蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2、其制备方法及应用
阅读：29发布：2020-05-20
专利汇可以提供蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2、其制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 蜂毒 阴离子抗菌肽AcHy-a2，其具有SEQ ID NO:1所示 氨 基酸序列或者为如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸取代、添加或缺失而形成的、对 革兰氏阳性菌 具有抑制作用的衍生多肽；还涉及编码该肽的多核苷酸，含有该多核苷酸的构建体、表达载体和转化的细胞，该肽的制备方法及医药用途。本发明的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2可来源于天然动物资源，属于抗菌肽，与传统抗菌药物相比，具有活性高、毒 副作用 小、不易产生耐药性、体内无药物残留等优点，又因其结构简单、人工合成方便、能很好地解决细菌对传统抗菌药物日益增强的耐药性问题而具有较好的临床应用前景。，下面是蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2、其制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2，其为：
(a)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或者，
(b)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，对革兰氏阳性菌、优选金黄色葡萄球菌具有抑制作用的由(a)衍生的多肽。
2.编码如权利要求1所述蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的多核苷酸。
3.一种核酸构建体，其包含权利要求2所述的多核苷酸，以及与之可操作连接、可指导多肽在表达宿主中生产的一个或多个控制序列。
4.一种表达载体，其包含权利要求3所述的核酸构建体。
5.一种转化的细胞，其中转化了权利要求3所述的核酸构建体或权利要求4所述的表达载体。
6.如权利要求1所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2在制备抑制革兰氏阳性菌、优选金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
7.如权利要求1所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2在制备治疗由革兰氏阳性菌、优选金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病的药物中的应用；
优选地，所述感染性疾病为局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎、败血症、脓毒症。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2及药学上可接受的载体。
9.如权利要求1所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的制备方法，其包括采用固相化学合成法、优选芴甲氧羰基固相化学合成法，按其氨基酸序列合成蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的线性肽。
10.如权利要求1所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的生物提取方法，其包括：
(1)从蜜蜂科(Honey bee)东方蜜蜂属(Apiscerana)蜜蜂的毒腺中，提取毒素多肽；
(2)所述毒素多肽经6-10M、优选8M的尿素变性、8-12mM优选10mM的二硫苏糖醇和
50-60mM、优选55mM的碘乙酰胺还原烷基化处理后，使用C18固相萃取柱进行多肽富集；
(3)根据抗菌肽AcHy-a2的氨基酸序列，对富集的多肽进行分离、鉴定。
蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2、其制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种新的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2，编码该肽的多核苷酸，含有该多核苷酸的构建体、表达载体和宿主细胞，该肽的天然提取及人工合成方法，以及该肽的医药用途。
背景技术
[0002] 金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》中记录该菌危害程度为第三类(中华检验医学网,2010,8)。该菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。鉴于疫苗目前还不可用于人类，所以用药方面还是以红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素Ⅵ等抗生素为主。随着抗生素的滥用，该菌也出现了不少的耐药株。
[0003] “传统抗生素”的滥用给全球公共健康带来了巨大威胁，促使着一个个“超级细菌”的诞生，近期世界卫生组织报告在全球首份耐药性监控报告中指出，基于对抗肺炎、腹泻、淋病、血液及尿路感染等常见或严重疾病抗生素耐药性的分析，诸多传染病原正在产生耐药性，这将延长病人患病时间，同时增加其死亡风险。解决抗生素耐药性问题迫在眉睫，为此，科学家们都在积极的探索全新的抗生素来源，从纳米结构，到海洋的有用生物。自然界各种来源的抗菌肽成为人们研发新型抗感染药物的新希望，抗菌肽的大量研发成功将有望解决这一难题。
[0004] 抗菌肽(多肽抗生素)最初指的是昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，由20～60个氨基酸残基组成，分子量在2000～7000左右，多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌活性，其对细菌具有很强的杀伤作用，尤其体现在对耐药病原菌的杀灭作用方面，且很大一部分天然抗菌肽携带正电荷的双亲性肽分子，即便是处于离子强度大的条件下和酸碱性极端的情况下，其活性也不会削减(范译文,等.畜牧与饲料科学,2012,33)。世界上首个被发现的抗菌肽是1980年由瑞典科学家G.Boman等人通过注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的多肽，定名为Cecropins(Ying Lian,Chinese Journal of Animal Nutrition,2014,26)。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程，中科院昆明动物研究所研究员张云课题组发现，天然抗菌肽具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用，相关研究在线发表于美国《医药化学杂志》。
[0005] 抗菌肽的作用机制至今尚未明确，但细胞膜是抗菌肽的主要作用靶点(EPAND R M,et al.Biopolymers,2000,55)，基于其抗细菌、真菌、病毒及抗肿瘤作用，抗菌肽现在已经逐步应用于医药、农业、食品等多个领域。目前，已有多种多肽抗生素正在进行临床前的可行性研究，其中在非洲爪蟾皮肤中发现的小分子抗菌肽magainins已经进入三期临床试验阶段。
[0006] 除了通常表现为带正电荷的阳离子抗菌肽外，阴离子抗菌肽也有相关报道被研究发现和应用，如中国科学院昆明动物研究所的赖仞研究员曾首次发现了基因编码的阴离子抗菌肽(http://news.ebioe.com/show/46403_2.htm)。2003年9月由美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市的daptomycin是一种阴离子抗菌肽，由Cubit Pharmaceuticals公司研发，其可用于金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌引起的皮肤感染和脓毒症的治疗(JUNG D,et al.Chemistry and Physics of Lipids,2008,154)。
[0007] 蜜蜂富含抗菌肽，其体内的抗菌肽主要是受到微生物或其他外源物质的侵染时产生的apidaecin、abaecin、bee defensin和hymenoptaecin等，同时王浆腺产生oyalisin和其他抗菌小肽，以及毒腺中的主要毒蛋白melittin等具有抗菌作用蛋白质肽类的总称。浙江大学农学院昆虫研究所的陈学新教授课题组首次通过实验发现中华蜜蜂比意大利蜜蜂体质要好，具有更强的抗寒能力和抗病能力，主要是因为中华蜜蜂比意大利蜜蜂具有更多与免疫相关的物质—抗菌肽(Xu P1,et al.PLoS One.2009,4)。
[0008] 蜂毒肽(melittin)是蜂毒中的主要成分，约占蜂毒干重的50％，具有抗菌、消炎、抗关节炎等作用，研究发现蜂毒肽在抗肿瘤，抗辐射方面也有独特的作用。关于蜂毒中抗菌肽的报道基本都是关于蜂毒肽的，由于已有的蜂毒肽大多具有溶血作用，因而限制了其抗菌性能的利用。因此，开发结构简单、抗菌活性高且溶血毒性低的抗菌肽迫不可待。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种新的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2，编码该肽的多核苷酸，含有该多核苷酸的构建体、表达载体和宿主细胞，该肽的天然提取及人工合成方法，以及该肽的医药用途。本发明的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2对革兰氏阳性菌具有显著的抑制作用，抑制效果与广谱半合成抗生素氨苄青霉素钠(Amp)及氨基糖苷类抗生素卡那霉素(Kana)接近；且其分子量较小、热稳定、体内无药物残留、免疫原性低，细菌对其较难产生耐受，对革兰氏阳性菌引起的感染性疾病有一定的治疗潜力。
[0010] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0011] 第一方面，本发明提供了一种蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2，其为：
[0012] (a)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或者，
[0013] (b)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，对革兰氏阳性菌、优选金黄色葡萄球菌具有抑制作用的由(a)衍生的多肽。
[0014] 本发明的发明人首次从蜜蜂科(Honey bee)东方蜜蜂属(Apiscerana)蜜蜂中提取并鉴定了阴离子蜜蜂多肽AcHy-a2，其分子量为2377.59道尔顿，带4个负电荷，全序列为：EIYFEEKFLDDSWEKNWV(即SEQ ID NO:1)。
[0015] 第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的多核苷酸。
[0016] 在具体实施方案中，当蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列时，编码其的多核苷酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，即其核苷酸序列为：gagatctactttgaagaaaaatttcttgatgattcctgggaaaaaaattgggtg。
[0017] 第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如第二方面所述的多核苷酸，以及与之可操作连接、可指导多肽在表达宿主中生产的一个或多个控制序列。
[0018] 第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如第三方面所述的核酸构建体。
[0019] 第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其中转化了如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体。
[0020] 第六方面，本发明提供了如第一方面所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2在制备抑制革兰氏阳性菌、优选金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
[0021] 发明人研究了本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的生物学活性。具体地，采用微量稀释法对蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的杀菌活性进行检测，并以广谱半合成抗生素Amp及氨基糖苷类抗生素Kana作为阳性对照，以评价本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的抑菌活性。
[0022] 发明人通过上述实验发现，本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2对革兰氏阳性菌，尤其是对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用，其抑菌效果接近Amp及Kana。
[0023] 第七方面，本发明提供了如第一方面所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2在制备治疗由革兰氏阳性菌、优选金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病的药物中的应用；
[0024] 优选地，所述感染性疾病为局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎、败血症、脓毒症。
[0025] 第八方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如第一方面所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2及药学上可接受的载体。
[0026] 第九方面，本发明提供了如第一方面所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的制备方法，其包括采用固相化学合成法、优选芴甲氧羰基固相化学合成法，按其氨基酸序列合成蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的线性肽。
[0027] 此外，如上述第一方面中所述，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2还可以通过从天然生物体中提取获得。因此，在第十方面，本发明提供了如第一方面所述的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的生物提取方法，其包括：
[0028] (1)从蜜蜂科(Honey bee)东方蜜蜂属(Apiscerana)蜜蜂的毒腺中，提取毒素多肽；
[0029] (2)所述毒素多肽经6-10M、优选8M的尿素变性、8-12mM优选10mM的二硫苏糖醇和50-60mM、优选55mM的碘乙酰胺还原烷基化处理后，使用C18固相萃取柱进行多肽富集；
[0030] (3)根据抗菌肽AcHy-a2的氨基酸序列，对富集的多肽进行分离、鉴定。
[0031] 在具体实施方案中，采用下述步骤提取并鉴定具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2：
[0032] 收集蜜蜂科(Honey bee)东方蜜蜂属(Apiscerana)蜜蜂，取其腹部毒腺，提取其毒素多肽；然后经8M尿素变性、10mM二硫苏糖醇(DTT)和55mM碘乙酰胺(IAM)还原烷基化处理后，使用C18固相萃取柱进行多肽富集纯化，然后采用纳升高效液相色谱-质谱联用仪(nanoLC-MS/MS)进行多肽质谱检测。产生的质谱数据经过数据解析和生物信息分析后得到蜜蜂多肽完整的氨基酸序列。
[0033] 有益效果
[0034] 本发明的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2可来源于天然动物资源，属于抗菌肽，与传统抗菌药物相比，具有活性高、毒副作用小、不易产生耐药性、体内无药物残留等特点，又因其结构简单、人工合成方便、能很好地解决细菌对传统抗菌药物日益增强的耐药性问题而将被广泛应用于金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌引起的局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，及败血症、脓毒症等全身感染等疾病的治疗。附图说明
[0035] 图1显示本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的二级质谱序列比对图；
[0036] 图2显示本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2在加药后3h时的抑菌效果图(n＝3)；
[0037] 图3显示本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2在加药后18h时的抑菌效果图(n＝3)。
具体实施方式
[0038] 为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0039] 实施例1蜜蜂毒液多肽的制备
[0040] 1、蜜蜂毒液提取及还原烷基化
[0041] 将10只东方蜜蜂属(Apiscerana)蜜蜂解剖腹部剪取毒腺，8M尿素(含蛋白酶抑制剂)裂解提取毒液。使用Bradford法测定毒液中蛋白浓度为7.87mg/ml。取总蛋白量为1mg，加入终浓度为10mM的DTT，于56℃反应1h，还原冷却至室温后加入终浓度为55mM的IAM于室温暗室反应45min。
[0042] 2、毒液多肽富集
[0043] 将经上述处理的蜜蜂多肽，用Strata-X C18柱对蜜蜂毒液中多肽进行富集。Strata-X C18富集操作按标准规程操作：1)加1ml甲醇活化柱子；2)加1ml 0.1％FA平衡柱子；3)毒液样品上样1ml，缓冲液(5％ACN+0.1％FA)洗涤，重复洗涤3次；4)100％ACN洗脱，收集洗脱液。富集多肽用MALDI-TOF-MS检测其分子量大小。
[0044] 实施例2本发明阴离子抗菌肽AcHy-a2的鉴定
[0045] 1、蜜蜂多肽序列鉴定
[0047] 2、nanoLC-MS/MS分析
[0048] 液质联用仪采用的是日本岛津的nano HPLC色谱仪系统和Thermo Fisher Scientific的Q-Exactive质谱仪系统。上步复溶的多肽液体经过内置的12cm长，75μm内径，填充了粒径3μm孔径120A的Welch Materials品牌XB-C18柱料的Ultimate毛细管分析柱分离，流速为300nl/min。检测进样体积为12μl，洗脱梯度为B液浓度从5％均匀上升到30％经过40min。质谱采集模式为DDA模式(数据依赖性采集)，可在一级和二级间切换，一级质谱全扫描分子量范围为350～1800m/z，轨道阱的分辨率达70000。二级质谱的采集，离子强度排在前20的离子相继分离后进行高能碰撞碎裂(HCD)，选择母离子价态在2电荷到5电荷的范围，碎片离子通过高分辨率17500的轨道阱质量器记录，其中动态排除的设定是：重复次数为2，动态排除时间为8s。
[0049] 3、数据分析
[0050] 将nanoLC-MS/MS检测得到的原始质谱数据进行格式转换成MGF后再用Mascot搜索软件进行数据搜索鉴定。得到的多肽序列中，通过序列特征分析选取全长氨基酸序列为EIYFEEKFLDDSWEKNWV的本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2进行化学合成。AcHy-a2多肽的二级质谱序列比对解析如附图1所示。
[0051] 4、多肽合成及质检
[0052] 应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相化学合成的方法合成本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的线性肽(由上海吉尔生化合成公司完成)，通过MALDI-TOF-MS质谱进行多肽质量控制。
[0053] 实施例3本发明蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2的抑菌活性检测
[0054] 称取实施例2中合成的蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2，采用微量稀释法对抗菌肽AcHy-a2的杀菌活性进行检测，并以广谱半合成抗生素Amp及氨基糖苷类抗生素Kana作为阳性对照，评价本发明抗菌肽AcHy-a2的抑菌活性。
[0055] 试验步骤如下：菌种复苏，将标准菌株金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003-5a20]接种在营养肉汤培养基内，37℃生化培养箱中培养24h后经LB固体培养基划线纯化培养后，取一接种环菌接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温培养6h，细菌血球计数仪计数，菌液浓度为1.4*1010cfu/mL，用培养基稀释菌落至105cfu/mL，受试药AcHy-a2及阳性药Amp、Kana浓度均为100μg/ml，设置C0为培养基空白对照组，C为培养基+菌对照组，Amp及Kana为两种阳性对照。各管中加入已校正的菌液(105cfu/mL)0.1mL，混匀后放置37℃培养，并与不同时间点监测抑菌活性，分别与3h、6h、9h及18h酶标仪检测OD600，以评价药物对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用，实验设置3个复孔。
[0056] 结果显示：与C组(即培养基+菌对照)相比，AcHy-a2在3h内对金黄色葡萄球菌有较好抑菌效果，抑菌效果与Amp及Kana接近。结果见附图2、附图3。
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