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一种含锰生物 纳米材料的合成方法及其应用

阅读：26发布：2020-07-05

专利汇可以提供一种含锰生物纳米材料的合成方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种含锰生物纳米材料的合成方法及其生物医学应用。所述含锰生物纳米材料是由细胞经高锰酸钾处理、超声和纯化所得。该含锰生物纳米材料具备对谷胱甘肽和过氧化氢响应的性质。此外，该含锰生物纳米材料能够装载各种药物，并降低或沉默药物的荧光、毒性、光敏性、溶血等性质，且又能在谷胱甘肽的作用下可控释放并恢复其特定性质。因此，该含锰生物纳米材料可用于催化产氧、谷胱甘肽检测和药物递送等。，下面是一种含锰生物纳米材料的合成方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种含锰生物纳米材料的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过离心将细胞和培养液分离，取离心下层细胞，用缓冲液重悬，然后与高锰酸钾溶液混合反应，结束后超声，离心，取上层液体，透析，即得所述含锰生物纳米材料。
2.根据权利要求1所述的含锰生物纳米材料的合成方法，其特征在于，所述细胞选自细菌、真菌或哺乳动物细胞，所述混合反应的时间5–30分钟，超声15–60分钟。
3.根据权利要求2所述的含锰生物纳米材料的合成方法，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌或益生菌，所述真菌包括酵母菌或里氏木霉，所述哺乳动物细胞包括红细胞、免疫细胞或癌细胞。
4.权利要求1–3任一项所述合成方法所合成的含锰生物纳米材料。
5.权利要求4所述的含锰生物纳米材料在催化产氧中的应用。
6.权利要求4所述的含锰生物纳米材料在谷胱甘肽检测中的应用。
7.权利要求4所述的含锰生物纳米材料作为药物递送载体的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括将所述含锰生物纳米材料与负载药物混合搅拌反应，经离心纯化，即得。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物选自化疗药物、光疗药物或多肽类药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包括盐酸阿霉素、硫酸长春新碱、盐酸米托蒽醌、羟基喜树碱或姜黄素；所述光疗药物包括α,β,γ,δ-四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩对甲苯磺酸盐、孟加拉玫瑰红、光克洛、原卟啉、二氢卟吩e6和四苯基卟啉四磺酸水合物；所述多肽类药物选自蜂毒肽。

说明书全文

一种含锰生物 纳米材料的合成方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种含锰生物纳米材料的合成方法及其生物医学应用，属于生物纳米材料技术领域。

背景技术

[0002] 目前，纳米颗粒的合成主要有三种方法，分别是物理法、化学法和生物合成法。其中，利用物理法制备的纳米材料纯度高、活性高，但易团聚；利用化学法制备的纳米颗粒分散性好，但合成较为复杂、杂质较多，且产物的生物相容性较差。生物合成法，是利用生物介导纳米颗粒的合成。相比于前两种传统方法，生物合成法更加经济简便，且反应条件温和，利用生物法合成的金属纳米颗粒，如银、金、铂、锆、钯、铁、镉以及钛氧化物、氧化锌等金属氧化物，不仅具有特定的形貌，也表现出良好的生物相容性。纳米颗粒生物合成法的一个重要挑战是从参与合成的生物材料中分离出纯净的纳米颗粒。生物体，包括植物、真菌、藻类、放线菌、细菌、病毒和酵母等，因其纯天然和高效性被广泛地作为生物还原剂用于纳米颗粒的绿色合成。但是，极少有利用生物体一步合成含锰纳米材料的报导。

[0003] 另一方面，锰是人体有效控制代谢所必需的微量元素之一。重要的是，二价锰离子可以用作较好的核磁共振造影剂，然而设计和合成高稳定和灵敏度高的二价锰配合物用于临床依然是十分困难的。为了解决这一问题，许多含锰纳米材料被广泛地合成，如二氧化锰纳米片、介孔二氧化硅包裹的空心二氧化锰纳米颗粒、锰掺杂的锆金属有机框架纳米管和牛血清白蛋白稳定的二氧化锰纳米颗粒等，但多步复杂的合成步骤、较高的合成成本和较单一的性质依然阻碍了它们的生物医学发展。

发明内容

[0004] 发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含锰生物纳米材料的合成方法，并通过简单的方法实现药物负载，最终获得载药含锰生物纳米材料，用于生物医学领域。

[0005] 技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0006] 一种含锰生物纳米材料的合成方法，包括以下步骤：

[0007] 通过离心将细胞和培养液分离，取离心下层细胞，用缓冲液重悬，然后与高锰酸钾溶液混合反应，结束后超声，离心，取上层液体，透析，即得所述含锰生物纳米材料。

[0008] 优选，所述细胞选自细菌、真菌或哺乳动物细胞。进一步优选，所述细菌包括大肠杆菌各种益生菌等，所述真菌包括酵母菌或里氏木霉等，所述哺乳动物细胞包括红细胞、免疫细胞等正常细胞和癌细胞等。

[0009] 优选，所述混合反应的时间5–30分钟，超声15–60分钟。

[0010] 本发明还提供了所述合成方法所合成的含锰生物纳米材料。

[0011] 最后，本发明提供了所述含锰生物纳米材料的生物医学应用，例如所述的含锰生物纳米材料在催化产氧中的应用，或者在谷胱甘肽检测中的应用，或者作为药物递送载体的应用，能够用于乏氧改善、可控释药和肿瘤特异性的化学动力学疗法联合治疗癌症。

[0012] 作为药物递送载体应用时，包括将所述含锰生物纳米材料与负载药物混合搅拌反应，经离心纯化，即得。

[0013] 优选，所述药物选自化疗药物、光疗药物或多肽类药物等。进一步优选，所述负载药物包括化疗药物如盐酸阿霉素、硫酸长春新碱、盐酸米托蒽醌、羟基喜树碱和姜黄素等，光疗药物如α,β,γ,δ-四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩对甲苯磺酸盐、孟加拉玫瑰红、光克洛、原卟啉、二氢卟吩e6和四苯基卟啉四磺酸水合物等，多肽类药物如蜂毒肽等，其他分子类药物等，以及上述药物的混合。

[0014] 含锰纳米材料不仅表现出独特的肿瘤微环境响应性，在化学动力学治疗癌症中也有很好的应用前景。因此，本发明利用生物体简单的合成一种含锰生物纳米材料不仅将进一步拓展含锰纳米材料的合成策略，也能够更全面地研究含锰纳米材料的性质和应用，为癌症的治疗提供新的思路。有益效果：本发明创新性地将细胞作为生物还原剂和合成模板，经高锰酸钾处理、超声和纯化得到含锰生物纳米材料。该生物合成方法原料广泛易得且成本低、制备方法简单、无需化学还原剂参与合成、载药简单、稳定、广谱且可智能释放。该含锰生物纳米材料对谷胱甘肽和过氧化氢均有一定响应：能够消耗谷胱甘肽释放锰离子实现化学动力学治疗，同时，能够催化过氧化氢产生氧气改善肿瘤区域的乏氧，增强治疗效果。此外，该含锰生物纳米材料能够装载各种药物，负载药物不限于药物的亲疏水性和所带电荷，并降低或沉默药物的荧光、毒性、光敏性、溶血等性质，且又能在谷胱甘肽的作用下可控释放并恢复其特定性质，从而可用于谷胱甘肽的荧光检测、可控释药和肿瘤特异性的化学动力学疗法联合的癌症治疗。
附图说明

[0015] 图1为本发明含锰生物纳米材料的合成和载药示意图；

[0016] 图2为本发明所得含锰生物纳米材料载阿霉素前的透射电子显微镜图；

[0017] 图3为本发明所得含锰生物纳米材料载阿霉素后的透射电子显微镜图；

[0018] 图4为含锰生物纳米材料体外谷胱甘肽消耗和锰离子释放结果；

[0019] 图5为含锰生物纳米材料体外催化过氧化氢产生氧气的结果；

[0020] 图6为载阿霉素含锰生物纳米材料对不同浓度的谷胱甘肽的荧光响应；

[0021] 图7为载阿霉素含锰生物纳米材料在不同环境下的药物释放；

[0022] 图8为载阿霉素含锰生物纳米材料对正常细胞和癌细胞的毒性评价；

[0023] 图9为载阿霉素含锰生物纳米材料对癌细胞的联合抗癌效果。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图进一步描述本发明的技术解决方案。

[0025] 以下实施例所用细胞可以通过商业化购买获得。

[0026] 实施例1

[0027] 含锰生物纳米材料的合成，包括以下步骤：

[0028] (1)通过离心将大肠杆菌和培养液分离，取离心下层大肠杆菌，用磷酸盐缓冲液重悬；

[0029] (2)将大肠杆菌与高锰酸钾溶液(终浓度为1mg mL–1)摇床反应5分钟，随后进行探头超声15分钟；

[0030] (3)对上述反应产物进行离心，取上层液体，用截留分子量为10kDa的透析袋进行透析，得到纯净的含锰生物纳米材料。

[0031] 该反应的示意图见图1，所得含锰生物纳米材料的透射电子显微镜图见图2。

[0032] 实施例2

[0033] 含锰生物纳米材料的合成，与实施例1基本相同，不同之处仅在于将步骤(1)中的大肠杆菌换成益生菌、酵母菌或红细胞等。

[0034] 实施例3

[0035] 含锰生物纳米材料的合成，与实施例1基本相同，不同之处仅在于将步骤(2)中改为摇床反应30分钟，随后进行探头超声60分钟。

[0036] 实施例4

[0037] 含锰生物纳米材料的载药，将纯净的含锰生物材料与盐酸阿霉素混合搅拌反应，经离心纯化得到载阿霉素含锰生物纳米材料。

[0038] 该反应的示意图见图1，所得载阿霉素含锰生物纳米材料的透射电子显微镜图见图3。

[0039] 实施例5

[0040] 含锰生物纳米材料的载药，与实施例4基本相同，不同之处仅在于将盐酸阿霉素换成羟基喜树碱、孟加拉玫瑰红、原卟啉和蜂毒肽等其他分子类药物。

[0041] 实施例6

[0042] 含锰生物纳米材料体外谷胱甘肽消耗和锰离子释放实验，设置7个实验组，分别为：(1)甲基蓝(超纯水)；(2)甲基蓝+过氧化氢(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)；(3)甲基蓝+过氧化氢+锰离子(超纯水)；(4)甲基蓝+过氧化氢+锰离子(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)；(5)甲基蓝+过氧化氢+锰离子+谷胱甘肽(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)；(6)甲基蓝+过氧化氢+实施例1所得含锰生物纳米材料(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)；(7)甲基蓝+过氧化氢+实施例1所得含锰生物纳米材料+谷胱甘肽(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)。混合后置于37度孵育30分钟后，分别测定溶液紫外–可见吸收光谱。

[0043] 结果见图4，可见在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中过氧化氢和锰离子的共同作用能够使甲基蓝褪色，说明反应产生了羟基自由基使甲基蓝褪色；并且谷胱甘肽的加入除去了部分羟基自由基，使甲基蓝褪色情况减弱。实验组6证明，实施例1所得含锰生物纳米材料中含有少量锰离子，与过氧化氢共同作用使部分甲基蓝褪色。实验组7证明，实施例1所得含锰生物纳米材料经谷胱甘肽作用后，不仅消耗了谷胱甘肽，也释放出锰离子，接着与过氧化氢共同作用使大量甲基蓝褪色。这一实验证明了实施例1所得含锰生物纳米材料的谷胱甘肽消耗以及锰离子释放促进过氧化氢变为羟基自由基的能力。

[0044] 实施例7

[0045] 含锰生物纳米材料体外催化过氧化氢产生氧气实验，设置3个实验组，分别为：(1)过氧化氢；(2)实施例1所得含锰生物纳米材料+过氧化氢；(3)实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料+过氧化氢。用便携式溶解氧测定仪检测10分钟内溶液的实时溶氧情况。

[0046] 结果见图5，可见实施例1所得含锰生物纳米材料和实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料都能够催化过氧化氢分解产生氧气。

[0047] 实施例8

[0048] 载阿霉素含锰生物纳米材料对不同浓度的谷胱甘肽的荧光响应实验，将实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料分别与不同浓度的谷胱甘肽孵育(谷胱甘肽终浓度分别为
0、1、2、5、10、20、30、50、70、100、150、200、300、400、500、700、1000、1200、1500和2000μM)，分别测定混合液在500nm激发光下的荧光发射光谱。

[0049] 结果见图6，可见随着孵育谷胱甘肽浓度的升高，混合液的荧光强度越来越大，表明谷胱甘肽的加入能够恢复所载阿霉素荧光，且这一荧光恢复增强的性质是谷胱甘肽浓度依赖的，因此实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料可用于谷胱甘肽检测。

[0050] 实施例9

[0051] 载阿霉素含锰生物纳米材料在不同环境下的药物释放实验，设置4个实验组，分别为：实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料在(1)pH＝6.5，含谷胱甘肽；(2)pH＝7.4，含谷胱甘肽；(3)pH＝6.5，不含谷胱甘肽；(4)pH＝7.4，不含谷胱甘肽这四种条件下阿霉素的释放量通过紫外特征峰进行监测。

[0052] 结果见图7，可见在谷胱甘肽存在下，阿霉素的释放量明显快且高于不含谷胱甘肽的情况，表明谷胱甘肽能够促进所载药物的释放及性质恢复。

[0053] 实施例10

[0054] 载阿霉素含锰生物纳米材料对正常细胞和癌细胞的毒性评价实验，选择正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7，利用酶标仪采用MTT检测法分别测定阿霉素浓度为0、0.5、1、2、5、10、15和20μg mL–1的实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料对两种细胞的毒性(孵育24小时之后测定)。

[0055] 结果见图8，可见载阿霉素含锰生物纳米材料对癌细胞的毒性远高于对正常细胞的，表明了该药物对癌细胞的选择性杀伤效果。

[0056] 实施例11

[0057] 载阿霉素含锰生物纳米材料对癌细胞的联合抗癌效果实验，选择乳腺癌细胞MCF-7，利用酶标仪采用MTT检测法分别测定阿霉素浓度为0、0.5、1、2、5、10、15和20μg mL–1的游离阿霉素和实施例4所得载阿霉素含锰生物纳米材料对MCF-7分别作用的毒性(孵育24小时之后测定)。

[0058] 结果见图9，可见载阿霉素含锰生物纳米材料的毒性高于游离阿霉素的，表明载阿霉素含锰生物纳米材料中不仅释放的阿霉素起到抗癌作用，实施例8证明的产生的羟基自由基也能够使癌细胞凋亡，起到化疗和化学动力学疗法联合的抗癌效果。

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