蟾毒灵(bufalin)是动物蟾蜍体内的一种成分,化学结构式如下:体外实验证实其具有良好的抗
肿瘤、逆转化疗耐药、提高免疫
力和抑制乙肝病毒复制等作用,实验同时证实其在一定浓度范围内对肿瘤的杀伤和抑制作用与其作用时间成正线性相关。(苏永华,尹西才,谢觉民,等。“华蟾素配伍丝裂霉素体外抑瘤作用”.安徽中医学院学报.2003,22(3).45-48/苏永华,尹西才,谢觉民,等.“三种蟾毒
单体对SMMC-7721和BEL-7402人肝癌细胞生长的抑制作用”。第二军医大学学报。2003,24(4).393-395/韩克起,顾伟,苏永华,等。“Anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model ofhuman hepatocellular carcinoma in nude mice”.Journal of Medical Colleges of PLA,2004,19(6)338-341,345/Romero MR,Efferth T,Serrano MA,et al.Effect of artemisinin/artesunate asinhibitors of hepatitis B virus production in an″in vitro″replicative system..Antiviral Res.2005Aug22)但蟾毒灵毒性较强而且体内
半衰期短,其口服容易分解失效,而且用药后药物广泛分布于胃、小肠、肝脏、
肺脏、肾、胰腺等多器官中并被迅速清除(Toma S,Hirai Y,SugimotoC,et al.“Metabolic fate of bufalin in rats”.Yakugaku Zasshi.1991Nov;111(11):676-86.)大部分药物在非靶器官的积聚并且作用强而短,这种特性造成其临床使用毒性大而不能达到很好的
治疗效果,因此至今未形成药物制剂。
白蛋白化学性质稳定、无毒,白蛋白纳米粒作为药物载体具有安全无毒、无免疫原性、可
生物降解、
生物相容性好,且具有靶向性、缓释性、
控释性和药物保护作用等特点。实验证实,纳米粒粒径在50~100nm之间时,纳米药物载体能进入肝实质细胞;纳米粒径在100~200nm之间时,纳米药物载体能被网状内皮的巨噬细胞从血液中摄取,最终到达肝脏枯否氏细胞的溶酶体中(徐辉碧.纳米医药,北京,清华大学出版社,2004,38),因此,控制白蛋白纳米颗粒粒径的大小和表面特性,可使其具有良好的缓释性、肝靶向性等特点。但现有制备白蛋白纳米粒的某些方法往往存在难以控制粒径大小、
表面活性剂残留较多或不稳定等缺点,如采用热变性乳剂化法,需使用
有机溶剂去除油性残余物和表面活性剂,不仅易引起
有机溶剂的残留,为纳米粒的纯化带来困难,而且粒径较难控制,另外对热不稳定的药物也不利。若采用pH-凝聚法,白蛋白纳米粒粒径大小同样较难控制,且需在无盐条件下进行pH值调整,但在高浓度
蛋白质存在条件下,以玻璃
电极测定pH值的可靠性有限。鉴于以上原因,至今未见有蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂的报道发明内容本发明提供一种蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂及其制备方法。
本发明的蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂的制备方法是一种去溶剂化及物理包裹
吸附法,具有快速简便、成本低、可操作性强、粒径分布较窄、有机溶剂残留少等特点。
本发明制备方法如下:组份与配比:蟾毒灵 5~200mg白蛋白 5~600mg蒸馏
水或10mM NaCl 0.5~10ml95%
乙醇 0.5~30ml脱水剂 3~30ml交联剂 0~800μl稳定剂乳酸 0~800μl表面活性剂泊洛沙姆 0~800μl其中脱水剂选自乙醇、甲醇、丙
酮中的一种;交联剂选自戊二
醛、甲基聚乙烯—右旋糖苷中的一种。
具体步骤为:
1.制备蟾毒灵白蛋白溶液按配比将白蛋白溶于蒸馏水或10mM NaCl中,配制成白蛋白溶液;将蟾毒灵溶于乙醇,配制成蟾毒灵乙醇溶液;将蟾毒灵乙醇溶液加入到白蛋白溶液中,加或不加表面活性剂,得蟾毒灵白蛋白溶液。
2.制备蟾毒灵白蛋白纳米粒胶体混悬液将上述蟾毒灵白蛋白溶液pH值调整为5-7,在搅拌情况下以0.1~5.0ml/min速率将脱水剂持续加入上述制得的蟾毒灵白蛋白溶液中,待形成乳状胶体混悬液后停止。
3.交联稳定与纯化,制备蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂在制得的蟾毒灵白蛋白纳米粒胶体混悬液中按配比加入一定量交联剂或/和稳定剂乳酸,搅拌24小时以上促使纳米粒交联
固化,再微热减压
蒸发,去除乙醇或丙酮等有机溶剂,
冷冻干燥,得蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂。
电镜检测显示,本发明方法制得的蟾毒灵纳米粒形态圆整,粒度分布较窄,粒径范围为50~250nm,平均粒径102nm。体外释放实验证实,本发明制剂具有缓释作用。
本发明蟾毒灵白蛋白纳米制剂具有缓释性和肝靶向性,有利于蟾毒灵治疗作用的发挥,且降低了毒
副作用,可用于制备治疗肝癌或乙型
肝炎的药物。
附图说明
图1为本发明制备的蟾毒灵纳米粒制剂电镜照片图2为本发明制备的蟾毒灵纳米粒制剂体外释药曲线具体实施方式现结合
实施例,对本发明作详细描述实施例1.制备蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂将50mg白蛋白溶于2ml水中,将5mg蟾毒灵溶于1ml乙醇液中,在白蛋白水溶液中加入蟾毒灵醇溶液,控制pH值在5-7之间,搅拌情况下以0.5ml/min速度持续加入3ml乙醇,至形成乳状胶体混悬液,搅拌情况下加入27μl交联剂戊二醛,连续搅拌24小时促使纳米粒交联固化,微热减压蒸发,去除乙醇等有机溶剂,冷冻干燥,即得本发明蟾毒灵纳米粒制剂。
实施例2制备蟾毒灵白蛋白纳米粒制剂将100mg白蛋白溶解于4ml水中,将20mg蟾毒灵溶于2ml乙醇液中,在白蛋白水溶液中加入蟾毒灵醇溶液,控制pH值5-7之间,搅拌情况下持续加入适量脱水剂丙酮,至形成乳状胶体混悬液,搅拌情况下加适量交联剂甲基聚乙烯—右旋糖苷至形成乳白色不透明液,连续搅拌26小时促使纳米粒交联固化,微热减压蒸发,去除乙醇、丙酮等有机溶剂,冷冻干燥,得本发明蟾毒灵纳米粒制剂。
外观形态观察:采用
磷酸钨负染法,以透射
电子显微镜观察本发明方法制得的蟾毒灵纳米粒的外观形态,可见纳米粒形态圆整,粒度分布较窄,粒径范围为50~250nm,见图1。激光散射粒度仪测定其平均粒径为102nm。
体外释放实验:取经
超滤离心分离纯化的胶体混悬液适量,置入
透析袋中,用透析夹封口,放入装有100ml
磷酸盐缓冲液(pH7.4)的广口瓶中,密闭,然后放于恒温振荡箱中振荡(37±1℃,50±1振次·分-1),分别于不同时间点取出1ml释放介质,并补充同温等量的释放介质,利用高效液相仪,测定所取样品中蟾毒灵浓度,并推算得累积释药百分数,作体外释药曲线见图2。结果显示:该纳米粒药物释放存在两相。前3小时为突释相,累积释放药物59.16%;此后进入缓释相,在6~8小时内,可基本释放完全。可见纳米粒中的药物具有缓释的特性。另外,其0.5小时累积释放量为7.34%,小于40%,符合国家药典规定。该纳米粒体外释放方程拟合为:lnln[1/(1-Q)]=-1.4092+0.9581lnt,(r=0.9535),符合weibull方程。
本发明通过将蟾毒灵制备成一定粒径范围内的蟾毒灵白蛋白纳米制剂,使其具有一定的缓释性和肝靶向性,可减轻蟾毒灵的毒副作用,增加蟾毒灵体内使用的安全性,并有利于蟾毒灵治疗作用的发挥,可用于制备治疗肝癌或乙型肝炎的药物。