技术领域

本发明涉及现代生物医学领域的病毒基因工程领域，具体地讲，本发明涉及肿瘤生物治 疗领域的肿瘤特异性增殖溶瘤病毒治疗领域。本发明具体涉及既能在肿瘤细胞内特异性 增殖以裂解肿瘤细胞，同时又随着病毒的增殖复制能在肿瘤细胞内表达具有抗肿瘤或辅 助抗肿瘤活性的外源基因蛋白的重组水疱性口炎病毒的构建、制备、生产方法，含有该 重组水疱性口炎病毒的药物或药物组合物，以及使用含该重组水疱性口炎病毒的药物或 药物组合物治疗局部肿瘤及转移肿瘤的方法。

技术背景

20世纪后期近30年以来我国的癌症发病率一直呈上升的趋势。随着烈性传染病得以控 制，新生儿死亡率大幅度下降，平均寿命延长，到90年代初，癌症已仅次于心脑血管 病，成为排在第二位的死亡原因，90年代末，则升至第一位。根据1973-1975年及 1990-1992年两次中国范围的死因调查，近20年期间恶性肿瘤在死因中的构成比，自 70年代的12.6％升至90年代的17.9％。恶性肿瘤的病死率在此近20年期间也呈上升趋 势，1997年公布的中国90年代人口死亡原因抽样结果显示，癌症死亡率为124.46/10 万(世界调整标化率)，比70年代增长了29.4％，消除年龄构成不同的影响，增长率为 11.6％，年死亡人数也已由90万人增至130万人以上。

据世界卫生组织报告，1997年世界新发癌症患者924万人，死亡623.5万人；我国每年 新发癌症患者160万人，死亡130万人。在不到20年的时间里，我国癌症发病率上升 69％，死亡率增长29％；在我国2.7亿个家庭中，平均每90个家庭中就有1个癌症病 人。

根据国家卫生部的统计数据及专家的保守估计，我国目前现有癌症患者450万人，每年 我国新诊肿瘤患者约160万人，肿瘤患者年死亡约130万人。

众所周知，临床上治疗肿瘤最常用的传统的肿瘤手术切除和放化疗疗法，在给患者带来 极大的痛苦和负担的同时，并没有获得理想的治疗效果，特别是对中晚期恶性肿瘤患者， 甚至有加速其死亡的可能。而且，对转移性肿瘤患者而言，一方面很难将肿瘤彻底手术 切除或通过放化疗疗法彻底杀灭；另一方面，切除原位肿块，往往有引发肿瘤在身体其 它部位生长的风险，结果反而加速了肿瘤的扩散。 肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。 肿瘤免疫治疗的方法包括应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机体的免疫功能，激 活机体的抗肿瘤免疫应答，以达到治疗肿瘤的目的非特异性免疫治疗；给机体输入具有 抗原性的瘤苗，刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫以治疗肿瘤的主动免疫治疗；以及给 机体输注外源的免疫效应物质，由这些外源性效应物质在机体内发挥治疗肿瘤作用的被 动免疫治疗。肿瘤的免疫治疗只能清除少量的、播散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤 疗效有限，因而仅作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规疗法联合应用。一般先 用常规疗法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞。虽然目前已经 建立了多种免疫方法，并在动物实验中取得了一些良好疗效，但在临床应用时受到很多 因素的影响，其临床治疗的效果尚很有限。

由于恶性肿瘤严重危害人类健康，且目前仍缺乏有效的治疗手段，常规治疗的治愈率低， 复发率及死亡率高、预后较差，因此，通过改造基因来治疗疾病的基因治疗概念一经提 出，很快就被应用至肿瘤治疗。从80年代初提出肿瘤的基因治疗，到90年初进入临床 试验，人们对肿瘤的基因治疗抱有很高的热情，一段时间以来肿瘤基因治疗研究如火如 荼，基因治疗被普遍认为是人类最终征服肿瘤的希望。

肿瘤基因治疗常使用下列基因：自杀基因HSV-TK(单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶脱氧核苷 激酶)，CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)及细胞色素P450；抑癌基因P53，P16及Rb，抗 血管生成基因Angiostatin(血管生成抑制因子)和Endostatin(内皮抑制素)；免疫基因 白细胞介素IL-4、12，干扰素IFN-α、β、γ，热休克蛋白HSP70和GRP94/GP96等。 然而经过近二十年500多个肿瘤的基因治疗临床试验方案的研究，其结果远非象人们所 希望的哪样理想，临床研究的结果显示肿瘤的基因治疗是非常安全的，但其抗肿瘤效应 也非常低，有的单独应用甚至无任何治疗作用。分析起来，主要原因是现阶段基因治疗 的载体系统在人体内既不能特异性转染所有的肿瘤细胞，也不能使治疗基因在肿瘤细胞 高效表达，因而不能彻底杀灭肿瘤细胞，这严重阻碍着肿瘤基因治疗的临床疗效。在肿 瘤病人体内，如果只能杀灭部分肿瘤细胞，残留少部分细胞(那怕只有1％肿瘤细胞) 也会很快生长，导致肿瘤复发。因此如何进一步提高基因转染率、抗癌基因的表达量及 靶向肿瘤的特异性成为目前肿瘤基因治疗的关键难题，直接决定着肿瘤治疗的疗效，甚 至肿瘤基因治疗的成败。

肿瘤特异性增殖溶瘤病毒治疗的发现曾为肿瘤的治疗带来了一线曙光。约百年来前就偶 有肿瘤病人在某种病毒感染后会出现肿瘤暂时性消退的现象，引起医学家的关注，开始 寻找能杀灭肿瘤细胞的病毒。至1970年，人们已发现了38种在动物或人体体内具有抗 肿瘤活性的病毒，并开始在晚期肿瘤病人中进行临床试验，但当时只能应用病毒的粗提 物，其疗效并不显著，治疗后病人平均生存期很短。溶瘤病毒具有多方面的性质，其经 改造后能产生更加有选择性的抗肿瘤效果。在将来，有可能获得靶向特异性肿瘤抑制途 径或靶向肿瘤细胞表面不同受体的溶瘤病毒。溶瘤病毒治疗肿瘤在临床上已取得了初步 成功，但大量经验表明，许多治疗肿瘤的新方法在研究早期均有明确疗效，最终往往令 人失望，虽然可以肯定溶瘤病毒可使肿瘤萎缩甚至消失，但其最终对肿瘤的疗效的判断 还需要更长时间，并且溶瘤病毒单独应用的临床疗效均不十分理想，需要联合常规化疗 才能取得令人满意的临床疗效。

肿瘤生长最显著的特征之一是通过新生血管的形成以满足肿瘤的血供需要。肿瘤细胞能 分泌大量促进血管生长的许多血管生长因子，使肿瘤形成新的血管而快速生长，而血管 内皮细胞也可分泌血管生长因子促使血管内皮细胞自身乃至肿瘤细胞的增殖。毛细血管 如果没有血管生长因子诱导不会同肿瘤相连接，肿瘤如果没有血管生长和得不到源源不 断的血液供应就只能处于休眠状态。因此，利用血管生成抑制剂特异性地抑制肿瘤血管 内皮细胞的增殖和活性，从而抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤细胞的营养供应，导 致肿瘤细胞因营养不足而死亡，同时达到抑制肿瘤的生长和阻断肿瘤转移通路的目的而 不影响其它正常细胞，这就是肿瘤的抗血管生成疗法。内皮抑素(Endostatin)及血管抑 素(Angiostatin)是目前认为最强的血管生成抑制因子，具有高效抑制肿瘤新生血管的 形成从而抑制肿瘤的生长和转移、即使数百倍剂量在人体中也无毒副作用及反复应用也 无耐药性等优点。目前内皮抑素在国内外均已进入II期临床研究，但目前使用其蛋白质 治疗的最大难题是需要每天进行，同时需要量也极大，即使作用最强的内皮抑素治疗的 剂量也高达500～1000mg，无论从经济上或生产上均不堪负担切极不现实。近年，国内 有人将内皮抑素转入经过基因改造过的腺病毒载体而构建出重组人内皮抑素腺病毒 Ad-Endo，但使用的重组腺病毒不是肿瘤增殖病毒，仅仅是携带Endostatin基因进入肿 瘤细胞的一种基因治疗载体。

因此，迄今为止，传统的手术治疗和放化疗对机体本身造成伤害而且难以消除转移性肿 瘤；瘤基因治疗在临床上均证实是非常安全的，但急需进一步提高转染率、抗癌基因的 表达量及靶向肿瘤的特异性，现阶段用病毒等作为载体对肿瘤进行的基因治疗不仅只能 针对局部肿瘤，对转移性肿瘤也无能为力，而且疗效非常有限；肿瘤溶瘤病毒治疗虽和 肿瘤基因治疗一样在临床上均证实是非常安全的，但单独应用的临床疗效均不十分理 想，需要联合常规化疗才能取得令人满意的临床疗效；肿瘤的抗血管生成疗法使用蛋白 质治疗，需要每天进行极高剂量的治疗，似乎仅具有研究意义而从经济上和生产上均不 太现实；用白介素、干扰素等细胞因子对肿瘤进行免疫治疗只能激发免疫调节反应和很 少的CTL细胞介导的对肿瘤细胞的特异性杀伤效应；最近发展的“癌症疫苗”疗法强 调个体特性，不仅非常昂贵且没有普遍适用性。

近二十年来，随着分子生物学、分子病毒学及肿瘤学的发展，特别是基因组学的重大进 展，已完成了许多病毒的全部基因组测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为 详细的研究，能有效地对病毒基因进行结构修饰。病毒具有感染、复制增殖和溶解细胞 的能力，经过修饰的病毒使其在肿瘤细胞内的这些效应得到有效加强，病毒一旦感染肿 瘤细胞即可在细胞内增殖并裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放的病毒颗粒再次感染其它细 胞，直至将全部肿瘤细胞杀灭，修饰后的病毒其特异性更高，已经不能在正常细胞内增 殖，故对正常细胞影响不太，从而使修饰后的病毒只能在肿瘤细胞中特异性增殖，而在 正常细胞内不增殖，这样正常细胞损害不大，这种病毒即是肿瘤特异性增殖溶瘤病毒， 简称为肿瘤增殖病毒或溶瘤病毒。与此同时，对各种病毒的纯化及浓集方案也日趋成熟， 能够大量制备高纯度、高效价的病毒，为开发这种病毒制剂在肿瘤治疗的应用提供了可 能性。

近年来，对呼吸道肠道病毒(reovirus)、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、 自主微小病毒(parvovirus)及水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)等几种天 然存在的可在肿瘤细胞内特异性增殖的溶瘤病毒的研究为肿瘤的治疗带来了新的希望， 它不仅可能拯救陷入困境的肿瘤基因治疗和抗血管生成蛋白治疗，更可能最终成为人类 战胜癌症恶魔的制胜武器。

水泡状口炎病毒(VSV)对干扰素非常敏感，广泛应用于干扰素的活性检测。在正常细胞 中由于干扰素传导信号途径正常，故干扰素发挥有效的功能，从而抑制VSV在正常细 胞内复制，而在肿瘤细胞内由于干扰素传导信号途径异常，故干扰素不能起效，VSV能 有效复制，从而达到特异性杀灭肿瘤细胞。

VSV在分类上属于弹状病毒科(rhabdovirus)水泡病毒属，是弹状病毒科的典型代表。 在已经过去的30年里，被广泛用作分子和细胞生物学工具，其被普遍应用是由于其结 构简单并能在大多数哺乳动物细胞和许多其它种类细胞中快速生长并达到高滴度。VSV 同样为其他具有单一负链RNA基因组的RNA病毒的研究提供了模式，这使得其基因组 结构被研究得十分清楚。VSV病毒每一个均编码并产生一个RNA依赖的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase)，此酶转录11161nt的基因组RNA并产生亚基因组 mRNA(subdenomic mRNA)，也可通过不同的机制复制完整的基因组RNA。VSV亚基 因组mRNA编码5个结构蛋白：1个核壳体蛋白(nucleocapsid protein)N，两个多聚酶亚 单位(polymerase subunits)L和P，1个基质蛋白(matrix protein)M及1个转膜糖蛋白 (transmembrane glycoprotein)G。VSV的转录从基因组RNA的3’端顺序进行，先产生一 短的引导序列(Leader)，再依次是五个mRNA。

病毒作为选择性溶解及杀灭肿瘤的制剂虽已有很长的历史，但是进一步用基因操纵和基 因重组技术、通过遗传工程改造基因成分产生肿瘤选择性的病毒则是近几年的事。虽然 VSV mRNA和基因组的完整序列已经明了多年，但直到最近利用重组DNA技术改造 VSV并从DNA重获VSV才成为可能。基于DNA的单一负链RNA病毒重获系统使得 传染性病毒的基因工程和遗传工程成为可能。

迄今的研究发现，VSV具有如下优良的特性：

特异性和有效性：水泡状口炎病毒(VSV)对干扰素非常敏感，广泛应用于干扰素的活性 检测。在正常细胞中由于干扰素传导信号途径正常，故干扰素发挥有效的功能，从而抑 制VSV在正常细胞内复制(病毒滴度＜10PFU/ml；而在肿瘤细胞内由于干扰素传导信 号途径异常，故干扰素不能起效，VSV能在肿瘤细胞内选择性增殖(除个别例外，病毒 滴度＞3×106PFU/ml，甚至高达5×109PFU/ml)，并导致其裂解从而达到特异性高效杀 灭肿瘤细胞。

安全性及可控性：VSV基因组结构简单清楚，遗传稳定，增值机理及致病基因清晰，不 整合到人的基因组，感染所导致的人类疾病轻微并已熟知，且由于其对干扰素非常敏感， 在不需要或发生紧急情况时可用干扰素予以彻底清除，因而安全性及可溶性均非常高。 可获得性：VSV能在大多数哺乳动物细胞和许多其它种类细胞中快速生长并达到高滴 度，病毒生产及纯化工艺简单，生产周期短，产量高。

适用性：VSV在体内能感染多种组织及细胞，能在除脑部肿瘤外(因血脑屏障原因)绝 大部分肿瘤细胞中，包括血液肿瘤细胞中特异性增殖并溶解杀死肿瘤细胞，抗瘤谱广， 具有广泛的适应性。

资源适应性：可以使用现有的抗肿瘤药物研究的动物模型来进行临床前的动物实验研 究，包括药效学、药理学、毒理学既要代动力学等研究。

近二十年来，随着分子生物学、分子病毒学及肿瘤学的发展，特别是基因组学的重大进 展，已完成了许多病毒的全部基因组测序工作，并对其基因的一结构及其功能进行了较 为详细的研究，能有效地对病毒基因进行结构修饰。病毒具有感染、复制增殖和溶解细 胞的能力，经过修饰的病毒使其在肿瘤细胞内这些效应得到有效加强，病毒一旦感染肿 瘤细胞即可在细胞内增殖并裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放的病毒颗粒再次感染其它细 胞，直至将全部肿瘤细胞杀灭，但修饰后的病毒应该不能在正常细胞内增殖，故对正常 细胞影响不太，从而使修饰后的病毒只能在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不 增殖，这样正常细胞损害不大，这种病毒即是肿瘤特异性增殖溶瘤病毒，简称为肿瘤增 殖病毒或溶瘤病毒。与此同时，对各种病毒的纯化及浓集方案也日趋成熟，能够大量制 备高纯度、高效价的病毒，为开发这种病毒制剂在肿瘤治疗的应用提供了可能性。

病毒作为选择性溶解及杀灭肿瘤的制剂已有很长的历史，但是进一步用基因工程改造基 因成分产生肿瘤选择性的病毒则是近几年的事。肿瘤特异性增殖溶瘤病毒具有多方面的 性质，并经改造后能产生更加有选择性的抗肿瘤效果。在将来，有可能获得靶向特异性 肿瘤抑制途径的肿瘤特异性增殖溶瘤病毒或靶向肿瘤细胞表面不同受体的肿瘤特异性 增殖溶瘤病毒。无论是毒性还有有效性方面，进一步明确免疫系统在限制或增强抗肿瘤 效果的作用可进一步完善病毒作用。

肿瘤特异性增殖溶瘤病毒治疗的高特异性和安全性为肿瘤基因治疗所面临的难题提供 了一种极好的解决方法，一种全新的结合基因治疗与病毒治疗的肿瘤治疗新策略—肿瘤 基因-病毒疗法为肿瘤治疗开辟了广阔的前景。

肿瘤基因-病毒疗法，即应用肿瘤特异性增殖病毒携带抗癌基因，利用该病毒在肿瘤细 胞内特异性增殖及复制，其抗癌基因基因拷贝数成千上万倍增加，从而数百倍乃至上万 倍提高抗癌基因的表达量。由于病毒在正常细胞内不增殖，从而使抗癌基因在肿瘤细胞 内特异性且高效表达，它克服了传统肿瘤基因治疗的转染率低、靶向性差、抗瘤基因表 达量低以及病毒治疗对肿瘤杀伤力不足的缺点。这种新型的肿瘤治疗新方案充分利用了 病毒体积小、弥散力及复制力均较强的优点，在肿瘤原发灶及转移灶局部形成高浓度病 毒，从而达到杀灭肿瘤细胞的目的。同时由于病毒携带抗癌基因，该基因随着病毒在肿 瘤细胞内复制，从而在肿瘤细胞内高效表达抗癌基因，两者协同作用将进一步提高抗肿 瘤的疗效。这种方案与传统肿瘤基因治疗的病毒载体有本质不同，所谓载体从本意上讲 是一种运送工具，即将抗癌基因运输至肿瘤细胞内，而其载体本身而言并无治疗作用。 而基因-病毒系统是利用病毒将基因特异地运至肿瘤细胞内，其抗癌基因随着病毒在肿 瘤细胞复制，使基因拷贝数成千上万倍增加，数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量， 从而杀灭肿瘤细胞，同时病毒本身也有直接裂解肿瘤的作用，并激发疫苗反应，因此基 因-病毒系统对肿瘤具有双重治疗作用。

肿瘤基因治疗常使用下列基因同样可以应用于肿瘤基因-病毒疗法：自杀基因HSV-TK (单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶)，CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)及细胞色素 P450；抑癌基因P53、pRB，抗血管生成基因Angiostatin(血管生成抑制因子)和Endostatin (内皮抑制素)；免疫基因白细胞介素IL-4、12，干扰素IFN-α、β、γ，热休克蛋白HSP70 和GRP94/GP96等。利用分子生物学手段，通过基因工程方法将这些基因与肿瘤特异性 增殖溶瘤病毒进行基因重组，获得的基因工程重组病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复 制，从而使携带的抗癌基因在肿瘤细胞内特异性且高效地表达，由此而产生对肿瘤的双 重治疗作用，而在正常细胞内既不增殖，也不表达，确保对正常细胞和组织的安全性。 现有的研究表明，VSV的M蛋白是具有多种功能，并为包括宿主基因表达抑制等几种 关键的病毒功能所要求。VSV M所具有的抑制宿主基因表达的特性是由于其阻断宿主 RNA聚合酶活性或抑制蛋白和mRNA进出宿主细胞核的核转运。现已发现两个与野生 型印第安那株VSV(VSVwt)相比，其VSV M发生了点突变的VSV天然减毒突变株： 51位氨基酸点突变的VSVM51R、221位和226位氨基酸点突变的VSVM221F+226R。细胞试 验和动物实验证明，这两种天然减毒突变株在表皮细胞中诱导产生内源性IFN-α的能力 比VSVwt高20～50倍，从而使得其在保有原有溶解肿瘤能力的基础上，特异性大大提 高而对正常细胞和组织的毒性大大降低。

近年，国内有人将内皮抑素转入经过基因改造过的腺病毒载体而构建出重组人内皮抑素 腺病毒Ad-Endo，但使用的重组腺病毒仅仅是携带Endostatin基因选择性进入肿瘤细胞 的一种基因治疗载体，尚不能在肿瘤细胞内特异性高滴度增殖，如上海韦池生物技术公 司的郑严光的公开发明专利“01119903肝癌细胞特异的基因工程腺病毒的构建及应用” 和广东黄文林的授权发明专利“01127894一种人血管内皮细胞生长抑制因子的重组病 毒”。

发明概述

本发明总的目的在于以水疱性口炎病毒为基础，利用分子生物学手段、通过基因工程方 法构建一种能在肿瘤细胞内特异性增殖并同时表达具有抗肿瘤或辅助抗肿瘤活性的外 源基因的基因重组溶瘤病毒，并以其为主要药效成分组成药物或药物组合物，以及施用 这种药物或药物组合物于肿瘤患者以杀灭其体内的肿瘤。具体来讲，本发明包括如下几 个方面：

本发明是以水疱性口炎病毒为基础，首先人工合成带有限制性酶且位点XhoI和NheI的 连接序列，利用分子生物学手段、通过基因工程方法，将其插入到VSVwt、VSVM51R、 VSVM221F+226R或VSVM51Δ基因组中G蛋白与L蛋白之间G蛋白的非编码区，并以此结 构为基础分别构建出用于创建重组水疱性口炎病毒的pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、 pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因组质粒；

以四个pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因组质粒 为基础，利用分子生物学手段、通过基因工程方法构建一种能在肿瘤细胞内特异性增殖 并同时表达具有抗肿瘤或辅助抗肿瘤活性的外源基因(Anti-tumor foreign gene，ATFG) 的基因重组溶瘤病毒rVSVwt-ATFG、rVSVM51R-ATFG、rVSVM221F+226R-ATFG或 rVSVM51 Δ-ATFG。这些具有抗肿瘤或辅助抗肿瘤活性的外源基因ATFG包括但不限于：自杀基 因HSV-TK(单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶)，CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶) 及细胞色素P450；抑癌基因p53，p16及pRB；抗血管生成基因Angiostatin(血管生成 抑制因子)和Endostatin(内皮抑制素)；免疫基因白细胞介素IL-4、12，干扰素IFN-α、 β、γ，热休克蛋白HSP70和GRP94/GP96；以及保有这些基因的作用功能的多肽片断。 本发明的又一目的在于提供一种药物或药物组合物，其主要药效成分为本发明的基因工 程重组水疱性口炎病毒rVSVwt-ATFG、rVSVM51R-ATFG、rVSVM221F+226R-ATFG或 rVSVM51Δ-ATFG。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗肿瘤、特别是恶性肿瘤的方法，该方法包括给肿 瘤患者施用有效剂量的本发明的药物或药物组合物以杀灭其体内的肿瘤。

附表简述

附表1是本发明所述的野生型水疱性口炎病毒印第安娜株的基因组核酸序列。

野生型水疱性口炎病毒印第安娜株的基因组核酸序列全长共11161个碱基。

附表2是野生型水疱性口炎病毒VSVwt、发生了M蛋白点突变的两个VSV天然减毒突变 株及一个重组减毒突变株的M蛋白氨基酸序列。

其中天然减毒突变株VSVM51R突变位点为51R，VSVM221F+226R突变位点为221F及 226R，VSVM51Δ为M51缺失突变。

附表3是人内皮抑素Endostatin基因核苷酸序列及蛋白质氨基酸序列

附图简述

图1是本发明所述的野生型水疱性口炎病毒印第安娜株的基因组mRNA结构图。 整个基因组由引导序列(Leader)、核蛋白N、非结构蛋白NS或磷蛋白P、基质蛋 白M、糖蛋白G、聚合酶蛋白L及非转录序列(nontranscribed sequence)组成。从3’ 端开始至5’端依次为：引导序列1-50，N蛋白51-1376，NS蛋白或P蛋白1386-2199， M蛋白2209-3039，G蛋白3049-4713，L蛋白4723-11095，非转录序列11102-11161； 基因间为由UUUUUUU和G/CA形成的长度为9nt的基因间隔序列。

图2水疱性口炎病毒基因组图及连接序列

人工合成的带有限制性酶且位点XhoI和NheI的连接序列插入到水疱性口炎病毒基 因组中G蛋白与L蛋白之间的G蛋白的非编码区。

图3用于创建基因工程重组水疱性口炎病毒的pVSV-XN2质粒结构

其中的VSV可以分别是VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或VSVM51Δ。

图4是携带抗癌基因的基因工程重组水疱性口炎病毒pVSV-ATFG基因组质粒结构图

其中的VSV可以分别是VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或VSVM51Δ。所携带的抗 癌基因是具有抗肿瘤或辅助抗肿瘤活性的外源基因(ATFG)，包括但不限于：自杀 基因HSV-TK、CD及细胞色素P450；抑癌基因p53、p16及RB；抗血管生成基因 Angiostatin和Endostatin；免疫基因白细胞介素IL-4、12，干扰素IFN-α、β、γ；热 休克蛋白HSP70等；以及保有这些基因的作用功能的多肽片断。

图5Vero细胞固定化培养生产重组VSV的动力学

图6重组水疱性口炎病毒rVSVM51R-Endo表达Endostatin的实验结果

重组人内皮抑素水疱性口炎病毒rVSVM51R-Endo治疗肝癌施用48小时后，Endostatin 在肝癌(BEL-7402)裸鼠体内的分布情况

图7重组水疱性口炎病毒rVSVM51R-Endo治疗原位及转移肿瘤试验结果

发明详述

本发明的重组水疱性口炎病毒是综合肿瘤基因疗法、溶瘤病毒疗法、免疫疗法及蛋白质 疗法的所有优势来治疗恶性肿瘤的创新药物。它是利用目前有效性和特异性最好的天然 溶瘤病毒、运用基因操纵和基因重组技术、采用遗传工程和基因工程方法创造性设计构 建的，并通过高滴度重组病毒生产工艺和富集纯化工艺而制备。因其具有感染多种组织 及细胞但仅在肿瘤原发灶及转移灶高度特异性高滴度增殖、且同时高水平表达具有抗肿 瘤或辅助抗肿瘤活性的外源基因的广谱双重超强抗癌活性，既能高效特异地彻底杀灭患 者体内的原发肿瘤及转移肿瘤又无传统疗法伤害正常组织和细胞的严重并发症，有望成 为彻底治愈恶性肿瘤的特效药物。

本发明的基因重组溶瘤病毒具有下列独特的优势：

1)、在肿瘤细胞中高特异性高滴度增值及复制，通过溶解肿瘤细胞而高效杀灭肿瘤， 产生的病毒继续感染临近肿瘤细胞直至消灭所有肿瘤。

2)、具有抗肿瘤或辅助抗肿瘤活性的外源基因因重组病毒的增值及复制，基因拷贝 数成千倍上万倍增加，从而使外源基因在肿瘤细胞内得到高效、特异性表达，利用患者 本身肿瘤细胞作为外源基因生产的加工厂，不仅大大降低成本及提高抗肿瘤疗效，而且 能在体内长时间稳定表达直至肿瘤完全消褪。

3)、具有的感染多种组织和细胞的能力使其不仅能在多种肿瘤原发灶也能在转移灶 高滴度增殖复制，具有彻底杀灭患者体内各种肿瘤的广谱抗肿瘤作用。

4)、超强的肿瘤特异性使其具有不伤害正常组织和细胞、毒副反应轻微的高度耐受 性。

5)、独具的诱导产生内源性干扰素的能力更为正常组织和细胞提供有力的保护。

6)、对干扰素的高度敏感性使得必要时可以迅速彻底地清除重组病毒，为产品提供 了高度的安全性保障。

在本发明中，我们采用的水疱性口炎病毒可以是野生型VSVwt，或两个发生了M蛋白 点突变的VSV天然减毒突变株(其中天然减毒突变株VSVM51R突变位点为51R， VSVM221F+226R突变位点为221F及226R。)及人工减毒突变株VSVM51Δ四种中的任意一种， 他们均在肿瘤细胞中特异性增殖而在正常细胞中基本上不生长。

本发明中的重组病毒在肿瘤细胞中特异性增值及复制的同时，表达具有抗肿瘤或辅助抗 肿瘤活性的外源基因蛋白。这些具有抗肿瘤或辅助抗肿瘤活性的外源基因包括但不限 于：自杀基因HSV-TK(单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶)，CD(大肠杆菌胞嘧 啶脱氨酶)及细胞色素P450；抑癌基因p53，p16及pRB，抗血管生成基因Angiostatin (血管抑素)和Endostatin(内皮抑素)；免疫基因白细胞介素IL-4、12，干扰素IFN-α、 β、γ，热休克蛋白HSP70和GRP94/GP96；以及保有这些基因的作用功能的多肽片断。

本发明中重组病毒所表达的一类蛋白为能抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤细胞的营 养供应，可导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，同时也达到阻断肿瘤转移通路目的的血管 生成抑制因子。肿瘤生长最显著的特征之一是通过新生血管的形成以满足肿瘤的血供需 要。例如，目前认为最强的Angiostatin及Endostatin，具有高效抑制肿瘤新生血管的形 成从而抑制肿瘤的生长和转移，即使数百倍剂量在人体中也无毒副作用及反复应用也无 耐药性等优点。但目前使用其蛋白质治疗，需要每天进行，同时需要量也极多，治疗的 剂量为500～1000mg，无论从经济上或生产上均不堪负担，也不太现实。而利用本发明 的携带Angiostatin或Endostatin基因的重组病毒，其在患者肿瘤细胞内增殖及复制，使 Angiostatin或Endostatin基因拷贝数上千倍乃至上万倍增加，从而使Angiostatin或 Endostatin在肿瘤细胞内得到高效、特异性表达。利用患者本身肿瘤细胞作为Angiostatin 或Endostatin生产的加工厂，不仅大大降低成本及提高抗肿瘤疗效，而且能在体内长时 间稳定表达，直至肿瘤完全消褪。

本发明中重组病毒所表达的一类蛋白为能够粘附肿瘤抗原并对抗原提呈细胞有亲和性 的蛋白，这类蛋白能够结合肿瘤特异抗原多肽形成蛋白-多肽复合物，并通过抗原肽伴 侣转移作用将抗原提交给树突状细胞等抗原提呈细胞，抗原被加工提呈，激发机体特异 性CTL免疫反应。这类蛋白的实例包括以热休克蛋白为主的分子伴侣蛋白。热休克蛋 白(Heat Shock Proteins，HSP)是一类高度保守并具有ATP酶活性的蛋白家族，在所有的 原核生物以及大多数真核细胞中都存在。无论是否存在外界压力，热休克蛋白在蛋白质 代谢中都起着重要作用，包括在蛋白质从头合成途径中蛋白质的折叠和跨膜转运以及错 误折叠后的降解。热休克蛋白，包括从肿瘤细胞和细菌感染的细胞中得到的hsp70和 grp94/gp96，都能够激发细胞性的免疫反应。热休克蛋白的免疫原性主要是由结合到其 分子上的多肽所产生。产生的热休克蛋白—抗原多肽通过一种不表达内生性抗原的特异 性细胞将抗原呈递给T淋巴细胞后，从而激活免疫系统。这些结果表明热休克蛋白作为 分子伴侣能够将抗原性的多肽呈递给抗原提呈细胞，可能是通过使这些多肽与MHC I 和MHC II分子结合而进入MHC I和MHC II呈递抗原途径；这些抗原多肽会进一步被 提呈给CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T细胞。

重要的一点是，本发明中重组病毒正确进行蛋白表达并不需要病毒整合到受体细胞的基 因组中。重组病毒可以以游离体状态存在于靶细胞中。

本发明的一个应用是重组病毒直接加入到瘤内，利用其所具有的优良特性来达到杀死局 部肿瘤和转移的肿瘤。给予重组病毒进行治疗可以单独使用，也可以和其它形式的免疫 治疗剂联合使用，包括细胞因子和传统中药。本研究领域的技术人员从本发明中可以认 识到重组病毒可以应用于肿瘤的治疗。

在适当的情况下，重组病毒可根据其给予的途径不同被加工成固体，半固体，液体或气 雾剂形式。可以利用已知的方法来阻止组合物在到达靶器官前被释放和吸收。本发明中 可采用任何一个可以接受的药剂形式保证本发明组分的有效性。在制剂时，本发明中的 重组病毒可以单独使用，也可和其它的药学上活性组分以适当的比例结合/配合使用。应 保证在给药时有足够多量的重组病毒，从而保证能提供药学上有效剂量的重组病毒及基 因产物。本发明的重组病毒可以单独使用也可以和不同的佐剂共同配制。

通常，可将本发明的重组病毒以治疗有效量通过本领域已知的各种常规的和可接受的方 式单独或与其它治疗剂一起联合给药。治疗有效量将根据疾病的严重程度、个体的年龄 和相对健康状况、所用重组病毒的效力以及其它因素有很大变化。通常，本领域普通技 术人员可以根据个人知识以及本申请所公开的内容确定出用于治疗给定肿瘤时的本发 明的重组病毒的治疗有效量。

本发明的重组病毒可以以药物组合物的形式通过下列途径之一给药：瘤内注射、口服、 全身性给药(例如，经皮、鼻内或通过栓剂给药)或胃肠外给药(例如，肌肉内、静脉内或 皮下)。组合物可以是片剂、丸剂、胶囊、半固体、散剂、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、 气雾剂的形式或是任何其它适宜的组合物，并且通常由本发明重组病毒以及至少一种可 药用赋形剂组成。可药用赋形剂是无毒的、对所述重组病毒的活性没有实质性损害的、 有助于给药的并且不会对其他活性成分的免疫或治疗效果产生不利影响物质。所述赋形 剂可以是任何固体、液体、半固体，或者在气雾剂组合物的情况下，可以是气体赋形剂。 这些赋形剂是本领域技术人员易于得到的。

固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘 露糖醇、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、 氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可以选自水、乙醇、甘油、丙二醇和各种油， 包括来源于石油、动物、植物或合成的油(例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。 优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的液体载体包括水、盐水、葡萄糖水溶液和二 甘醇。

本发明的组合物中重组病毒的用量可以根据制剂的种类、单位剂量的大小、赋形剂的种 类以及药学领域技术人员已知的其它因素有很大变化。而且，实际的剂量和治疗方案会 根据其它因素如该发明的组分是否和其它治疗组分结合，个体的药物动力学，药物分布 和代谢等各不相同而有所变化。而且，加入细胞的重组病毒量也随着插入载体的治疗基 因的长度、稳定性和序列的性质而不同，是一个由经验决定的变量，很可能被非本发明 中方法之外的其它因素所改变。一个本领域的技术人员可以根据具体情况的出现很容易 的进行调整。

实验实施例

实施例1 pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因 组质粒的构建

以水疱性口炎病毒为基础，首先人工合成带有限制性酶且位点XhoI和NheI的连接序列 (Linker Insert)：GCTAGG  TATGAAAAAAA CT  AACAG AT  ATC ACG  CTCGAG AATTAA  GCTAG，利用本领域专业人员熟知的分子生物学手段与基因重组技术，将其 插入到VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或者VSVM51Δ基因组中G蛋白与L蛋白之间G 蛋白的非编码区，并以此结构为基础分别构建出用于创建重组水疱性口炎病毒的 pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因组质粒。 pVSV-XN2基因组质粒(其中VSV可以是VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或者VSVM51 Δ )包含了完整的VSV基因组，并分别在紧接着外源基因转录的起始位点和终止位点之 外具有特异性的XhoI和NheI酶切位点，以便于外源基因的插入。

实施例2自杀基因TK、白细胞介素IL-4、内皮抑素Endostatin、热休克蛋白HSP70 及绿色荧光蛋白GFP基因的克隆

利用PCR方法从pKO-TK质粒(Clontech Laboratories)中扩增得到自杀基因TK基因，引 物序列为5-CTTGTAGA CTCGAGTATGGCTTCGTACCCCGGCCATCAG和5- GTATTGTCT GCTAGCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATC(斜体下划线表示限制性 酶切位点，黑体表示外源基因，下同).；

利用PCR方法从pGexp质粒(Clontech Laboratories)中扩增得到白细白介素IL-4基因， 引物序列为5-GGCA CTCGAGATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTTG和5-GCCG GCTAGCCTACGAGTAATCCATTTGCATGATGC.； 利用PCR方法从pE18质粒中扩增得到内皮抑素Endostatin基因，引物序列为 5’-TAGCAT CTCGAGGTACGATGTAG和5’-ATCGTC GCTAGCAACCTAGCAG；

利用PCR方法从人肿瘤细胞系SKOV3细胞的cDNA中扩增HSP70基因，引物序列为： TACTAATCT CTCGAGACCTCCTCAATGGTGGG和GGTATGGAA GCTAGCGAT CCCTCGAGATC；

利用PCR方法从pLEGFP-C1质粒(Clontech Laboratories)中扩增得到绿色荧光蛋白GFP 基因，引物序列为5-GGCA CTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG和5-GCTTG AGC GCTAGCTCTGAGTCCCTACTTGTACAGC。

使用PE公司的PCR仪，反应条件是：每个反应的引物终浓度是30pM，dNTP为100mM， 模板DNA为100ng，Taq DNA聚合酶为2.5个单位。其他反应条件依照GeneAmp DNA 扩增试剂盒中的使用说明进行，每个反应总体积为100微升。每份反应混合物上覆盖以 75微升矿物油。扩增共进行30个循环，每一循环包括变性步骤92℃1分钟，退火步骤 50℃1分钟，延长步骤72℃2分钟。反应结束后，使用Qiagen公司的PCR产物纯化 试剂盒纯化所得产物。

实施例3重组人ATFG水疱性口炎病毒基因组质粒pVSV-ATFG的构建

将从实施例2回收得到的TK PCR产物、IL-4 PCR产物、Endostatin PCR产物、HSP70 PCR 产物及GFP PCR产物分别用XhoI+NheI进行双酶切，所切下基因片段分别插入由实施 例1得到的已用XhoI+NheI双酶切的pVSV wt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2 或pVSVM51Δ-XN2基因组质粒中，获得携带外源抗癌基因的基因工程重组水疱性口炎病 毒基因组质粒pVSVwt-ATFG、pVSVM51R-ATFG、pVSVM221F+226R-ATFG或pVSVM51Δ-ATFG (其中ATFG＝TK、IL-4、Endostatin、HSP70或GFP)。

实施例4重组人ATFG水疱性口炎病毒rVSV-ATFG的转染和重获

将幼仓鼠肾细胞BHK-21在10cm培养皿中用添加5％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) 的DME(Dubecco’s modified Eagle)培养基培养，到BHK-21细胞有约70％融合时，以 MOI 10剂量vTF7-3株(表达T7 RNA聚合酶)重组痘苗病毒感染细胞。30分钟后，由 实施例3获得的重组病毒基因组质粒pVSVwt-ATFG、pVSVM51R-ATFG、 pVSVM221F+226R-ATFG或pVSVM51Δ-ATFG(其中ATFG＝TK、IL-4、Endostatin、HSP70 或GFP)用磷酸钙转染试剂盒按厂家说明转染BHK-21细胞，重组病毒基因组质粒使用 总量10μg。于37℃3％CO2浓度的空气中孵育48小时后，将细胞从培养皿上刮下，并 冻溶三个循环(-70℃，37℃)以释放附着于细胞上的病毒，然后离心沉淀5分钟(1250 ×g)，分离细胞碎片，所得约5ml细胞裂解液。

将BHK-21细胞在10cm培养皿中用10ml添加5％FBS的DME培养基培养至细胞数量 达到约106个，将所得的细胞裂解也加入培养皿。48小时后，离心10分钟(1250×g) 收养培养液，并用孔径0.2μm的滤器过滤以除去绝大部分痘苗病毒。

将1ml滤液直接加在平铺于盖玻片上并置于35mm培养皿中的BHK-21细胞上，其余滤 液-70℃冻存。4小时后，细胞用3％多聚甲醛固化，并用经若丹明偶联抗鼠单克隆抗体 包被的抗印地安那株VSV G蛋白(GI)单克隆抗体GI-Mab染色。经直接免疫荧光分析检 测，100％的细胞均显示VSV G蛋白特有的典型的亮色，证明重组病毒rVSV-ATFG重 获成功。

实施例5用BHK-21细胞培养制备重组病毒rVSV-ATFG

将BHK-21细胞在10cm培养皿中用10ml添加5％FBS的DME培养基培养至长成单层， 弃去上清营养液，用无血清的维持液洗2次，用实施例4冻存的重组病毒rVSV-ATFG 原液接种BHK-21细胞，37℃吸附1小时，换维持液，于37℃培养。当出现75％细胞 病变(CPE)时，收获感染病毒的细胞，冻溶三次(-70℃，37℃)，离心沉淀(1250× g)分离细胞碎片，所得细胞裂解液冻存于-70℃。然后按照常规方法，测定TCID50(病 毒半数组织培养感染剂量)。

实施例6 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)固定化培养生产重组病毒rVSV-ATFG 培养条件：

工作体积300ml的转瓶；

固定化培养用微载体：固体微载体1.0g/L、多孔微载体CultiSpher-G 0.5g/L；

生产用细胞：Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)；

培养基：添加5％FBS、100μg/ml硫酸链霉素(streptomycin sulfate)及100U/ml 青霉素G(penicillin G)的DME；

转速：30rpm。

细胞培养基病毒生产过程：

按上述细胞培养条件在转瓶中培养Vero细胞至不再生长后，沉积微载体，移去150ml 培养基以降低反应器的容积。以0.01 MOI(Multiplicity of infection，感染复数)剂 量接种实施例5所制备的重组病毒rVSV-ATFG毒种于附着于微载体的Vero细胞。 在重组病毒rVSV-ATFG毒种添加完毕、细胞已经培养满166小时，通CO2将pH将 抵至6.8。吸附一小时，在此期间维持pH 6.5～6.8，并使用断续旋转(1分钟/15分钟)。 吸附过程结束，加入150ml培养基，重新调整pH到7.2并恢复连续旋转。在接种病 毒后5小时内，留在上清液中99％以上的病毒颗粒被快速吸附到细胞上。

接种后48小时后收获感染的细胞，三次冻融(-70℃，37℃)，低速离心(1250×g) 离心去除细胞碎片，所得细胞裂解液经两次氯化铯密度梯度离心纯化，超滤法浓缩 后于-70℃冻存。

对于多孔微载体CultiSpher-G，由于其具有比较大的有效表面积，因而可以使用比 较低的浓度。其在接种后48小时获得了最高的VSV滴度3.25×108PFU/ml，换算 到每个细胞上对应的病毒产量是315PFU/cell，而固体微载体则单个细胞的价值则 只有85PFU/cell。但使用多孔微载体CultiSpher-G并未引起VSV生产过程的动力学 变化。

实施例7鸡胚成纤维细胞固定化培养生产重组病毒rVSV-ATFG

采用鸡胚成纤维细胞，其他所有条件同实施例6，则以多孔微载体CultiSpher-G为固定 化培养用微载体的病毒的产量为340PFU/cell。

实施列8重组人内皮抑素水疱性口炎病毒rVSVM51R-Endo抑制原位及远端肿瘤生长试 验

在同系的BALB/c小鼠上评价重组人内皮抑素水疱性口炎病毒rVSVM51R-Endo对CT26 肿瘤的治疗效果。将小鼠用CT26肿瘤细胞(1×105)在小鼠肋部对称部位分别进行皮 下注射，以此小鼠作为患有转移性肿瘤的动物模型。

1周后，当皮下注射的肿瘤迅速生长至肿瘤直径为0.5cm～0.7cm时，随机分组：将动物 分成3组，每组各10只动物，第一和第二组作为实验组，第三组作为对照组。

将第一组每只动物非对称(右面)的瘤内接种rVSVM51R-Endo(1×106PFU)，并于第一 次接种7天后进行第二次接种。

将第二组每只动物非对称(右面)的瘤内接种VSVM51R(1×106pFU)，并于第一次接种 7天后进行第二次接种，以次作为评价内皮抑素影响因素的参照。

将第三组每只动物非对称(右面)的瘤内接种紫外灭活的VSVM51R，并于第一次接种7 天后进行第二次接种，以此作为评价病毒影响因素的对照。

肿瘤体积用卡尺测量，体积的计算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其肿瘤直径超过 18毫米，将被处死，并记录下日期来研究其存活率。用非配对法t检验进行方差统计分 析。

实验结果显示，用重组人内皮抑素水疱性口炎病毒rVSVM51R-Endo接种能引起非常显著 的抗肿瘤效果，无论是被注射一侧的肿瘤，还是同只动物身体上未经注射的对称端的肿 瘤的生长都明显受到抑制(如图10所示)。经注射重组人内皮抑素水疱性口炎病毒 rVSVM51R-Endo的小鼠身上的肿瘤无论在注射侧还是在非注射侧都已经消退得无法检测 到。而注射VSVM51R同样能引起对注射侧和非注射侧肿瘤生长的抑制，其抑制作用的影 响虽也明显，但与注射rVSVM51R-Endo有显著差异。仅注射紫外灭活的VSVM51R的对照 组显示出对注射侧和非注射侧的肿瘤都没有影响。这些结果表明重组人内皮抑素水疱性 口炎病毒rVSVM51R-Endo通过局部瘤内注射可以引起系统性感染，从而高度特异性地在 体内所有肿瘤细胞内高度增殖并表达内皮抑素，以双重抗肿瘤作用对给药部位和远端肿 瘤产生强烈的生长抑制和杀灭作用。

                                 附表1

   1  acgaagacaa acaaaccatt attatcatta aaaggctcag gagaaacttt aacagtaatc

  61  aaaatgtctg ttacagtcaa gagaatcatt gacaacacag tcatagttcc aaaacttcct

 121  gcaaatgagg atccagtgga atacccggca gattacttca gaaaatcaaa ggagattcct

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3601  ccactgtcca taactctaca acctggcatt ctgactataa ggtcaaaggg ctatgtgatt

3661  ctaacctcat ttccatggac atcaccttct tctcagagga cggagagcta tcatccctgg

3721  gaaaggaggg cacagggttc agaagtaact actttgctta tgaaactgga ggcaaggcct

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3841  tggctgataa ggatctcttt gctgcagcca gattccctga atgcccagaa gggtcaagta

3901  tctctgctcc atctcagacc tcagtggatg taagtctaat tcaggacgtt gagaggatct

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4261  gatataagtt tcctttatac atgattggac atggtatgtt ggactccgat cttcatctta

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5281  gaggactttc aaaggcaaag tcagaagaag ttctcatgga acgaacatat gcaggattag

5341  ggttcccagc ttgggtccta cttttatttc agaaggatgg gcttacttca agaaacttga

5401  tattctaatg gaccgaaact ttctgttaat ggtcaaagat gtgattatag ggaggatgca

5461  aacggtgcta tccatggtat gtagaataga caacctgttc tcagagcaag acatcttctc

5521  ccttctaaat atctacagaa ttggagataa aattgtggag aggcagggaa atttttctta

5581  tgacttgatt aaaatggtgg aaccgatatg caacttgaag ctgatgaaat tagcaagaga

5641  atcaaggcct ttagtcccac aattccctca ttttgaaaat catatcaaga cttctgttga

5701  tgaaggggca aaaattgacc gaggtataag attcctccat gatcagataa tgagtgtgaa

5761  aacagtggat ctcacactgg tgatttatgg atcgttcaga cattggggtc atccttttat

5821  agattattac actggactag aaaaattaca ttcccaagta accatgaaga aagatattga

5881  tgtgtcatat gcaaaagcac ttgcaagtga tttagctcgg attgttctat ttcaacagtt

5941  caatgatcat aaaaagtggt tcgtgaatgg agacttgctc cctcatgatc atccctttaa

6001  aagtcatgtt aaagaaaata catggcccac agctgctcaa gttcaagatt ttggagataa

6061  atggcatgaa cttccgctga ttaaatgttt tgaaataccc gacttactag acccatcgat

6121  aatatactct gacaaaagtc attcaatgaa taggtcagag gtgttgaaac atgtccgaat

6181  gaatccgaac actcctatcc ctagtaaaaa ggtgttgcag actatgttgg acacaaaggc

6241  taccaattgg aaagaatttc ttaaagagat tgatgagaag ggcttagatg atgatgatct

6301  aattattggt cttaaaggaa aggagaggga actgaagttg gcaggtagat ttttctccct

6361  aatgtcttgg aaattgcgag aatactttgt aattaccgaa tatttgataa agactcattt

6421  cgtccctatg tttaaaggcc tgacaatggc ggacgatcta actgcagtca ttaaaaagat

6481  gttagattcc tcatccggcc aaggattgaa gtcatatgag gcaatttgca tagccaatca

6541  cattgattac gaaaaatgga ataaccacca aaggaagtta tcaaacggcc cagtgttccg

6601  agttatgggc cagttcttag gttatccatc cttaatcgag agaactcatg aattttttga

6661  gaaaagtctt atatactaca atggaagacc agacttgatg cgtgttcaca acaacacact

6721  gatcaattca acctcccaac gagtttgttg gcaaggacaa gagggtggac tggaaggtct

6781  acggcaaaaa ggatggacta tcctcaatct actggttatt caaagagagg ctaaaatcag

6841  aaacactgct gtcaaagtct tggcacaagg tgataatcaa gttatttgca cacagtataa

6901  aacgaagaaa tcgagaaacg ttgtagaatt acagggtgct ctcaatcaaa tggtttctaa

6961  taatgagaaa attatgactg caatcaaaat agggacaggg aagttaggac ttttgataaa

7021  tgacgatgag actatgcaat ctgcagatta cttgaattat ggaaaaatac cgattttccg

7081  tggagtgatt agagggttag agaccaagag atggtcacga gtgacttgtg tcaccaatga

7141  ccaaataccc acttgtgcta atataatgag ctcagtttcc acaaatgctc tcaccgtagc

7201  tcattttgct gagaacccaa tcaatgccat gatacagtac aattattttg ggacatttgc

7261  tagactcttg ttgatgatgc atgatcctgc tcttcgtcaa tcattgtatg aagttcaaga

7321  taagataccg ggcttgcaca gttctacttt caaatacgcc atgttgtatt tggacccttc

7381  cattggagga gtgtcgggca tgtctttgtc caggtttttg attagagcct tcccagatcc

7441  cgtaacagaa agtctctcat tctggagatt catccatgta catgctcgaa gtgagcatct

7501  gaaggagatg agtgcagtat ttggaaaccc cgagatagcc aagtttcgaa taactcacat

7561  agacaagcta gtagaagatc caacctctct gaacatcgct atgggaatga gtccagcgaa

7621  cttgttaaag actgaggtta aaaaatgctt aatcgaatca agacaaacca tcaggaacca

7681  ggtgattaag gatgcaacca tatatttgta tcatgaagag gatcggctca gaagtttctt

7741  atggtcaata aatcctctgt tccctagatt tttaagtgaa ttcaaatcag gcactttttt

7801  gggagtcgca gacgggctca tcagtctatt tcaaaattct cgtactattc ggaactcctt

7861  taagaaaaag tatcataggg aattggatga tttgattgtg aggagtgagg tatcctcttt

7921  gacacattta gggaaacttc atttgagaag gggatcatgt aaaatgtgga catgttcagc

7981  tactcatgct gacacattaa gatacaaatc ctggggccgt acagttattg ggacaactgt

8041  accccatcca ttagaaatgt tgggtccaca acatcgaaaa gagactcctt gtgcaccatg

8101  taacacatca gggttcaatt atgtttctgt gcattgtcca gacgggatcc atgacgtctt

8161  tagttcacgg ggaccattgc ctgcttatct agggtctaaa acatctgaat ctacatctat

8221  tttgcagcct tgggaaaggg aaagcaaagt cccactgatt aaaagagcta cacgtcttag

8281  agatgctatc tcttggtttg ttgaacccga ctctaaacta gcaatgacta tactttctaa

8341  catccactct ttaacaggcg aagaatggac caaaaggcag catgggttca aaagaacagg

8401  gtctgccctt cataggtttt cgacatctcg gatgagccat ggtgggttcg catctcagag

8461  cactgcagca ttgaccaggt tgatggcaac tacagacacc atgagggatc tgggagatca

8521  gaatttcgac tttttattcc aagcaacgtt gctctatgct caaattacca ccactgttgc

8581  aagagacgga tggatcacca gttgtacaga tcattatcat attgcctgta agtcctgttt

8641  gagacccata gaagagatca ccctggactc aagtatggac tacacgcccc cagatgtatc

8701  ccatgtgctg aagacatgga ggaatgggga aggttcgtgg ggacaagaga taaaacagat

8761  ctatccttta gaagggaatt ggaagaattt agcacctgct gagcaatcct atcaagtcgg

8821  cagatgtata ggttttctat atggagactt ggcgtataga aaatctactc atgccgagga

8881  cagttctcta tttcctctat ctatacaagg tcgtattaga ggtcgaggtt tcttaaaagg

8941  gttgctagac ggattaatga gagcaagttg ctgccaagta atacaccgga gaagtctggc

9001  tcatttgaag aggccggcca acgcagtgta cggaggtttg atttacttga ttgataaatt

9061  gagtgtatca cctccattcc tttctcttac tagatcagga cctattagag acgaattaga

9121  aacgattccc cacaagatcc caacctccta tccgacaagc aaccgtgata tgggggtgat

9181  tgtcagaaat tacttcaaat accaatgccg tctaattgaa aagggaaaat acagatcaca

9241  ttattcacaa ttatggttat tctcagatgt cttatccata gacttcattg gaccattctc

9301  tatttccacc accctcttgc aaatcctata caagccattt ttatctggga aagataagaa

9361  tgagttgaga gagctggcaa atctttcttc attgctaaga tcaggagagg ggtgggaaga

9421  catacatgtg aaattcttca ccaaggacat attattgtgt ccagaggaaa tcagacatgc

9481  ttgcaagttc gggattgcta aggataataa taaagacatg agctatcccc cttggggaag

9541  ggaatccaga gggacaatta caacaatccc tgtttattat acgaccaccc cttacccaaa

9601  gatgctagag atgcctccaa gaatccaaaa tcccctgctg tccggaatca ggttgggcca

9661  attaccaact ggcgctcatt ataaaattcg gagtatatta catggaatgg gaatccatta

9721  cagggacttc ttgagttgtg gagacggctc cggagggatg actgctgcat tactacgaga

 9781  aaatgtgcat agcagaggaa tattcaatag tctgttagaa ttatcagggt cagtcatgcg

 9841  aggcgcctct cctgagcccc ccagtgccct agaaacttta ggaggagata aatcgagatg

 9901  tgtaaatggt gaaacatgtt gggaatatcc atctgactta tgtgacccaa ggacttggga

 9961  ctatttcctc cgactcaaag caggcttggg gcttcaaatt gatttaattg taatggatat

10021  ggaagttcgg gattcttcta ctagcctgaa aattgagacg aatgttagaa attatgtgca

10081  ccggattttg gatgagcaag gagttttaat ctacaagact tatggaacat atatttgtga

10141  gagcgaaaag aatgcagtaa caatccttgg tcccatgttc aagacggtcg acttagttca

10201  aacagaattt agtagttctc aaacgtctga agtatatatg gtatgtaaag gtttgaagaa

10261  attaatcgat gaacccaatc ccgattggtc ttccatcaat gaatcctgga aaaacctgta

10321  cgcattccag tcatcagaac aggaatttgc cagagcaaag aaggttagta catactttac

10381  cttgacaggt attccctccc aattcattcc tgatcctttt gtaaacattg agactatgct

10441  acaaatattc ggagtaccca cgggtgtgtc tcatgcggct gccttaaaat catctgatag

10501  acctgcagat ttattgacca ttagcctttt ttatatggcg attatatcgt attataacat

10561  caatcatatc agagtaggac cgatacctcc gaacccccca tcagatggaa ttgcacaaaa

10621  tgtggggatc gctataactg gtataagctt ttggctgagt ttgatggaga aagacattcc

10681  actatatcaa cagtgtttag cagttatcca gcaatcattc ccgattaggt gggaggctgt

10741  ttcagtaaaa ggaggataca agcagaagtg gagtactaga ggtgatgggc tcccaaaaga

10801  tacccgaact tcagactcct tggccccaat cgggaactgg atcagatctc tggaattggt

10861  ccgaaaccaa gttcgtctaa atccattcaa tgagatcttg ttcaatcagc tatgtcgtac

10921  agtggataat catttgaaat ggtcaaattt gcgaagaaac acaggaatga ttgaatggat

10981  caatagacga atttcaaaag aagaccggtc tatactgatg ttgaagagtg acctacacga

11041  ggaaaactct tggagagatt aaaaaatcat gaggagactc caaactttaa gtatgaaaaa

11101  aactttgatc cttaagaccc tcttgtggtt tttatttttt atctggtttt gtggtcttcg

11161  t

                            附表2

VSVwt    1      MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAP

VSVM51R          MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAP

VSVM221F-226R      MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAP

VSVM51Δ                  MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAP

          41     IDKSYFGVDE MDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT

                 IDKSYFGVDE  RDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT

                 IDKSYFGVDE MDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT

                 IDKSYFGVDE  ΔDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT

          81     YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATP

                 YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATP

                 YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATP

                 YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATP

          121    AVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRR

                 AVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRR

                 AVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRR

                 AVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRR

          161    PFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD

                 PFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD

                 PFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD

                 PFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD

          201    FREKALMFGL IVEKKASGAW VLDSISHFK

                 FREKALMFGL IVEKKASGAW VLDSISHFK

                 FREKALMFGL IVEKKASGAW  FLDSI RHFK

                 FREKALMFGL IVEKKASGAW VLDSISHFK

                              附表3

  1   ATGCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTG

  1   M  H  S  H  R  D  F  Q  P  V  L  H  L  V  A  L  N  S  P  L

 61   TCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCC

 21   S  G  G  M  R  G  I  R  G  A  D  F  Q  C  F  Q  Q  A  R  A

121   GTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGC

 41   V  G  L  A  G  T  F  R  A  F  L  S  S  R  L  Q  D  L  Y  S

181   ATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTG

 61   I  V  R  R  A  D  R  A  A  V  P  I  V  N  L  K  D  E  L  L

241   TTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGC

 81   F  P  S  W  E  A  L  F  S  G  S  E  G  P  L  K  P  G  A  R

301   ATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGACCCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTG

101   I  F  S  F  N  G  K  D  V  L  T  H  P  T  W  P  Q  K  S  V

361   TGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGG

121   W  H  G  S  D  P  N  G  R  R  L  T  E  S  Y  C  E  T  W  R

421   ACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTACTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGG

141   T  E  A  P  S  A  T  G  Q  A  Y  S  L  L  G  G  R  L  L  G

481   CAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATG

161   Q  S  A  A  S  C  H  H  A  Y  I  V  L  C  I  E  N  S  F  M

541   ACTGCCTCCAAGTAG

181   T  A  S  K