包含非-致病细菌的组合物及保护植物和动物宿主免于真菌、细菌和病毒疾病的方法
阅读：763发布：2022-05-27
专利汇可以提供包含非-致病细菌的组合物及保护植物和动物宿主免于真菌、细菌和病毒疾病的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 预防 和/或 治疗 由 真菌 、细菌和/或病毒病原体引起的 植物 或动物宿主物种的感染的方法，其中所述方法包括提供一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物，和将所述混合物给予所述宿主物种的步骤。本发明还涵盖包含非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物的组合物。，下面是包含非-致病细菌的组合物及保护植物和动物宿主免于真菌、细菌和病毒疾病的方法专利的具体信息内容。
1. 一种预防和/或治疗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的植物或动物宿主物种的感染的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a) 提供一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
b) 给予所述宿主物种步骤(a)的混合物。
2.一种预防和/或治疗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的植物或动物宿主物种的感染的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a) 分开提供：
(i) 包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
(ii) 包含一种或多种活化剂的组合物；和
b) 分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
3. 依据权利要求1或权利要求2的方法，其中非-致病细菌选自枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)和益生菌。
4.依据权利要求3的方法，其中非-致病细菌是物种枯草芽胞杆菌的细菌。
5. 依据权利要求4的方法，其中枯草芽胞杆菌的菌株是QST 713菌株。
6.依据权利要求4的方法，其中非-致病细菌是益生菌的一种或多种物种。
7. 依据权利要求5的方法，其中益生菌选自鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)、干酪乳杆菌(L. Casei)、植物乳杆菌(L. plantarum)、瑞士乳杆菌(L. helveticus) (嗜酸的)、长双歧杆菌(B. longum)、短双歧杆菌(B. breve)、乳酸片球菌(Pediococcus Acidilactici)、乳酸乳球菌(Lactocuccus latis)及其组合。
8.权利要求2的方法，其中要给予宿主物种的第一组合物是包含非-致病细菌的组合物。
9.权利要求2的方法，其中要给予宿主物种的第一组合物是包含一种或多种活化剂的组合物。
10.权利要求2的方法，其中包含非-致病细菌的组合物和包含一种或多种活化剂的组合物在大致相同的时间给予宿主物种。
11.依据前述权利要求的任一项的方法，其中一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
12.依据权利要求11的方法，其中一种或多种活化剂是能够抑制NO和/或TNF-α产生的物质。
13. 依据前述权利要求12的方法，其中所述活化剂各自具有少于1.5 mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于2.5 mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
14. 依据权利要求12的方法，其中所述活化剂各自具有少于0.1 mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.2 mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
15. 依据权利要求12的方法，其中所述活化剂各自具有少于0.05 mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.1 mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
16.依据前述权利要求的任一项的方法，其中一种或多种活化剂选自香紫苏醇、柚皮苷、香柏酮、甜菊糖苷和大麻二酚。
17. 依据前述权利要求的任一项的方法，其中一种或多种活化剂选自紫菀(aster tataricus)、香附子(cyperus rotundus)及其组合。
18.依据前述权利要求的任一项的方法，其中宿主物种为植物物种。
19.依据前述权利要求的任一项的方法，其中宿主物种为动物物种。
20.依据权利要求19的方法，其中动物物种为驯养的动物或农业动物。
21.依据权利要求19的方法，其中动物物种为具有农业重要性的昆虫物种，特别是蜜蜂。
22.依据权利要求18的方法，其中一种或多种非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合经叶片施用而给予植物。
23.依据权利要求18的方法，其中一种或多种非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合通过将这些物质加入到所述植物生长于其中的培养基中而给予植物。
24.依据权利要求23的方法，其中非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合以用这些物质涂覆的颗粒形式给予。
25.依据权利要求24的方法，其中所述颗粒还包含控释聚合物。
26.依据权利要求18的方法，其中非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合通过在播种植物物种的种子之前用这些物质涂覆所述种子来给予。
27.依据权利要求26的方法，其中涂覆的种子还包含控释聚合物。
28.一种包含非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物的组合物，其中所述一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
29. 依据权利要求28的组合物，其中所述活化剂各自具有少于1.5 mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于2.5 mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
30. 依据权利要求28的组合物，其中所述活化剂各自具有少于0.1 mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.2 mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
31. 依据权利要求28的组合物，其中所述活化剂各自具有少于0.05 mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.1 mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
32.依据权利要求28-31的任一项的组合物，其还包含一种或多种选自稳定剂、溶剂、螯合剂、乳化剂和控释剂的另外的试剂。
33.依据权利要求28-32的任一项的组合物，其中一种或多种活化剂选自香紫苏醇、柚皮苷、香柏酮、甜菊糖苷和大麻二酚。
34.依据权利要求28-33的任一项的组合物，其中非-致病细菌选自枯草芽胞杆菌和益生菌。
35.依据权利要求34的组合物，其中非-致病细菌是物种枯草芽胞杆菌的细菌。
36. 依据权利要求35的组合物，其中枯草芽胞杆菌的菌株是QST 713菌株。
37.依据权利要求34的组合物，其中非-致病细菌是益生菌的一种或多种物种。
38.依据权利要求37的组合物，其中益生菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌(嗜酸的)、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌及其组合。
39.一种包含一种或多种能够使枯草芽胞杆菌活化的试剂的混合物的组合物，所述试剂选自香紫苏醇、柚皮苷、香柏酮、甜菊糖苷和大麻二酚。
40. 一种增加具有农业或园艺重要性的植物的产量的方法，其通过以下方式实现：
a) 提供一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
b) 给予所述宿主物种步骤(a)的混合物。
41.一种增加具有农业或园艺重要性的植物的产量的方法，其通过以下方式实现：
a) 分开提供：
(i) 包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
(ii) 包含一种或多种活化剂的组合物；和
b) 分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
42. 一种增加得自具有农业重要性的动物的产物的产量的方法，其通过以下方式实现：
a) 提供一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
b) 给予所述宿主物种步骤(a)的混合物。
43.一种增加得自具有农业重要性的动物的产物的产量的方法，其通过以下方式实现：
a) 分开提供：
(i) 包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
(ii) 包含一种或多种活化剂的组合物；和
b) 分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
44. 一种提高植物或动物宿主物种抵抗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的损害的能力的方法，其包括以下步骤：
a) 提供非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
b) 给予植物或动物宿主物种步骤(a)的混合物。
45.一种提高植物或动物宿主物种抵抗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的损害的能力的方法，其包括以下步骤：
a) 分开提供：
(i) 包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
(ii) 包含一种或多种活化剂的组合物；和
b) 分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
46.依据权利要求40-45的任一项的方法，其中所述方法包括权利要求3-27的任一项的技术特征。
包含非-致病细菌的组合物及保护植物和动物宿主免于真菌、
细菌和病毒疾病的方法
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 非-致病性土传细菌在保护具有农业和园艺重要性的植物和其他宿主物种免于细菌和真菌攻击中的用途是本领域众所周知的。在这样的系统中所用的非-致病细菌物种的一个例子是枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)。
[0004] 有若干现有技术出版物描述了包含枯草芽胞杆菌的杀真菌和杀细菌产品，以及这样的产品在保护农业上重要的植物免于微生物疾病中的用途。然而，这些产品大部分具有低水平的活性，因而主要用作增加常规化学剂的活性的辅助剂。此外，文献还描述了此类产品作为保护有机栽培植物(即在不允许使用更强的化学剂的情况下)的唯一试剂的用途。
[0005] 因此，尽管使用枯草芽胞杆菌对微生物害虫的生物控制的应用因为其对宿主细胞的低毒性而是非常有利的，但其相对低水平的活性阻止了这种方法在农业和园艺中在较大的商业规模上被更广泛地采用。
[0006] 因此，对于保护商业-重要的植物和动物物种的组合物和方法存在未满足的需求，所述组合物和方法将基于非-致病细菌如枯草芽胞杆菌的使用的系统的低宿主毒性与在提高宿主物种抵抗微生物攻击的能力方面的有效性大大增加组合。
[0007] 本发明满足了这种需求。
[0008] 发明简述
[0009] 本发明主要涉及提高植物或动物宿主物种抵抗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的损害的能力的方法。以其最一般的形式，该方法包括以下步骤：
[0010] a)提供非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
[0011] b)给予植物或动物宿主物种步骤(a)的混合物。
[0012] 在某些情况下，在以上步骤(a)提及的两种组分(即非-致病细菌和活化剂)可分开给予。因此，在这样的情况下，用于提高植物或动物宿主物种抵抗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的损害的能力的方法包括以下步骤：
[0013] a)分开提供：
[0014] (i)包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
[0015] (ii)包含一种或多种活化剂的组合物；和
[0016] b)分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
[0017] 不希望受到理论的束缚，要注意到采用本发明的方法和组合物所观察到的保护作用可能是由于直接的抗微生物活性，宿主物种对微生物感染的抵抗力的提高(例如通过提高宿主免疫反应)，或是由于两种机制的组合。因此，上述短语“抵抗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的损害的能力”应根据在微生物病原体的存在下提高的存活力、宿主物种的大小和健康状况(并且视情况而定，农业或园艺产品产量增加)来理解，而不管涉及这些参数的提高的实际机制。类似地，术语“由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的损害”应被理解为对宿主物种的任何有害作用，所述有害作用直接或间接地与所述宿主物种的细胞或组织内的或极为接近所述宿主物种的微生物病原体的存在有关。这些有害作用包括(但不限于)对宿主物种的生长、大小或繁殖能力的干扰，对宿主物种的一个或多个器官的致命和非致命损伤，降低由宿主物种产生的具有农业重要性的产品(例如水果、蔬菜、豆类、乳、蜂蜜等)的产量。
[0018] 在本发明的上下文中，术语“活化剂”被用来表示一种物质，当其以与非-致病细菌一起的混合物存在时，或当分开递送时，能够提高所述非-致病细菌细胞对经处理的植物或动物宿主物种的有益作用。在某些情况下，这种提高可以是非-致病细菌和活化剂之间的协同相互作用的结果。可供选择地，活化剂和非-致病细菌在单独使用时，各自可能缺乏对宿主的任何显著的有益作用，但当两类物质一起或连续施用时，可在宿主物种中导致显著的抗-微生物、免疫刺激和/或其他有益作用。
[0019] 本发明人意外地发现，适用于本发明方法的许多活化剂享有共同的特征，即它们抑制炎性介质的能力，所述炎性介质更通常与高级动物物种相关(例如肿瘤坏死因子α[TNF-α])，而不是与植物物种相关。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
[0020] 在一个方面，本发明涉及预防和/或治疗由真菌、细菌和/或病毒病原体引起的植物或动物宿主物种的感染的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0021] a)提供非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
[0022] b)给予所述宿主物种步骤(a)的混合物。
[0023] 在本发明的该方面的一个备选实施方案中，非-致病细菌和活化剂可如上文解释的那样分开给予。
[0024] 在进一步的方面，本发明还涉及一种增加具有农业或园艺重要性的植物的产量或得自具有农业重要性的动物的产品(例如乳或蜂蜜)的产量的方法，其通过以下方式实现：
[0025] a)提供非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
[0026] b)给予所述宿主物种步骤(a)的混合物。
[0027] 在本发明的该方面的一个备选实施方案中，非-致病细菌和活化剂可如上文解释的那样分开给予。
[0028] 本文上面已公开，在本发明的各种方法的一些实施中，非-致病细菌和活化剂可分开给予，即一个接一个地给予。在这样的实施中，要给予的第一组合物可以是包含非-致病细菌的组合物或包含一种或多种活化剂的组合物。在其中非-致病细菌和活化剂分开给予的类型的某些其他实施方案中，它们二者在大致相同的时间给予宿主物种。
[0029] 在另一方面，本发明还提供一种包含非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物的组合物，其中所述一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质，如将在下文进一步详细讨论的。
[0030] 非-致病细菌的许多不同的物种和菌株可与本文描述的活化剂组合使用(或者作为选择，可以分开和依序给予)。术语“非-致病的”在本文中用于指所选的物种对给予本发明的含有细菌的组合物的宿主物种没有或仅有极小的毒性或其他有害作用。
[0031] 在本文限定的方法和组合物的一个优选实施方案中，非-致病细菌选自枯草芽胞杆菌和益生菌。
[0032] 在一个优选实施方案中，非-致病细菌物种是枯草芽胞杆菌。该物种的几个不同的菌株可被采用。然而，在一个高度优选的实施方案中，所用的菌株是QST 713。
[0033] 在另一个优选实施方案中，非-致病细菌选自益生菌的一个或多个物种。要注意到，在这一点上，用于本发明目的的术语“益生菌”应被理解为指活的微生物，其被认为在消费或以其他方式给予预定宿主时提供健康益处。许多这样的益生菌是已知的，它们中的许多是双歧杆菌属(Bifidobacterium)的物种(如长双歧杆菌(B.longum)和短双歧杆菌(B.breve))或乳杆菌属(Lactobacillus)的物种(如鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.Casei)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)等)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和方法中所用的益生菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌(L.plantarum)、瑞士乳杆菌(嗜酸的)、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳酸片球菌(Pediococcus Acidilactici)、乳酸乳球菌(Lactocuccus latis)及其组合。
[0034] 本发明的其他实施方案和优点随着描述的进展将变得显而易见。
[0036] 图1图形显示了对于其作为枯草芽胞杆菌的活化剂用于增强抗细菌和抗真菌作用的潜在用途，来自植物化学物的初步筛选的结果。
[0037] 图2表示3或4种不同活化剂组合的组合的枯草芽胞杆菌活化作用和含有这些组合与枯草芽胞杆菌一起的组合物的杀真菌和杀细菌活性的结果。
[0038] 图3表示与图2中呈现的那些类似的调查结果，除了使用不同浓度的活化剂之外。
[0039] 图4表示了使用类似于用来生成图1中所示结果的那些的组合物的杀真菌和杀细菌活性的结果，除了使用枯草芽胞杆菌的不同制剂外。
[0040] 图5表示了使用类似于用来生成图5的结果的那些的组合物获得的杀真菌和杀细菌结果，除了使用不同浓度的活化剂之外。
[0041] 图6呈现了显示两种植物-紫菀(Aster tataricus)和香附子(Cyperus rotundus)的提取物与枯草芽胞杆菌的组合的杀真菌和杀细菌作用的结果。
[0043] 图8显示用活化剂和枯草芽胞杆菌的不同组合接种黄瓜幼苗能够保护黄瓜植物避免真菌和细菌感染。
[0044] 图9呈现了显示用活化剂和枯草芽胞杆菌的不同组合接种番茄幼苗能够保护番茄植物避免微生物感染的结果。
[0045] 图10呈现了显示被番茄花叶病毒感染的番茄植物在用本发明的组合物处理后存活力增加的结果。
[0046] 图11显示在用本发明的组合物接种胡椒植物幼苗后，所述组合物在胡椒植物中对抗微生物感染的保护作用。
[0047] 图12显示在用本发明的组合物接种后，所述组合物在玉米中对抗微生物感染的保护作用。
[0048] 图13呈现了显示在用本发明的组合物接种幼苗后，所述组合物在小麦中对抗微生物感染的保护作用的结果。
[0049] 图14显示在用本发明的组合物接种稻苗后，所述组合物在水稻植物中对抗微生物感染的保护作用。
[0050] 图15表示在用本发明的组合物处理后，显示在鹰嘴豆植物中对抗微生物感染的保护作用的现场研究结果。
[0051] 图16呈现了显示在用本发明的组合物处理后，表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)(一种对人类龋齿发展具有重要意义的细菌物种)被几乎完全消除的体外结果。
[0052] 图17呈现了显示在用本发明的组合物处理后，乳杆菌(Lactobacilli)(一种对人类龋齿发展具有重要意义的物种)被几乎完全消除的体外结果。
[0053] 图18是显示在用韧皮杆菌(Candidatus liberibacter)感染后，本发明的组合物对生长中的胡萝卜和胡萝卜植物叶的影响的现场研究中所用的将田间划分为不同的处理组的试验图。
[0054] 图19图表描述了本发明的组合物在减少具有由韧皮杆菌引起的叶子病变的胡萝卜植物的百分率中的有益效果。
[0055] 图20图表描述了本发明的组合物在减少具有由韧皮杆菌引起的损害的胡萝卜的平均数量中的有益效果。
[0057] 图22呈现了显示与未经处理的对照比较，在用本发明的组合物处理蜜蜂后，蜂箱中存在的蜜蜂成虫数量增加的数据。
[0058] 优选实施方案的详细描述
[0059] 如在上文解释的，本发明人意外地发现，适用于本发明方法的许多活化剂(与非-致病细菌如枯草芽胞杆菌或益生物种组合)共有抑制炎性介质的能力，所述炎性介质更通常与高级动物物种相关(例如肿瘤坏死因子α[TNF-α])。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
[0060] 如所提及的，本发明人已发现，与本发明的活化剂相关的上述抗炎活性至少部分地受一种或多种关键的炎性介质如TNF-α和/或氧化氮(NO)的抑制作用的介导。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，上述方法中所用的一种或多种活化剂是能够抑制NO和/或TNF-α的产生的物质。
[0061] 在本发明的一个更优选的实施方案中，活化剂各自具有少于1.5mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于2.5mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
[0062] 在另一个优选的实施方案中，各个单独的活化剂(无论是单独使用或与其他这样的活化剂组合使用)具有少于0.1mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.2mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
[0063] 在又一个更优选的实施方案中，各个单独的活化剂(无论是单独使用或与其他这样的活化剂组合使用)具有少于0.05mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.1mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
[0064] 应注意到，使用IC50值(即造成介质、激动剂或其他生物活性分子的最大抑制的50％的试剂浓度)作为比较拮抗剂和其他生物学和药理学活性分子的效力的手段，是本领域所有技术人员熟知的。简言之，IC50值可通过对参数如特定炎性介质的抑制作用绘制剂量-反应曲线，并从所述曲线提取所述值而获得。
[0065] 在另一个优选的实施方案中，活化剂选自香紫苏醇(Sclareol)、柚皮苷(Naringin)、香柏酮(Nootkatone)、甜菊糖苷(Steviol glycoside)和大麻二酚(cannabidiol)及其组合。
[0066] 在更进一步优选的实施方案中，活化剂(包括具有以上公开的定性和定量抗炎特性的那些)来源于植物材料(例如植物粗提取物，如全植物水性提取物，部分纯化或分级分离的提取物，纯化的提取物和所述提取物中存在的活性分子的合成类似物)。
[0067] 在本发明这一方面的一个优选的实施方案中，源自植物的活化剂是选自紫菀(Aster tataricus)和香附子(Cyperus rotundus)及其组合的草药提取物。
[0068] 在一个优选的实施方案中，宿主物种是植物物种，包括(但不限于)蔬菜、豆类、谷粒、热带物种(如香蕉)、亚热带物种(如柑橘类水果)、其他树和灌木、具有园艺重要性的开花植物等。
[0069] 在另一个优选的实施方案中，宿主物种是动物物种，特别是有农业重要性的昆虫物种，例如各种蜜蜂，包括但不限于蜜蜂(Apismellifera.L)。在另一个优选的实施方案中，经处理的动物物种是哺乳动物，包括人类受试者和非人类物种。关于后者，许多驯养的动物，或有农业重要性的动物可用本发明的组合物和方法处理。在一个优选的实施方案中，要处理的哺乳动物受试者是牛或羊。
[0070] 在一个优选的实施方案中，非-致病细菌物种是枯草芽胞杆菌。
[0071] 虽然枯草芽胞杆菌的许多不同的菌株可被用来执行本发明的方法，在一个优选的实施方案中，所用的菌株是QST 713菌株。该菌株可以以各种不同的制剂，包括ASO和 经商业途径获得。
[0072] 在另一个优选的实施方案中，非-致病细菌选自益生菌的一种或多种物种。如上文所解释的，益生菌的许多不同的物种(包括，但不限于乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的物种)可被用来执行本发明的方法。
[0073] 在一些实施方案中，1-5种上述活化剂被用来制备用于该方法的步骤(a)中的混合物。在一个优选的实施方案中，使用全部5种所述活化剂。
[0074] 在另一个特别优选的实施方案中，5种活化剂以以下百分比范围存在于该混合物中。
[0075]
[0076] 优选地，枯草芽胞杆菌细胞和活化剂在该混合物中的百分比组成如下：
[0077] 枯草芽胞杆菌(Serenade)0.1％-10％(更优选0.5％-5％)
[0078] 活化剂0.01％-10％(更优选0.05％-5％)
[0079] 在其中宿主物种是植物的本文公开和要求的方法的实施方案中，使步骤(a)的混合物与宿主有机体接触的许多不同手段可用于所述方法的步骤(b)。这些手段包括(但不限于)：灌溉施肥(fertigation)、喷洒、乳化、控释膜或基质，及其组合。
[0080] 在一些优选的实施方案中，一种或多种非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合经叶片施用而给予植物。这可例如通过使用常规方法喷射这些物质而实现。
[0081] 在其他优选的实施方案中，一种或多种非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合通过将这些物质加入到所述植物生长于其中的培养基中而给予植物。这可通过制备颗粒或其他物质(如吸收纤维、球团、珠粒等)而实现，所述颗粒或其他物质已用非-致病细菌和/或活化剂涂覆，或者作为选择，通过沉浸在其中或通过任何其他方式使这些物质被吸收到其内部结构中。在一个特别优选的实施方案中，所用的传递形式包含已用要传递的物质涂覆的颗粒(如珍珠岩颗粒(Perlite granules))。一般来说(但不限于)，这些颗粒还可包含控释聚合物，其通常作为颗粒表面的外涂层存在。
[0082] 在一个更优选的实施方案中，非-致病细菌、一种或多种活化剂和/或其组合通过在播种所述种子之前，用这些物质涂覆植物物种的种子给予。这样的涂覆的种子还可包含一种或多种控释聚合物，通常为(但不限于)外涂层的形式。
[0083] 在一些实施方案中，本发明的方法包括分开给予非-致病细菌和活化剂。这样的分开给予也可通过用于所述非-致病细菌和本文描述的活化剂的任何给予途径实现。
[0084] 在一些实施方案中，步骤(a)的混合物以一种连续的方式(例如在数小时和约180天之间)给予要处理的宿主有机体。
[0085] 当采用乳化方法时，处理期一般为数小时，第二次处理可在约10天后施用。
[0086] 当采用控释膜或基质时，处理将花费约180天。控释基质可具有几种不同的类型。在一个优选的实施方案中，这种基质形成为颗粒，如本技术领域技术人员熟知的珍珠岩颗粒。用于控释基质的其他选项包括各种具有吸水能力在相对于其干燥重量1:15以上的球团、珠粒、微珠、纤维。为实现所需的控释特性，可用蜡、乙基纤维素(Ethocel)、其他控释聚合物(如农业、杀虫和药学领域所熟知的)和植物油涂覆基质。
[0087] 在采用本发明的方法处理动物的情况下，本发明的组合物可以凝胶或霜剂的形式配制以供局部使用。或者，可配制该组合物以使它能被加入到已按照每日基础给予动物的固体或液体饲料中。最后，打算口服或胃肠外给予动物宿主物种的其他剂型将是本领域技术人员熟知的，并且全部包括在本发明的范围内。
[0088] 本发明也提供包含非-致病细菌和一种或多种活化剂的组合物，其中所述一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。优选地，这样的抗炎药能够抑制抗炎介质氧化氮(NO)和/或TNF-α的产生或释放。
[0089] 在一个优选的实施方案中，所述活化剂各自具有少于1.5mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于2.5mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
[0090] 在另一个优选的实施方案中，所述活化剂各自具有少于0.1mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.2mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
[0091] 在一个更优选的实施方案中，所述活化剂各自具有少于0.05mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或少于0.1mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
[0092] 在这个方面的一个优选的实施方案中，本发明涉及一种植物-保护或动物-保护组合物，其包含枯草芽胞杆菌和一种或多种活化剂的混合物，所述活化剂选自香紫苏醇、柚皮苷、香柏酮、甜菊糖苷和大麻二酚。
[0093] 在一个优选的实施方案中，任何以上公开的组合物还可包含一种或多种另外的组分，包括渗透剂、稳定剂、溶剂、螯合剂、乳化剂和控释(如缓释)剂。
[0094] 合适的渗透剂的例子有极性非质子溶剂DMSO、DMSO-6、二甲基甲酰胺(DUF)。
[0095] 合适的非离子表面活性剂的例子包括Triton X-100、Tergitol 15-S-3、15-S-5、15-S-7。
[0097] 乳化剂的例子包括polyaldo 10-6-O、E-471、E-475和E-476。
[0098] 控释剂的例子包括包含二环戊二烯和亚麻油或大豆油醇酸(soy bean oil alkyd)的涂料(如以注册商标 售出而经商业获得的涂料组合物，或由ICI,Specialty Fertilizers,Israel分销的，及在US 4,657,576中公开的涂料组合物)，以及可从Sekisui Specialty Chemicals,Japan获得的聚合物E603。
[0099] 当然，给出以上列出的另外的组分仅仅是为了举例说明的缘故，而许多其他不同的添加剂和赋形剂也可包括在本文公开的组合物中。
[0100] 应注意到在本发明的一些优选的实施方案中，活化剂的混合物包括亲水性和疏水性两类物质。结果，在许多情况下，制备作为以下两种独立组分的乳化混合物的组合物是必要的：含有多种可溶于水中的水溶性试剂的水性部分和含有可溶于脂肪酸、中链甘油三酯、乙醇、其他溶剂及其组合中的较少水溶性的试剂的疏水性部分。
[0101] 在本发明上文公开的组合物的一个优选实施方案中，非-致病细菌选自枯草芽胞杆菌和益生菌。
[0102] 在一个高度优选的实施方案中，非-致病细菌是物种枯草芽胞杆菌的细菌。虽然在一个优选的实施方案中，可使用这类物种的许多不同菌株，组合物包含QST 713菌株。
[0103] 在另一个高度优选的实施方案中，组合物中的非-致病细菌是益生菌的一种或多种物种。在该实施方案的一个实施中，益生菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌(嗜酸的)、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌及其组合。
[0104] 在进一步的方面，本发明还提供能够使枯草芽胞杆菌活化的试剂混合物，其选自：香紫苏醇、柚皮苷、香柏酮、甜菊糖苷和大麻二酚，及其组合。
[0105] 本发明的方法和组合物的进一步的优点是，非-致病细菌(例如枯草芽胞杆菌和益生菌)和活化剂的混合物可能对其处理过的植物的活力有正面的影响，特别是在种子发育的早期阶段。因此，在另一方面，本发明涉及一种增加具有农业或园艺重要性的植物产量的方法，其通过以下方式实现：
[0106] a)提供一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物；和
[0107] b)给予所述宿主物种步骤(a)的混合物。
[0108] 在这一方面的另一个实施方案中，本发明还提供一种增加具有农业或园艺重要性的植物产量的方法，其通过以下方式实现：
[0109] a)分开提供：
[0110] (i)包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
[0111] (ii)包含一种或多种活化剂的组合物；和
[0112] b)分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
[0113] 类似地，本发明还涵盖一种增加得自具有农业重要性的动物的产品(例如：乳、蜂蜜等)产量的方法，其通过以下方式实现：
[0114] a)分开提供：
[0115] (i)包含一种或多种非-致病细菌的组合物；和
[0116] (ii)包含一种或多种活化剂的组合物；和
[0117] b)分开给予所述宿主物种组合物(i)和(ii)的每一种。
[0118] 在该方法的变化中(如上文有关本发明的其他方法中所公开的)，非-致病细菌和包含一种或多种活化剂的组合物可分开给予所述宿主物种。
[0119] 以上定义的增加农业产品的产量和提高植物或宿主物种抵抗微生物引起的损害的能力的方法，可各自包括上文结合用于预防和/或治疗植物或动物宿主物种由微生物病原体所致感染的方法所公开和描述的任何技术特征。
[0120] 在另一方面，本发明涉及一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物，其用于预防和/或治疗由真菌、细菌和/或病毒病原体在动物物种中引起的感染。
[0121] 在另一方面，本发明还涉及一种或多种非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物在治疗和/或预防由真菌、细菌和/或病毒病原体在植物或动物宿主物种中引起的感染中的用途。
[0122] 上文结合各种治疗方法所公开和描述的所有技术特征，同样适合于上文刚刚公开的非-致病细菌和一种或多种活化剂的混合物的应用。
[0123] 本发明现在将参考以下非限制性工作实施例和附图进一步说明。实施例
[0124] 材料和方法
[0125] 1.非-致病细菌
[0126] a)枯草芽胞杆菌
[0127] 为了本文如实施例1-18报告的研究的目的，使用可商业获得的QST 713菌株。该菌株可以两种不同的制剂从Bayer Corporation获得：1) ASO和2) 在下面提出的大多数工作实施例中， ASO被用作枯草芽胞杆菌的来源。然而，在实施例3-11中，使用 代替
[0128] b)益生菌
[0129] 为了本文如实施例19和20报告的研究的目的，使用可商业获得的称为’Jarro Dophilus’的益生菌混合物制备本发明的组合物。这种益生菌混合物的更多细节见此后的实施例19。
[0130] 2.活化剂
[0131] 在初步筛选大量的候选物分子后，以下植物化学物被选择用作本研究的第一部分中的活化剂：
[0132] 1.香紫苏醇–从南欧丹参(Salvia sclarea)提取的二萜烯醇
[0133]
[0134] 2.柚皮苷–从葡萄柚皮提取的黄烷酮-7-O-糖苷
[0135]
[0136] 3.香柏酮-倍半萜烯–从橘子皮提取
[0137]
[0138] 4.甜菊糖苷-从甜菊(Stevia rebaudiana)提取
[0139]
[0140] 5.CBD-大麻二酚-从大麻提取
[0141]
[0142] 在这些作为枯草芽胞杆菌活化剂的5种或更少的物质的组合的初步试验后，还调查额外的草药材料的功效，如下文在实施例4和5中描述的。
[0143] 实施例1
[0144] 植物化学物作为枯草芽胞杆菌的活化剂的潜在用途的初步筛选
[0145] 导言：
[0146] 黄瓜(Cucumis sativus L)幼苗在发芽过程中非常容易受到真菌和细菌病原体的幼苗的攻击，因而被选择作为筛选和检查枯草芽胞杆菌和可使其活化的植物化学物的一种模式植物。
[0147] 材料和方法
[0148] 1.植物化学物筛选
[0149] 将潜在的植物化学物加入到在陪替氏培养皿(Petri dish)中的30cc葡萄糖50％V/V底物、10cc真菌病原体合剂(cocktail)和10cc细菌病原体合剂的混合物中。真菌合剂含有：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia salani)、腐霉属(Pythium spp.)和用于番茄发酵的非-致病真菌。细菌合剂含有：番茄致病性细菌(Clavibacter michiganensis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和用于番茄发酵的非-致病细菌。
[0150] 通过计算每次试验的菌落形成指数(colony forming index)(0＝无菌落；5＝最大菌落大小)，对大约1000个潜在植物化学物活化枯草芽胞杆菌的能力进行筛选。从大约1000个根据其卓越性能测试的植物化学物选择以上在导言到实施例部分中列出的5个植物化学物作为枯草芽胞杆菌活化剂。
[0151] 对下文报告研究中所用的每个宿主有机体测定以上列出的5个经选择的活化剂的最佳组合和浓度。选择的组合是在初步研究中发现具有能够产生所需保护作用的最低可能浓度的那些组合。这样，就避免了在给予这些试剂至宿主有机体期间的可能的副作用和环境污染。
[0152] 同时，对植物化学物消除细菌和真菌病原体的混合物的能力进行了筛选。为了比较各种处理之间的目的，计算出真菌和细菌消除指数(0＝最大消除；5＝无消除)。
[0153] 试验混合物(含有葡萄糖底物及以上提及的真菌和细菌混合物与所有5种活化植物化学物和渗透剂(DMSO)和溶剂(Triton)一起)以4个不同的浓度使用：1、2、3和4。在每种情况下，将相同量的葡萄糖底物和真菌和细菌混合物-30ml-加入到该化合物中。类似地，DMSO(0.5％v/v)和Triton(0.02％v/v)的浓度在所有混合物中都是相同的。然而，枯草芽胞杆菌的浓度和5种活化剂各自的浓度(以v/v％给出)在每种试验化合物中是不同的，如在表I中描述的：
[0154] 表I
[0155] 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4
枯草芽胞杆菌 0.25％ 0.5％ 0.75％ 1.0％
香紫苏醇98％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
柚皮苷98％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
香柏酮98％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
甜菊糖苷 0.25％ 0.5％ 0.75％ 1.0％
CBD3％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
枯草芽胞杆菌 0.25％ 0.5％ 0.75％ 1.0％
香紫苏醇98％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
柚皮苷98％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
香柏酮98％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
甜菊糖苷 0.25％ 0.5％ 0.75％ 1.0％
CBD3％ 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
[0156] 根据在下表II中给出的处理列表，在该研究中使用各种不同的试验化合物(含有某些或全部5种活化剂的不同组合)。在每种情况下，活化剂、枯草芽胞杆菌和底物以在表I中指定的浓度使用。例如，当以浓度1测试时，香紫苏醇在含有活化剂的试验化合物中的浓度是0.1％，而当以浓度2测试时，香紫苏醇以0.2％的浓度存在，等等。
[0157] 表II
[0158]
[0159] 结果
[0160] 初步研究表明，使用具有浓度2和浓度3的试验混合物(见上表I)，获得最佳的抗-真菌和抗-细菌活性。因为使用浓度3时，枯草芽胞杆菌菌落发育是最佳的，这是选择用于研究成果的浓度。对于浓度3试验的真菌消除、细菌消除和枯草芽胞杆菌活化(菌落大小)获得的结果分别图解概括于图1中的图的前排、中排和后排。上表II概括的11个不同的处理沿着该图的X轴标记为T1-T11。
[0161] 如上文所解释的，用来评估抗-真菌、抗-细菌和活化特性的3个半定量指数如下：
[0162] 真菌指数：0(无发育)至5(最大发育)
[0163] 细菌指数：0(无发育)至5(最大发育)
[0164] 枯草芽胞杆菌(B.s.)指数(菌落形成指数)：0(无发育)至5(最大发育)[0165] 从图1可以看出，最好的结果-枯草芽胞杆菌活化和病原体消除采用处理11获得，其(如上表II中所示)使用全部5种活化剂的组合。
[0166] 额外实验(其中测试了16种不同试剂的混合物)的结果如在下表中所示：
[0167] 表IIa
[0168]
[0169] 使用混合物12-16获得的结果将于特殊意义：这些混合物不含枯草芽胞杆菌，并且它们在该试验系统中完全缺乏对抗致病细菌的活性，表明活化剂单独(包括即使全部5种活化剂的混合物-表IIa中的试验混合物12)是无活性的。因此，活化剂和枯草芽胞杆菌二者(或者另一种非-致病细菌物种)的存在是需要的，以获得所需的抗微生物作用。应进一步注意到，这种特殊的作用-活化剂单独(即不存在枯草芽胞杆菌或其他非-致病细菌)活性的缺乏-在下文报告的所有研究(数据未示出)中被发现。
[0170] 实施例2
[0171] 改变活化剂组成对枯草芽胞杆菌活化和所述组合物的杀真菌和杀细菌活性的影响
[0172] 第二组研究旨在调查从全部5种组分的组合或选择性改变该化合物中的一种或两种组分的浓度消除一种植物化学物的作用。
[0173] 材料和方法
[0174] 如同实施例1。
[0175] 使用或者浓度3或者浓度4的各种试验混合物(如在上面的实施例1中限定的)。这些试验混合物的每一种的组成在下面两个表格中概括：
[0176] 表III
[0177] 浓度3
[0178]
[0179] *在试验8中，香柏酮和甜菊糖苷各自以升高的浓度存在-0.4％v/v香柏酮(而不是0.3％)和1.0％甜菊糖苷(而不是0.75％)
[0180] 表IV
[0181] 浓度4
[0182]
[0183] *在试验7中，柚皮苷以减少的浓度存在-0.3％v/v香柏酮(而不是0.4％)[0184] 结果：
[0185] 如可在图2中见到的，含3或4种活化剂(以浓度3使用)的所有试验混合物导致真菌和细菌指数的显著减少(分别为上图和中图)和枯草芽胞杆菌活化指数的显著增加(下图)，当与仅用介质和介质加枯草芽胞杆菌对照(分别为混合物1和2)比较时。
[0186] 类似地，如在图3中所示，含3或4种活化剂(以浓度4使用)的所有试验混合物导致真菌和细菌指数的显著减少(分别为上图和中图)和枯草芽胞杆菌活化指数的显著增加(下图)，当与仅用介质和介质加枯草芽胞杆菌对照(分别为混合物1和2)比较时。
[0187] 还在图2中观察到，5-组分活化剂混合物(其中香柏酮和甜菊糖苷组分都以高浓度存在(即试验混合物4)，而所有其他组分以浓度3存在；即试验混合物8)在所有3种指数上都具有最大的活性。
[0188] 此外，图3显示4-组分活化剂混合物(编号7)，其中柚皮苷浓度减少至浓度3，而所有其他组分为浓度4，在这个数据集中具有最大的活性，如用全部3种指数测量的。
[0189] 这些数据表明，含有少于最大5种活化剂的混合物可被用来保护宿主有机体防止真菌或细菌攻击。此外，这些结果也表明，混合物的最优化可通过控制混合物中一种或多种独立的活化剂的浓度而获得。
[0190] 实施例3
[0191] 各种活化剂组合物与不同的枯草芽胞杆菌制剂组合的杀真菌和杀细菌活性[0192] 在该研究中，使用不同的枯草芽胞杆菌制剂重复在以上实施例2中进行的实验。
[0193] 材料和方法
[0194] 如同对于实施例1。
[0195] 使用浓度3或浓度4的各种试验混合物(如在以上实施例1中定义的)。这些试验混合物的每一个组成概括于上文的实施例2的表III和IV中。
[0196] 结果：
[0197] 这个研究证实实施例2获得的结果。因此，如在图4(浓度3)和图5(浓度4)中所见到的，含有浓度3的3、4或5种活化剂的所有试验混合物导致真菌和细菌指数的显著减少(分别为上图和中图)。此外，它们也导致枯草芽胞杆菌活化指数的显著增加(下图)。
[0198] 特别注意的是这样的事实，即(如在使用 制剂的实施例2报告的研究的情况下)，在浓度3时，5-组分活化剂混合物(其中香柏酮和甜菊糖苷组分都以高浓度存在(即浓度4)，而所有其他组分以浓度3存在；即试验混合物8)在所有3种指数上都具有最大的活性(图4)。类似地，如在图5中所示，4-组分活化剂混合物(编号7)，其中柚皮苷浓度减少至浓度3，而所有其他组分为浓度4，在这个数据集中具有最大的活性，如用全部3种指数测量的。
[0199] 用 枯草芽胞杆菌制剂获得的这些数据证实用 制剂获得的结果(上文实施例2)，表明观察到的作用并非是对任何一种特定的枯草芽胞杆菌制剂都有特异性的。
[0200] 实施例4
[0201] 本发明所用的试剂的抗炎活性
[0202] 按照用枯草芽胞杆菌与在上文实施例1-3中报告的5种活化剂的一些或全部组合获得的结果，除了它们的杀细菌、杀真菌和枯草芽胞杆菌-活化能力外，还调查了所述试剂以寻找共同的功能特性。
[0203] 在一系列初步调查后，本发明人意外地发现，在上文提出的研究中测试的5种活化剂的每一种，还共享高效的抗炎活性。
[0204] 为了进一步研究这一点，对前述实施例中所用的3种活化剂-独立地，彼此组合和与枯草芽胞杆菌组合，抑制两种主要炎性介质：氧化氮(NO)和TNF-α的培养巨噬细胞系中的体外产生的能力进行了测试。另外，在执行抗炎分析时，以对应于NO和TNF-α抑制作用的合适IC50值测定巨噬细胞的生存能力。
[0205] 方法：
[0206] RAW 264.7巨噬细胞系：
[0207] RAW 264.7巨噬细胞在采用标准生长培养基(补充有5％FBS、抗生素和谷氨酰胺的DMEM)的平底烧瓶中生长。按照本领域熟知的标准程序维持细胞。细胞达到汇合后，使用机械装置将它们从烧瓶中移去，然后通过离心浓缩，再悬浮于小体积的新鲜培养基中。用生长培养基调节细胞浓度，以使75,000个细胞可被加入到96-孔板的各孔中。25μg/ml LPS和10U/ml IFN-γDMEM的组合被用于活化巨噬细胞。在活化前1小时，将各种试验试剂加入到各孔中。然后培养细胞另外24小时，然后测定炎性介质产生和细胞生存能力。
[0208] 细胞生存能力的测定：
[0209] 通过向各孔中加入100μL的10％阿拉玛蓝溶液(Alamar Blue solution)并于37℃培养1-2小时，进行生存能力的阿拉玛蓝测定法(AlamarBlue assay)。测定荧光(于545nm激发并在595nm发射)并表示为未处理对照细胞的值的百分率。
[0210] 通过Griess测定法测定氧化氮产生：
[0211] 使用Griess试剂(等体积的1％对氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)和0.1％萘亚甲基二胺(napthyethylene-diamine)的5％HCl溶液)，测定经历各种处理的巨噬细胞的NO产生。将得自各个试验孔的70μL上清液转移至新鲜的96-孔板中，与70μL Griess试剂混合，在540nm测量产生的紫色。
[0212] 用ELISA测定TNF-α：
[0213] 采用夹心ELISA测定TNF-α浓度。使用在PBS中的0.5μg/ml浓度的原始抗体。在稀释液中从0至1000pg/ml的TNF-α标准品(0.05％吐温-20,0.1％BSA在PBS中)的序列稀释液被用作内部标准。用生物素化的二次抗体和与TMB缀合的抗生物素蛋白(avidin)过氧化物酶缀合物作为检测试剂检测TNF-α。在655nm监测彩色显影，每过5分钟后取得读数。25分钟后，使用0.5M硫酸停止反应，测定450nm的吸光度。
[0214] 试验试剂：
[0215] 采用上述方法测定香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷，以及它们彼此的组合和与枯草芽胞杆菌的组合对NO和TNF-α产生，及对细胞生存能力的影响。抗炎活性的结果在下表V中作为NO和TNF-α产生的抑制作用的IC50值，与细胞生存能力结果一起呈现。此外，从科学文献(A.S.Ravipati et al.(2012)BMC补充和替代医学(BMC Complementary and Alternative Medicine),12:173“选择的中药材的抗氧化和抗炎活性及其与抗氧化剂含量的关系(Antioxidant and anti-inflammatory activities of selected Chinese medicinal plants and their relation with antioxidant content)”获得的两种另外的植物物种-紫菀(Aster tataricus)和香附子(Cyperus rotundus)-的比较结果存在于表的末端。本发明人研究了这两个物种的提取物与枯草芽胞杆菌的组合的杀真菌和杀细菌作用。这些研究的结果在下文实施例5中提出。
[0216] 结果：
[0217] 用各种试剂处理的培养巨噬细胞的抗炎和生存能力测定所获得的结果在下表V中呈现。
[0218] 表V
[0219]
[0220] 可以发现，测试的处理试剂均对巨噬细胞的生存能力没有任何显著的不利作用。因此，由这些试剂引起的两种炎性介质产生的任何抑制作用不是一般细胞毒性作用的结果。
[0221] 从表中注意到，当分开采取时，3种活化剂香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的NO抑制的IC50分别是0.04、0.04和0.02。而且，当彼此组合时，所述组合甚至是更有效的，在枯草芽胞杆菌的不存在下，对NO抑制的IC50是0.004，而在枯草芽胞杆菌的存在下为0.001。如果这些结果与先前提及的A.S.Ravipati et al.(2012)的论文对44种已选植物提取物公开的NO抑制的相当的IC50值进行比较，可发现香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的值是在所述论文中值的范围(0.03-1.49)的下端，在一种情况下(甜菊糖苷)甚至超出该范围最低程度。类似地，如果香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的均值与该论文报告的44种植物的值比较，可注意到前者(0.03)比从所述公布的值(0.26)提取的均值低得多。
[0222] 一个类似的结论也可就关于香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的TNF-α的抑制作用(当分开测试时)得出，其IC50值分别是0.08、0.09和0.08(范围＝0.08-0.09；均值＝0.083)，与A.S.Ravipati et al.(2012)对44种植物提取物公布的结果比较(范围＝0.07-2.5；均值＝1.04)。
[0223] 因此可以得出结论，在上文实施例1-3中选择和测试的3种试剂，都具有抗炎活性，且在关于NO和TNF-α抑制方面比一组通常用于中医药的44种草药提取物中的大多数更有效(即具有更低的IC50)(A.S.Ravipati et al.(2012))。
[0224] 而且，有意义的是，从表V注意到，即使在低效抗炎植物提取物(如紫菀、香附子、桔梗(Platycodon grandiflorus)和独蒜兰(Pleione bulbocadioides))的情况下，所述提取物作为枯草芽胞杆菌的活化剂在抗-真菌和抗-细菌活性方面也是有效的(如在下文实施例5中显示的)。
[0225] 实施例5
[0226] 两种不同的植物提取物与枯草芽胞杆菌的组合的杀真菌和杀细菌活性[0227] 两种具有抗炎特性的植物-紫菀和香附子-的提取物具有增强枯草芽胞杆菌的杀真菌和杀细菌活性的作用的潜在性被研究。
[0228] 方法：
[0229] 分析抗-真菌和抗-细菌特性的相同方法(如在上文实施例1所用的)在该研究中被用于枯草芽胞杆菌与紫菀和香附子的水性提取物的组合中。使用提取物和枯草芽胞杆菌悬浮液的两种不同的浓度，如在下表VI中概括的。
[0230] 表VI
[0231] 浓度3 浓度4
枯草芽胞杆菌 0.75％ 1.0％
紫菀 0.9％ 1.2％
香附子 0.9％ 1.2％
枯草芽胞杆菌 0.75％ 1.0％
紫菀 0.9％ 1.2％
香附子 0.9％ 1.2％
[0232] 制备提取物和枯草芽胞杆菌悬浮液的各种组合并根据表VII中提供的方案测试。所有这些组合在浓度3和浓度4进行测试。
[0233] 表VII
[0234]
[0235] 结果：
[0236] 图6图形显示使用表VII中的组合(浓度3)获得的结果。从上图应该看出，测试的所有组合显示杀真菌活性，且在这方面的最有效的组合是组合5，即枯草芽胞杆菌与香附子的提取物一起。类似的结果在浓度4获得，如在图7的上图中所示。然而，在这种情况下，枯草芽胞杆菌和紫菀的组合也产生类似的结果。
[0237] 至于杀细菌活性，图6的中图表明在浓度3，枯草芽胞杆菌与香附子的组合导致测试的所有组合的细菌细胞数量的最大减少。然而，至于浓度4的数据，图7的中图所示的杀细菌研究的结果表明-如在上文讨论的浓度4杀真菌数据的情况下-植物提取物与枯草芽胞杆菌的两种二元组合产生最大的杀细菌效果。
[0238] 最后，关于枯草芽胞杆菌的活化，从图6和图7的下图清楚地看出，植物提取物与枯草芽胞杆菌的每一种二元组合显示出最大效果。
[0239] 从这个初步研究可得出结论，具有抗炎特性的两种植物的水性提取物用作枯草芽胞杆菌的活化剂，增加其抗-细菌和抗-真菌活性。
[0240] 实施例6
[0241] 黄瓜幼苗的接种
[0242] 方法：
[0243] 从相关的陪替氏培养皿(petri dish)取出活化剂、枯草芽胞杆菌和额外的组分(包括如在上文实施例1的表I和II中所述的细菌和/或真菌合剂)的各个混合物的10cc样品，并在播种后10小时注入4份重复的发芽黄瓜幼苗中。
[0244] 每种植物的健康状况在处理后5天评估，采用一种半定量的接种指数(0＝健康的，5＝枯死的)。
[0245] 结果：
[0246] 该研究的结果在图8中以图形示出，其中4幅独立的图概括了使用浓度1、2、3和4(从上到下)的活化剂获得的数据。
[0247] 如可从图8中的第一幅(上)图见到的，当采用最低浓度(浓度1)时，治疗方案都未能保护植物防止微生物感染(对于所有处理组，接种指数为5)。
[0248] 图8的第二幅图表明，在该系列中的次高浓度(浓度2)，活化剂混合物6-11都对黄瓜植物提供全面的保护，以免真菌和细菌感染。当使用浓度3的活化剂时也看到类似的结果，如在图8的第三幅图中所示。
[0249] 在最高浓度(浓度4；图8的最后的图)时，用活化混合物5-11观察到保护作用。
[0250] 总之：所有的多组分活化剂混合物，以及仅含有一种活化剂的某些混合物，当以浓度2-4使用时，在体内保护黄瓜植物方面是有效的。在该研究中获得的半定量数据与经受各种处理的植物的外观有很好的相关性。
[0251] 实施例7
[0252] 番茄幼苗的接种
[0253] 方法：
[0254] 按照如上文实施例6中相同的方式，用含枯草芽胞杆菌与活化植物化学物的各种组合的试验混合物接种番茄幼苗。然而，所用的各种试验混合物的组成和浓度与实施例6的组成和浓度不同，并且概括在以下的两个表格中(所有浓度作为％v/v给出)：
[0255] 表VIII
[0256] 浓度2 浓度3 浓度4
枯草芽胞杆菌 0.5％ 0.75％ 1.0％
香紫苏醇98％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
柚皮苷98％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
香柏酮98％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
甜菊糖苷 0.5％ 0.75％ 1.0％
CBD3％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
枯草芽胞杆菌 0.5％ 0.75％ 1.0％
香紫苏醇98％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
柚皮苷98％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
香柏酮98％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
甜菊糖苷 0.5％ 0.75％ 1.0％
CBD3％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
[0257] 此外，这些混合物都含有浓度0.5％v/v的渗透剂(DMSO)和浓度0.02％v/v的溶剂(Triton)。
[0258] 表IX
[0259]
[0260] ***试验混合物7在以浓度2执行的设定中被省略。在浓度3，该混合物含有升高浓度(分别为0.4％和1.0％，而不是0.3％和0.75％)的香柏酮和甜菊糖苷。在浓度4，省略了香紫苏醇，和柚皮苷以较低的浓度(0.3％，而不是0.4％)使用。
[0261] 结果：
[0262] 该接种研究的结果图解概括于图9中。从该图可以看出，在浓度2(上图)，只有试验混合物6导致番茄植物的近最大保护作用。然而，在浓度3和4(分别在中图和下图)时，处理6和7都导致最大的保护作用。
[0263] 实施例8
[0264] 番茄植物-现场研究
[0265] 导言：
[0266] 在以色列的番茄主要种植区是在国家的西南部。
[0267] 两年前，该地区受到一种新的番茄花叶病毒(ToMV)侵袭株的严重感染。这种病毒感染该植物，商业产量降至正常产量水平的一半以下。不幸地，目前还没有遗传抗性品种存在。执行使用本公开的方法的现场研究以评估所述方法是否可增加ToMV-感染的番茄植物的存活率。
[0268] 方法：
[0269] 枯草芽胞杆菌和活化植物化学物的试验在番茄网室中进行，该番茄网室在前一个生长季节中已受到该病毒的严重感染。
[0270] 所用的处理混合物与在上文实施例1中描述的那些相同，以浓度2使用。
[0271] 所用的实施方法是：
[0272] a)喷洒；
[0273] b)喷洒和滴灌施肥；
[0274] c)滴灌施肥；
[0275] d)未处理的对照。
[0277] 结果：
[0278] 该研究的结果图解表示在图10中。该图中的前3个图涉及北向地块生长的植物，而第二组3幅图呈现南向地块生长的植物的结果。
[0279] 如从该图可以看出，当组合物通过滴灌施肥(在每一组的栏5和栏6)或通过滴灌施肥和喷洒的组合(栏3和栏4)施用时，6-处理和5-处理方案(从上数过来的第一和第二图)都产生良好的结果(如由减少接种指数所证实的)。
[0280] 从这些结果也显示南向排的番茄植物对这些处理和实施方法的响应要比北向地块中的那些更多。
[0281] 实施例9
[0282] 胡椒植物幼苗
[0283] 方法：
[0284] 采用如在上文实施例7中描述的接种番茄幼苗的相同方法，测试本发明的组合物对胡椒植物幼苗的活性。处理方案也与实施例7中所用的方案相同，如在上文表V和VI阐述的。
[0285] 结果：
[0286] 胡椒植物幼苗的处理的结果概括于图11中。上图表示以浓度2使用的活化混合物的结果，中图涉及以浓度3使用的混合物，而下图表示浓度4混合物的结果。
[0287] 从这些图可以看出，在浓度2时，活化混合物5和6提供对幼苗的完全保护。然而，在浓度3和4时，除了由活化混合物5和6提供完全保护外，活化混合物4也提供近乎完全的保护。
[0288] 实施例10
[0289] 玉米幼苗接种
[0290] 方法：
[0291] 采用如在上文实施例7和9中描述的接种番茄和胡椒幼苗的相同方法，用在实施例1的表I和II中定义的活化剂混合物(以4个不同的浓度)接种玉米(Zea mays ssp.Mays)。用于该研究的处理方案和前述实施例中描述的方案之间的唯一差别与所用细菌和真菌合剂的组成有关。因此，在该研究中，真菌合剂包含腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rizoctonia spp.)和草酸青霉(Penicilium oxalicum)，而细菌合剂含有菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、溶解欧文氏菌(Erwinia dissolvens)和溶解肠杆菌(Enterobacterdissolvens)。
[0292] 结果：
[0293] 这个接种研究的结果图解概括于图12中，其中4幅图表示以浓度1、2、3和4(以降序排列)使用的11种活化混合物的结果。
[0294] 从这些图可以看出，活化混合物11当以浓度2、3和4使用时，提供对抗真菌和细菌感染的最佳保护作用。
[0295] 实施例11
[0296] 小麦幼苗
[0297] 方法：
[0298] 采用如在上文实施例7和9中描述的接种番茄和胡椒幼苗的相同方法，用在实施例1的表I和II中定义的活化剂混合物(以4个不同的浓度)接种小麦幼苗(Triticum aestivum)。用于该研究的处理方案和前述实施例中描述的方案之间的唯一差别与所用细菌和真菌合剂的组成有关。因此，在该研究中，真菌合剂包含立枯丝核菌(Rizoctonia solani)、禾谷腐霉(Pythium graminicola)和群结腐霉(Pythium myriotylum)，而细菌合剂含有丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)和大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)。
[0299] 结果：
[0300] 这个接种研究的结果图解概括于图13中，其中4幅图表示以浓度1、2、3和4(以降序排列)使用的11种活化混合物的结果。
[0301] 从这些图可以看出，活化混合物11当以浓度2、3和4使用，以及活化混合物10以浓度3和4使用时，提供对抗真菌和细菌感染的最佳保护作用。
[0302] 实施例12
[0303] 稻苗
[0304] 方法：
[0305] 采用如在上文实施例7和9中描述的接种番茄和胡椒幼苗的相同方法，用在实施例1的表I和II中定义的活化剂混合物(以4个不同的浓度)接种稻苗(Oryza sativa)。用于该研究的处理方案和前述实施例中描述的方案之间的唯一差别与所用细菌和真菌合剂的组成有关。因此，在该研究中，真菌合剂包含刺腐霉(pythium spinosum)、立枯丝核菌(Rizoctoniasolani)和溶腐霉(Pythium dissotocum)，而细菌合剂含有水稻白叶枯病野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Oryzae)和Erwinia chrisantemi。
[0306] 结果：
[0307] 这个接种研究的结果图解概括于图14中，其中4幅图表示以浓度1、2、3和4(以降序排列)使用的11种活化混合物的结果。
[0308] 从这些图可以看出，活化混合物11(以测试的所有4种浓度)，混合物10当以浓度3和4使用，混合物9以浓度3和4使用，以及活化混合物8当仅以浓度4使用时，都提供对抗真菌和细菌感染的最佳保护作用。
[0309] 实施例13
[0310] 鹰嘴豆-现场研究
[0311] 方法：
[0312] 在以色列Nahalal的厚土中进行了田间播种试验(10.9.2015)。
[0313] 以色列的鹰嘴豆(Cicer arietinum L)的正常播种期是在二月初，主要是由于两种主要病原体-Ascochyta rabiei和Fusarium oxysporumf.sp.cicero。
[0314] 现有品种对这些病原体具有温和的耐受性且在以色列不能过冬。
[0315] 为该试验选择的现场在过去具有高的镰刀菌(Fusarium)负荷。
[0316] 在2016年2月16日之前，现场未经处理，整个现场观察到两种病原体的严重症状。
[0317] 在2016年2月16日，施用第一次处理。
[0318] 在试验-1、11、12和13中包括4种鹰嘴豆品种，每一品种的植物接受3种不同的方案之一：两种不同的处理方案(红色和蓝色方案；见下表X)及未处理的对照方案：
[0319] 表X
[0320]材料 红色方案(单浓度) 蓝色方案(双浓度)
枯草芽胞杆菌 0.5％ 0.5％
香紫苏醇 0.1％ 0.2％
柚皮苷 0.1％ 0.2％
香柏酮 0.1％ 0.2％
甜菊糖苷 0.1％ 0.2％
CBD 0.1％ 0.2％
DMSO 0.5％ 0.5％
Triton 0.025％ 0.025％
枯草芽胞杆菌 0.5％ 0.5％
香紫苏醇 0.1％ 0.2％
柚皮苷 0.1％ 0.2％
香柏酮 0.1％ 0.2％
甜菊糖苷 0.1％ 0.2％
CBD 0.1％ 0.2％
DMSO 0.5％ 0.5％
Triton 0.025％ 0.025％
[0321] 采用以下不同的应用程序，用处理和对照方案处理植物。
[0322] 1.在2016年2月16日喷洒1次。
[0323] 2.在2016年2月16日滴灌施肥1次。
[0324] 3.在2016年2月16日喷洒+滴灌施肥1次。
[0325] 4.在2016年2月16日和在2016年3月1日喷洒+滴灌施肥2次。
[0326] 各种处理的成功与否通过测量每个处理区域的产量，然后把这个重量外推为Kg/德南(1000m2)来确定。
[0327] 结果
[0328] 各种处理的结果图解概括于图15中。从该图注意到，鹰嘴豆品种13对这两种活化混合物处理(红色和蓝色方案)的反应要比测试的其他品种的反应程度大得多，而不管其中施用的处理的方式。因此，使用蓝色方案和最佳施用途径的品种13的外推产量是684kg。
[0329] 应注意到，该产量是对照的4.2倍，且是以色列预期最佳商业产量水平的超过两倍。
[0330] 用蓝色方案处理使得有可能提前4个月播种并获得这些产量结果。
[0331] 应注意到，核查使用所述方案处理的频率，越来越清楚，当处理频率非常密集时，获得最佳结果。这提示经由一种使宿主品种暴露于恒定水平的本发明的组合物的缓释膜和/或控释膜施用所述组合物可能是有利的。这种可能性被进一步研究，结果在下文提出(实施例18)。
[0332] 实施例14
[0333] 人受试者龋齿相关的细菌病原体的体外研究
[0334] 导言：
[0335] 在该初步研究中，体外测试了本发明的组合物对牵涉到人受试者龋齿发展的两种细菌物种的作用：
[0336] 1.表兄链球菌(Streptococcussobrinus)
[0337] 2.乳杆菌(Lactobacilli)
[0339] 方法：
[0340] 为了在各种处理之间进行比较，计算接种指数(0＝最大消除，5＝无消除)。
[0341] 试验混合物，含有与所有5种活化植物化学物和渗透剂(DMSO)和溶剂(Triton)一起的30ml待测细菌(悬浮于50％v/v蔗糖中)，以4种不同的浓度使用：浓度1、2、3和4。在每种情况下，将相同量的细菌悬浮液-30ml-加入到该混合物中。类似地，DMSO(0.5％v/v)和Triton(0.02％v/v)的浓度在所有混合物中是相同的。然而，枯草芽胞杆菌的浓度和5种活化剂各自的浓度(以v/v％给出)在每种试验混合物中是不同的，如在上文实施例1中表I中描述的。
[0342] 含有一些或全部5种活化剂的不同组合的各种试验混合物被用于该研究中，根据在下表XI中给出的处理列表。
[0343] 表XI
[0344]
[0345] 结果：
[0346] 使用试验细菌表兄链球菌获得的结果示于图16中，而使用乳杆菌获得的对应结果呈现于图17中。
[0347] 当使用活化混合物6时-不管所用浓度，发现细菌(在表兄链球菌和乳杆菌的情况下)几乎完全消除。此外，当使用浓度2、3或4的混合物5时，观察到几乎最大的消除。这后一结果提示，当用在这项研究中测试的两种致龋细菌物种攻击时，混合物5中不存在的植物化学物-CBD-对获得观察到的保护作用可能不是必要的。然而，可能的是，含全部5种植物化学物(即包括CBD)的混合物6将确保更一致的结果。
[0348] 实施例15
[0349] 使用本发明的组合物对胡萝卜对韧皮杆菌(candidates liberbacter)感染的保护作用的初步现场试验
[0350] 导言：
[0351] 韧皮杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae family)中的一个革兰氏阴性细菌的属。到目前为止，还不可能在培养中维持这些细菌，它们的检测和定量一般用特异性引物使用其165rRNA基因的PCR扩增来完成。所述属的成员是主要由木虱类传播的植物病原体。
[0352] 这些细菌可感染胡萝卜和柑橘类(绿化病)，而如果是这样的话，可能会造成重大的商业损害。
[0353] 该研究的目的是研究包含枯草芽胞杆菌和活化剂的组合的本发明的组合物是否能够在整个生长季节中保护胡萝卜植物。
[0354] 材料和方法：
[0355] 将珍珠岩颗粒浸泡在含枯草芽胞杆菌和活化剂的组合的制剂中，然后用缓释聚合物涂布。
[0356] 这些颗粒被放置在播种沟的下面，在播种后，监测植物和胡萝卜感染韧皮杆菌的症状发展。
[0357] 试验方案的细节如下：
[0358] 1.在2017年2月8日进行播种-每床193cm 3x3排。
[0359] 2.用Agrinet网覆盖试验区，直至完全发芽。
[0360] 3.用提供4qm/d的小型喷头进行灌溉。
[0361] a)在发芽期间，70％penman每天。
[0362] b)发芽后，90％penman每4天。
[0364] 5.杀真菌剂：每10天，使用Polar(Amiran K Ltd.,Nairobi,Kenya),Shavit(Adama Ltd.,Israel),和Ami-oz.)针对粉孢子和拟粉孢子霉进行处理。
[0365] 6.灭草剂：
[0366] a)发芽前
[0367] b)在叶闭前
[0368] 7.针对胡萝卜蝇病媒Psila rosae，未对作物进行处理。
[0369] 所用的试验图示于图18。如在该现场图指示的，使用两种不同的处理(T1和T2)和对照。每种试验处理包括施用两种不同类型的珍珠岩颗粒：
[0370] a)将颗粒浸泡在活化剂的乳化混合物中，所述混合物包含表XII所示的活化剂：
[0371] 表XII
[0372]活化剂溶液 250ml乳化混合物中存在的各种试剂的体积
香紫苏醇98％ 1.94
香柏酮98％ 1.94
CBD3％ 1.94
柚皮苷98％ 1.94
甜菊糖苷6％ 3.26
香紫苏醇98％ 1.94
香柏酮98％ 1.94
CBD3％ 1.94
柚皮苷98％ 1.94
甜菊糖苷6％ 3.26
[0373] 然后干燥浸泡的颗粒并用羟丙基甲基纤维素(HPMC)控释聚合物(通过喷雾)涂覆。
[0374] 在制备的颗粒的聚合物浓度方面，两种不同的处理(T1和T2)不同：
[0375] T1：10％(w/w)
[0376] T2：20％(w/w)
[0377] b)使颗粒浸泡在枯草芽胞杆菌(在500ml水中混合的1.25g 粉末)中。干燥后，用与含上述活化剂的颗粒相同的控释聚合物喷雾-覆盖颗粒。对于所用的两种处理方案的每一种，枯草芽胞杆菌颗粒具有以下聚合物浓度：
[0378] T1：5％(w/w)
[0379] T2：10％(w/w)
[0380] 在每一排处理中，将上面分别含活化剂的20个颗粒和含枯草芽胞杆菌的20个颗粒((a)和(b))按一式三份(即每种颗粒类型，20x 3＝60)加入到每一个1m排中。
[0381] 现场研究所用的各种处理概括于表XIII中：
[0382] 表XIII
[0383]处理组 控释聚合物浓度 颗粒/m/排 颗粒g/1000m2
T1：活化剂颗粒 10％ 20 600
T1：枯草芽胞杆菌颗粒 5％ 20 600
T2：活化剂颗粒 20％ 20 600
T2：枯草芽胞杆菌颗粒 10％ 20 600
T1：活化剂颗粒 10％ 20 600
T1：枯草芽胞杆菌颗粒 5％ 20 600
T2：活化剂颗粒 20％ 20 600
T2：枯草芽胞杆菌颗粒 10％ 20 600
[0384] 用珍珠岩颗粒处理对照排，所述珍珠岩颗粒不含处理物质(活化剂或枯草芽胞杆菌)或控释涂层。
[0385] 结果：
[0386] 在整个试验期监测植物叶子和发育的胡萝卜的情况。
[0387] 叶子：
[0388] 在播种后5个月评估由韧皮杆菌(Candidatus liberibacter)的存在不利地影响的3个组(对照、处理T1、处理T2)的每一组中植物的百分比，计算平均结果并示于图19中。从该图可以看出，处理方案T2导致具有不利影响的叶子的植物的百分率的显著减少(从对照植物的40.6％至T2组的26.1％)。这种差别被发现是有统计学意义的(P<0.05)。
[0389] 胡萝卜：
[0390] 计算3组的每一组由韧皮杆菌感染的存在不利地影响的胡萝卜的平均数量。从图20可以看出，感染的胡萝卜的平均数量通过T1和T2方案而得到显著的减少(当与对照组比较时)。
[0391] 结论：
[0392] 这项初步研究证实，用含本发明的组合物的颗粒化制剂处理生长的胡萝卜植物显著减少含韧皮杆菌感染引起的损害的植物和胡萝卜的数量。
[0393] 实施例16
[0394] 本发明的组合物对蜜蜂生存力的影响的初步研究
[0395] 导言：
[0396] 近年来，已观察到蜜蜂(主要为物种Apis mellifera)数量的显著减少。鉴于蜜蜂对农业和园艺的重要性，这种现象(称为群体衰竭性失调)对活动的那些田野有严重的后果。群体衰竭性失调的特征是蜂群中大量的工蜂消失，通常只留下母蜂与仅一小部分照顾母蜂的工蜂，剩下的是未成熟的蜜蜂。虽然群体衰竭性失调的准确原因尚未确凿地了解，可能是病毒和/或真菌的感染，可能伴随着螨如瓦螨(Varroa mite)(用作病毒感染的虫媒)的侵扰，起着主要作用。例如，已知瓦螨破坏螨对蜂群的破坏性很大，并且这至少在一定程度上要归因于可能携带的病毒，包括残翅病毒与急性蜜蜂麻痹病毒。其他病毒也牵涉到这种现象，包括以色列急性麻痹病毒。此外，有证据表明，某些真菌物种，例如蜂小孢子虫(Nosema opis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)可涉及导致群体衰竭性失调的致病过程。最后，至少一项主要研究发现，病毒(彩虹病毒6型(iridescent virus type 6))和真菌(东方蜜蜂微孢子虫(N.ceranae))病原的组合可能是涉及这种现象的发病机理。
[0397] 在本研究中，本发明人假定，本发明的抗微生物组合物(具有其广谱抗微生物活性)可能能够阻止或防止蜜蜂的丧失。
[0398] 方法：
[0399] 该研究使用位于西班牙埃斯特雷马杜拉地区的卡米诺莫里斯科的7对蜂箱进行。每对的一个蜂箱(标记为’hive no.-A’)用本发明的组合物处理。另一个蜂箱(标记为’hive no.-B’)用作对照，由于它未用所述组合物处理，而是继续接受通常施用于蜂箱的普通常规维持处理。
[0400] 用来处理试验(’A’)蜂箱的组合物含有以下组分：
[0401] a)油相
[0402]
[0403]
[0404] b)水相
[0405]
[0406] 将两相混合在一起，形成一种乳液。
[0407] 然后使300g乳液与悬浮于20ml水中的20g枯草芽胞杆菌制剂 混合在一起。然后加入另外80ml水，得到400ml的处理溶液。然后将这种处理溶液分成两份：300ml用于处理蜜蜂，100ml用于处理幼虫。
[0408] 通过加入300ml所述溶液至蜜蜂饲料制剂(300ml稀释水与850ml蜂蜜混合)，将处理溶液给予’A’蜂箱中的成年蜜蜂。
[0409] 通过加入100ml所述溶液至幼虫饲料制剂(480g花粉与80g蜂蜜混合)，将处理溶液给予’A’蜂箱中的蜜蜂幼虫。
[0410] 每个蜂箱含有10个托盘，每个托盘配备有排列的孔，其中一些含有成年蜜蜂，而另一些含有蜜蜂幼虫。在试验开始时及之后14、28、42和62天，评估在这些托盘中的成年蜜蜂和幼虫的数目，得到群体指数，以确定所述处理对蜂箱中蜂群的作用。
[0411] 结果：
[0412] 不包括一对蜂箱(5A和5B，其中所有的蜂群都因为其他原因而死亡)，从7对蜂箱获得有关成年蜜蜂和幼虫的数目的数据。结果概括于图21(幼虫)和图22(成年蜜蜂)中。在这些图中可以看出，用本发明的组合物处理(’A’蜂箱)导致比未处理的对照蜂箱(’B’蜂箱)更多数量的幼虫和成年蜜蜂的存活。
[0413] 因此，可得出结论，本发明的枯草芽胞杆菌和活化剂的混合物有效防止或逆转蜂群的减少。
[0414] 实施例17
[0415] 本发明的组合物对牛奶的体细胞计数的影响
[0416] 导言：
[0417] 牛奶的体细胞计数高被乳品工业用作潜在感染的一种指示，并可认定为在食品生产中牛奶是不合格食用的。因此，体细胞计数高由于需要丢弃整批牛奶，可导致牛奶生产商的直接经济损失。此外，经济罚款也可能必须由生产商支付。而且，在某些地区，体细胞计数高的两份报告可导致批发商拒绝接受受影响生产商的更多的牛奶供应。
[0418] 方法：
[0419] 6头已鉴定在牛奶中预先存在高水平的体细胞的奶牛各自用以下局部凝胶制剂之一处理：
[0420] 1.一种含5％油水乳液的凝胶剂，其为商业上可获得的霜剂配方(Bio Spa，富含小麦奶油，由Spa,Arad,Israel的Sea生产)(2头奶牛)。
[0421] 2.一种含5％油水乳液的凝胶剂，其为商业上可获得的Aloe-Vera霜剂(2头奶牛)。
[0422] 3.制剂(1)的仅霜剂对照(1头奶牛)。
[0423] 4.制剂(2)的仅霜剂对照(1头奶牛)。
[0424] 含本发明的组合物的乳液被制备为分开的油相和水相，然后将其合并。乳液的组成在下表中给出：
[0425] 表XIV
[0426]
[0427]
[0428] 将0.5g 粉末加入到99.5g的以上乳液中，建立处理乳液，然后将其以5％的浓度加入到上文描述的两种霜剂制剂的每一种中。
[0430] 对奶牛挤奶并用霜剂制剂一天两次处理。
[0431] 收集体细胞样品以供在开始试验之前及在此后15天和21天进行分析。
[0432] 结果：
[0433] 包括在试验中的6头奶牛的每一头的牛奶中的体细胞数目示于表XV中：
[0434] 表XV
[0435]
[0436] 这些结果清楚地表明，在采自用本发明组合物处理的4头奶牛中的3头的牛奶样品中体细胞数量显著减少。这种减少在从试验开始时的21天特别明显。在用本发明的组合物处理的1头奶牛(奶牛编号989)中，虽然结果并未显示出这样一种如同其他3个试验样品的显著变化，然而在体细胞计数方面有明显减少(至初始值的约25％)。
[0437] 这些结果表明，可采用本发明的组合物作为奶牛和农业中所用的其它产奶动物的预防性局部处理来控制奶中的体细胞数量。
[0438] 实施例18
[0439] 现场研究：用本发明的组合物直接涂覆鹰嘴豆种子
[0440] 导言：
[0441] 以色列的鹰嘴豆(Cicer arietinum L)的正常播种期是在二月初，主要是由于遇到两种土传真菌病原体-Ascochyta rabiei和Fusarium oxysporumf.sp.cicero的问题。现有的鹰嘴豆品种不能在以色列的冬天存活，因为存在这些病原体。
[0442] 这项研究的目的是调查用本发明的组合物直接涂覆鹰嘴豆种子对鹰嘴豆植物存活的影响。
[0443] 方法：
[0444] 用乳液A(一种根据本发明的组合物-见下文)涂覆鹰嘴豆，随后用控释聚合物(得自Sekisui Specialty Chemicals,Japan的E603)涂覆。
[0445] 乳液A由以下组分制备：
[0446]
[0447] 然后准备3批不同的鹰嘴豆种子(品种13，平均重量0.5g/种子)：
[0448] A批：用1-25g乳液(用水稀释至40ml)，使用流化床涂布机涂覆7000粒鹰嘴豆。随后，经乳液涂覆的种子用425g聚合物E603涂覆。
[0449] B批：以如同A批的方式处理7000粒鹰嘴豆，不同的是所用的乳液的量(在用水稀释至40ml前)是2.5g。经乳液涂覆的种子以完全如同A批的方式用控释聚合物涂覆。
[0450] 对照：留下3000粒鹰嘴豆未经涂覆且未以任何其他方式处理。
[0451] 2016年9月15日在试验田地(总面积1000平米)(其含重质土，位于以色列Nahalal)进行播种，总共17000粒种子品种13(平均重量0.5g/种子)，被分配到上述3个不同的批次中。从以前的经验已知这块田地具有高的镰刀菌负载。
[0452] 结果：
[0453] 各种处理的成功与否通过测量每个处理区域的鹰嘴豆产量，然后把这个重量外推为Kg/德南(1000m2)来确定。各种处理的结果概括于下表中：
[0454] 表XVI
[0455]
[0456] 从这些结果可以看出，含有用本发明组合物和控释涂层涂覆的种子的两个批次(即A批和B批)导致鹰嘴豆产量增加(当与未处理的对照比较时)。使用B批种子发现最大的产量增加，其用与A批种子比较的两倍量的本发明组合物涂覆。
[0457] 这些结果表明，用本发明的组合物直接涂覆农业种子可能使幼苗能够抵抗由土传的致病性微生物的感染。这种作用似乎是剂量-依赖性的。
[0458] 实施例19
[0459] 各种活化剂与益生菌混合物组合的杀真菌和杀细菌活性
[0460] 在这项研究中，益生菌抗菌物种的混合物与一种或多种活化剂组合使用，以调查此类物种与所述活化剂组合是否具有如上报告的当细菌物种为枯草芽胞杆菌时本发明人所见到的相同作用。
[0461] 方法：
[0462] 在这项研究中，与活化剂组合使用的细菌混合物是’Jarro Dophilus’，其是一种在以色列由Altman Health Ltd分销的市售益生菌产品。
[0463] 这种产品的细菌含量如在表XVII中所示：
[0464] 表XVII
[0465]细菌物种 量(百万/胶囊)
鼠李糖乳杆菌R0-11 880
干酪乳杆菌R0-215 680
植物乳杆菌R0-1012 340
瑞士乳杆菌(嗜酸的)R0-52 880
长双歧杆菌(记录菌株morinaga)BB536 680
短双歧杆菌R0-70 340
乳酸片球菌R0-1001 870
乳酸乳球菌乳亚种R0-1058 330
总计 5000
鼠李糖乳杆菌R0-11 880
干酪乳杆菌R0-215 680
植物乳杆菌R0-1012 340
瑞士乳杆菌(嗜酸的)R0-52 880
长双歧杆菌(记录菌株morinaga)BB536 680
短双歧杆菌R0-70 340
乳酸片球菌R0-1001 870
乳酸乳球菌乳亚种R0-1058 330
总计 5000
[0466] 使用浓度0.5％W/W的这种益生菌产品代替在上文给出的其他实施例中所用的枯草芽胞杆菌制剂。这种益生菌混合物与最多5种活化剂的组合如上文实施例1中所述，以在该实施例中描述的相同浓度(浓度3和4)进行测试。因此，这项研究和上文实施例1中报告的研究之间的唯一差别在于这样的事实，即枯草芽胞杆菌被益生菌混合物替代。
[0467] 结果：
[0468] 如在下表XVIIIA-C中可见到的，使用益生菌的这种混合物作为该组合物的细菌要素获得的结果基本上与上文实施例1中报告的含枯草芽胞杆菌的混合物获得的那些结果相同。这些表中所示的结果是对于含以浓度4使用的活化剂的组合。
[0469] 表XVIIIA
[0470]
[0471] 表XVIIIB
[0472]
[0473] 表XVIIIC
[0474]
[0475] (JD指数＝Jarro Dophilus指数；相当于实施例1的枯草芽胞杆菌指数)[0476] 结论是：这项研究中所用的益生菌混合物似乎是以与上文报告的抗微生物活性研究中的枯草芽胞杆菌相同的方式发挥功能，因此在本发明的组合物和方法中可替代所述枯草芽胞杆菌。
[0477] 实施例20
[0478] 使用各种活化剂与益生菌混合物组合接种玉米幼苗
[0479] 在这项研究中，以与上文实施例10中所述相同的方式接种玉米种子，不同的是接种混合物(即本发明的组合物)包含替代枯草芽胞杆菌的益生菌混合物，在实施例19中描述的’Jarro Dophilus’。
[0480] 结果：
[0481] 下表呈现了用浓度4的活化混合物执行接种的结果：
[0482] 表XIX
[0483]
[0484] (接种指数：半定量标度；0＝健康的，5＝枯死的)。
[0485] 从这些结果可以看出，用于这项研究的益生菌混合物，当与表XIX中指示的活化剂组合施用于玉米种子时，能够以与其中非-致病细菌物种是枯草芽胞杆菌(实施例10)的组合物非常相同的方式及相同的程度保护玉米幼苗的发育。
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