本发明普遍涉及表达治疗活性蛋白质的转基因植物。特别是，本发 明涉及在亚细胞器，优选地在液泡或更优选地在植物质体中表达治疗活 性蛋白质的植物。本发明也涉及这些转基因植物的治疗用途。

有多种疾病可折磨动物，包括人、宠物和家畜。这些疾病不仅引起 极大的痛苦，而且转化为较大的经济损失。患病的工人不能工作或具有 较差的表现，而侵袭农畜的疾病能显著降低农业产量。每种人类文明都 用自己的药物治疗疾病，虽然许多疾病已经并且仍在通过现代医学成功 治疗，但多种其他疾病仍无法治疗或仅能部分治疗。

大量药品的成本或其有限供应是影响疾病治疗的问题。因此，有时 只有少量患者能得到有效治疗，特别是在发展中国家，昂贵的治疗对于 全世界范围内的卫生系统是一个沉重的负担。此外，在农业领域中，由 于成本大大超过有效治疗所获得的效益，所以导致较低产量的某些疾病 不能充分治疗。某些药物的高成本的一个重要原因是缺乏经济的生产方 法，特别是对于基于蛋白质或肽的药物。当前医学中的另一个有时被忽 略但很重要的问题在于向希望的宿主器官或身体部分施用治疗有效量的 药物。实际上，当前可用的施用方法有时不能令人完全满意，例如，对 于变态反应或自身免疫病的治疗。另一个与药物有关的问题是其运输， 特别是在高温气候时，这需要昂贵的冷藏和昂贵的配制，从而进一步提 高了成本。不导致昂贵的运输或施用成本的大量药物的可用性将是十分 有利的。

对于治疗活性蛋白质的表达，植物是有力的候选者，因为它们是可 食用的，并有高生物量产量。在与胞质蛋白酶隔离的细胞区室中表达治 疗活性蛋白质是在植物中产生治疗活性化合物的一种特别吸引人的方 法。

总之，一直需要但仍未获得可大量且便宜地获得的新型药物，其能 通过多种方法对患者或宿主施用，并在全世界易于获得。    

本发明阐述了大量且便宜的药品特别是基于蛋白质的药品的供应的 需要，用于预防或治疗疾病。因此，本发明提供能表达治疗活性蛋白质 的转基因植物，特别是能在亚细胞器中，优选地在液泡中，或更优选地 在植物质体中表达治疗活性蛋白质的转基因植物。本发明的植物特别可 用于抑制或降低不希望的免疫应答。能通过多种施用方法，优选地经 口，对宿主施用在转基因植物中表达的蛋白质。例如，在某些情况中并 如下文所述，能在未预先提取或纯化的情况下，或经较少的提取或纯 化，经口摄食含有治疗活性蛋白质的植物或植物材料。这种通过饮食对 疾病的预防或治疗是方便的，并可大大降低药物的成本。此外，能用医 药领域众所周知的方法提取并施用在转基因植物中表达的蛋白质。

特别地，本发明涉及从其质体基因组表达治疗活性蛋白质的转基因 植物。根据本发明的质体中的表达水平通常超过核表达的转基因的水 平。这种高水平的表达导致每克植物组织中的高浓度的蛋白质，从而通 过在多种治疗用途中使用植物或来源于这些植物的植物材料满足了迄今 仍未满足的长期存在的需要。此外，由于基因沉默的缺乏，转基因表达 水平经一定时间仍稳定，由于转基因通过同源重组在质体基因组上的精 确、靶向位置的插入，位置效应变化不是问题。此外，在植物质体内表 达的蛋白质在细胞器中隔离，因此方便地免于降解，特别是免于在经口 摄食时在消化系统中降解。在细胞器中的隔离也防止质体表达的转基因 与胞质环境相互作用。如果植物中表达的蛋白质也显示对植物某些成分 的活性，则该特征是必要的。另外，可获得诱导型质体表达系统(参见 WO 98/11235)，这使转基因的表达局限于希望的时点，从而长时间地潜 在限制了高转基因表达水平的不利作用。类似地，导向其他亚细胞区室 如液泡的由核基因组表达的蛋白质也被保护免于降解或免于与胞质环境 的不利相互作用。

本发明也提供包含来源于这些转基因植物的植物物质的治疗组合 物，表达治疗活性蛋白质的新方法，和改善多种宿主包括人、家畜、宠 物及其他动物的病情的新方法。也提供了施用植物衍生的治疗剂的方 法。

本发明因此提供：

一种在质体基因组中包含至少一种DNA分子的植物，该DNA分子编 码至少一种当对宿主优选地对需要的宿主以治疗有效量施用时有治疗活 性的蛋白质，其中该植物能表达一种或多种蛋白质。在一个优选实施 方案中，治疗活性蛋白质在植物质体中积累。在另一个优选实施方案 中，该蛋白质在植物的可食用部分中表达。在另一个优选实施方案中， 对宿主经口施用该蛋白质。在另一个优选实施方案中，该宿主是一种脊 椎动物，优选地是哺乳动物，更优选地是人、牛、绵羊、猪、犬或猫。 在一个更优选的实施方案中，治疗活性蛋白质是一种抗原，优选地是一 种免疫活性抗原。因此，本发明提供一种植物，其在质体基因组中含有 编码一种抗原优选地免疫活性抗原的DNA分子，其中该植物能表达该抗 原。优选地，该抗原在该植物中表达，更优选地，在宿主摄取该植物后 对该抗原的免疫应答降低。

在另一个优选实施方案中，抗原能抑制或降低动物对抗原的免疫应 答，优选地通过诱导宿主对该抗原的耐受，例如，通过肠粘膜接触或摄 取。一种优选的抗原是变应原，优选地是空气传播的变应原，优选地花 粉变应原。优选的变应原的实例是Der f I、Der f II、Der p I和Der p II、 Can f II、Lol p V、Sor h I、Amb a I，优选地Amb a I.1、Amb a II、 Aln g I、Cor a I、Bet v I、Fel d I或rAed a1和rAed a2。例如，在本发 明的植物中表达的变应原未糖基化。另一种优选的抗原是自身抗原，如 胶原蛋白，优选地I型或III型胶原蛋白、II型胶原蛋白、髓鞘碱性蛋白、 髓鞘蛋白脂蛋白、感光细胞间受体结合蛋白(interphoto receptor binding protein)、乙酰胆碱受体、S-抗原、胰岛素、谷氨酸脱氢酶、胰 岛细胞特异性抗原或甲状腺球蛋白，或移植抗原，如同种异体移植或异 种移植抗原，例如MHC蛋白，优选地MHC II类蛋白，优选地a或b链。 在另一个优选实施方案中，免疫活性抗原能诱导动物对抗原的免疫。在 另一个优选实施方案中，治疗活性蛋白质是一种血液蛋白质、激素、生 长因子、细胞因子、酶、受体、结合蛋白、免疫系统蛋白、翻译或转录 因子、癌蛋白或原癌蛋白、乳蛋白、肌肉蛋白质、髓蛋白、神经活性肽 或肿瘤生长抑制蛋白或肽，例如制管张素或内皮生长抑制素，此两者均 抑制血管发生。在本发明的另一个优选的实施方案中，治疗活性蛋白质 是一种抗脓毒肽，如BPI(杀菌通透性增强蛋白)。在另一个实施方案 中，免疫系统蛋白是一种抗体。根据本发明的DNA分子与能在植物质体 中表达该DNA分子的启动子有效连接。在一个优选的实施方案中，启动 子是clpP启动子，在另一个优选的实施方案中是16S r-RNA基因启动子。 在本发明的一个特别优选的实施方案中，启动子是一种反式激活蛋白介 导的启动子，特别是T7基因10启动子。另外，本发明提供了一种植物， 其还包含含有一种编码反式激活蛋白的DNA序列的异源核表达盒。在一 个优选的实施方案中，反式激活蛋白是T7聚合酶。本发明进一步提供一 种植物，其在核基因组中含有一种编码当对需要的宿主以治疗有效量施 用时有治疗活性的蛋白质的DNA分子，其中该治疗活性蛋白质选自蚊子 变应原r Aed a1和r Aed a2、杀菌通透性增强蛋白(BPI)和花粉变应原 Amb a I、Amb a I.1、Amb a II、Amb t V、Aln g I、Cor a I、Lol p V、Sor h和Bet v I。

本发明也提供一种植物，其在核基因组中含有一种编码当对需要的 宿主以治疗有效量施用时有治疗活性的蛋白质的DNA分子，其中该治疗 活性蛋白质被导向至该植物的亚细胞器。在一个优选实施方案中，治疗 活性蛋白质被导向至液泡中。导向液泡的治疗活性蛋白质优选地选自变 应原，如Der f I、Der f II、Der p I和Der p II、Can f II、Lol p V、Sor h I、Amb a I，优选地Amb a I.1、Amb a II、Amb t V、Aln g I、Cor a I、Bet v I、Fel d I，或rAed a1和rAed a2，自身抗原，如胶原蛋白，优 选地I型或III型胶原蛋白、II型胶原蛋白、髓鞘碱性蛋白、髓鞘蛋白脂蛋 白、感光细胞间受体结合蛋白、乙酰胆碱受体、S-抗原、胰岛素、谷氨酸 脱氢酶、胰岛细胞特异性抗原或甲状腺球蛋白，或移植抗原，如异体移 植或异种移植抗原，例如MHC蛋白，优选地MHC II类蛋白，优选地a或 b链，或来自于血液蛋白、激素、生长因子、细胞因子、酶、受体、结合 蛋白、免疫系统蛋白、翻译或转录因子、癌蛋白或原癌蛋白、乳蛋白、 肌肉蛋白质、髓蛋白、神经活性肽或肿瘤生长抑制蛋白或肽，例如制管 张素或内皮生长抑制素，此两者均抑制血管发生。在另一个优选的实施 方案中，可导向液泡的治疗活性蛋白质是一种抗脓毒肽，如BPI(杀菌通 透性增强蛋白)。

在一个更优选的实施方案中，根据本发明的植物是一种可食用的植 物。在另一个优选的实施方案中，该植物是一种双子叶植物，优选地是 烟草、番茄、大豆或菠菜。在另一个实施方案中，该植物是一种单子叶 植物，优选地是玉米或稻。

在一个更优选的实施方案中，蛋白质在植物中的表达是可调节的， 优选地是可化学调节的。此外，蛋白质的表达也可是组成型、组织特异 的或发育调节的。

这也包括这种植物的种子，其种子被任选地处理(如装填或包被) 和/或包装，例如与使用说明书一起放于袋子或其他容器中。

根据本发明的宿主是一种脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别地是 人、牛、绵羊、猪、犬或猫。

本发明进一步提供：

一种含有根据本发明的植物或来源于这些植物的植物物质的组合 物，其中该组合物含有一种治疗有效量的所述蛋白质，和其中在对宿主 施用之前处理该植物的一种组合物。

本发明进一步提供方法，其中：

—以改善宿主病情有效的量对一种需要的宿主施用根据本发明的 组合物

—对该宿主经口施用该组合物

—该蛋白质是一种抗原，由此该宿主对该抗原的免疫应答受到抑 制或降低

—该抗原特别是一种变应原、自身抗原或移植抗原。

本发明也提供一种治疗或预防疾病的方法，其包括对需要的宿主施 用一种治疗有效量的根据本发明的植物或来源于该植物的植物物质。

在一个特殊实施方案中，所述疾病是变态反应、自身免疫病或移植 排斥。在另一个特殊实施方案中，对宿主经口施用所述的治疗有效量。

本发明进一步提供：

用作药物的本发明的植物，优选地用于治疗或预防疾病，例如变态 反应、自身免疫病或移植，例如通过在需要的患者中诱导耐受，例如口 服耐受，或用于宿主的免疫。

本发明进一步提供：

用作医用食品的本发明的植物，优选地用于治疗或预防疾病，例如 变态反应、自身免疫病或移植，例如通过在需要的患者中诱导耐受，例 如口服耐受，或用于宿主的免疫。

本发明进一步提供：

一种含有编码一种蛋白质的DNA分子的质体转化载体，当对需要的 宿主以治疗有效量施用时，该蛋白质有治疗活性，其中该DNA分子与能 引导该DNA分子在植物质体中表达的启动子有效连接。在一个优选的实 施方案中，该蛋白质在植物质体中积累。在另一个优选实施方案中，质 体转化载体中的启动子是clpP启动子、16S r-RNA基因启动子、psbA启 动子、rbcL启动子或由核反式激活蛋白调节的反式激活蛋白介导的启动 子(例如，当反式激活蛋白是T7时，为T7基因10启动子)。

一种含有如上所述的转化载体的质体。

一种含有如上所述的质体的植物细胞，其中该植物细胞能产生所述 蛋白质。

本发明还提供：

一种植物，其包含：

一种异源核表达盒，其含有一种启动子，例如诱导型启动子，创伤 诱导型或化学诱导型启动子，例如烟草PR-1a启动子，或组织特异型或器 官特异型启动子，或发育调节的启动子，该启动子与编码反式激活蛋白 (优选的是不在植物中天然存在的反式激活蛋白，优选地RNA聚合酶或 DNA结合蛋白，如T7 RNA聚合酶)的DNA序列有效连接，该反式激活 蛋白任选地与质体导向序列如叶绿体导向序列(例如，可在植物中表达 的表达盒)融合；和

一种异源质体表达盒，其含有由反式激活蛋白调节并任选地与编码 本发明的治疗活性蛋白质的DNA分子有效连接的反式激活蛋白介导启动 子(例如，当反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶时为T7基因启动子)；

还包括这种植物的种子，其种子被任选地处理(如装填或包被)和/ 或包装，例如与使用说明书一起放于袋子或其他容器中。

本发明进一步提供：

一种含有如上所述的植物或植物物质的组合物，其中该组合物含有 一定量的所述蛋白质，当对需要的宿主施用时它是治疗有效的。在一个 优选的实施方案中，在对宿主施用之前处理植物物质。这种处理优选地 是常规用于食品或饲料工业中的一种处理。在另一个优选实施方案中， 本发明的组合物含有一定量的免疫有效的抗原。

本发明进一步提供：

包含本发明的植物或植物物质的药用组合物，和包含本发明的植物 或植物物质的医用食品组合物。

本发明还提供：

一种方法，包括用如上所述的转化载体转化植物的质体基因组，优 选地进一步包括在该植物中表达一种治疗活性蛋白质。在一个优选的实 施方案中，治疗活性蛋白质是一种抗原，优选地是一种免疫活性抗原。

本发明进一步提供：

一种方法，包括对需要的宿主以足以改善宿主状况的量施用一种如 上所述的组合物。优选地，该方法包括对宿主口服施用该组合物。

本发明进一步提供：

一种治疗或预防疾病如变态反应、自身免疫病或移植排斥的方法， 例如通过在需要的宿主中诱导耐受，或用于宿主的免疫，该方法包括对 宿主施用一种治疗有效量的本发明的植物或由其衍生的植物物质。

本发明进一步提供：

本发明的植物在生产用于治疗或预防疾病的药品中的用途，例如， 通过在需要的宿主中诱导耐受，用于变态反应、自身免疫病或移植的治 疗，或用于宿主的免疫。

本发明进一步提供：

本发明的植物在生产用于治疗或预防疾病的医用食品中的用途，例 如，通过在需要的宿主中诱导耐受，用于变态反应、自身免疫病或移植 的治疗，或用于宿主的免疫。

本发明进一步提供：

本发明的植物在生产用于测定免疫学活性的抗原中的用途。

本发明进一步提供：

一种对本发明的植物中表达的抗原特异的抗体。

一种抗体，其干扰对本发明的植物中表达的抗原特异的抗体与该表 达抗原的结合。

本发明进一步提供：

一种食品，其含有含根据本发明的DNA分子的植物可食用部分，其 中当以治疗有效量对需要的宿主施用时，该食品有治疗活性。

本发明进一步提供：

来源于含有根据本发明的DNA分子的植物或植物部分的农产品，其 中当以治疗有效量对需要的宿主施用时，该农产品有治疗活性。

本发明还提供：

如此处所述的所有新产品、方法和应用。

定义

广义上来说，“治疗活性蛋白质”当以治疗有效量对宿主施用时以 积极的方式有助于宿主病况。治疗活性蛋白质对疾病有治愈、治疗或缓 和作用，并可施用以改善、减轻、缓解疾病的严重程度。“治疗活性蛋 白质”也有预防作用，并用来预防疾病的发作或在发作时缓解疾病或病 症的严重程度。术语“治疗活性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，或其 治疗活性片段。它也包括该蛋白质或肽的治疗活性类似物，或该蛋白质 或肽的片段的类似物。术语“治疗活性蛋白质”也指协同作用以提供治 疗作用的多种蛋白质或肽。

治疗活性蛋白质的“类似物”包括与具有与该蛋白质相同的生物活 性的蛋白质结构相关的蛋白质。

“免疫应答”是指由抗原激活免疫系统引起的生理学反应。在本发 明中，特别是在经口施用抗原时，可通过根据接触抗原诱导耐受，抑制 免疫应答。

“免疫活性”在此是指，例如通过刺激免疫应答或抑制或降低免疫 应答或炎症条件，能调节免疫系统，

“抗原”是一种与免疫系统，优选地与特异体液或细胞免疫的产物 相互作用，而刺激“免疫应答”的物质。抗原优选地是一种多肽，并且 是一种“治疗活性蛋白质”。抗原包括为多肽的全部或部分的多肽。这 些多肽部分例如是抗原的表位或抗原决定簇。一个抗原可包含一个或一 个以上的表位或抗原决定簇。抗原也包括抗原的类似物，包括与具有与 该抗原相同的生物活性，即相同免疫学活性的抗原结构相关的分子。在 本发明说明书中，抗原包括例如变应原、自身抗原和移植抗原。

“表位”是抗原的一部分，其决定在抗原-抗体相互作用中与相应抗 体的特异结合位点结合的能力。

“抗原决定簇”是决定抗原刺激的免疫应答特异性的抗原部分。

“佐剂”是一种物质，优选地油类物质，当与抗原混合施用时，特 别是当与抗原混合并注射时，非特异地增强对该抗原的免疫应答。一种 典型的佐剂是完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(Lando等人 (1981)J.P.immunol.126：1526)。

“自身抗原”是在动物体内通常发现的任何物质，在异常情况如自 身免疫病时，其不再被该动物的免疫系统识别为动物自身的一部分，因 此象外源物质一样被免疫系统攻击。

“变应原”是可诱导宿主变态反应的抗原。

宿主对病原体或毒素的“免疫”是刺激免疫应答的一个方面，此处 是指宿主通过诱导免疫系统对抗病原体或毒素的保护。优选地，诱导直 接免疫应答和免疫记忆，优选地提供快速且长期的宿主保护。毒素宿主 的抗原用于免疫。接种也包含于术语免疫中。

对需要的宿主“施用”治疗活性蛋白质是指对宿主提供治疗活性蛋 白质，以使该蛋白质的治疗作用保持足以为宿主提供希望的有利作用的 时间。

治疗活性蛋白质的“经口施用”主要是指经口的施用，优选地通过 食用，也包括向宿主的胃或消化道提供这些蛋白质的任何施用。在一个 优选的实施方案中，经口施用导致治疗活性蛋白质与肠粘膜的接触。

“宿主”是对其施用本发明的治疗活性蛋白质的动物。术语“动 物”涵盖具有免疫系统的所有生命形式，包括人、牛、绵羊、猪、犬或 猫。

“食物”或“食品”在此是指液体或固体食物或食品或饲料，是可 被人及其他动物摄入的植物、植物部分或由其衍生的植物物质。该术语 包括可以直接供人及其他动物食用的原始植物或植物材料，或供人及其 他动物食用的含营养载体的任何已加工的植物物质。从植物获得的材料 包括最终被人或其他动物摄入的植物的任何部分。

“医用食品”包括可被宿主食用或饮用并对宿主具有治疗作用的组 合物。医用食品包括例如本发明的植物或由其衍生的植物物质。医用食 品可被单独摄入，或可与医学领域众所周知的药用组合物一起施用。医 用食品也包括供给非人动物的等同物饲料。

在此使用时，“农业产品”是指可被整个食用的植物，如苜蓿芽、 小萝卜芽、小麦芽等，或指以生的或熟的形式被人消费的植物的可食用 部分。可食用的部分可以是根，如芜菁甘蓝、甜菜、胡萝卜和红薯；块 茎或贮存茎，如马铃薯、朝鲜蓟和芋；茎，如天冬和苤蓝；芽，如芽甘 蓝；鳞茎，如洋葱和蒜；叶柄，如芹菜和大黄；叶，如卷心菜、莴苣、 欧芹和菠菜；未成熟的花，如花椰菜、花茎甘蓝和朝鲜蓟；种子；未成 熟的果实，如茄子、黄瓜和甜玉米(玉米)；或成熟的果实，如番茄、 胡椒、苹果、梨、香蕉、橙、浆果等。

“植物”是指任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是指植物的结构与生理学单位，包含原生质体和细胞 壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或者作为高级组 织单位如植物组织或植物器官的一部分。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、花粉 管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养物 或植物的其他任何部分或产物。

“植物物质”是指处于任一发育阶段的植物的任一部分，优选地是 能经口施用的这些植物。植物物质包括可食用的植物部分，如叶、种 子、果实、块茎，或能生或熟着摄食的其他植物部分。植物物质也包括 分离的植物的部分，如亚细胞器，例如质体或液泡。植物物质也包括已 经受多种加工步骤，特别是食品或饲料工业中常用的加工步骤的植物部 分，这些步骤包括但不限于：植物固体物质的浓缩，而形成例如沉淀、 糊状、干燥或冻干的产物，或通过切割或磨碾使植物破碎成不同程度， 或抽提植物的液体部分产生汤、糖浆或汁液。加工步骤也能包括烹煮植 物或植物物质。

“表达”是指内源基因或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如， 对于反义构建体，表达可以仅指反义DNA的转录。

在此使用的“表达盒”意思是一种能引导特定核苷酸序列在适当宿 主细胞中表达的DNA序列，其含有与目的核苷酸序列有效连接的启动 子，该序列任选地与3’序列如3’调节序列或终止信号有效连接。表达盒一 般也含有核苷酸序列适当翻译所需的序列。编码区通常编码目的蛋白 质，但也可编码一种目的功能RNA，例如反义RNA或非翻译RNA，它们 以有义或反义方向抑制特定基因如反义RNA的表达。含有目的核苷酸序 列的表达盒可以是嵌合的，意思是该核苷酸序列由一个以上的不同来源 的DNA序列组成，它们通过重组DNA技术融合在一起，产生非天然存在 的，特别是在被转化的植物中不存在的核苷酸序列。表达盒也可以是天 然存在但已经以用于异源表达的重组形式获得的。然而一般而言，表达 盒对于宿主是异源的，即表达盒的特定DNA序列在宿主细胞中不天然存 在，必须通过转化事件导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中核 苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子的控制，该启动子 只有在宿主细胞接触某种特定外部刺激物时才起始转录。对于多细胞生 物，如植物，启动子也可能是对特定组织或器官或发育阶段特异的。核 表达盒通常被插入植物的核基因组中，并且能引导该植物核基因组的特 定核苷酸序列的表达。质体表达盒通常被插入植物的质体基因组中，并 且能引导该植物质体基因组的特定核苷酸序列的表达。对于质体表达 盒，为了由质体基因组表达核苷酸序列，可能需要其他元件，即核糖体 结合位点，或阻止质体RNA聚腺苷酸化和随后降解的3’茎-环结构。

“基因”是指一种编码序列或相关的调节序列，其中该编码序列可 转录为RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义 RNA。调节序列的实例是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。 可能存在的其他元件是例如内含子。

在此使用的“异源的”意思是不同自然或合成来源的。例如，如果 用被转化细胞中不存在的核苷酸序列转化宿主细胞，则认为该核苷酸序 列对于该宿主细胞是异源的。转化的核酸可以含有一种异源启动子、异 源编码序列或异源终止序列。此外，转化的核酸也可以是完全异源的， 或者可包含异源和内源核酸序列的任一可能的组合。类似地，异源是指 一种来源于和插入相同天然、原始细胞型的核苷酸序列，但它以非天然 状态存在，例如，具有不同拷贝数，或处于不同调节元件控制之下。

“标记基因”是一种编码选择性或可筛选性状的基因。

如果两种序列位于某处使得调节DNA序列影响编码一种RNA或蛋白 质的DNA序列的表达，那么认为该调节DNA序列与该编码DNA酸序列 “有效连接”或“相关”。

“调节元件”是指参与核苷酸序列表达的序列。调节元件含有一种 与目的核苷酸序列有效连接的启动子，任选地3’序列，如3’调节序列或 终止信号。它们一般也包含核苷酸序列适当翻译所需的序列。

“亚细胞器”是指具有特有结构和功能的细胞内器官。亚细胞器是 例如，液泡、质体、线粒体、细胞核、内质网或质膜。

“同质的”指一种植物、植物组织或植物细胞，其中所有的质体都 是遗传学上相同的。当质体未被转化、突变或以其他方式遗传改变时， 这在植物中是正常状态。在不同的组织或发育阶段中，质体可能有不同 的形式，例如叶绿体、前质体、黄化质体、造粉体、色质体等等。

“启动子”是指起始相关DNA序列转录的DNA序列。启动区也可包 含作为基因表达调节物如激活物、增强剂和/或阻抑物的元件。

“诱导型启动子”是仅当植物接触某些特定的外部刺激物时才起始 转录的启动子，其不同于组成型启动子或对特定组织或器官或发育阶段 特异的启动子。对于本发明特别优选的是化学诱导型启动子和创伤诱导 型启动子。化学诱导型启动子包括植物衍生的启动子，如系统获得性抗 性途径中的启动子，例如PR启动子，如PR-1、PR-2、PR-3、PR-4和 PR-5启动子，尤其是烟草PR-1a启动子和拟南芥PR-1启动子，当植物接 触BTH和相关化学药品时它们起始转录。见美国专利5,614,395，在此 引用作为参考，以及WO 98/03536，在此引用作为参考。化学诱导型启动 子也包括如来源于其他生物的受体介导的系统，如类固醇依赖的基因表 达，例如糖皮质激素、孕酮和雌激素受体系统，铜依赖的基因表达，如 基于ACE1的表达，四环素依赖的基因表达，应用保幼生长激素及其拮抗 剂介导的果蝇(Drosophila)USP受体的Lac阻抑系统和表达系统，这在 WO 97/13864中有述，在此引用作为参考，以及使用受体组合的系统，如 WO 96/27673所述，在此引用作为参考。其他化学诱导启动子包括诱发剂 (elicitor)诱导的启动子、安全剂诱导的启动子及可由特定醇和酮诱导 的alcA/alcR基因活化系统(WO 93/21334；Caddick等人(1998)自然生 物技术(Nat Biotechnol)16：177-180，其内容在此引用作为参考)。创 伤诱导型启动子包括蛋白酶抑制剂的启动子，如来自马铃薯的蛋白酶抑 制剂II启动子，及其他参与创伤应答途径的植物衍生的启动子，如多酚氧 化酶、LAP和TD的启动子。总的见C.Gatz，“基因表达的化学调控”， 植物生理学与植物分子生物学年报，(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)(1997)48：89-108，其内容在此引用作为参考。

“反式激活蛋白”是一种蛋白质，其本身或与一种或多种其他蛋白 质结合，能使编码区的转录受相应反式激活蛋白介导的启动子的控制。 反式激活蛋白系统的实例包括噬菌体T7基因10启动子，其转录激活依赖 于特异的RNA聚合酶如噬菌体T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白一般是一种 RNA聚合酶或DNA结合蛋白，它能通过直接激活启动子或灭活阻遏基 因，例如，抑制阻遏蛋白的表达或积累，与特定的启动子相互作用而起 始转录。DNA结合蛋白可以是一种包含与适当转录激活蛋白结构域连接 的结合区(如GAL4结合区)的嵌合蛋白。某些反式激活蛋白系统可能具 有多种反式激活蛋白，例如对于启动子识别、DNA结合或转录激活不仅 需要聚合酶而且需要特定亚单位(sigma因子)的启动子。反式激活蛋白 优选地对于进行诱导的植物或亚细胞器或植物细胞组分而言是异源的。

“最小启动子”包括启动子元件，特别是TATA元件，其为无活性 的，或可在无上游激活时具有大大降低的启动子活性。在与最小启动子 融合的适当上游激活序列和相应转录因子的存在下，最小启动子允许转 录。

“重组DNA技术”是指用来连接DNA序列的方法，例如，如 Sambrook等人，1989，冷泉港，NY：冷泉港实验室出版社所述。

“可筛选的标记基因”是指一种基因，其表达不能赋予转化细胞选 择优势，但其表达使转化细胞在表型上不同于未转化的细胞。

“选择性标记基因”是指一种基因，其在植物细胞中的表达给予该 细胞一种选择优势。与未转化的细胞的生长相比，用选择性标记基因转 化的细胞所具有的选择优势可能是由于其在负选择剂如抗生素或除草剂 存在下生长的能力。与未转化的细胞相比，转化细胞具有的选择优势也 可能是由于其增强的或新的利用添加的化合物作为养分、生长因子或能 源的能力。选择性标记基因也指在植物细胞中的表达给予该细胞负选择 和正选择优势的基因或基因组合。

“合成的”是指含有天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。 例如，更类似于双子叶植物和/或单子叶植物基因的G+C含量和正常密码 子分布的人工序列被认为是合成的。

“转化”是指核酸向细胞中的导入。特别是，DNA分子向目的生物 基因组中的稳定整合。

序列表中序列简述

SEQ ID No：1寡核苷酸

SEQ ID No：2寡核苷酸

SEQ ID No：3寡核苷酸

SEQ ID No：4寡核苷酸

SEQ ID No：5寡核苷酸

SEQ ID No：6寡核苷酸

SEQ ID No：7寡核苷酸

SEQ ID No：8寡核苷酸

SEQ ID No：9寡核苷酸

SEQ ID No：10寡核苷酸

SEQ ID No：11寡核苷酸

SEQ ID No：12寡核苷酸

SEQ ID No：13寡核苷酸

SEQ ID No：14寡核苷酸

SEQ ID No：15寡核苷酸

SEQ ID No：16寡核苷酸

SEQ ID No：17寡核苷酸

SEQ ID No：18寡核苷酸

SEQ ID No：19寡核苷酸

SEQ ID No：20寡核苷酸

SEQ ID No：21寡核苷酸

SEQ ID No：22寡核苷酸

SEQ ID No：23寡核苷酸

SEQ ID No：24寡核苷酸

SEQ ID No：25寡核苷酸

SEQ ID No：26寡核苷酸

SEQ ID No：27寡核苷酸T73a_U

SEQ ID No：28寡核苷酸T73a_L

SEQ ID No：29寡核苷酸minpsb_U

SEQ ID No：30寡核苷酸minpsb_L

SEQ ID No：31寡核苷酸

SEQ ID No：32寡核苷酸

SEQ ID No：33寡核苷酸

SEQ ID No：34寡核苷酸

SEQ ID No：35寡核苷酸

SEQ ID No：36寡核苷酸

SEQ ID No：37寡核苷酸ErspU

SEQ ID No：38寡核苷酸ErspL

SEQ ID No：39寡核苷酸ErspovL

SEQ ID No：40寡核苷酸AmboeU

本发明公开了表达治疗活性蛋白质特别是抗原的转基因植物。编码 这些蛋白质的DNA分子从植物的质体基因组表达，或在细胞核中表达， 并将该蛋白质导向细胞溶胶或亚细胞器如液泡中。本发明的植物能以节 省成本的方式表达蛋白质，并易于获得。这些植物能以节省成本的方式 表达大量该蛋白质。此外，在质体中表达的治疗活性蛋白质通常被包 装，使纯化和加工特别容易。这种区室化也使治疗分子在消化过程中受 到保护，从而适于经口施用。能用多种方法对包括人、宠物或家畜在内 的宿主施用在根据本发明的转基因植物中表达的治疗活性蛋白质，以预 防或治疗多种疾病，从而改善所治疗的宿主的病情。特别是，本发明的 转基因植物或来源于这些植物的植物材料能被宿主经口摄取，并能优选 地通过诱导宿主对抗原的耐受，用于例如治疗变态反应、自身免疫病或 防止移植排斥。本发明也公开了包含这些植物或来源于这些植物的植物 物质的组合物，如药用组合物，以及通过施用本发明的组合物改善宿主 病情的方法。 在转基因植物中表达的治疗活性蛋白质

本发明的蛋白质优选地能调节宿主的免疫应答，下面给出了实施 例。因此，它们能用来治疗或预防不希望的免疫应答，例如，通过诱导 耐受抑制或降低宿主的免疫应答。此外，它们也能刺激宿主的免疫系 统，从而有助于或导致宿主对疾病如细菌、寄生虫或病毒性疾病的免 疫。

在一个优选的实施方案中，在转基因植物中表达一种蛋白质。在此 情况中，如果对于特殊治疗希望有几种蛋白质，则使用每种表达不同蛋 白质的混合的植物。在另一个优选的实施方案中，在同一转基因植物中 表达几种不同的蛋白质。在此情况中，在转化植物的不同表达盒中包含 编码不同蛋白质的DNA分子，或者另外，这些DNA分子包含于同一表达 盒中。对于从质体基因组的表达，例如，能将编码不同治疗活性蛋白质 的DNA分子构造到一种表达盒中，形成一种多顺反子的信使RNA。为了 简单和明了，本文中提到的“一种”治疗活性蛋白质是指“至少一种” 治疗活性蛋白质，意思是一种或多种蛋白质。治疗有效量的本发明的治 疗活性蛋白质也可从一种植物或从来源于一种植物的植物物质中获得， 或可从多个植物如植物的姊妹株中获得。

根据本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不 限于：玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、洋 白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、萝卜、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大 蒜、胡椒、芹菜、笋瓜、南瓜、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏、甜 瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠萝、鳄 梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、 油籽油菜、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、 黄瓜、拟南芥(Arabidopsis)，草坪草和观赏植物和木本植物如松柏类 和落叶类树。希望的基因转化特定植物种后，即可利用传统繁育技术在 该物种中繁育或转移到相同物种的其他品种中，特别包括商业品种。

本发明也包括食用藻类，如单细胞绿藻(例如衣藻属 (Chlamydomonas))、多细胞绿藻(例如石莼(Ulva))、单细胞红 藻(例如紫球藻属(Porphyridium))和多细胞红藻(例如紫菜属 (Porphyra))，其含有基本上类似于高等植物的质体基因组，可用类 似的方式转化。 治疗活性蛋白质在植物质体中的表达

本发明特别涉及治疗活性蛋白质从植物质体基因组中的表达。在此 情况中，用编码本发明的治疗活性蛋白质的DNA分子转化每种植物细胞 中存在的某些或全部几千个拷贝的环形质体基因组。质体典型的大量转 基因拷贝数使表达水平通常大大超过从核表达基因中通常获得的表达水 平。这种高水平表达进一步降低了在植物中产生治疗活性蛋白质的成 本，而且允许将这些转基因植物用于在植物材料中需要高水平蛋白质的 用途中，例如，在经口摄食植物或植物材料以治疗变态反应、自身免疫 病或预防移植排斥时。质体基因表达也有大量其他优点。例如，由于基 因沉默的缺乏和位置效应变化，转基因表达水平经一定时间仍稳定，多 顺反子操纵子能以协同方式由允许产生等摩尔量的几种蛋白质的单一启 动子或调节序列表达，单亲质体基因遗传防止了大多数经济重要作物中 外源DNA的花粉传送，因而降低了向野生或栽培植物横向转移的可能 性。质体转基因整合也通过同源重组过程发生，意思是，精确导向的改 造和基因替换易于进行。此外，在质体内表达的蛋白质在细胞器中隔 离，因此防止了与胞质环境相互作用。如果植物中表达的蛋白质也显示 对抗植物细胞溶胶某些成分的活性或不利地相互作用，则该特征是必要 的。

美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,576,198；PCT申请 号WO 95/16783和WO 97/32977；和McBride等人，美国国家科学院院报 (Proc.Natl.Acad.Sci.美国)91：7301-7305(1994)中广泛描述了质 体转化技术，在此全部引用作为参考。经biolistics的质体转化最初在单细 胞绿藻莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中进行(Boynton 等人(1988)科学(Science)240：1534-1537，在此引用作为参考)， 很快将利用选择顺式作用抗生素抗性基因座(壮观霉素/链霉素抗性)或 非光合作用突变表型互补的该方法扩展到烟草(Nicotiana tabacum) (Svab等人(1990)美国国家科学院院报87：8526-8530，在此引用作 为参考)。

烟草质体转化的基本技术包括，对叶或愈伤组织的粒子轰击，或具 有侧翼为选择性抗生素抗性标记的克隆质体DNA区的原生质体中PEG介 导的质粒DNA摄取。0.5-1.5kb侧翼区，称为导向序列，利于与质体基因 组的同源重组，因此允许156kb烟草质体基因组特定区的置换或修饰。开 始时，用赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的质体16S rRNA和rps12基因中 的点突变作为转化的选择性标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和 Maliga，P.(1990)美国国家科学院院报87，8526-8530；Staub，J.M. 和Maliga，P.(1992)植物细胞4，39-45，在此引用作为参考)。这产 生稳定的同质转化体，频率为每100次轰击靶叶产生大约一个。这些标记 之间克隆位点的存在使得能产生用于导入外源基因的质体导向载体 (Staub，J.M.和Maliga，P.，EMBO J.12：601-606(1993)，在此引 用作为参考)。通过用显性选择标记一编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3’- 腺苷转移酶的细菌aadA基因置换隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，能 实现转化频率的大大提高(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)美国国家科 学院院报90，913-917，在此引用作为参考)。以前，该标记曾成功地用 于绿藻莱因哈德衣藻质体基因组的高频转化(Goldschmidt-Clermont， M.(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)19，4083-4089，在此引用作为 参考)。最近，用聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取实现了烟草和藓类 Physcomitrella patens的原生质体的质体转化(O’Neill等人(1993)植物 杂志3：729-738；Koop等人(1996)Planta 199：193-201，两者在此都 引用作为参考)。粒子轰击和原生质体转化这两种方法在本发明中都是 适合的。

将编码本发明的治疗活性蛋白质的DNA分子插入包含一种能在植物 质体中表达DNA分子的启动子的质体表达盒中。一种能在植物质体中表 达的优选启动子是从质体基因编码区上游5’侧翼区分离的启动子，它可能 来源于相同的或不同的物种，其天然产物一般存在于大多数质体类型中 包括非绿色组织中存在的质体中。质体中的基因表达不同于核基因表 达，并且与原核生物中的基因表达有关(如Stern等人(1997)植物科学 趋势(Trends in plant Sciences)2：308-315所述，在此引用作为参 考)。质体启动子通常含有原核启动子典型的-35和-10元件，一些质体启 动子由主要在质体基因组中编码的大肠杆菌样RNA聚合酶识别，称为 PEP(质体编码的RNA聚合酶)启动子，而另一些质体启动子由核编码 的RNA聚合酶识别(NEP启动子)。两种类型的质体启动子都适用于本 发明。质体启动子的实例包括clpP基因的启动子，如烟草clpP基因启动子 (WO 97/06250，在此引用作为参考)和拟南芥clpP基因启动子(包含于 拟南芥质体基因组中位点71882与72371之间，其序列可获自Takakazu Kaneko和Satoshi Tabata of the Kazusa DNA Institute，URL： ftp：//genome-ftp.stanford.edu/pub/arabidopsis/chloroplast/)。能在植物 质体中表达DNA分子的另一种启动子来源于质体16S核糖体RNA操纵子 的调节区(Harris等人，微生物学综述(Microbiol.Rev.)58：700-754 (1994)，Shinozaki等人，EMBO J.5：2043-2049(1986)，两篇在此 都引用作为参考)。能在植物质体中表达DNA分子的启动子的其他实例 是psbA启动子或rbcL启动子。质体表达盒优选地也另外含有与本发明的 DNA分子有效连接的质体基因3’非翻译序列(3’UTR)。非翻译序列的 作用优选地是引导转录RNA的3’加工，而不是转录终止。优选地，3’ UTR是质体rps16基因3’非翻译序列或拟南芥质体psbA基因3’非翻译序 列。在另一个优选实施方案中，质体表达盒含有一个poly-G序列段代替3’ 非翻译序列。质体表达盒优选地还含有与本发明的DNA分子有效连接， 在植物质体中有功能的5’非翻译序列(5’UTR)。

质体表达盒包含于质体转化载体中，该载体优选地还含有用于通过 同源重组向质体基因组中整合的侧翼区。质体转化载体可任选地含有至 少一个叶绿体复制起点。本发明也包括用这种质体转化载体转化的植物 质体，其中DNA分子可在植物质体中表达。本发明也包括一种包含该植 物质体的植物或植物细胞，包括其后代。在一个优选实施方案中，该植 物或植物细胞，包括其子代，对于转基因质体而言是同质的。

能在植物质体中表达DNA分子的其他启动子有反式激活蛋白调节的 启动子，优选地对于其中实现表达的植物或亚细胞器或植物细胞成分是 异源的。在这些情况中，将编码反式激活蛋白的DNA分子插入一种适当 的核表达盒中，并将其转化到植物核DNA中。用质体转运肽将反式激活 蛋白导向到质体中。使反式激活蛋白和反式激活蛋白驱使的DNA分子集 合在一起，方法是使选择的质体转化系与含有一种DNA分子的转基因系 杂交，该DNA分子编码添加有质体导向序列的反式激活蛋白，并与一个 核启动子有效连接，或者将含有希望的DNA分子的质体转化载体直接转 化到含有一种DNA分子的转基因系中，该DNA分子编码添加有质体导向 序列的反式激活蛋白，并与一个核启动子有效连接。如果该核启动子是 一种诱导型启动子，特别是化学诱导型启动子，则DNA分子在植物质体 中的表达由化学诱导物的叶施用而激活。这种反式激活蛋白介导的诱导 型质体表达系统优选地是可紧密调节的，在诱导之前无可检测的表达， 在诱导之后有异常高的蛋白质表达和积累。一种优选的反式激活蛋白是 例如病毒RNA聚合酶。该类型的优选启动子是可被单亚基RNA聚合酶识 别的启动子，如T7基因10启动子，它可被噬菌体T7 DNA依赖的RNA聚 合酶识别。优选地将编码T7聚合酶的基因转化到核基因组中，并用质体 转运肽将T7聚合酶导向到质体中。在下文中描述了适用于基因如编码病 毒RNA聚合酶如T7聚合酶的基因核表达的启动子。DNA分子在质体中的 表达可以是组成型的或是诱导型的。DNA分子在质体中的表达也能是器 官或组织特异的。在WO 98/11235中广泛描述了这些不同的实施方案，在 此引用作为参考。 反式激活蛋白或治疗活性蛋白质的核表达

为在特定转基因植物中表达，根据本发明的核苷酸序列可能需要修 饰和优化。在转基因植物中的低表达可能是由于含有在植物中非优选的 密码子的异源核苷酸序列引起的。本领域中公知，所有生物都具有密码 子使用的特殊偏好性，并且能改变本发明所述的核苷酸序列的密码子， 使之符合植物偏好性，而保留由此编码的氨基酸。此外，由至少具有 35％优选地45％以上的GC含量的编码序列可最佳地实现在植物中的高表 达。另外，由于存在可能使信息去稳定的ATTTA基元和可引起不适当聚 腺苷酸化的AATAAA基元，具有低GC含量的核苷酸序列可能在植物中表 达较差。虽然优选的基因序列在单子叶植物和双子叶植物种中都可以充 分表达，但是可以在这些偏好性显示不同时修饰这些序列来适应单子叶 植物或双子叶植物的特殊密码子偏好性和GC含量偏好性(Murray等 人，核酸研究17：477-498(1989))。也可针对导致信息截断的非常 规剪接位点的存在筛选DNA分子。用公开专利申请EP 0 385 962、EP 0 359 472和WO 93/07278所述的方法，利用众所周知的定点诱变、PCR和 合成基因构建技术，进行如上所述需要在DNA分子内进行的所有改变。

为了翻译的有效起始，与起始甲硫氨酸相邻的序列可能需要修饰。 例如，可包括已知在植物中有效的序列。Joshi曾经报道了植物核的合适 的共有区(NAR 15：6643-6653(1987))，Clontech提出另一种共有翻 译起始区(1993/1994目录，第210页)。这些共有序列适于本发明的 DNA分子使用。将这些序列掺入含有该DNA分子的构建体中，直到并包 含ATG(而第二个氨基酸不修饰)，或者直到并包含在ATG之后的GTC (具有修饰转基因的第二个氨基酸的可能性)。

编码反式激活蛋白或治疗活性蛋白质的核苷酸序列在转基因植物中 的表达由在植物中显示有功能的启动子所引导。启动子的选择取决于表 达的时间和空间需要，也取决于宿主物种。本发明的DNA分子在植物中 的表达可以是组成型的或诱导型的，例如化学诱导型的，或者DNA分子 的表达可以是器官或组织特异的。虽然多种来源于双子叶植物的启动子 显示在单子叶植物中也是有效的，并且反之亦然，但理想的是为了在双 子叶植物中的表达选择双子叶植物启动子，为了在单子叶植物中的表达 选择单子叶植物启动子。然而，对于所选择的启动子的来源没有限制； 只要它们在引导核苷酸序列在希望的细胞中表达这一方面有效就足够 了。组成型表达的优选启动子包括CaMV 35S和19S启动子、来源于编码 肌动蛋白或遍在蛋白的基因的启动子。本发明的DNA分子也能在化学调 节的启动子的调节下表达。在专利申请EP 0 332 104和美国专利5,614,395 中详述了用于化学诱导基因表达的优选技术。用于化学诱导的一种优选 启动子是烟草PR-1a启动子。一种优选的启动子是创伤诱导的启动子。曾 经描述了在创伤部位也在植物病原体感染部位表达的多种启动子。理想 地，这种启动子仅在感染部位局部有活性。该种类的优选启动子包括以 下所述的启动子：Stanford等人，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.) 215：200-208(1989)，Xu等人，植物分子生物学(Plant Molec. Biol.)22：573-588(1993)，Logemann等人，植物细胞(Plant Cell) 1：151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22：783- 792(1993)，Firek等人，植物分子生物学22：129-142(1993)，和 Warner等人，植物杂志(Plant J.)3：191-201(1993)。优选的组织特 异性表达模式包括：绿色组织特异性、根特异性、茎特异性和花特异性 表达。适于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基因的 多种启动子，其中许多已经从单子叶植物和双子叶植物中克隆。一种优 选的启动子是来源于磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth 和Grula，植物分子生物学12：579-589(1989))。一种用于根特异性 表达的优选启动子是de Framond(FEBS 290：103-106(1991)；EP 0 452 269)所述的启动子，另一种优选的根特异性启动子是来源于T-1基因 的启动子(de Framond等人FEBS 290：103-106(1991)；EP 0 452 269)。一种优选的茎特异性启动子是美国专利5,625,136所述，引导玉米 trpA基因表达的启动子。本发明优选的实施方案是以根特异的方式表达 DNA分子的转基因植物。更优选的实施方案是以创伤诱导或病原体感染 诱导的方式表达DNA分子的转基因植物。其他启动子有合成启动子，如 Gelvin Super MAS启动子(Ni等人(1995)植物杂志7：661-676)。

除了适当启动子的选择之外，用于在植物核中表达DNA分子的构建 优选地包括与异源核苷酸序列下游有效连接的适当3’序列，如3’调节序列 或转录终止子。几种这样的终止子在本领域中是可获得的和公知的(例 如来自CaMV的tm1和来自rbcS的E9)。在本发明中能使用已知在植物中 起作用的任一可获得的启动子。能将多种其他序列掺入本发明所述的 DNA分子的表达盒中。这包括显示能增强表达的序列如(例如来源于 Adh1和bronze1的)内含子序列和(例如，来源于TMV、MCMV和 AMV的)病毒前导序列。

在另一个优选的实施方案中，将本发明的核表达的DNA分子导向到 植物的亚细胞位置。例如，治疗活性蛋白质从细胞中分泌到质外体中， 或者将治疗活性蛋白质导向特定亚细胞器，如液泡或内质网中。其实现 方法是例如，用本领域众所周知的技术将合适的导向序列与本发明的 DNA分子融合。因此，为向质外体或液泡中导向，蛋白质优选地包含合 适的信号肽，优选地在其N端，其允许蛋白质向细胞器的导向。在一个优 选的实施方案中，将本发明的蛋白质导向液泡中。为了蛋白质向液泡中 的导向，除了N端信号肽之外，蛋白质优选地还包含如来源于烟草壳多糖 酶基因的液泡导向序列，优选地在其C端(Neuhaus等人(1991)美国国 家科学院院报88，10362-10366)。利用优选地包含于如下详述的蛋白 质N端的合适的质体转运肽，也能将本发明的DNA分子所编码的蛋白质的 表达导向质体中。本发明的蛋白质也能导向线粒体中，例如，通过与线 粒体导向序列融合，如N.plumbaginifolia F1-ATP酶β-亚基(Chaumont 等人(1994)植物分子生物学24：631-641)。

在本说明书中另外叙述了适用于植物转化的载体。对于农杆菌介导 的转化，二元载体或携带至少一种T-DNA边界序列的载体是合适的，而 对于直接基因转移，任何载体都是合适的，仅含目的构建体的线性DNA 可能是优选的。在直接基因转移的情况中，能使用单DNA种转化或共转 化(Schocher等人，生物技术(Biotechnology)4：1093-1096 (1986))。对于直接基因转移和农杆菌介导的转移，通常(但不是必 须)用可提供抗生素(卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤)或除草剂(例如 Basta/膦丝菌素或原卟啉原氧化酶的抑制剂)抗性的选择性标记进行转 化。然而，选择性标记的选择对于本发明是不重要的。表达盒和转化载 体的实例在下面更详细地描述。

用大量众所周知的方法将本发明的DNA分子导入植物细胞中。本领 域技术人员应当理解，方法的选择取决于植物类型，即准备转化的单子 叶植物或双子叶植物。转化植物细胞的合适的方法包括显微注射 (Crossway等人，生物技术4：320-334(1986))、电穿孔(Riggs和 Bates，美国国家科学院院报83：5602-5606(1986))、农杆菌介导的转 化(Hinchee等人，生物技术6：915-921(1988))、直接基因转移 (Paszkowski等人，EMBO J.3：2717-2722(1984))和利用购自 Agracetus，Inc.，Madison，Wisconsin and Dupont，Inc.， Wilmington，Delaware的装置的ballistic粒子加速(参见，例如，美国专 利4,945,050；和McCabe等人，生物技术6：923-926(1988)；参见 Weissinger等人，遗传学年述(Annual Rev.Genet.)22：421-477 (1988)；Sanford等人，微粒子科学与技术(Particulate Science and Technology)5：27-37(1987)(洋葱)；Christou等人，植物生理学 87：671-674(1988)(大豆)；McCabe等人，生物技术6：923-926 (1988)(大豆)；Datta等人，生物技术8：736-740(1990)(稻)； Klein等人，美国国家科学院院报，85：4305-4309(1988)(玉米)； Klein等人，生物技术6：559-563(1988)(玉米)；Klein等人，植物生 理学91：440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，生物技术8：833-839 (1990)；和Gordon-Kamm等人，植物细胞2：603-618(1990)(玉 米)；Koziel等人(生物技术11：194-200(1993))(玉米)； Shimamoto等人自然338：274-277(1989)(稻)；Christou等人生物 技术9：957-962(1991)(稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(果园草和 其他Pooideae)；Vasil等人(生物技术11：1553-1558(1993)(小 麦)；Weeks等人(植物生理学102：1077-1084(1993)(小麦)； Wan等人(植物生理学104：37-48(1994)(大麦))；Umbeck等人， (生物技术5：263-266(1987)(棉花)。 治疗活性蛋白质对宿主的施用

本发明的一个优点是转基因植物所表达的治疗活性蛋白质可以通过 多种方式对宿主施用，例如经口、经肠、经鼻、肠道外、特别是肌内或 静脉内、经直肠、局部、经眼、经肺或者通过接触施用等。在一个优选 的实施方案中，向宿主经口施用转基因植物中表达的一种变应原。

在一优选的实施方案中，提取并纯化转基因植物中表达的治疗活 性蛋白质，并用来制备药用组合物。表达的治疗活性蛋白质定位于质体 大大有利于这种提取和纯化。例如，首先离心分离完整的质体，使得该 治疗活性蛋白质的提取和纯化更加容易。在另一优选的实施方案中，依 照本领域过去已知的用来分离蛋白质的常规条件和技术分离纯化蛋白 质，例如抽提、沉淀、层析、亲和层析、电泳等。这样的组合物一般包 含有效剂量的治疗活性蛋白质以及一种或多种、有机或无机、液体或固 体的药学上合适的载体物质。根据本发明生产的治疗活性蛋白质可以以 多种剂型使用，例如片剂、锭剂、散剂、悬剂、溶剂、胶囊、霜剂、软 膏、气雾剂、粉剂或液体溶液，只要该剂型不破坏该蛋白质的生物学活 性皆可。例如，该蛋白质可通过常规混合、研磨、制成糖衣丸、溶解、 冻干或类似的方法制成药用组合物。该蛋白质的剂型依赖于病人的体 重、年龄、体格及药物动力学条件以至施用方法。

若该蛋白质是经肠施用，则可采用固体、半固体、悬液或乳剂形 式，也可与任何药学可接受的载体包括水、悬浮剂、乳化剂化合。本发 明的蛋白质也可用泵或以缓释形式施用，尤其是在作为一种预防方法施 用以预防患者疾病发展时，或是在施用以改善或缓解已发作的疾病时。

依照本发明生产的治疗活性蛋白质特别适用于作为药用组合物口 服施用。口服组合物包括干粉、食品、水性或非水性溶剂、悬液或乳剂 形式的蛋白质。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼 油以及注射用有机酯。水性载体包括水、水-醇溶液、乳剂或悬液，包 括盐水及缓冲的医用肠外载体，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、 葡萄糖加氯化钠溶液、含乳糖的林格氏溶液或不挥发油。在一个优选的 实施方案中，这类组合物单独经口摄入或与食物或饲料或饮料一起摄 入。

在另一个优选的实施方案中，表达本发明的治疗活性蛋白质的转 基因植物或来源于该转基因植物的植物物质作为药用食物经口施用。这 些可食用组合物若为固体形式可通过食用消费，若为液体形式则可通过 饮用消费。在一个优选的实施方案中，转基因植物材料未经预加工步骤 或仅经少许的烹调预备即可直接摄取。例如，在可直接食用的植物部 分，如果实或蔬菜中表达治疗活性蛋白质。优选地，在可食用的植物部 分的质体内表达该蛋白质。任何植物中所有类型的质体皆适用于本发 明。例如，在菠菜或莴苣的叶绿体内、番茄的色质体内或马铃薯的造粉 体内表达蛋白质。在一个可供选择的优选实施方案中，加工该转基因植 物，并摄取加工后回收的植物材料。在本发明中优选使用的加工方法是 通常用于食品或饲料工业的方法。这类方法的终产品仍然包含基本量的 蛋白质，且能便于食用或饮用。该终产品也可与其他食品或饲料形式例 如盐、载体、香料、抗生素等相混合，并以固体、半固体、悬液或乳剂 形式消费。在另一个优选的实施方案中，这些方法包括一个保守的步 骤，例如巴氏消毒、烹调或添加保藏剂及防腐剂。在本发明中使用并加 工任何植物以生产可食用或可饮用的植物物质。例如，当依照本发明使 用烟草植物时，则有必要处理该植物或植物材料以去除其中的有害物质 如尼古丁。在一个优选的实施方案中，一种低生物碱含量的烟草植物用 于本发明中的蛋白质的表达。在一个优选的实施方案中，测定根据本发 明的可食用或可饮用植物材料中治疗活性蛋白质的含量。例如应用该蛋 白质的特异性抗体通过Elisa或Western印迹分析法测定该含量。该测定 用来标准化所摄取的蛋白质的量。例如通过混合具有不同蛋白质水平的 不同批次产品，使每一剂量的可饮用果汁的量都能被标准化，来测定和 调节在果汁如番茄汁中治疗活性蛋白质的量。显然，本发明提供了新型 且有效的方法来生产和施用作为医学食物的植物表达的治疗活性蛋白 质。

在植物中产生且可被宿主食用的治疗活性蛋白质被消化系统吸 收。摄取植物或植物材料，尤其是完整的植物或植物材料，或仅经适度 加工的植物材料的一项益处在于能使该蛋白质包围于植物细胞中或与之 隔绝。因此该蛋白质可以受到至少部分的保护，以在到达大肠或小肠之 前免遭上消化道的破坏，因此可以摄取较高比例的活性蛋白质。

当用于表达本发明的治疗活性蛋白质的植物是烟草时，粗制的所 谓“F2可溶性蛋白质部分”例如能用于治疗施用。另一部分F1通过从 粗制烟草提取物中沉淀高分子量蛋白质而产生。在非转基因植物中，如 美国专利4,347,324所公开的，该F1部分几乎唯一地由核酮糖二磷酸羧 化酶所组成。通过本发明的方法生产的某些转基因治疗活性蛋白质也可 以分配到F1部分中。此时，该F1部分也能用于治疗施用。

对于本发明的治疗活性蛋白质优选的宿主或受体是动物。动物优 选地包括脊椎动物，优选地是哺乳动物。优选地哺乳动物是人、宠物或 伴随动物，如猫、狗、啮齿动物、雪貂、灵长类动物、鱼或鸟或农畜， 如牛、猪、家禽等。 免疫

几种当前所用的疫苗需要昂贵的冷藏，因此不太适用于发展中国 家。而且，针对某些病原体的有效的疫苗仍然不能大量生产，或者对于 广泛分布没有足够的安全性。为改善此状况，乙型肝炎病毒表面抗原已 在植物中表达，并为了对乙肝肝炎病毒接种而通过可食用植物施用(例 如见美国专利5,484,719和5,612,487)。然而，编码该疫苗的基因由该 植物的核基因组表达，仅可获得相对较低的疫苗产量，因此，妨碍了可 食用疫苗的生产。针对致病微生物的免疫也已经尝试进行，在转基因植 物中表达病原体的抗原决定簇对宿主经口施用植物(美国专利 5,654,184；5,679,880；5,689,079)。然而，在此情况中，从转基因植 物核基因组的相对低水平的表达也限制了该方法的商业成功性。

因此本发明的一个优选实施方案是在转基因植物中，尤其是在亚 细胞器内，优选地在液泡内，更优选地在植物质体内表达能诱导宿主对 病原体免疫的抗原，病原体如细菌、寄生虫或病毒病原体，或者使宿主 对毒素免疫。本发明的植物用于人类对下列疾病的免疫，例如：脊髓灰 质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、天花、黄热病、乙型肝炎、流行性感冒、 狂犬病、腺病毒感染、日本乙型脑炎、水痘、痢疾、急性呼吸道感染、 疟疾、百日咳、白喉、破伤风或新生期破伤风。此类蛋白质也方便地用 于免疫动物，以预防疾病，如马的感染、犬瘟热、狂犬病、犬肝炎、细 小病毒病、猫白血病、新城疫、牛疫、猪霍乱、蓝舌病和口蹄疫、布氏 菌病、家禽霍乱、炭疽热和黑腿病，以及原生动物和蠕虫感染所致疾 病。本发明的植物也用于动物，包括人类，对多种毒素或刺激物例如蛇 或蜂毒、蚊子唾液、有毒常青藤等产生免疫。在施用抗原，优选地经口 摄入植物或来源于该植物的植物物质后，宿主被免疫。如免疫学领域众 所周知的，佐剂可以一定量加入到包含本发明的抗原的组合物中，用以 提高该组合物的免疫学活性，从而提高其免疫效果。有关免疫系统和免 疫学反应的信息见于Hood等人(1984)，免疫学(Immunology)， Benjiamin/Cummings Publishing Co，Inc，Menlo Park，CA。 耐受

有关抑制或降低不希望的免疫应答的医学领域也需要改进。动物 的免疫系统是一个对多种特异信号作用的特化细胞和器官的复杂网络。 其主要功能之一是区别“自己”和“非己”。该基本特性可以保护宿 主免受入侵病原体的损害，而不激起针对宿主本身的有害的免疫反应。 一般而言，免疫应答的特征在于淋巴系统中某些细胞引起的细胞反应和 抗体引起的体液反应，由免疫系统遭遇非己抗原决定簇而引发并导致 “非已”的破坏。然而，在一些情况下，“自己”与“非己”之间的 区别变得模糊，导致针对自身某些部分的免疫反应，从而引发自身免疫 病。在另一些情况下，针对特异非己抗原的免疫应答导致不希望的免疫 效果，例如，对非自体组织或器官移植物的排斥，或者针对环境因素的 变态反应的发展。在这些情况下，免疫应答的有效抑制或降低是希望 的。已经尝试了几种策略来达到这一目的。例如，已通过以气雾剂施用 自身抗原预防了某些自身免疫病(美国专利5,641,473和5,641,474)。 其他几种治疗尝试是基于宿主对抗原的口服耐受，其机制是摄入的蛋白 质导致了针对特异外来物质或自身抗原的免疫应答的抑制或降低(例如 见Weiner(1994)，美国国家科学院院报91,10,762-10,765； Friedman等人，(1994)，Grandstein RD(编)：《免疫调控机制》 化学与免疫学(Chem.Immunol.)，Basel，Karger，58卷，259- 290)。口服耐受涉及多种机制，主要的两个机制为活性细胞的抑制或 克隆性无反应性，该机制被认为与小肠粘膜的吸收有关。抗原在肠中被 吸收并呈递于特定的粘膜组织，例如派尔集合淋巴结细胞，该细胞是进 入肠相关免疫系统的入口。这种诱导的低反应性或无反应性与大多数个 体中通常发生的食物变态反应有关，并且是引起对作为饮食成分进入消 化道的多种潜在抗原的耐受的主要途径。在治疗领域，口服胰岛素在I 型糖尿病的治疗方面已经引起了一定缓解(美国专利5,763,396)，口 服I或III型胶原蛋白在自身免疫性关节炎的治疗方面也获得了部分成功 (美国专利5,733,547)。此外，也已进行了口服多形性MHC II类分子 异体肽抑制移植物排斥的尝试(美国专利5,593,698)。在从前的这些 例子中，所用抗原由自然来源纯化。然而，为使口服耐受有效，必须摄 入大量的抗原。如此大的数量对于很多抗原来说难以获得或者代价太 高，尤其对于空气传播的抗原来说，且不易制备于可口服的组合物中。 因此，缺乏足够量的可经口摄入的蛋白质制约了若干类似策略的成功。 最近，尝试了某些移植抗原和自身抗原在转基因植物中的表达，及其肠 内或经口施用(WO/95/08347)。然而，相对低水平的核转基因表达可 能再次阻碍了这些方法的成功应用。

因此，在一个优选的实施方案中，能抑制或降低宿主免疫应答或 炎症的抗原在植物中，尤其是在植物的质体中表达。优选地，对宿主经 口施用这些抗原。表达该类抗原的转基因植物在治疗、预防或缓解疾病 如变态反应、自身免疫性疾病或移植物排斥方面特别有益，优选地通过 诱导宿主对一种或多种抗原的耐受来实现。对于经口摄取来说，表达抗 原的植物或来源于该植物的植物物质既可生着食用，又可经加工如经过 如前所述的加工步骤后食用或饮用。在一个优选的实施方案中，经口摄 取植物或植物物质的结果是诱导宿主对该抗原的耐受。本发明通过由植 物质体基因组表达抗原，首次提供了丰富且廉价的可用于产生口服耐受 的抗原。在一个优选地实施方案中，经改造以过量表达如本发明所述的 特异性肽抗原的可食用植物，是基于药用食物的口服耐受的理想载体。 转基因植物在口服耐受中的使用较当前的方法(生物化学纯化或在细胞 培养系统中的重组表达，以及在转基因牛奶中的蛋白质表达)有许多优 势。这些优势包括每剂的低生产成本，传播哺乳动物病原体的最小危险 性，以及当含有抗原的植物或植物材料作为食物直接消费时不需要或仅 需简单的纯化、加工或包装。

在另一个优选的实施方案中，本发明的抗原与耐受佐剂对宿主共 同施用。该类佐剂如毒素，象霍乱毒素B亚单位(如Arakawa等人， (1998)自然生物技术，16：934-8所述)。该毒素亚单位分子在本领域 已知与粘膜免疫相比可增强口服耐受(Sun等人，PNAS(1996) 93：7196-201)。在本发明中使用的另一种佐剂是大肠杆菌不稳定的肠 毒素B。在一个优选的实施方案中，编码毒素的核酸序列与编码抗原的 核酸序列融合，产生编码一种融合蛋白的DNA分子。如本发明所述产 生含有该DNA分子的植物，并如本发明所述对宿主施用该融合蛋白。 在另一个优选的实施方案中，毒素和抗原以分离的多肽形式在植物中表 达，并如本发明所述对宿主施用。此外，毒素或抗原在不同的植物中表 达，并在结合后再对宿主施用。此外，从不同的生物中获得优选地纯化 毒素，然后与抗原结合，之后对宿主施用。 变应原

变态反应在高比例人群中引起不适，怀疑也对动物有不良影响。 人群中变态反应的强度范围包括从轻微的症状到重型的和急剧的表现， 例如过敏性休克，一般的病理表现包括食物性变态反应、皮肤反应(荨 麻疹或特应性皮炎)，上呼吸道变态反应(例如枯草热或变应性鼻炎) 或下呼吸道变态反应，这是引发哮喘的主要原因(综述，见O’Hehir等 人，(1991)免疫学年报(Annu.Rev.Immunol.9：67-95)。变态反应 一般归因于针对各种类型变应原(例如羊毛、动物鳞屑、昆虫粪便或灰 尘以及食物变态原)的过度的IgE反应，并且通常伴有炎症反应。IgE- 抗原相互作用的病理表现特别是由于肥大细胞脱颗粒引起，导致了组 胺、肝素、白三烯的释放。目前的药物治疗主要是非特异的，以一种处 理方式进行，例如使用抗组胺药、肾上腺素—肥大细胞脱颗粒的拮抗 剂。也已经发展了更特异的治疗，其基于定期注射亚变态剂量的变应 原，导致宿主对该变应原的脱敏。然而，这样的注射令人生厌，而且脱 敏仅仅致力于或根本没有与变态反应有关的T细胞反应。因此，脱敏注 射经常仅有有限的疗效。本发明提供了新型的、特异的方法来治疗变态 反应，方法是在植物中表达编码变应原的DNA分子，并对宿主施用该 类植物或来源于该类植物的植物材料。这样的植物或植物材料优选地对 宿主经口施用，其产生对该变应原的耐受。婴儿或年轻个体若其家谱显 示他们可能在以后的生活中有变态反应性疾病发作的危险，也可采取预 防方法来防止变态反应的发生。此外，依据本领域已知的方法提取并纯 化本发明的转基因植物中表达的变应原，并通过定期注射亚变态反应剂 量的该变应原使宿主对其脱敏。

用于本发明的合适变应原包括食物变应原、药物变应原、毒液变 应原、植物变应原、真菌变应原、细菌变应原、动物变应原以及其他来 源于自然发生或人工合成物质的变应原及其提取物。食物变应原包括， 例如海鲜、草莓、新鲜水果和蔬菜、花生以及牛奶。药物变应原包括， 例如青霉素和胰岛素。毒液变应原包括，例如蜜蜂、黄蜂和蚊子毒液。 优选的变应原为蜜蜂毒液肽PLA-2。植物变应原包括，例如花粉来源的 变应原，如树木花粉、草花粉、杂草花粉。真菌变应原包括，例如霉菌 孢子。动物变应原包括，例如狗、猫、马等来源的鳞屑或唾液。本发明 优选的变应原为马尘螨变应原，如来源于粉尘螨(Dermatophagoides farinae)和屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的变应原，优 选地为Der f I，Der f II，Der p I和Der p II变应原(美国专利 5,552,142、5,770,202和5,798,099)。可供选择的优选变应原来源于黑 麦草花粉，例如来源于Lolium perenne，包括Lol p V的分离肽(美国 专利5,710,126)。进一步可供选择的优选变应原包括来源于约翰逊草 花粉的变应原，如Sor h I，为来源于高粱(Sorghum halepense)的主 要变应原(美国专利5,480,972和％，710,126)。进一步优选的变应原包 括豚草属花粉变应原，象Amb a I和Amb a II变应原(美国专利 5,698,204)。进一步优选的变应原也包括桤木的Aln g I变应原(桤木 属(Alnus)的种)、榛树的Col a I变应原(榛属(Corylus)的种) 以及桦树的Bet v I变应原(桦属(Betula)的种)，如美国专利 5,693,495所述。其他变应原包括猫抗原，如Feld I变应原(美国专利 5,328,991)，和狗鳞屑变应原，如Can f II(美国专利5,939,283)。其 他变应原也包括源自蚊子埃及伊蚊(Aedes aegypty)的rAed a 1和 rAed a 2变应原(WO 98/04274)以及蜜蜂毒液抗原(Lomnitzer和 Rabson(1986)，变态反应与临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.78：25-30)或鼠尿蛋白(Gurka等人，(1989)，变态 反应与临床免疫学杂志83：945-954)。

此外，已经表明过敏反应和IgE介导的反应是可分的，并且二硫键 与过敏性反应有极大关联。去除粉尘螨Der f II变应原中与二硫键形成 有关的半胱氨酸残基，已经显示出可极大地降低过敏反应而不改变变态 反应的表位(Takai等人，(1997)，自然生物学技术(Nature Biotechnolohy)，15：754-758)。本发明也包括以缺失二硫键的方式修 饰的变应原的表达。通过本领域众所周知的技术在质体转化载体中克隆 编码变应原的DNA分子，产生转基因植物。本发明的植物或植物材料 对宿主单独施用或与针对变态反应的其他治疗相结合施用。 转基因植物中表达的抗原

在转基因植物，尤其是在植物质体中表达抗原是本发明的一个优 选实施方案。优选地，这样的抗原能调节需要的宿主的免疫系统，达到 所期望的治疗效果。表达该类抗原的转基因植物在治疗、预防或改善疾 病如变态反应、自身免疫性疾病或移植物排斥方面或在免疫程序中特别 有益，优选地通过诱导宿主对一种或多种抗原的耐受。该转基因植物可 通过本领域已知的不同方法对宿主施用，优选地经口施用，优选地通过 食用或饮用本发明的植物或来源于该植物的植物物质。 自身免疫病抗原或自身抗原

自身免疫病是动物，包括人类免疫系统的功能障碍，其中免疫系 统不能区别动物体内的外源物质和是动物正常组合物一部分的特质。因 无免疫耐受，T细胞或B细胞(或两者)共同出现携带受体，允许其识 别和攻击自身成分。这导致含有此类T细胞或B细胞的宿主产生自身免 疫病。已经诊断多种疾病至少部分是由自身抗原引起。例如，血细胞是 受影响的最常见的细胞类型，导致疾病如形成抗血小板抗体的血小板增 多性紫癜，或有抗多形核白细胞的自身抗体形成的恶性中性白细胞减 少。溶血和贫血也已经报道在一些情况下是由靶向于红细胞表面的自身 抗体引起的。抗细胞表面受体抗体通过干扰受体功能也能导致疾病发 生，例如在重症肌无力中，其中形成抗乙酰胆碱受体抗体，因此阻止了 神经肌肉传递。抗受体自身抗体刺激受体有相反效果，也已经在格雷夫 斯病或甲状腺功能亢进中发现。此外，怀疑或者已知为免疫耐受丧失的 疾病的其他实例包括如多发性硬化症、糖尿病、系统性红斑狼疮、多 软骨炎、系统性硬化病、Wegeners肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝 炎、银屑病、Steve-Johnson综合征、原发性口炎性腹泻、自身免疫性 炎性肠病(包括如溃疡性结肠炎和局限性肠炎)、结节病、原发性胆汁 性肝硬化、色素层炎(腹面和后面)、干燥性角膜结膜炎和春季角膜结 膜炎、间质性肺纤维化、银屑病性关节炎和肾小球肾炎(有或无肾病综 合征，如包括特发性肾病综合征或最轻微的肾病改变)以及关节炎(例 如风湿性关节炎、慢性progrediente关节炎和变形性关节炎)。

对于自身免疫病如变态反应，目前的药疗法极大地缺少特异性， 并且经常产生不满意的副作用，例如宿主的全身性免疫抑制。因此本发 明一个优选的实施方案就是通过在植物质体中表达自身抗体靶定的自身 抗原提供对自身免疫病的新型治疗。该类植物或来源于该类植物的植物 物质对需要的宿主优选地经口施用，优选地通过宿主食用或饮用。因而 建立了宿主对特异自身抗体的耐受，而不影响该宿主的总体免疫应答能 力。本发明的植物或植物材料单独与免疫抑制剂或抗炎剂，包括环孢菌 素、雷帕霉素、FK506以及类固醇一起对宿主施用。

本发明优选的自身抗原为，例如，胶原蛋白，优选地为I型或III 型胶原，用以治疗或预防关节炎，优选地为风湿性关节炎(见美国专利 5,733,547)，髓鞘碱性蛋白用以治疗或预防多发性硬化病，S抗原用以 治疗或预防自身免疫性uveoretinitis，胰岛素用以治疗或预防I型糖尿 病(见美国专利5,763,396)，谷氨酸脱羧酶或胰岛细胞特异性抗原用 以治疗或预防糖尿病，甲状腺球蛋白用以治疗或预防自身免疫性甲状腺 炎，乙酰胆碱受体用以治疗或预防重症肌无力。

用本领域众所周知的技术在质体转化载体中克隆编码自身抗原的 DNA分子，或将其导入转化载体中进行核转化，产生转基因植物。 移植抗原

十分需要移植物或移植以替换严重受损的组织或器官。来源于个 体自身的移植物(自体移植物)通常获得成功，但若移植物是来源于相 同物种的遗传不相似的个体(同种异体移植物)或来源于不同物种的个 体(异种移植物)，若不使用免疫抑制药物则一般不会成功。不经持续 的免疫抑制药物治疗，移植器官会被排斥。因此，诱导对移植器官耐受 以提高同种或异种移植物成功机率的一般性方法具有很大的潜力，并且 在本发明中得到阐述。

移植排斥由针对可区别供体和宿主的细胞表面抗原的免疫应答激 活。该类细胞表面抗原主要属于组织相容性抗原，尤其是主要组织相容 性复合物(MHC)。I类或II类MHC基因产物与呈递抗原有关。因 此，它们在通过T细胞识别非己抗原中非常重要，在移植排斥中起重要 作用。I类MHC复合物包含一种与b2微球蛋白一部分连接的跨膜糖蛋 白同型二聚体(重链，HC)(Bjorkman等人(1987)，自然， 329：506)。已鉴别了三类Ia基因座(在人类为HLA-A、B和C，在鼠中 为H-2K、H-2D、H-2L)，和编码HC的一部分的几种Ib类基因座 (York和Rock(1996)，免疫学年报，14：369-396)。II类MHC是由 两种糖蛋白a和b链构成的异型二聚体(Brown等人(1993)，自然， 364：33)。由于MHC基因座在脊椎动物，尤其是在哺乳动物中保守 (Klein(1986)，《主要组织相容性复合物的自然历史》，牛津： Blackwell Sci.)，编码MHC抗原的DNA分子也能从多种哺乳动物，包 括猪中分离，后者为异种移植优选的供体。

通过单克隆抗体靶向II类分子削弱了移植排斥，已经进一步证实 了MHC抗原在移植排斥中的重要性。因此，在涉及移植物受体对供体 特异的MHC决定簇的耐受的治疗中，MHC抗原为良好的候选物。最 近，已经尝试了某些转基因抗原和自身抗体在转基因植物中的表达，以 及肠内或口施用(WO/95/08347)。然而，相对较低水平的核转基因表 达可能再一次排除这些方法的成功结果。

本发明中，从植物质体基因组或核基因组中表达MHC基因，尤其 编码I类MHC的一部分的基因和编码a或b链的II类MHC基因。优选 地在组织或器官移植(同种或异种移植)之前或之后，对宿主施用包含 该类质体的转基因植物，以诱导宿主耐受。优选地，对宿主经口施用该 类植物或来源于该类植物的物质，以诱导宿主的口服耐受。将编码I类 MHC HC基因不同已知同种异型的DNA分子及编码a或b链的II类 MHC基因导入转基因植物中。对于特殊移植中的应用，确定供体和受 体双方的同种异型，并且优选地对受体经口施用包含所选的供体MHC 抗原的植物物质。对宿主单独施用或与免疫抑制剂包括如环孢菌素一起 施用本发明的植物或植物物质。 其他治疗活性蛋白质

本发明中的植物中表达的其他治疗活性蛋白质例如，但并不仅限 于，血液蛋白质(如凝血因子VIII和IX、补体因子和补体、血红蛋白或其 他血液蛋白质、血清白蛋白等)、激素(如胰岛素、生长激素、甲状腺 激素、儿茶酚胺、促性腺激素、PMSG、营养激素、催乳素、催产素、 多巴胺、牛生长激素、肥胖蛋白(leptin)等)、生长因子(如EGF、 PDGF、NGF、IGF等)、细胞因子(如白细胞介素、CSF、G-CSF、 GMCSF、EPO、TNF、TGFa、TCHb、干扰素等)、酶(组织纤溶 酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、类固醇合成酶、激 酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白 酶、脂酶、磷酯酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经 氨酸酶等)、激素或其他受体(如类固醇蛋白、肽、脂类或前列腺素 等)、结合蛋白(如类固醇结合蛋白、生长激素或生长因子结合蛋白 等)、免疫系统蛋白(如抗体、抗体片段、嵌合抗体、可变区等或 MHC基因)、抗原(如细菌、寄生虫、病毒性抗原、变应原、自身免 疫病抗原、移植抗原等)、翻译或转录因子，癌蛋白或原癌蛋白、乳蛋 白(如酪蛋白、乳白蛋白、乳清等)、肌肉蛋白质(如肌球蛋白、原肌 球蛋白等)、髓蛋白、神经活性肽(如脑啡肽)、胶原蛋白、抗脓毒肽 (如BPI(杀菌通透性增强蛋白))或肿瘤生长抑制蛋白或肽，如制管 张素或内皮生长抑制素，两者皆可抑制血管生成。 杀菌通透性增强蛋白(BPI)在植物中的表达

本发明也涉及BPI或其片段在转基因植物中，尤其是在亚细胞器 中，优选地在空泡或更优选地在植物质体中的表达。BPI是一种分离自 哺乳动物多形核白细胞(PMN)颗粒的蛋白质，PMN是哺乳动物中抵 御侵入的微生物所必需的血细胞(美国专利5,641,874；Wilde等人。 (1994)，生物化学杂志，269：17411-17416)。BPI是一种具有广谱 抗革兰氏阴性菌活性的强杀菌剂(见例如美国专利5,753,620、5, 827,816和5,763,567，在此引用作为参考)。BPI在细胞毒作用中 表现出高度的特异性，即10-40nM(0.5-2.0微克)，对敏感菌产生大 于90％的杀灭率，而100倍浓度的BPI对于其他微生物和真核细胞无 毒。分离自人和兔PMN的BPI已被纯化为同质。人BPI的分子量大约为 58,000道尔顿(58kDa)，兔BPI的分子量大约为50kDa。由于精确选 择性以及对革兰氏阴性菌以外的细胞无细胞毒性，本发明的BPI片段特 别可用作特异治疗剂。当前革兰氏阴性菌的感染，例如由大肠杆菌、多 种沙门氏菌、克雷伯氏菌或者假单胞菌引起的感染通过抗生素治疗，例 如青霉素衍生物、氨基糖苷类抗生素和氯霉素。因革兰氏阴性杆菌倾向 于对目前多种可用抗生素产生明显的内在抗性，并且由于抗性因子质粒 的获得而易于产生另一种抗性，抗生素疗效受到限制。然而，在重组体 系中的BPI生产一直有问题，并且假如为治疗效率优选的以克计才能达 到治疗效果的话，从哺乳动物细胞中纯化并不合算。所需高剂量的一个 原因是BPI从血流中的快速清除率。因此本发明优选的一个实施方案是 在植物质体基因组中表达编码BPI或BPI片段的DNA分子。质体中高产 量的表达在这种情况下尤其有益。

当用于治疗因革兰氏阴性菌所引起的菌血症(即细菌出现在血流 中)或者脓毒症(体液的细菌污染)时，根据本发明所生产的BPI或 BPI片段优选地通过肠胃外施用，并且以每次治疗约1-1000μg，优选地 约10-250μg的剂量，最优选地静脉内施用。治疗疗程和次数可根据疾 病的严重程度因个体而不同。典型治疗方案可包括静脉施用大约100μg BPI片段，每日3次。为避免快速灭活，BPI或BPI片段可与生理上可接 受的载体，例如正常存在的血清蛋白质(如白蛋白或溶菌酶)偶联。本 发明的BPI或BPI片段也能局部用于治疗患皮肤感染的哺乳动物，该感 染发生于患褥疮性溃疡(褥疮)卧床不起的病人或烧伤病人，由敏感的 革兰氏阴性菌引起。在一个优选的实施方案中，每次剂量为1-1000μg 的本发明的BPI或BPI片段可与抗生素混合使用。在另一个本发明优选 的实施方案中，治疗感染革兰氏阴性菌哺乳动物的药用组合物，除含有 标准剂量(本领域众所周知)的抗生素如青霉素G(可获自E.R.Squibb 和Sons，Inc.，Princeton，N.J.)或头孢菌素(可获自Eli Lily & Co.， Indianapolis，Ind.)外，还可包含本发明的BPI片段。在一个特别优选 的实施方案中，本发明的BPI片段也可与疏水性抗生素混合，如利福 平，以及疏水性青霉素，例如苄星青霉素V(Lederle Labs，Pearl River，N.Y.)。经BPI治疗后增加的革兰氏阴性菌通透性预计可增强 不易进入非通透性细菌的该类抗生素的疗效。

本发明的BPI或BPI片段预计理想地适用于使用对革兰氏阴性菌有 效的任何抗生素、免疫系统细胞或因子，例如T细胞或白细胞介素-2、 细胞毒性剂等的共同治疗。由于更加具有致病性的光滑的革兰氏阴性菌 对本发明的BPI片段敏感性的增加，本发明的BPI片段预计可降低该类 细菌对上述因子的抗性。基本上同时施用本发明的BPI片段与所选择的 抗生素是优选的。在另一个优选的实施方案中，BPI或BPI片段根据如 上所述的实施方案经口摄取，优选地用于治疗消化系统细菌感染。该蛋 白质作为药用组合物施用或作为药用食品摄取。

BPI也显示在病症的治疗中具有活性，包括中和肝素的抗凝集活 性，抑制血管发生、肿瘤及内皮细胞增殖，以及慢性炎症疾病的治疗 (见美国专利US5807818，在此引用作为参考)。

将参照下列详细实施例进一步描述本发明。这些实施例只是为了说 明，除非另外指明而不意在限制。

实施例

此处使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中众所周知，并 被描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，《分子克隆：实验 室指南》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L. Berman和L.W.Enquist，《基因融合实验》，冷泉港实验室，冷泉港， NY(1984)和Ausubel，F.M.等人，《现代分子生物学方法》，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interseience出版(1987)。 实施例1：通过RT-PCR扩增对短豚草(Ambrosia artemisiifolia)花粉 Amb a I.1 cDNA的分离

用酚/SDS法(《现代分子生物学方法》)从100mg脱脂花粉 (Greer Laboratories)中分离总RNA。使用oligo(dT)18引物用 Advantage RT-for-PCR试剂盒(Clontech)由0.5mg总RNA合成第一链 cDNA。单链DNA作为模板用于使用Pfu Turbo DNA聚合酶试剂盒 (Stratagene)PCR扩增Amb a I.1 cDNA(Rafnar等人(1991)生物化 学杂志266：1229-1236)，其中使用下列寡核苷酸：“顶链”引物，向 Amb a I.1的翻译起始位点加入了一个NcoI位点(5’-GCG GCC ATG GGG ATC AAA CAC TGT TGT TA-3’，SEQ ID NO：1)，“底链”引 物，向3’非翻译区中终止密码子之后加入一个XbaI位点(5’-GCG GTC TAG ATC ATT ATA AGT GCT TAG T-3’，SEQ ID NO：2)。用NcoI 和XbaI消化1.2kb带用于亚克隆，对完整cDNA测序，并与GenBank保 藏号M80558比较。观察到7bp的差异，但这些差异均未改变氨基酸组 成。 实施例2：用于向烟草质体基因组中同源重组的载体的构建

为了经同源重组插入嵌合基因，修饰烟草质体基因组的trnV和 rps12/7基因间隔区。由烟草质体基因组PCR扩增1.78kb区(位点139255- 141036，Shinozaki等人(1986)EMBO J.5：2043-2049)，并在位点 140169之后插入一个PstI位点，产生位于PstI插入位点5’和3’的915bp和 867bp侧翼质体DNA。用在位点139255之前插入一个BsiEI位点(5’-TAA CGG CCG CGC CCA ATC ATT CCG GAT A-3’，SEQ ID NO：3)和 在位点140169之后插入一个PstI位点(5’-TAA CTG CAG AAA GAA GGC CCG GCT CCA A-3’，SEQ ID NO：4)的引物对进行PCR扩增 (Pfu Turbo DNA聚合酶，Stratagene，La Jolla，CA)。也用在位点 140170之前插入一个PstI位点(5’-CGC CTG CAG TCG CAC TAT TAC GGA TAT G-3’，SEQ ID NO：5)和在位点141036之后插入一个BsiWI 位点(5’-CGC CGT ACG AAA TCC TTC CCG ATA CCT C-3’，SEQ ID NO：6)的引物对进行PCR扩增。将PstI-BsiEI片段插入pBlueseript SK+(Stratagene)的PstI-SacII位点，产生pAT216，并将PstI-BsiWI片 段插入pBluescript SK+的PstI-Acc65I位点，产生pAT215。pAT218含确 1.78kb的质体DNA，其含有PstI位点用于嵌合基因和选择性标记的插入， 通过将pAT215的2.0kb PstI-ScaI片段与pAT216的2.7kb PstI-ScaI带连接 而构建。 实施例3：烟草16S rRNA基因启动子和rbcL基因的rbs的扩增

由烟草DNA(烟草cv.Xanthi)PCR扩增16S rRNA启动子，并与烟 草质体rbcL基因的合成核糖体结合位点(rbs)融合。“顶链”引物在位 点102568之前在16S rRNA基因启动子5’末端插入一个EcoRI位点(5’- GCC AGA ATT CGC CGT CGT TCA ATG AGA ATG-3’，SEQ ID NO：7)。“底链”引物扩增到16S rRNA基因启动子的位点102675，通 过改变位点102661(A改为C)和102670(A改为C)除去两个上游 ATG，加入rbcL基因的rbs(位点57569-57584)作为引物的5’延伸，并 在rbs的3’末端插入一个BspHI位点(5’-GCC TTC ATG ATC CCT CCC TAC AAC TAT CCA GGC GCT TCA GAT TCG-3’，SEQ ID NO： 8)。凝胶纯化142bp扩增产物，用EcoRI和BspHI酶切，产生含有与rbcL 基因的rbs融合的烟草16S rRNA基因启动子的128bp片段。 实施例4：拟南芥(Arabidopsis)16S rRNA基因启动区的分离

拟南芥质体基因组中的基因顺序相对于烟草(Nicotiana tabacum) —完整质体基因组已知的植物—而言是保守的可能性有利于拟南芥16S rRNA基因启动区的分离。在与拟南芥密切相关的物种白芥子(Sinapis alba)中，16S rRNA基因和缬氨酸tRNA方向如在烟草中一样 (GenBank保藏号CHSARRN1)。经PCR扩增(PfuTurbo DNA聚合 酶，Stratagene，La Jolla，CA)分离拟南芥16S rRNA基因启动区，其 中用总拟南芥(cv“Landsberg erecta”)作为模板，并使用在烟草和白芥 子中都保守的下列引物：“顶链”引物(5’-CAG TTC GAG CCT GAT TAT CC-3’，SEQ ID NO：9)和“底链”引物(5’-GTT CTT ACG CGT TAC TCA CC-3’，SEQ ID NO：10)。使预测的379bp扩增产物成为平 端，其含有对应于烟草质体基因组的核苷酸102508-102872的拟南芥16S rRNA基因启动区(Shinozaki等人(1986)EMBO J 5：2043-2049)，将 其连接到pGEM5Zf(-)(Promega)的EcoRV位点，并进行序列分析和 与烟草16S rRNA基因启动子的对比。 实施例5：烟草质体rps16基因3’非翻译RNA序列(3’UTR)的扩增

使用下列寡核苷酸对由烟草DNA(烟草cv.Xanthi)PCR扩增烟草质 体rps16 3’UTR：用“顶链”引物(5’-CGC GAC TAG TTC AAC CGA AAT TCA AT-3’，SEQ ID NO：11)在紧接编码核糖体蛋白S16的质体 rps16基因的终止密码子之后加入一个SpeI位点，用“底链”引物(5’- CGC TCT GCA GTT CAA TGG AAG CAA TG-3’，SEQ ID NO：12) 在rps16 3’UTR的3’末端加入一个PstI位点。凝胶纯化扩增产物，用SpeI 和PstI消化，产生含有烟草rps16 3’UTR的163bp片段(烟草质体基因组 的位点4941-5093，Shinozaki等人，1986，EMBO J.5：2043-2049)， 其5’侧翼为一个SpeI位点，3’为一个PstI位点。 实施例6：用于质体转化筛选的16S rRNA基因启动子∷aadA基因∷rps16 3’UTR盒的构建

从pRL277中分离aadA基因的编码序列，aadA基因是一种编码提供 壮观霉素和链霉素抗性的氨基糖苷3’腺苷转移酶的细菌基因(Black等人 (1993)分子生物学9：77-84和Prentki等人(1991)基因103：17- 23)。aadA编码序列的5’主要部分从pRL227分离724bp BspHI-BssHII片 段(起始密码子位于BspHI位点)，用pRL277作为模板，通过PCR扩增 在终止密码子20bp之后加入一个SpeI位点来修饰aadA基因的3’剩余部 分，其中使用下列寡核苷酸对：“顶链”引物(5’-ACC GTA AGG CTT GAT GAA-3’，SEQ ID NO：13)和加入一个SpeI位点的“底链”引物 (5’-CCC ACT AGT TTG AAC GAA TTG TTA GAC-3’，SEQ ID NO：14)。凝胶纯化658bp扩增产物，用BssHII、SpeI消化，将89bp片 段与724bp BspHI-BssHII片段上带有的aadA基因5’部分、128bp EcoRI- BspHI PCR扩增片段上带有的16S rRNA基因启动子和rbcL的rbs及 EcoRI-SpeI消化的pLITMUS28载体(New England Biolabs)相连接， 产生pAT223。对pAT223的含有16S rRNA基因启动子-rbs引导的aadA基 因的EcoRI-SpeI 0.94kb片段、163bp含有rps16 3’UTR的SpeI、PstI消化 的PCR片段和EcoRI、PstI酶切的pUC19(New England Biolabs)进行 三路连接，获得含有引导带rps 16 3’UTR的aadA基因的16S rRNA基因启 动子之UTR的pAT229。 实施例7：噬菌体T7基因10启动子的扩增

从pET-3d(Stratagene)PCR扩增噬菌体T7基因10启动子，其中使 用下列寡核苷酸对：“顶链”引物在T7启动子5’末端插入一个EcoRI位点 (5’-CCC GAA TTC ATC CCG CGA AAT TAA TA-3’，SEQ ID NO： 15)，“底链”引物在3’末端插入一个NcoI位点(5’-CGG CCA TGG GTA TAT CTC CTT CTT AAA GTT AAA-3’，SEQ ID NO：16)。凝 胶纯化扩增产物，用EcoRI、NcoI酶切，产生含有T7启动子的96bp片 段。 实施例8：噬菌体T7基因10终止子的扩增

从pET-3d(Stratagene)PCR扩增噬菌体T7基因10终止子，其中使 用下列寡核苷酸对：“顶链”引物在终止子的5’末端插入一个HindIII位 点(5’-GCG AAG CTT GCT GAG CAA TAA CTA GCA TAA-3’，SEQ ID NO：17)，“底链”引物在终止子的3’末端插入一个PstI位点(5’- GCG CTG CAG TCC GGA TAT AGT TCC TCC T-3’，SEQ ID NO： 18)。凝胶纯化扩增产物，用HindIII-PstI酶切，产生含有T7终止子的 86bp片段。 实施例9：拟南芥质体psbA 3’非翻译RNA序列(UTR)的扩增

从拟南芥DNA(生态型Landsburg erecta)PCR扩增拟南芥质体 psbA 3’UTR，其中使用下列寡核苷酸对：“顶链”引物向3’UTR的5’端 添加了一个SpeI位点，并通过将G突变为A(下划线标出)除去了天然序 列中的一个XbaI位点(5’-GCG ACT AGT TAG TGT TAG TCT AAA TCT AGT T-3’，SEQ ID NO：19)，“底链”引物向UTR的3’端添加了 一个HindIII位点(5’-CCG CAA GCT TCT AAT AAA AAA TAT ATA GTA-3’，SEQ ID NO：20)。扩增区域从GenBank保藏号X79898的位 点1350延伸到1552。凝胶纯化218bp PCR产物，用SpeI和HindIII消化， 并与带有T7终止子的HindIII-PstI酶切PCR片段一起连接到pBluescript SK-(Stratagene)的SpeI-PstI位点，产生pPH171。与GenBank保藏号 X79898相比，pPH171的psbA 3’UTR区的序列分析显示在位点1440和 1452处缺失了腺嘌呤核苷酸。 实施例10：用聚鸟苷序列段作为3’UTR替代者的载体的构建

聚鸟苷序列段显示可在体内功能性地替代质体atpB基因3’UTR (Drager等人(1996)RNA 2：652-663)。含有18个连续鸟苷残基，在 5’和3’末端侧翼分别为SpeI、HindIII粘端的polyG序列段是通过使下列两 种激酶处理的寡核苷酸退火而装配成的：(5’-CTA GTG GGG GGG GGG GGG GGG GGA-3’，SEQ ID NO：21)和(5’-AGC TTC CCC CCC CCC CCC CCC CCA-3’，SEQ ID NO：22)。含有SpeI、HindIII 粘端的polyG18序列段与含有T7终止子的HindIII、PstI消化的PCR片段一 起连接到pBluescript SK+(Stratagene)的SpeI，PstI位点，产生 pAT222。 实施例11：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的豚草花粉变应原Amb a I.1编码序列 的嵌合基因的制备

通过含有T7启动子的96bp EcoRI，NcoI PCR片段，含有Amb a I.1 cDNA的1.2kb NcoI，XbaI PCR片段，和含有拟南芥psbA 3’UTR的 pPH171的295bp XbaI，PstI片段和T7终止子，向pGEM-3Z (Stratagene)的EcoRI，PstI位点中的四路连接，构建噬菌体T7基因10 启动子∷Amb a I.1∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终止子盒，产生质粒 pAT230。通过将含有16S rRNA基因启动子-rbs∷aadA∷rps16 3’UTR盒 的pAT229的1.1kb HindIII，EcoRI片段，和带有T7启动子∷Amb a I.1∷psbA 3’UTR∷T7终止子盒的1.6kb EcoRI，PstI pAT230片段，克隆 到pBlueseript SK+(Stratagene)的HindIII，PstI位点，将T7启动子引 导的Amb a I.1基因盒与aadA选择性标记盒相连接，产生质粒pAT234。 将含有Amb a I.1的pAT234的2.7kb PstI带和选择性标记盒连接到pAT218 的PstI位点，并对Amb a I.1基因以与rps12/7ORF相同方向转录时的插入 方向进行筛选，构建质体转化载体pAT238。 实施例12：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和聚鸟苷序列段融合的豚草花粉变应原Amb a I.1编码序列的嵌合基因 的制备

通过含有T7启动子的96bp EcoRI，NcoI PCR片段，含有Amb a I.1 cDNA的1.2kb NcoI，XbaI PCR片段，和带有poly G18序列段的pAT222 的30bp XbaI，HindIII片段，向含有选择性标记、T7终止子和侧翼同源 质体区的pAT238的5.9kb EcoRI、HindIII载体片段中四路连接，并对 Amb a I.1基因以与rps12/7ORF相同方向转录时的插入方向进行筛选，构 建含有T7基因10启动子∷Amb a I.1∷鸟苷序列段∷T7终止子和16S rRNA 基因启动子-rbs∷aadA∷rps16 3’UTR盒的质体转化载体pAT239。 实施例13：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的尘螨变应原Der f I编码序列的嵌合 基因的制备

美国专利5,770,202中描述了Derf I基因的编码序列。该序列用来设计 用于由粉尘螨cDNA扩增Der f I编码序列的PCR引物。通过反转录(对于 Amb a I.1)由从粉尘螨制剂(Greer Laboratories)中提取的总RNA获 得cDNA。噬菌体T7基因10启动子∷Der fI∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终 止子盒如对于pAT230所述构建。T7启动子引导的Der fI基因盒与aadA选 择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+(Stratagene)的HindIII， PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化载体。 实施例14：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的尘螨变应原Der f II编码序列的嵌合 基因的制备

美国专利5,770,202中描述了Derf II基因的编码序列。该序列用来设 计用于由粉尘螨cDNA扩增Der f II编码序列的PCR引物。通过反转录 (对于Amb a I.1)由从粉尘螨制剂(Greer Laboratories)中提取的总 RNA获得cDNA。噬菌体T7基因10启动子∷Der f II∷拟南芥psbA 3’ UTR∷T7终止子盒如对于pAT230所述构建。T7启动子引导的Der f II基 因盒与aadA选择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+(Stratagene) 的HindIII，PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化载体。 实施例15：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的尘螨变应原Der p I编码序列的嵌合基 因的制备

美国专利5,770,202中描述了Derp I基因的编码序列。该序列用来设 计用于由屋尘螨cDNA扩增Der p I编码序列的PCR引物。通过反转录(对 于Amb a I.1)从屋尘螨制剂(Greer Laboratories)中提取的总RNA获 得cDNA。噬菌体T7基因10启动子∷Der p I∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终 止子盒如对于pAT230所述构建。T7启动子引导的Der p I基因盒与aadA 选择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+(Stratagene)的HindIII， PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化载体。 实施例16：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的尘螨变应原Der p II编码序列的嵌合 基因的制备

美国专利5,770,202中描述了Derp II基因的编码序列。该序列用来设 计用于由屋尘螨cDNA扩增Der p II编码序列的PCR引物。通过反转录 (对于Amb a I.1)从屋尘螨制剂(Greer Laboratories)中提取的总 RNA获得cDNA。噬菌体T7基因10启动子∷Der p II∷拟南芥psbA 3’ UTR∷T7终止子盒如对于pAT230所述构建。T7启动子引导的Der p II基 因盒与aadA选择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+(Stratagene) 的HindIII，PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化载体。 实施例17：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的约翰逊草花粉变应原Sor h I编码序列 的嵌合基因的制备

美国专利5,480,972中描述了Sor h I基因的编码序列。构建噬菌体T7 基因10启动子∷Sor h I∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终止子盒。T7启动子引 导的Sor h I基因盒与aadA选择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+ (Stratagene)的HindIII，PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化 载体。 实施例18：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的桦树花粉变应原Bet V I编码序列的嵌 合基因的制备

Breiteneder等人(1989)EMBO J.8：1935-1938描述了Bet V I基因 的编码序列。构建噬菌体T7基因10启动子∷Bet V I∷拟南芥psbA 3’ UTR∷T7终止子盒。T7启动子引导的Bet V I基因盒与aadA选择性标记盒 连接，并插入pBluescript SK+(Stratagene)的HindIII，PstI位点。然 后如实施例11所述构建质体转化载体。 实施例19：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的蚊子唾液变应原rAed a1编码序列的 嵌合基因的制备

WO 98/04274中描述了rAed a1基因的编码序列。构建噬菌体T7基 因10启动子∷rAed a1∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终止子盒。T7启动子引导 的rAed a1基因盒与aadA选择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+ (Stratagene)的HindIII，PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化 载体。 实施例20：在烟草质体转化载体中含有与噬菌体T7基因10启动子和终止 子和拟南芥质体psbA 3’UTR融合的谷氨酸脱羧酶(GAD)编码序列的 嵌合基因的制备

人GAD基因的编码序列从Genbank(保藏号L16888)获得。构建噬 菌体T7基因10启动子∷GAD∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终止子盒。T7启动 子的引导GAD基因盒与aadA选择性标记盒连接，并插入pBluescript SK+ (Stratagene)的HindIII，PstI位点。然后如实施例11所述构建质体转化 载体。 实施例21：含有与噬菌体T7基因10启动子和终止子和烟草质体转化载体 中拟南芥质体psbA 3’UTR融合的甲状腺球蛋白编码序列的嵌合基因的制 备

甲状腺球蛋白基因的编码序列从Genbank(保藏号U93033)获得。 构建噬菌体T7基因10启动子∷甲状腺球蛋白∷拟南芥psbA 3’UTR∷T7终 止子盒。T7启动子的引导甲状腺球蛋白基因盒与aadA选择性标记盒连 接，并插入pBluescript SK+(Stratagene)的HindIII，PstI位点。然后 如实施例11所述构建质体转化载体。 实施例22：烟草质体基因组的Biolistic转化

每板七个，以1″环形排列于T琼脂培养基上，使烟草c.v.’Xanthi nc’ 的种子萌发，并在播种12-14天后，基本如Svab，Z.和Maliga，P. (1993)PNAS 90，913-917所述，用质粒DNA包被的1μm钨颗粒 (M10，Biorad，Hercules，CA)轰击。将轰击的秧苗在T培养基上温 育两天，之后切下叶子，远轴侧朝上置于亮光下(350-500μmol光子 /m2/s)，于含有500μg/ml壮观霉素二盐酸盐(Sigma，St.Louis，MO) 的RMOP培养基板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P. (1990)PNAS 87，8526-8530)。轰击3-8周后在漂白叶下出现的抗性苗 被亚克隆至相同的选择培养基上，使之形成愈伤组织，分离并亚克隆第 二批苗。独立亚克隆中完全分离的转化的质体基因组拷贝(同质状 态)，用Southern印迹标准技术(Sambrook等人(1989)《分子克 隆：实验室手册》，冷泉港实验室，冷泉港)评价。BamHI/EcoRI消化 的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)植物分子生物学报告5，346- 349)在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移至尼龙膜上 (Amersham)，用32P-标记的随机引物DNA序列探查，该序列对应于含 有一部分rps7/12质体导向序列的pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段 (见专利申请WO 98/11235)。同质的苗在含有壮观霉素的MS/IBA培养 基(McBride，KE.等人(1994)PNAS 91，7301-7305)上无菌生根， 并将其转移到温室中。 实施例23：与烟草PR-1a启动子融合的质体导向的噬菌体T7 NRA聚合酶 基因的构建

将以下片段连接，构建pPH110：一种合成寡核苷酸接头，其含有一 个NcoI限制位点和ATG起始密码子，随后是rbcS基因(编码核酮糖二磷 酸羧化酶的小亚基)的前7个质体转运肽密码子和内源PstI限制位点(顶 链：5’-CAT GGC TTC CTC AGT TCT TTC CTC TGC A-3’，SEQ ID NO：23；底链：5’-GAG GAA AGA ACT GAG GAA GC-3’，SEQ ID NO：24)，pCGN4205(McBride，K.E.等人(1994)，PNAS 91，7301- 7305)的2.8kb PstI/SacI DNA片段，其含有与rbcS基因转运肽编码序列 3’部分在框架内融合的噬菌体T7 RNA聚合酶基因(T7 Pol)，pCIB296 的0.9kb NcoI/KpnI DNA片段，其含有烟草PR-1a启动子，在起始密码子 处有一个引入的NcoI限制位点(Uknes等人(1993)植物细胞5，159- 169)，和二元农杆菌转化载体pSGCGC1(pGPTV-Hyg的衍生物，含有 克隆到SacI/HindIII位点的来源于pGEM4(Promega，Madison WI)的 多接头)的4.9kb SfiI/KpnI和6.6kb SacI/SfiI片段。 实施例24：嵌合PR-1a/T7 Pol基因通过农杆菌介导的叶盘转化向烟草核 基因组中的导入

将烟草‘Xanthi’和“NahG”(Friedrich等人(1995)植物分子 生物学29：959-68)的叶盘与带有pPH110二元载体的GV3101农杆菌共培 育，如述从由此获得的幼苗再生为潮霉素抗性NT-pPH110烟草植物。对 于每个转基因系，大约2-3cm2的双叶钻孔在3ml BTH(5.6mg/10ml)或 无菌蒸馏水中，于约300μmol/m2/s照射下温育2天。收获叶物质，急冻， 并在液氮中磨碎。提取总RNA(Verwoerd等人(1989)NAR 17， 2362)，使用放射性标记的T7 RNA聚合酶基因探针如述(Ward等人 (1991)植物细胞3，1085-1094)进行Northern印迹分析。将显示一定 程度T7 Pol表达的19个NT-110X(Xanthi遗传背景)和7个NT-110N (NahG遗传背景)的T1系植物转移到温室中并自花传粉。连锁的潮霉素 抗性标记3∶1分离的子代自体受精，选择纯合的T2系。 实施例25：豚草变应原在转基因植物质体中表达的诱导

用含有PR-1a-T7 RNA Pol构建体的纯合NT-110X和NT-110N植物对 携带母体遗传的pAT238和pAT239构建体的同质质体转化系授粉。Nt_ pAT238×NT-110X或NT_110N，和Nt_pAT239×NT-110X或NT_110N F1子代(其对于PR-1/T7聚合酶核表达盒是杂合的，对于T7/Amb a I.1质 体表达盒是同质的)在土壤中发芽。达到20-40cm的高度后，向植物喷洒 诱导化合物BTH以引发定位于质体的Amb a I.1基因的T7 Pol调节的表 达。在诱导前及诱导后8小时及1、2、3、7和14或28天时收获植物材料， 在液氮中急冻。对含有Der fI、Sor h I、Bet V I和rAed a 1变应原基因和 GAD和甲状腺球蛋白基因的转基因植物使用类似的方法。 实施例26：转基因植物的抗原表达与含量的测定

提取总RNA(Verwoerd等人(1989)NAR 17，2362)，并如述 (Ward等人(1991)植物细胞3，1085-1094)用放射性标记的Amb a I.1基因特异的探针进行Northern印迹分析。为了测定转基因植物组织中 存在的Amb a I.1的量，根据使用说明书和Harlow和Lane(1988)《抗 体：实验室指南》(Antibodies：A laboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，用抗Amb a I.1蛋白的抗血清 和纯化的Amb a I.1蛋白质标准进行化学发光(Amersham)Western印迹 分析。对于Der f I、Sor h I和Bet V I、rAed a 1变应原，和GAD和甲状 腺球蛋白使用类似的方法。 实施例27：大鼠中口服耐受的诱导

使用重150-220g(6-8周龄)的雌性Lewis或Wistar Furth大鼠。用 在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的50μg豚鼠抗原在两只后足垫中免疫大 鼠。在某些实验中，向乳化的抗原中加入50μg卵清蛋白(OVA) (Sigma)，并类似地注射。为了诱导口服耐受，大鼠以3天间隔5次喂食 本发明的转基因植物。免疫9天后，处死大鼠，并取出其腘淋巴结。通过 将淋巴结压过不锈钢筛制备单细胞悬液。一式四份在圆底96孔平板 (Costar)中将总共105个淋巴结细胞(LNC)与指定数量的来源于喂大 鼠的照射(2000 Rads)或完整的LNC一起培养。向培养液中加入体积为 20μl的抗原(50μg/ml)。培养物温育80小时，并在培养的最后16小时 用1μCi[3H]TdR/孔脉冲标记。然后用自动细胞收集器收集培养物，并 用标准液体闪烁计数仪读数。然后计算引发的(primed)LNC (PLNC)增殖的百分数。在所有实验中均使用增殖培养基RPMI (Gibco)。该培养基在加入2×10-5M 2-巯基乙醇、1％丙酮酸钠、1％青 霉素和链霉素、1％非必需氨基酸和1％自体血清后，无菌过滤。

实施例28：抗体的测定 A.抗体的血清水平

固相酶联免疫吸附试验(ELISA)用于测定针对抗原的抗体滴度。 用每孔0.1ml 10μg抗原/ml重蒸馏水温育微量滴定板。平板在25℃下温育 18小时。用PBS/吐温-20 pH7.5(Bio-Rad)洗涤3次后，平板在37℃下 用3％BSA/PBS温育2小时。洗涤2次，一式四份加入100μl稀释血清。平 板在37℃下温育2小时。用PBS/吐温-20漂洗3次后，平板用在1％ BSA/PBS中1∶1000稀释的100μl/孔辣根过氧化物酶偶联的山羊抗大鼠IgG 抗体(Tago，美国)在25℃温育1小时。通过暴露于含有30％H2O2的邻 苯二胺(0.4mg/ml磷酸盐)柠檬酸缓冲液，pH5.0)获得显色反应。通 过加0.4N H2SO4终止反应，并用ELISA读数仪读取OD 492nm。

B.抗体产生的体外测定

从饲养的、野生的和攻击的大鼠中获得腘和脾LNC，并单独或与其 他指定的PLNC一起照射(2000 Rads)，以每ml 107个细胞的浓度接种 于培养皿。培养物置于含或不含抗原(20μg/ml)的增殖培养基中，在培 养箱中3天，然后收获。稀释的上清液用于测定IgG抗体的体外产生和分 泌，并如前所述用ELISA试验测定抗体产生。 实施例29：小鼠中口服耐受的诱导

使用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。为了诱导口服耐受，对小鼠喂食根 据实施例22由T7/Amb a I.1质体表达盒表达重组豚草的烟草植物的提取 物。更具体而言，对小鼠喂食用T7/Amb a I.1质体表达盒转化的烟草植 物的组分1或组分2，或未转化的对照烟草植物的组分1或组分2作为对 照。野生型的动物分为3个重组豚草饲养组(0.1、1和10mg重组豚草/ 天)和1个未转化的烟草饲养组(作为对照)。每组由8只动物组成。在 动物饲养设施适应期的最初10天之后开始向动物经口施用抗原。通过连 续5-8天每天一次管饲用H2O或磷酸缓冲盐液调节为0.2-0.5ml终体积的相 应的烟草组分，饲养动物。

最后一次经口喂食烟草表达的变应原4天后评价口服耐受的诱导。通 过以2周间隔腹膜内注射重组豚草(10μg/动物)致敏所有4组小鼠3次。 除了重组豚草外，每只小鼠也对卵白蛋白(10μg/动物；Sigma Chemical，St.Louis，MO，美国)致敏，以证明该小鼠能实现对其他抗 原的免疫应答。抗原溶解于0.9％盐水中并与氢氧化铝混合(2∶1；Alu Gel S Serva，Feinbiochemica GmbH，Heidelberg，德国)，得到200μl/小 鼠终体积中的希望的浓度。

收集血清标本4次，用以测定抗原特异的IgE、IgG1和IgG2a水平： 一次在开始口服抗原之前，和三次免疫之每一次的适当时间。等分血 清，贮存于-20℃下直到测定。

所有血清标本均进行捕获固相酶联免疫吸附试验(ELISA)，用以 测定重组豚草和卵白蛋白特异的血清IgE、IgG1和IgG2a水平。96孔微量 滴定板(1mmunoplates MaxisorpTM Surface，Nunc，Roskilde，丹麦) 用每孔0.1ml溶于0.015M碳酸钠碳酸氢钠缓冲液(pH9)的相应抗原 (1-10μg/ml)在37℃下温育2小时，随后4℃过夜。所有洗涤均用含有 0.05％吐温溶液的0.8％盐溶液(pH7.4；洗涤缓冲液；Sigma Chemical)进行。除非另外指出，血清标本、指示性抗体和试剂均用含 有1％加热灭活的胎牛血清的洗涤缓冲液稀释，所有温育均在湿润环境下 进行，反应体积为100μl/孔。包被后，用洗涤缓冲液洗板3次。血清标本 以3倍连续稀释加入抗原包被的孔中，并在37℃下温育2小时。用洗涤缓 冲液洗涤3次后，向板中加入相应的生物素化的指示性抗体(So. Biotechnology Assoc.，Birmingham，AL，美国；Binding Site， Birmingham，英国)37℃ 1小时。洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的 亲和素D检测免疫反应性(1∶3,000，60分钟，37℃；Vector Lab.， Burlingame，CA，美国)。洗涤后，另外用柠檬酸缓冲液(底物缓冲 液，pH5)洗板3次。用溶于底物缓冲液中的邻苯二胺(Sigma Chemical)(0.5mg/ml)和过氧化氢(1μl/ml)检测酶活性，并在1-15 分钟后用4N H2SO4(50μl/孔；Merck KgaA，Darmstadt，德国)终 止。用ELISA读板器于492nm下分光光度测定光密度。最终结果表示为 相对于标准血清集合体(pool)(任意指定为100 REU)的相对ELISA单 位(REU)或绝对蛋白质浓度(μg/ml)。

对于包含Der fI、Sorh I、Bet v I和rAed a1变应原基因和GAD和甲 状腺球蛋白基因或本发明的其他任何抗原的转基因植物使用类似方法测 定口服耐受。

Sato等人，免疫学95：193-199，1998描述了对屋尘螨提取物的口服 耐受的诱导。Passalacqua等人，柳叶刀(Lancet)，351：629-632，1998 描述了人体中的屋尘螨实验。 实施例30：人BPI基因在植物质体中的化学调节的表达

I.含有在噬菌体T7 RNA聚合酶反应性启动子元件控制下的BPI基因 的质体转化载体的构建

将人BPI基因的编码序列(如美国专利5,198,541所述)克隆为182bp NcoI/EcoRI限制片段(含有cDNA的5’部分并在NcoI位点中掺入起始密 码子)和1288 bp EcoRI/XbaI限制片段(含有cDNA序列的3’部分和终止 密码子)。凝胶纯化这些片段，以三路反应与来源于质粒pT7_GUS的 7693 bp NcoI/XbaI片段连接。经DNA测序和限制酶分析证实得到的质粒 (pT7_BPI)在来源于质粒pET3a(Novagen)的T7基因10启动子下游含 有BPI基因，其含有来源于T7基因10前导区的嵌合5’非翻译前导区，序列 为5’-GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC TCT AG-3’(SEQ ID NO：25)，来源于质粒pC8的StuI接头的接头序列5’-CGAGG-3’，和修饰 后在起始密码子处含有NcoI限制位点(以下划线标出)的来源于烟草质 体psbA基因5’前导区的序列5’-GGG AGT CCC TGA TGA TTA AAT AAA CCA AGA TTT TA C  CAT  GG-3’(SEQ ID NO：26)。pT7_GUS 的构建方法是，将凝胶纯化的含有嵌合T7启动子/psbA 5’前导区的质粒 pPH142的386bp EcoRI/NcoI片段与去磷酸化并凝胶纯化的GUS质体转化 载体pC8的9241 bp NcoI/EcoRI片段连接(国际专利申请WO 98/11235)。质粒pPH142的构建方法包括，用BsaBI消化质粒pPH136 (60℃ 2小时)，凝胶纯化，并用BsmFI再次消化线性化的质粒DNA (37℃ 1小时)，用碱性磷酸酶处理(37℃ 1小时，随后酚抽提)，并将 得到的凝胶纯化的3398bp片段与合成的双链寡核苷酸连接，该双链寡核 苷酸是通过将寡核苷酸T73a_U(5’-CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC C-3’， SEQ ID NO：27)与T73a_L(5’-TAG AGG GAA ACC GTT GTG GTC TCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA ATT TCG CGG GAT CG-3’， SEQ ID NO：28)退火，随后用T4多核苷酸激酶磷酸化(37℃ 1小时)而 制备的。在缺乏dam甲基化酶活性的大肠杆菌株(DM-1，Stratagene， La Jolla，California)中扩增质粒pPH136 DNA，以允许用BsaBI消化。 随后构建pPH136，方法是将来源于质粒pPH120的3428 bp凝胶纯化的 StuI/NcoI片段与合成双链寡核苷酸连接，该双链寡核苷酸是通过将寡核 苷酸minpsb_U(5’-GGG AGT CCC TGA TGA TTA AAT AAA CCA AGA TTT TAC-3’，SEQ ID NO：29)与minpsb_L(5’-CAT GGT AAA ATC TTG GTT TAT TTA ATC ATC AGG GAC TCC C-3’，SEQ ID NO：30)退火而制备的。该寡核苷酸包含烟草psbA基因5’非翻译引导序 列的38nt部分，该部分与psbA基因产物在体外质体翻译系统中的翻译上 调有关(Hirose和Sugiura，EMBO J.15：1687-1695，1996)。pPH120 含有psbA启动子-引导的aadA基因的修饰部分和质粒pC8的分歧T7-lac启 动子(来源于Novagen质粒pET21d)，和来源于烟草质体rbcL基因的嵌 合核糖体结合位点，其中插入了酵母DNA的片段，以阻断来源于质粒 pPRV111A的载体所特有的psbA启动子的低水平双向转录活性(AHison 等人，EMBO J.1996 Jun 3；15(11)：2802-9)。pPH120的构建是将酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LEU2基因的256bp EcoRI/HincII片 段，pPH119的2645bp EcoRI/DraIII片段，和pPH119的569bp DraIII/Klenow-补平的EcoRI片段连接。随后构建pPH119，方法包括用 StuI消化质粒pPH118，并重新连接以去除pPH118的pC8衍生嵌合T7启动 子中存在的重复的StuI接头。pPH118含有pC8的235bp SpeI/NcoI片段， 分离并凝胶纯化该片段，然后连接到用NcoI和SpeI消化的克隆载体 pGEM5Zf(+)(Promega，Madison WI)中。 II：用质粒pT7 BPI对烟草质体基因组的Biolistic转化

如实施例22所述进行质体基因组的转化。将轰击3-8周后在漂白叶下 出现的抗性苗亚克隆至相同的选择培养基上，使之形成愈伤组织，分离 并亚克隆第二批苗。独立亚克隆中完全分离的转化的质体基因组拷贝 (同质状态)，用Southern印迹标准技术(Sambrook等人(1989) 《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室，冷泉港)评价。 BamHI/NcoI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)植物分子生物学 报告5，346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移至 尼龙膜上(Amersham)，用32P-标记的随机引物DNA序列探查，该序列 对应于包含一部分rps7/12质体导向序列的来源于pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段。含有预期的1.25kb片段并缺乏野生型3.3kb 片段的同质苗在含壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等人 (1994)PNAS 91，7301-7305)上无菌生根，并将其转移到温室中。 III：用质粒pT7 BPI转化，并携带由BTH-反应性PR-1a启动子控制的含 有在核基因组质体导向序列之噬菌体T7 RNA聚合酶基因的烟草植物中 BPI表达的化学诱导

用烟草系Nt_110X6b-5对C35BPI-5B-4系的同质Nt_pT7_BPI植物授 粉，并检测种子由转化质粒pT7_BPI携带的壮观霉素抗性标记的母体遗 传。使这些F1子代的其他种子在6英寸花盆的土壤中发芽。播种8周后， 向植物喷洒叶面施用的1.0mM BTH直到从叶上流下。收获组织，在应用 BTH后以0、1、2、3、7、14、21、28和35天的间隔分析BPI积累。对同 一系的对照植物喷洒水或惰性成分，而同时使只含质体BPI基因，不含化 学诱导型反式激活蛋白的C35BPI-5B-4植物发芽，并用相同的时间安排以 相同方法测定。用Northern杂交(mRNA)和Western印迹(蛋白质) 标准技术测定BPI的积累。另外，用叶提取物进行活性测定，以估计植物 表达的BPI在革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌)的液体培养基中抑制指数生 长的能力。

实施例31：用于在植物中核表达转基因的表达盒的构建

准备在转基因植物中表达的基因序列首先装配于位于适当启动子之 后并位于适当转录终止子上游的表达盒中。植物表达盒构建的所有要求 均适用于本发明的DNA分子，特别是编码反式激活蛋白或治疗活性蛋白 质的DNA分子，并用本领域众所周知的技术进行。

启动子选择

在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因植物中DNA分子的空 间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、 叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达 DNA分子，这种选择将反映该转基因生物合成的希望的定位。另外，所 选的启动子可在光诱导的或其他时间调节启动子之下引导转基因的表 达。另一个选择是所选的启动子可被化学调节。这将提供仅当希望时和 用化学诱导剂处理时才诱导DNA分子表达的可能性。

3’调节序列

许多3’调节序列可在表达盒中使用。在植物核中，这些序列例如负 责超出转基因的转录的终止及其正确的聚腺苷酸化。适当的转录终止子 和已知在植物中起作用的转录终止子包括CaMV 35S终止子、tml终止 子、胭脂氨酸合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子。它们能用于单子叶植 物和双子叶植物中。

增强或调节表达的序列

已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与转基 因结合使用以增强其在转基因植物中的表达。

多种内含子序列显示能增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例 如，发现当被导入玉米细胞时，玉米Adh1基因的内含子显著增强野生型 基因在同源启动子之下的表达。发现内含子1在与氯霉素乙酰转移酶基 因的融合构建体中特别有效且增强表达(Callis等人，基因发展1：1183- 1200(1987))。在相同的实验系统中，来源于玉米bronzel基因的内含 子在增强表达方面具有类似的作用(Callis等人，同上)。内含子序列已 被常规掺入植物转化载体，一般在非翻译前导区内。已知来源于病毒的 多种非翻译前导序列也可增强表达，且其在双子叶植物细胞中特别有 效。具体而言，来源于烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黄病 斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方 面是有效的(如Gallie等人，核酸研究15：8693-8711(1987)；Skuzeski 等人，植物分子生物学15：65-79(1990))。 实施例32：细胞内基因产物的导向

已知植物中存在多种导向基因产物的机制，并且较详细地表征了控 制这些机制作用的序列。例如，基因产物向质体如叶绿体的导向受在多 种蛋白质氨基端发现的信号序列控制，该信号序列在叶绿体输出过程中 被切下，产生成熟蛋白质(例如，Comai等人，生物化学杂志 263：15104-15109(1988))。这些信号序列能与异源基因产物融合，而实 现异源产物向叶绿体中的输入(van den Broeck等人自然313：358-363 (1985))。能从编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、GS2蛋 白和已知定位于叶绿体的其他多种蛋白质的cDNA的5’端分离编码合适 的信号序列的DNA。所选择的信号序列应包括已知的酶切位点，构建的 融合体应考虑酶切所需的酶切位点之后的任何氨基酸。有时这种需要可 通过在酶切位点和转基因ATG之间加入少量氨基酸，或者另外替换转基 因序列内的某些氨基酸来实现。利用(Bartlett等人，于：Edelmann等 人(编.)《叶绿体分子生物学方法》(Methods in Chloroplast Molecular Biology)，Elsevier.1081-1091(1982)；Wasmann等人，分子普通遗传 学205：446-453(1986))所述的技术，通过体外转录的构建体的体外 翻译，随后体外叶绿体摄取，能检测为叶绿体输入而构建的融合体的叶 绿体摄取效率。因此，将这些信号序列的任一种与编码反式激活蛋白的 核苷酸序列融合，以将反式激活蛋白导向至叶绿体中。上述细胞导向机 制不仅可与同源启动子一起，而且可与异源启动子一起使用，以在表达 模式与产生导向信号的启动子不同的启动子的转录调节下实现特异细胞 导向目的。

其他基因产物定位于其他细胞器如线粒体和过氧化物酶体中(例 如，Unger等人，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)13：411-418 (1989))。也可操作编码这些产物的cDNA，以实现异源基因产物向这些 细胞器的导向。这些序列的实例是核编码的ATP酶和线粒体之特异的天 冬氨酸氨基转移酶同功酶。Rogers等人(美国国家科学院院报82：6512- 6516(1985))描述了向细胞蛋白体的导向。另外，已表征了使基因产物 导向其他细胞区室的序列。氨基端序列负责向ER、质外体的导向，和由 糊粉细胞的胞外分泌(Koehler和Ho，植物细胞2：769-783(1990))。 另外，氨基端序列与羧基端序列一起负责基因产物的液泡导向(Sbinshi 等人，植物分子生物学14：357-368(1990))。

实施例33：表达盒构建的实施例

本发明包括本发明的DNA分子在可在植物中表达的任何启动子调节 下的表达，而不论该启动子的来源如何。因此，用本领域众所周知的技 术将DNA分子插入任何表达盒中。然后可将这些表达盒容易地转移到以 下所述的植物转化载体中。此外，本发明还包括任何植物可表达的启动 子与转基因表达所需或所选的其他任何序列的联合使用。这些序列包括 但不限于，转录终止子、增强表达的外来序列(如内含子[如Adh内含子 1]、病毒序列[如TMV-Ω])和准备将基因产物导向特定细胞器和细胞区 室的序列。

组成型表达：CaMV 35S启动子

质粒pCGN1761的构建在公开的专利申请EP 0 392 225中描述。 pCGN1761含有“双”35S启动子和tml转录终止子，在启动子与终止 子之间具有唯一的EcoRI位点，并且具有pUC型骨架。构建了 pCGN1761的一种衍生物，它含有一个除已有的EcoRI位点外还包含 NotI和XhoI位点的修饰过的多接头。该衍生物被命名为 pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于其多接头内cDNA序列或基因 序列(包括微生物开放阅读框序列)的克隆，其目的是在35S启动子控 制下在转基因植物中表达。该结构的完整的35S启动子-基因序列-tml终 止子盒可从启动子5’侧的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点以及终止子 3’侧的XbaI、BamHI和BglI位点切割，用于向转化载体转移。此外， 可通过用HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI进行5’切割，并用任何多 接头限制位点(EcoRI、NotI或XhoI)进行3’切割，切下双35S启动子 片段，而替换为另一种启动子。

化学调节型启动子下的表达

(1)PR1-a启动子

本部分描述了用选择的任一启动子代替pCGN1761ENX中的双35S 启动子；以举例的方式描述了化学调节型PR-1a启动子。优选地用限制 酶从其来源上切下选择的启动子，但另外也能用具有合适的终止限制性 位点的引物PCR扩增。如果应进行PCR扩增，则启动子应再次测序， 以在靶载体中克隆扩增的启动子之后检查扩增错误。从质粒pCIB1004 (参见EP 0 332 104)上切下化学调节型烟草PR-1a启动子，并转移到 质粒pCGN1761ENX中。用NcoI酶切pCIB1004，通过用T4 DNA聚合 酶处理使得到的线性片段的3’突出部分成为平端。然后用HindIII酶切 该片段，胶凝纯化得到的含PR-1a启动子片段，将其克隆到已去除双 35S启动子的pCGN1761ENX中。其实现方法包括，用XhoI酶切，用 T4聚合酶处理成平端，随后用HindIII酶切，并分离克隆有pCIB1004 启动子片段的较大的含载体终止子片段。这产生一种pCGN1761ENX衍 生物，其含有PR-1a启动子和tml终止子和含唯一EcoRI和NotI位点的 间插多接头。

将编码本发明的DNA分子的核苷酸序列插入该载体中，随后将融合 产物(即启动子-基因-终止子)转移到所选择的任何转化载体中，包括本 申请书中所述的载体，从而准备反式激活蛋白的化学诱导型表达。

(2)乙醇诱导型启动子

可被某些醇类或酮类如乙醇诱导的启动子也用于提供本发明的转基 因的诱导型表达。这种启动子例如是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的alcA基因启动子(Caddick等人(1998)自然生物技术 (Nat BiotechnoI)16：177-180)。在构巢曲霉中，alcA基因编码乙醇脱 氢酶I，其表达由AlcR转录因子在化学诱导剂的存在下调节。对于本发 明，将质粒palcA：CAT中的CAT基因序列—其含有与最小35S启动子 融合的alcA基因启动子序列(Caddick等人(1998)自然生物技术 16：177-180)—替换为编码一种转基因的核苷酸序列，形成在alcA基因 启动子控制下含有编码一种转基因的核苷酸序列的表达盒。这用本领域 众所周知的方法进行。在一个优选的实施方案中，将最小35S启动子替 换为任何方便的最小启动子，例如玉米Bronze-1最小启动子(Roth等人 (1991)植物细胞(The植物Cell)3：317-325)。palcA：CAT中的终止 信号也能替换为本领域众所周知的其他终止信号。产生的构建体转化希 望的植物种。在含有与alcA基因启动子融合的编码本发明的DNA分子 的核苷酸序列的植物中也含有alcR基因，alcR基因的表达由本领域周知 的或此处描述的适用于植物表达的任何启动子控制。因此，实现alcR基 因产物的组织或器官特异性，导致转基因的可诱导的组织或器官特异 性。本领域已知的任何终止信号也适用于alcR表达盒。

(3)糖皮质激素诱导型启动子

也涉及利用基于类固醇激素的系统诱导本发明的DNA分子的表达。 例如，使用糖皮质激素介导的诱导系统(Aoyama和Chua(1997)植物 杂志(The植物Journal)11：605-612)，并通过应用糖皮质激素，如合 成糖皮质激素(优选地塞米松)来诱导表达，浓度优选地为0.1mM-1 mM，更优选地为10mM-100mM。对于本发明，将萤光素酶基因序列 替换为编码一种转基因的核苷酸序列，以形成一种表达盒，该表达盒含 有编码一种与35S最小启动子融合的，在6个拷贝的GAL4上游激活序 列控制下的转基因的核苷酸序列。这用本领域众所周知的方法进行。在 一个优选的实施方案中，将最小35S启动子替换为方便的最小启动子， 如玉米Bronze-1最小启动子(Roth等人(1991)植物细胞3：317- 325)，玉米终止信号也能被替换为本领域众所周知的其他终止信号。得 到的构建体转化希望的植物种。反式作用因子包含与疱疹病毒蛋白VP16 的反式激活域融合(Triezenberg等人(1988)基因发展(基因s Devel.)2：718-729)、与大鼠糖皮质激素受体的激素结合域融合(Picard 等人(1988)细胞54：1073-1080)的GAL4 DNA结合域(Keegan等人 (1986)科学231：699-704)。融合蛋白的表达由本领域众所周知的或此 处所述的适用于植物表达的任何启动子控制。在含有编码与6xGAL4/最 小启动子融合的转基因的核苷酸序列的植物中也含有该表达盒。因此， 实现融合蛋白的组织或器官特异性，导致转基因的可诱导的组织或器官 特异性。本领域已知的任何终止信号也适用于含有融合蛋白的表达盒 的。

组成型表达：肌动蛋白启动子

已知肌动蛋白的几个同种型可在大多数细胞类型中表达，因此肌动 蛋白启动子是组成型启动子的较佳选择。尤其是，稻Act1基因的启动子 已被克隆和表征(McElroy等人，植物细胞2：163-171(1990))。发现该 启动子的1.3kb片段含有在稻原生质体中表达所需的所有调节元件。此 外，已构建了多种基于Act1启动子的表达载体，以特别用于单子叶植物 (McElroy等人，分子普通遗传学231：150-160(1991))。其中掺入了 Actl-内含子1、Adhl 5’侧翼序列和(玉米乙醇脱氢酶基因的)Adhl-内含 子1和CaMV 35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和Actl内 含子或Actl 5’侧翼序列和Actl内含子的融合体。在(GUS报道基因)起 始ATG周围的序列之优化也增强表达。McElroy等人(分子普通遗传学 231：150-160(1991))所述的启动子表达盒可容易地为了本发明DNA分 子的表达而修饰，且尤其适用于单子叶植物宿主。例如，可从McElroy 结构中切下含启动子片段，用它来替换pCGN1761ENX中的双35S启动 子，然后该载体可用于特定基因序列的插入。将这样构建的融合基因转 移至合适的转化载体。在个别报道中，也发现含有第一种内含子的稻 Actl启动子可引导在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等人，植物 细胞报道(Plant Cell Rep.)12：506-509(1993))。

将本发明的DNA分子插入该启动子下游，随后将融合产物(即启动 子-基因-终止子)转移到选择的任何转化载体中，包括本申请书中所述的 载体。

组成型表达：遍在蛋白启动子

遍在蛋白是已知可在多种细胞类型中积累的另一种基因产物，其启 动子已从几个种中克隆，用于转基因植物(如向日葵—Binet等人，植物 科学79：87-94(1991)，玉米—Christensen等人，植物分子生物学 12：619-632(1989))。已在转基因单子叶系统中研究了玉米遍在蛋白，并 且其序列和为单子叶植物转化构建的载体公开于专利公开文本EP 0 342 926中。另外，Taylor等人(植物细胞报道12：491-495(1993))描述了 一种载体(pAHC25)，其包含玉米遍在蛋白启动子和第一种内含子，经 微粒轰击引入时在多种单子叶植物细胞悬液中具有高活性。遍在蛋白启 动子适于在转基因植物尤其单子叶植物中表达核苷酸序列。合适的载体 是通过引入适当遍在蛋白启动子和/或内含子序列而修饰的pAHC25衍生 物或本申请所述的任何转化载体。

拟南芥遍在蛋白3(UBQ3)基因启动子(Norris等人(1993)植物 分子生物学(Plant Mol Biol)21：895-906)也是一种适用于在植物中表 达本发明的转基因的启动子。因此将编码一种转基因的核苷酸序列插入 任一种这类载体中，并用融合产物(即启动子-基因-终止子)转化植物， 引起转基因的组成型表达。

根特异的表达

本发明的转基因的一种优选表达模式是根表达。一种合适的根启动 子是de Framond(FEBS 290：103-106(1991))所述并在公开的专利申 请EP 0 452 269中描述的启动子。该启动子被转移至合适的载体如 pCGN1761ENX中，并向该载体中插入编码一种转基因的核苷酸序列。 随后将完整的启动子-基因-终止子盒转移至目的转化载体中。 创伤诱导型启动子

创作诱导型启动子特别适用于转基因的表达。已描述了许多这类启 动子(例如，Xu等人，植物分子生物学22：573-588(1993)， Logemann等人，植物细胞1：151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植 物分子生物学22：783-792(1993)，Firek等人，植物分子生物学 22：129-142(1993)，Warner等人，植物杂志3：191-201(1993))，且均 都适用于本发明。Logemann等人(同上)描述了双子叶植物马铃薯 wun1基因的5’上游序列。Xu等人(同上)证明双子叶植物马铃薯的创 伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物稻中有活性。此外，Rohrmeier和 Lehle(同上)描述了玉米Wipl cDNA的克隆，其为创伤诱导型，并可 用来使用标准技术分离同源启动子。类似地，Firek等人(同上)和 Warner等人(同上)描述了单子叶植物药用芦笋(Asparagus officinalis)的创伤诱导基因，它在局部创伤和病原体侵入部位表达。使 用本领域众所周知的克隆技术，可将这些启动子转移至适当载体中，与 编码转基因的核苷酸融合，并用来在害虫侵害部位表达这些基因。

髓偏好的表达

专利申请WO 93/07278描述了玉米trpA基因的分离，该基因优先 在髓细胞中表达。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转 移至如pCGN1761的载体中，替换35S启动子，并用来以髓偏好的方式 引导本发明的转基因的表达。实际上，包含髓偏好的启动子或其部分的 片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。编码一种 转基因的核苷酸序列的髓偏好的表达通过向该载体中插入编码转基因的 核苷酸序列而实现。

花粉特异的表达

专利申请WO 93/07278还描述了在花粉细胞中表达的玉米钙依赖的 蛋白激酶(CDPK)基因的分离。该基因序列和启动子从转录起点延伸可 达1400bp。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至如 pCGN1761的载体中，替换35S启动子，并用来以花粉特异的方式引导 本发明的转基因的表达。实际上，包含花粉特异的启动子或其部分的片 段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。

叶特异的表达

Hudspeth和Grula(植物分子生物学12：579-589(1989))描述了 一种编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。应用标准分子生物学技 术，该基因的启动子可用来以叶特异的方式引导本发明的转基因在转基 因植物中的表达。

叶绿体导向的表达

Chen和Jagendorf(生物化学杂志268：2363-2367(1993))曾描 述了用叶绿体转运肽来输入异源转基因的成功应用。所使用的肽是 Nicotiana plumbaginifolia的rbcS基因的转运肽(Poulsen等人，分子普通 遗传学205：193-200(1986))。使用限制酶DraI和SphI，或Tsp509I 和SphI，能从质粒prbcS-8B上切下编码该转运肽的DNA序列(Poulsen等 人，同上)，操作后与上述任何结构一起使用。DraI-SphI片段从相对于 起始rbcS ATG的-58延伸至，并且包括，紧接输入切割位点之后的成熟肽 的第一个氨基酸(也是甲硫氨酸)，而Tsp509I-SphI片段从相对于起始 rbcS ATG的-8延伸至，并且包括，成熟肽的第一个氨基酸。因此，可将 这些片段适当地插入所选的任一表达盒的多接头中，产生与所选启动子 (如35S、PR-1a、肌动蛋白、遍在蛋白等)的非翻译前导序列融合的转 录融合基因，而能使编码转基因的核苷酸序列插入转运肽下游的正确的 融合基因中。这种构建在本领域中是常规的。例如，DraI末端本来就是 平端，而5’Tsp509I位点可经T4聚合酶处理产生平端，或者另外可与接头 或衔接头序列连接，以便于它与所选择的启动子融合。可照此保留3’ SphI位点，或者另外可与接头序列的衔接头连接，以便于它插入所选择 的载体，这样使可得的合适的限制位点可用于随后所选的编码反式激活 蛋白的核苷酸序列的插入。理想的是保留SphI位点的ATG，并包含DNA 分子的第一个ATG。Chen和Jagendorf(出处同上)提供了用于叶绿体输 入的理想切割的共有序列，在所有情况中甲硫氨酸优选地位于成熟蛋白 质的第一个位点。在随后的位点上有更多的变化，并且氨基酸可能不如 此关键。在任何情况中，可用Bartlett等人(在：Edelmann等人(编) 《叶绿体分子生物学方法》，Elsevier，1081-1091页(1982))和 Wasmann等人(分子普通遗传学205：446-453(1986))所述的方法， 评估融合构建体的体外输入效率。一般而言，最好的方法可能是用在氨 基端未修饰的DNA分子产生融合基因，并仅当融合基因显然不以高效率 输入叶绿体时才引入修饰，在这种情况中可根据已有的文献(Chen和 Jagendorf；Wasmann等人；Ko和Ko，生物化学杂志267：13910-13916 (1992))进行修饰。

通过将prbcS-8B的DraI-SphI转运肽编码片段转移至克隆载体 pCGN1761ENX/Sph-中构建一种优选的载体。该质粒用EcoRI酶切，经 T4 DNA聚合酶处理使末端变为平端。用SphI酶切质粒prbc-8B，连接至 退火的分子衔接头。通过T4激酶处理使所得产物5’端磷酸化。随后用 DraI酶切，释放连接于上述修饰载体的平端ex-EcoRI位点的转运肽编码 片段。通过测序鉴定带有方向为插入片段5’端的与35S启动子3’端相邻的 克隆。这些克隆携带35S前导序列与rbcS-8A启动子-转运肽序列的DNA融 合基因，其从相对于rbcS ATG的-58延伸至成熟蛋白质的ATG，并且在 此位点包含唯一的SphI位点、一个新产生的EcoRI位点和已有的 pCGN1761ENX的NotI和XhoI位点。这个新载体被命名为 pCGN1761/CT。DNA序列被符合读框地转移入pCGN1761/C7，方法是 用PCR技术扩增，在用适当酶限制性酶切后将其连入SphI切割的pCGN 1761/CT，在扩增的ATG处插入SphI，NsphI或NIaIII位点。为了方便构 建，需要改变克隆基因的第二个氨基酸，然而在几乎所有情况中，与标 准定点诱变一起使用PCR，能构建在成熟蛋白质的酶切位点和第一个甲 硫氨酸附近的任一希望的序列。

另一种优选载体的构建方法是，用prbcS-8A的BamHI-SphI片段替 换pCGN1761ENX的双35S启动子，前者包含全长的光调节rbcS-8A启动 子，它从-1038(相对于转录开始位点)直到成熟蛋白质的第一个甲硫氨 酸。用PstI和EcoRI酶切带有破坏的SphI位点的经修饰的pCGN1761，并 用T4 DNA聚合酶处理产生平端。用SphI酶切prbcS-8A，连接于上述序列 的退火的分子衔接头上。所得产物经T4激酶处理使5’-端磷酸化。随后用 BamHI酶切释放启动子-转运肽，它包含经T4 DNA聚合酶处理产生 BamHI平端的片段。将如此产生的启动子-转运肽片段克隆到制备的 pCGN1761ENX载体中，产生一种包含rbcS-8A启动子和转运肽并在用来 插入异源基因的切割位点处有一个SphI位点的结构。此外，SphI位点下 游有EcoRI(重新产生的)、NotI和XhoI克隆位点。这个结构被命名为 pCGN1761rbcS/CT。

可以应用其他来源(单子叶和双子叶的)和其他基因的其他GS2叶 绿体转运肽编码序列进行相似的操作。

通过优化翻译起始位点对pCGN1761ENX的修饰

对于该部分中所述的任何构建体，可通过引入可增强翻译的序列进 行克隆位点周围的修饰。当向植物表达盒中导入来源于微生物的基因 时，这是特别有用的，因为这些基因可能不含与适于植物中翻译起始的 起始甲硫氨酸相邻的序列。在向植物表达盒的ATG处克隆来源于微生物 的基因时，修饰其插入位点以优化表达可能是有用的。以举例的方式描 述了pCGN1761ENX的修饰，掺入几种优化序列之一用于植物表达(例 如Joshi，同上)

pCGN1761ENX用SphI酶切，用T4 DNA聚合酶处理并再连接，从 而破坏了位于双35S启动子5’的SphI位点。这产生载体 pCGN1761ENX/Sph-。pCGN1761ENX/Sph-用EcoRI酶切，并连接于退 火的分子接头。这产生载体pCGNSENX，其掺入了准优化的植物翻译起 始序列TAAA-C，该序列与本身是SphI位点一部分的ATG相邻，适于在 其起始甲硫氨酸处克隆异源基因。保留了SphI位点的下游—EcoRI、NotI 和XhoI位点。

构建另一种载体，其在起始ATG处应用NcoI位点。该载体，被命名 为pCGN1761NENX，是通过在pCGN1761ENX EeoRI位点处插入一个退 火的分子接头而制备的。因此，该载体包括准优化的序列TAAACC，它 与在NcoI位点之内的起始ATG相邻。下游位点是EcoRI、NotI和XhoI。 然而在该操作之前，用与以上对SphI所述相似的技术，或者另外用“内 外”PCR(Innes等人，《PCR方法：方法与应用指南》(PCR Protocols：A guide to methods and applications)，Academic Press，纽 约(1990))破坏pCGN1761ENX载体中的两个NcoI位点(位于5’35S 启动子单位的上游位点)。通过向克隆位点中插入任何植物cDNA或报道 基因序列，随后在植物中常规表达分析，能测定该操作对表达的任何可 能的不利影响。

因此，将编码一种转基因的核苷酸序列插入pCGN1761ENX中，用 于在含优化的翻译起始位点的CaMV 35S启动子控制下组成型表达。

实施例34：植物转化载体的构建

许多转化载体可用于植物转化，并且本发明的DNA分子可插入上述 任何表达盒中，使其能在适当条件下在希望的细胞中表达该DNA分子。 然后将含核苷酸序列的表达盒掺入以下所述的任一适当转化载体中。

所用载体的选择将取决于优选的转化技术和用于转化的目标物种。 对于某些目标物种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规 使用的选择标记包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的npfII基因 (Messing和Vierra，基因19：259-268(1982)；Benvan等人，自然 (Nature)304：184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因 (White等人，核酸研究18：1062(1990)，Spencer等人，理论与应用 遗传学79：625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因 (Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)和赋予氨甲 喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)：1099-1104 (1983))，和细菌aadA基因(Goldschmidt-Clermont，1991，核酸研 究(Nucl.Acids Res.)19：4083-4089)，其编码氨基糖苷3’-腺苷基转移 酶并提供对链霉素或壮观霉素的抗性。可使用的其他标记包括提供对除 草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究18：1062(1990)， Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor Appl基因t)79：625-631 (1990))、编码草甘膦抗性的突变EPSP合酶基因(Hinchee等人， 1988，生物技术(Bio/Technology)6：915-922)、提供咪唑啉酮或磺酰 脲抗性的突变乙酰乳酸合酶(ALS)基因(Lee等人，1988，EMBO J.7： 1241-1248)、提供阿特拉津抗性的突变psbA基因(Smeda等人，1993， 植物生理学(Plant Physiol.)103：911-917)或如EP 0 769 059所述的突 变原卟啉原氧化酶基因。

也使用导致正选择的选择标记，如在专利申请WO 93/05163中所述 的磷酸甘露糖异构酶。

也可通过表达可筛查标记基因，如编码氯霉素乙酰转移酶 (CAT)、β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白 (GFP)或赋予转化细胞表型不同的性状的其他蛋白质，实现转化细胞 的鉴定。 (1)适用于农杆菌转化的载体的构建

许多载体可用于应用根瘤农杆菌的转化。它们一般携带至少一个T- DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和 pXYZ的载体。以下描述了两种典型载体的构建。

pCIB200和pCIB2001的构建

二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建农杆菌使用的重组载体，按 以下方法构建。通过用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，细 菌学杂志164：446-455(1985))切下四环素抗性基因，随后插入一个来 自pUC4K的带有NPTII的AccI片段(Messing和Vierra，基因19：259-268 (1982)；Bevan等人，自然304：184-187(1983)；McBride等人，植 物分子生物学14：266-276(1990))，产生pTJS75kan。使XhoI接头与 pCIB7的EcoRV片段连接，该片段包含左和右T-DNA边界、植物选择性 nos/nptII嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等人，基因53：153-161 (1987))，并将XhoI消化片段克隆入SalI消化的pTJS75kan中产生 pCIB200(参见EP 0 332 104)。pCIB200含有下列单一多接头限制位 点：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的 衍生物，它是通过向多接头中插入其他限制位点而产生的。pCIB2001多 接头的单一限制位点是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、 MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除包含这些单一限制位点外， pCIB2001还有植物和细菌卡那霉素的选择性、用于农杆菌介导的转化的 左和右T-DNA边界、在大肠杆菌和其他宿主之间转移的RK2衍生的trfA 功能以及也源自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适用于含有其 自身调节信号的植物表达盒的克隆。

优选地使用多接头，将含本发明的DNA分子的上述任一种植物表达 盒插入pCIB2001中。

pCIB10及其潮霉素筛选衍生物的构建

二元载体pCIB10含有编码植物中筛选所需卡那霉素抗性的基因、T- DNA右和左边界序列，并且掺入宽宿主范围的质粒pRK252的序列，使其 在大肠杆菌和农杆菌中均可复制。其构建由Rothstein等人描述(基因 53：153-161(1987))。已构建了pCIB10的多种衍生物，其中掺入了 Gritz等人(基因25：179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸转移酶基因。 这些衍生物能使在仅有潮霉素(pCIB743)或同时有潮霉素和卡那霉素 (pCIB715、pCIB717)时筛选转基因植物细胞。该载体用来转化含有本 发明的DNA分子的表达盒。 (2)适用于非农杆菌转化的载体的构建

不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的 需要，所以除如上所述包含T-DNA序列的载体外，还可使用缺少这些序 列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄 取(如PEG和电穿孔)、显微注射的转化或花粉转化(美国专利 5,629,283)。载体的选择主要取决于待转化种的优选。下面，描述了某 些典型载体的构建。

pCIB3064的构建

pCIB3064是一种pUC衍生载体，适用于与除草剂basta(或膦丝菌 素)筛选结合的直接基因转移技术。质粒pCIB246包含与大肠杆菌GUS 基因有效地融合的CaMV 35S启动子和CaMV 35S转录终止子，在PCT公 开申请WO 93/07278中有述。该载体的35S启动子在起始位点5’端包含两 个ATG序列。用标准PCR技术突变这些位点以去除ATG，产生限制位点 SspI和PvuII。新限制位点距唯一的SalI位点96bp和37bp，距实际起始位 点101bp和42bp。产生的pCIB246的衍生物命名为pCIB3025。然后通过 SalI和SacI消化从pCIB3025上切下GUS基因，使末端变为平端，并再连 接，产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82从John Innes Centre，Norwich获 得，切下含有产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromo基因s)bar基 因的400bp的SmaI片段，将其插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等 人，EMBO J.6：2519-2523(1987))。这产生了pCIB3064，其含有位 于CaMV 35S启动子和终止子控制下的用于除草剂筛选的bar基因、氨苄 青霉素抗性基因(用于在大肠杆菌中筛选)和具有单一SphI、PstI、 HindIII、BamHI位点的多接头。该载体适用于含有自身调节信号的植物 表达盒的克隆，用来引导本发明的DNA分子的表达。

pSOG19和pSOG35的构建

pSOG35是一种应用大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选 择性标记提供氨甲喋呤抗性的转化载体。用PCR扩增35S启动子 (～800bp)、玉米Adh1基因的内含子6(～550bp)和pSOG10的18bp的 GUS非翻译前导序列。也PCR扩增编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基 因的250bp片段，将这两个PCR片段与pBI221(Clontech)的包含pUC19 载体骨架和胭脂氨酸合酶终止子的SacI-PstI片段装配。这些片段的装配 产生pSOG19，它含有与内含子6序列融合的35S启动子、GUS前导序列、 DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子。pSOG19中的GUS前导序列替换为玉 米萎黄病斑点病毒(MCMV)的前导序列产生载体pSOG35。pSOG19和 pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因，并且具有可用于克隆外源序列 尤其是本发明的DNA分子的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点。

质体转化载体

对于本发明的核苷酸序列在clpP基因启动子元件控制下在植物质体 中的组成型表达，使用质体转化载体pPH143(WO 97/32011的实施例 36)。将该核苷酸序列插入pPH143中，由此代替PROTOX编码序列。该 载体然后用于质体转化和根据壮观霉素抗性对转化体的筛选。此外，也 在pPH143中插入该核苷酸序列，使其代替在psbA基因启动子控制下 aadA的基因。在此情况中，根据对PROTOX抑制剂的抗性筛选转化体。 在另一个实施方案中，用来源于烟草或拟南芥的质体16S核糖体RNA基因 的启动子表达PROTOX编码序列。 实施例35：玉米的质体转化

I型胚发生愈伤组织培养(Green等人(1983)，于：A. Fazelahmad，K.Downey，J.Schultz，R.W.Voellmy，编，基因技术进 展：植物与动物的分子遗传学。迈阿密冬季研讨会，第20卷，Academic Press，N.Y.)从温室生长物质的1.5-2.5mm长的未成熟胚开始。传粉大约 14天后从表面消毒的穗上无菌切下胚。将胚置于含有2％蔗糖和5mg/L草 灭畏的D愈伤组织起始培养基上(Duncan等人(1985)Planta 165：322- 332)，或将胚置于含有3％蔗糖和0.75mg/L 2，4-滴的KM愈伤组织起始培 养基上(Kao和Michayluk(1975)Planta 126：105-110)。随后在暗处 培养胚和胚发生培养物。大约14天后从外植体上切下胚发生反应物。将 胚发生反应物置于含有2％蔗糖和0.5mg/L 2，4-滴的D愈伤组织维持培养基 上，而将来自KM愈伤组织起始培养基的反应物置于含有2％蔗糖和 5mg/L麦草畏的KM愈伤组织维持培养基上。每周向新鲜维持培养基中选 择性传代培养，3-8周后建立高质量密集胚发生培养物。选择活跃生长的 胚发生愈伤组织片作为基因送递的靶组织。在基因送递前大约4小时，将 这些愈伤组织片置于含有含12％蔗糖的维持培养基的靶平板上。这些愈 伤组织片以环形排列，半径为距靶平板中心8mm和10mm.。如DuPont Biolistics手册所述使质粒DNA沉淀于金微载体上。在每次6次轰击的微载 体制备中使用2-3μg的每种质粒。用PDS-1000He Biolistics装置向靶组织 细胞送递基因。Biolistics装置的设置如下：破裂片与巨载体之间8mm， 巨载体与终止筛之间10mm，终止筛与目标之间7cm。每个靶平板用 650psi破裂片轰击两次。在终止筛与靶组织之间放置一个200×200的不锈 钢筛(McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)。

5天后，将轰击的愈伤组织片转移到含有2％蔗糖和0.5mg/L 2，4-滴而 不含氨基酸及含有750或1000nM通式XVII的维持培养基中。转移4-5小时 后或第二天将愈伤组织片置于光架上1小时，于27℃在暗处贮存5-6周。5- 6周初次筛选阶段后，将黄色到白色的组织转移到含有补加有500或 750nM通式XVII的相同培养基的新鲜平板上。转移4-5小时后或在第二 天，将组织置于光架上1小时，在暗处27℃贮存3-4周。3-4周二次筛选阶 段后，将组织转移到含有补加有500nM通式XVII的相同培养基的平板 上。将健康生长的组织置于光架上1小时，并在暗处27℃贮存。每两周传 代培养一次，直到集落大到足以再生时为止。

在这一点上，将集落转移到含有3％蔗糖而不含选择剂的改良MS培 养基(MS3S)中(Murashige和Skoog(1962)植物生理学15：473- 497)，置于光下。向该培养基中加入0.25mg/L环丙嘧啶醇和0.5mg/L细 胞分裂素来诱导胚的萌发，或加入2mg/L苄基腺嘌呤。2周后，对于分别 将再生的集落转移到不含环丙嘧啶醇和细胞分裂素或不含苄基腺嘌呤的 MS3S培养基中。将生根或无根的再生苗转移到含有MS3S培养基的盒 中，最后回收生根的小植物，并转移到温室中的土壤中。 实施例36：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的豚草花粉变应原Amb a I.1编码序列的嵌合基因的制备

通过将Amb a I.1的5’半段作为pAT230的0.83kb NcoI，SalI片段和 Amb a I.1的3’端作为0.39kb SalI，XbaI PCR产生片段插入pPH121的 NcoI，XbaI位点中，以除去Amb a I.1基因3’端的dam甲基化XbaI位点， 而使豚草花粉变应原Amb a I.1编码序列与拟南芥UBQ3启动子(Norris等 人(1993)植物分子生物学21：895-906)融合。用pAT230作为模板并 使用下列引物对进行PCR扩增：“顶链”引物(5’-GTC GCT TTC AAC ACG TTC AC-3’，SEQ ID NO：31)和除去XbaI位点之前的A的“底 链”引物(5’-GCG CTC TAG ACA TTA TAA GTG CTT AGT-3’， SEQ ID NO：32)。凝胶纯化452bp扩增产物，用SalI和XbaI消化，并如 上连接，产生pAT240。含有引导Amb a I.1基因的UBQ3启动子的 pAT240的HindIH-XbaI连接于11.3kb HindIII、XbaI消化的pPH108片 段，产生一种携带组成型表达的Amb a I.1基因的二元载体。 实施例37：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的推断成熟豚草变应原Amb a I.1编码序列的嵌合基因的制备

Amb a I.1具有推断的信号肽切割位点，位点26的丙氨酸预测为残基 +1(Rafnar等人(1991)生物化学杂志266：1229-1236)。用pAT230 作为模板并使用下列寡核苷酸对经PCR扩增修饰Amb a I.1编码序列，以 除去信号肽：“顶链”引物在成熟Amb a I.1蛋白第一个密码子之前放置 了一个ATG，该成熟蛋白质的前20bp和新产生的ATG处的NcoI位点 (5’-GCA CCA TGG CCG AAG ATC TCC AGG AAA T-3’，SEQ ID NO：33)，和“底链”引物(5’-CTA CCA GCC CAT CAA CAG ACT TAC-3’，SEQ ID NO：34)。产生594 bp扩增产物，其含有Amb a I.1基 因的5’端，而不含信号序列。凝胶纯化该片段，用NcoI和ClaI消化，并将 0.35kb片段与作为0.81kb ClaI，XbaI片段的Amb a I.1基因的3’端连接于 pAT240的NcoI，XbaI 4.4kb片段，产生不含与拟南芥UBQ3启动子融合 的信号肽的Amb a I.1基因，将其与终止序列一起克隆到一种二元载体 中。 实施例38：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的粉尘螨主要变应原Der f I编码序列的嵌合基因的制备

将如实施例13所述克隆的尘螨变应原Der f I编码序列与拟南芥UBQ3 启动子融合，并如实施例34所述插入一种二元载体中。 实施例39：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的粉尘螨主要变应原Der f II编码序列的嵌合基因的制备

将如实施例13所述克隆的尘螨变应原Der f II编码序列与拟南芥 UBQ3启动子融合，并如实施例34所述插入一种二元载体中。 实施例40：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的屋尘螨主要变应原Der p I编码序列的嵌合基因的制备

将如实施例13所述克隆的尘螨变应原Der p I编码序列与拟南芥 UBQ3启动子融合，并如实施例34所述插入一种二元载体中。 实施例41：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的屋尘螨主要变应原Der p II编码序列的嵌合基因的制备

将如实施例13所述克隆的尘螨变应原Der p II编码序列与拟南芥 UBQ3启动子融合，并如实施例34所述插入一种二元载体中。 实施例42：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的约翰逊草变应原Sor h I编码序列的嵌合基因的制备

将约翰逊草变应原Sor h I编码序列与拟南芥UBQ3启动子融合，并如 实施例34所述插入一种二元载体中。 实施例43：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的桦树花粉变应原Bet V I编码序列的嵌合基因的制备

将桦树花粉变应原Bet V I编码序列与拟南芥UBQ3启动子融合，并 如实施例34所述插入一种二元载体中。 实施例44：用于在植物中核表达，含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合 的蚊子唾液变应原rAed a 1编码序列的嵌合基因的制备

将rAed a 1编码序列与拟南芥UBQ3启动子融合，并如实施例34所述 插入一种二元载体中。 实施例45：含有与组成型拟南芥UBQ3启动子融合的豚草花粉变应原Amb a I.1编码序列，用于液泡表达的嵌合基因的制备

用含有豚草花粉变应原基因Amb a 1.1的质粒pAT240作为PCR模 板，使用Amb a I.1基因中相对于内源ATG从位点775延伸到799的“顶 链”引物(5’-GCA ACG GTC GCT TTC AAC ACG TTC A-3’，SEQ ID NO：35)和一条“底链”引物(5’-CGC TCT AGA TTA CAT AGT ATC GAC TAA AAG TCC GCA AGG TGC TCC GGG TTG GCA-3’， SEQ ID NO：36)，其序列与Amb a I.1的最后21bp同源，且包括来源于 烟草壳多糖酶基因(Shinshi等人，(1990)植物分子生物学14，357- 368，Neuhaus等人(1991)美国国家科学院院报88，10362-10366)的 21 bp液泡导向序列、相同烟草壳多糖酶基因的最后密码子和XbaI限制位 点。PCR扩增产生447bp产物，凝胶纯化，并用SalI和XbaI消化。将含 有与烟草壳多糖酶液泡导向序列融合的Amb a I.1 3’端的383 bp SalI， XbaI片段与作为pAT240的0.83kb NcoI，SalI片段的Amb a I.15’端连接 到含有UBQ3启动子和载体的pAT240的4.4kb NcoI，XbaI片段。与烟草 壳多糖酶液泡导向序列盒融合的拟南芥UBQ3启动子∷Amb a I.1编码序列 与终止序列一起克隆到一种二元载体中。

质粒pSCH10(Shinshi等人，(1990)植物分子生物学14，357- 368，Neuhaus等人(1991)美国国家科学院院报88，10362-10366)用 作PCR扩增模板，使用氨基酸序列与烟草壳多糖酶23个氨基酸N端信号肽 的前22bp和ATG处的BspHI限制位点同源的“顶链”引物(ErspU 5’- CGG TCA TGA GGC TTT GTA AAT TCA CAG-3’，SEQ ID NO：37)，和序列与烟草壳多糖酶N端信号肽后17 bp同源，与Amb a I.1 基因的推断的成熟5’端的前14bp融合的“底链”引物(ErspL 5’-TGG AGA TCT TCG GCT GCC GAG GCA GAA AGC A-3’，SEQ ID NO：38)。凝胶纯化88 bp扩增产物，用BspHI和BglII酶切，并将含有与 Amb a I.1基因5’端融合的烟草壳多糖酶23个氨基酸N端信号肽，不含天然 信号肽的76bp片段与含有烟草壳多糖酶液泡导向序列的Amb a I.1基因的 3’端—作为BglII，XbaI片段—连接入含有UBQ3启动子和载体的pAT240 的4.4kb NcoI，XbaI片段中。将已经去除天然信号肽的拟南芥UBQ3启动 子∷Amb a I.1基因、N端烟草壳多糖酶信号肽和C端烟草壳多糖酶液泡导 向序列盒与终止序列一起克隆到一种二元载体中。

质粒pSCH10用作PCR扩增的模板，使用序列与烟草壳多糖酶23个氨 基酸N端信号肽的前22 bp和ATG处的BspHI限制位点同源的“顶链”引 物(ErspU)，和序列与烟草壳多糖酶N端信号肽最后17bp同源的“底 链”引物，该信号肽与Amb a I.1前13bp的5’延伸部分融合(ErspovL 5’- AGT GTT TGA TCC CTG CCG AGG CAG AAA GCA-3’，SEQ ID NO：39)。质粒pAT240用作PCR扩增的模板，使用序列与Amb a I.1起 始密码子之后的前25bp同源，并可与引物ErspovL的13bp退火的“顶 链”引物(AmboeU 5’-GGG ATC AAA CAC TGT TGT TAC ATC T- 3’，SEQ ID NO：40)，和在Amb a I.1基因中相对于内源ATG从位点135 延伸到158的“底链”引物。凝胶纯化两种PCR扩增产物，并进行PCR重 叠延伸反应以将两种产物如下融合在一起：在一个PCR反应管中合并2 ml每种纯化扩增产物，并在无引物的情况下进行10个循环，以退火并延 伸融合产物，然后用5ml反应物作为使用“外部”引物ErspU和AmboeL 的PCR扩增的模板。扩增终产物包括烟草壳多糖酶N端23个氨基酸信号 肽，在起始密码子处有一个BspHI位点，并与从ATG后第一个氨基酸到 155bp下游的Amb a I.1基因框内融合。凝胶纯化该产物，用BspHI和 BglII消化，并与作为BglII，XbaI片段的含有烟草壳多糖酶液泡导向序列 的Amb a I.1基因的3’端连接于含UBQ3启动子和载体的pAT240的4.4kb NcoI，XbaI片段中。将拟南芥UBQ3启动子∷Amb a I.1基因、N端烟草 壳多糖酶信号肽和C端烟草壳多糖酶液泡导向序列盒与终止序列一起克隆 到一种二元载体中。 实施例46：含有与烟草PR-1a启动子融合的豚草花粉变应原Amb a I.1编 码序列，用于液泡表达的嵌合基因的制备

切下来源于PR-1aDXhoNco(Uknes等人(1993)，植物细胞5， 159-169)的PR-1a启动子作为903bp XhoI，NcoI片段，将其与含有Amb a I.1基因、N端壳多糖酶信号肽和C端烟草壳多糖酶液泡导向序列的 NcoI，XbaI片段连接于pLITMUS28(New England Biolabs)的XhoI， XbaI位点。将PR-1a启动子∷Amb a I.1基因、N端烟草壳多糖酶信号肽 和C端烟草壳多糖酶液泡导向序列盒与终止序列一起克隆到一种二元载体 中。Xho、NcoI PR-1a启动子片段也与含有除去天然信号肽的Amb a I.1 基因、N端烟草壳多糖酶信号肽和C端烟草壳多糖酶液泡导向序列盒的 NcoI，XbaI片段连接于pLITMUS28的XhoI，XbaI位点。将天然信号肽 已去除的PR-1a启动子∷Amb a I.1基因、N端烟草壳多糖酶信号肽和C端 烟草壳多糖酶液泡导向序列盒与终止序列一起克隆到一种二元载体中。 达到20-40cm高度后，向含有上述嵌合基因的转基因植物喷洒诱导化合物 BTH，以引发Amb a I.1基因的表达。在诱导前及诱导后8小时及1、2、 3、7和14或28天时收获植物材料，在液氮中急冻。

以上公开的实施方案是说明性的。本发明的公开内容将使本领域的 技术人员掌握本发明的多种变化。所有这些明显且可预测的变化都包括 于附加的权利要求书中。

 序列表 <110>Novartis AG <120>口服耐受 <130>S-30674A/S-30675 CGC 2034/2035 <140> <141> <150>US 09/168231 <151>1998-10-07 <150>US 09/167362 <151>1998-10-07 <160>40 <170>PatentIn Ver.2.2 <210>1 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>1 gcggccatgg ggatcaaaca ctgttgtta                                   29 <210>2 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>2 gcggtctaga tcattataag tgcttagt                                    28 <210>3 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>3 taacggccgc gcccaatcat tccggata                                     28 <210>4 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>4 taactgcaga aagaaggccc ggctccaa                                    28 <210>5 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>5 cgcctgcagt cgcactatta cggatatg                                    28 <210>6 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>6 cgccgtacga aatccttccc gatacctc                                   28 <210>7 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>7 gccagaattc gccgtcgttc aatgagaatg                                  30 <210>8 <211>45 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>8 gccttcatga tccctcccta caactatcca ggcgcttcag attcg                  45 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>9 cagttcgagc ctgattatcc                                              20 <210>10 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>10 gttcttacgc gttactcacc                                             20 <210>11 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>11 cgcgactagt tcaaccgaaa ttcaat                                      26 <210>12 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>12 cgctctgcag ttcaatggaa gcaatg                                      26 <210>13 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>13 accgtaaggc ttgatgaa                                               18 <210>14 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>14 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<210>36 <211>54 <212>DNA <213>人工序列 <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>36 cgctctagat tacatagtat cgactaaaag tccgcaaggt gctccgggtt ggca      54 <210>37 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>37 cggtcatgag gctttgtaaa ttcacag                                    27 <210>38 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>38 tggagatctt cggctgccga ggcagaaagc a                                31 <210>39 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>39 agtgtttgat ccctgccgag gcagaaagca                                 30 <210>40 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：寡核苷酸 <400>40 gggatcaaac actgttgtta catct                                      25