发明领域

本发明涉及用于治疗代谢性状况或疾病的方法和组合物，所述状 况或疾病特别是可通过减少热量利用率而减缓病情的那些，例如糖尿 病、肥胖、进食障碍疾患、抗-胰岛素综合征(综合征X)、葡萄糖不耐 症、脂代谢异常血症(dyslipidemia)、以及心血管疾病。

                      背景技术

众多相关激素组成了胰多肽(PP)家族。胰多肽以胰岛素提取物的 污染物被发现，往往以其来源的器官命名，而非根据其发挥的功用 (Kimmel，Pollock等人，Endocrinology 83：1323-30，1968)。胰 多肽是一种36-氨基酸的肽[SEQ ID NO.：1]，内含独特的结构基元。 随后在肠提取物中发现了一种相关的肽，因其N-末端及C-末端酪氨酸 而命名为肽YY(PYY)(Tatemoto.Proc Natl Acad Sci USA 79： 2514-8，1982)[SEQ ID NO.：2]。后来，在脑提取物中发现了第三种 相关的肽，命名为神经肽Y(NPY)(Tatemoto.Proc Natl Acad Sci USA 79：5485-9，1982；Tatemoto，Carlquist等人Nature 296：659-60， 1982)[SEQ ID NO.：4]。

现已报道这三种相关的肽发挥不同的生物功效。PP的作用包括抑 制胰腺分泌及松弛胆囊。中枢施用(Centrally administered)PP 使进食量轻微增加，这可能是通过定位于丘脑下部及脑干的受体介导 的(综述见(Gehlert.Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22，1998))。

PYY[SEQ ID NO.：2]的释放发生在进餐后。PYY的另一种分子 形式是PYY[3-36][SEQ ID NO.：3](Eberlein，Eysselein等人 Peptides 10：797-803，1989)(Grandt，Schimiczek等人Regul Pept 51：151-9，1994)。在人和犬肠提取物中该片段占总PYY-样免疫 反应性的约40％，占总血浆PYY免疫反应性在禁食状态的约36％至在 进餐后的略高于50％。显然是一种二肽肽酶-IV(DPP4)切割PYY产物。 据报道PYY[3-36]是Y2和Y5受体的选择性配体，其在优先N-末端截 短的(即C-末端片段的)NPY类似物方面显示独一无二的药物学特性。 据报道外周施用PYY会减少胃酸分泌、胃动力、胰腺外分泌(Yoshinaga， Mochizuki等人Am J Physiol 263：G695-701，1992)(Guan，Maouyo 等人Endocrinology 128：911-6，1991)(Pappas，Debas等人 Gastroenterology 91：1386-9，1986)、胆囊收缩及肠动力(Savage， Adrian等人Gut 28：166-70，1987)。中枢注射PYY对胃排空、胃动 力及胃酸分泌的影响，与在后脑/脑干内或周围直接注射后观察到的情 况相同(Chen and Rogers.Am J Physiol 269：R787-R792，1995) (Chen，Rogers等人Regul Pept 61：95-98，1996)(Yang和Tache. Am J Physiol 268：G943-8，1995)(Chen，Stephens等人 Neurogastroenterol Motil 9：109-116，1997)，而与外周注射后 观察到的反应可能不同。例如中枢施用PYY的一些反应与本文中所述 外周注射PYY[3-36]的反应相反，是刺激了胃酸的分泌，而非抑制。 只有在与TRH刺激联用时才能抑制胃动力，单独施用则不抑制，而且 实际上是在较高剂量时通过与PP受体间的相互作用刺激了胃动力。现 已表明在中枢给药后PYY能刺激食物和水的摄入(Morley，Levine等 人Brain Res 341：200-203，1985)(Corp，Melville等人Am J Physiol 259：R317-23，1990)。

类似地，最早报道的NPY[SEQ ID NO.：4]中枢反应之一是增加食 物摄入，具体为丘脑下部(Stanley，Daniel等人Peptides 6： 1205-11，1985)。据报道PYY和PP模拟这些反应，而PYY在效力上强 于或相当于NPY(Morley，J.E.，Levine，A.S.，Grace，M.，和 Kneip，J.Brain Res 341：200-203，1985)(Kanatani，Mashiko等 人Endocrinology 141：1011-6，2000)(Nakajima，Inui等人J Pharmacol Exp Ther 268：1010-4，1994)。几个研究小组发现NPY- 介导进食程度上高于此前试验过的任一药物，而且持续时间还很长。 NPY-介导的刺激进食已在多个物种中再现。在三种基本大量营养元素 (脂肪、蛋白及碳水化合物)中，优先刺激碳水化合物的摄入。当重 复施用NPY 10天以上时，未发现任何对NPY开胃作用的耐受性，并观 察到增重率显著增加。在饥饿后，下丘脑PVN中的NPY的浓度随时间 而增加，并且在摄取食物后快速恢复至对照水平。

药物学研究及克隆试验已经发现了PP肽家族7种跨膜受体，这些 受体命名为Y1到Y6(以及一种推定的PYY-优选受体或Y7)。这些受 体的一般信号应答近似于其他Gi/Go-偶联受体的信号应答，即抑制腺 苷酸环化酶。甚至由于这些受体间的序列同源性相当低，明显在Y1，Y4 和Y6受体间具有一氨基酸序列相似的簇，而Y2和Y5则定义其他家 族。通过各种肽的效力的强弱排序已经鉴定出了其他结合位点。NPY- 优先受体已被克隆，命名为Y3，PYY-优先受体也已被证明存在(推定 的Y7)(见述于(Michel，Beck-Sickinger等人Pharmacol Rev 50： 143-50，1998)(Gehlert，D.R.Proc Soc Exp Biol Med 218： 7-22，1998))。

现已认为Y5和Y1受体是食物摄入应答的主要介导物(Marsh， Hollopeter等人Nat Med 4：718-21，1998)(Kanatani，A.， Mashiko，S.，Murai，N.，Sugimoto，N.，Ito，J.，Fukuroda，T.， Fukami，T.，Morin，N.，MacNeil，D.J.，Van der Ploeg，L.H.， Saga，Y.，Nishimura，S.，和Ihara，M.Endocrinology 141：1011-6， 2000)。普遍的观点为内源性NPY，通过这些受体，增加摄食行为。提 出的对肥胖的治疗一致指向为NPY受体的拮抗，而对于厌食的治疗指 向为对该配体家族的激动(参见，例如，美国专利5,939,462；6,013， 622；和4,891,357)。通常，据报道PYY和NPY是等效的，并且在所 有的Y1，Y5(和Y2)受体试验中发挥着同等的效力(Gehlert，D.R. Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22，1998)。

推定的Y3受体的主要特征是它们能识别NPY，而PYY在效力上低 至少1个数量级。所述Y3受体代表唯一优选NPY的结合位点/受体。

另外还有一个结合位点/受体表现出对PYYs的优选特性，其命名 为PYY-优先受体，本申请中称其为Y7受体。结合该受体或该类受体 的不同排序已被报道，表明在该家族中不止1个受体。多数情况下用 下述特征来描述受体：PYY较NPY的效力强3-5倍。国际药物学联合 会给NPY，PYY和PP受体的命名提出建议，术语PYY-优先受体不应使 用，除非发现PYY和NPY间的效力差异至少20倍(Michel，M.C.， Beck Sickinger，A.，Cox，H.，Doods，H.N.，Herzog，H.， Larhammar，D.，Quirion，R.，Schwartz，T.，和Westfall，T. Pharmacol Rev 50：143-50，1998)。但是，就本申请而言，提到的 Y7受体或PYY-优先受体的药理学是指相对于NPY对PYY有任何程度偏 爱的受体。

肥胖及其相关疾病在美国乃至全世界都是普遍且非常严重的公众 健康问题。上体肥胖是2型糖尿病已知的最危险因素，也是心血管疾 病的一大危险因素。肥胖是下列疾病的已知危险因素：高血压，动脉 硬化症，充血性心力衰竭，中风(stroke)，胆囊疾病，骨关节炎， 睡眠窒息、生殖障碍如多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome)、乳腺、前列腺及结肠癌、以及全身麻醉并发症发病率增 加。(参见，例如，(Kopelman.Nature 404：635-43，2000))。它 能缩短寿命并带来导致上述共-发病率的一系列危险，以及下列疾病如 感染、静脉曲张、黑色棘皮症(acanthosis nigricans)、湿疹、运 动不耐症(exercise intolerance)、胰岛素抗性、高血压高胆固醇 血症、胆石病、矫形损伤(orthopedic injury)、以及血栓栓塞性 疾病(thromboembolic disease)(Rissanen，Heliovaara等人BMJ 301：835-7，1990)。肥胖还是称为抗胰岛素综合征，或“综合征X” 的一组状况的危险因素。最新估算的全世界用于肥胖及相关疾病的医 疗费用为一千五百亿美元。肥胖的发病机理被认为是多因性的，但是 基本问题是在于肥胖患者的营养利用度(nutrient availabitity)和 能量消耗没有实现平衡导致过量的脂肪组织。肥胖目前仍然是一种难 于治疗的、慢性的、基本上难以处理的代谢性疾病。能够用于肥胖病 人减重的治疗性药物必将给他们的健康带来巨大的收益。

本文所引的全部文献通过引用并入本申请，如同在本申请中全文 引入一样。

                      发明概述

现已发现，与胰腺多肽家族成员中枢给药报道的活性相反，PYY 及PYY激动剂的外周给药能减少营养利用度，可用于治疗肥胖及相关 疾病。本发明公开了PYY及PYY激动剂组合物及其用于调节患者营养 利用度从而治疗那些可通过减少营养利用度而获益的代谢性疾病的用 途。这些方法可用于治疗，例如，肥胖、糖尿病、包括但不限于2型 或非-胰岛素依赖性糖尿病、进食障碍疾患、抗胰岛素综合征以及心血 管疾病。

″PYY″意指获自或源自任何物种的肽YY多肽。因此，术语″PYY″ 包括人全长、SEQ ID NO：2所示的36氨基酸的肽，以及PYY的种变 体，包括，例如，鼠、仓鼠、鸡、牛、大鼠及犬PYY。″PYY激动剂意 指能够引发减少营养利用度的PYY效应的任何化合物，例如化合物(1) 在本申请实施例1、2、5或6所述的食物摄入、胃排空、胰腺分泌或 减重试验中显示活性，以及(2)在Y受体试验(实施例10)或在竞争性 结合试验中与标记后的来自含有丰富Y-受体的某些组织的PYY或PYY [3-36]特异性结合，包括，例如，最后区(area postrema)(实施例 9)，其中所述PYY激动剂并非胰腺多肽。优选地，PYY激动剂在这样 的试验中的结合亲和力大于1μM，更优选大于1-5nM。

这样的激动剂可以包括具有功能性PYY结构域的多肽、PYY活性片 段、或者化合物或小分子。PYY激动剂可以是肽或非-肽化合物，以及 包括“PYY激动剂类似物”，PYY激动剂类似物是指结构近似于PYY 且一般通过与下述受体结合或直接或间接地相互作用而表现出PYY活 性的任何化合物：PYY受体或者那些PYY本身能与其相互作用引发生理 应答的受体。这样的化合物包括PYY的衍生物，延长的多于36个氨基 酸的PYY分子，截短的少于36氨基酸的PYY分子，以及取代后的具有 1个或多个不同氨基酸的PYY分子，或者上述情况任意组合的分子。所 述化合物还可以通过加工进行修饰，如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸 化、磷酸化、乙酰化及环化。

所述PYY激动剂类似物的一种为PYY[3-36]，本申请中表示为SEQ ID NO：3。多肽带有的括号内的数字是指将全长肽序列在括号中氨基 酸位置处截短。因此，PYY[3-36]的序列等同于PYY中从第3至第36 位的氨基酸。PYY激动剂可以较高或较低的亲和力与PYY受体结合，这 表明较长或较短的体内或体外半衰期，或者比天然PYY的功效强或弱。

″可通过减少热量(或营养)利用度而减缓的状况或疾病″是指患 者由于相对高的营养利用度而引发、并发或加剧的任何状况或疾病， 或者能够通过减少营养利用度，如减少食物摄入量减缓病情的状况或 疾病。这样的状况或疾病包括，但不限于，肥胖、糖尿病、包括2型 糖尿病、进食障碍疾患、及抗胰岛素综合征。

一方面，本发明提供了一种通过向肥胖或超重患者施用治疗有效 量的PYY或PYY激动剂来治疗肥胖的方法。尽管“肥胖”一般是指体 重指数(body mass index)超过30，但是就本申请而言，包括体重 指数低于30的任何受治疗者，只要他们需要或想要减轻体重那么就包 括在所述“肥胖”的范围之内。抗胰岛素、葡萄糖不耐症或者任一类 型糖尿病(如1、2或妊娠型糖尿病)的受治疗者都可从该方法收益。

其他方面，本发明提供了减少食物摄入量、治疗糖尿病以及改善 脂类构成(包括减少LDL胆固醇和甘油三酯水平以及/或者改变HDL胆 固醇水平)的方法，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的PYY或者 PYY激动剂。在优选的实施方案中，本发明方法用于治疗可通过减少 需要治疗的受治疗者营养利用度而减缓病情的状况或疾病的方法，该 方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的PYY或PYY激动剂。所述 状况或疾病包括，但不限于高血压、脂代谢异常血症、心血管疾病、 进食障碍疾患、抗-胰岛素、肥胖以及任一型糖尿病。

在本发明所述的方法中，优选的PYY激动剂是指那些在本申请所 述试验(优选为食物摄入、胃排空、胰腺分泌或体重减少试验)其中之 一中的效力高于NPY在同一试验中所表现效力的物质。

就全部适应征而言，在优选的实施方案中，优选的PYY激动剂为 PYY[3-36]，优选外周给药，每天以单一或分割剂量给药约1μg～约5 mg剂量，或者约0.01μg/kg～约500μg/kg每一剂量，更优选约0.05 μg/kg～250μg/kg，最优选低于约50μg/kg。这些范围内的剂量可以根 据每一激动剂的效力来调整，当然，这容易由本领域技术人员来决定。

在本发明的方法中，PYY′s及PYY激动剂可以单独或者与其他长 效或短效减少营养利用度的一种或多种其它化合物和组合物一起施 用，所述其它化合物和组合物包括但不限于，包括下列物质的其他化 合物和组合物：淀粉状蛋白毒素(amylin)或淀粉状蛋白毒素激动剂， 缩胆囊肽(CCK)或CCK激动剂，苗条蛋白(OB蛋白)或苗条蛋白激动剂， exendin或exendin激动剂，GLP-1或GLP-1激动剂。合适的淀粉状 蛋白毒素激动剂包括，例如，[25，28，29Pro-]-人淀粉状蛋白毒素(又 称为″pramlintide，″见述于美国专利Nos.5,686,511和5,998,367) 和鲑降血钙素。使用的CCK优选CCK 8肽(CCK-8)。苗条蛋白的论述 见，例如，(Pelleymounter，Cullen等人Science 269：540- 543，1995)(Halaas，Gajiwala等人Science 269：543-6，1995) 和(Campfield，Smith等人Science 269：546-549，1995)。合适的 exendins包括exendin-3和exendin-4，以及exendin激动剂化合物 包括，例如，PCT公开文本WO 99/07404，WO 99/25727和WO 99/25728 中描述的那些化合物。

                     附图简述

图1为过夜禁食NIH/SW小鼠食物摄入试验中Y受体配体的活性曲 线。

图2为各种Y受体配体对HSD大鼠胃排空活性的曲线。

图3显示的是急促外周施用PYY[3-36]对大鼠胃酸分泌的抑制。 数据表示为分泌的胃酸的μmol数/10分钟。

图4的柱形图表明急促外周施用PYY[3-36]可阻止小鼠胆囊排 空。这种作用可通过施用CCK-8来逆转。

图5显示的是皮下施用PYY[3-36]对经CCK-8-刺激后的大鼠胰腺 外分泌(通过淀粉酶活性来测定)的急促、剂量-依赖性抑制作用。

图6显示的是育肥后的C57BI/6(食物-诱导的肥胖，或者DIO) 小鼠在4周连续外周输注PYY[3-36]时体重增加量减少的情况。

图7表明在4周的时段内，连续外周输注PYY[3-36]降低育肥后 的C57BI/6(食物诱导的肥胖，或DIO)小鼠热量利用率的作用。

图8显示的是通过测量肥胖型糖尿病(ZDF)大鼠28天时段内 HbA1c变化的百分率，连续外周输注PYY[3-36]对血糖调控的改善情 况。

                      发明详述

已被普遍接受的观点是内源性NPY(综述见(Schwartz，Woods等 人Nature 404：661-71，2000))和PYY(Morley，J.E.，Levine， A.S.，Grace，M.，和Kneip，J.Brain Res 341：200-203，1985)) 通过其受体增加进食行为。直接治疗肥胖的方法无一例外地尝试拮抗Y 受体，尽管在治疗厌食时主张采用该配体家族的激动剂。但是，正如 本申请中所描述和主张的那样，令人惊奇地发现外周施用PYY及其激 动剂能够强效地减少营养利用度，而并非如那些专利及科技文献(参 见，例如，美国专利Nos 5,912,227和6,315,203，其中公开了PYY 受体激动剂用于增重的用途)中报道的那样会增加营养利用度。抑制食 物摄入、减慢胃排空、抑制胃酸分泌、以及抑制胰腺酶分泌，这些作 用谱都可用于代谢疾病的临床改善，所述代谢疾病为例如1型、2型或 妊娠型糖尿病、肥胖及其他抗胰岛素综合征(综合征X)的症状，以及任 何其他用于减少营养利用度的用途。

PYY和PYY激动剂用于减少食物摄入及营养利用度用途，以及用于 治疗例如糖尿病及肥胖等疾病的用途，此前尚未被主张。事实上，这 样的治疗糖尿病的应用并不能从不出现血糖急性反应以及抑制胰岛素 分泌的报道中就能推断出来。但是，本申请中证明了该组配体及激动 剂配体可用于这些状况及相关状况。

申请人的数据表明：外周施用的PYY或PYY[3-36]减少食物摄入 及延缓胃排空的作用通过与Y-类家族中一种或多种独特的受体类别或 者相类似的受体类别相互作用测定出来。这些数据通过与类似于PYY- 优先(或Y7)受体的受体相互作用得到最好的解释，而通过与其他已知 Y-受体如Y1-Y6相互作用来解释则效果较差。表1(下面)显示的是， 已知受体中报告的公开的PP家族配体的效力，以及申请人的某些未公 开的数据，和各种配体的效力排序。本申请实施例中的效力排序与任 何单个公开的受体的药理学并不相符，这表明PYY在减少热量利用度 上有新的作用机制。

                        表1

来自公开数据和专利的PP受体家族受体药理学的概括：外周食欲 及胃排空数据为本申请人未公开过的数据。 受体                 药理学                    参考文献 食物摄入的 抑制程度 (外周) PYY[3-36]≥PYY＞＞NPY＝NPY[3-36]＝PP＝ Ac-PYY[22-36](见图1) 申请人的数据 胃排空 PYY[3-36]≥PYY＞＞NPY＝NPY[3-36]＝PP＝ Ac-PYY[22-36](见图2) 申请人的数据 食物摄入的 刺激程度 (中枢) PYY≥PYY[3-36]＝NPY＝NPY[3-36]＞PP (Iyengar，Li等人J Pharmacol Exp Ther 289：1031-40，1999) Y1 NPY＝PYY＞NPY[3-36]＝PYY[3-36]＝PP (Iyengar，S.，Li，D.L.，和Simmons， R.M.J Pharmacol Exp Ther 289： 1031-40，1999)(Gehlert，D.R.Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22， 1998；Michel，M.C.，Beck-Sickinger， A.，Cox，H.，Doods，H.N.，Herzog，H.， Larhammar，D.，Quiriou，R.，Schwartz， T.，和Westfall，T.Pharmacol Rev 50： 143-50，1998) US 5,968,819 Y2 NPY＝PYY＝PYY[3-36]＝NPY[3-36]＞＞PP (Gehlert，D.R.Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22，1998；Michel，M.C.，Beck- Sickinger，A.，Cox，H.，Doods，H.N.， Herzog，H.，Larhammar，D.，Quirion， R，Schwartz，T.，和Westfall，T. Pharmacol Rev 50：143-50， 1998；Iyengar，S.，Li.D.L.，和 Simmons，R.M.J Pharmacol Exp Ther 289：1031-40，1999)US 5,968,819 Y3 NPY＞PP＞PYY (Gehlert，D.R.Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22，1998；Michel，M.C.，Beck- Sickinger，A.，Cox，H.，Doods，H.N.， Herzog，H.，Larhammar，D.，Quirion， R.，Schwartz，T.，和Westfall，T. Pharmacol Rev 50：143-50，1998)  Y4  PP＞PYY＞NPY＞PYY[3-36]＝NPY[3-36] (Gehlert，D.R.Proc Soc Exp Biol Med. 218：7-22，1998；Michel，M.C.，Beck- Sickinger，A.，Cox，H.，Doods，H.N.， Herzog，H.，Larhammar，D.，Quirion， R.，Schwartz，T.，和Westfall，T. Pharmacol Rev 50：143-50， 1998；Iyengar，S.，Li，D.L.，和 Simmons，R.M.J Pharmacol Exp Ther 289：1031-40，1999)US 5,968,819  Y5  NPY＝PYY≥PP≥PYY[3-36]＝NPY[3-36] (Gehlert，D，R.Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22，1998；Michel，M.C.，Beck- Sickinger，A.，Cox，H.，Doods，H.N.， Herzog，H.，Larhammar，D.，Quirion， R.，Schwartz，T.，和Westfall，T. Pharmacol Rev 50：143-50， 1998；Iyengar，S.，Li，D.L.，和 Simmons，R.M.J Pharmacol Exp Ther 289：1031-40，1999)US 5,968,819  Y6  NPY＝PYY≥NPY[3-36]＞PP (Gehlert，D.R.Proc Soc Exp Biol Med 218：7-22，1998；Michel，M.C.，Beck- Sickinger，A.，Cox，H.；Doods，H.N.， Herzog，H.，Larhammar，D.，Quirion， R.，Schwartz，T.，和Westfall，T. Pharmacol Rev 50：143-50， 1998；Iyengar，S.，Li，D.L.，和 Simmons，R.M.J Pharmacol Exp Ther 289：1031-40，1999)US 5,968,819 (Y7)  PYY＞NPY＞＞PYY[3-36]＝PP (Yang，Li等人Br J Pharmacol 123： 1549-54，1998) (Y7)  PYY[3-36]≥PYY＞NPY＞＞PP (Haynes，Hill等人Br J Pharmacol 122：1530-6，1997) (Y7)  PYY＞＞NPY＝PYY[3-36]＝PP (Kawakubo，Yang等人Brain Res 854：30-4，2000)

任何PYY或PYY激动剂都可用于本发明。优选的PYY激动剂包括 肽激动剂，特别是PYY激动剂类似物如PYY[3-36]。类似物可通过， 例如对PYY或其部分的序列进行保守性氨基酸置换制备，并可以通过 采用实施例中提供的试验或者其他能将PYY与NPY或PP的作用区分开 来的合适试验来测试。非肽激动剂也在所预料的范围内。

PYY表现出的作用谱，例如，抑制食物摄入、减慢胃排空、抑制胃 酸分泌、抑制胰腺酶分泌，等，协同作用限制养分同化，从而对代谢 疾病发挥临床改善作用，所述代谢疾病为例如糖尿病、肥胖、心血管 疾病(动脉硬化、高血压、脂代谢异常血症等)以及抗胰岛素综合征(例 如综合征X)的表现。

本申请中涉及的PP配体家族中的肽的人源序列如下所列(用常用 的单字母氨基酸编码表示)：

PP：APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRYINMLTRPRY(SEQ ID NO：1)

PYY：YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY(SEQ ID NO：2)

PYY[3-36]：IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY(SEQ ID NO：3)

NPY：YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY(SEQ ID NO：4)

这些肽在生理表达时为C-末端酰胺化的，但是用于本发明不必如 此。这些肽还可有其他翻译后的修饰。

本申请所述的PYY及以肽为基础的PYY激动剂可以用本领域已知 的标准重组表达或化学合成肽技术来制备，例如用自动或半自动肽合 成仪。

固相肽合成可以在自动肽合成仪(例如，Model 430A，Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上进行，使用NMP/HOBt(Option 1)系统和tBoc或Pmoc化学(参见，Applied Biosystems User′s Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer，Version 1.3B July 1，1988，section 6，pp.4970，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)加帽。还可以用Advanced Chem Tech Synthesizer(Model MPS 350，Louisville，Kentucky)装配肽。肽可以通过RP-HPLC(制 备型及分析型)，使用，例如，Waters Delta Prep 3000系统以及 C4、C8或C18制备型柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，CA) 纯化。

本发明可使用的肽化合物还可以使用重组DNA技术制备，使用本 领域已知的方法。参见，例如，Sambrook等，分子克隆：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor(1989)。本发明可使用的非- 肽化合物可以用本领域已知方法制备。例如，含磷酸的氨基酸以及含 此类氨基酸的肽，可以用本领域已知方法制备。参见，例如，Bartlett 和Landen，Biorg.Chem.14：356-377(1986)。

上述化合物因其药理特性而有用。特别是，本发明所述化合物具 有可作为减少营养利用度，包括减少食物摄入的药物的活性。

所述组合物或药物组合物可通过任一途径施用，包括静脉内，腹 膜内、皮下、及肌内，口服，局部、经粘膜，或者通过肺吸入。可用 于本发明的组合物可以适于肠道外(包括静脉内、肌内及皮下)、鼻或 口施用的制剂的形式便利提供。在一些情况下，将PYY或PYY激动剂 和另外的减少食物摄入、降血糖或调血脂的药物，如淀粉状蛋白毒素 或淀粉状蛋白毒素激动剂、CCK或CCK激动剂、或者苗条蛋白或苗条蛋 白激动剂，以一起施用的同一组合物或溶液的形式提供是适宜的。其 他情况下，将该另外的药物与所述PYY或PYY激动剂分开使用则更 好。

合适的施用形式最好由每一患者个人的开业医生来决定。各种药 物学上可接受的载体及其制剂的描述见标准制剂论著，例如，E.W. Martin编著的Remington′s Pharmaceutical Sciences。也可参见， Wang，Y.J.和Hanson，M.A.″Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stability and Stabilizers，″Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10， Supp.42：2S(1988)。

可用于本发明的化合物可以非肠道给药组合物提供，用于例如， 注射或输注。优选地，将其悬于含水载体，例如，等渗缓冲液，pH约 3.0～约8.0，优选pH为约3.5～约7.4，3.5～6.0，或者3.5～约 5.0。有用的缓冲剂包括柠檬酸钠-柠檬酸、磷酸钠-磷酸以及乙酸钠/ 乙酸缓冲剂。可以使用储藏库或“仓库”形式的缓释制剂，以便将治 疗有效量的该制剂在经皮注射或递送后许多小时或许多天中输送入血 流。

由于本发明的产品是两性的，所以它们可作为游离碱、作为酸加 成盐或作为金属盐使用。所述盐当然必须是药物学可接受的，这些盐 包括金属盐、特别是碱金属及碱土金属盐，例如，钾或钠盐。可获得 多种多样的药物学可接受的酸加成盐。所述产品可通过本领域已知的 方法容易地制备而成。

为了医师的使用，所述组合物可以单位剂量的形式提供，内含一 定量的PYY或PYY激动剂，含有或不含另外的活性成分，例如，减少 食物摄入、降血糖或调血脂的药物。用于减少营养利用度的治疗有效 量的PYY或PYY激动剂是那些能以理想水平抑制食欲的物质。正如本 领域技术人员所知的那样，治疗药物的治疗有效量随多种因素而变 化，其中包括患者的年龄及体重、患者的生理状况、血糖水平、所要 达到的体重水平，以及其他因素。

所述化合物的有效日食欲-抑制剂量一般为约1～30μg至约5mg/ 天，优选约10～30μg至约2mg/天，更优选约5～100μg至约1mg/ 天，最优选约5μg至500μg/天，对于50kg的患者，以单一或分 割剂量施用。优选地，剂量范围为约0.01～约100μg/kg/剂。所施用 的准确剂量为本领域技术人员易于确定，取决于具体化合物的效力、 以及个体的年龄、体重和健康状况。无论何时只要想抑制营养利用度、 食物摄入，降低体重、血糖或血脂，那么就可以开始施用。例如，在 肥胖、糖尿病或抗胰岛素综合征的第一次症状出现时或者诊断后马上 施用。施用可采用任一途径，例如，注射，优选皮下或肌内注射，口 服，鼻腔，经皮等。某些途径的剂量，例如口服施用，应该将减少了 的生物利用度增补上，例如约5-100倍。

本申请化合物施用给患者的最佳制剂及模式取决于本领域已知的 多种因素，例如具体的疾病或病症，期望效果，患者类型。尽管所述 化合物一般用于治疗人类患者，但是它们也可以用于治疗其他脊椎动 物的类似或同样疾病，例如其他灵长类动物、圈养动物如猪、牛及禽 类，以及体育动物及宠物如马、狗及猫。

其他PYY激动剂的筛选

其他的PYY激动剂可以通过将下文(例如，实施例9和10)所述 或者本领域已知的受体结合试验与下文实施例中描述的生理学筛选试 验结合使用鉴定得到。可将潜在的PYY激动剂与PYY或PYY[3-36]的 活性进行比较。

可选择地，一旦1种或多种PYY-优先(Y7)受体已被定性且克隆， 那么就可按照下文或者本领域已知的那样进行替代性试验和高通量筛 选。Y7受体对PYY或PYY[3-36]的亲和力大于对NPY的亲和力。用于 筛选可调控PYY受体活性的化合物的方法包括让测试化合物与PYY受 体接触，并测试该化合物与所述PYY受体之间复合物的存在。在这类 试验中，测试配体通常被标记。适当孵育后，将游离配体同结合形式 的分离开来，游离或未形成复合物的标记物的量就可作为该特定化合 物结合所述PYY受体的能力的量度。可选择地，也可对结合后的标记 配体进行测量(例如，用表达的膜结合型Y7受体)。

本发明的另一实施方案中，利用高通量筛选试验来筛选具有对PYY 受体合适亲和力的化合物。例如，将大量不同的小肽测试化合物合成 在固相底物上。让所述肽测试化合物与PYY受体接触，并洗涤。然后， 用本领域熟知的方法检测结合后的PYY受体。另外还可将纯化后的测 试化合物直接包被在平板上用于上述的药物筛选技术。另外，如果测 试化合物是蛋白，那么可通过利用抗体通过本领域任一已知方法俘获 所述蛋白并将其固定在固相支持物上。

本发明的其他实施方案包括使用竞争性筛选试验，其中让能特异 性结合本发明多肽的中和抗体与用于结合该多肽的测试化合物展开竞 争。在该方法中，可以用所述抗体检测任一种与PYY激动剂间具有1 个或多个抗原决定簇的肽的存在。放射性标记的竞争结合研究的描述 见A.H.Lin等人Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1997， vol.41，no.10.pp.2127-2131，该文献的内容整体在此引入作为 参考。

为了有助于理解本发明，本申请给出了下列实施例。本发明相关 试验当然不应该被理解为是对本发明的具体限制，现有的或者是以后 发展的对本发明的改动，只要是本领域技术人员理解到的那么就应该 视为落入本申请及所附权利要求要求保护的范围之内。

                       实施例

在下文所述的试验中，PP配体家族的成员用于各个不同试验。除 另有说明，所有肽测试化合物都是以1-5mg/ml浓度溶解于盐水，不 测量pH。所有情况下，在施用前所有制剂都是肉眼所视为清澈的。

实施例1：禁食过夜后Y受体对食物摄入的活性

NIH/SW小鼠将雌性NIH/Swiss小鼠(8-12周龄)分组圈养，在 0600开始给光进行12∶12小时光∶暗循环。除另有说明外，水和标准 粒状鼠粮可随便采食。在出生后大约1500小时开始试验，试验前1天 让动物断食并单独圈养。试验当天的早晨(大约0630小时时)，给所 有动物称重，并分成试验组以便让组和组之间有最近似的体重分布。 在一典型试验中，对照组为n＝10，而每一治疗组为至少5个。

在时间＝0分钟的时刻，让所有动物腹膜内注射5ml/kg载体或 化合物，并立即给予预先称量好的(10-15g)标准鼠粮。增加剂量的 PYY[3-36]或PYY(0.1μg/kg～500μg/kg)和NPY(100和500μg/kg)， 以及单一高剂量的NPY[3-36](100μg/kg)、N-末端乙酰化的Ac-PYY [22-36](200μg/kg)和PP(500μg/kg)被供给，如图1所标示。在 1小时时移去食物并称重测量所消耗食物的量(Morley，Flood等人 Am J Physiol 267：R178-R184，1994)。

分析：

用0时刻最初提供的食物的重量减去1小时后剩余食物的重量， 计算出食物的摄入量。治疗对食物摄入的影响用相对于对照变化的％来 表示。

用ANOVA来鉴定显著疗效(p＜0.05)。当有显著差异存在时，将 试验平均值与对照平均值用Dunnett′s检验(Prism v2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)进行比较。

结果：

如图1所示，以10100和500μg/kg的剂量外周施用(腹膜内注射) 的PYY对过夜-禁食的雌性NIH/SW小鼠作用的60分钟时段内显著减少 了食物的摄入量。这些剂量的PYY[3-36]具有大约相等的效力。PP和 NPY在500μg/kg开始显示活性。而NPY和NPY[3-36][SEQ ID NO.： 5]在100μg/kg无活性。Ac-PYY[22-36][SEQ ID NO.：6]在200μg/kg 还无活性。所以效力排序为：PYY[3-36]≥PYY＞＞NPY＝NPY[3- 36]＝PP＝Ac-PYY[22-36]。上述效力排序，特别是NPY无效时， 并不能反映任何已知克隆受体的药理学。

已经报道外周给予的PP可减少摄食(Asakawa，Inui等人 Peptides 20：1445-8，1999)。另外，还报道了向肥胖小鼠外周施用 PP减少了食物摄入量和体重增加量(Malaisse-Lagae，Carpentier 等人Experientia 33：915-7，1977)。据报道ob/ob小鼠对几种减食 欲原(anorexigens)高度敏感(Young和Bhavsar.Program and Abstracts，10th International Congress of Endocrinology 419 (poster P2-58)，1996)。据报道过表达PP的小鼠减少了体重和食物 摄入量(Ueno，Inui等人Gastroenterology 117：1427-32， 1999)。申请人在图1所示的测试系统中用PP没能减少食物摄入量。 Asakawa等人的试验是急促单-注射试验，没有提供体重改变的数据。 尽管PP转基因小鼠研究(Ueno等人，Gastroenterology 117： 1427-32，1999)宣称过表达动物显示了体重和食物摄入量的减少，但是 半数动物死于围产期，能够在病理学同奶摄入量减少导致饿死的直接 解释区分开来。另外，所述基因表达系统并非胰腺特异性的，肽表达于 脑内，这使对过表达数据的任何解释混乱。Ueno等从其数据中推断PP 可能通过调控GE部分参与了摄食及体重调控，但是实施例1和2中的 数据(下文)表明PP对食物的消耗影响极小或无影响，在减慢胃排空 方面基本无活性。重要的是，PP仅50％同源于PYY(或NPY)，并具有 不同的初始组织定位(胰腺vs.肠L-细胞vs.神经元)，对Y4受体 较Y1和Y2表现出明显的偏爱。NPY与PYY具有70％的同源性，当中 枢施用时是一种强效的开胃原(orexigen)。但当外周给与时仅导致食 物摄入量的适度减少，在实施例2(下述)的胃排空试验中根本没有活 性。

实施例2：Y肽配体对HSD大鼠胃排空的活性

雄性HSD大鼠，180-215g，在12∶12小时的光照∶黑暗循环下圈 养，断食20小时(过夜)。在时间＝0分钟的时刻，将测试肽(PYY[3-36]， PYY，Ac-PYY[22-36]，NPY，NPY[3-36]，或PP)或盐水载体注射(腹 膜内)给有知觉的大鼠(n＝6/组)。在t＝1分钟的时刻，将1ml含5μCi 3H-3-O-甲基-葡萄糖的无菌水溶液通过口咽管强饲给有知觉的大鼠。 饲后40分钟采集血样(10μl)，分析血浆中的每分钟计数(CPM)。为 了消除尾静脉采样过程中的痛苦，在距尾巴末梢3-4cm处注射2％的 利多卡因(0.1ml)(Gedulin，Jodka等人Gastroenterology 108： A604，1995)。

数据分析：

测试化合物的效果用相对于对照变化的百分比来表示，计算方法 为-100*(1-(测试大鼠平均值/对照平均值))。

如果用ANOVA测定的p＜0.05，那么相对活性就可定为显著。 当显著差异存在时，将测试平均值与对照平均值用Dunnett′s检验 (Prism v2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)进行比 较。

结果：

如图2所示，外周施用(腹膜内注射)的PYY[3-36]在剂量大于 或等于10μg/kg时显著地并呈剂量依赖性地减小了40分钟测量的HSD 大鼠的胃排空。PYY在100和500μg/kg也是有效的。通过比较，NPY、 NPY[3-36]或PP以500μg/kg注射时以及Ac-PYY[22-36]以200 μg/kg注射时无活性。测试化合物的效力排序为：PYY[3-36]≥PYY＞＞ NPY＝NPY[3-36]＝PP＝Ac-PYY[22-36]。该效力排序与食物摄 入研究所见类似(图1)。NPY没有作用并不能反映任何已知克隆受体 的药理学。Ac-PYY[22-36]在两个试验中都无活性，这一点很重要， 因为Balasubramanian等人的美国专利5,604,203报道该亚肽是大 鼠肠PYY受体以及Y2受体二者的配体。

实施例3：急促(Acute)外周施用PYY[3-36]抑制大鼠的胃酸分泌

将雄性Harlan Sprague Dawley大鼠在12∶12小时光∶暗循环 的条件下圈养。所有试验均在光循环阶段进行。试验前约20小时给动 物断食但水可自由获取直至试验开始。

用外科手术的方法为大鼠(11-16周龄，体重291-365g)装配上胃 瘘管(Kato，Martinez等人Peptides 16：1257-1262，1995)。给 断食过夜的大鼠称重，摘去胃瘘管的盖，并将其与一柔性Tygon管(3/8 ×1/16)连接，在Tygon管内安装有一段能延伸入胃的PE205管。通 过较窄PE205管注射盐水，经由Tygon管收集流出物。为了确保准确 地流经所述瘘管和空胃，用～5mL室温盐水冲洗胃部几次直至流动流 畅以及流出物清澈。通过注射5mL盐水及后续的3mL空气并收集流 出物的方法，每隔10分钟测量一次胃酸。每一胃抽出物取3mL使用 pH计用0.01N氢氧化钠滴定至pH7.0。用每次滴定校正到收集总体 积需要的碱的量来计算每一样品中酸的摩尔数。

收集基线样本后，记录回收的体积，然后给动物皮下注射125μg/kg 五肽促胃泌素刺激胃分泌。每10分钟收集胃酸分泌物。在注射五肽促 胃泌素40分钟后，给该动物皮下注射100μg/kg PYY[3-36]或盐水， 继续每10分钟对胃分泌物取样，共持续2小时。数据表示的是每10 分钟取样间隔中分泌的酸的μmol(平均值±SEM n＝4/组)。

结果

图3显示的是通过外周(腹膜内)急促注射(100μg/kg)PYY[3-36] 对大鼠体内经五肽促胃泌素-刺激后的胃酸分泌抑制的情况。该效果的 ED50为≈20μg/kg。

实施例4：急促外周施用的PYY[3-36]阻止小鼠胆囊排空-为CCK-8可 逆

将小鼠在12∶12小时光∶暗循环并可自由获取水和鼠粮的条件下 圈养，直至试验开始。在t＝0时，给小鼠皮下注射1，10，100，或1000 μg/kg PYY[3-36]，1或10μg/kg CCK-8，这二者或者盐水(处理及 n/组见图4)。三十分钟后，麻醉动物，取其完整胆囊并称重。

分析：

数据表示的是mg计的器官重量。活性用与对照组平均值的差异定 义。用ANOVA和/或Dunnett′s检验定义的统计显著性为p＜0.05。

结果：

如图4所示，以大于或等于10μg/kg的剂量通过急促外周注射的 PYY[3-36]阻止小鼠的胆囊排空。这种排空的抑制为ED50≈31μg/kg， 并能被CCK-8对消，即使在PYY[3-36]为试验最大量时。

实施例5：急促外周施用PYY[3-36]可抑制大鼠经CCK-8-刺激后的胰 腺外分泌(淀粉酶)

将雄性Harlan Sprague Dawley大鼠在12∶12小时光∶暗循环 的条件下圈养。所有试验均在光循环阶段进行。试验前约20小时给动 物断食但水可自由获取直至试验开始。

用5％氟烷麻醉大鼠，在手术过程中用2％氟烷维持，然后用1％氟 烷。进行右股动脉切开术和套管插入术的操作，将体温调节器调至加 热操作面板来控制体温。将肝素化后的盐水(2U/ml)灌注入用来采血 样的股动脉，并将其连接到用于记录血压的压力传感器上。通过中线 切口，在胰胆共用管的胰腺入口靠上约0.5cm的点插入两聚乙烯管。 其中的第一个管向上往肝脏的地方插入以收集胆汁。该管的另一端通 过十二指肠的一个小切口置入十二指肠。因此，胆汁直接从肝流到小 肠，完全避开了胰腺。在靠近第一个管处向共用的胰胆管插入第二个 聚乙烯管，指向胰腺收集胰液。在胰腺管的十二指肠入口处将其结扎， 迫使胰液分泌入收集管。

在t＝-15至+60分钟时间段内，每隔15分钟收集胰液。对每15 分钟的等份测定胰液的体积(以重量计)和淀粉酶的活性(Taniguchi， Yazaki等人Eur J Pharmacol 312：227-33，1996)。胰液在分析 前作1∶2000稀释。用活性乘以收集体积得到以每15分钟单位计的酶 分泌量(Taniguchi，H.，Yazaki，N.，Yomota，E.，Shikano，T.， Endo，T.，和Nagasaki，M.Eur J Pharmacol 312：227-33，1996)。

统计学分析

用Student′s t-检验进行成对统计学分析；用Dunnett′s检验与 对照多比较；一般效果用单相(one-way)ANOVA测试。结果表示为平 均值±标准误差的平均值。P＜0.05作为显著水平。

结果：

图5表明通过测量胰液中淀粉酶活性发现30μg/kg急促外周(皮下) 注射PYY[3-36]阻止了经CCK-8-刺激后的大鼠胰腺分泌。在没有 CCK-8作用的情况下，与注射盐水的对照组相比300μg/kg的PYY[3-36] 对基础淀粉酶活性没有任何影响。

实施例6：持续外周输注PYY[3-36]减少育肥C57BI/6(DIO)小鼠的 体重增加。

用高脂肪(HF；食物热量的58％为脂肪)或低脂肪(LF；食物热量 的11％为脂肪)的鼠粮饲喂雄性C57BI/6小鼠(在4周龄开始试验)。 饲喂鼠粮7周后，每一小鼠植入一渗透压力泵(Alzet#2004)，用该压 力泵输送如图6标示剂量的PYY[3-36](30，100，300，或1000μg/kg/ 天)，持续4周。体重和食物摄入量以每周来测量(Surwit，Feinglos 等人Metabolism-Clinical and Experimental 44：645-651，1995)。

数据分析：

测试化合物的效果表示为平均值±与起始体重相差克数的标准 差，每一试验组至少14只小鼠((p＜0.05 ANOVA，Dunnett′s检验 (Prism v2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)。

结果：

图6表明持续外周输注施用PYY[3-36]使食物-诱导肥胖(DIO) 小鼠的体重增加量呈剂量-相关性的减少。剂量为300μg/kg/天时前 3周以及在剂量为1000μg/kg/天时所有时间点所述效果是显著的。

实施例7：持续外周输注PYY[3-36]可降低育肥C57BI/6(DIO)小 鼠的热量效率。

用高脂肪(HF；食物热量的58％为脂肪)或低脂肪(LF；食物热量 的11％为脂肪)的鼠粮饲喂雄性C57BI/6小鼠(在4周龄开始试验)。 饲喂鼠粮7周后，每一小鼠植入一渗透压力泵(Alzet#2004)，用该压 力泵输送如图6标示剂量的PYY[3-36](30，100，300，或1000μg/kg/ 天)，持续4周。体重和食物摄入量以每周来测量(Surwit，Feinglos 等人Metabolism-Clinical and Experimental 44：645- 651，1995)。

分析：

测试化合物的效果表示为每所消耗的千卡数与起始体重间的体重 差(g)。消耗的千卡数通过消耗食物的重量(g)乘以生产商标明的千 卡密度(kcal/g)计算得来的。注意这些数据是从实施例3使用动物 得来的。

活性定义为变化的平均值±n＝至少14个小鼠/组的sd。显著性定 义为在用ANOVA或Dunnett′s检验时p＜0.05。

结果：

图7表明通过持续外周输注亚慢性地施用PYY[3-36]使食物-诱 导肥胖(DIO)小鼠的热量效率(计算方法为增加的重量/消耗的千卡 数)呈剂量-相关性的降低。在剂量为1000μg/kg/天时所有时间点以 及剂量为300μg/kg/天时的一些时间点所述效果是显著的。

实施例8：连续28天外周输注PYY[3-36]可改善肥胖性糖尿病(ZDF) 大鼠的血糖控制(Glycemic Control)。

将糖尿病肥胖Zucker大鼠(7周龄)圈养在12∶12小时光∶暗循 环的房间内，高脂肪鼠粮和水可随意获取。顺应环境1周后，抽取血 样，通过开始HbA1c分拣动物以便为每一试验组提供近似的范围。

在动物内植入渗透压力泵，用该压力泵连续外周输送如图8标示 剂量的PYY[3-36]或盐水，共持续28天。以每周间隔测量HbA1c。绘 制出HbA1c的水平(％)相对于时间的曲线图(Brown，Henke等人 Diabetes 48：1415-24，1999)。

结果：

如图8所示，通过测定HbA1c的水平表明，以外周输注的方式向 Diabetic Zucker Fatty(ZDF)大鼠连续施用PYY[3-36]对长期血糖 控制产生剂量-依赖性的改善效果。所述血糖控制改善效果在整个治疗 期内都是增强的，28天当中所有剂量PYY[3-36]的条件下都是显著 的。

上述实施例直接表明PYY激动剂可以用于降低热量利用率，可用 作通过减少热量利用率而减缓病情的疾病的治疗剂，例如肥胖和2型 糖尿病。另外，该实施例表明PYY激动剂降低热量利用率的作用可通 过几种机制产生，提供了鉴定PYY激动剂的框架。由于据报道PYY和 NPY是等效的，在所有进行的Y1和Y2受体试验中效果是相同的，上述 实施例1和2中的数据表明PYY以及激动剂在减少食物摄入(图1)和减 慢胃排空(图2)方面的作用不是通过Y1或Y2受体介导的。那些数据 表明PYY′s在食物摄入和胃排空方面的作用与报道的对Y1和Y2受体 的作用之间不具有可比性，因为在这些试验中NPY几乎或根本没有活 性。

图1图解了本发明的一个方面。中枢施用PYY或NPY激动剂 能增 加食物摄入这一点是已知的(Clark，Kalra等人Endocrinology 115： 427-9，1984；Clark，Sahu等人Regul Pept 17：31-9，1987)。 令人惊奇的是，我们发现了外周施用PYY或PYY[3-36]能有效地减少 食物摄入。在本申请未给出，我们已经证明在其他啮齿类模型包括 ob/ob小鼠，以及fa/fa大鼠，的长期试验中，PYY[3-36]减少了食 物的摄入量。外周施用时，PP家族的其他成员对食物摄入几乎或根本 没有作用。效力顺序，特别是NPY没有效力，并不能反映任何已知克 隆Y受体的药理学。它们减慢胃排空的作用以及与之对比的是其他PP 家族成员在该试验中无活性的事实，进一步表明了PYY激动剂独特的 药理学(参见，例如，图2中的数据)。

PYY激动剂PYY[3-36]的特征表明了其他能降低热量利用率的机 制。这些包括减少胃酸分泌(图3)、减少胰腺外分泌(图5)以及减慢 胆囊排空(图4)。不受任一理论束缚，我们提出这一在食物摄入及胃肠 道功能上的完整作用谱促进了PYY激动剂降低热量利用率的作用。例 如，据报道PYY和PYY[3-36]抑制了兔子经迷走神经刺激的胃酸排出 量(Lloyd，Grandt等人Am J Physiol 270：G123-G127，1996)。 PYY还抑制了人(Adrian，Ferri等人Gastroenterology 89： 1070-7，1985)和大鼠(Greeley，Guo等人Proc Soc Exp Biol Med 189：325-8，1988)经五肽胃泌素-刺激后的胃酸分泌，以及大鼠经 CRF-诱导后的胃酸分泌(Gue，Junien等人Br J Pharmacol 118： 237-42，1996)。另外还报道，PYY(Yoshinaga，Mochizuki等人Am J Physiol 263：G695-701，1992)(Guan，Maouyo，等人 Endocrinology 128：911-6，1991)(Pappas，Debas等人Am J Physiol 248：G118-23，1985)和PYY[3-36](Deng，Guarita等 人Dig Dis Sci 46：156-65，2001)抑制胰酶的分泌。最近报道， 在正常人体内，PYY能缩短胆囊排空的头期(cephalic)阶段，但是 不能缩短胆囊排空的CCK-依赖性阶段(Hoentjen，Hopman等人 Scand J Gastroenterol 35：166-71，2000)。

我们提出通过本发明鉴定的机制用PYY激动剂治疗能减轻体重。 我们还发现，在几种肥胖啮齿类模型中，外周施用PYY[3-36]能够产 生体重或增重率的剂量-依赖性减少。我们阐明了本发明中对食物-诱 导肥胖(DIO)小鼠模型的作用(图6)。

另外，如图1中概括的那样，外周施用PYY激动剂能减少食物摄 入。从DIO小鼠试验中消耗每千卡所获得体重的计算结果，可以清楚地 看出外周施用PYY激动剂能够降低热量转化为体重的效率(图7)。因 此，本实施例支持了PYY激动剂在减少与热量利用度降低相关的体重 增加方面的作用。

特别是，PYY和PYY激动剂可以用于治疗那些能够通过减少热量 利用率而获益的疾病，例如肥胖、2型糖尿病以及心血管疾病。我们已 经查明了PYY[3-36]在肥胖型糖尿病啮齿类动物，ZDF大鼠中的抗糖 尿病作用。通过测量血色素A1c水平表明，外周施用PYY激动剂可在 血糖控制上产生显著的、强效的剂量-相关改善作用(图8)。尽管该实 施例中未给出，食物摄入量也因PYY[3-36]的施用而减少。

实施例9：最后区(Area Postrema)试验

已报道外周施用PYY能够激活最后区中的神经细胞(Bonaz， Taylor等人Neurosci Lett 163：77-80，1993)。对本发明潜能 化合物的PYY激动剂活性的评估可通过将下述最后区试验与PYY效力 试验，例如实施例1和2中的试验联合使用来进行。

膜的制备

在该试验中，从由猪或牛脑干切下来的组织制备最后区膜。最后 区膜制备的起始步骤为，在冰冷的温度下，用例如Polytron组织匀 浆器(Brinkman Instruments，NY)将组织在缓冲液中短暂(4-10秒) 匀浆，所述缓冲液为例如磷酸盐缓冲盐溶液(138mM NaCl，8.1mM Na2PO4，2.5mM KCI，1.2mM KH2PO4，0.9mM CaCl2，0.5mM MgCl2，pH 7.4)。在裂解组织后，通过离心(200×g，5分钟，4℃)除去大块 颗粒及碎片，将上清部分放置在冰上。通过高速离心(至少40,000×g， 至少10分钟，4℃)将膜与上清部分分离开来。通常，通过用新鲜缓冲 液再匀浆化及再离心的方式至少洗涤膜两次，为了除去内源性干扰物 质。将洗涤后的膜重悬于含有蛋白水解酶抑制剂的缓冲液中，例如苯 甲基磺酰氟(PMSF)或杆菌肽。可添加缓冲液的体积以足以可将最终组 织浓度调节到适于具体所使用筛选方法的水平。

结合反应

在一个实施方案中，按照下列方法对用于筛选方法的混合物进行 孵育。向玻璃或聚合物管中加入小体积的由下列成分组成的缓冲混合 物(″HBBM″)：例如含有例如杆菌肽或PMSF的蛋白酶抑制剂的HEPES 缓冲液、不含蛋白酶的血清白蛋白(优选级分V BSA，不合蛋白酶)、 和任选的Mg2+或Ca2+盐、以及EDTA。向上述缓冲混合物中加入小体积 的缓冲液，该缓冲液中含有浓度为约10-11～10-6M的用于测试激动剂 活性的未标记分子。对照管中只含有缓冲液。向该混合物中加入不同 量的标记的最后区制剂配体(此处为，PYY)，以在缓冲液中得到的终浓 度为约10～约100pM。由于可获得高特异活性并便于化学标记，所以 优选用125I来标记该最后区配体。配体可以从人组织、动物组织中分离 得到，或者通过化学、合成或重组的方式来得到。将标记后的最后区 制剂配体溶解于含无蛋白酶的级分V BSA的无菌水中，等分，冻存至 使用。

通过将例如膜加入每一孵育管中，启动反应。每一管中所需膜蛋 白的量是不同的，以使试验中膜结合的标记配体的量低于例如该配体 总浓度的10％(通常约100μg)。

将反应混合物孵育一段时间，孵育温度足以使得反应可在这段时 间内达到稳定态。本申请中使用的术语“稳定态”是指可将能影响结 合激素的净量的所有反应及过程总计都包括在内。在词义上，可等同 于也可不等同于″平衡态″。通常，在室温下孵育管约60分钟。

检测

当使用膜的时侯，要将膜在结合后分离出来，以测定在标记与未 标记配体间竞争后结合的标记配体的量。用真空-动力的Brandel细 胞收获器(Brandel Instruments，Gaithersburg，Maryland，Model M-24)通过玻璃纤维过滤器(例如，GF/B，Whatman)可以很方便的将 膜收集起来，上述玻璃纤维过滤器已预先用试剂浸泡过以减少非特异 性的结合(NSB)。优选地，将过滤器用约0.3％的聚乙烯亚胺预浸泡 约5小时。本领域技术人员应该知道其他的膜收集仪器，例如the Millipore Filtration Assembly((Model 1225)或the Sandbeck filter box(Bennett，J.P.，in Neurotransmitter Receptor Binding，H.I.Yamura，等人；Raven，New York 1978，Pages 57-90)，收集过滤器，以及NSB-减少试剂都可用于受体结合试验。在 过滤前后的即刻都用大(ml)体积冰冷缓冲液洗涤过滤器以除去污染 物，例如未被结合的标记配体。除去过滤器，对膜结合的标记配体的 量进行定量。标记物为125I时，可用γ射线计数器来测定放射活性。 当使用的是化学发光报道分子(例如，AMPPD，Tropix，Inc.， Bedford，MA)时，可用发光计来对所产生的光进行定量。酶及荧光标 记物也可使用。

取代过滤，可以在孵育后通过离心(例如，Beckman-2-21-M冷 冻离心，21,000rpm或Beckman 12或Eppendorf microfuge)将膜 分离出来，用冰冷缓冲液洗涤，然后，同样地或者在用洗涤剂或碱溶解 膜之后进行计数。

数据分析

用标准方法对结合数据进行Scatchard图饱和分析，其中结合/ 游离(B/F)标记配体绘制为结合量的函数。参见，例如，(Scatchard. Ann NY Acad Sci 51：660，1949)。

竞争曲线中该结合量(B)绘制为配体浓度对数的函数，对该竞争 曲线进行电脑分析，例如用4-参数对数方程非线性回归(Prism Program；GraphPAD Software，San Diego，California)或者ALLFIT 程序(Version 2.7(NIH，Bethesda，MD 20892))进行分析(Munson and Rodbard.Anal Biochem 107：220-39，1980；de Lean，A.， Munson，P.J.等人1988)。

为了测定结合常数，可按照Scatchard方法的改进方式制作 Scatchard饱和曲线并进行分析，描述见Bylund，D.B.，等人， ″Methods for Receptor Binding，″In H.I.Yamamura等人，eds.， Methods in Neurotransmitter Analysis，Raven Press，New York， 1990 pp.1-35。

为了试验获得特异性结合数值，用大范围示踪浓度的标记配体 (通常为，1-150pM)来获取总结合量，并且在极高浓度，例如100nM， 未标记配体存在的条件下，对双份试管重新测定获取非特异性结合 (NSM)。每一总结合数值减去后一数值得到的就是每一浓度标记配体的 特异性结合。

实施例10：Y受体结合试验

本发明潜能化合物的PYY激动活性的评估可以通过下述方法来进 行：对所述化合物与任何已知Y受体，例如Y1-Y6间的相互作用，或 者其与表达于细胞中的与PYY-优先受体(如Y7)类似的1个或多个单一 受体类别间的相互作用进行研究，并将该研究与PYY效力试验，例如 实施例1和2中的试验联合使用。这些细胞可以是内源性地表达目的Y 受体(如表达Y1受体的SK-N-MC细胞或者表达Y2受体的SK-N-BE2 细胞)或者也可以是用目的Y受体克隆转染后的其他细胞(如COS-7或 HEK293 cells)。下面以与SK-N-BE2细胞的结合为实例。

细胞培养

将SK-N-BE2细胞培养于例如150mm的培养皿中，所用的组织培 养基中加入添加成分(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，具有10％ 胎牛血清，4mM谷氨酰胺，100单位/mL青霉素以及100μg/mL链霉 素)培养条件为37℃，在5％CO2的湿润环境。对原始培养皿(Stock plates)进行胰蛋白酶消化，每3-4天将培养物1分为6。

膜的制备

将细胞从培养皿上刮入小体积的缓冲液中，例如磷酸盐缓冲的盐 水(138mM NaCl，8.1mM Na2PO4，2.5mM KCl，1.2mM KH2PO4，0.9mM CaCl2， 0.5mM MgCl2，pH7.4)，或者用胰蛋白酶消化，洗涤并重悬于缓冲液。 膜制备的起始步骤为在冰冷的温度下用例如Polytron组织匀浆器 (Brinkman Instruments，NY)将细胞短暂(10秒)匀浆。用上述实 施例9中的离心进一步制备膜。结合反应、检测及数据分析均按照实 施例9中所述的方法进行。

除本申请已给出以及已描述的实施方案外，本发明的各种改进本 领域普通技术人员可以从上述说明书中显而易见地得到，并且都落于 下列权利要求请求保护的范围之内。

                 相关申请的交互参考

本申请要求于2000年12月15日提交的序列号为No.60/256,216 的美国临时申请的优先权，该临时申请的题目为″用于治疗肥胖、糖尿 病及其他代谢性疾病的肽YY及肽YY激动剂″，在此通过引用将其内容 并入本文。

                           序列表

<110>Amylin Pharmaceuticals，Inc.

     Pittner，Richard

     Young，Andrew

     Paterniti，James

<120>用于治疗代谢疾病的肽YY及肽YY激动剂

<130>24001-100

<150>US 60/256,216

<151>2000-12-15

<160>6

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>36

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln

1               5                   10                  15

Met Ala Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Arg Tyr

        35

<210>2

<211>36

<212>PRT

<213>人

<400>2

Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu

1               5                   10                  15

Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>3

<211>34

<212>PRT

<213>人

<400>3

Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn

1               5                   10                  15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln

            20                  25                  30

Arg Tyr

<210>4

<211>36

<212>PRT

<213>人

<400>4

Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp

1               5                   10                  15

Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

            20                  25                  30

Arg Gln Arg Tyr

        35

<210>5

<211>34

<212>PRT

<213>人

<400>5

Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala

1               5                   10                  15

 Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln

             20                  25                  30

 Arg Tyr

 <210>6

 <211>15

 <212>PRT

 <213>人

 <400>6

 Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr

 1               5                   10                  15