一种新型重组蜂毒多肽及其制备方法和应用
阅读：555发布：2020-05-19
专利汇可以提供一种新型重组蜂毒多肽及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新型重组 蜂毒 多肽， 氨 基酸序列为SEQ ID No.1，编码新型重组蜂毒蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2，制备方法为将UA8短肽与 蜂毒肽 基因相连接成重组蜂毒融合基因，构建重组蜂毒多肽融合基因真核表达载U-melittin-pPICZα，转入毕赤 酵母 诱导表达重组蜂毒蛋白并进行表达和纯化，本发明相对于蜂毒肽具有更强的抗 肿瘤 活性和较小的溶血毒性，应用于由于HPV病毒引起的 宫颈 相关 疾病 及 宫颈癌 的 预防 及 治疗 。，下面是一种新型重组蜂毒多肽及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种新型重组蜂毒多肽，其特征在于：氨基酸序列为SEQ ID No.1。
2.编码如权利要求1所述的新型重组蜂毒多肽的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
3.如权利要求1所述的新型重组蜂毒多肽的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
一.合成SEQ ID No.2：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5’-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基，合成DNA原料亚磷酰胺保护核酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，使其3'端活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应，接下来进行带帽反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止后续反应，最后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，重复以上步骤直到所需的所有碱基被接上去，最后进行纯化得到新型重组蜂毒蛋白编码的核苷酸序列；
二.构建重组蜂毒融合基因真核表达载体骨架U-melittin-pPICZα，以SacII酶切位点ccgcgg，SacII的粘性末端被添加于5'端，EcoRI的终止密码子和粘性末端被添加到3'；后进行如下反应，6μl 0.5mmol NaCl和25μmol步骤一中制得的融合基因混合，混合物于80℃反应3min接着逐渐降至室温，pPICZαC质粒被SacII和EcoRI剪切，将制备完成的DNA片段插入pPICZαC载体，将重组质粒转入Escherichia coli XL-Blue的细胞，携带重组质粒的克隆通过25μg/ml的博莱霉素抗性筛选，0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR产物，取20～25μg表达载体骨架U-melittin-pPICZα经SacI酶消化后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀，线性化的重组表达质粒溶解后置冰上备用；
三.建立新型重组蜂毒多肽的表达体系：从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞；
然后取80μl上述感受态菌，与20～25μg步骤二中制得的线性化的重组表达质粒混合后进行电转化；取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天；然后用PCR方法筛选转化酵母菌；离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；
四.新型重组蜂毒多肽的表达：取步骤三中鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY，pH为6.0培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD600达到2.0～6.0时收集细胞，用等体积(10ml)BMMY，pH为6.0重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达；诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变；在培养的第0、24、48、
72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清液。
4.如权利要求1所述的新型重组蜂毒多肽在治疗HPV感染及抗宫颈癌药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的宫颈癌来自于宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)。
一种新型重组蜂毒多肽及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病率和致死率在发展中国家女性恶性肿瘤中分别居第二位和第三位，且年轻化态势显著，严重危害了女性的身心健康。据不完全统计，全球2012年新发宫颈癌528000例，致死266000例，东亚人群的宫颈癌发病率为7.9/10万。因我国人口基数大，宫颈癌筛查、防治措施尚未全面推广，近年来发病人数逐年提高，占全球发病总数的1/3。宫颈癌的发病因素复杂，联系最为密切的是高危型人乳头瘤病毒的持续感染。几乎所有的侵袭性宫颈癌及95％的宫颈上皮内瘤变、原位癌病理组织中均可检测出HPV。70～80％的女性一生都感染过HPV，其中10％的女性面临持续性HPV感染的危险状态，但高危型HPV感染虽然会导致高级别CIN和宫颈癌的发生，但多数呈一过性亚临床改变，是因为游离HPV基因组对宿主基因组的稳定性威胁不大，一旦HPV DNA整合进入宿主基因组，将导致一系列基因结构及功能异常，最终使细胞发生恶性转化。E6和E7是主要的致癌蛋白，在HPV整合进入宿主基因组后发挥重要的致癌作用，E6可通过泛素化等途径调节影响p53蛋白的抑癌作用，E7与pRb结合后可使细胞周期调节失控。因此早期有效抑制HPV及病毒蛋白E6、E7的表达成为预防宫颈癌的有效途径。
[0003] 目前宫颈癌治疗中最常用的药物之一顺铂，是主要与DNA链上碱基作用，DNA结合形成交叉键，从而破坏DNA的功能不再复制，高浓度时会抑制RNA及蛋白质的合成，主要副作用为消化道反应、肾脏毒性、骨髓抑制及听神经毒性，目前缺乏有效方法改善其副作用。干扰素(Interferon)是细胞受病毒感染后释放出来的免疫物质。由病毒和病毒以外物质诱发的干扰素分别称为Ⅰ型和Ⅱ型干扰素。干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。已用于临床的干扰素有三类：干扰素α是病毒诱导白细胞产生的干扰素，β是病毒诱导纤维母细胞产生的干扰素，γ是病毒诱导淋巴样细胞产生的干扰素。不良反应主要是发热、疲乏、肌痛、头痛等流感样症状。其次是轻度骨髓抑制，氨基转移酶、血肌酐升高。但临床中干扰素用于治疗HPV感染效果不佳，HPV感染无法得到有效的控制，开发一种能够有效治疗HPV病毒的药物将会填补该领域的空白。
[0004] 蜂毒肽占蜂毒干重的45％～50％，是蜂毒的主要成分。研究发现蜂毒具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗炎、降压、镇痛、缓解风湿以及抗凝等重要功能。其中，蜂毒肽的抗肿瘤、抗菌抗病毒作用近年来备受关注。蜂毒肽的独特作用由其结构决定：蜂毒肽作为一种分子量为2840的多肽链，N-端(1-20aa)是疏水性，C-端(21-26aa)是亲水性在特定PH及离子浓度时，蜂毒肽自我交联呈α-螺旋四聚体结构，具有膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征，因此既可溶于水，又可溶解细胞发挥细胞毒活性。此外，因蜂毒肽分子量相对较小，现有技术中，蜂毒的临床应用主要有以下几种：(1)结缔组织疾病，如风湿性和类风湿性关节炎；(2)神经炎和神经痛，如治疗坐骨神经痛、三叉神经痛、枕神经痛、背神经根炎等；(3)心血管疾病，如高血压动脉粥样硬化症、静脉血栓形成、血栓闭塞性脉管炎和动脉内膜炎；(4)变应性疾病，如支气管哮喘。与目前临床应用的抗肿瘤药物相比，还具有免疫原性略低的优势。在卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等常见肿瘤的研究中，蜂毒肽对肿瘤细胞生长抑制作用、直接溶解作用均得到证实。但是蜂毒肽在抗HPV病毒及宫颈癌治疗中的应用尚无报道。根据宫颈癌的发病机制，蜂毒肽的抗病毒、抗肿瘤等多种治疗特性将适用于HPV感染的治疗，进而达到宫颈癌的防治目的。
[0005] 蜂毒肽作为一种非特异性小分子多肽，目前在其应用中存在以下问题：一、磷脂酶A2与蜂毒肽分子量接近且具有高致敏性，现有传统提纯技术无法将两者实现有效分离，从而限制了蜂毒肽的应用；二、蜂毒肽性质极不稳定，入血后易降解，从而影响了蜂毒肽药效的发挥；三、蜂毒肽作为一种强碱性肽，通过裂解细胞膜而具有极强的溶血副作用，静脉注射后严重的溶血作用甚至致死作用成为限制其发展的主要原因。要突破蜂毒肽的发展阻碍，一是利用微纳米等先进生物材料包被运输蜂毒肽，以提高其稳定性和靶向特异性；二是利用基因工程技术工定向改造蜂毒肽的结构；三是改变蜂毒肽作为药物的剂型，从静脉给药转为局部用药。蜂毒蛋白在抗HPV病毒及宫颈癌治疗中的应用未见相同报道，与目前临床应用的抗病毒、抗肿瘤药物相比，蜂毒肽具有分子量相对较小，免疫原性低等优势。UA8片段是由8个氨基酸序列组成的短肽，将其连接于蜂毒肽通过改造其结构来减轻蜂毒肽的溶血毒性等毒副作用。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种新型重组蜂毒多肽，相对于蜂毒肽具有更强的抗肿瘤活性和较小的溶血毒性，应用于由于HPV病毒引起的宫颈癌的预防及治疗。
[0007] 本发明所述的新型重组蜂毒多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
[0008] 编码上述新型重组蜂毒蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
[0009] 本发明的另一个目的是提供以上的新型重组蜂毒多肽的制备方法，将UA8短肽与蜂毒肽基因相连接成重组蜂毒融合基因，构建重组蜂毒多肽融合基因真核表达载U-melittin-pPICZα，转入毕赤酵母诱导表达重组蜂毒蛋白并进行表达和纯化，具体包括如下步骤：
[0010] 1.合成新型重组蜂毒多肽基因编码的核苷酸序列：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5’-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基，合成DNA原料亚磷酰胺保护核酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，使其3'端活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应，接下来进行带帽反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止后续反应，最后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，重复以上步骤直到所需的所有碱基被接上去，最后进行纯化得到新型重组蜂毒蛋白编码的核苷酸序列：5'-gcc taa agc tgc ttg tcc aag agt atg aaa ttc ttag tca acg ttg ccc ttg ttt tta tgg tcg tgt aca ttt ctt aca tct atg cg g ccc ctg aac cgg aac cgg cac cag agc cag agg cgg agg cag acg cgga ggc gat ccg gaa gcg gga att gga gca gtt ctg aag gta tta acc aca gga ttg ccc gcc ctc ata agt tgg att aaa cgt aag agg caa cag ggt tag-3'；
[0011] 2.构建重组蜂毒融合基因真核表达载体骨架U-melittin-pPICZα，以SacII酶切位点ccgcgg，SacII的粘性末端被添加于5'端,EcoRI的终止密码子和粘性末端被添加到3'；后进行如下反应，6μl 0.5mmol NaCl和25μmol融合基因混合，混合物于80℃反应3min接着逐渐降至室温，pPICZαC质粒被SacII和EcoRI剪切，将制备完成的DNA片段插入pPICZαC载体，将重组质粒转入Escherichia coli XL-Blue的细胞，携带重组质粒的克隆通过25μg/ml的博莱霉素抗性筛选，0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR产物，取20～25μg表达载体骨架U-melittin-pPICZα经SacI酶消化后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀，线性化的重组表达质粒用10μl超纯水溶解后置冰上备用；
[0012] 3.建立新型重组蜂毒多肽的表达体系：从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞；然后取80μl上述感受态菌，与20～25μg步骤2中制得的线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化；取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天，观察转化子的生长状况；然后用PCR方法，筛选转化酵母菌；离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；
[0013] 4.新型重组蜂毒多肽的表达：取步骤3中鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY，pH为6.0培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD600达到2.0～6.0时收集细胞，用等体积(10ml)BMMY，pH为6.0重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达；诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变；在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清液。
[0014] 本发明还有一个目的是提供新型重组蜂毒多肽在治疗HPV感染及抗宫颈癌药物中的应用，尤其涉及通过抑制高危型HPV16、18型病毒蛋白的表达在抗HPV治疗和预防及治疗由HPV感染引起的宫颈癌中的应用。
[0015] 本发明所述的新型重组蜂毒多肽的主要特征是蛋白组分包括修饰成分及蜂毒肽主体成分、使用毕赤酵母表达系统生产，使其具有更强的抗肿瘤活性和较小的非特异性生物毒性。针对目前宫颈癌防治进程中的瓶颈问题及蜂毒肽研究中的空白，本发明根据蜂毒肽抗病毒、抗肿瘤等广泛的生物学特性，添加8个氨基酸短肽对蜂毒肽一级结构加以改造以增强特异性减轻溶血毒性，通过毕赤酵母菌表达系统表达重组蜂毒肽，进一步发现新型重组蜂毒多肽具有抑制HPV16、HPV18两种宫颈癌高危病毒E6/E7蛋白的表达及抑制宫颈癌细胞生长，促进其凋亡等作用，达到抗HPV病毒的效果，使其可以应用于由于HPV病毒引起的宫颈癌的预防及治疗。在各组给药浓度下，蜂毒肽和新型重组蜂毒多肽对瘤体体积增大的抑制作用呈剂量依赖性增强，但两种多肽对应的高中低剂量组对种瘤的抑制率持平，无明显差异。蜂毒肽和新型重组蜂毒多肽对hela和caski荷瘤小鼠瘤重抑制率(％)比较如下表1。
[0016] 表1
[0018] 图1：不同质量浓度(0，10，20，40，80ug/ml)新型重组蜂毒多肽作用Hela，Caski 24h，48h，其对Hela，Caski生长抑制作用随着浓度和作用时间的增加而增加；对Hela，Caski作用24h时的IC50分别为49.83ug/ml，32.76ug/ml；
[0019] 图2：Hela细胞经过4个浓度新型重组蜂毒蛋白处理24小时后，随着新型重组蜂毒多肽浓度升高，细胞数量减少，间隙增大，体积缩小，形态皱缩变圆；
[0020] 图3：Caski细胞经过4个浓度新型重组蜂毒多肽处理24小时后，随着浓度升高，细胞数量减少，间隙增大，体积缩小，形态皱缩变圆；
[0021] 图4：Hela细胞经过4个浓度新型重组蜂毒多肽处理24小时后，随着浓度升高，HPV18E7、HPV18E6表达量下降；
[0022] 图5：Caski细胞经过4个浓度新型重组蜂毒多肽处理24小时后，随着浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降；
[0023] 图6：hela细胞经过新型重组蜂毒多肽处理24h，随着药物浓度的增加，早期凋亡及中晚期凋亡均增加，且以中晚期凋亡增加为主；
[0024] 图7：Caski细胞经过新型重组蜂毒多肽处理24h，随着药物浓度的增加，早期凋亡及中晚期凋亡均增加，且以中晚期凋亡增加为主；
[0025] 图8：在各组给药浓度下，宫颈癌荷瘤小鼠瘤体积随时间增加而增大。对瘤体体积增大的抑制作用呈剂量依赖性增强，其中80mg/kg对瘤体体积增长的抑制作用明显优于顺铂；
[0026] 图9：经过各给药组处理后的Hela宫颈癌荷瘤小鼠瘤体E6、E7的表达情况：随着浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降，E6尤为明显，且80mg/kg给药组E6、E7的表达量明显低于干扰素及顺铂组；
[0027] 图10：经过各给药组处理后的Caski宫颈癌荷瘤小鼠瘤体E6、E7的表达情况：随着浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降，E6尤为明显，且80mg/kg给药组E6、E7的表达量明显低于干扰素及顺铂组。
具体实施方式
[0029] 实施例1：一种新型重组蜂毒多肽的具体制备方法包括如下步骤：
[0030] 1.合成新型重组蜂毒多肽基因编码的核苷酸序列：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5’-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基，合成DNA原料亚磷酰胺保护核酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，使其3'端活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应，接下来进行带帽反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止后续反应，最后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，重复以上步骤直到所需的所有碱基被接上去，合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率，最后进行纯化得到新型重组蜂毒蛋白编码的核苷酸序列：5'-gcc taa agc tgc ttg tcc aag agt atg aaa ttc ttag tca acg ttg ccc ttg ttt tta tgg tcg tgt aca ttt ctt aca tct atg cg g ccc ctg aac cgg aac cgg cac cag agc cag agg cgg agg cag acg cgga ggc gat ccg gaa gcg gga att gga gca gtt ctg aag gta tta acc aca gga ttg ccc gcc ctc ata agt tgg att aaa cgt aag agg caa cag ggt tag-3'。
[0031] 2.构建重组蜂毒融合基因真核表达载体骨架U-melittin-pPICZα，以SacII酶切位点ccgcgg，为了将已合成的重组蜂毒多肽DNA插入pPICZαC质粒,SacII的粘性末端被添加于5'端,EcoRI的终止密码子和粘性末端被添加到3'；增加重组多肽的产量同义密码子被决定产量的密码子替换，反应条件如下，6μl 0.5mmol NaCl，25μmol单链DNA混合，混合物于80℃反应3min接着逐渐降至室温.pPICZαC质粒被SacII和EcoRI剪切,将制备完成的DNA片段插入pPICZαC载体，将重组质粒转入Escherichia coli XL-Blue的细胞，携带重组质粒的克隆通过博莱霉素(25μg/ml)抗性筛选，按如下比例在0.2ml EP管中建立PCR反应体系：重组质粒100ng；含Mg2+的10×LA PCR缓冲液10μl，dNTPs(各2.5mmol/L)8μl，引物1μl(20pmol/μl)，TaKaRa LA Taq(5U/μl)1μl，灭菌超纯水至终体积100μl，在PCR仪上进行循环扩增；扩增程序为：94℃4分钟；94℃30秒，50℃30秒，70℃1分钟，共30个循环，然后70℃8分钟；0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR产物，取20～25μg表达载体u-melittin-pPICZα经SacI酶消化后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀，线性化的重组表达质粒用10μl超纯水溶解后置冰上备用；所述的引物的序列5′-GTT CCA TCG AAC TGT GAC CGA TGC TG-3′5′-GGT TCT CGA TGG TGG TGA GTT TCC AT-3′；
[0032] 3.建立新型重组蜂毒多肽的表达体系：从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞；然后取80μl上述感受态菌，与20～25μg步骤2中制得的线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化；取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天，观察转化子的生长状况；然后用PCR方法，筛选转化酵母菌；离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；
[0033] 4.新型重组蜂毒多肽的表达：取步骤3中鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY，pH为6.0培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD600达到2.0～6.0时收集细胞，用等体积(10ml)BMMY，pH为6.0重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达；诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变；在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清液。
[0034] 实施例2：新型重组蜂毒多肽对宫颈癌细胞系及HPV16/18E6、E7表达的影响[0035] (1)新型重组蜂毒多肽宫颈癌细胞系的生长抑制试验
[0036] a.选对数生长期的细胞Hela(HPV18阳性)及Caski(HPV16阳性)用胰酶消化，制成细胞悬液，细胞计数板计数，将细胞稀释至密度4*104/ml。将稀释好的细胞充分混勾后，接种于孔板，每孔加入100ul(沿侧壁加入，勿摇晃)。
[0037] b.0ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml四个浓度梯度组，每个浓度设置3个复孔。待种板12小时细胞贴壁后，加入不同浓度药物，作用24小时和48小时。弃含药培基，加入新的含10％CCK-8溶液的培养基。
[0038] c.37℃培养1-4小时后，用酶标仪测定450nm的OD值。
[0039] d.计算24小时及48小时不同浓度对Hela和Caski细胞的抑制率及IC50。结果如图1所示。
[0040] e.于倒置显微镜下观察加入不同浓度后Hela和Caski形态学变化。如图2和图3所示。
[0041] (2)新型重组蜂毒多肽对HPV18E6、E7及HPV16E6、E7蛋白表达的抑制作用[0042] 将药物处理后的各组细胞经胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤1次。
[0043] a.裂解液裂(含PMSF)。然后置于冰上。
[0044] b.裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
[0045] c.BCA法检测蛋白浓度，计算上样量。
[0046] d.SDS－PAGE电泳：浓缩胶80V*30min，分离胶120V*1h。
[0047] e.转膜：300mA*30min。
[0049] g.孵育E6、E7、β-actin一抗，4℃过夜。
[0050] h.孵育二抗，45min。
[0051] i.显色，处理图像，如图4和图5所示。
[0052] (3)新型重组蜂毒多肽促进宫颈癌细胞系凋亡作用
[0053] a.将对数生长期的Hela及Caski细胞用胰酶消化，制成细胞悬液。细胞计数板计数，将细胞稀释至密度4*104/ml，将稀释好的细胞充分混勻后，接种于6孔板，每孔加入2ml。接种待贴壁后，加入不同浓度药物，作用24小时。
[0054] b.将不同药物浓度作用后的细胞培养液分别吸入不同的离心管中备用，用不含EDTA胰酶消化细胞并将消化下的不同组细胞分别对应加入不同离心管中，1000rpm离心5分钟，吸弃上清，加入1ml预冷的PBS，吹打混匀，1000rpm离心5分钟，吸弃上清。
[0055] c.再次用PBS洗涤。每管细胞中加100ul的Binding Buffer充分混匀，加入5ul Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5分钟，加入10ul 20ug/ml的电话丙锭溶液，并加400ulPBS，立刻进行流式检测其凋亡，结果如图6和图7所示。
[0056] 实施例3：新型重组蜂毒多肽抑制宫颈癌及HPV16/18E6、E7表达作用荷瘤裸鼠体内试验
[0057] (1)荷瘤裸鼠模型建立及分组
[0058] a.Balb/c-nu裸鼠，雌性，鼠龄6-8周，体重18-22g，于SPF级环境下饲养，共60只。取处于对数生长期的HeLa、Caski细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用无血清培养液离心洗涤2次，并用无血清培养液调整细胞浓度为10^7个/ml。无菌条件下用带6号针头的注射器抽取0.2m1细胞悬液接种于经75％酒精消毒的裸鼠右侧腋窝皮下。
[0059] b.约4天后被接种裸鼠皮下均出现结节或至肿瘤组织生长至约150mm3时，进行随机分组。体积V＝长径*短径*纵径
[0060] c.分组：将接种Hela，Caski的鼠分别设置为A，B组，每组分别设置以下6组，每组5只。
[0061] 空白对照组：生理盐水
[0062] 阳性对照组1：顺铂2.5mg/kg
[0063] 阳性对照组2：干扰素250万U/kg
[0064] 新型重组蜂毒多肽低剂量组：20mg/kg
[0065] 新型重组蜂毒多肽中剂量组：40mg/kg
[0066] 新型重组蜂毒多肽高剂量组：80mg/kg
[0067] (2)测量肿瘤组织大小及瘤重抑制率
[0070] c.计算瘤重抑制率(％)＝(1-给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重)*100％[0071] 结果说明：瘤重抑制率呈剂量依赖性增强，其中80mg/kg瘤重抑制率明显大于顺铂及干扰素，如图8和表2和表3所示。
[0072] 表2
[0073] Hela荷瘤小鼠的瘤重抑制率
[0074]
[0075] 表3
[0076] Caski荷瘤小鼠的瘤重抑制率
[0077]
[0078] (3)肿瘤组织中HPV18、HPV16的E6、E7蛋白表达量的测定
[0079] 从液氮中取1/3组织块，用干净的剪刀将组织块剪碎。
[0080] a.裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
[0081] b.裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
[0082] c.BCA法检测蛋白浓度，计算上样量。
[0083] d.SDS－PAGE电泳：浓缩胶80V*30min，分离胶120V*1h。
[0084] e.转膜：300mA*30min。
[0085] f.封闭：5％脱脂牛奶封闭1h。
[0086] g.孵育E6、E7、β-actin一抗，4℃过夜。
[0087] h.孵育二抗，45min。
[0088] i.显色，处理图像如图9和图10所示。
[0089] 以上实验得到如下结论：将新型重组蜂毒多肽用于抑制HPV16、HPV18两种宫颈癌高危病毒E6/E7蛋白的表达及抑制宫颈癌细胞生长，促进其凋亡，达到抗HPV病毒的效果，使其可以应用于由于HPV病毒引起的宫颈癌的预防及治疗。所说的高危型HPV特指感染Hela细胞的HPV18、感染caski细胞的HPV16。其中所说的高危型HPV致瘤蛋白特指E6、E7蛋白。对给予不同剂量新型重组蜂毒多肽的HPV16、HPV18进行体外研究和体内研以Western Blotting检测致瘤蛋白E6、E7的表达量。其中所说的不同剂量分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。其中所说的体外研究为宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)细胞培养。其中所说的体内研究对象为宫颈癌荷瘤裸鼠模型。通过用在显微镜下观察及CCK-8方法检测新型重组蜂毒多肽的增殖抑制作用，通过流式细胞术检测新型重组蜂毒多肽的促凋亡作用。随着新型重组蜂毒多肽浓度的增加，HPV18E6/E7及HPV16E6/E7表达量逐渐降低，说明新型重组蜂毒多肽可以有效抑制高危型HPV 18及HPV16致瘤蛋白的表达，从而达到抗HPV18、HPV16的效果，进一步预防宫颈癌。其中所说的体内研究对象为宫颈癌荷瘤裸鼠模型，通过瘤块生长曲线及瘤重抑制率检测新型重组蜂毒多肽的生长抑制作用。该方法发现新型重组蜂毒多肽可以有效的抑制宫颈癌细胞的增殖，且促进其凋亡，进一步蜂毒肽有明显的抗癌作用。
[0090] 实施例4：新型重组蜂毒多肽溶血试验
[0091] 2％红细胞悬液的制备取新鲜兔血10～20ml，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。加入生理水100ml，摇匀，
1000～1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液(红细胞2ml，加生理盐水至100ml)，供试验用。取10ml干净玻璃试管8支，编号，按表4所示，依次加入2％红细胞液。0.9％氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37±0.5℃的恒温水浴中进行温育，观察并记录各管的溶血情况。开始每隔30分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。蜂毒肽与新型重组蜂毒多肽溶血试验比较如表2所示。
1000～1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液(红细胞2ml，加生理盐水至100ml)，供试验用。取10ml干净玻璃试管8支，编号，按表4所示，依次加入2％红细胞液。0.9％氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37±0.5℃的恒温水浴中进行温育，观察并记录各管的溶血情况。开始每隔30分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。蜂毒肽与新型重组蜂毒多肽溶血试验比较如表2所示。
[0092] 表4
[0093]
[0094] 注：-表示不溶血+表示部分溶血++表示全溶血
[0095] 蜂毒肽与新型重组蜂毒多肽的溶血程度均随浓度升高而升高，对应两种多肽低中高组比较，新型重组蜂毒蛋白明显的改善了蜂毒肽的溶血毒性。
[0096] 制备实施例
[0097] 一种治疗人乳头瘤病毒及宫颈癌含有新型重组蜂毒多肽的药物含有如下重量的成份：新型重组蜂毒多肽0.05-5％；卡波姆0.1-1％；三乙醇胺0.5-3％冰片3-6％；葡萄糖1-5％；甘油0.5-5％；其余为水；所述的冰片选自天然冰片和/或合成冰片。所述的药物组合物制备成阴道给药制剂型。所述的制剂包括栓剂，软膏剂、胶囊剂、泡腾片、凝胶剂、洗剂、膜剂或泡沫剂。
[0098] 制备实施例1：
[0099] 新型重组蜂毒多肽阴道软膏，配方：新型重组蜂毒多肽3g，十二烷基磺酸钠改性蒙脱土50g，液体石蜡480g，甘油25g，肉豆蔻酸异丙酯200g，环甲基硅酮30g，硬脂醇55g，冰片10g，薄荷2g具体制备步骤是：
[0100] a.称取十二烷基磺酸钠改性蒙脱土50g溶于液体石蜡480g，置于胶体磨中湿磨分散5分钟，充分分散后，加入甘油25g继续分散5分钟，得十二烷基磺酸钠改性蒙脱土分散形成的液体石蜡凝胶
[0101] b.加热至70摄氏度，然后向其中缓慢添加新型重组蜂毒多肽3g，边添加边搅拌，然后添加预热至55摄氏度的肉豆蔻酸异丙酯200g、环甲基硅酮30g、硬脂醇55g，冰片10g，薄荷2g，边加边搅拌均匀，待混合均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，即得新型重组蜂毒多肽软膏。
[0102] 制备实施例2：
[0104] 具体制备步骤是：
[0105] a.基质的制备：称取1000g明胶，加入等量的纯水浸渍1小时置水浴中加热至80℃溶解，再加入甘油一定量(1600g)，搅拌，蒸去多余的水分；
[0106] b.在基质中加入甘露醇6g、乳糖6g、柠檬酸5g、戊二酸5g、枸橼酸钠4g、β-环糊精6g，搅匀，温度控制在37～40℃，加入新型重组蜂毒多肽2g，搅匀后在37～40℃灌入已灭菌并涂有润滑剂的阴道栓模中；
[0107] c.冷却至通常室温，温度控制在15～25℃下，削去模口溢出部分，脱模，密封，得新型重组蜂毒多肽栓剂成品；
[0108] 制备实施例3：
[0110] a.按配方量的碳酸氢钠与柠檬酸，进行充分混合，过80目筛。
[0111] b.加无水乙醇溶液适量，制湿颗粒，混匀，过20目筛，42～45℃干燥4～6小时烘干，得泡腾颗粒。
[0112] c.按配方将新型重组蜂毒多肽，稀释成适当浓度。
[0113] d.取配方量的其他辅料，按倍比稀释法混合均匀后，过80目筛；加新型重组蜂毒多肽溶液制软材，过20目筛，制湿颗粒。
[0114] e.42～45℃烘干4-6小时；测水分含量，水分含量应在1％以下，得新型重组蜂毒多肽颗粒。
[0115] f.将泡腾颗粒与新型重组蜂毒多肽颗粒混合均匀后，加入硬脂酸镁，压片、包装，得新型重组蜂毒多肽泡腾片。
[0116] 制备实施例4：
[0117] 新型重组蜂毒多肽阴道凝胶：配方：新型重组蜂毒多肽2g、醋酸氯己定1.6g、卡波姆10g、甘油120g、三乙醇胺4g、羟苯乙酯1g、其余为纯化水。具体制备步骤如下：
[0118] a.制备1000g凝胶，按重量比取新型重组蜂毒多肽2g、醋酸氯己定1.6g混匀后粉碎，过100目筛备用；
[0119] b.按重量比取卡波姆10g、三乙醇胺4g和纯化水备用；将卡波姆均匀撒于纯化水表面，放置40-48小时充分自然溶胀后再加入三乙醇胺搅拌均匀，调PH5-6,制成基质；
[0120] c.在步骤a中制备的粉碎药中按重量比加入甘油120g、羟苯乙酯1g搅拌混合均匀得到混合物备用；
[0121] d.取步骤c中的混合物逐渐加入到搅拌状态下步骤2制成的基质中加入纯化水混合均匀制成1000g凝胶；
[0122] e.取步骤d得到的凝胶按照每支5克的规格要求的重量进行灌装包装后得到新型重组蜂毒多肽阴道凝胶产品。
[0123] 制备实施例5：
[0124] 新型重组蜂毒多肽洗剂：配方：新型重组蜂毒多肽3g、火炭母20g、青蒿20g、穿心莲20g、薄荷5g，冰片5g、九里明5g、水1000ml。
[0125] 上述妇科阴道冲洗液的制备方法如下：
[0126] 按重量配比取原材料：火炭母、青蒿、穿心莲、薄荷、冰片、九里明；
[0127] 将上述药材洗净、切细放入烧瓶内加水至煮开；
[0128] 待其冷却后，用筛网过滤两次后，收集滤液；
[0129] 按配方将新型重组蜂毒多肽，稀释成适当浓度。
[0131] 制备实施例6：
[0132] 新型重组蜂毒多肽蛋白敷料，配方(1000g)新型重组蜂毒多肽2g：卡波姆10g，薄荷5g，绿茶提取物20g，甘油50g，尼泊金酯25g,苯氧乙醇20g，其余为水。包括以下步骤：
[0133] a.先将甘油、薄荷和绿茶提取物溶解到纯水中，然后加入卡波姆，使其充分溶解，然后加入用0.22μm的膜过滤过的新型重组蜂毒多肽蛋白，继续搅拌，得到均匀体系。
[0134] b.加入混合均匀的苯氧乙醇和尼泊金酯，用纯水补足余量，搅拌均匀。
[0135] c.最后用质量浓度为20％的NaOH溶液将得到的一升隐形膜调节pH值至4.5到6.5之间，即得成品。
[0136] 临床实施试验
[0137] 此实验为本发明新型重组蜂毒多肽软膏，对不伴高级别宫颈病变的HPV持续感染者疗效的的临床观察。
[0138] 研究对象选择：为HPV持续感染(HPV—DNA)检测阳性，6个月后复查仍阳性)且不伴高级别宫颈病变，所有人自愿入组并签订知情同意书。
[0139] 入选标准：
[0140] 1既往无宫颈手术史
[0141] 2排除宫颈高级别病变及癌变(行TCT检查，对于TCT结果为ASCUS及以上的患者进一步行阴道镜检查)
[0142] 3无新型重组蜂毒多肽禁忌症
[0143] 4半年内未使用抗病毒药物及免疫调节制剂
[0144] 5非妊娠期、哺乳期女性
[0145] 6无急性阴道炎、急性盆腔炎等急性炎症性疾病
[0146] 7无不规则阴道出血
[0147] 8无免疫功能低下(恶性肿瘤，SLE，艾滋病等)
[0148] 9有随访条件并配合治疗
[0149] 10所有患者签署知情同意书，自愿参加本次临床试验
[0150] 排除标准：
[0151] 1免疫功能低下者，如肿瘤术后或放、化疗后，艾滋病及系统性红斑狼疮等；
[0152] 2妊娠和哺乳期妇女；
[0153] 3患有急性生殖道炎症，如淋病、支原体或衣原体感染等；
[0154] 对照组：不使用任何药物干预，观察期间患者使用避孕套避孕；
[0155] 治疗组：睡前清洗外阴后，使用推进器将药物推送至穹窿部，一次2g，一日一次连用10天后停药，下个月经周期重复。月经期停用，下一周期从月经干净后第3-5天开始用药，连续使用3个月经周期后复查HPV，HPV转阴患者停止用药，HPV未转阴患者再继续使用本发明新型重组蜂毒多肽软膏3个月经周期：用药期间禁止坐浴及性生活，用药后半年内使用避孕套避孕。
[0156] 疗效判断方法：
[0157] 转阴：复查时HPV(-)；
[0158] 有效：于复查HPV感染定量减少，但并未完全清除
[0159] 无效：复查时，HPV感染定量减少或定量增加。
[0160] 结果：治疗3个月治疗组HPV清除率和有效率均比对照组高。6个月后，治疗组HPV清除率和有效率也均比对照组高。用药后3个月及6个月后复查治疗组与对照组的疗效对比详见下表5。
[0161] 表5
[0162]
[0163] 注：清除率＝N转阴/N总人数×100％有效率＝(N转阴+N有效)/N总人数×100％[0164] 以上结果说明本发明新型重组蜂毒多肽栓剂对人HPV感染治疗有显著疗效。
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