大豆凝集素基因lec-s的应用
阅读：825发布：2020-05-18
专利汇可以提供大豆凝集素基因lec-s的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程领域，涉及大豆凝集素基因lec-s的应用。本发明对大豆凝集素基因lec-s（GenBank登录号为DQ235094）进行了转基因 烟草 及其抗病抗虫性的研究，获得的转基因烟草对TMV表现出显著的抗性，对甜菜夜蛾也表现良好抗性。可见，大豆凝集素基因lec-s可在培育抗病和/或抗虫的转基因 植物 品种中应用。，下面是大豆凝集素基因lec-s的应用专利的具体信息内容。
大豆凝集素基因lec-s的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及大豆凝集素基因lec-s的应用。
背景技术
[0002] 烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是一种植物正链RNA病毒，可侵染38科268种植物，引起多种重要的植物病毒病（Scholthof，2004）。由于TMV抗逆性极强，对寄主专性寄生，加上植物缺乏完整的免疫代谢系统，使得该病很难防治。甜菜夜蛾最初产生于东南亚，但在世界范围内也是一种重要的虫害，可以危害多种园艺作物及蔬菜（Smagghe et al，2003）。化学药剂的使用是目前防治植物病虫害的一种重要措施，但化学药剂的滥用对环境和农产品安全造成了严重的影响。而近年来植物抗病虫基因工程的发展则为防治植物病虫害提供了一条新途径，主要思路是将抗性相关基因通过基因工程手段转入受体植物中，从而获得植物抗病虫新品种，而且较传统育种具有基因资源多、育种周期短等特点（Kang et al，2005）。
[0003] 凝集素是一种能凝集红细胞、多糖或糖复合物的非免疫来源的糖蛋白。目前为止，人们已经从多种植物、动物、细菌、病毒和真菌中分离出凝集素（Tateno et al，1998；Wang et al，1996；Inamori and Saito，1999；Leteux and Chai，2000）。迄今为止已发现的许多凝集素中，植物凝集素是最大的一个家族。在这些植物中，尤以豆科植物的种子中凝集素含量最为丰富。植物凝集素在植物中具有重要的防御功能。以往的许多研究报道表明，植物凝集素可以提高植物对真菌、细菌、线虫等多种病原物和有害昆虫的抗性（Ye et al，2001；Ooi et al，2000；Machuka and Oladapo，2000）。但关于大豆凝集素抗植物病毒的研究还未见报道。在发明人的前期工作中，利用RACE和反向PCR技术从大豆品种合丰29号中分离得到一个新的大豆凝集素基因，命名为lec-s（DQ235094）。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的大豆凝集素基因lec-s的应用。
[0005] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0006] 大豆凝集素基因lec-s在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。
[0007] 其中，所述的抗病为抗烟草花叶病毒，所述的抗虫指抗甜菜夜蛾。
[0008] 含有大豆凝集素基因lec-s的重组质粒在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中的应用其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。
[0009] 其中，所述的抗病为抗烟草花叶病毒，所述的抗虫指抗甜菜夜蛾。
[0010] 有益效果：
[0011] 转基因烟草由于其基因转化技术成熟，从侵染到获得再生苗的周期较短，已被作为一个模式工作系统，常被用来进行植物抗病虫性研究。本发明对大豆凝集素基因lec-s进行了转基因烟草及其抗病抗虫性的研究，获得的转基因烟草对TMV表现出显著的抗性，对甜菜夜蛾也表现良好抗性。qRT-PCR的检测结果也表明，与转空载体烟草相比，转基因烟草接种TMV后12h和24h，烟草中防卫基因PR-1a、Pa1和GST1和HR标志基因hsr515均显著上调表达，并且最终表现为转基因烟草对TMV的抗性增强。所以，我们推断，lec-s基因在烟草体内表达，可能同时激活了烟草中的抗病性SA信号通路和过敏性细胞死亡（hypersensitive cell death，HCD）信号通路，赋予了烟草对TMV的抗性。可见将大豆凝集素基因lec-s通过基因工程手段转入农作物，能够获得具有抗病性以及抗虫性的转基因植物新品种。附图说明
[0012] 图1lec-s基因RT-PCR扩增图（A）和pMD18-T Simple::lec-s（B）的酶切验证图A：M.分子量标记（DNA Marker DL2000）;1~2.从大豆品种29中扩增lec-s;3.清水对照B：M.分子量标记（DNA Marker DL2000）;1.Sma I和Xba I酶切pMD18-T Simple::lec-s[0013] 图2大豆凝集素lec-s基因编码的氨基酸同其它大豆凝集素的同源比较
[0014] 有*的位点是相似性高的位置
[0015] 图3植物重组表达质粒pBI121：：lec-s构建图谱
[0017] 图4植物表达载体pBI121::lec-s构建酶切图
[0018] M1.分子量标记（DNA Marker DL2000）；M2.分子量标记（DNA Marker DL15000）；1~2.质粒pBI121::lec-s用Sma I和Xba I双酶切；3.质粒pBI121用Sma I和Xba I双酶切。
[0019] 图5重组载体pBI121::lec-s转化农杆菌的PCR验证
[0020] M.分子量标记（DNA Marker DL2000）;W.阴性对照，清水；P.阳性对照，质粒pBI121::lec-s；1～3.不同的转化子。
[0021] 图6转基因烟草T0代的PCR检测
[0022] A、B：M.分子量标记(DNA Marker DL2000)；P.阳性对照，质粒pBI121::lec-s；W.阴性对照，清水；CK.阴性对照，未转化植株；1~45.转基因植株；
[0023] C：M.分子量标记(DNA Marker DL2000)；P.阳性对照，质粒pBI121；W.阴性对照，清水；
[0024] CK.阴性对照，未转化植株；1~24.转空载体植株。
[0025] 图7转基因植株T0代的Southern杂交分析
[0026] M.分子量标记（DNA Marker DL2000，λ-HindⅢdigest）；1.阳性对照，lec-s PCR扩增产物；2.未转化植株；3.转空载体植株；4～8.转基因植株
[0027] 图8T1代转基因烟草对TMV的抗性
[0028] WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，T1-20.转基因烟草
[0029] 图9T1代转基因烟草接种TMV后病斑数差异比较
[0030] WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，T1-20.转基因烟草；数据表示为平均值±标准差；*表示与转空载体烟草相比在0.05水平上差异显著
[0031] 图10qRT-PCR测定防卫反应相关基因表达
[0032] A：接种TMV后12h；B.接种TMV后24h；WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；
[0033] B：T1-11，T1-20.转基因烟草
[0034] 数据表示为平均值±标准差；*表示与转空载体烟草相比在0.05水平上差异显著
[0035] 图11T1代转基因烟草对甜菜夜蛾幼虫体重的影响
[0036] WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，T1-20.转基因烟草
[0037] 图12T1代转基因烟草对甜菜夜蛾幼虫化蛹率的影响
[0038] WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，T1-20.转基因烟草
具体实施方式
[0040] 烟草品种为三生烟（Nicotiana tabacum cv.Samsun NN），取烟草叶片作为转化材料。根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105、植物表达载体pBI121购自Invitrogen。
[0041] 烟草组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，121℃灭菌15min。预培养培养基：MS+6BA0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-BA1mg/L；筛选培养基：MS+6-BA1mg/L+Km100mg/L+Cb500mg/L；生根培养基：1/2MS+Km100mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L；农杆菌培养用YEB培养基。
[0042] Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶、dNTPs、核酸分子质量标准、DNaseⅠ、TM TMPrimeScript Reverse Transcriptase和SYBR Premix ExTaq Kit均购自TaKaRa公司。质粒抽提和DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。植物RNA提取试剂盒Plant RNAKit购自Omega公司。卡那霉素（Kanamycin）、羧苄青霉素（Carbenicillin）购自上海索莱宝生物科技有限公司。
[0043] 实施例1pBI121::lec-s质粒的构建1.1lec-s的克隆
[0044] 取大豆品种合丰29号叶片，使用Omega公司的Plant RNAKit植物RNA提取TM试剂盒提取大豆总RNA，用无RNase的DNase I处理纯化。使用PrimeScript Reverse Transcriptase（Takara）进行RNA反转录合成cDNA。以1μg总RNA经反转录酶获得cDNA第一链为模板，lec-s-F/lec-s-R为引物，通过PCR反应扩增的到两端含有Xba I/Sma I酶切位点的lec-s基因片段。采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对PCR电泳条带进行回收。将回收的lec-s片段连接至测序载体pMD18-T Simple Vector，获得质粒pMD-18T Simple vector::lec-s。质粒pMD-18T Simple vector::lec-s转化DH5α感受态细胞，使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取初筛阳性克隆的质粒，经PCR筛选阳性克隆，从经PCR筛选的阳性克隆中提取的质粒，使用TaKaRa公司限制性内切酶进行酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒送测序。
[0045] PCR反应体系为：
[0046]
[0047] 其中，上游引物lec-s-F：5’-TCTAGAATGGCCACCTCCAACTTCTC-3’（含XbaI，SEQ ID NO.1）
[0048] 下游引物lec-s-R：5’-CCCGGGTTAGATGGCCTCATTGAGCAC-3’（Sma I，SEQ ID NO.2）PCR反应程序为：
[0049] 95℃预变性5min；95℃变性45sec、58.6℃复性45sec、72℃延伸40sec，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0050] 利用RT-PCR方法从大豆品种合丰29中扩增出lec-s基因（图1A），将其连接到pMD18-T Simple载体后（图1B），测序，结果表明该基因为849bp，与数据库（GenBank）中DQ235094序列的同源性为100%。将大豆凝集素lec-s基因推测的氨基酸序列同GenBank上已登录的其它大豆凝集素le1和le2进行比对（图2），结果表明:该全长cDNA所编码的氨基酸序列与le1同源性60％，与le2同源性为34％。
[0051] 1.2pBI121::lec-s质粒的构建
[0052] 提取质粒pMD-18T Simple vector::lec-s和pBI121，用Sma I和Xba I酶切pMD-18T Simple vector::lec-s载体和pBI121质粒，将lec-s连接到pBI121载体上，得到pBI121::lec-s质粒（图3）。pBI121::lec-s质粒转化DH5α感受态细胞，使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取pBI121::lec-s质粒，用Sma I和Xba I酶切pBI121::lec-s质粒，将酶切验证正确的质粒送测序。参照余云舟（2003）等的方法，将重组质粒导入土壤杆菌EHA105。使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取EHA105/pBI121::lec-s质粒，用Sma I和Xba I酶切EHA105/pBI121::lec-s质粒，将酶切验证正确的质粒送测序。
[0053] 从图4可知，用Sma I和Xba I将重组质粒pBI121::lec-s酶切后，得到了预期849bp的片段。将lec-s基因的测序结果与数据库中序列进行比对分析，同源性为100%。这说明lec-s基因已经成功连到pBI121质粒，即体外表达载体pBI121::lec-s构建成功。将验证正确的重组转基因载体冻融法转化根癌土壤杆菌EHA105。对转化后的抗性单菌落PCR检测后，挑选阳性克隆送测序，将测序结果与lec-s基因序列比对，同源性为100%。结果表明重组转基因载体已成功转入根癌土壤杆菌EHA105（图5）。
[0054] 实施例2农杆菌介导的烟草遗传转化
[0055] 烟草的转化采用农杆菌介导的叶盘法。取烟草叶圆片（直径0.5cm）作为转化受体，在预培养基中预培养1～2d后浸入备好的农杆菌菌液感染20min，烟草叶盘与农杆菌黑暗共培养2d后，转入含羧卞霉素（500mg/L）和卡那霉素（100mg/L）的筛选培基中。25℃、L∶D=16h∶8h培养，1周继代1次。1周左右叶盘开始分化抗性愈伤组织，然后逐渐分化出抗性芽。3~6周开始有芽分化。待绿芽长到2～3cm高后，切下再生芽置于生根培养基中培养。待转化小苗株高6～8cm、根系发育良好后开瓶炼苗2d，再移栽温室培养。
[0056] 其中，烟草组织培养基以MS培养基为基础（Murashige and Skoog，1962），pH5.8，121℃灭菌15min。预培养培养基：MS+6-BA0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-BA1mg/L；筛选培养基：MS+6-BA1mg/L+Km100mg/L+Cb500mg/L；生根培养基：1/2MS+Km100mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L；农杆菌培养用YEB培养基。
[0057] 实施例3转基因烟草T0代的PCR检测
[0058] 上一步共计得到转基因烟草抗性幼苗总计45株，植物总DNA提取采用CTAB法。用转基因烟草T0代叶片总DNA为模板，空载体转化植株和未转化植株总DNA作阴性对照，质粒pBI121：：lec-s做阳性对照进行PCR扩增。根据目的基因序列设计引物lec-s-F/lec-s-R（SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2），扩增目的基因（扩增产物849bp），检测出呈阳性的有31株。检测结果表明，转基因烟草植株和阳性对照质粒一样，均能扩增出相应目的基因的特异片段849bp，而未转化植株和转空体植株没有扩增条带出现（图6A）。因此，PCR检测的结果证明外源基因已经转入到这些再生植株中。为了确保PCR扩增的准确性，还用部分载体序列设计引物pBI-vector-F/pBI-vector-R（SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14）进行了扩增。检测结果表明，转基因烟草植株和阳性对照质粒一样，均能扩增出相应目的基因的特异片段1303bp，而未转化植株和清水对照没有扩增条带出现（图6B），转空载体植株中均能扩增出相应目的基因的特异片段454bp（图6C）。因此，PCR检测的结果初步证明外源基因已经转入到这些再生植株中。
[0059] 实施例4转基因烟草T0代的Southern杂交检测
[0060] 选取部分PCR阳性的转基因植株进行Southern杂交分析，以未转化植株和转空载体植株作阴性对照，lec-s片断PCR扩增产物做阳性对照。用1.2%琼脂糖凝胶电泳，电压2V/cm，电泳结束后用虹吸印迹法将PCR产物转移到尼龙膜上。探针基因（1ec-s基因的一部分，约400bp）用地高辛标记，标记与杂交方法按照试剂盒说明书进行。杂交结果（图7）表明，5株转基因植株中均出现杂交信号，其中3株出现1条杂交信号谱带，1株出现2条杂交信号谱带，1株出现3条杂交信号谱带，说明相应的转基因植株中有1、2和3个拷贝；而未转化植株和转空载体植株则没有出现杂交信号。分子杂交进一步证明了外源基因已经稳定整合到了烟草的基因组中。
[0061] 实施例5T1代转基因烟草的抗TMV效果评价
[0062] 用同批温室培养的烟草，TMV病毒汁液稀释10倍，50倍和100倍后分别接种。选取48-72小时后发病均匀且较多的浓度用于正式接种。烟草用T1代移栽后6周的烟草。采用摩擦接种法接种TMV（方中达，1998）。具体操作步骤如下：
[0063] （1）取TMV病叶组织1g加灭菌水1ml，在干净研钵中研成匀浆；
[0064] （2）将匀浆加入2ml ep管中，低速离心取上清放置在冰水中备用；
[0065] （3）将少量金刚砂（600目）撒在待接种的叶片上，用加样器吸取100ul的稀释后的TMV悬浮液均匀点滴在叶面上，用手指在叶面上轻轻摩擦接种；
[0066] （4）接种后的叶片用水轻轻冲洗，将试验植株置于22-25℃温室中培养。
[0067] 每个处理接种10株，每株接种中部3张叶龄一致的叶片，试验重复3次，每次以转空载体植株作对照，48h后调查叶片枯斑发生情况。抗病性表示为转基因植株与对照相比，病斑个数减少的百分数，即：病斑数减少率（%）=[（转基因烟草病斑数－转空载体烟草病斑数）/转空载体烟草病斑数]×100。
[0068] 接种TMV后48h接种叶片上出现坏死斑，为TMV侵染三生烟后发病的典型症状。接种叶片的病斑数统计结果表明，与未转化和转空载体的烟草相比，接种TMV后转lec-s基因烟草的T1-11和T1-20株系病斑数显著减少，对TMV均表现出明显的抗性（图8），其中T1-11株系病斑数约减少41.72%，T1-20株系病斑约减少43.79%（图9）。未转化烟草与转空载体的烟草接种TMV后病斑数没有明显差异。
[0069] 实施例6实时定量RT-PCR测定转基因烟草防卫相关基因的表达情况
[0070] 分别取接种TMV后12h和24h的转基因烟草叶片用液氮冷冻研磨，使用试剂盒提取叶片总RNA。经无RNase的DNaseⅠ处理后，分别取2μg RNA作模板，采用Prime TMScript Reverse Transcriptase进行反转录。反转录产物稀释1倍后，取2μL作为模板，TM
使用SYBR Premix Ex Taq Kit，采用Two-step-qRT-PCR在ABI PRISM7500荧光定量PCR仪上进行PR-1a、GST1、Pal和hsr515基因表达量的测定，EF-1a基因作为内参，引物序列见表-ΔΔCT
1。试验均设3个重复，以空载体转化植株和未转化植株作对照，采用2 方法进行实验数据处理。
使用SYBR Premix Ex Taq Kit，采用Two-step-qRT-PCR在ABI PRISM7500荧光定量PCR仪上进行PR-1a、GST1、Pal和hsr515基因表达量的测定，EF-1a基因作为内参，引物序列见表-ΔΔCT
1。试验均设3个重复，以空载体转化植株和未转化植株作对照，采用2 方法进行实验数据处理。
[0071] PCR反应体系：
[0072]
[0073] PCR扩增反应条件：
[0074] 95℃，10sec；95℃，5sec，40个循环；60℃，34sec；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec。
[0075] 表1引物
[0076]
[0077] 接种TMV后12h和24h转基因烟草叶片中防卫反应基因PR-1a、GST1、Pa1和hsr515的表达情况见图10。结果显示，接种TMV12h和24h后，转lec-s基因烟草两个株系的叶片中PR-1a、GST1、Pa1和hsr515基因均显著上调表达，说明TMV侵染后转基因烟草叶部上述基因的mRNA快速积累，而在未转化烟草和转空载体烟草的叶部，TMV侵染并未造成PR-1a、GST1、Pa1和hsr515基因的上调表达。由此推断，lec-s基因编码的大豆凝集素表达可能是转基因烟草中PR-1a、GST1、Pal和hsr515基因上调表达所必需的。
[0078] 实施例7T1代转基因烟草对甜菜夜蛾的抗性鉴定
[0079] 参考Van de Veire等（1997）的方法，进行转基因烟草对甜菜夜蛾的抗性实验。做一个底面直径为9cm，高3cm的圆柱形塑料笼子。上面用纱布封好，防止幼虫爬出，同时可以透气。将烟草离体叶片放在笼子中，用棉花包住叶柄保湿。选用甜菜夜蛾2龄幼虫开始进行实验。每个笼子放3头幼虫，每个株系10个笼子。每天更换新鲜的叶片。每两天调查一次幼虫的死亡数和个体鲜重，直至幼虫化蛹。最后根据统计结果算出甜菜夜蛾的幼虫存活率、至化蛹所用的时间、化蛹率等。
[0080] 选取同一批次的甜菜夜蛾2龄幼虫，分别喂食野生型烟草、转空载体烟草及两个株系的转基因烟草，直至幼虫化蛹，整个周期持续平均约18天。
[0081] 统计结果表明，与喂食野生型烟草和转空载体烟草的幼虫相比，喂食转基因烟草株系T1-11的甜菜夜蛾幼虫在取食2天后（体重减少率为33.83%），以及喂食转基因烟草株系T1-20的甜菜夜蛾幼虫在取食4天后体重开始明显下降（体重减少率为17.34%），达到显著水平，且这种体重下降的情况一直持续到幼虫取食12天后（图11）。
[0082] 此外，与喂食野生型烟草和转空载体烟草的幼虫相比，喂食转基因烟草的甜菜夜蛾幼虫表现出生长发育的延迟，化蛹率也明显下降。喂食野生型烟草和转空载体烟草的幼虫在第15天开始化蛹，而喂食转基因烟草的幼虫化蛹推迟到第16天。到第18天时，喂食野生型烟草和转空载体烟草的幼虫化蛹率达到100%和96%，而取食转基因烟草的幼虫化蛹率分别降至60%（T1-11）和73%（T1-20）（图12）。
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