靶向VEGFR-1/NRP-1的肽
阅读：103发布：2020-07-09
专利汇可以提供靶向VEGFR-1/NRP-1的肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及分子医学和 治疗 剂靶向递送的领域。更具体地说，本发明涉及新肽序列的鉴定，所述新肽序列包含 氨 基酸Leu-Pro-Arg(LPR)，尤其是D(LPR)，它们选择性靶向表达VEGFR-1和NRP-1的细胞。本发明的靶向分子可用于治疗和检测新血管生成或血管生成VEGF相关病症，所述病症包括但不限于：癌症、 肥胖症 、糖尿病、哮喘、关节炎、硬化和眼病。，下面是靶向VEGFR-1/NRP-1的肽专利的具体信息内容。
1.大小为10个氨基酸或更小的分离的肽，至少含连续的氨基酸序列Leu Pro Arg。
2.权利要求1的分离的肽，其中所述肽的大小为7个氨基酸或更小。
3.权利要求2的分离的肽，其中所述肽的大小为5个氨基酸或更小。
4.权利要求1的分离的肽，还被定义为含Cys Leu Pro Arg Cys(SEQ ID NO：1)。
5.权利要求4的分离的肽，还被定义为由SEQ ID NO：1构成。
6.权利要求5的分离的肽，还被定义为环肽。
7.权利要求1的分离的肽，其中所述肽由序列Leu Pro Arg构成。
8.权利要求7的分离的肽，其中所述肽由D(Leu Pro Arg)构成。
9.权利要求1的分离的肽，还被定义为含一个或多个D氨基酸。
10.权利要求9的分离的肽，其中所述肽由D氨基酸构成。
11.权利要求1～10中任一项的分离的肽，其中所述肽附着于分子。
12.权利要求11的分离的肽，其中所述分子是蛋白，且所述肽与所述蛋白缀合形成蛋白缀合物。
13.权利要求12的分离的肽，其中所述肽位于所述蛋白末端。
14.权利要求11～13中任一项的分离的肽，其中所述分子是药物、化学治疗剂、诊断剂、放射性同位素、促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、细胞毒性剂、肽、蛋白质、抗生素、抗体或其片段或单链抗体，显像剂，存活因子，抗凋亡剂，激素拮抗剂，抗原。
15.权利要求14的分离的肽，其中所述分子是选自下列的促凋亡剂：短杆菌肽、马加宁、蜂毒素、防御素、杀菌肽、(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：2)、(KLAKKLA)2(SEQ ID NO：3)；
(KAAKKAA)2(SEQ ID NO：4)、(KLGKKLG)3(SEQ ID NO：5)、Bcl-2、Bad、Bak、Bax、和Bik。
16.权利要求14的分离的肽，其中所述分子是选自下列的抗血管生成剂：凝血酶敏感蛋白、血管抑素、色素上皮衍生因子、血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相关蛋白、羧基氨基三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、多胺、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、信号肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4、米诺环素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C端血液结合素结构域、人纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱导的单核因子(Mig)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(鳍样酪氨酸激酶1受体)、和激酶插入结构域受体(KDR)。
17.权利要求14的分离的肽，其中所述分子是选自下列的细胞因子：白细胞介
素-1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、干扰素-γ(IF-γ)、IF-α、IF-β、肿瘤坏死因子、和GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。
18.权利要求11的分离的肽，其中所述肽附着于高分子复合物。
19.权利要求18的分离的肽，其中所述复合物是：病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微颗粒、磁珠、酵母细胞、或哺乳动物细胞。
20.权利要求19的分离的肽，其中所述肽与病毒连接。
21.权利要求20的分离的肽，其中所述病毒是慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆转录病毒、AAV、牛痘病毒或疱疹病毒。
22.权利要求1～21中任一项的分离的肽，其中所述肽附着于固体支持物。
23.权利要求22的分离的肽，其中所述固体支持物是微孔盘或微芯片。
24.蛋白融合构建体，其含权利要求1～10中任一项的分离的肽，所述肽融合选定蛋白形成蛋白融合构建体，其中所述蛋白融合构建体不是天然存在的蛋白。
25.权利要求24的融合构建体，其中所述选定蛋白是促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、细胞毒性剂、蛋白抗生素、抗体或其片段或单链、抗凋亡剂、激素拮抗剂、或抗原。
26.权利要求25的融合构建体，其中所述选定蛋白是选自下列的促凋亡剂：短杆菌肽、马加宁、蜂毒素、防御素、杀菌肽、(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：2)、(KLAKKLA)2(SEQ ID NO：3)、(KAAKKAA)2(SEQ ID NO：4)、(KLGKKLG)3(SEQ ID NO：5)、Bcl-2、Bad、Bak、Bax、和Bik。
27.权利要求25的融合构建体，其中所述选定蛋白是选自下列的抗血管生成剂：凝血酶敏感蛋白、血管抑素、色素上皮衍生因子、血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、血小板因子4、IP-10、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相关蛋白、血管生成素2、16K催乳素片段、内皮抑素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C端血液结合素结构域、人纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱导的单核因子(Mig)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(鳍样酪氨酸激酶1受体)、和激酶插入结构域受体(KDR)。
28.权利要求25的融合构建体，其中所述选定蛋白是选自下列的细胞因子：白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、干扰素-γ(IF-γ)、IF-α、IF-β、肿瘤坏死因子、和GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。
29.制备VEGFR-1/NRP-1靶向构建体的方法，其包括：
●获得权利要求1～10中任一项的肽，及
●将所述肽附着于分子，以制备所述构建体。
30.将分子或蛋白递送靶向表达VEGFR-1或NRP-1的细胞的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)获得：
●权利要求11～21中任一项的肽，
●权利要求24～28中任一项的蛋白融合构建体，或
●根据权利要求29的方法制备的靶向构建体；及
(b)将所述肽或蛋白融合构建体施用于细胞群，由此将所述分子或蛋白递送到所述细胞，其中所述群包括表达VEGFR-1或NRP-1的细胞。
31.权利要求30的方法，其中，
●所述表达VEGFR-1或NRP-1的细胞在受试者中，
●将所述肽或蛋白融合构建体配于药学可接受的组合物中，及
●将所述组合物施用于所述受试者。
32.权利要求31的方法，其中所述受试者是人受试者。
33.权利要求30的方法，其中所述方法还被定义为检测方法，且所述方法还包括检测已递送到所述细胞的所述肽或蛋白。
34.权利要求31的方法，其中所述受试者患有疾病或病症，且所述方法还被定义为治疗方法。
35.权利要求34的方法，受试者患有血管生成组分上的疾病或病症，且所述受试者需要抗血管生成治疗。
36.权利要求35的方法，其中所述疾病或病症是：过度增生疾病、体重失调、肥胖症、糖尿病、哮喘、关节炎、硬化、或眼病。
37.权利要求36的方法，其中所述受试者患有过度增生疾病。
38.权利要求37的方法，其中所述过度增生疾病是：类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、瘤前病变(如腺瘤性增生和前列腺上皮内瘤)、原位癌、口腔毛状白斑、或牛皮癣。
39.权利要求37的方法，其中所述过度增生疾病是癌症。
40.权利要求39的方法，其中所述癌症选自：牙龈癌、舌癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、眼癌、脑癌、白血病、间皮瘤、成神经细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤和膀胱癌。
41.权利要求36的方法，其中所述受试者患有以眼内细胞增生或新血管生成为特征的眼疾病或病症。
42.权利要求41的方法，其中所述眼病选自：老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、青光眼、和增生性玻璃体视网膜病变。
43.权利要求34的方法，其中所述受试者患有体重失调。
靶向VEGFR-1/NRP-1的肽
[0001] 本发明在美国政府的国家卫生研究所的资金CA103056和CA100632的支持下完成。因此美国政府具有本发明的某些权利。
背景技术
1.技术领域
[0003] 本发明涉及分子医学和治疗剂的靶向递送领域。本发明更具体涉及新肽序列的鉴定，所述肽选择性地靶向VEGFR-1和NRP-1作为治疗靶点，来治疗和检测新血管或血管生成
VEGF相关的病症，包括但不限于：癌症，肥胖症，糖尿病，哮喘，关节炎，硬化和眼病
VEGF相关的病症，包括但不限于：癌症，肥胖症，糖尿病，哮喘，关节炎，硬化和眼病
[0004] 2.相关技术说明
[0005] 血管是身体的必要组分，向几乎所有器官和组织输送氧气和营养。大部分血管形成于胚胎发育时期，成年后新血管的形成(这一过程叫做血管生成)受到限制，主要在创伤
愈合和女性生理周期时发生。这对一些疾病的治疗来说是一个机遇，因为一旦可诱导形成
新的血管，一些疾病就会发展；开发血管生成抑制剂，可使包括癌症，肥胖症，糖尿病，哮喘，关节炎，硬化和眼病在内的许多疾病发展减缓或阻断。
愈合和女性生理周期时发生。这对一些疾病的治疗来说是一个机遇，因为一旦可诱导形成
新的血管，一些疾病就会发展；开发血管生成抑制剂，可使包括癌症，肥胖症，糖尿病，哮喘，关节炎，硬化和眼病在内的许多疾病发展减缓或阻断。
[0006] 血管内皮生长因子(VEGF)被视为是血管生成中的核心分子控制因子，美国食品和药物管理局已经批准了3种抗VEGF的药物用于特定类型的癌症的治疗，取得了良好，但
不理想的治疗效果(Kambaand McDonald，2007)。因此，研制新一代靶向于VEGF通路的药物
对多种疾病的治疗有着重大意义。VEGF是血管生成的关键调控因子，其通过结合细胞表面
VEGF酪氨酸激酶受体(VEGFR-1和-2)和neuropilin(NRP)来刺激内皮细胞分裂和迁移。
由于VEGFR-2是VEGF有丝分裂细胞内信号转导的主要介质，现在临床中大部分药物直接
或间接作用于该受体。另外，起初认为VEGFR-1和NRP-1是VEGF(VEGFR-1)的诱饵或结合
槽(sink)，或是VEGFR-2活性的调节物(NRP-1)。然而，过去几年的研究表明它们有其他作
用。这些受体在血管生成中作用巨大(Carmeliet等人，2001；Autiero等人，2003；Luttun
等人，2004；Kaplan等人，2005；Wu等人，2006；Pan等人，2007)，并且是血管生成治疗的重要靶点。例如，直接作用于VEGFR-1和NRP-1的单克隆抗体已经被认为是有前途的抗肿瘤
剂，特别是和化学疗剂联用(Wu等人，2006；Pan等人，2007)。
不理想的治疗效果(Kambaand McDonald，2007)。因此，研制新一代靶向于VEGF通路的药物
对多种疾病的治疗有着重大意义。VEGF是血管生成的关键调控因子，其通过结合细胞表面
VEGF酪氨酸激酶受体(VEGFR-1和-2)和neuropilin(NRP)来刺激内皮细胞分裂和迁移。
由于VEGFR-2是VEGF有丝分裂细胞内信号转导的主要介质，现在临床中大部分药物直接
或间接作用于该受体。另外，起初认为VEGFR-1和NRP-1是VEGF(VEGFR-1)的诱饵或结合
槽(sink)，或是VEGFR-2活性的调节物(NRP-1)。然而，过去几年的研究表明它们有其他作
用。这些受体在血管生成中作用巨大(Carmeliet等人，2001；Autiero等人，2003；Luttun
等人，2004；Kaplan等人，2005；Wu等人，2006；Pan等人，2007)，并且是血管生成治疗的重要靶点。例如，直接作用于VEGFR-1和NRP-1的单克隆抗体已经被认为是有前途的抗肿瘤
剂，特别是和化学疗剂联用(Wu等人，2006；Pan等人，2007)。
[0007] 许多抗VEGF药物，如贝伐珠单抗( )和ranibizumab()，已用于临床，其对新血管生成病症(包括各种类型的癌症，及影响眼的新血管生成疾
病(如老年性黄斑变性))的治疗和调控有一定的功效。不幸的是，该非特异的VEGF治
疗有着潜在的严重的副作用，特别是心脏相关的毒副作用(如，胸痛，中风，轻度中风
(ministrokes)，充血性心力衰竭和心脏病，出血，蛋白尿，高血压，充血性心力衰竭，动脉血栓栓塞和胃肠穿孔)。一些研究认为这些副作用与这些直接靶向血管内皮生长因子
(VEGF-A；VEGF165)的药物有关，与选择性靶向受体相反，这些药物对正常的VEGF通路有不
利影响(Betsholtz等人，2006)。VEGF-A在众多被认为调控血管生成的分子中具有特殊地
位。胚胎发育时期，它控制许多发育过程，从血管系统最早的细胞前体的扩展到内皮细胞的
增生和迁移，血管重塑和动静脉特化(Ferrara，2004)。VEGF-A蛋白的正确水平对血管发育
极为关键，因为它的表达量减半或翻倍都是会使小鼠胚胎致死的条件。
病(如老年性黄斑变性))的治疗和调控有一定的功效。不幸的是，该非特异的VEGF治
疗有着潜在的严重的副作用，特别是心脏相关的毒副作用(如，胸痛，中风，轻度中风
(ministrokes)，充血性心力衰竭和心脏病，出血，蛋白尿，高血压，充血性心力衰竭，动脉血栓栓塞和胃肠穿孔)。一些研究认为这些副作用与这些直接靶向血管内皮生长因子
(VEGF-A；VEGF165)的药物有关，与选择性靶向受体相反，这些药物对正常的VEGF通路有不
利影响(Betsholtz等人，2006)。VEGF-A在众多被认为调控血管生成的分子中具有特殊地
位。胚胎发育时期，它控制许多发育过程，从血管系统最早的细胞前体的扩展到内皮细胞的
增生和迁移，血管重塑和动静脉特化(Ferrara，2004)。VEGF-A蛋白的正确水平对血管发育
极为关键，因为它的表达量减半或翻倍都是会使小鼠胚胎致死的条件。
[0008] VEGF定向疗法相关毒性被认为与正常毛细血管床和含VEGF的心脏细胞失去有关，VEGF是正常细胞功能和血管化所必须的。有趣的是，依赖VEGF的毛细血管床享有共同
特征，即表现出高表达被称为2型和3型受体的VEGF受体(分别为VEGFR-2和VEGFR-3)，
还表现出少或无VEGFR-1受体。然而，在那些与期望的疾病靶点(包括视网膜血管和肿瘤
血管系统)有关的组织中发现有VEGFR-1受体的表达。因此，极需开发特异性靶向VEGFR-1
受体的抗VEGF疗法，这些治疗方法有望能在保持所需治疗活性的同时减少毒副作用。本发
明涉及提供选择性靶向VEGFR-1的肽配体。
特征，即表现出高表达被称为2型和3型受体的VEGF受体(分别为VEGFR-2和VEGFR-3)，
还表现出少或无VEGFR-1受体。然而，在那些与期望的疾病靶点(包括视网膜血管和肿瘤
血管系统)有关的组织中发现有VEGFR-1受体的表达。因此，极需开发特异性靶向VEGFR-1
受体的抗VEGF疗法，这些治疗方法有望能在保持所需治疗活性的同时减少毒副作用。本发
明涉及提供选择性靶向VEGFR-1的肽配体。
发明内容
[0009] 本发明通过使用靶向基序LPR(Leu-Pro-Arg)(更优选为D(LPR)提供选择性靶向VEGFR-1和NRP-1(以下称为“VEGFR-1/NRP-1”)的方法和组合物来克服了现有技术的缺陷。
通过使用LPR基序选择性靶向VEGFR-1/NRP-1可用于例如治疗癌症或其他与血管生成或血
管生长有关的疾病(如肥胖症，糖尿病，哮喘，关节炎、硬化和眼病)。
通过使用LPR基序选择性靶向VEGFR-1/NRP-1可用于例如治疗癌症或其他与血管生成或血
管生长有关的疾病(如肥胖症，糖尿病，哮喘，关节炎、硬化和眼病)。
[0010] 在某些实施方式中，本发明涉及分离的LPR靶向肽，就是说，靶向肽结构中包含连续的LPR序列的肽，例如，所述LPR序列位于所述肽的氨基端或羧基端或者内部。尽管认为
LPR序列位于末端最好，但认为LPR位于内部也有靶向VEGFR-1/NRP-1的能力。为了便于制
备和操作，本发明的某些实施方式涉及10个氨基酸或更小尺寸的分离的肽，至少包含连续
的氨基酸序列Leu Pro Arg。因此，即使更短的短肽，例如，7个或5个氨基酸，或者更小尺
寸的肽，甚至是LPR三肽本身会甚至更优选。因此，本发明的靶向肽可含3、4、5、6、7、8、9或
10个氨基酸，其中，连续的LPR序列或SEQ ID NO：1的序列位于其中。
LPR序列位于末端最好，但认为LPR位于内部也有靶向VEGFR-1/NRP-1的能力。为了便于制
备和操作，本发明的某些实施方式涉及10个氨基酸或更小尺寸的分离的肽，至少包含连续
的氨基酸序列Leu Pro Arg。因此，即使更短的短肽，例如，7个或5个氨基酸，或者更小尺
寸的肽，甚至是LPR三肽本身会甚至更优选。因此，本发明的靶向肽可含3、4、5、6、7、8、9或
10个氨基酸，其中，连续的LPR序列或SEQ ID NO：1的序列位于其中。
[0011] 在另一些特定实施方式中，本发明涉及合并了可被制成环形的LPR序列的特定肽，例如两端具有半胱氨酸残基(“C”)的肽，如果需要，可例如通过形成二-半胱氨酸(即
胱氨酸)将其以环形提供。该肽的一例为Cys Leu Pro Arg Cys(SEQ ID NO：1)。该环肽
可能由于二硫键的作用使得它们对化学、温度或酶解有显著的稳定性。考虑到可用性差，易
受蛋白水解和体内半衰期短这些问题，该环肽在治疗和诊断中可能有特别的重要作用。
胱氨酸)将其以环形提供。该肽的一例为Cys Leu Pro Arg Cys(SEQ ID NO：1)。该环肽
可能由于二硫键的作用使得它们对化学、温度或酶解有显著的稳定性。考虑到可用性差，易
受蛋白水解和体内半衰期短这些问题，该环肽在治疗和诊断中可能有特别的重要作用。
[0012] 另一些实施方式中，本发明涉及D氨基酸用于制备上述肽的全部或部分的用途。与L型氨基酸构成的肽相比，D氨基酸构成的肽有特定的优势，D氨基酸的使用使本发明的
靶向肽能抵抗蛋白酶和肽酶的作用。本发明这方面尤其优选完全由D氨基酸构成的靶向
肽，如D(LeuPro Arg)和D(Cys Leu Pro Arg Cys)(SEQ ID NO：1)。
靶向肽能抵抗蛋白酶和肽酶的作用。本发明这方面尤其优选完全由D氨基酸构成的靶向
肽，如D(LeuPro Arg)和D(Cys Leu Pro Arg Cys)(SEQ ID NO：1)。
[0013] 某些实施方式中，LPR靶向部分，如前所述，可与第二分子或物质有效缀合。在优选实施方式中，该结合为共价结合，如化学缀合物(如，通过用化学接头形成)或融合构建
体(如，通过将编码融合肽的核酸编码区与编码期望靶向VEGFR-1/NRP-1的期望蛋白或肽
的核酸编码区框内融合而形成)所例示。在靶向蛋白或肽中，靶向肽可位于或邻近期望靶
向的蛋白或肽的氨基端或羧基端(即头20个或末20个氨基酸内)。
体(如，通过将编码融合肽的核酸编码区与编码期望靶向VEGFR-1/NRP-1的期望蛋白或肽
的核酸编码区框内融合而形成)所例示。在靶向蛋白或肽中，靶向肽可位于或邻近期望靶
向的蛋白或肽的氨基端或羧基端(即头20个或末20个氨基酸内)。
[0014] 在各选定的实施方式中，所述第二分子或物质是诊断剂、药物、化学治疗剂、放射性同位素、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞毒性剂、肽、蛋白质、激素、生长因子、细胞因子、抗生素、抗体或片段或单链抗体、显像剂、存活因子、抗凋亡剂、激素拮抗剂或抗原。这些分子或物质仅为代表，实际上可将任何可在癌症治疗中产生治疗或诊断益处的分子附着于LPR
靶向部分，且/或在本发明的范围内施用于受试者。
靶向部分，且/或在本发明的范围内施用于受试者。
[0015] 因此，当待靶向分子是促凋亡剂时，例示制剂包括：依托泊苷、神经酰胺鞘磷脂、Bcl-2、Bax、Bid、Bik、Bad、细胞凋亡蛋白酶-3，细胞凋亡蛋白酶-8，细胞凋亡蛋白酶-9，fas，fas配体、fadd、fap-1、tradd、faf、rip、reaper、凋亡素(apoptin)，白细胞介素-2转化酶，膜联蛋白V、(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：2)、(KLAKKLA)2(SEQ ID NO：3)、(KAAKKAA)2(SEQ ID NO：4)、或(KLGKKLG)3(SEQ ID NO：5)。需知，对于本发明的全部肽，如上所述的序列可以D型和L型提供。例如，对促凋亡肽(如，SEQ ID NO：2～5)而言，认为D型和L型均有着
相似的促凋亡活性，但D型由于其相关的蛋白酶抗性而有基本上更长的半衰期。然而，某些
情况下，L型由于潜在的降低的毒副作用(由于其较短的半衰期)而在实践中更有优势。
相似的促凋亡活性，但D型由于其相关的蛋白酶抗性而有基本上更长的半衰期。然而，某些
情况下，L型由于潜在的降低的毒副作用(由于其较短的半衰期)而在实践中更有优势。
[0016] 此外，在待靶向分子是抗血管生成剂的实施方式中，例示制剂包括：凝血酶敏感蛋白、血管抑素(如血管抑素5)、血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、细胞因子(如白细胞介素12)、血小板因子4、
IP-10、Gro-β、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相关蛋白、羧基氨基三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)，除莠霉素A，PNU145156E、16K催乳素片段、利
诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素(如内皮抑素XVII和XV)、紫杉醇、多西紫杉醇)、多胺、蛋白酶抑制剂、激酶抑制剂、信号肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、米诺环素、基质金属蛋白酶-2的C端血液结合素结构域、人纤溶
酶原kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原kringle
5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱导的单核因子(Mig)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶
性FLT-1(鳍样酪氨酸激酶1受体)、激酶插入结构域受体(KDR)、色素上皮衍生因子、干扰
素-α(第4线干扰素)、信号转导抑制剂(SU5416、SU6668，Sugen，South SanFrancisco，
CA)。
IP-10、Gro-β、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相关蛋白、羧基氨基三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)，除莠霉素A，PNU145156E、16K催乳素片段、利
诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素(如内皮抑素XVII和XV)、紫杉醇、多西紫杉醇)、多胺、蛋白酶抑制剂、激酶抑制剂、信号肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、米诺环素、基质金属蛋白酶-2的C端血液结合素结构域、人纤溶
酶原kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑素的融合蛋白、内皮抑素和人纤溶酶原kringle
5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱导的单核因子(Mig)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶
性FLT-1(鳍样酪氨酸激酶1受体)、激酶插入结构域受体(KDR)、色素上皮衍生因子、干扰
素-α(第4线干扰素)、信号转导抑制剂(SU5416、SU6668，Sugen，South SanFrancisco，
CA)。
[0017] 另一些优选实施方式中，当靶向分子是细胞因子时，例示细胞因子包括：白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、IL-24、干扰素-γ(INF-γ)、干扰素-α、干扰素-β、肿瘤坏死因子(如TNF-α)、或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因
子)。
子)。
[0018] 上述例子仅为代表，并不旨在排除其他本领域中已知的促凋亡剂、抗血管生成剂或细胞因子。
[0019] 本发明的其他实施方式中，所述分离的肽可附着于高分子复合物。在优选实施方式中，所述高分子复合物是：病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微颗粒、纳米颗粒(例如金纳米颗粒)、磁珠、酵母细胞、哺乳动物细胞或细菌细胞。当为病毒时，尤其优选包括：噬菌体、慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆转录病毒、AAV、牛痘病毒或疱疹病毒。这只是代表性例子，本发明范围内的高分子复合物可包括实际上任何可附着靶向肽并施用于受试者的高分子复合
物。在其他优选实施方式中，所述分离的肽可附着于真核表达载体，更优选为基因治疗载
体。
物。在其他优选实施方式中，所述分离的肽可附着于真核表达载体，更优选为基因治疗载
体。
[0020] 再一实施方式中，所述分离的肽可附着于固体支持物，优选为：磁珠，Sepharose珠、琼脂糖珠、硝酸纤维素膜、尼龙膜、柱层析基质、高效液相色谱(HPLC)基质、快速高效液相色谱法(FPLC)基质、微孔板或微芯片。
[0021] 另一实施方式中，本发明涉及蛋白融合构建体，其含上述LPR靶向肽中的任一种，所述靶向肽融合选定蛋白融合形成蛋白融合构建体，所得到的蛋白融合构建体(其特征在
于还包括LPR靶向部分)优选为人造的，而不是天然存在的蛋白。一般而言，在所述优选的
实施方式中，可用任何上述类别的分子来制备所述蛋白融合构建体。
于还包括LPR靶向部分)优选为人造的，而不是天然存在的蛋白。一般而言，在所述优选的
实施方式中，可用任何上述类别的分子来制备所述蛋白融合构建体。
[0022] 另一些实施方式中，本发明涉及VEGFR-1/NRP-1靶向构建体的制备，其包括：获得上述LPR靶向肽，及将所述肽附着(优选通过共价附着)于分子，以制备所述构建体。如上
所述，当所述待靶向分子是蛋白或肽时，优选的靶向构建体将是所述靶向肽附着于所述分
子的氨基端或羧基端的靶向构建体。
所述，当所述待靶向分子是蛋白或肽时，优选的靶向构建体将是所述靶向肽附着于所述分
子的氨基端或羧基端的靶向构建体。
[0023] 本发明还涉及将分子或蛋白递送靶向表达VEGFR-1或NRP-1的细胞的方法，其中所述方法包括：获得上述LPR靶向肽或上述蛋白融合构建体，或着如上所述制备的靶向构
建体，及将所述肽或蛋白融合构建体施用于细胞群，由此将所述分子或蛋白递送到所述细
胞，其中所述群包括表达VEGFR-1或NRP-1的细胞。一般而言，当所述缀合物或融合蛋白旨
在应用于受试者(如人受试者)的诊断和治疗时，将所述缀合物或融合蛋白配于药物可接
受的组合物中，并将所述组合物施用于所述受试者。
建体，及将所述肽或蛋白融合构建体施用于细胞群，由此将所述分子或蛋白递送到所述细
胞，其中所述群包括表达VEGFR-1或NRP-1的细胞。一般而言，当所述缀合物或融合蛋白旨
在应用于受试者(如人受试者)的诊断和治疗时，将所述缀合物或融合蛋白配于药物可接
受的组合物中，并将所述组合物施用于所述受试者。
[0024] 认为在治疗患有疾病或病症的患者时，所述受试者一般会需要抗血管生成治疗。所述疾病或病症包括：过度增生疾病、体重失调、肥胖症、糖尿病、哮喘、关节炎，硬化或眼病。认为可用本发明的治疗性缀合物治疗例示过度增生疾病，所述过度增生疾病包括：类风
湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、瘤前病变(如腺瘤性增生和前列腺内上皮瘤)、原位癌、口腔毛状白斑、
或牛皮癣。
湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、瘤前病变(如腺瘤性增生和前列腺内上皮瘤)、原位癌、口腔毛状白斑、
或牛皮癣。
[0025] 本发明还包括，本发明的缀合物可用于许多癌症的治疗，尤其是那些高度血管生成性癌症。例示癌症包括：牙龈癌、舌癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、眼癌、脑癌、白血病、间皮瘤、成神经细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、肝癌、子宫颈癌、头颈部癌、骨癌、食道癌、子宫癌、膀胱癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤，胃癌、和膀胱癌。
[0026] 另一些实施方式中，认为待治疗受试者患有以眼内细胞增生或新血管生成为特征的眼疾病或病症。例示病症包括：老年性黄斑变性、增生性糖尿病性视网膜病变、早产儿视
网膜病变、青光眼、增生性玻璃体视网膜病变，眼部缺血综合征引起的新血管生成、视网膜
分支静脉阻塞引起的新血管生成、视网膜中央静脉阻塞引起的新血管生成、或镰状细胞视
网膜病变引起的新血管生成。
网膜病变、青光眼、增生性玻璃体视网膜病变，眼部缺血综合征引起的新血管生成、视网膜
分支静脉阻塞引起的新血管生成、视网膜中央静脉阻塞引起的新血管生成、或镰状细胞视
网膜病变引起的新血管生成。
[0027] 另一些实施方式中，本发明包括，本发明的缀合物可用于治疗体重失调(如肥胖症)。
[0029] 图1A、1B.D(LPR)抑制体内新血管生成。移植7天后含500μg/ml的D(LPR)或对照肽的基质胶填料的代表图(a，下图)。切断基质胶填料，并通过测量基质胶填料中的血红
蛋白含量来定量血管形成。柱形图表示同一实验中的代表性动物(a，上图)。(b)人von
Willebrand因子血管阳性的数量(P＜0.01)。
蛋白含量来定量血管形成。柱形图表示同一实验中的代表性动物(a，上图)。(b)人von
Willebrand因子血管阳性的数量(P＜0.01)。
[0030] 图2A，2B，2C.D(LPR)抑制局部缺血诱导的视网膜血管生成。
[0031] (a)通过暴露于75％的氧，再用D(LPR)处理(每天以20mg/Kg进行注射)来在C57B6新生小鼠中诱导视网膜新血管生成。
[0032] (b)H&E视网膜切片(P19天)表明，与对照动物相比，视网膜内表面(箭头所指)新血管的形成显著降低。
[0033] (c)在P19天内表面内皮细胞核定量。
[0034] 图3A，3B.用D(LPR)治疗携肿瘤小鼠降低肿瘤生长。将携带源于EF43.fgf4的肿瘤的Balb/c小鼠分组(N＝7)，并每天用50mg/Kg的D(LPR)或其环状形式D(CLPR)、对照肽
或仅媒质处理。
或仅媒质处理。
[0035] (a)处理5天后，接收D(LPR)或其环状形式D(CLPRC)的动物与对照组相比肿瘤体积减小，
[0036] (b)盒型图代表中值和方差。接收D(LPR)或其环状形式D(CLPRC)的动物之间的肿瘤体积差异显著(P＜0.02)。两组独立的实验得到结果相似。
[0037] 图4A，4B，4C.用VEGF模拟化合物D(CLPRC)对肥胖症的治疗。将喂了高热量高脂肪的食物的肥胖症小鼠(C57BL/6)(体重在40～50g之间)用于该研究。将动物分成4组，
每天经以下处理：
每天经以下处理：
[0038] (a)腹膜内注射VEGF-模拟肽D(CLPRC)(50mg/Kg)；
[0039] (b)以1mg/Kg皮下注射脂肪除手(Fat-zapper)肽(CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2；Kolonin等人，2004)，联合以50mg/Kg注射VEGF模拟肽D(CLPRC)；或
[0040] (c)3mg/Kg的脂肪除手。
[0041] 对照组动物仅注射媒质(磷酸盐缓冲溶液，PBS)。
[0042] 实施方式
[0043] 1.概述
[0044] 由组合库鉴定的肽是药物发现和设计的重要线索。他们易于合成，并易于经各种官能团修饰，为科学和医学提供了有效的工具来合理地设计药物和选择性靶向。由于与高
分子(如抗体)相比较小的分子量，这些肽在组织渗透性和生物分布上有优势，从而使它们
成为药物发现和开发的出色的潜在化合物(见Falciani等人的总述，2005)。事实上，已将
通过噬菌体展示鉴定的肽成功用于体内靶向治疗，以递送化学治疗物(Arap，1998#10)、促
凋亡肽(Ellerby，1999#69)，或递送病毒来成像和进行基因治疗(Hajitou，2006#6744)。然
而，它们在药物开发中的应用受到各种困难的阻碍。
分子(如抗体)相比较小的分子量，这些肽在组织渗透性和生物分布上有优势，从而使它们
成为药物发现和开发的出色的潜在化合物(见Falciani等人的总述，2005)。事实上，已将
通过噬菌体展示鉴定的肽成功用于体内靶向治疗，以递送化学治疗物(Arap，1998#10)、促
凋亡肽(Ellerby，1999#69)，或递送病毒来成像和进行基因治疗(Hajitou，2006#6744)。然
而，它们在药物开发中的应用受到各种困难的阻碍。
[0045] 肽通常不是合适的药物，因为它们很快被蛋白酶降解而从血浆中清除。在需要细胞增生、迁移和组织重塑(常见于大多数生理学过程，如血管生成)的生物过程中，蛋白酶
表达经常上调，导致局部蛋白水解活性上升和肽降解。从药物设计的角度上看，肽常表现出
广泛的构象变异，使得结构研究非常困难(Giordano等人，2005)。因此，基于通过噬菌体展
示鉴定的潜在肽的肽模拟化合物的设计是一项艰巨的任务，并且经常局限于有合成能力和
大量化合物库的制药公司和实验室。
表达经常上调，导致局部蛋白水解活性上升和肽降解。从药物设计的角度上看，肽常表现出
广泛的构象变异，使得结构研究非常困难(Giordano等人，2005)。因此，基于通过噬菌体展
示鉴定的潜在肽的肽模拟化合物的设计是一项艰巨的任务，并且经常局限于有合成能力和
大量化合物库的制药公司和实验室。
[0046] 血管生成是从原有血管的新血管萌发，并且是肿瘤生长和转移(Folkman，1971)及多种病理病症(例如糖尿病、牛皮癣、肥胖症、和类风湿性关节炎)的必要因素
(Carmeliet，2005)。成年人的血管生成仅在伤口愈合、怀孕和月经周期时发生，因此，靶
向血管生成血管的药物可对许多疾病有着重要的临床应用(Carmeliet等人，2005)。血
管内皮生长因子(VEGF)及其受体是该领域关注的中心，因为它们在血管发育中用关键作
用。VEGF通过结合酪氨酸激酶受体(VEGFR-1，VEGFR-2)和neuropilin-1(NRP-1)发挥作
用(Olsson等人，2006)。VEGF对细胞内信号转导和有丝分裂的大部分影响是由VEGFR-2介
导的，多种靶向这一通路的药物正在临床中进行研究(Cardones和Banez，2006；Schneider
和Sledge，2007)。虽然VEGFR-1和NRP-1是这一过程中重要的参与者，但起初并没有得到
足够的重视，将其视为潜在的治疗靶点。过去几年已经改变了这一看法，并且研究提示两种
受体在血管生成中有重要作用(Luttun等人，2004；Wu等人，2006；Pan等人，2007)。基因
缺失研究表明VEGFR-1和NPR-1是血管发育所必需的。两种分子是VEGF和胎盘生长因子
(PIGF)的受体，且后者与VEGFR-1缀合，参与病理性血管生成(Carmeliet等人，2001)、肿瘤
生长(Luttun等人，2002)，由VEGFR-1/VEGFR-2交叉激活的细胞信号转导增强(Autiero等
人，2003)、及新血管生成时源于骨髓的前体细胞募集(Jin et al，2006；Li等人，2006)。最近的报道已经提示：VEGFR1+造血细胞前体的募集对肿瘤转移的起始很重要(Kaplan等人，
2005)。同样，NRP-1不仅能增强VEGF和VEGFR-2的结合(Soker等人，2002)，还诱导不依赖
于VEGFR-2活化的内皮细胞附着和迁移(Wang等人，2003；Murga等人，2005)。针对NRP-1
的VEGF结合结构域的单克隆抗体和针对VEGFR-1的单克隆抗体都能抑制血管生成和降低
肿瘤生长(Wu等人，2006；Pan等人，2007)。因此，靶向VEGFR-1和NRP-1通路的药物可能
在临床中有重要应用。
(Carmeliet，2005)。成年人的血管生成仅在伤口愈合、怀孕和月经周期时发生，因此，靶
向血管生成血管的药物可对许多疾病有着重要的临床应用(Carmeliet等人，2005)。血
管内皮生长因子(VEGF)及其受体是该领域关注的中心，因为它们在血管发育中用关键作
用。VEGF通过结合酪氨酸激酶受体(VEGFR-1，VEGFR-2)和neuropilin-1(NRP-1)发挥作
用(Olsson等人，2006)。VEGF对细胞内信号转导和有丝分裂的大部分影响是由VEGFR-2介
导的，多种靶向这一通路的药物正在临床中进行研究(Cardones和Banez，2006；Schneider
和Sledge，2007)。虽然VEGFR-1和NRP-1是这一过程中重要的参与者，但起初并没有得到
足够的重视，将其视为潜在的治疗靶点。过去几年已经改变了这一看法，并且研究提示两种
受体在血管生成中有重要作用(Luttun等人，2004；Wu等人，2006；Pan等人，2007)。基因
缺失研究表明VEGFR-1和NPR-1是血管发育所必需的。两种分子是VEGF和胎盘生长因子
(PIGF)的受体，且后者与VEGFR-1缀合，参与病理性血管生成(Carmeliet等人，2001)、肿瘤
生长(Luttun等人，2002)，由VEGFR-1/VEGFR-2交叉激活的细胞信号转导增强(Autiero等
人，2003)、及新血管生成时源于骨髓的前体细胞募集(Jin et al，2006；Li等人，2006)。最近的报道已经提示：VEGFR1+造血细胞前体的募集对肿瘤转移的起始很重要(Kaplan等人，
2005)。同样，NRP-1不仅能增强VEGF和VEGFR-2的结合(Soker等人，2002)，还诱导不依赖
于VEGFR-2活化的内皮细胞附着和迁移(Wang等人，2003；Murga等人，2005)。针对NRP-1
的VEGF结合结构域的单克隆抗体和针对VEGFR-1的单克隆抗体都能抑制血管生成和降低
肿瘤生长(Wu等人，2006；Pan等人，2007)。因此，靶向VEGFR-1和NRP-1通路的药物可能
在临床中有重要应用。
[0047] 本发明提供了独特的血管生成抑制剂和VEGFR-1靶向剂，LPR和D(LPR)，它们在三种不同检测中表现出显著降低血管生成。D(LPR)在全身施用后还能抑制两种动物模型中
的新血管生成。由于D(LPR)具有抵抗胰酶混合物的降解的耐受性，这些数据表明，此化合
物，及合并该序列的更大肽结构可明显存活于消化道中，并可口服施用于患者。因此，本发
明通过鉴定LPR基序来克服了现有技术中的困难，所述基序用于制备选择性靶向VEGFR-1/
NRP-1的组合物、治疗剂或诊断剂，如用于治疗和/或检测新血管或血管生成的VEGF相关的
病症，所述病症包括但不限于：癌症、肥胖症、糖尿病、哮喘、关节炎、硬化和眼病。
的新血管生成。由于D(LPR)具有抵抗胰酶混合物的降解的耐受性，这些数据表明，此化合
物，及合并该序列的更大肽结构可明显存活于消化道中，并可口服施用于患者。因此，本发
明通过鉴定LPR基序来克服了现有技术中的困难，所述基序用于制备选择性靶向VEGFR-1/
NRP-1的组合物、治疗剂或诊断剂，如用于治疗和/或检测新血管或血管生成的VEGF相关的
病症，所述病症包括但不限于：癌症、肥胖症、糖尿病、哮喘、关节炎、硬化和眼病。
[0048] 在某些实施方式中，本明涉及靶向表达VEGFR-1/NPR-1的细胞的特定靶向部分，包括最一般的肽，多肽和蛋白质，它们经修饰而包含LPR基序，所述LPR基序或位于内部，或
者更优选位于或邻近所述肽或蛋白的N端或C端。虽然由于基本上耐受蛋白酶的降解作
用的抗性而优选D氨基酸形式，但是本发明并不排除次优选的L型氨基酸，或D氨基酸和L
氨基酸的混合物的使用。特定实施方式涉及与治疗剂或诊断剂有效偶联的VEGFR-1/NPR-1
靶向部分。某些实施方式中，治疗剂是病毒，所述病毒可经改造而表达VEGFR-1/NPR-1靶向
肽，或者合并有VEGFR-1/NPR-1靶向肽，或所述病毒包膜或纤维蛋白结合有VEGFR-1/NPR-1
靶向肽。靶向病毒可用于包括癌症在内的各种疾病的基因治疗。用肽，经修饰的肽，抗体，
病毒和/或其他亲和制剂选择性靶向肿瘤中和/或肿瘤附近的的血管中的VEGFR-1/NPR-1
的能力提供了治疗癌症的显著优势，可得到提高的功效和潜力。
者更优选位于或邻近所述肽或蛋白的N端或C端。虽然由于基本上耐受蛋白酶的降解作
用的抗性而优选D氨基酸形式，但是本发明并不排除次优选的L型氨基酸，或D氨基酸和L
氨基酸的混合物的使用。特定实施方式涉及与治疗剂或诊断剂有效偶联的VEGFR-1/NPR-1
靶向部分。某些实施方式中，治疗剂是病毒，所述病毒可经改造而表达VEGFR-1/NPR-1靶向
肽，或者合并有VEGFR-1/NPR-1靶向肽，或所述病毒包膜或纤维蛋白结合有VEGFR-1/NPR-1
靶向肽。靶向病毒可用于包括癌症在内的各种疾病的基因治疗。用肽，经修饰的肽，抗体，
病毒和/或其他亲和制剂选择性靶向肿瘤中和/或肿瘤附近的的血管中的VEGFR-1/NPR-1
的能力提供了治疗癌症的显著优势，可得到提高的功效和潜力。
[0049] 2.定义
[0050] 说明书中所提到的“a”或“an”可表示一个或多个、一种或多种。如权利要求中所提到的，与“包含”结合使用的表述“a”或“an”可表示一个或多于一个、一种或多于一种。这里提到的“another”可表示至少有另一个或更多个、另一种或更多种。
[0051] “靶向部分”为包括各种类型的亲和制剂的术语，可用来增强物质向动物特定部位的定位和结合，所述动物特定部位包括：器官、组织、特定细胞类型、病变组织或肿瘤。靶向部分可包括肽、肽模拟物、多肽、抗体、抗体样分子、核酸、适体，及它们的片段。靶向部分还包括小分子。在某些实施方式中，靶向部分可增强物质向胞外表达VEGFR-1/NRP-1(即
VEGFR-1/NRP-1结合在细胞表面或结合在周围的细胞外基质)的细胞的定位。本发明靶向
部分(例如靶向肽及其变体和片段)的选择性结合指所述靶向部分结合靶(如VEGFR-1/
NRP-1)而不显著结合无关蛋白。即使靶向部分也结合其他不与所述靶基本上同源的蛋白，
只要所述蛋白与所述抗体肽靶的片段或结构域享有同源性，则所述靶向部分仍被认为是选
择性结合。在这种情况下，可知，尽管有一些交叉反应，但靶向部分与靶的结合仍是选择性
的。通常，交叉反应程度是可测定的，并可与结合靶区分开来。
VEGFR-1/NRP-1结合在细胞表面或结合在周围的细胞外基质)的细胞的定位。本发明靶向
部分(例如靶向肽及其变体和片段)的选择性结合指所述靶向部分结合靶(如VEGFR-1/
NRP-1)而不显著结合无关蛋白。即使靶向部分也结合其他不与所述靶基本上同源的蛋白，
只要所述蛋白与所述抗体肽靶的片段或结构域享有同源性，则所述靶向部分仍被认为是选
择性结合。在这种情况下，可知，尽管有一些交叉反应，但靶向部分与靶的结合仍是选择性
的。通常，交叉反应程度是可测定的，并可与结合靶区分开来。
[0052] 靶向部分是含一连续的LPR氨基酸序列的肽，其特征在于选择性定位于器官、组织或细胞类型，其包括：特异性结合在特定组织或细胞类型中特异性表达或产生的细胞外
蛋白或分子。选择性定位是可用例如以下方法测定，其中将所述推定的靶向肽序列合并到
在噬菌体外表面展示的蛋白。
蛋白或分子。选择性定位是可用例如以下方法测定，其中将所述推定的靶向肽序列合并到
在噬菌体外表面展示的蛋白。
[0053] “受试者”一般指哺乳动物。在某些实施方式中，所述受试者是：小鼠、兔、猪、马、牛、猫、狗、绵羊、山羊、或灵长类动物。在特定实施方式中，所述受试者是人。
[0054] 3.蛋白和肽
[0055] 在某些实施方式中，本发明涉及至少包含一种蛋白或肽的新组合物。本文中所用的蛋白或肽通常(但不局限于此)是指大小约200个氨基酸至由基因翻译出的全场序列的
蛋白；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3个～约100个氨基酸的肽。方便起见，术语
“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用。
蛋白；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3个～约100个氨基酸的肽。方便起见，术语
“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用。
[0056] 某些实施方式中，至少一种蛋白或肽的大小可包括，但不限于：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、约110、约120、约130、约140、约
150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约275、约
300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约
600、约625、约650、约675、约700、约725、约750、约775、约800、约825、约850、约875、约
900、约925、约950、约975、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1750、约2000、约2250、约2500或更多氨基酸残基，或介于它们中的任意氨基酸残基范围(如，约
200～约2500个氨基酸残基)。
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、约110、约120、约130、约140、约
150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约275、约
300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约
600、约625、约650、约675、约700、约725、约750、约775、约800、约825、约850、约875、约
900、约925、约950、约975、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1750、约2000、约2250、约2500或更多氨基酸残基，或介于它们中的任意氨基酸残基范围(如，约
200～约2500个氨基酸残基)。
[0057] 本文所述“氨基酸残基”指任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或本领域已知的任何氨基酸模拟物。在某些实施方式中，蛋白或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸
隔断所述氨基酸残基序列。在另一些实施方式中，该序列可含一个或多个非氨基酸部分。在
特定实施方式中，蛋白或肽的残基序列可被一个或多个非氨基酸部分隔断。
隔断所述氨基酸残基序列。在另一些实施方式中，该序列可含一个或多个非氨基酸部分。在
特定实施方式中，蛋白或肽的残基序列可被一个或多个非氨基酸部分隔断。
[0058] 因此，“蛋白或肽”涵盖含天然存在的蛋白中发现的20种常见氨基酸中的至少一种，或者至少一种经修饰的或不常见的氨基酸的氨基酸序列，所述经修饰的或不常见的氨
基酸包括但不限于：Aad，2-氨基己二酸；EtAsn，N-乙基天冬酰胺；Baad，3-氨基己二酸，
Hyl，羟赖氨酸；Bala，β-丙氨酸，β-氨基-丙酸；AHyl，别羟赖氨酸；Abu，2-氨基丁酸；
3Hyp，3-羟脯氨酸；4Abu，4-氨基丁酸，哌啶酸；4Hyp，4-羟脯氨酸；Acp，6-氨基己酸，Ide，异锁链赖氨酸；Ahe，2-氨基庚酸；AIle，别异亮氨酸；Aib，2-氨基异丁酸；MeGly，N-甲基甘氨酸，肌氨酸；Baib，3-氨基异丁酸；MeIle，N-甲基异亮氨酸；Apm，2-氨基庚二酸；MeLys，
6-N-甲基赖氨酸；Dbu，2，4-二氨基丁酸；MeVal，N-甲基缬氨酸；Des，锁链赖氨酸；Nva，正缬氨酸；Dpm，2，2’-二氨基庚二酸；Nle，正亮氨酸；Dpr，2，3-二氨基丙酸；Orn，鸟氨酸；和EtGly，N-乙基甘氨酸。
基酸包括但不限于：Aad，2-氨基己二酸；EtAsn，N-乙基天冬酰胺；Baad，3-氨基己二酸，
Hyl，羟赖氨酸；Bala，β-丙氨酸，β-氨基-丙酸；AHyl，别羟赖氨酸；Abu，2-氨基丁酸；
3Hyp，3-羟脯氨酸；4Abu，4-氨基丁酸，哌啶酸；4Hyp，4-羟脯氨酸；Acp，6-氨基己酸，Ide，异锁链赖氨酸；Ahe，2-氨基庚酸；AIle，别异亮氨酸；Aib，2-氨基异丁酸；MeGly，N-甲基甘氨酸，肌氨酸；Baib，3-氨基异丁酸；MeIle，N-甲基异亮氨酸；Apm，2-氨基庚二酸；MeLys，
6-N-甲基赖氨酸；Dbu，2，4-二氨基丁酸；MeVal，N-甲基缬氨酸；Des，锁链赖氨酸；Nva，正缬氨酸；Dpm，2，2’-二氨基庚二酸；Nle，正亮氨酸；Dpr，2，3-二氨基丙酸；Orn，鸟氨酸；和EtGly，N-乙基甘氨酸。
[0059] 可用本领域技术人员已知的任意技术来制备蛋白或肽，所述技术包括：用标准的分子生物学技术表达蛋白、多肽或肽，从天然源分离蛋白或肽，或者化学合成蛋白或肽。对
应于各基因的核酸和蛋白、多肽和肽序列已于上述，且可见于本领域普通技术人员已知的
计算机数据库中。所述数据库之一是美国国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数
据库(网址是ncbi.nlm.nih.gov)。已知基因的编码区可用本文所述技术或本领域普通技
术人员知道的技术来扩增和/或表达。另外，蛋白、多肽和肽的各种商业制剂为本领域技术
人员所知。
应于各基因的核酸和蛋白、多肽和肽序列已于上述，且可见于本领域普通技术人员已知的
计算机数据库中。所述数据库之一是美国国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数
据库(网址是ncbi.nlm.nih.gov)。已知基因的编码区可用本文所述技术或本领域普通技
术人员知道的技术来扩增和/或表达。另外，蛋白、多肽和肽的各种商业制剂为本领域技术
人员所知。
[0060] 4.融合蛋白
[0061] 蛋白缀合的其他实施方式涉及融合蛋白。这些分子通常具有靶向肽(如LPR靶向肽)的全部或实质性部分，在N端或C端和第二多肽或蛋白的全部或部分相连。例如，融
合可使用来自其他物种的前导序列，使蛋白在异源宿体中重组表达。另一种可用的融合包
括添加免疫活性域(例如抗体表位)，来例如促进融合蛋白的纯化。包括位于或邻近融合
接头的断裂位点会促进纯化后外来多肽的去除。其他有用的融合包括功能结构域的连接，
例如来自酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区域。在优选实施方式中，本
发明的融合蛋白含与治疗性蛋白或肽连接的LPR靶向肽。可并入融合蛋白的蛋白质或肽
例包括：细胞生长抑制蛋白、杀细胞蛋白、促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药、抗体、Fab片段抗体、抗原、受体蛋白、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白和结合蛋白。这些例子不旨在限制，认为在本发明的范围内，实际上任何蛋白或肽均可并入含靶向
肽的融合蛋白中。制备融合蛋白的方法为本领域技术人员所熟知。所述蛋白可例如通过用
双官能团交联剂进行化学附着，从头合成整个融合蛋白，或通过将编码靶向肽的DNA序列
附着于编码第二蛋白或肽的DNA序列后再表达完整的融合蛋白来得到。
合可使用来自其他物种的前导序列，使蛋白在异源宿体中重组表达。另一种可用的融合包
括添加免疫活性域(例如抗体表位)，来例如促进融合蛋白的纯化。包括位于或邻近融合
接头的断裂位点会促进纯化后外来多肽的去除。其他有用的融合包括功能结构域的连接，
例如来自酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区域。在优选实施方式中，本
发明的融合蛋白含与治疗性蛋白或肽连接的LPR靶向肽。可并入融合蛋白的蛋白质或肽
例包括：细胞生长抑制蛋白、杀细胞蛋白、促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药、抗体、Fab片段抗体、抗原、受体蛋白、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白和结合蛋白。这些例子不旨在限制，认为在本发明的范围内，实际上任何蛋白或肽均可并入含靶向
肽的融合蛋白中。制备融合蛋白的方法为本领域技术人员所熟知。所述蛋白可例如通过用
双官能团交联剂进行化学附着，从头合成整个融合蛋白，或通过将编码靶向肽的DNA序列
附着于编码第二蛋白或肽的DNA序列后再表达完整的融合蛋白来得到。
[0062] 5.蛋白纯化
[0063] 一些实施方式中蛋白或肽可能要进行分离或纯化。蛋白纯化技术为本领域技术人员所熟知。首先，这些技术包括对细胞，组织或器官的搅匀及粗分级分离成多肽和非多肽级
分。可用层析和电泳技术进一步分离目的蛋白或多肽，以达到部分或完全纯化(或纯化至
均一)。尤其适于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电
泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦。美国专利5,206,347公开了用亲和层析纯化受
体蛋白的例子，将其全文通过引用并入本文。特别有效的纯化肽的方法是快速液相色谱法
(FPLC)，或甚至是高效液相色谱(HPLC)。
分。可用层析和电泳技术进一步分离目的蛋白或多肽，以达到部分或完全纯化(或纯化至
均一)。尤其适于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电
泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦。美国专利5,206,347公开了用亲和层析纯化受
体蛋白的例子，将其全文通过引用并入本文。特别有效的纯化肽的方法是快速液相色谱法
(FPLC)，或甚至是高效液相色谱(HPLC)。
[0064] 纯化的蛋白或肽本来是指和其他组分分离的组合物，其中所述蛋白或肽被纯化到相对其天然存在状态的任意程度。因此，分离或纯化的蛋白或肽还指从其天然存在环境游
离的蛋白或肽。通常，“纯化”意味着已经分级分离而除去各种其他组分的蛋白或肽组合物，且该组合物基本上保留其表达的生物活性。术语“基本上纯化的”是指蛋白或肽形成所述
组合物的主要成分的组合物，例如所述所述蛋白占所述组合物的约50％、约60％、约70％、
约80％、约90％、约95％、或者更多。
离的蛋白或肽。通常，“纯化”意味着已经分级分离而除去各种其他组分的蛋白或肽组合物，且该组合物基本上保留其表达的生物活性。术语“基本上纯化的”是指蛋白或肽形成所述
组合物的主要成分的组合物，例如所述所述蛋白占所述组合物的约50％、约60％、约70％、
约80％、约90％、约95％、或者更多。
[0065] 根据本公开，本领域技术人员熟知各种用于定量蛋白或肽的纯化程度的方法。这些包括例如，测定活性级分的比活，或用SDS/PAGE分析估计级分中多肽的量。估计级分纯
度的优选方法是计算所述级分的比活，以将其与初始提取物的比活进行比较，从而计算出
纯化的程度，估计为“-纯化倍数”。当然，实际用来表示活性的量的单位取决于用来纯化的特定检测技术，及表达的蛋白或肽是否表现出可检测的活性。
度的优选方法是计算所述级分的比活，以将其与初始提取物的比活进行比较，从而计算出
纯化的程度，估计为“-纯化倍数”。当然，实际用来表示活性的量的单位取决于用来纯化的特定检测技术，及表达的蛋白或肽是否表现出可检测的活性。
[0066] 适合于蛋白纯化的各种技术为本领域技术人员所熟知。这些包括例如，用硫酸铵、PEG、抗体等，或用热变性进行沉淀，随后进行离心、层析步骤(如离子交换层析、凝胶过滤
层析、反相层析、羟基磷灰石层析和亲和层析)、等电聚焦、凝胶电泳、以及这些和其他技术的组合。本领域内众所周知，进行各纯化步骤的顺序可改变，某些步骤可省去，仍然可得到
合适的制备基本上纯化的蛋白或肽的方法。
层析、反相层析、羟基磷灰石层析和亲和层析)、等电聚焦、凝胶电泳、以及这些和其他技术的组合。本领域内众所周知，进行各纯化步骤的顺序可改变，某些步骤可省去，仍然可得到
合适的制备基本上纯化的蛋白或肽的方法。
[0067] 一般并没有要求蛋白或肽总是达到最纯净的状态。事实上，某些实施方式中次基本上纯化的产物也实用。组合使用较少纯化步骤，或利用不同形式的同一纯化方案可实现
部分纯化。例如，用HPLC设备进行阳离子交换柱层析能比用低压层析系统进行的同一技术
得到更高倍数的纯化。表现出较低程度相对纯化的方法在蛋白产物的总回收率，或在维持
表达蛋白的活性方面有优势。
部分纯化。例如，用HPLC设备进行阳离子交换柱层析能比用低压层析系统进行的同一技术
得到更高倍数的纯化。表现出较低程度相对纯化的方法在蛋白产物的总回收率，或在维持
表达蛋白的活性方面有优势。
[0068] 亲和层析是依赖于待分离物质和其特异性结合的分子之间的特异亲和性的层析方法。这是受体-配体型相互作用。柱材料通过共价偶联结合偶体之一与不溶性基质来合
成。株材料则可特异性吸附溶液中的物质。通过将条件变化为不发生结合的条件(例如，
改变的pH、离子强度、温度等)来进行洗脱。所述基质本身应为不以任何显著程度吸收分
子，并有广泛的化学、物理和热稳定性的物质。应以不影响其结合特性的方式偶联配体。配
体也应该提供相对紧密地结合。且它也应该能在不损伤样品或配体的前提下洗脱物质。
成。株材料则可特异性吸附溶液中的物质。通过将条件变化为不发生结合的条件(例如，
改变的pH、离子强度、温度等)来进行洗脱。所述基质本身应为不以任何显著程度吸收分
子，并有广泛的化学、物理和热稳定性的物质。应以不影响其结合特性的方式偶联配体。配
体也应该提供相对紧密地结合。且它也应该能在不损伤样品或配体的前提下洗脱物质。
[0069] 6.合成肽
[0070] 由于它们的体积较小，本发明的靶向肽可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成仪已可商购，且可根据移植操作方法使用。例如，见于Stewart and
Young，1984；Tam等人，1983；Merrifield，1986；Barany and Merrifield，1979，将它们各通过引用并入本文。可用所述方法易于合成段肽序列(通常约6个到约35个～50个氨基
酸)。另外，可用重组DNA技术，其中将编码本发明的肽的核苷酸序列插入到表达载体，转化
或转染到合适的宿主细胞，并在适于表达的条件下培养。
Young，1984；Tam等人，1983；Merrifield，1986；Barany and Merrifield，1979，将它们各通过引用并入本文。可用所述方法易于合成段肽序列(通常约6个到约35个～50个氨基
酸)。另外，可用重组DNA技术，其中将编码本发明的肽的核苷酸序列插入到表达载体，转化
或转染到合适的宿主细胞，并在适于表达的条件下培养。
[0071] 7.治疗或诊断缀合物
[0072] 用这些方法鉴定的靶向部分可偶联或附着于各种物质(包括治疗剂或诊断剂)，用于将所述缀合物选择性递送到小鼠模型系统中期望的器官、组织或细胞类型中。例如，
在携肿瘤的小鼠模型中，将化学治疗剂和促凋亡肽靶向递送到位于肿瘤血管生成血管系
统中的受体，导致治疗功效显著提高，全身毒性显著降低(Arap等人，1998；Ellerby等人，
1999)。
在携肿瘤的小鼠模型中，将化学治疗剂和促凋亡肽靶向递送到位于肿瘤血管生成血管系
统中的受体，导致治疗功效显著提高，全身毒性显著降低(Arap等人，1998；Ellerby等人，
1999)。
[0073] 本发明的实施方式涉及与各种疾病状态相关的新血管生成(如肿瘤血管系统)的治疗。除肿瘤生长外，血管生成在其他疾病中也是重要的。不受控制的血管生成促进类风
湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、子宫内膜异位症、老年性黄斑变性和牛皮癣的发展。血
管的生长引起血管瘤形成和动静脉畸形，其导致多种临床问题，所述问题从化妆品并发症
到危及生命的出血。本发明的实施方式还涉及这些例示疾病状态以及其他与新血管生成有
关的疾病状态的治疗。
湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、子宫内膜异位症、老年性黄斑变性和牛皮癣的发展。血
管的生长引起血管瘤形成和动静脉畸形，其导致多种临床问题，所述问题从化妆品并发症
到危及生命的出血。本发明的实施方式还涉及这些例示疾病状态以及其他与新血管生成有
关的疾病状态的治疗。
[0074] 另外，VEGFR-1/NRP-1的上调或促进血管生成的物质的靶向可用于促进血管生成。VEGFR-1/NRP-1的上调可通过VEGFR-1(即Flt-1)或NRP-1转基因的递送来实现，这转而可
用各种本领域技术人员所熟知的基因治疗载体来递送。
用各种本领域技术人员所熟知的基因治疗载体来递送。
[0075] A.细胞因子和趋化因子
[0076] 在某些实施方式中，期望将特异性生物活性剂偶联到一种或多种靶向部分，用于靶向递送至器官、组织或细胞类型。所述制剂包括但不限于：细胞因子、趋化因子、促凋亡因子和抗血管生成因子。“细胞因子”是由一种细胞群释放的蛋白的总称，其作为细胞间介质
作用于其他细胞。
作用于其他细胞。
[0077] 所述细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。所包括的细胞因子中有：生长激素(如人生长激素、N-甲硫胺酰基人生长激素、和牛生长激素)、
甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、前胰岛素、松弛素、前松弛素、糖蛋白激素(如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH))、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生
长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α和-β、副中肾管抑制物质、小鼠
促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(如NGF-β)、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰岛
素样生长因子-I和-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因素、干扰素(如干扰素-α、-β、
和-γ)、集落刺激因子(CSF)(如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)
和粒细胞-CSF(G-CSF))、白细胞介素(IL)(如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或Flt-3、血管抑素、凝血酶敏感蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子、和LT。本文所述“细胞因子”包括天然来源的蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白
和天然序列细胞因子的生物活性等同物的蛋白。
甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、前胰岛素、松弛素、前松弛素、糖蛋白激素(如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH))、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生
长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α和-β、副中肾管抑制物质、小鼠
促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(如NGF-β)、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰岛
素样生长因子-I和-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因素、干扰素(如干扰素-α、-β、
和-γ)、集落刺激因子(CSF)(如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)
和粒细胞-CSF(G-CSF))、白细胞介素(IL)(如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或Flt-3、血管抑素、凝血酶敏感蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子、和LT。本文所述“细胞因子”包括天然来源的蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白
和天然序列细胞因子的生物活性等同物的蛋白。
[0078] 趋化因子一般作为化学引诱物吸引免疫效应细胞到达趋化因子的表达位点。这有利于特定趋化因子基因与例如细胞因子基因的联合表达，以增加其他免疫系统成分募集到
治疗位点。趋化因子包括但不限于：RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、和IP-10。本领域技术人员会认识到一些细胞因子也有化学吸引作用，并且也能称之为趋化因子。
治疗位点。趋化因子包括但不限于：RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、和IP-10。本领域技术人员会认识到一些细胞因子也有化学吸引作用，并且也能称之为趋化因子。
[0079] B.显像剂和放射性同位素
[0080] 在一些实施方式中，本发明的靶向部分可附着于显像剂，所述显像剂用于各种病变器官、组织或细胞类型的显像和诊断。本领域已知到许多合适的显像剂，它们附着于蛋白
或肽的方法(见例如，美国专利5,021,236和4,472,509，均通过引用并入本文)。某些附
着方法包括金属螯合物复合物的使用，例如有机螯合剂(如DTPA)附着于蛋白或肽(美国
专利4,472,509)。蛋白或肽还在偶联剂(戊二醛或高碘酸盐)的存在下与酶反应。用这些
偶联剂存在下或与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光标记物的缀合物。
或肽的方法(见例如，美国专利5,021,236和4,472,509，均通过引用并入本文)。某些附
着方法包括金属螯合物复合物的使用，例如有机螯合剂(如DTPA)附着于蛋白或肽(美国
专利4,472,509)。蛋白或肽还在偶联剂(戊二醛或高碘酸盐)的存在下与酶反应。用这些
偶联剂存在下或与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光标记物的缀合物。
[0081] 潜在用作显像剂的顺磁离子的非限制性例子包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，尤其优选为钆。有其他应用(如X射线成像)的离子包括
但不限于：镧(III)、金(III)、铅(II)，特别是铋(III)。
但不限于：镧(III)、金(III)、铅(II)，特别是铋(III)。
[0082] 作为显像或治疗剂的可用的放射性同位素包括：211砹、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、67 152 67 3 123 125 131 111 59 32 186 188 75 35 99m 90
铜、 铕、镓、氢、 碘、 碘、 碘、 铟、 铁、磷、 铼、 铼、 硒、硫、 锝和
125 99m 111
钇。某些实施方式中常优选 碘，且 锝和 铟也常优选，因为其能量较低并适于长期检
测。
铜、 铕、镓、氢、 碘、 碘、 碘、 铟、 铁、磷、 铼、 铼、 硒、硫、 锝和
125 99m 111
钇。某些实施方式中常优选 碘，且 锝和 铟也常优选，因为其能量较低并适于长期检
测。
[0083] 本发明的经放射性标记的蛋白或肽可根据本领域熟知的技术制备。例如可通过与碘化钠或碘化钾和化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶氧化剂(如乳过氧化物酶)接触来将它
99m
们碘化。本发明的蛋白或肽可通过配体交换过程用 锝进行标记，例如通过用二价锡溶液
还原高锝酸盐，将经还原的锝螯合在Sephadex柱上，并将所述肽应用于所述柱上；或者通
过直接标记技术(例如通过温育高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、缓冲溶液(如酞酸钠-钾溶
液)和肽)。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合到肽的中间官能团是二亚
乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。认为使用的是荧光标记物，包括罗丹明，
异硫氰酸荧光素和肾造影剂。
99m
们碘化。本发明的蛋白或肽可通过配体交换过程用 锝进行标记，例如通过用二价锡溶液
还原高锝酸盐，将经还原的锝螯合在Sephadex柱上，并将所述肽应用于所述柱上；或者通
过直接标记技术(例如通过温育高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、缓冲溶液(如酞酸钠-钾溶
液)和肽)。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合到肽的中间官能团是二亚
乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。认为使用的是荧光标记物，包括罗丹明，
异硫氰酸荧光素和肾造影剂。
[0084] 在某些实施方式中，要求保护的蛋白或肽可连接于第二结合配体或酶(酶标签)，所述酶会在与生色底物接触后产生着色产物。合适的酶的例子包括：脲酶、碱性磷酸
酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和亲和素或链
霉亲和素化合物。本领域技术人员熟知所述标记物的使用，如见于，美国专利3,817,837、
3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，各通过引用并入
本文。
酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和亲和素或链
霉亲和素化合物。本领域技术人员熟知所述标记物的使用，如见于，美国专利3,817,837、
3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，各通过引用并入
本文。
[0085] 在又一实施方式中，靶向部分可与纳米颗粒有效偶联。纳米颗粒包括但不限于：胶体金和银纳米颗粒。金属纳米颗粒在可见光范围内显示颜色。普遍认为这些颜色是金属颗
粒的表面等离子体共振的结果，并且对所述颗粒的大小、形状、和聚合状态，周围介质的介
电性能，颗粒表面的离子吸收极其敏感(见于例如美国专利申请20040023415，其通过引用
并入本文)。
粒的表面等离子体共振的结果，并且对所述颗粒的大小、形状、和聚合状态，周围介质的介
电性能，颗粒表面的离子吸收极其敏感(见于例如美国专利申请20040023415，其通过引用
并入本文)。
[0086] C.交联剂
[0087] 双官能团交联剂已被广泛用于各种目的，包括：亲和基质的制备、不同结构的修饰和稳定、配体和受体结合位点的鉴定，和结构研究。已证明，带有两个相同的官能团的双同
官能团试剂高效诱导相同或不同高分子或高分子亚基之间的交联，多肽配体和它们的特异
性结合位点的连结。双异官能团试剂含两种不同的官能团。利用两种不同官能团的不同的
反应性，可选择性地和顺序地控制交联。双官能团交联剂可根据它们的官能团(例如，氨
基、巯基、胍基、吲哚、羧基特异性基团)的特异性进行分类。当然，针对自由氨基基团的制剂特备受欢迎，由于它们的商业可用率，易于合成，可应用的反应条件温和。大部分双异官
能团交联剂含主要的氨基反应基团和硫羟基反应基团。
官能团试剂高效诱导相同或不同高分子或高分子亚基之间的交联，多肽配体和它们的特异
性结合位点的连结。双异官能团试剂含两种不同的官能团。利用两种不同官能团的不同的
反应性，可选择性地和顺序地控制交联。双官能团交联剂可根据它们的官能团(例如，氨
基、巯基、胍基、吲哚、羧基特异性基团)的特异性进行分类。当然，针对自由氨基基团的制剂特备受欢迎，由于它们的商业可用率，易于合成，可应用的反应条件温和。大部分双异官
能团交联剂含主要的氨基反应基团和硫羟基反应基团。
[0088] 美国专利5,603,872和5,401,511描述了配体和脂质体的交联方法的例子，这两个专利都通过引用整体并入本文。可通过氨基残基的交联将各种配体共价结合到脂质体表
面。根据已建立的方法制备了脂质体，尤其是多层泡囊(MLV)或单层泡囊(如微乳化脂质
体(MEL))和大型单层脂质体(LUVET)，各含磷脂酰乙醇胺(PE)。脂质体中包含PE向脂质
体表面提供用于交联目的的活性功能性残基。已成功地将配体(如表皮生长因子(EGF))
与PE-脂质体连结。将配体共价结合到脂质体表面上的离散位点。这些位点的数量和表面
密度决定于脂质体配方和脂质体类型。脂质体表面也可具有非共价结合位点。为形成配
体和脂质体的共价缀合物，研究了交联剂的效用和生物相容性。交联剂包括戊二醛(GAD)、
双官能团环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和水溶性碳二亚胺，优选为1-乙
基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。通过复杂的交联过程，建立了识别物质的胺
残基和脂质体的连结。
面。根据已建立的方法制备了脂质体，尤其是多层泡囊(MLV)或单层泡囊(如微乳化脂质
体(MEL))和大型单层脂质体(LUVET)，各含磷脂酰乙醇胺(PE)。脂质体中包含PE向脂质
体表面提供用于交联目的的活性功能性残基。已成功地将配体(如表皮生长因子(EGF))
与PE-脂质体连结。将配体共价结合到脂质体表面上的离散位点。这些位点的数量和表面
密度决定于脂质体配方和脂质体类型。脂质体表面也可具有非共价结合位点。为形成配
体和脂质体的共价缀合物，研究了交联剂的效用和生物相容性。交联剂包括戊二醛(GAD)、
双官能团环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和水溶性碳二亚胺，优选为1-乙
基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。通过复杂的交联过程，建立了识别物质的胺
残基和脂质体的连结。
[0089] 另一些例子中，描述了双异官能团交联剂和交联剂使用方法(美国专利5,889,155，通过引用特别整体并入本文)。交联剂组合了亲核酰肼残基和亲电马来酰亚胺
残基，在一个例子中使醛和游离巯基偶联。可将交联剂修饰为交联各种官能团。
残基，在一个例子中使醛和游离巯基偶联。可将交联剂修饰为交联各种官能团。
[0090] 8.核酸
[0091] 本发明的核酸可编码靶向肽、靶向抗体、靶向抗体片段、治疗性多肽、融合蛋白或其他蛋白和肽。所述核酸可源于基因组DNA、互补DNA(cDNA)或合成DNA。
[0092] 本文所述“核酸”包括单链和双链分子，及DNA、RNA、经化学修饰的核酸和核酸类似物。本发明范围内的核酸可为几乎任意大小，部分决定于编码的蛋白或肽的长度。
[0093] 靶向肽或融合蛋白可被编码合适的氨基酸序列的任意核酸序列编码。使用标准的密码子表，本领域技术人员熟知编码期望氨基酸序列的核酸的设计和制备。优选的实施方
式中，所选编码各氨基酸的密码子可经修饰以使核酸在目的宿主细胞中的表达最优化。
式中，所选编码各氨基酸的密码子可经修饰以使核酸在目的宿主细胞中的表达最优化。
[0094] 9.基因治疗载体的靶向递送
[0095] 有许多方法可将基因治疗载体导入细胞。本发明的某些实施方式中，基因治疗载体包括病毒。某些病毒的通过受体介导的胞吞作用进入细胞，而整合入宿主细胞基因组，或
游离保持，并稳定有效地表达病毒基因的能力使得病毒成为将外源基因转染进哺乳动物细
胞的优良候选物(Ridgeway，1988；Nicolas and Rubinstein，1988.；Baichwaland Sugden，
1986；Temin，1986)。优选的基因治疗载体通常是病毒载体。用作基因治疗载体的DNA病毒
包括乳多空病毒(如，猿猴病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal
andSugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986)。
游离保持，并稳定有效地表达病毒基因的能力使得病毒成为将外源基因转染进哺乳动物细
胞的优良候选物(Ridgeway，1988；Nicolas and Rubinstein，1988.；Baichwaland Sugden，
1986；Temin，1986)。优选的基因治疗载体通常是病毒载体。用作基因治疗载体的DNA病毒
包括乳多空病毒(如，猿猴病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal
andSugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986)。
[0096] 体内递送的优选方法之一包括使用腺病毒表达载体。尽管已知的腺病毒载体的用于整合到基因组DNA中的运力较低，但此特征被这些载体的高效基因转染所平衡。″腺病
毒载体″包括但不限于含腺病毒序列的构建体，其足以(a)支持构建体的包装，及(b)表达
克隆于其中的反义或正义多核苷酸。
毒载体″包括但不限于含腺病毒序列的构建体，其足以(a)支持构建体的包装，及(b)表达
克隆于其中的反义或正义多核苷酸。
[0097] 腺病毒载体已用于真核基因表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus and Horwitz，1992；Graham and Prevec，1991)。将重组腺病毒施用于不同组织的研究包括：气管灌注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射
(Ragot等人，1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)和立体定位接种到大脑(Le Gal
La Salle等人，1993)。
(Ragot等人，1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)和立体定位接种到大脑(Le Gal
La Salle等人，1993)。
[0098] 一些优选实施方式中，将治疗性分子或物质偶联到靶向疾病组织(如肿瘤或新血管床)血管系统的LPR靶向部分可得到特定优势。特别是，在携带肿瘤异种移植体的小鼠实
验模型中，已将定居在肿瘤血管系统的部分与细胞毒性药物或促凋亡肽偶联而产生的化合
物比原化合物更有效，并且毒性更小(Arap等人，1998；Ellerby et al，1999)。将RGD-4C肽插入到腺病毒表面蛋白，已产生了可用于靶向肿瘤的基因治疗的腺病毒载体(Arap等人，
1998)。
验模型中，已将定居在肿瘤血管系统的部分与细胞毒性药物或促凋亡肽偶联而产生的化合
物比原化合物更有效，并且毒性更小(Arap等人，1998；Ellerby et al，1999)。将RGD-4C肽插入到腺病毒表面蛋白，已产生了可用于靶向肿瘤的基因治疗的腺病毒载体(Arap等人，
1998)。
[0099] 本发明的″纤维蛋白″优选包括腺病毒纤维蛋白。可将任意一种血清型的人或非人腺病毒(例如嵌合纤维蛋白)用作为纤维蛋白或纤维基因的来源。然而，所述腺病毒最
好是Ad2或Ad5腺病毒(见美国专利6,649,407，其通过引用并入本文)。
好是Ad2或Ad5腺病毒(见美国专利6,649,407，其通过引用并入本文)。
[0100] 纤维蛋白是“嵌合的”，即其含不常见于从野生型腺病毒分离出来的蛋白(即，包括天然蛋白或野生型蛋白)的氨基酸残基。因此，所述纤维蛋白含″非天然氨基酸序
列″。″非天然的氨基酸序列″指任意合适长度的序列，优选为约3～约200个氨基酸，最
好是约3～约30个氨基酸。期望将非天然氨基酸序列以基因表达水平导入到纤维蛋白中
(例如通过″编码非天然氨基酸序列的核酸序列″的导入)。可将非天然氨基酸序列导入
到腺病毒序列或腺病毒序列外的位置。无论哪一种导入，其以DNA或蛋白水平整合到腺病
毒纤维蛋白中，导致在得到的嵌合纤维蛋白中产生肽基序(即肽结合基序)。
列″。″非天然的氨基酸序列″指任意合适长度的序列，优选为约3～约200个氨基酸，最
好是约3～约30个氨基酸。期望将非天然氨基酸序列以基因表达水平导入到纤维蛋白中
(例如通过″编码非天然氨基酸序列的核酸序列″的导入)。可将非天然氨基酸序列导入
到腺病毒序列或腺病毒序列外的位置。无论哪一种导入，其以DNA或蛋白水平整合到腺病
毒纤维蛋白中，导致在得到的嵌合纤维蛋白中产生肽基序(即肽结合基序)。
[0101] 肽基序例如通过包含本发明的靶向部分和/或细胞表明结合位点的配体来允许靶向细胞。所述肽基序任选可包含用于细胞靶向的其他元件(例如单链抗体序列)。肽结合
基序可通过插入例如天然和非天然序列而产生，且可包含例如天然和非天然序列，或者可
完全由非天然序列构成。通过将非天然氨基酸序列插入到嵌合纤维蛋白而得到的肽基序可
为高亲和性肽(即，当以相对低浓度提供时结合其同源结合位点的肽，如VEGFR-1/NRP-1)，
或为低亲和性肽(即，当以相对高浓度提供时结合同源其结合位点的肽，如VEGFR-1/
NRP-1)。然而，得到的肽基序优选为高亲和性基序，特别是由于其局限于腺病毒纤维蛋白中
而对其同源结合位点有高亲和性的基序。
基序可通过插入例如天然和非天然序列而产生，且可包含例如天然和非天然序列，或者可
完全由非天然序列构成。通过将非天然氨基酸序列插入到嵌合纤维蛋白而得到的肽基序可
为高亲和性肽(即，当以相对低浓度提供时结合其同源结合位点的肽，如VEGFR-1/NRP-1)，
或为低亲和性肽(即，当以相对高浓度提供时结合同源其结合位点的肽，如VEGFR-1/
NRP-1)。然而，得到的肽基序优选为高亲和性基序，特别是由于其局限于腺病毒纤维蛋白中
而对其同源结合位点有高亲和性的基序。
[0102] 其他基因转移载体可由逆转录病毒构建(Coffin，1990)。为了构建逆转录病毒载体，将编码目的蛋白的核酸插入到病毒基因组中特定病毒序列的位置上，以产生复试缺陷
型病毒。为了产生病毒颗粒，构建了含gag、pol、和env基因，但没有LTR和包装成分的包装
细胞系(Mann等人，1983)。当将含cDNA与逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒导入该
细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录本包装进病毒颗粒，
然后其被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。
回收含重组逆转录病毒的培养基，任选经浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能转染广
泛类型的细胞。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞分裂(Paskind等人，1975)。
型病毒。为了产生病毒颗粒，构建了含gag、pol、和env基因，但没有LTR和包装成分的包装
细胞系(Mann等人，1983)。当将含cDNA与逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒导入该
细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录本包装进病毒颗粒，
然后其被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。
回收含重组逆转录病毒的培养基，任选经浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能转染广
泛类型的细胞。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞分裂(Paskind等人，1975)。
[0103] 其他病毒载体可用作靶向基因治疗载体。可应用源于下列病毒的载体，如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)、腺相关病毒(AAV)(Ridgeway，1988；
Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒。
Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒。
[0104] 本发明的另一实施方式中，可将基因治疗构建体包裹于脂质体。脂质体介导的核酸递送和外源DNA的体外表达已非常成功。Wong等人(1980)在培养的鸡胚、HeLa、和肝瘤
细胞中证明了外源DNA的脂质体介导的递送和表达的可行性。Nicolau等人(1987.)在静
脉注射后在大鼠中成功地实现了脂质体介导的基因转移。
细胞中证明了外源DNA的脂质体介导的递送和表达的可行性。Nicolau等人(1987.)在静
脉注射后在大鼠中成功地实现了脂质体介导的基因转移。
[0105] 本发明的基因治疗载体可包含各种转基因，其一般是表达载体的编码的DNA或RNA。基因治疗可用于治疗性基因的表达，VEGFR-1/NRP-1的表达，以增强新血管生成，或用
于VEGFR-1/NRP-1表达的抑制，用于治疗与新血管生成相关的疾病状态。DNA可为cDNA、
体外聚合的DNA、质粒DNA、质粒DNA的一部份、源于病毒的遗传物质、线性DNA、载体(P1、
PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、重组DNA、染色体DNA、寡核苷酸、反义DNA的形式、或这些群体的衍生物形式。RNA可为寡核苷酸RNA、tRNA(转移RNA)、snRNA(核内小
RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、体外聚合的RNA、重组RNA、嵌合序列、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、核酶形式，或这些群体衍生物形式。反义多核苷酸干扰DNA或RNA的功
能的多核苷酸。反义多聚核酸包括但不限于：吗啉代、2′-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。
SiRNA包含通常含15～50个碱基对，优选为21～25个碱基对，且具有与细胞中表达的靶
基因或RNA相同或近乎相同的核酸序列的核苷酸序列的双链结构。干扰可引起表达抑制，
此外，DNA或RNA可为单链、双链、三链或四链。
于VEGFR-1/NRP-1表达的抑制，用于治疗与新血管生成相关的疾病状态。DNA可为cDNA、
体外聚合的DNA、质粒DNA、质粒DNA的一部份、源于病毒的遗传物质、线性DNA、载体(P1、
PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、重组DNA、染色体DNA、寡核苷酸、反义DNA的形式、或这些群体的衍生物形式。RNA可为寡核苷酸RNA、tRNA(转移RNA)、snRNA(核内小
RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、体外聚合的RNA、重组RNA、嵌合序列、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、核酶形式，或这些群体衍生物形式。反义多核苷酸干扰DNA或RNA的功
能的多核苷酸。反义多聚核酸包括但不限于：吗啉代、2′-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。
SiRNA包含通常含15～50个碱基对，优选为21～25个碱基对，且具有与细胞中表达的靶
基因或RNA相同或近乎相同的核酸序列的核苷酸序列的双链结构。干扰可引起表达抑制，
此外，DNA或RNA可为单链、双链、三链或四链。
[0106] 10.药物组合物
[0107] 本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种包括本文所述的靶向部分的组合物，所述靶向部分溶解或分散于药学可接受载体中。″药物的”或“药学可接受的″指
当施用于动物(例如人，视情况而定)时，不产生副作用、过敏反应或其他不利反应的分
th
子实体和组合物。根据本文所公开(如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18
Ed.MackPrinting Company，1990所例示，该文献通过引用并入本文)，本领域技术人员会知
道药物组合物的制备，所述药物组合物含本发明的至少一种组合物(例如LPR靶向部分)
或另外的活性成分。此外，用于动物(如，人)治疗时，制备过程应该符合FDA生物标准品
办公室的无菌标准、致热原性标准、普遍安全标准和纯度标准。
当施用于动物(例如人，视情况而定)时，不产生副作用、过敏反应或其他不利反应的分
th
子实体和组合物。根据本文所公开(如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18
Ed.MackPrinting Company，1990所例示，该文献通过引用并入本文)，本领域技术人员会知
道药物组合物的制备，所述药物组合物含本发明的至少一种组合物(例如LPR靶向部分)
或另外的活性成分。此外，用于动物(如，人)治疗时，制备过程应该符合FDA生物标准品
办公室的无菌标准、致热原性标准、普遍安全标准和纯度标准。
[0108] 本文所述″药学可接受载体″包括任意及所有溶剂、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似材料及它们的组合，这些为本领域普通技术人员所熟知(例如，见Remington′s Pharmaceutical
Sciences，第18版，1990，其通过引用并入本文)。除非任意传统载体不与活性成分相容，考虑其作为治疗或药物组合物的用途。
Sciences，第18版，1990，其通过引用并入本文)。除非任意传统载体不与活性成分相容，考虑其作为治疗或药物组合物的用途。
[0109] 本发明的治疗和诊断组合物可包含不同类型的载体，取决于其以液体、固体或气溶胶形式中的哪种形式施用，及其在该施用途径中是否需要无菌。认为本发明的成分可用
本领域普通技术人员已知的任何方法施用，例如经口施用、静脉施用、皮内施用、动脉内施
用、鞘内施用、眼内施用、结膜下施用、视网膜下施用、玻璃体膜内施用、施用于眼的前房、施用于眼的特农下空间、局部施用、腹膜内施用、损伤区内施用、颅内施用、关节内施用、胸膜内施用、气管内施用、瘤内施用、肌内施用、腹膜内施用、皮下施用、囊内施用、吸入(如气雾吸入)、注射、输液、连续输液、通过导管、通过灌洗直接以脂质组合物(如脂质体)局部灌注清洗靶细胞，或通过其他方法或上述方法的组合(如本领域普通技术人员所熟知)(例如见
Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，其通过
引用并入本文)。
本领域普通技术人员已知的任何方法施用，例如经口施用、静脉施用、皮内施用、动脉内施
用、鞘内施用、眼内施用、结膜下施用、视网膜下施用、玻璃体膜内施用、施用于眼的前房、施用于眼的特农下空间、局部施用、腹膜内施用、损伤区内施用、颅内施用、关节内施用、胸膜内施用、气管内施用、瘤内施用、肌内施用、腹膜内施用、皮下施用、囊内施用、吸入(如气雾吸入)、注射、输液、连续输液、通过导管、通过灌洗直接以脂质组合物(如脂质体)局部灌注清洗靶细胞，或通过其他方法或上述方法的组合(如本领域普通技术人员所熟知)(例如见
Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，其通过
引用并入本文)。
[0110] 施用于受试者的本发明的组合物的实际剂量可决定于身体和生理因素，例如体重、严重情况、所治疗的疾病类型、以前或现在的治疗干预、患者特发症和施用途径。无论如何，从业医师决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的合适的剂量。
[0111] 某些实施方式中，药物组合物可含，例如，至少约0.1％的活性化合物。其他实施方式中，活性化合物可含单位体重的约2％～约75％，或约25％～约60％，例如，及从它们
而来的任意范围。在一些非限制性例子中，每次施用约1mg肽/kg体重、约5mg/kg体重、约
10mg/kg体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重或更多，及从它们而
来的任意范围。从本文所列数值而来的范围的非限制性例子中，每日多剂量优选范围为约
1mg/kg体重～约100mg/kg体重，尤其优选约20mg/kg～约50mg/kg之间(类似布洛芬、阿
司匹林等，每4～8小时施用)。
而来的任意范围。在一些非限制性例子中，每次施用约1mg肽/kg体重、约5mg/kg体重、约
10mg/kg体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重或更多，及从它们而
来的任意范围。从本文所列数值而来的范围的非限制性例子中，每日多剂量优选范围为约
1mg/kg体重～约100mg/kg体重，尤其优选约20mg/kg～约50mg/kg之间(类似布洛芬、阿
司匹林等，每4～8小时施用)。
[0112] 任何情况下，组合物可包含各种抗氧化剂来减缓一种或多种组分的氧化。另外，对微生物活性的抑制可使用防腐剂，例如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于：对羟基苯
甲酸(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及它们的组合。
甲酸(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及它们的组合。
[0113] 组合物是液体形式的实施方式中，载体可为溶剂或分散介质，包括但不限于：水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、脂(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及它们的组合。许多情况下，优选包括等渗剂，例如，糖、氯化钠或它们的组合。
[0114] 通过将LPR靶向部分或其缀合物以所需量掺入含各种其他上述成分的合适的溶剂中，并根据需要进行过滤除菌来制备无菌注射溶液。一般来说，通过将各种无菌的活性成
分掺入到含基本分散介质和/或其他活性成分的无菌媒质中来制备分散剂。在用无菌粉末
制备无菌注射溶液、悬浊液或乳化液时，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这些
技术能制备添加任意额外所需成分(来自先前无菌过滤的液体介质)的活性成分粉末。如
有必要，液体介质应该根据需要适当缓冲，并且在注射足够的盐和葡萄糖之前使液体稀释
液等渗。还考虑到用于直接注射的组合物的制备，假设将DMSO用作溶剂，将导致极快地浸
渍，将高浓度的活性剂递送到小区域。
分掺入到含基本分散介质和/或其他活性成分的无菌媒质中来制备分散剂。在用无菌粉末
制备无菌注射溶液、悬浊液或乳化液时，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这些
技术能制备添加任意额外所需成分(来自先前无菌过滤的液体介质)的活性成分粉末。如
有必要，液体介质应该根据需要适当缓冲，并且在注射足够的盐和葡萄糖之前使液体稀释
液等渗。还考虑到用于直接注射的组合物的制备，假设将DMSO用作溶剂，将导致极快地浸
渍，将高浓度的活性剂递送到小区域。
[0115] 这些组合物在制备和储存条件下必须是稳定的，并且能防止微生物(如细菌和真菌)的污染。在安全水平下，内毒素的污染也应该最低控制在安全水平，例如，小于0.5ng/
mg蛋白。
mg蛋白。
[0116] 本文所述组合物可任选包含一种或多种的第二治疗剂，所述第二治疗剂针对本文所述任何疾病的治疗或预防。
[0117] 11.治疗剂
[0118] 某些实施方式中，可将治疗剂有效偶联于用于选择性递送到例如表达VEGFR-1/NRP-1的肿瘤血管系统的靶向肽或融合蛋白上。合适使用的制剂或因子可包括任何诱导凋
亡、细胞死亡、细胞停滞和/或抗血管生成的化合物。
亡、细胞死亡、细胞停滞和/或抗血管生成的化合物。
[0119] A.程序性细胞死亡的调节剂
[0120] 凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育，维持成体组织内稳态和抑制癌症发生的必要过程(Kerr等人，1972)。Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶被证明是其他系统中重要的
凋亡调节剂和效应物。发现Bcl-2蛋白与滤泡性淋巴瘤相关，在控制凋亡和促进细胞响应
各种凋亡刺激而存活中有重要作用(Bakhshi等人，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等
人，1986；Tsujimoto等人，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现在认为进化保守的Bcl-2
蛋白是相关蛋白家族的成员，这些蛋白被划分为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
凋亡调节剂和效应物。发现Bcl-2蛋白与滤泡性淋巴瘤相关，在控制凋亡和促进细胞响应
各种凋亡刺激而存活中有重要作用(Bakhshi等人，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等
人，1986；Tsujimoto等人，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现在认为进化保守的Bcl-2
蛋白是相关蛋白家族的成员，这些蛋白被划分为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
[0121] 随后的发现表明Bcl-2发挥抑制各种刺激引发的细胞死亡的作用。同样，现已知存在一个Bcl-2细胞死亡调控蛋白家族，这些蛋白有着共同的结构和序列同源性。已发现
这些不同的家族成员或与Bcl-2具有相似功能(BclXL，BclW，BclS，Mcl-1，A1，Bfl-1)，或与Bcl-2功能相反而促进细胞死亡(Bax，Bak，Bik，Bim，Bid，Bad，Harakiri)。
这些不同的家族成员或与Bcl-2具有相似功能(BclXL，BclW，BclS，Mcl-1，A1，Bfl-1)，或与Bcl-2功能相反而促进细胞死亡(Bax，Bak，Bik，Bim，Bid，Bad，Harakiri)。
[0122] B.血管生成抑制剂
[0123] 本发明的某些实施方式中可涉及与抗血管生成剂有效偶联的靶向部分的施用，所述抗血管生成剂例如：血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制
剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相关蛋白、羧基氨基三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)、α-干扰素、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片
段、利诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相关蛋白、羧基氨基三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)、α-干扰素、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片
段、利诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
[0124] 肿瘤细胞的增生严重依赖广泛的肿瘤血管系统，其伴随癌症发展。因此，用抗血管生成剂来抑制新血管生成并靶向摧毁现存血管已被引入作为肿瘤治疗的有效且相对无毒
的方法(Arap等人，1998；Arap等人，1998；Ellerby等人，1999)。已经知道很多抗血管生成剂和/或血管抑制剂(例如，Folkman，1997；Eliceiri and Cheresh，2001)。
的方法(Arap等人，1998；Arap等人，1998；Ellerby等人，1999)。已经知道很多抗血管生成剂和/或血管抑制剂(例如，Folkman，1997；Eliceiri and Cheresh，2001)。
[0125] C.细胞毒性剂
[0126] 化学治疗(细胞毒性)剂可用于治疗包括癌症在内的各种疾病。可使用的化学治疗(细胞毒性)剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸
氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、plicomycin、甲卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、红豆杉醇、temazolomide(含水形式的DTIC)、反式铂、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱，或上述物质的任何类似物或衍生变体。大部分化学治疗剂可分为烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂、和亚硝基脲、激素剂、杂剂，或任何上述物质的类似物或衍生变体。
氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、plicomycin、甲卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、红豆杉醇、temazolomide(含水形式的DTIC)、反式铂、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱，或上述物质的任何类似物或衍生变体。大部分化学治疗剂可分为烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂、和亚硝基脲、激素剂、杂剂，或任何上述物质的类似物或衍生变体。
[0127] 化学治疗剂和施用方法，剂量等为本领域技术人员所熟知(例如见，“PhysiciansDesk Reference”，Goodman和Gilman’s“ThePharmacological Basis of Therapeutics”
th
和“Remington’sPharmaceutical Sciences”15 ed.，pp 1035-1038和1570-1580，相关
部分通过引用并入本文)，且可与本文公开的本发明组合。有必要根据受试者的状况调整剂
量。无论如何，负责给药的人将决定对个体受试者合适的剂量。当然，本文所述所有剂量和
制剂只代表一些例子，并不限于此，本领域技术人员可针对特定的患者或用途使用其他剂
量或制剂。任何在这些点或从其而来的范围之间的剂量都能用于本发明。
th
和“Remington’sPharmaceutical Sciences”15 ed.，pp 1035-1038和1570-1580，相关
部分通过引用并入本文)，且可与本文公开的本发明组合。有必要根据受试者的状况调整剂
量。无论如何，负责给药的人将决定对个体受试者合适的剂量。当然，本文所述所有剂量和
制剂只代表一些例子，并不限于此，本领域技术人员可针对特定的患者或用途使用其他剂
量或制剂。任何在这些点或从其而来的范围之间的剂量都能用于本发明。
[0128] D.烷化剂
[0129] 烷化剂是直接和基因组DNA相互作用而阻断细胞增生的药物。这类化学药物代表影响细胞周期的所有阶段的药物，就是说它们不是阶段特异性的。烷化剂包括但不限于：氮
芥、ethylenimene、烷基磺酸盐、亚硝基脲或三嗪。它们包括但不限于：白消安、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、氮芥(mustargen)和美法仑。
芥、ethylenimene、烷基磺酸盐、亚硝基脲或三嗪。它们包括但不限于：白消安、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、氮芥(mustargen)和美法仑。
[0130] E.抗代谢剂
[0131] 抗代谢剂阻断DNA或RNA的合成。与烷化剂不同，它们特异性影响细胞周期的S期。抗代谢剂可被分为不同的类别，例如叶酸类似物、嘧啶类似物和嘌呤类似物及相关抑制
化合物。抗代谢剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西
他滨和甲氨蝶呤。
化合物。抗代谢剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西
他滨和甲氨蝶呤。
[0132] F.天然产物
[0133] 天然产物通常是指从天然来源分离出来的化合物，并且被定义为有药物活性。所述化合物和它们的类似物或衍生物可分离自天然来源，化学合成或用本领域技术人员所知
道的任意技术来重组产生。天然产物可分成有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物反应
修饰剂。
道的任意技术来重组产生。天然产物可分成有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物反应
修饰剂。
[0134] 有丝分裂抑制剂包括植物碱和其他可抑制细胞分裂所需的蛋白合成的或抑制有丝分裂的天然制剂。它们在细胞周期的特定时期发挥作用。有丝分裂抑制剂包括，例如，多
烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、红豆杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、红豆杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
[0135] 紫杉醇类化合物是从短叶紫杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出的一类相关化合物。紫杉醇类化合物包括但不限于化合物如：多西紫杉醇和紫杉醇。紫杉醇结合微管蛋
白(在异于长春花碱使用的位点)，并促进微管装配。
白(在异于长春花碱使用的位点)，并促进微管装配。
[0136] 长春花碱是一类被鉴定为有药物活性的植物碱。它们包括化合物，如：长春碱(VLB)和长春新碱。
[0137] G.抗生素
[0138] 某些抗生素兼有抗微生物或细胞毒性活性。这些药物还通过化学抑制酶来干扰DNA和有丝分裂或改变细胞膜。这些制剂并不是阶段特异性的，因此他们作用于细胞周期的
所有阶段。细胞毒性抗生素的例子包括但不限于：博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、普卡霉素(光神霉素)和伊达比星。
所有阶段。细胞毒性抗生素的例子包括但不限于：博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、普卡霉素(光神霉素)和伊达比星。
[0139] H.杂剂
[0140] 不属于上述种类的杂细胞毒性剂包括但不限于：铂配位络合物、蒽二酮、经取代的脲、甲基肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶、和维甲酸。铂配位络合物包括化合物诸如：卡铂和顺铂(cis-DDP)。例示蒽二酮是米托蒽醌。例示的经取代的脲是羟基脲。例示的甲基肼
衍生物是并卡巴肼(N-甲基肼，MIH)。并不局限于这些例子，认为将任何已知的细胞毒性
剂，细胞生长抑制剂或杀细胞剂附着于靶向肽，并施用于靶器官、组织或细胞类型也在本发
明的范围内。
实施例
衍生物是并卡巴肼(N-甲基肼，MIH)。并不局限于这些例子，认为将任何已知的细胞毒性
剂，细胞生长抑制剂或杀细胞剂附着于靶向肽，并施用于靶器官、组织或细胞类型也在本发
明的范围内。
实施例
[0141] 包括下列实施例，以展示本发明的优选实施方式。本领域技术人员会知道，下列实施例所揭示的技术代表实施本发明中表现良好的发明人发现的技术，并且因此认为构成其
优选实施方式。然而，根据本文公开的教导，本领域技术人员会认识到，在已公开的特定实
施方式中可在脱离分发明的精神的情况下做许多修改，并且仍可获得一样或相似的结果。
优选实施方式。然而，根据本文公开的教导，本领域技术人员会认识到，在已公开的特定实
施方式中可在脱离分发明的精神的情况下做许多修改，并且仍可获得一样或相似的结果。
[0142] 实施例1：靶向VEGF通路的抗-血管生成化合物
[0143] 1.材料与方法
[0144] 制 剂 和 肽。 合 成 肽，并 在 经 HPLC 纯 化 达 说 明 书 的 纯 度 超过 95 ％ ：L-Arg-L-Pro-L-Leu(RPL)，D-Leu-D-Pro-D-Arg【D(LPR)】，
D-Cys-D-Ala-D-Pro-D-Ala-D-Cys【D(CAPAC)；SEQ ID NO：6】，来 自 多 肽 实 验 室
(Polypeptide Laboratories)(Torrence，CA) 和 D-Ala-D-Pro-D-Ala【D(APA)】，来 自
Genemed Synthesis Inc.(SanFrancisco，CA)。重组受体(VEGFR-1和NPR-1)和生长因
子(人VEGF165)，来自R&D System(Minneapolis，MN)。肝素、Drabkin试剂、人血红蛋白，
brij-35来自(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
D-Cys-D-Ala-D-Pro-D-Ala-D-Cys【D(CAPAC)；SEQ ID NO：6】，来 自 多 肽 实 验 室
(Polypeptide Laboratories)(Torrence，CA) 和 D-Ala-D-Pro-D-Ala【D(APA)】，来 自
Genemed Synthesis Inc.(SanFrancisco，CA)。重组受体(VEGFR-1和NPR-1)和生长因
子(人VEGF165)，来自R&D System(Minneapolis，MN)。肝素、Drabkin试剂、人血红蛋白，
brij-35来自(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
[0145] 动物。小鼠实验得到了Texas M.D.Anderson大学癌症中心的动物实验管理委员会的批准。C57BL/6和Balb/c小鼠购自(Harlan，Indianapolis)。本研究遵照视觉与眼科
研究协会的声明，用动物进行眼科和视觉研究。
研究协会的声明，用动物进行眼科和视觉研究。
[0146] 噬菌体实验。噬菌体通过感染大肠杆菌K91kan对数生长期培养物来制备，并在37℃和250rpm下，在添加了卡那霉素(100μg/ml)和四环素(20μg/ml)的LB培养基中培
养过夜。用PEG/NaCl方法使噬菌体从培养基上清液中沉淀下来，噬菌体滴度通过连续稀释
和菌落计数来测定(Giordano，2001)。有关噬菌体结合和竞争实验，将VEGFR-1、NRP-1或
BSA(PBS中10μg/ml)固定在微滴孔上，4℃过夜。测试孔冲洗两次，在室温下用PBS(3％
9
BSA)阻断2小时，并和10TU的CPQPRPLC或阴性对照无插入(Fd-tet)噬菌体在PBS(3％
BSA)中温育。室温下一小时后，用PBS洗涤孔10次，并通过细菌感染回收结合于固定受体
的噬菌体(Giordano，2001)。
养过夜。用PEG/NaCl方法使噬菌体从培养基上清液中沉淀下来，噬菌体滴度通过连续稀释
和菌落计数来测定(Giordano，2001)。有关噬菌体结合和竞争实验，将VEGFR-1、NRP-1或
BSA(PBS中10μg/ml)固定在微滴孔上，4℃过夜。测试孔冲洗两次，在室温下用PBS(3％
9
BSA)阻断2小时，并和10TU的CPQPRPLC或阴性对照无插入(Fd-tet)噬菌体在PBS(3％
BSA)中温育。室温下一小时后，用PBS洗涤孔10次，并通过细菌感染回收结合于固定受体
的噬菌体(Giordano，2001)。
[0147] 蛋白酶抗性检测。D(LPR)和RPL肽用PBS稀释到500μg/ml，并在37℃下，在递增浓度的胰酶中温育2小时(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。然后用质谱(MALDI-TOF)分析
样品。
样品。
[0148] 血管生成检测。发明人使用了体内基质胶血管生成实验(其中生长因子降低用重组人VEGF165(1μg/ml)和肝素(10U/ml)浸渍的基质胶基质(BD Biosciences，Bedford，
MA)(含或不含肽模拟化合物(500μg)))体内皮下移植(0.5ml)到Balb-c小鼠的背部区
域。将D(CAPAC)用作对照肽模拟化合物。7天后，处死小鼠，切细基质胶填料，照相，用杜恩斯匀化器使之在Brij 0.35％溶液中搅匀，以13.000g离心5分钟。上清液分成两份，以用
Drabkin’s剂测量血红蛋白(Hb)，并根据同时测量的标准Hb来计算Hb浓度。
MA)(含或不含肽模拟化合物(500μg)))体内皮下移植(0.5ml)到Balb-c小鼠的背部区
域。将D(CAPAC)用作对照肽模拟化合物。7天后，处死小鼠，切细基质胶填料，照相，用杜恩斯匀化器使之在Brij 0.35％溶液中搅匀，以13.000g离心5分钟。上清液分成两份，以用
Drabkin’s剂测量血红蛋白(Hb)，并根据同时测量的标准Hb来计算Hb浓度。
[0149] 人血管生成的SCID小鼠模型。将106个在基质胶/支架中的人皮肤微内皮细胞(HDMEC)移植给小鼠，每个小鼠2个支架，每胁腹一个。移植后第12天，每天用D(LPR)或对
照肽模拟物D(APA)处理小鼠(腹腔内注射100μL 2mg/ml溶液)。通过溶于DMSO至20mg/
ml的储存浓度来配制药物，每次注射时用PBS新鲜稀释(1/10)。收获支架，并用10％甲醛
/PBS固定。用von Willebrand因子抗体(Neomarkers，Freemont，CA)标记组织切片，用
AEC(DABCO)显影，并用苏木精复染。光学显微镜下计数，在200倍放大倍数下每个支架6个
视场(对于D(LPR)，n＝6；对于对照肽模拟物，n＝4)。在Sigmastat上进行统计学分析。
照肽模拟物D(APA)处理小鼠(腹腔内注射100μL 2mg/ml溶液)。通过溶于DMSO至20mg/
ml的储存浓度来配制药物，每次注射时用PBS新鲜稀释(1/10)。收获支架，并用10％甲醛
/PBS固定。用von Willebrand因子抗体(Neomarkers，Freemont，CA)标记组织切片，用
AEC(DABCO)显影，并用苏木精复染。光学显微镜下计数，在200倍放大倍数下每个支架6个
视场(对于D(LPR)，n＝6；对于对照肽模拟物，n＝4)。在Sigmastat上进行统计学分析。
[0150] 视网膜新生血管生成实验。为进行视网膜新生血管生成实验，发明人使用了C57BL/6小鼠幼崽和它们的代理母亲。小鼠(P7)暴露于75％氧气5天，返回到室内空气
(20.8％O2)(P12)，并每天注射D(LPR)、对照肽模拟物D(CAPAC；SEQ ID NO：6)(磷酸缓冲盐
水中20mg/Kg，作为媒质)或媒质7天(P12～P18)。有关组织学分析，在P19天血管生成
顶峰时处死小鼠，取出眼，固定，连续切片，用苏木精和伊红(H&E)染色。计量内界膜玻璃体侧边的内皮细胞核数。每个眼至少评估10张H&E染色切片，各条件下计量4～6个眼的细
胞核平均数。
(20.8％O2)(P12)，并每天注射D(LPR)、对照肽模拟物D(CAPAC；SEQ ID NO：6)(磷酸缓冲盐
水中20mg/Kg，作为媒质)或媒质7天(P12～P18)。有关组织学分析，在P19天血管生成
顶峰时处死小鼠，取出眼，固定，连续切片，用苏木精和伊红(H&E)染色。计量内界膜玻璃体侧边的内皮细胞核数。每个眼至少评估10张H&E染色切片，各条件下计量4～6个眼的细
胞核平均数。
[0151] 肿瘤生长。在添加有胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Dulbelco’s改良的Eegles培养基中培养EF43.fgf4细胞。在达到汇合前收获细胞，并皮下注射到Balb/c小鼠的乳腺
3
脂肪垫中。10天后，肿瘤达到～50～80mm 将小鼠分成4组，每组7只动物(N＝7)。每组
动物用仅媒质(磷酸盐缓冲溶液)或对照肽D(CAPAC)(SEQ ID NO：6)或D(LPR)(以50mg/
Kg)或环型D(CLPRC)(SEQ ID NO：7)(以25mg/Kg)处理。通过测量各肿瘤的长轴(L)和短
2
轴(S)的长度来计算肿瘤体积(V＝S×L×0.04)。
3
脂肪垫中。10天后，肿瘤达到～50～80mm 将小鼠分成4组，每组7只动物(N＝7)。每组
动物用仅媒质(磷酸盐缓冲溶液)或对照肽D(CAPAC)(SEQ ID NO：6)或D(LPR)(以50mg/
Kg)或环型D(CLPRC)(SEQ ID NO：7)(以25mg/Kg)处理。通过测量各肿瘤的长轴(L)和短
2
轴(S)的长度来计算肿瘤体积(V＝S×L×0.04)。
[0152] 统计分析。对于体内实验，统计的差异显著性用克鲁斯卡尔-瓦利斯检验(非参数单因素ANOVA法)以每处理日p＜0.05计统计学差异显著。用维尔科克森秩和检验进一
步计算处理日的各成对研究组之间的差异，其由克鲁斯卡尔-瓦利斯检验显示出统计学显
著性。用Bejamini和Hochberg方法调整多重比较。全部统计分析均用The R(2.4.1版)
Project for Statistical Computing计算。
步计算处理日的各成对研究组之间的差异，其由克鲁斯卡尔-瓦利斯检验显示出统计学显
著性。用Bejamini和Hochberg方法调整多重比较。全部统计分析均用The R(2.4.1版)
Project for Statistical Computing计算。
[0153] 2.实验结果
[0154] 为评估肽模拟化合物D(LPR)是否表现出VEGFR-1和NRP-1竞争结合，进行以下实验。在存在递增浓度的本发明的RPL肽或D(LPR)肽模拟物的情况下，进行亲本
CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)噬菌体向固定的VEGF受体NRP-1和VEGFR-1的结合。正如我们先
前工作所预期的那样(Giordano等人，2005)，RPL肽完全消除CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)噬
菌体和两种受体的结合。有趣的是，D(LPR)肽模拟物也与RPL非常相似的水平抑制噬菌体
的结合。RPL和D(LPR)以剂量依赖性的方式抑制噬菌体结合，而即便使用高浓度(100μM)
的对照肽也不影响CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)噬菌体的结合。由于抑制50％噬菌体结合的
肽浓度(IC50)和所述肽对受体的亲和性成反比，我们的数据提示，和CPQPRPLC(SEQ ID NO：
8)肽相比，RPL和D(LPR)都对VEGFR-1和NRP-1有较高的亲和性(Giordano等人，2001)。
D(LPR)对两种受体的IC50(1～10pM)显著低于前文所描述的CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)对
VEGFR-1(～1nM)或NRP-1(～50～100nM)的IC50(Giordano等人，2001)。
CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)噬菌体向固定的VEGF受体NRP-1和VEGFR-1的结合。正如我们先
前工作所预期的那样(Giordano等人，2005)，RPL肽完全消除CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)噬
菌体和两种受体的结合。有趣的是，D(LPR)肽模拟物也与RPL非常相似的水平抑制噬菌体
的结合。RPL和D(LPR)以剂量依赖性的方式抑制噬菌体结合，而即便使用高浓度(100μM)
的对照肽也不影响CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)噬菌体的结合。由于抑制50％噬菌体结合的
肽浓度(IC50)和所述肽对受体的亲和性成反比，我们的数据提示，和CPQPRPLC(SEQ ID NO：
8)肽相比，RPL和D(LPR)都对VEGFR-1和NRP-1有较高的亲和性(Giordano等人，2001)。
D(LPR)对两种受体的IC50(1～10pM)显著低于前文所描述的CPQPRPLC(SEQ ID NO：8)对
VEGFR-1(～1nM)或NRP-1(～50～100nM)的IC50(Giordano等人，2001)。
[0155] 然后，检测了D(LPR)对蛋白降解的抗性。将RPL和D(LPR)与递增浓度的胰酶(胰腺产生的几种消化酶的混合物)温育，并用质谱分析了降解产物。用D(LPR)肽模拟物在最
高比例的酶/所检测肽浓度(400pg/nmol)下没有发现分解产物。然而，RPL肽显示出显著
降解，存在PL二肽降解产物。总之，这些数据证明了D(LPR)是不易蛋白降解的RPL模拟物，
它以高亲和性的结合VEGFR-1和NRP-1，是更好的研究RPL基序在血管生成中的作用的潜在
药物候选物。
高比例的酶/所检测肽浓度(400pg/nmol)下没有发现分解产物。然而，RPL肽显示出显著
降解，存在PL二肽降解产物。总之，这些数据证明了D(LPR)是不易蛋白降解的RPL模拟物，
它以高亲和性的结合VEGFR-1和NRP-1，是更好的研究RPL基序在血管生成中的作用的潜在
药物候选物。
[0156] 在已鉴定和表征了D(LPR)肽模拟化合物的情况下，研究了D(LPR)在新血管形成中的作用。为此，用了两种血管生成动物模型：体内基质胶和人内皮细胞在鼠宿主中的生长
(Nor等人，2001)。先用体内基质胶实验模型进行研究，其中，给小鼠皮下注射含VEGF165和
D(LPR)肽模拟物的基质胶。移植7天后，和只含VEGF165的阳性对照人工基质胶填料相比，
已浸渍D(LPR)的基质胶填料表现出降低的血管生成；在含对照肽模拟物的填料中没有观察
到其对新血管生成有影响(图1A)。
(Nor等人，2001)。先用体内基质胶实验模型进行研究，其中，给小鼠皮下注射含VEGF165和
D(LPR)肽模拟物的基质胶。移植7天后，和只含VEGF165的阳性对照人工基质胶填料相比，
已浸渍D(LPR)的基质胶填料表现出降低的血管生成；在含对照肽模拟物的填料中没有观察
到其对新血管生成有影响(图1A)。
[0157] 接下来研究了人血管生成SCID小鼠模型中D(LPR)的作用。在此模型中，将人内皮细胞体内培养于聚合物移植物中，并生长至形成微血管，其然后与小鼠毛细血管融合。这些
新生血管是有功能的，和表达血管生成标志物的人内皮细胞并排，并转运鼠血细胞。为了评
估D(LPR)在血管生成动物模型中的作用，给小鼠移植含人内皮细胞的支架，并使之生长12
天。这12天期间，内皮细胞形成无功能的含空腔的管状结构，其缓慢成熟成为功能完全的
含鼠血细胞的血管(Nor等人，2001)。然后从第12天～第21天用D(LPR)或对照肽模拟物
处理小鼠(25mg/Kg/天)。每天腹腔内注射肽模拟化合物，在治疗结束时，除去支架，并测定
形成有功能的血管的内皮细胞数。在第21天，全部动物发育出具有预期细胞密度的功能性
血管；这些血管是有功能的，并对血管生成标记物呈阳性。本发明人发现，与用对照肽模拟
物处理的动物相比，用D(LPR)肽处理的动物组的血管形成降低了36.7％(在每个放大视野
中32.1血管对D(LPR)存在下的20.3)(图1B)。总之，这些数据表明了D(LPR)肽模拟物在
两种不同的血管生成动物模型中都抑制体内血管的形成和成熟。
新生血管是有功能的，和表达血管生成标志物的人内皮细胞并排，并转运鼠血细胞。为了评
估D(LPR)在血管生成动物模型中的作用，给小鼠移植含人内皮细胞的支架，并使之生长12
天。这12天期间，内皮细胞形成无功能的含空腔的管状结构，其缓慢成熟成为功能完全的
含鼠血细胞的血管(Nor等人，2001)。然后从第12天～第21天用D(LPR)或对照肽模拟物
处理小鼠(25mg/Kg/天)。每天腹腔内注射肽模拟化合物，在治疗结束时，除去支架，并测定
形成有功能的血管的内皮细胞数。在第21天，全部动物发育出具有预期细胞密度的功能性
血管；这些血管是有功能的，并对血管生成标记物呈阳性。本发明人发现，与用对照肽模拟
物处理的动物相比，用D(LPR)肽处理的动物组的血管形成降低了36.7％(在每个放大视野
中32.1血管对D(LPR)存在下的20.3)(图1B)。总之，这些数据表明了D(LPR)肽模拟物在
两种不同的血管生成动物模型中都抑制体内血管的形成和成熟。
[0158] 然后，进行研究以回答D(LPR)肽模拟化合物是否可作为治疗病理生理性血管生成的药物的问题。为此，选择两种疾病用动物模型，已知血管生成在疾病发展中起重要作用，
所述疾病如早产儿视网膜病变(ROP)和癌症。为进行ROP研究，使用了氧气诱导的视网膜
病的小鼠模型(Smith等人，1994；Lahdenranta等人，2001)。该模型中，将新生小鼠(7日
龄)暴露于高水平氧(75％)中5天，然后放回到室内空气(20.8％氧)中。氧水平变化导
致动物相对缺氧，内皮细胞通过激活氧应答元件(例如低氧诱导因子-1(HIF-1)和VEGF)
做出响应(Smith等人，1994；Lahdenranta等人，2001)。回到室内空气中(第12天)后，
每天用D(LPR)或对照肽模拟物处理动物7天(20mg/Kg)。在处理结束时(第19天)，取出
眼，并通过计量从视网膜伸出的血管和内皮细胞数来测定新血管生成的水平(图2A)。发
现和只用媒质或对照肽模拟物处理的动物相比，用D(LPR)处理的动物的血管生成显著下降
(68.5％)(图2B，2C)(只用媒质处理的动物中为29.8±3.8核/视网膜；用对照肽模拟物处
理的动物中为29.3±6.0核/视网膜；用D(LPR)处理的动物中为9.4±1.0核/视网膜)。
所述疾病如早产儿视网膜病变(ROP)和癌症。为进行ROP研究，使用了氧气诱导的视网膜
病的小鼠模型(Smith等人，1994；Lahdenranta等人，2001)。该模型中，将新生小鼠(7日
龄)暴露于高水平氧(75％)中5天，然后放回到室内空气(20.8％氧)中。氧水平变化导
致动物相对缺氧，内皮细胞通过激活氧应答元件(例如低氧诱导因子-1(HIF-1)和VEGF)
做出响应(Smith等人，1994；Lahdenranta等人，2001)。回到室内空气中(第12天)后，
每天用D(LPR)或对照肽模拟物处理动物7天(20mg/Kg)。在处理结束时(第19天)，取出
眼，并通过计量从视网膜伸出的血管和内皮细胞数来测定新血管生成的水平(图2A)。发
现和只用媒质或对照肽模拟物处理的动物相比，用D(LPR)处理的动物的血管生成显著下降
(68.5％)(图2B，2C)(只用媒质处理的动物中为29.8±3.8核/视网膜；用对照肽模拟物处
理的动物中为29.3±6.0核/视网膜；用D(LPR)处理的动物中为9.4±1.0核/视网膜)。
[0159] 接下来，进行研究以确定D(LPR)肽是否对肿瘤诱导的新血管生成起作用。为此研究，选择了高度血管生成的乳腺癌EF43.fgf4小鼠模型(Deroanne等人，1997；Hajitou et
al，1998)。在此模型中，癌症细胞产生并分泌成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)，其诱导生成
导致高度血管化肿瘤的VEGF的自分泌产生。向动物乳腺脂肪垫皮下注射乳腺癌细胞，并使
3
肿瘤生长达小尺寸(50～80mm)。每天分别向携肿瘤的动物腹腔内注射D(LPR)(50mg/Kg)、
对照肽模拟物或仅媒质来处理所述动物。处理5天后，在用D(LPR)处理的动物中检测到肿
瘤体积明显减小(图3)。为这些研究，利用了D(LPR)肽模拟物的环状变体D(CLPRC)。用
D(CLPRC)(25mg/Kg)处理携肿瘤动物也显著减小了肿瘤体积(图3)。未观察到对用对照肽
模拟物处理的动物肿瘤生长有影响。
al，1998)。在此模型中，癌症细胞产生并分泌成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)，其诱导生成
导致高度血管化肿瘤的VEGF的自分泌产生。向动物乳腺脂肪垫皮下注射乳腺癌细胞，并使
3
肿瘤生长达小尺寸(50～80mm)。每天分别向携肿瘤的动物腹腔内注射D(LPR)(50mg/Kg)、
对照肽模拟物或仅媒质来处理所述动物。处理5天后，在用D(LPR)处理的动物中检测到肿
瘤体积明显减小(图3)。为这些研究，利用了D(LPR)肽模拟物的环状变体D(CLPRC)。用
D(CLPRC)(25mg/Kg)处理携肿瘤动物也显著减小了肿瘤体积(图3)。未观察到对用对照肽
模拟物处理的动物肿瘤生长有影响。
[0160] 总之，这些数据表明D(LPR)肽模拟物及其环状形式是一类新的血管生成抑制剂和靶向剂，其在临床及后期(如管形成和成熟)中有重要应用(人血管生成的SCID小鼠模
型)。当给小鼠全身施用D(LPR)时，显著减少病理性血管生成(ROP小鼠模型)和肿瘤诱导
的血管生成中的血管形成。
型)。当给小鼠全身施用D(LPR)时，显著减少病理性血管生成(ROP小鼠模型)和肿瘤诱导
的血管生成中的血管形成。
[0161] 实施例2：靶向脂肪的研究/肥胖症研究
[0162] 在发达国家，饮食和生活方式是肥胖症高发的原因。美国约65％成年人群超重，体2 2
重指数大于或等于25kg/m，且超过30％是肥胖(体重指数大于或等于30kg/m)。肥胖症与
糖尿病、癌症和心脏病风险增加有关，并且常使人寿命变短。肥胖症治疗的进展迄今相当有
限，局限于一些控制非正常脂肪堆积的药物(Clapham等人，2001)。大部分抗肥胖症剂基于
改变能量平衡通路和通过作用于脑内的受体来影响食欲。这类药物(如芬氟拉明)中有一
些已经由于无法预期的毒性而从市场上退出。近来尝试开发通过作用于胃肠道为来抑制脂
肪吸收的药物(如奥利司他，商品名 Roche)，可增强抗肥胖症治疗。然而，即使
最有效的药物，最多也只能降低5％的体重，进一步体重减轻需要严格限制饮食(Clapham
等人，2001；Padwal和Majumdar，2007)。
重指数大于或等于25kg/m，且超过30％是肥胖(体重指数大于或等于30kg/m)。肥胖症与
糖尿病、癌症和心脏病风险增加有关，并且常使人寿命变短。肥胖症治疗的进展迄今相当有
限，局限于一些控制非正常脂肪堆积的药物(Clapham等人，2001)。大部分抗肥胖症剂基于
改变能量平衡通路和通过作用于脑内的受体来影响食欲。这类药物(如芬氟拉明)中有一
些已经由于无法预期的毒性而从市场上退出。近来尝试开发通过作用于胃肠道为来抑制脂
肪吸收的药物(如奥利司他，商品名 Roche)，可增强抗肥胖症治疗。然而，即使
最有效的药物，最多也只能降低5％的体重，进一步体重减轻需要严格限制饮食(Clapham
等人，2001；Padwal和Majumdar，2007)。
[0163] 已经认识到非瘤组织(即脂肪组织)的生长还依赖于新血管的形成(新血管生成)。例如，不同的接受抗血管生成剂的肥胖症模型的小鼠出现治疗剂量依赖的可逆的体重
减少和脂肪组织消失(Rupnick等人，2002)。这些研究表明脂肪组织质量对血管生成抑制
剂敏感。
减少和脂肪组织消失(Rupnick等人，2002)。这些研究表明脂肪组织质量对血管生成抑制
剂敏感。
[0164] 因此本发明人进行研究以评估本发明的LPR VEGFR-1靶向肽靶向脂肪组织，进而降低饮食导致的肥胖症小鼠的体重的能力。为此，将饮食导致肥胖症的小鼠分组，并用
VEGFR-1/NRP-1靶向肽处理。C57BL/6J-60％DIO小鼠(36周龄)购自The Jackson实验
室。给这些动物喂高热量食物(J-60％)，以产生饮食导致的肥胖症(DIO)表型。
VEGFR-1/NRP-1靶向肽处理。C57BL/6J-60％DIO小鼠(36周龄)购自The Jackson实验
室。给这些动物喂高热量食物(J-60％)，以产生饮食导致的肥胖症(DIO)表型。
[0165] 将动物分组，并每天用以下【组1】～【组4】处理：
[0166] 【组1】D(CLPRC)(SEQ ID NO：7)(N＝5)；
[0167] 【组2】CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：9)(N＝3)；
[0168] 【组3】D(CLPRC)联合CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：10)(N＝4)；
[0169] 【组4】仅媒质(N＝4)。
[0170] 所有动物都通过在治疗前30分钟经腹膜内施用1ml盐溶液(0.9％氯化钠溶液，美国药典质量)来给水。每天用溶解于磷酸缓冲盐水媒质(PBS)中的D(CLPRC)以
50mg/Kg/体重的剂量处理(组1和组3)小鼠(共注射100μl)；或用溶于PBS中的
CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：9)以3mg/Kg的剂量皮下施用(100μl总体积)(组
2)；或当与D(CLPRC)联用时以1mg/Kg的剂量施用(组3)，一周5天(周一～周五)。小鼠
一周称重一次。
50mg/Kg/体重的剂量处理(组1和组3)小鼠(共注射100μl)；或用溶于PBS中的
CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2(SEQ ID NO：9)以3mg/Kg的剂量皮下施用(100μl总体积)(组
2)；或当与D(CLPRC)联用时以1mg/Kg的剂量施用(组3)，一周5天(周一～周五)。小鼠
一周称重一次。
[0171] 研究结果示于图4A～4C。在每天经腹膜内注射D(CLPRC)(50mg/Kg)治疗的肥胖症小鼠组中，可发现在处理期约3克(约体重的6％)的相当实质性的体重减轻，而对照组
的小鼠表现为体重相对增加(图4A)。接下来，为了证实D(CLPRC)降低体重的作用，设计了
联合治疗实验。用VEGFR-1/NRP-1靶向肽和脂肪除手(fat-zapper)抗肥胖症化合物一起
处理肥胖症小鼠。在先前的研究中，本发明人已经证明，可通过用缀合了的导向肽(homing
peptide)CKGGRAKDC(SEQ ID NO：11)和促凋亡肽D(KLAKLAK)2(SEQID NO：2)选择性靶向脂
肪血管系统来实现白色脂肪消融(Kolonin等人，2004)。此化合物，命名为“脂肪除手”(序
列CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2)(SEQ ID NO：9)，在治疗剂量等于或高于3mg/Kg/体重时引
起脂肪消融。然而，在联合实验中，将VEGFR-1/NRP-1靶向肽D(CLPRC)(SEQ ID NO：7)与亚
治疗剂量的脂肪除手(1mg/Kg)联合，期望D(CLPRC)的抗血管生成作用会与脂肪除手的组
织消融作用相协同。
的小鼠表现为体重相对增加(图4A)。接下来，为了证实D(CLPRC)降低体重的作用，设计了
联合治疗实验。用VEGFR-1/NRP-1靶向肽和脂肪除手(fat-zapper)抗肥胖症化合物一起
处理肥胖症小鼠。在先前的研究中，本发明人已经证明，可通过用缀合了的导向肽(homing
peptide)CKGGRAKDC(SEQ ID NO：11)和促凋亡肽D(KLAKLAK)2(SEQID NO：2)选择性靶向脂
肪血管系统来实现白色脂肪消融(Kolonin等人，2004)。此化合物，命名为“脂肪除手”(序
列CKGGRAKDC-GG-D(KLAKLAK)2)(SEQ ID NO：9)，在治疗剂量等于或高于3mg/Kg/体重时引
起脂肪消融。然而，在联合实验中，将VEGFR-1/NRP-1靶向肽D(CLPRC)(SEQ ID NO：7)与亚
治疗剂量的脂肪除手(1mg/Kg)联合，期望D(CLPRC)的抗血管生成作用会与脂肪除手的组
织消融作用相协同。
[0172] 当动物接受这两种药物时，观察到体重确实显著减少了约8克(至约体重的16％)(图4B)。接受联合治疗的动物表现出与只接受脂肪除手(以最佳治疗剂量3mg/Kg)
的小鼠组(图4C)(其减轻约10克(20％的体重))类似的体重减轻。总之，这些数据证明
VEGFR-1/NRP-1靶向肽引起肥胖症小鼠体重下降，并且它们可与其他抗肥胖症治疗协同作
用。VEGFR-1/NRP-1靶向肽可在治疗人肥胖症中发挥重要作用。
的小鼠组(图4C)(其减轻约10克(20％的体重))类似的体重减轻。总之，这些数据证明
VEGFR-1/NRP-1靶向肽引起肥胖症小鼠体重下降，并且它们可与其他抗肥胖症治疗协同作
用。VEGFR-1/NRP-1靶向肽可在治疗人肥胖症中发挥重要作用。
[0173] ※※※
[0174] 根据本文公开，无需过多实验就可制备和实施本文公开及权利要求要求保护的所有组合物和方法。尽管通过优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人
员明晰，在不脱离本发明的概念，精神和范围的前提下，可对本文所述组合物、方法、步骤或方法步骤的顺序做出改变。更具体而言，明显可用某些化学和生理学上相关的制剂代替本
文所说的制剂，并取得相同或类似的结果。所有本领域技术人员明晰的类似替代和修饰都
在随附的权利要求中定义的本发明的精神，范围和概念之内。
员明晰，在不脱离本发明的概念，精神和范围的前提下，可对本文所述组合物、方法、步骤或方法步骤的顺序做出改变。更具体而言，明显可用某些化学和生理学上相关的制剂代替本
文所说的制剂，并取得相同或类似的结果。所有本领域技术人员明晰的类似替代和修饰都
在随附的权利要求中定义的本发明的精神，范围和概念之内。
[0175] 参考文献
[0176] 下列参考文献在一定程度上提供了例示过程或其他对本文上述的补充性细节，将它们通过引用特别并入本文。
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[0182] U.S.Patent 4,277,437
[0183] U.S.Patent 4,366,241
[0184] U.S.Patent 4,472,509
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