃下温育四天。对
该生物测定的昆虫死亡率和生长迟缓进行评分。PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ
ID NO:6)的结果示于表5中。
[0646] 实例7:用纯化蛋白在菱纹背蛾(Plutella xylostella)中进行的交叉抗性测试
[0647] 使用类似于Wang,et al.,((2007)Appl.Environ.Microbiol.73:1199-1207)(wang等人,2007年,《应用与环境微生物学》,第73卷,第1199-1207页)的饲料叠加测定来测试样品对易感的和Cry1A抗性的菱纹背蛾(DBM,Plutella xylostella)的LC50和IC50。
为进行新生幼虫生物测定,将PIP-1A(SEQ ID NO:2)样品溶液的等分试样施加到30ml昆虫
饲养杯中的5ml人工饲料(南部产品公司(Southland Products Inc.))的表面(约7cm2)。
每个生物测定包括七个来自500ng/cm2的PIP-1A(SEQ ID NO:2)样品的2X连续稀释液和
阴性对照,每种浓度有三个平行样。PIP-1A(SEQ ID NO:2)蛋白稀释液通过将PIP-1A蛋白
(SEQ ID NO:2)与适当量的PBS缓冲溶液(飞世尔科技公司(Fisher Scientific Inc))混
合而制备。将新生幼虫(<孵化后24小时)放入每个测定杯中。在27℃下饲喂经处理的
饲料4天后,对由每种样品引起的死亡率和幼虫生长抑制(如果在4天内幼虫未进入二龄
期,则被定义为抑制)进行评分。基于概率元分析,计算了50%死亡率(LC50)或50%个体
受抑制(IC50)的浓度。结果(表6)显示菱纹背蛾中PIP-1A(SEQ ID NO:2)与Cry1A没有
交叉抗性(抗性比<2)。
[0648] 表6
[0649]
[0650] 实例8:PIP-1A变体的构建和鉴定
[0651] 使用递归序列重组方法(Crameri,et al.,(1998)Nature.391:288-291(Crameri等人,1998年,《自然》,第391卷,第288-291页);Stemmer,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA
91:10747-10751(Stemmer,1994年,《美国国家科学院院刊》,第91卷,第10747-10751页);
Ness,et.al.,(2002)Nature Biotechnology20:1251-1255(Ness等人,2002年,《自然-生物技术》,第20卷,第1251-1255页)),也称为基因改组方法,来生成经修饰的PIP-1A多核
苷酸的文库。为了增加这两个基因之间的交叉点,使用作为模板的PSEEN3174(SEQ ID NO:
5)的密码子用法修饰PIP-1A(SEQ ID NO:1)的密码子,同时不改变蛋白质序列。经修饰的
PIP-1A编码序列被命名为PIP-1A Synth(SEQ ID NO:15)并被合成。修饰后这两个基因之
间的DNA序列同一性从78%增加至87%。为了进行经典的基因家族改组,通过有限的核酸
酶消化,产生PIP-1A Synth(SEQ ID NO:15)和PSEEN3174(SEQ ID NO:5)的随机DNA片段。
从琼脂糖凝胶中回收这两个基因的分子量为50至200个碱基对的DNA片段。将分离的DNA
片段在热循环仪上用聚合酶装配并通过位于两个末端旁侧的克隆引物拯救。将文库作为麦
芽糖结合蛋白融合体克隆到 (NEB)中并转化到大肠杆菌细胞中。在草盲蝽测
定中筛选来自改组文库的大约5000个克隆,并且大约1000个克隆以显著水平表达多肽,并
且在草盲蝽生物测定中作为澄清细胞裂解物是有活性的。使用PIP-1多肽浓度为100ppm
的细胞裂解物进行草盲蝽生物测定。使用以BSA作为标准品的SDS-PAGE的密度测定法,利
用程序Phoretix ID(TotalLab Ltd Keel House,Garth Heads,Newcastle upon Tyne NE1
2JE(泰恩河畔纽卡斯尔加思黑兹龙骨屋的TotalLab公司,邮编NE1 2JE))估计PIP-1多肽
的浓度。对活性克隆中的50个进行DNA测序(SEQ ID NO:152-202)并测定所编码PIP-1
多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:101-151)。表7示出了PIP-1多肽(SEQ ID NO:101-151)
与PIP-1A(SEQ ID NO:2)的同源性百分比。对于表7中的每个序列,仅示出了PIP-1A(SEQ
ID NO:2)、PSEEN3174(SEQ ID NO:6)和PIP-1多肽有差异的那些位置和相应氨基酸。还在
PIP-1A(SEQ ID NO:2)的不是PSEEN3174(SEQ ID NO:6)的相应氨基酸的第3、6、49、213、
249位(阴影部分)处鉴定了氨基酸置换。这些结果证实了不同组的PIP-1A多肽变体具有
杀昆虫活性。
[0652]
[0653]
[0654]
[0655]
[0656]
[0657]
[0658] 实例9:影响蛋白稳定性和功能的氨基酸位置的鉴定
[0659] 使用PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)序列对能源部联合基因组研究所网站(www.jgi.doe.gov/)和NCBI数据库进行BLAST搜索,揭示了与具有较低同
源性的三个另外基因有关的信息:AECFG_592740(2035954615-注释为假定蛋白[切叶蚁
(Acromyrmex echinatior)菌圃])、Pput_1063(登录号ABQ77224;基因ID:5191350-注
释为假定蛋白[恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F1])以及Pput_1064(登录号
ABQ77225;基因ID:5191351-注释为假定蛋白[恶臭假单胞菌F1])。AECFG_592740编码
序列具有以SEQ ID NO:11示出的DNA序列,并编码具有以SEQ ID NO:12示出的氨基酸
序列的多肽。Pput_1063编码序列具有以SEQ ID NO:7示出的DNA序列,并编码以SEQ ID
NO:8示出的多肽。Pput_1064编码序列具有以SEQ ID NO:9示出的DNA序列,并编码以
SEQ ID NO:10示出的多肽。合成AECFG_592740(SEQ ID NO:11)、Pput_1063(SEQ ID NO:
7)和Pput_1064(SEQ ID NO:9)基因,将各自的蛋白在大肠杆菌中表达为麦芽糖结合蛋白
融合体,并且在如之前针对PIP-1A(SEQ ID NO:2)所述的草盲蝽测定中测试细胞裂解物。
AECFG_592740(SEQ ID NO:12)、Pput_1063(SEQ ID NO:8)和Pput_1064(SEQ ID NO:8)蛋
白在草盲蝽测定中是非活性的。
[0660] 三种活性同源物PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PSEEN3174(SEQ ID NO:6)和PIP-1B(SEQID NO:4)与三种非活性直系同源物AECFG_592740(SEQ ID NO:12)、Pput_1063(SEQ ID NO:
8)和Pput_1064(SEQ ID NO:10)的蛋白序列比对示于图1中。PIP-1A(SEQ ID NO:2)的二
级结构特征使用程序Garnier(EMBOSS浏览器)(Garnier,et al.,(1978)J. Mol.Biol.120:
97-120(Garnier等人,1978年,《分子生物学杂志》,第120卷,第97-120页))获得,并且
所选结构特征示于图1的比对上方。选择六个位置(SEQ ID NO:2的P43、W66、P89、Y93、
Y176、F259)用于饱和诱变分析。使用每个位点的简并寡核苷酸(表8)并使用每个位点的
N端(无突变)和C端(含突变)基因的两个重叠片段的拼接和拯救PCR策略,来产生突变
体,如图2所示使用N端(无突变)和C端(含突变)基因的两个重叠片段的拼接和拯救
PCR策略。将经拯救的突变体文库克隆到 -c2x(NEB)的麦芽糖结合蛋白融合体中。
通过对每个文库的96个克隆测序来鉴定单独的突变。在大肠杆菌中表达各自的变体蛋白,
并且在如之前针对PIP-1A(SEQ ID NO:2)所述的草盲蝽测定中测试细胞裂解物。表9示出
了对于每个突变位置所鉴定的如下氨基酸置换:表达可溶性蛋白的那些置换,以及在草盲
蝽测定和/或大豆尺蠖测定中有活性且在总体最大分数8中具有最小分数4或更大的那些
置换。加有括号的置换的表达和活性未进行测定。用“*”指示的置换具有显著降低的可溶
性表达。该数据表明表9中指示为“活性突变体”的氨基酸置换可在保留活性的同时制得。
[0661] 表8
[0662]
[0663] 表9
[0664]
[0665] 实例10:杀昆虫活性的基序的鉴定
[0666] 选择四个保守基序:活性蛋白(PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PSEEN3174(SEQ ID NO:6)和PIP-1B(SEQ ID NO:4))的SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸(基序1)、SEQ ID NO:2的
第149-159位氨基酸(基序2)、SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸(基序3)以及SEQ ID
NO:2的第240-249位氨基酸(基序4)(基序在图1中带有下划线),以测定其杀昆虫功能的
作用。对于每个所选基序,SEQ ID NO:2的第64-79位氨基酸、SEQ ID NO:2的第149-159
位氨基酸、SEQ ID NO:2的第171-183位氨基酸、以及SEQ ID NO:2的第240-249位氨基酸,
将序列替换为分别来自三种远源相关但无功能活性的蛋白的相应序列AECFG_592740(SEQ
ID NO:12)、Pput_1063(SEQ ID NO:8)和Pput_1064(SEQ ID NO:10)(表10示出了同一
性%)。
[0667] 表10
[0668]PIP-1A PIP-1B PSEEN3174 Pput_1063 AECFG_592740 Pput_1064
PIP-1A 93 79 23 37 36
PIP-1B 79 26 38 35
PSEEN3174 24 36 34
Pput_1063 22 23
AECFG_592740 36
Pput_1064
[0669] 使用编码非活性蛋白的替换序列的重叠寡核苷酸(表11),利用对野生型PIP-1A的N端和C端片段的拼接PCR策略,来产生嵌合体。
[0670] 如上文针对PIP-1A所述的那样将包含替换的拯救PCR产物克隆到pMAL表达载体中。将所得的嵌合体在草盲蝽昆虫生物测定中进行表达和功能测试。表12示出了来
自PIP-1A的四个基序(图1中带有下划线)中每个的氨基酸序列以及基于与被置换的
AECFG_592740(SEQ ID NO:12)、Pput_1063(SEQ ID NO:8)和Pput_1064(SEQ ID NO:10)的
比对(图1)的相应氨基酸序列。在表12中,各自序列之间的差异以“粗体”和“下划线”指
示。
[0671] 表11
[0672]
[0673]
[0674]
[0675] 表12
[0676]
[0677]
[0678] 表12还指示当在大肠杆菌中表达为MAL融合体时所得蛋白是否可溶以及在草盲蝽测定中是否有活性。
[0679] 如表12中指示,这些嵌合体中除一个以外的所有都具有降低的可溶性蛋白的表达,并且在生物测定中是非活性的,指示这四个基序具有功能限制。
[0680] 实例11:基序的饱和诱变以限定保留杀昆虫活性的序列变异
[0681] 选择两个基序,PIP-1A(SEQ ID NO:2)的第171至183位氨基酸(基序3)和第240至249位氨基酸(基序4),以进一步限定这些区域在杀昆虫功能方面的作用。为了进
一步限定这两个所选基序内的容许序列变异,使用如分别针对基序3和基序4在表13和表
14中所示的诱变寡核苷酸,为基序的每个位置设计饱和诱变。使用如实例9中所述的类似
策略产生变体。表15和表16示出了对于每个突变位置所鉴定的如下氨基酸置换:表达可
溶性蛋白的那些置换,以及在草盲蝽测定和/或大豆尺蠖测定中有活性且在总体最大分数
8中具有最小分数4或更大的那些置换。该数据表明表15和表16中指示为“活性突变体”
的氨基酸置换可在保留活性的同时制得。
[0682] 表13
[0683]
[0684]
[0685] 表14
[0686]
[0687]
[0688] 表15
[0689]
[0690]
[0691] 表16
[0692]
[0693]
[0694] 实例12:对瞬时叶组织的瞬时表达和昆虫生物测定
[0695] 将PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)两者作为MBP融合体并单独地克隆到受到病毒启动子pDMMV控制的瞬时表达载体中(Dav,et.al.,(1999)Plant Mol.
Biol.40:771-782(Dav等人,1999年,《植物分子生物学》,第40卷,第771-782页))。将农杆菌细胞悬液引入完整组织的植物细胞使得可以测量或研究可重复感染和后续植物来源转
基因表达的农杆菌渗入方法是本领域熟知的(Kapila,et.al.,(1997)Plant Science 122:
101-108(Kapila等人,1997年,《植物科学》,第122卷,第101-108页))。简而言之,用测
试和对照菌株的正常化细菌细胞培养物对菜豆或大豆的幼小植株进行农杆菌渗入。产生叶
盘,并用大豆尺蠖(SBL)(Pseudoplusia includes)或黎豆毛虫(VBC)(Velvet Anticarsia
gemmatalis)的3只新生幼虫进行侵染,且仅用农杆菌产生两个对照叶盘。在两天侵染后对
绿色叶片组织的消耗进行评分。瞬时表达的PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ ID
NO:6)保护叶盘不被侵染的SBL和VBC昆虫消耗,而对于两个阴性对照则观察到完全的绿
色组织消耗。使用提取自渗透叶片组织的蛋白裂解物,通过基于质谱的蛋白鉴定方法证实
了PIP-1A(SEQ ID NO:2)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)两者的瞬时蛋白表达(Patterson,
(1998)10(22):1-24,Current Protocol in Molecular Biology published by John Wiley & Son Inc(Patterson,1998年,第10卷,第22期,第1-24页,《现代分子生物学实验手册》,由约翰·威利父子出版公司出版))。
[0696] 实例13:所限定的保留活性的片段的蛋白序列
[0697] 通过对最开始和/或最后30个氨基酸的PCR克隆,以5个氨基酸的增量从两个末端产生PIP-1A(SEQ ID NO:2)的一系列截短变体。将截短的基因克隆到如上列出的相同表
达系统。用昆虫测定这些截短形式PIP-1A的重组蛋白并以仍保留可检测杀昆虫活性的变
体限定该蛋白的最小长度。
[0698] 实例14:N端截短变体
[0699] PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PSEEN3174(SEQ ID NO:6)和PIP-1B(SEQ ID NO:4)蛋白通过有限的胰蛋白酶消化(1份胰蛋白酶与100份纯化蛋白)来消化。通过N端氨基酸
测序,与各自全长蛋白相比,所得的N端胰蛋白酶截短变体,PIP-1AT1(SEQ ID NO:204)、
PSEEN3174T1(SEQ ID NO:206)、PIP-1BT1(SEQ ID NO:208)缺失了第1-28位氨基酸。将
PIP-1AT1(SEQ ID NO:204)、PSEEN3174T1(SEQ ID NO:206)、PIP-1BT1(SEQ ID NO:208)在草盲蝽测定中进行测定,并发现具有与各自的全长蛋白基本上相同的活性。
[0700] 实例15:蛋白水解裂解位点变体
[0701] 使PIP-1A第28位处的精氨酸(R)突变以改变胰蛋白酶裂解位点。使用与实例9中所述类似的策略,采用饱和诱变引物R28R(SEQ ID NO:218)和R28F(SEQ ID NO:219)产
生变体。表17示出了所鉴定的如下氨基酸置换:表达可溶性蛋白的那些置换,以及在草盲
蝽测定中有活性且在总体最大分数8中具有最小分数4或更大的那些置换。该数据表明,
可制备表17中指示为“活性突变体”的氨基酸置换以在保留活性的同时消除蛋白水解裂解
位点。
[0702] 表17
[0703]
[0704] 实例16:多个残基基序4的PIP-1A变体
[0705] 为进一步探索基序4(PIP-1A(SEQ ID NO:2)的第240至249位氨基酸)的作用,产生在基序4中具有多个氨基酸置换的一系列变体。使用与实例9中所述类似的诱变策
略,采用与引物3188R(GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAG(SEQ ID NO:327))配对的饱和诱变引物
基序 4-Comb-F(CCGCTGGATTGGGATACTGTTVWWNGCHAYDTTWTKDTKGRKNAYTWTNAYCCAGGCAGCAAT
AGTGGGCACTTC(SEQ ID NO:326))以及与3188F(CAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAG(SEQ ID NO:
329))配对的Comb-R(AACAGTATCCCAATCCAGCGG(SEQ ID NO:328))来产生变体。诱变引物
基序4-Comb-F被设计为在PIP-1A(SEQ ID NO:2)的第240-249位残基处部分简并,从而在
每个残基处产生所选的氨基酸置换。表18示出了编码第240-249位残基中每个的简并密
码子和可能得到的氨基酸。在表18中,天然氨基酸以粗体和下划线指示。
[0706] 表18
[0707]
[0708]
[0709] 所得的编码PIP-1A变体多肽的多核苷酸在大肠杆菌中被表达为MBP融合体,并且如实例1所述作为澄清裂解物在96孔格式(3个板)中筛选草盲蝽杀昆虫活性,并且在0
至8的标度上对活性进行评分(参见图4)。对编码具有4至8范围内的草盲蝽杀昆虫活性
的变体PIP-多肽的克隆进行DNA测序(SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、
SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:
233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244)以确定表19中示出的SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:
253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:268和SEQ ID NO:
269的PIP1A多肽的第240-249位残基处的氨基酸置换的同一性。相比于PIP-1A(SEQ ID
NO:2),基序4氨基酸置换以粗体和下划线指示。
[0710] 表19
[0711]
[0712]
[0713] 表19,续表
[0714]
[0715]
[0716] 对编码具有0至4范围内的草盲蝽杀昆虫活性的变体PIP-1A多肽的克隆进行DNA测序(SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280、SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296和SEQ ID NO:297)以确定表20中示出的SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:
300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:
311、SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323、SEQ ID NO:324和SEQ ID NO:325的PIP-1A多肽的第20-249位
残基处的氨基酸置换的同一性。通过SDS-PAGE进行的蛋白表达分析(数据未示出)揭示
了,具有0至4的草盲蝽杀昆虫活性的变体蛋白影响在大肠杆菌中的可溶性表达(蛋白折
叠和溶解度),其中蛋白聚积成澄清裂解物的不溶性部分。由基序4中多个置换引起的活性
丧失似乎是源于大肠杆菌表达系统中缺少可溶性表达蛋白。基序4似乎能耐受多个氨基酸
置换,同时保持活性。
[0717] 表20
[0718]
[0719]
[0720] 实例17:来自菌株JH19887-2的对草盲蝽有活性的杀昆虫蛋白的鉴定
[0721] 针对SEQ ID NO:1的PIP-1多核苷酸序列对生防假单胞菌菌株JH19887-2的专有基因组重叠群文库进行Blast搜索,鉴定了SEQ ID NO:331的多核苷酸,其编码与
PIP-1A(SEQ ID NO:2)具有82%序列同一性的SEQ ID NO:332的多肽(本文称为PIP-1C)。
表21示出了PIP-1C(SEQ ID NO:332)与PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PIP-1B(SEQ ID NO:4)与
PSEEN3174(SEQ ID NO:6)之间的序列同一性%。
[0722] 图5示出了PIP-1A(SEQ ID NO:2)、PIP-1B(SEQ ID NO:4)、PIP-1C(SEQ ID NO:332)和PSEEN3174(SEQ ID NO:6)的序列比对。PIP-1C以与PIP-1A相同的方式在大肠
杆菌中表达。在基于饲料的测定中针对大豆尺蠖(SBL)和草盲蝽测定纯化的PIP-1C。
PIP-1C(SEQ ID NO:332)显示对于SBL和草盲蝽的杀灭活性,证实了与PIP-1A(SEQ ID NO:
2)类似的杀昆虫谱。
[0723] 表21
[0724]
[0725] 实例18:通过粒子轰击转化玉蜀黍及转基因植物再生
[0726] 将来自温室供体植物的不成熟玉蜀黍胚用含有毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1)的DNA分子进行轰击,该毒素核苷酸序列可有效连接到泛素启动子和赋予对双丙氨膦除
草剂的抗性的选择性标记基因PAT(Wohlleben,et al.,(1988)Gene 70:25-37(Wohlleben
等人,1988年,《基因》,第70卷,第25-37页))。或者,该选择性标记基因在单独的DNA分
子上提供。如下进行转化。培养基配方见下文。
[0727] 靶标组织的制备TM
[0728] 将穗去壳并在30%CLOROX 漂白剂加0.5% Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟,然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下,并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置,每板
25个胚,在560Y培养基上放置4小时,然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。
[0729] DNA的制备
[0730] 制备包含与泛素启动子有效连接的核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1)的质粒载体。例如,合适的转化载体包含来自玉米的UBI1启动子、来自UBI1的5′UTR、UBI1内含子以
及PinII终止子。该载体另外含有由CAMV35S启动子驱动的PAT选择性标记基因并包括
CAMV35S终止子。任选地,该选择性标记可以存在于单独的载体上。采用CaCl2沉淀程序如
下将包含毒素核苷酸序列及PAT选择性标记的DNA分子沉淀到1.1μm(平均直径)钨丸上。
[0731] 100μL制备的钨粒子水溶液
[0732] 10μL(1μg)DNA/Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)
[0733] 100μL 2.5M CaCl2
[0734] 10μL 0.1M亚精胺
[0735] 将每种试剂依序加到钨粒子悬液,同时保持在多管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理,并且允许其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后,将各管进行短
暂离心,除去液体,用500mL 100%乙醇洗涤,离心30秒。再次移除液体,将105μL 100%乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击,将钨/DNA粒子进行短暂超声处理,并取10μL
点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上,让其干燥约2分钟后进行轰击。
[0736] 粒子枪处理
[0737] 将样品板在粒子枪#HE34-1或#HE34-2中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击,每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
[0738] 后续处理
[0739] 在轰击之后,将胚保持在560Y培养基上2天,然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基,每隔2星期进行分培。在进行大约10个星期的选择后,将抗选择的愈伤
组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期),将发育良
好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后,将发育
的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天,直到小植株完全长好。然后将植株转
移到含有盆栽土的浅箱嵌块(inserts in flats)(相当于2.5英寸盆),在生长室中生长1
个星期,随后在温室中另外生长1-2个星期,然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生
长至成熟。通过本领域知道的测定法或者如上所述监测植株并对毒素表达进行评分。
[0740] 轰击法和培养基
[0741] 轰击培养基(560Y)包含4.0g/L N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L 2,4-D和
TM
2.88g/L L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容);2.0g/L Gelrite (用去离
子水定容后加入);及8.5mg/L硝酸银(将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基
(560R)包含4.0g/L N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000X
SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L 2,4-D(用KOH调至pH5.8后用去
TM
离子水定容);3.0g/L Gelrite (用去离子水定容后加入);及0.85mg/L硝酸银和3.0mg/
L双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
[0742] 植物再生培养基(288J)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0mL/L MS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/L盐酸硫胺、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸,用精制
去离子水(polished D-I H2O)定容)(Murashige and Skoog,(1962)Physiol.Plant.15:
473(Murashige和Skoog,1962年,《植物生理学》,第15卷,第473页))、100mg/L肌醇、
0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L的0.1mM脱落酸(在调至pH 5.6后用精制去离子
TM
水定容);3.0g/L Gelrite (用去离子水定容后加入);以及1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L
双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。
[0743] 无激素培养基(272V)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0mL/L MS维生素原液(0.100g/L烟酸、0.02g/L盐酸硫胺、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸,用精制去
离子水定容)、0.1g/L肌醇和40.0g/L蔗糖(调节pH至5.6后用精制去离子水定容);和
6g/L细菌琼脂(在用精制去离子水定容后加入),灭菌并冷却到60℃。
[0744] 实例19:农杆菌介导的玉蜀黍转化和转基因植物的再生
[0745] 为用毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1)进行农杆菌介导的玉蜀黍转化,可使用Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和PCT专利公布No.WO 1998/32326;将所述专利的
内容以引用方式并入本文)。简而言之,从玉蜀黍分离未成熟胚,并使胚与农杆菌悬液在该
细菌能够将核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:1)转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞的
条件下进行接触(步骤1:感染步骤)。在这个步骤中,可将未成熟胚浸入农杆菌悬液中以
引发接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2:共培养步骤)。在该感染步骤之后,可
将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在这个共培养期之后,设想到任选的“静息”步骤。
在这个静息步骤中,将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育,
不添加植物转化体的选择剂(步骤3:静息步骤)。可将未成熟胚在含有抗生素但无选择剂
的固体培养基上培养,为了消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息阶段。接着,将经接种的
胚在含有选择剂的培养基上进行培养,回收生长出的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤)。
将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养,从而导致转化细胞的选择性生长。然
后将愈伤组织再生为植株(步骤5:再生步骤),将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固
体培养基上进行培养以再生出植株。
[0746] 实例20:大豆胚的转化
[0747] 如下所述,用含有与pinII启动子有效连接的核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:1)的质粒对大豆胚进行轰击。为了诱导体细胞胚,从适当的大豆栽培种的经表面灭菌的未成
熟种子解剖出长3-5mm的子叶,然后将其在适当的琼脂培养基上于26℃在光照或黑暗中培
养六至十个星期。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选
择作为早期球状阶段的胚繁殖的体细胞胚的簇之后,如下所述维持悬浮物。
[0748] 大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35mL液体培养基中,以荧光灯按16∶8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周,通过将大约35mg
的组织接种到35mL的液体培养基中,将培养物进行传代培养。
[0749] 然后可通过粒子枪轰击方法(Klein,et al.,(1987)Nature(London)327:70-73(Klein等 人,1987年,《自 然》(伦 敦),第327卷,第70-73 页),美 国 专 利
No.4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器
(氦改型)进行这些转化。
[0750] 可用于促进大豆转化的选择性标记基因,是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell,et al.,(1985)Nature 313:810-812(Odell等人,1985年,《自然》,第313
卷,第810-812页))、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌;Gritz,et al.,(1983)Gene 25:
179-188(Gritz等人,1983年,《基因》,第25卷,第179-188页))的潮霉素磷酸转移酶基因
和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区所组成的转基因。包含
与pinII启动子有效连接的毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1)的表达盒可作为限制性
片段分离。然后可将这个片段插入携带标记基因的载体的独特限制性酶切位点中。
[0751] 向50μL的60mg/mL 1μm金粒子悬浮液加入(按顺序):5μL DNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟,在微量离心
机中离心10秒,移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μL 70%乙醇中洗涤一次并再
悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次,每次1秒。然后将五微升
DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
[0752] 将大约300-400mg两周龄悬浮培养物置于空的60×15mm培养皿中,用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验,通常轰击大约5-10个组织平板。将膜破裂压力设
定为1100psi,将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约
3.5英寸放置,轰击三次。轰击后,可将组织一分为二并放回进液体中,如上所述进行培养。
[0753] 轰击后五至七天,可将液体培养基与新鲜培养基交换,轰击后七至十二天与含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基交换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周,可观察
到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独
的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的
转化事件。然后可将这些悬浮物传代培养,并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细
胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
[0754] 说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文,如同每个单独的公布
或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
[0755] 虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了上述公开内容,但显然可以在所附权利要求范围内实施一些改变和修改。
[0756] 以上对本发明各种所示实施例的描述并不是穷举的或者将本发明限制于所公开的精确形式。尽管本发明的具体实施例以及实例出于说明性目的在本文进行了描述,但各
种等同修改形式都可能在本发明的范围内,如相关领域的技术人员将认识到的。本文中提
供的本发明的教导可以适用于除上述实例之外的其他目的。除了按照在前面的说明书和实
例中具体描述的方式以外,本发明还可以以其他方式实施。根据上述教导,可以对本发明进
行许多修改和改变,因此,这些修改和改变也在所附的权利要求的范围内。
[0757] 根据以上具体描述可以对本发明做出这些变化和其他变化。一般来讲,在以下权利要求中,所使用的术语不应被解释为将本发明限制为说明书和权利要求书中所公开的具
体实施例。
[0758] 背景技术、具体实施方式和实例中所引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容均以引用的方式全文并入本文。
[0759] 以上列出的实例目的在于为本领域普通技术人员提供如何制造与使用主题发明的完整公开和描述,而无意限制被认为是本发明的范围。已作出努力以确保所使用的数据
(例如,数量、温度、浓度等)的准确性,但应允许一些实验误差和偏差。除非另外指明,否则份数是重量份,分子量是平均分子量;温度以摄氏度计;并且压力为大气压或接近大气压。
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