转录因子诱饵
阅读：987发布：2022-01-10
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1.降低原核细胞活力的方法，所述方法包括：
(a)提供包含靶转录因子的结合位点的诱饵多核苷酸(诱饵序列)；
(b)将所述诱饵多核苷酸引入原核细胞，所述原核细胞包含与一或多个基因可操纵地连接的上述转录因子的识别位点；
其中所述诱饵多核苷酸的引入减少了所述靶转录因子与细胞中结合位点的结合，导致可操纵地连接的一或多个基因的表达被改变；
并且其中所述靶转录因子包含一或多个基因的表达调控因子，所述一或多个基因编码下述中的一或多个：
(i)细胞适应性反应；
(ii)细胞内在抗生素抗性机制；
(iii)细胞毒力因子；
(iv)细胞应激反应；或者
(v)细胞关键基因。
2.提高原核细胞抗生素敏感性的方法，所述方法包括：
(a)提供包含靶转录因子的结合位点的诱饵多核苷酸(诱饵序列)；
(b)将所述诱饵多核苷酸引入原核细胞，所述原核细胞包含与一或多个基因可操纵地连接的所述转录因子的结合位点；
其中所述诱饵多核苷酸的引入减少了所述靶转录因子与细胞中结合位点的结合，导致可操纵地连接的一或多个基因的表达被改变，从而提高该细胞的抗生素敏感性；
并且其中所述靶转录因子包含一或多个基因的表达调控因子，所述一或多个基因编码下述中的一或多个：
(i)细胞适应性反应；
(ii)细胞内在抗生素抗性机制；
(iii)细胞毒力因子；
(iv)细胞关键基因。
3.权利要求1或2的方法，其中降低活力包括下述中的一或多个：
(i)抑制细胞的适应性反应，比如应激反应；
(ii)提高细胞对抗生素的易感性；
(iii)抑制一或多个关键基因的表达；
(iv)抑制一或多个毒力基因的表达。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶转录因子选自：WhiB7、FadR、YycG/YycF、σ54(或SigA)、Fur、TcdR、Vfr、NtrC、ArsR、TcaA、AgrA、WalR、sigB、Ksig、fhu或者它们中任何一种的功能性变体或同源物。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述原核细胞是细菌。
6.权利要求5所述的方法，其中所述细菌是病原菌。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诱饵多核苷酸中的转录因子结合位点并未可操纵地连接基因。
8.包含靶转录因子结合位点的诱饵多核苷酸，其中所述结合位点并未与基因可操纵地连接，并且其中所述转录因子包含一或多个基因的表达调控因子，所述一或多个基因编码下述中的一或多个：：
(i)细胞适应性反应；
(ii)细胞内在抗生素抗性机制；
(iii)细胞毒力因子；
(iv)细胞应激反应；或者
(v)细胞关键基因。
9.权利要求8所述的诱饵多核苷酸，其中所述靶转录因子包含下述基因的表达调控因子：
(a)一或多个基因，其编码细胞外排泵蛋白，决定细胞壁组成、细胞壁密度或细胞壁代谢的蛋白；
(b)一或多个细胞应激反应基因；
(c)一或多个编码金属调控蛋白的基因；
(d)一或多个编码固氮蛋白的基因；
(e)一或多个编码致病蛋白或毒力因子的基因；
(f)一或多个关键基因。
10.权利要求8或9所述的诱饵多核苷酸，其中所述靶转录因子选自：WhiB7、FadR、YycG/YycF、σ54(或SigA)、Fur、TcdR、Vfr、NtrC、ArsR、TcaA、AgrA、WalR、sigB、Ksig或fhu或者它们中任何一种的功能性变体或同源物。
11.权利要求8-10中任一项所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸包含：环形双链DNA或线性寡核苷酸；和/或至少一个二级结构元件；和/或一个以上拷贝的转录因子结合位点；和/或结合位点的其他序列；和/或用于提高多核苷酸的核酸酶抗性的修饰过的碱基或糖；和/或质粒或质粒文库。
12.权利要求11所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸包含转录因子结合位点的多个直接重复。
13.权利要求11所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸包含多个转录因子结合位点。
14.权利要求11、12或13所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸包含含有至少一个5’胆固醇修饰的线性寡核苷酸。
15.权利要求11-14中任一项所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸包含环形哑铃。
16.权利要求11所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸包含质粒，所述质粒含有一或多个拷贝的包含陷阱序列的单体序列，所述陷阱序列包含转录因子结合位点，其中所述结合位点没有可操纵地连接基因。
17.前述权利要求中任一项所述的诱饵多核苷酸，其中所述诱饵多核苷酸中的转录因子结合位点包含SEQ ID NOS：25-60中的任一个，或者其保留了诱饵功能的变体或片段。
18.包含外源诱饵多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含没有可操纵地连接基因的靶转录因子结合位点；其中所述细胞包含可操纵地连接一或多个基因的转录因子结合位点；并且其中所述靶转录因子包含一或多个基因的表达调控因子，所述一或多个基因编码下述中的一或多个：
(i)细胞适应性反应；
(ii)细胞内在抗生素抗性机制；
(iii)细胞毒力因子；
(v)细胞关键基因。
19.权利要求18所述的细胞，其中所述诱饵多核苷酸为权利要求8-17中任一项所定义。
20.权利要求18或19所述的细胞，其中所述细胞是细菌性病原菌。
21.按照权利要求1-7中任一项所述方法制备的细胞。
22.治疗受试对象中细菌感染的方法，所述方法包括将权利要求8-17中任一项所述的诱饵多核苷酸，任选与一或多种抗生素和/或抗细菌剂组合进行给药。
23.权利要求8-17中任一项定义的诱饵多核苷酸用于治疗细菌感染。
24.权利要求8-17中任一项定义的诱饵多核苷酸在制备治疗细菌感染的药物中的用途。
25.诱饵多核苷酸或者权利要求23-24所述的用途，其中治疗细菌感染包括使用一或多种抗生素和/或其他抗细菌剂。
26.权利要求22-25中任一项所述的方法、诱饵多核苷酸或用途，其中治疗细菌感染包括治疗选择以下的状况：肺炎、菌血症、百日咳、莱姆病、布鲁氏菌病、急性肠炎、脓毒病(sepsis)、兔热病、流感、消化性溃疡病、军团病、淋病、医院内感染、脓毒症、立克次氏病、伤寒、痢疾、霍乱、鼠疫、炭疽病、假膜性结肠炎、白喉、李斯特氏菌病、结核、败血症(septicemia)。
27.杀死细菌、抑制细菌生长或者减弱细菌毒力的离体(ex vivo)方法，所述方法包括将权利要求8-17中任一项所述的诱饵多核苷酸，任选与一或多种抗生素和/或抗细菌剂组合施用。
28.药物组合物，包含权利要求8-17中任一项所述的诱饵多核苷酸和药物可接受赋形剂或载体，任选组合一或多种抗生素和/或抗细菌剂。
29.清洁组合物，包含权利要求8-17中任一项所述的诱饵多核苷酸，任选组合一或多种抗生素和/或抗细菌剂。
30.试剂盒，包含权利要求8-17中任一项所述的诱饵多核苷酸以及一或多种抗生素和/或抗细菌剂，其中所述诱饵以及一或多种抗生素和/或抗细菌剂联用于杀死细菌、抑制细菌生长或者减弱细菌毒力。
31.转录因子诱饵(TFDs)在降低原核细胞活力中的用途。
32.转录因子诱饵(TFDs)在降低原核细胞毒力中的用途。
33.包含SEQ ID NO：57的转录因子诱饵(TFD)。
34.包含SEQ ID NO：58的转录因子诱饵(TFD)。
35.包含SEQ ID NO：60的转录因子诱饵(TFD)。
36.权利要求33、34或35中任一项所述的转录因子诱饵在治疗细菌感染中的用途。
转录因子诱饵
[0002] 本申请与2008年10月3日提交的美国临时申请、2008年10月3日提交的国际专利申请PCT/GB2008/003353、2009年4月4日提交的美国临时申请61/167,592以及2009年4月4日提交的英国专利申请09069130相关，以上申请的内容均通过引用全文并入本文。
[0003] 控制细菌的生长和毒性在尤其是医学和兽医学应用中构成日益严重的问题，并且可能成为对公共健康的重大挑战。用于对抗病原菌的抗生素是本领域公知的。但这些抗生素的广泛使用导致出现对至少一种，某些情况中甚至是多种抗生素(所谓多重耐药菌株)有抗性的细菌。新发现和开发的传统抗生素数量下降进一步恶化了这一情况。抗生素抗性的确是抗菌研究面临的主要挑战，威胁到已经上市和那些还处于开发期的抗生素的药效。因此存在对能够用于解决细菌传播和感染的新抗菌剂的需求。
[0004] 作为一个例子，金黄色葡萄球菌是对全球健康的重要挑战，它能够引起多种人和动物疾病，严重程度涵盖从皮肤感染到由中毒性休克引起的致死脓毒症的广泛范围(Lowy，New Engl.J.Med.(1998)339：520-532)。据估计人类人口中20％在软组织感染中携带该菌，通常有不易察觉的临床特征，细菌由此进入体内感染血液，然后感染骨骼和心脏组织(Gordon and Lowy，Clin.Infect.Dis.(2008)40(S5)：S350-9)。虽然主要被认为是胞外病原菌，涌现大量证据表明金黄色葡萄球菌可以通过躲在胞内而避开抗菌作用或胞吞(Garzoni and Kelley，Trends Microbiol.(2009)17：59-65)，因此可能使它的治疗复杂化。自首次接触抗生素获得或者发展出抗性机制的程度使得目前临床上的多重耐药菌株非常普遍(Hawkey，J.Antimicrob.Chemother.(2008)62(S1)：i1-9)，而这进一步限制了治疗选择。
[0005] 金黄色葡萄球菌之所以是一个非常灵活的病原菌的几个原因在于：其拥有规避宿主免疫反应的机制(Foster，Nat.Rev.Microbiol.(2005)3：948-958)；可以产生各种毒力因子(Novick，Mol.Micro.(2003)48：1429-1449)；有分解代谢宿主组织的能力(Vojtov et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：10102-10107)以及能够容易地适应宿主体内的营养物缺乏和缺氧的环境(Haselbeck et al，Curr.Pharm.Des.(2002)8：1155-1172)。这些过程中很多是在转录水平调控，因此目前不是传统抗生素的针对目标(抗生素主要作用于细胞壁、蛋白或DNA合成)。
[0006] 通常化脓链球菌(Streptococcus pyogenes(A型链球菌：GAS))感染可以用许多不同抗生素进行治疗。早期治疗可能减少由侵袭性A型链球菌疾病造成的死亡的风险。但即使最好的医疗护理也不能杜绝所有病例不发生死亡。对于病情非常严重的患者，可能需要重症护理病房的支持性护理。对于有坏死性筋膜炎的人，经常需要手术来移除受损组织。已出现了抗大环内酯类抗生素的化脓链球菌菌株，但所有菌株仍统一地对青霉素敏感。
[0007] 世界范围内肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)对青霉素和其他β-内酰胺的抗性都在增强。主要的抗性机制涉及在编码青霉素结合蛋白的基因中引入了突变。选择压被认为在这其中发挥了重要的作用，而β-内酰胺类抗生素的使用也显示是感染和增殖的危险因素。肺炎链球菌能够引起肺炎、菌血症、中耳炎、脑膜炎、鼻窦炎、腹膜炎和关节炎。
[0008] 与青霉素抗性淋病一样，由肺炎链球菌(肺炎球菌)导致的青霉素抗性肺炎也是在1967年首次被发现。在金黄色葡萄球菌之外的青霉素替代品抗性也是已知的。至1993年，大肠杆菌已对5种氟喹诺酮类变体有抗性。结核分枝杆菌普遍抗异烟肼和利福平，有时对常规疗法都有抗性。表现出某些抗性的其他病原菌包括沙门氏菌、弯曲菌和链球菌。
[0009] 粪肠球菌(Enterococcus faecium)是医院中可见的另一种超级细菌。青霉素抗性的肠球菌发现于1983年，万古霉素抗性的肠球菌(VRE)发现于1987年，而利奈唑胺(Linezolid)抗性肠球菌(LRE)发现于90年代晚期。
[0010] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种及其普遍的机会病原菌。铜绿假单胞菌最令人担忧的特性之一是它的低抗生素敏感性。这种低敏感性得益于多重药物外排泵和染色体编码的抗生素抗性基因(例如mexAB-oprM、mexXY等)的联合作用以及细菌细胞被膜的低渗透率。除了内在的抗性，铜绿假单胞菌可以通过染色体上编码的基因的突变，或者抗生素抗性因子的水平基因传递而容易地发展出获得性抗性。铜绿假单胞菌分离株发展多重药物抗性需要几个不同的遗传事件，包括获得不同突变和/或生物素抗性基因的水平传递。高突变有利于选择产生慢性感染的铜绿假单胞菌菌株中的突变推动的抗生素抗性，而整合子中聚集多个不同抗生素抗性基因有利于抗生素抗性因子的共同获得。近年的一些研究显示与生物膜形成或者出现小菌落变体相关联的表型耐药可能对于铜绿假单胞菌群体对抗生素治疗的反应来说很重要(Cornelis P.(编辑)Pseudomonas：Genomics and Molecular Biology(1st ed.)(2008)Caister Academic Press)。
[0011] 艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)是在世界范围内医院中引起腹泻病的医院源性病原菌。据报道氯洁霉素(Clindamycin)抗性艰难梭状芽孢杆菌正是1989至1992年间造成纽约、亚利桑那、佛罗里达和麻省医院中腹泻病大爆发的致病菌(Johnson S.et al，New England Journal of Medicine(1999)341：1645-1651)。2005年北美也报道过地理上分散的抗氟喹诺酮类抗生素(比如环丙沙星(ciprofloxacin)和左氧氟沙星(levofloxacin))的艰难梭状芽孢杆菌爆发(Loo V.et al N.Engl.J.Med.(2005)353(23)：2442-9)。
[0012] 大肠杆菌和沙门氏菌直接来自被污染的食物。感染了大肠杆菌的肉中百分之八十的细菌耐一或多种药物，导致耐抗生素的膀胱感染(“HSUS Fact Sheet”)。沙门氏菌在1970年代首次在人中发现，某些病例中耐多达九种不同抗生素(“HSUS Fact Sheet”)。当这两种细菌传播时，会出现严重的健康状况。每年有许多人被感染后住院，有些甚至因此死亡。
[0013] 2004年11月5日，疾病预防与控制中心(CDC)报告为在伊拉克/科威特地区和阿富汗受伤的服役人员提供治疗的军事医疗设施中，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)血流感染病例增加。这些菌株多数表现出多重耐药性，其中几个分离株对检测的所有药物有抗性。
[0014] 基于DNA的疗法构成新型抗菌剂，这类抗菌剂被设计成作用于细菌活性或致病性的关键基因目标。这种疗法有潜力应用于多种病原菌，并且可以预计通过靶位点突变产生对这些疗法的抗性是可能性很小的事件。此外，这类制剂具备的优点有开发时间可能更快和同时作用于多个新的无抗性目标。
[0015] 基于DNA的疗法有潜力克服现有疗法的局限性，因为可以设计这些疗法使它们通过防止抗生素抗性机制的表达或者通过下调必要或适应性基因来抑制生长，从而可能治疗任何病原菌。此外，细菌不可能发展出对这些制剂的抗性，因为这种抗性将需要影响转录因子及其相应结合位点的同时突变。对于调控多个必要基因的制剂尤其是这样。
[0016] 转录因子诱饵(Transcription Factor Decoys，TFD)是一种这样的基于DNA的疗法。诱饵寡核苷酸被设计为模拟转录因子的结合位点并能防止转录因子与其相应基因组靶点结合，因此使基因表达得以改变(Mann and Dzau，J.Clin.Investigation(2000)106：1071-1075)。
[0017] 转录因子诱饵的用途主要已在真核系统中进行了展示，它们作为新型治疗剂的潜力刺激了其在真核系统中的发展(Mann & Dzau(2000))。为了这一目的，诱饵寡核苷酸被用来展示了转录因子EF2抑制大鼠中平滑肌的增殖(Morishita et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)95：5855-5859)；阻断STAT3介导的癌变增殖(Leong et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)100：4138-4143)；以及靶向cAMP应答元件可以控制体内癌症增殖(Park et al，J.Biol.Chem.(1999)274：1573-1580)。
[0018] TFD比其他基于DNA的疗法有明显的优势。它们的作用机制非常简单-通过用大量拷贝的特异结合序列(因此名词称为“诱饵”)淹没细胞来捕获转录因子，防止转录因子与启动子结合，TFD由此可以控制基因表达。这与反义策略不同，在反义策略中由于mRNA二级结构复杂，很难界定靶分子。与反义方法相比，TFD还有作用迅速、防止基因表达的优点，而反义方法着手于表达的结果。因此，TFD在低得多的浓度即有效，因为单个TFD-转录因子相互作用可以阻断单个基因的转录，否则该基因就可以产生几千拷贝的mRNA，后者构成反义方法的靶分子。
[0019] 据发明人所知，已有两份关于诱饵在真核细胞中使用的报道。第一份中，富含AT的诱饵寡核苷酸(被设计用于模拟核糖1，5，-二磷酸羧化酶/加氧酶(rbc)基因启动子中富含AT的元件)被用于改变蓝细菌中CO2对rbc基因表达的调控(Onizuka et al，FEBS Lett.(2003)542：42-46)。
[0020] 第二份报道中，诱饵寡核苷酸被用于鉴定天蓝色链霉菌(S.coelicolor)A3的actII-orf4启动子中的新顺式调控序列(2)，所述基因编码产生抗生素放线菌紫素的途径特异激活子(McArthur and Bibb，PNAS(2008)105：1020-1025)。
[0021] 本发明就是在这一背景下进行了改进。
[0022] 为了改变细胞活性，发明人使用了TFD技术来打断原核细胞的细胞途径、应答和抗性机制的调控。例如方法可以用于改变一或多种抗生素抗性表现型、细胞对环境条件的适应反应、细胞毒性和细胞基本代谢。因此，发明人提供了治疗细菌感染和限制细菌生长的手段。
[0023] 根据一方面，本发明在于利用转录因子诱饵(TFDs)减弱原核细胞的活力。
[0024] 具体来说，本发明包括减弱原核细胞活力的方法，所述方法包括：
[0025] (a)提供包含靶转录因子的结合位点的诱饵多核苷酸(诱饵序列)；
[0026] (b)将诱饵多核苷酸引入原核细胞，所述原核细胞包含与基因可操纵地连接的转录因子识别位点；
[0027] 其中诱饵多核苷酸的引入减少了细胞中靶转录因子与结合位点的结合，导致可操纵地连接的基因的表达被改变；其中所述靶转录因子包含基因的表达调控因子，所述基因编码下述中的一或多个：
[0028] (i)细胞适应性反应；
[0029] (ii)细胞内在抗生素抗性机制；
[0030] (iii)细胞毒力因子；
[0031] (iv)细胞应激反应；或者
[0032] (v)细胞关键基因。
[0033] 另一方面，本发明提供了：
[0034] -提高原核细胞抗生素敏感性的方法，所述方法包括：
[0035] (a)提供包含靶转录因子的结合位点的诱饵多核苷酸(诱饵序列)；
[0036] (b)将诱饵多核苷酸引入原核细胞，所述原核细胞包含与基因可操纵地连接的转录因子识别位点；
[0037] 其中诱饵多核苷酸的引入减少了细胞中靶转录因子与结合位点的结合，导致可操纵地连接的基因的表达被改变，从而提高细胞的抗生素敏感性；其中所述靶转录因子包含基因的表达调控因子，所述基因编码下述中的一或多个：
[0038] (i)细胞适应性反应；
[0039] (ii)细胞内在抗生素抗性机制；
[0040] (iii)细胞毒力因子；
[0041] (iv)细胞应激反应；
[0042] (v)细胞关键基因。
[0043] 发明还提供了：
[0044] -包含靶转录因子的结合位点的诱饵多核苷酸，其中所述结合位点没有可操纵地连接基因，并且其中所述转录因子包含基因的表达调控因子，所述基因编码下述中的一或多个：
[0045] (i)细胞适应性反应；
[0046] (ii)细胞内在抗生素抗性机制；
[0047] (iii)细胞毒力因子；
[0048] (iv)细胞应激反应；
[0049] (v)细胞关键基因。
[0050] 靶转录因子可以选自：WhiB7(SEQ ID NOs：5 & 9)、FabB(SEQ ID NO：6)、LytM(SEQ ID NO：7)、Ssa(SEQ ID NO：8)、FadR(SEQ ID NO：10)、YycG/YycF(SEQ ID NOs：11 & 12)、σ54(或SigA)(SEQ ID NOs：13 & 14)、Fur(SEQ ID NOs：15、16 & 17)、TcdR(SEQ ID NO：18)、Vfr(SEQ ID NOs：19、20 & 21)、NtrC(SEQ ID NO：22)、ArsR(SEQ ID NOs：23 & 24)、TcaA(SEQ ID NO：25)、AgrA(SEQ ID NOs：26 & 27)、WalR(SEQ ID NOs：44、45、48、49 & 57)、sigB(SEQ ID NO：58)或Ksig(SEQ ID NOs：59 & 60)；或者任何一种的功能变体或同源物。
[0051] 发明还提供了如上所述的诱饵多核苷酸，其包含一个以上的靶转录因子的一个以上的结合位点。
[0052] -包含外源诱饵多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含没有可操纵地连接基因的靶转录因子的结合位点；其中所述细胞包含可操纵地连接基因的转录因子的结合位点；并且其中所述靶转录因子包含基因的表达调控因子，所述基因编码下述中的一或多个：
[0053] (i)细胞适应性反应；
[0054] (ii)细胞内在抗生素抗性机制；
[0055] (iii)细胞毒力因子；
[0056] (iv)细胞应激反应；
[0057] (v)细胞关键基因。
[0058] -治疗受试对象中细菌感染的方法，所述方法包括将本发明的诱饵多核苷酸，任选与一或多种抗生素和/或抗细菌剂组合进行给药。
[0059] -杀死细菌、抑制细菌生长或者减轻细菌毒力的离体(ex vivo)方法，所述方法包括将本发明的诱饵多核苷酸，任选与一或多种抗生素和/或抗细菌剂组合施用。
[0060] -药物组合物，所述组合物包含本发明的诱饵多核苷酸和药物可接受赋形剂或载体，任选组合一或多种抗生素和/或抗细菌剂。
[0061] -包含本发明的诱饵多核苷酸的消毒组合物，任选组合一或多种抗生素和/或抗细菌剂。
[0062] -包含本发明的诱饵多核苷酸的清洁组合物，任选组合一或多种抗生素和/或抗细菌剂。
[0064] -减弱原核细胞毒力的方法，所述方法包括：
[0065] (a)提供包含靶转录因子的识别位点的诱饵多核苷酸；
[0066] (b)将诱饵多核苷酸引入原核细胞，所述原核细胞包含与基因可操纵地连接的转录因子识别位点；
[0067] 其中诱饵多核苷酸的引入减少了细胞中靶转录因子与结合位点的结合，导致可操纵地连接的基因的表达被改变，从而减弱细胞毒力；并且其中所述靶转录因子包含基因的表达调控因子，所述基因编码下述中的一或多个：
[0068] (i)细胞适应性反应；
[0069] (ii)细胞内在抗生素抗性机制；
[0070] (iii)细胞毒力因子；
[0071] (v)细胞关键基因。
[0072] -包含靶转录因子的结合位点的诱饵多核苷酸，其中所述结合位点具有SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60所示的序列。
[0073] -包含SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60序列的诱饵多核苷酸在治疗细菌感染中的用途。
[0074] 一般来说，转录因子诱饵(TFD)序列(或诱饵序列)包含转录因子结合位点，所述结合位点包含细胞中的天然或内源顺式调控序列或者与之竞争结合细胞中的相应转录因子。(通过本文描述的方法或者其他方法)被引入包含所述顺式调控序列的合适宿主细胞时，诱饵序列与细胞内的顺式调控序列竞争结合相应的转录因子。这种竞争减少了转录因子与细胞内的顺式调控序列的结合，使得那些由转录因子与顺式调控序列的结合来调控表达的基因的表达被改变。用于本文的诱饵功能是指序列与顺式调控序列以这种方式竞争结合相应转录因子的能力。
[0075] 顺式调控序列或元件通常是指存在于基因的转录起始位点上游(5’)或下游(3’)，并行使调节基因表达之功能的核苷酸序列。一般来说，顺式调控序列包含蛋白质(转录因子)的结合位点，并且所述蛋白的结合能够调控给定基因的转录。蛋白质与序列的结合直接或间接导致基因表达的调整。例如，结合了的蛋白质可能与结合在附近区域的转录所需的另一个蛋白质相互作用，将后者锚定在正确位置；或者可能抑制转录所需的另一个蛋白质的结合。一般顺式调控序列或元件出现在基因的启动子区，但原核细胞中顺式调控序列位于受它们影响的基因的上游或下游几百碱基对处也并不罕见。
[0076] 顺式调控序列可能是抑制性的(结合了转录因子后抑制或减少基因的转录)或者活化性的(结合了转录因子后激活或增加基因的转录)。因此与顺式调控序列结合的转录因子可能是阴性效应物(阻遏蛋白)或者阳性效应物(激活蛋白)。
[0077] 诱饵多核苷酸或诱饵序列的靶序列是指与其竞争结合转录因子的细胞转录因子结合位点。类似地，靶调控蛋白是指诱饵序列要结合的转录因子。诱饵序列的靶基因是指与细胞转录因子结合位点可操纵地连接的基因。因此诱饵系统打断靶基因表达所受到的调控。
[0078] 发明人利用诱饵改变了原核细胞表现型，特别是与细菌致病性相关的表现型，并用于解决细菌感染。具体来说，为了使细胞对被杀死或生长抑制更易感，和/或不利条件下存活能力下降，和/或毒力更弱，发明人利用诱饵打断细胞途径、应答和抗性机制的表达。
[0079] 一方面，为了使例如常见条件下细胞活性较低，所述方法打断基因的表达。例如，可能因为对抗生素的易感性增加、应激反应受损、毒性反应受损和/或必要基因表达被打断，细胞变得活性较低。本方法可以利用诱饵来减弱细胞防御或存活系统和/或毒性系统。所述方法可能使细胞对细胞死亡和/或抑制生长或致病性更易感。因此，一个方面中，所述诱饵可能产生杀菌或抑菌效果。
[0080] 例如，一个方面中，发明人利用诱饵改变了原核细胞，特别是细菌，尤其是病原细菌的抗生素易感性表现型。一个方面中，易感性的增加不是一种抗生素或一类抗生素特异的。一个方面中，易感性的增加不是任何一种抗生素或一类抗生素结构和/或机制特异的。一个方面中，对广泛的抗生素或抗生素类型的敏感性获得了提高。
[0081] 一个方面中，易感性的增加不是选自以下的任何一种或一类抗生素特异的：氨基糖苷类(比如卡那霉素)、碳青霉烯类(比如美罗培南(meropenem))、头孢菌素类(比如头孢吡肟(cefepime))、糖肽(比如万古霉素和达托霉素(daptomycin))、青霉素类(比如氨苄西林、羧苄西林和盘尼西林)、多肽抗生素(比如多粘菌素B)、喹啉(比如levaquin)、磺胺类(比如复方新诺明(Bactrim))、四环素类(比如四环素)、以及各种氯霉素、利福平(rifampicin)、斯沃(Zyvox)。
[0083] 总的来说，所述方法提供了针对细菌感染和相关疾病的新手段。这可以通过强化抗生素的效果，或者通过对细菌的直接抑制效果(例如抑制生长或存活、抑制毒力因子的表达、抑制必要基因的表达)。因此，TFD可以自身作为抗生素或抗细菌剂。一个方面中，方法利用诱饵打断决定细胞活力的基因的表达。
[0084] 如上所述，本方法利用诱饵打断细胞途径、反应和抗性机制的调控。某些情况中，这涉及全局性调节分子的靶向结合。靶基因可以是应答抗生素调节的那些基因。
[0085] 靶分子可以包括内在抗生素抗性机制的调节因子，所述抗性机制包括内在多重药物耐药性机制。内在机制可能提供对药物(比如抗生素)的物理屏障，例如通过提高抗生素从细胞清理出去的速率或者通过降低细胞壁的穿透性或渗透性。内在机制可以提供对已进入细胞质的抗生素的抗性。内在抗性机制可能在应答环境条件时被诱导，例如文中列出的胁迫或其他条件。某些情况中，编码内在抗性机制的基因的表达受到抗生素反应的调节。例如，这些可以是编码具有生理作用的蛋白质的基因，所述基因的表达应答抗生素时差别调节。编码参与内在抗性的蛋白质的基因可能编码例如外排泵、或者决定细胞壁组成或密度或细胞壁代谢的蛋白质。一个方面中，靶基因编码的抗性机制就例如抗生素结构或机制来说，不是一种或一类抗生素特异的。
[0086] 靶分子可以包括细胞适应性反应的调控因子。通常这些是对环境条件，例如不利环境条件的适应性反应。例如，这些包括应激反应，比如氧化应激反应或者过氧化物应激反应、对营养缺乏(例如氮限制)的反应、对毒素，例如金属毒素(比如高铁条件)的反应、对高酸度(低pH)条件的反应。因此靶分子可能包括应激反应基因的调控因子、金属调控蛋白以及固氮基因的调控因子。
[0087] 细胞适应性基因是这样一些基因，这些基因的表达由环境因素决定，并且影响细菌在该环境下存活和引起疾病的能力。例如，细菌可能需要通过诱导基因来适应宿主体内的低铁浓度，所述基因表达能够摄取铁并将铁带入细胞的蛋白质。还包括生物膜的形成、细胞壁生理特性和初级代谢的变化。
[0088] 应激反应基因构成细胞适应性基因的一个类型。它们是数量有限的几组基因，它们中的全部或某些在应答多种胁迫时被诱导。所述胁迫可以包括物理因素(温度变化、酸度、低氧)、生物因素(应答宿主或其他细菌)以及化学因素(比如用抗生素进行的治疗)。
[0089] 还包括的有对生理条件的反应。因此靶分子可能包括致病基因或毒力因子(比如毒素)表达的调控因子。靶分子还包括决定生物膜形成和营养(例如铁)清除的蛋白质的调控因子。
[0090] 毒力因子基因是这样一些基因，这些基因控制细菌产生特定分子，比如毒素；或者引发宿主的反应，影响细菌存活和导致疾病的能力。
[0091] 靶分子还包括必要基因的调控因子。所述必要基因是那些它们的表达为细胞在常见环境条件下存活所必需的基因。例如，靶分子可以是编码DNA复制、初级代谢途径、脂肪酸合成或细胞分裂所需蛋白质的基因的调控因子。
[0092] 必要基因是细菌在任何环境下存活所必需的基因。
[0093] 以上描述的系统经常在细胞内有重叠。因此一个调控蛋白可能调控编码毒力因子的基因的表达以及应对环境胁迫反应的细胞壁代谢。另一个例子中，调控蛋白可能控制特定环境条件(例如营养缺乏)下对细胞关键的基因的表达。
[0094] 一个方面中，本方法可以靶向这样的基因，所述基因的表达调控决定细胞在有抗生素存在的情况(例如有一种以上或者一类以上抗生素)下存活的能力。
[0095] 抗生素抗性基因的实例在同时待审的申请PCT/GB2008/003353中有公开。为了改变，例如增强抗生素抗性，可以将如本文描述的诱饵用于靶向PCT/GB2008/003353所述任意一种或多种基因，所述基因编码β-内酰胺、外排泵(例如图1所示的那些)、氨基糖苷修饰酶或ermB基因。的确，诱饵可以含有两个或两个以上序列要作用于一个以上的基因或转录因子和/或一种以上的细菌菌株。例如，诱饵可以包含来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的Sig结合位点。
[0096] TFDs可以用于治疗发生在人体内任何部位的多种细菌感染。可以描述的有五种普通的细菌感染区域。呼吸道感染是最常见的一种，上呼吸道感染包括可以用局部施药或气溶胶制品治疗的耳、喉和鼻窦。下呼吸道感染包括肺炎，后者是由多种细菌病原菌、支气管炎和囊性纤维化的感染性并发症导致的。社区和医院诊所的一个常见问题是尿道感染，该病中尿液被感染，抗细菌剂需要进入膀胱、前列腺、输尿管和肾。肠易被感染(例如胃肠道感染)，其中细菌通过侵入粘膜或者产生毒素引起疾病，实例包括霍乱流行，以及当口服或静脉内施用抗生素时。皮肤和软组织感染通常可以通过局部施药治疗，在创伤性损伤或烧伤后很常见，这使得微生物能够定居和内移，造成局部化的或者快速通过组织扩散的感染。造成皮肤感染的微生物经常来自正常的皮肤菌群，比如化脓链球菌导致浅表皮肤感染(脓疱病)、蜂窝组织炎(更深层的感染，可能扩散到血液)和坏死性筋膜炎(进展迅速的感染，经常会危及生命)。最后中枢神经系统的感染，比如细菌性脑膜炎，可能是最不容易治疗的，因为治疗剂必需象病原细菌一样透过血脑屏障。
[0097] 可以按照同时待审的申请PCT/GB2008/003353所述制备和测试诱饵。
[0098] 考虑到本方法时，以上方面中的一个或多个可以进行组合。
[0099] 本方法利用诱饵多核苷酸打断原核细胞中的基因表达。诱饵多核苷酸包含转录因子结合位点(诱饵序列)。通常在本方法中，诱饵多核苷酸被引入靶细胞，所述细胞包含与顺式调控序列可操纵地连接的基因，所述顺式调控序列中含有转录因子的结合位点。多核苷酸将转录因子从细胞结合位点抢夺下来(titrates)，打断对细胞中所述可操纵地连接基因的表达的调控。基因表达的改变导致细胞表现型的变化。
[0100] 利用本方法(包括本文和同时待审的申请PCT/GB2008/003353所述)可以寻靶转录因子和基因。具体实例包括图2中也列出的以下调控因子和调控序列。
[0101] 提到每个特定调控因子包括所列举的物种中的该调控因子及其任何物种的同源物。每个目标有天然结合位点和/或共有结合序列。靶向调控因子的诱饵序列可以包含存在的天然序列或共有序列或者它们的具有文所述诱饵功能的变体或片段，例如另一物种中的天然结合位点。检测变体序列的诱饵功能的方法在同时待审的申请PCT/GB2008/003353中有描述。正如下文列举的，靶向特定调控因子的诱饵尤其适合在有该调控因子的原核细胞中使用。以下还给每个调控因子列举了靶向该调控因子的诱饵的用途实例，例如在用诱饵处理后，细胞通常变得对其更易感的抗生素。
[0102] 本文提供的序列显示了结合位点的单条链。但是，应当明白自然界中和本发明的TFDs中的序列是双链的。文中列出的序列的互补链可以根据例如Molecular ClOning：A rdLaboratory Manual(3 Edition)，2001 by Joseph Sambrook and David Russell清楚容易地推断。
[0103] WhiB7
[0104] WhiB7是包括分枝杆菌(例如耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和结核分枝杆菌)和链霉菌的放线菌中抗生素抗性基因的转录调控因子(Nguyen et al，Trends in Microbiology(2006)14：304-312)。
[0105] 耻垢分枝杆菌菌株MC2155中的天然WhiB7结合位点包含：
[0106] 5’-CACCAGCCGA AAAGGCCACG GACCCGCAGT CACCCGGATC CGTGGCCATT TTTGTCGGAC CCCCCGAGAA ATCTGGTCGC AGGATCCATC AGCTCAGACA GATCAC-3’(SEQ ID NO：9)
[0107] 基因座 CP000480 6988209bp DNA环形BCT 12-DEC-2006
[0108] 定义 耻垢分枝杆菌菌株MC2 155，完整基因组。
[0109] 登录号 CP000480
[0110] 版本 CP000480.1 GI：118168627
[0111] 坐标 20313637-2031742
[0112] 用途：提高多种亲水/疏水抗生素的效力，所述抗生素包括大环内酯类、林可酰胺类、氯霉素、亚胺培南、普那霉素(pristinamycin)、利福平、链霉素、壮观霉素、四环素、异烟肼、乙胺丁醇。
[0113] WhiB7 TFD序列的一个实例包含：
[0114] WhiB7 TFD 5’TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3’[0115] (SEQ ID NO：5；实施例2)
[0116] FadR
[0117] FadR是大肠杆菌中脂肪酸合成关键途径的基因(包括fabA和fabB)(Campbell & Cronan，J.Bacteriology(2001)183：5982-5990)
[0118] 大肠杆菌K12中的天然FadR结合位点包含序列：
[0119] 5’AGTAAGTTTC GAATGCACAA TAGCGTACAC TTGTACGCCG AACAAGTCCG ATCAGCCATT TAA-3’(SEQ ID NO：10)
[0120] 基因座 CP000948 4686137bp DNA 环形BCT 05-JUN-2008
[0121] 定义 大肠杆菌菌株K12亚菌株DH10B，完整基因座
[0122] 登录号 CP000948
[0123] 版本 CP000948.1 GI：169887498
[0124] 坐标 2531419-2531481
[0125] 用途：提高任何针对脂肪酸合成的抗生素的效力，所述抗生素比如平板霉素(platensimycin)、平板素(platnecin)衍生物、茎点霉联烯酸(phomallenic acid)、紫堇块茎碱(corytuberine)、环砜、邻氨基苯甲酸衍生物、cerulenic acid。
[0126] FadR TFD序列的一个实例包含
[0127] FabB TFD 5’TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3’.
[0128] (SEQ ID NO：6；实施例3)
[0129] YycG/YycF
[0130] YycG/YycF是低G+C革兰氏阳性细菌中的双组分调节因子，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。YycG/YycF已知是至少12种基因的关键调控因子，所述基因包括LytM和SsaA，以及参与毒性决定和细胞壁合成的基因(Dubrac & Msadek，Journal of Bacteriology(2004)186：1175-1181)。
[0131] 金黄色葡萄球菌中YycF和YycG的天然结合位点(位于LytM和Ssa启动子)包含：
[0132] YycF_LytM
[0133] 5’-GCTATTTTGTAATGACAATGTAATGAGTTTAGTAAAAA-3’(SEQ ID NO：11)
[0134] 基因座 CP000730 2872915bp DNA 环形BCT 16-NOV-2007
[0135] 定义 金黄色葡萄球菌金黄亚种USA300_TCH1516，完整基因座。
[0136] 登录号 CP000730
[0137] 版本 CP000730.1 GI：160367075
[0138] 坐标 322073-322109
[0139] YycF SsaA
[0140] 5’-ATTACAAATTTGTAACAGACTTATTTTA-3’(SEQ ID NO：12)
[0141] 基因座 CP000730 2872915bp DNA 环形BCT 16-NOV-2007
[0142] 定义 金黄色葡萄球菌金黄亚种USA300_TCH1516，完整基因座。
[0143] 登录号 CP000730
[0144] 版本 CP000730.1 GI：160367075
[0145] 坐标 2415067-2415093
[0146] 用途：提高大环内酯类-林可酰胺类-链阳性菌素B类(macrolide-lincosamide-streptogramin B)(MLSB)抗生素的效力。
[0147] YycG/YycF TFD序列的实例包括：
[0148] LytM TFD 5’GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAAAA3’[0149] SsaA TFD 5’ATT ACAAAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A 3’.
[0150] (SEQ ID NOs 7 & 8；实施例4)
[0151] σ54或SigB
[0152] σ54或SigB是适应性反应的主要调控因子，发生在大约60％细菌中，所述细菌包括耻垢分枝杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(Wigneshweraraj，Molecular Microbiology(2008)68：538-546)。
[0153] 金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的天然结合位点包含：
[0154] SA_sig
[0155] 5’-TTATTATATA CCCATCGAAA TAATTTCTAA TCTTC-3’(SEQ ID NO：13)
[0156] 基因座 CP000730 2872915bp DNA 环形BCT 16-NOV-2007
[0157] 定义 金黄色葡萄球菌金黄亚种USA300_TCH1516，完整基因座
[0158] 登录号 CP000730
[0159] 版本 CP000730.1 GI：160367075
[0160] 坐标 2187051-2187017
[0161] KP_sig
[0162] 5’-CCGATAAGGG CGCACGGTTT GCATGGTTAT-3’(SEQ ID NO：14)
[0163] 基因座 X133032 4206bp DNA 线性 BCT 18-APR-2005
[0164] 定义 肺炎克雷伯氏菌nif基因簇DNA
[0165] 登录号 X13303
[0166] 版本 X13303.1 GI：43820
[0167] 坐标 18301-18330
[0168] 用途：提高例如本文描述的杀菌和抑菌性抗生素的效力。
[0169] Fur
[0170] Fur调控最初被描述为对铁调节很重要，但逐渐认识到它参与其他适应性途径，最显著的是金属调节(Zn-Zur)还决定对过氧化物酶的抗性(Per)。Fur调控至少发生在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、枯草芽孢杆菌(Fur，PerR，Zur，MntR)(Horsburgh 2001、Lavarr 2003和Delany 2001)中。
[0171] 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中结合Fur的共有序列包含：
[0172] SA_fur
[0173] 5’-ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TT-3’(SEQ ID NO：15)[0174] 如Horsburgh，J.Bacteriology(2001)183：468所述共有序列(‘Fur BOX’)。
[0175] EC_fur
[0176] 5’-GATAATGATAATCATTATC-3’(SEQ ID NO：16)
[0177] 如de Lorenzo，J.Mol.Biol.(1998)283：537所述共有序列。
[0178] 幽门螺杆菌中的天然结合序列包含：
[0179] HP_fur
[0180] 5’-GTT GTC CCA TAA TTA TAG CAT AAA TGA TAA TGA AAA AGT AAA-3’(SEQ ID NO：17)
[0181] 基因座 CP001072 1608548bp DNA 环形BCT 12-JUN-2008
[0182] 定义 幽门螺杆菌Shi470，完整基因座.
[0183] 登录号 CP001072
[0184] 版本 CP001072.2 GI：189491895
[0185] 坐标 691415-691374
[0186] 用途：总体上提高抗生素(可能诱导胁迫，杀菌)的效力。Fur诱饵可以在没有抗生素的情况下，用于干扰应激反应机制和环境适应。
[0187] TcdR
[0188] TcdR是能够自身调节并调控决定毒力的两种主要外毒素的表达的选择性σ因子。已知TcdR调控发生在艰难梭状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌(C.botulinium)(其中同源物是BotR)、破伤风梭状芽孢杆菌(C.tetani)(TetR)和产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringenns)(UviA)(Matamourous，Molecular Microbiology(2007)64：1274-1288)中。
[0189] 艰难梭状芽孢杆菌中的共有结合位点包含：
[0190] TcdR
[0191] 5’-AAG TTT ACA AAA TTA TAT TAG AAT AAC TTT TTT A TT-3’(SEQ ID NO：18)[0192] 共有序列(TcdR，其中-35和-10盒带有下划线)如Dupuy，Mol.Micro.(2006)55：1196中所描述。
[0193] 用途：提高许多抗生素，最显著的是那些具有抑菌性能的抗生素的效力。
[0194] Vfr
[0195] Vfr是铜绿假单胞菌和大肠杆菌中毒力因子的全局调控因子(Kanack，Microbiology(2006)152：3485-3496)。大肠杆菌同源物是CRP，其结合位点发生在toxA基因的启动子和regA基因的启动子P1内。
[0196] 铜绿假单胞菌中的共有序列和两个天然结合位点是：
[0197] PA_Vfr
[0198] 5’-AAA TGT GAT CTA GAT CAC ATT T-3’(SEQ ID NO：19)
[0199] 共有序列如Kanack，Microbiol.(2006)55：1196中所描述的.
[0200] PA_ToxA
[0201] 5’-CACTCTGCAA TCCAGTTCAT AAATCC-3’(SEQ ID NO：20)
[0202] 基因座 EU595736 26bp DNA 线性 BCT 15-JUN-2008
[0203] 定义 铜绿假单胞菌菌株PACS458克隆fa1366，完整序列。
[0204] 登录号 EU595736 REGION：10145..10170
[0205] 版本 EU595736.1 GI：187939551
[0206] 坐标 10145-10170
[0207] PA_RegA
[0208] 5’-GTAACAGCGGAACCACTGCACAG-3’(SEQ ID NO：21)
[0209] 基因座 EU595736 26bp DNA 线性 BCT 15-JUN-2008
[0210] 定义 铜绿假单胞菌株PACS458克隆fa1366，完整序列
[0211] 登录号 EU595736 REGION：10145..10170
[0212] 版本 EU595736.1 GI：187939551
[0213] 坐标 312-334
[0214] 抗生素：可以在没有抗生素的情况下，利用诱饵控制决定铜绿假单胞菌和大肠杆菌的毒力的基因的表达。诱饵可以用于提高抗生素，最显著的是具有抑菌性能的抗生素的效力。
[0215] NtrC
[0216] NtrC是必要基因glnA的调控因子，该基因在至少肺炎克雷伯氏菌中是环境适应性所必需的(Minchin et al，The EMBO Journal(1989)8：3491-3499)。
[0217] 肺炎克雷伯氏菌的天然结合位点包含：
[0218] KP_NtrC
[0219] 5’-GCTTTGCACTACCGCGGCCCATCCCTGCCCCAAAACGATCGCT-3’(SEQ ID NO：22)[0220] 基因座 X13303 24206bp DNA 线性BCT 18-APR-2005
[0221] 定义 肺炎克雷伯氏菌nif基因簇DNA。
[0222] 登录号 X13303
[0223] 版本 X13303.1 GI：43820
[0224] 坐标 18159-18201
[0225] 用途：可以在没有抗生素的情况下，用诱饵干扰必要基因glnA的表达，该基因是环境适应性所必需的；或者诱饵与可能诱发胁迫(杀菌)的抗生素组合。
[0226] ArsR
[0227] ArsR是在至少幽门螺杆菌、猎豹螺杆菌(H.acinonychis)和猫螺杆菌(H.felis)中编码酸适应的基因的调控因子(Pflock et al，J.Bacteriology(2006)188：3449-3462)。如Pflock et al中的描述，结合位点存在于amiE启动子和rocF启动子内。
[0228] 天然结合序列的实例包括：
[0229] HP_AmiE
[0230] 5’-ATAATCATAA TGATTAAAGT TTTCATATTC ATTATAAATC CGTTTACACAATTATT-3’(SEQ ID NO：23)
[0231] 基因座 AE000511 56bp DNA 线性 BCT 27-DEC-2005
[0232] 定义 幽门螺杆菌26695，完整基因组。
[0233] 登录号 AE000511 REGION：310910..310965
[0234] 版本 AE000511.1 GI：6626253
[0235] 坐标 310910-310965
[0236] HP_RocF
[0237] 5’-GAAATTGTTC TATTTATTAT CCATTTGCTT ATTAATAATT GGTTGTTAAT TTTGGTTTAG A-3’(SEQ ID NO：24)
[0238] 基因座 AE000511 61bp DNA 线性 BCT 27-DEC-2005
[0239] 定义 幽门螺杆菌26695，完整基因组。
[0240] 登录号 AE000511 REGION：1459830..1459890
[0241] 版本 AE000511.1 GI：6626253
[0242] 坐标 1459830-1459890
[0243] 用途：可单独使用诱饵干扰介导铁摄取的必要基因的表达，所述基因是环境适应所必需的；或者将诱饵与一般会诱导胁迫(杀菌)的抗生素组合使用。
[0244] 糖肽抗性共有序列(GISA)
[0245] 通过对开放芯片数据进行生物信息学分析确定共有序列。将糖肽抗性菌株与其亲代，以及同一抗性株与回复突变体进行比较时，在显示被上调的基因中发现了基序(Scherl，BMC Genomics(2006)7：296)。在17/22启动子发现含有共有序列。
[0246] 在tcaA(已知的毒力阳性调控因子)的启动子中发现的一例共有序列可以用于诱饵(Maki，Antimicrobial Agents Chemother.(2004)48：1953)(参见下文)。
[0247] SA_TcaA
[0248] 5’-TGAACACCTTCTTTTTA-3’(SEQ ID NO：25)
[0249] 基因座 CP000730 2872915bp DNA 环形 BCT 16-NOV-2007
[0250] 定义 金黄色葡萄球菌金黄亚种USA300_TCH1516，完整基因组.
[0251] 登录号 CP000730
[0252] 版本 CP000730.1 GI：160367075
[0253] 坐标 2476452-2476436
[0254] 共有序列至少存在于金黄色葡萄球菌。靶向该序列的诱饵可以用于寻靶与天然启动子中该序列结合的任何调控蛋白。一般通过结合天然序列受到调控的基因导致糖肽抗性和/或毒性。
[0255] 用途：诱饵可以用于提高糖肽类抗生素的效力。
[0256] AgrA
[0257] 通过对开放芯片数据进行生物信息学分析确定共有序列。在显示受到和毒性相关的调控因子Agr阳性调控的基因中发现了基序(Dunman，J.Bacteriol.(2001)183：7341)。
[0258] 发现公认基序发生在两个启动子中，这两个启动子被认为可能参与决定致病性(SA2093(AraC样转录调控因子上游)和SA1269(Blt样基因))。
[0259] SA_Agr_2093
[0260] 5’-AGAAAG ACAAAC AGG AGT AA-3’(SEQ ID NO：26)
[0261] 基因座 CP000730 2872915bp DNA 环形BCT 16-NOV-2007
[0262] 定义 金黄色葡萄球菌金黄亚种USA300_TCH1516，完整基因组。
[0263] 登录号 CP000730
[0264] 版本 CP000730.1 GI：160367075
[0265] 坐标 2414790-2414771
[0266] SA_Agr_1269
[0267] 5’-GAA GAAACAAAAAGC AGC AT-3’(SEQ ID NO：27)
[0268] 基因座 AP009324 2880168bp DNA 环形BCT 09-JAN-2008
[0269] 定义 金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu3 DNA，完整基因组.
[0270] 登录号 AP009324
[0271] 版本 AP009324.1 GI：156720466
[0272] 坐标 1549580-1549561
[0273] 结合基序至少存在于金黄色葡萄球菌，在诸如铜绿假单胞菌和大肠杆菌的许多革兰氏阴性物种含有同源物。靶向该基序的诱饵可以用于寻靶与天然启动子中该基序结合的任何调控蛋白。一般通过结合天然序列受到调控的基因决定细胞中的毒性。
[0274] 用途：诱饵可以用于控制决定铜绿假单胞菌和大肠杆菌的毒性的一组基因的表达。
[0275] 通常，多核苷酸中的诱饵序列(转录因子结合位点)不与基因可操纵地连接。所述转录因子结合位点可以分离自相应启动子的任何其他元件。
[0276] 诱饵多核苷酸可以包含质粒载体。例如，诱饵多核苷酸可能包含如共同待审的申请PCT/GB2008/003353所述n[陷阱(snare)]质粒和/或根据共同待审的申请PCT/GB2008/003353所述方法来制备。
[0277] 诱饵多核苷酸可能包含一个以上拷贝的诱饵序列。所述多核苷酸可以包含多聚体分子，后者含有多拷贝诱饵序列。例如，从1到1000个拷贝。一般来说，有两个或以上拷贝，例如2-1000拷贝，例如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900拷贝。例如，可以有10-200、10-150、20-120、20-100、30-100、30-80、30-50、
30-40拷贝。例如，可以有30个拷贝的诱饵序列。一般有多拷贝诱饵，例如诱饵序列的多个直接重复。
30-40拷贝。例如，可以有30个拷贝的诱饵序列。一般有多拷贝诱饵，例如诱饵序列的多个直接重复。
[0278] 替代地，诱饵多核苷酸可以包含一个以上的诱饵序列以及诱饵序列的多个拷贝。
[0279] 诱饵多核苷酸可以包含诱饵序列之外的其他序列。一般所述其他序列使得诱饵序列更抗外切和/或内切核酸酶造成的降解。诱饵多核苷酸可以包含至少一个二级结构元件。一般所述二级结构使得诱饵序列更抗外切和/或内切核酸酶造成的降解。诱饵多核苷酸可以包含修饰的碱基或糖以便赋予更大的核酸酶抗性。诱饵多核苷酸可以在多核苷酸的末端包含2’OH核苷酸或氨基来减弱或抑制外切核酸酶活性。诱饵多核苷酸可以包含线性多核苷酸。诱饵多核苷酸可以包含环形双链DNA，例如所谓哑铃构型(Ahn et al，Biochemical Biophysical Res.Comm.(2003)310：1048-1053)。哑铃构型一般含有双链区，该双链区内含有被小的茎环结构或其它序列夹着的靶序列。诱饵多核苷酸可以在分子的一个或每个5’端含有胆固醇修饰。
[0280] 诱饵多核苷酸可以包含任意合适组合的一个或多个以上特征。
[0281] 诱饵多核苷酸可以包含本文描述的或者按照同时待审的申请PCT/GB2008/003353所述方法鉴定到的任何诱饵序列，还可以包含本文描述的其他序列。
[0282] 正如上文所述，诱饵多核苷酸可以包含n[陷阱(snare)]质粒。与例如线性寡核苷酸相比，质粒具有容易导入细菌、可以通过正筛选维持以及避免了外切核酸酶降解的问题的优势。
[0283] 制备质粒骨架版本的诱饵多核苷酸的优势包括降低制备成本、提高对核酸酶体内降解的抗性、通过(自身复制或者如果需要通过正筛选)维持质粒浓度、广泛的宿主范围、以及利用不同但兼容的n[陷阱]质粒(检测协同效应)检测组合或顺式调控序列的能力。
[0284] n[陷阱]质粒适合作为本方法中的诱饵多核苷酸。n[陷阱]质粒和文库还适合用于测试已知或公认的顺式调控序列的可能诱饵功能，或者用于筛选新的顺式调控序列(该序列可能作为诱饵序列)。
[0285] 使用n[陷阱]质粒的原理如图3所示。质粒包含“陷阱”序列(图中显示了多个拷贝)。如果所述“陷阱”包含与胞内顺式调控序列竞争结合转录因子的转录因子结合位点(即具有诱饵功能)，向细胞内导入n[陷阱]质粒将导致转录因子被从胞内顺式调控序列上除去而结合到陷阱上。其细胞内的表达受到该顺式调控序列的调控的那些基因，通过它们表达的变化或者通过细胞表现型的改变可以检测到这一点。
[0286] 通常n[陷阱]质粒包含质粒载体和插入序列(包含陷阱的插入)。在质粒中并入陷阱序列解决了现有技术中诱饵降解的问题，使得诱饵(以及对基因表达的任何影响)稳定保持在细胞内。
[0287] 插入序列包含一或多个拷贝的单体序列(其包含陷阱)。因此，插入可以包含例如1到200个单体序列。一般有两个或以上拷贝，例如2-200个拷贝，例如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190个拷贝。例如，可能有5-200、5-150、5-100、10-150、10-50、5-50、5-40、10-40、5-30个拷贝。例如可能有30个拷贝的单体序列。质粒一般包含单体的同聚物。一般它们是多重拷贝的单体，例如单体序列的多个直接重复。提供单体(也就是陷阱)的多重拷贝增加了诱饵的抢夺能量。
[0288] 单体序列包含陷阱序列。
[0289] 一般来说，陷阱中的转录因子结合位点没有在例如陷阱或陷阱质粒中可操纵地连接着基因。从这一意义上，结合位点与其相应基因分离。陷阱中的结合位点还可以与其相应启动子中的其他元件分离。一个例子中，单体序列不含有基因。
[0290] 单体可以包含陷阱之外的其他序列。这类其他序列经常来源于产生陷阱和/或质粒插入片段所使用的方法。例如，单体可以包含衔接子(adaptor)序列，比如根据本文描述的方法由“定制”n[陷阱]文库产生定制陷阱时经常得到的衔接子序列。所述衔接子序列可以包含例如一或多种限制酶的识别和/或切割位点。
[0291] 单体可以包含构成引物的结合位点的核苷酸序列，其中的引物是制备单体或者包含多重单体的插入片段时使用的引物。
[0292] 例如，当利用如同时待审的申请PCT/GB2008/003353所述滚环扩增法制备质粒插入片段时，单体一般包含一个区段对应滚环复制中使用的引物(例如T7引物)的结合位点。
[0293] 包含随机化陷阱序列的单体一般也包含恒定序列区。例如，n个核苷酸的随机化陷阱序列可能侧接着恒定序列区。替代地，恒定序列核心可能旁边连接着随机化核苷酸序列区域。
[0294] 单体的长度可以是例如至多1000个核苷酸，例如至多900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15或10个核苷酸。一般单体的长度在例如
10-100、10-50、20-75、30-60、30-50、35-55个核苷酸的范围内，比如35-54个核苷酸。例如，单体长度可以是30、40或50个核苷酸。
10-100、10-50、20-75、30-60、30-50、35-55个核苷酸的范围内，比如35-54个核苷酸。例如，单体长度可以是30、40或50个核苷酸。
[0295] 单体的陷阱部分一般大小在10-30个核苷酸范围内，例如10-25、10-20、15-20，比如15、16、17、18、19或20，例如19个核苷酸。
[0296] 衔接子序列可以包含例如5-30个核苷酸，例如5-25、5-20、5-15或5-10个核苷酸，比如10、11、12、13、14或15个核苷酸。
[0297] 一般来说，n[陷阱]质粒中的插入片段包含一或多个本文描述的单体。插入片段包含单体的多重重复的情况中，这些重复可以是串联重复。
[0298] 质粒载体中的插入片段可以包含例如大约1.5kb，例如1-2kb，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8kb。但是，可以使用任何合适的插入片段大小，只要保证质粒能够在合适的宿主细胞中稳定地保持并有效地用于本方法。
[0299] 一般单个质粒中所有单体的序列是相同的。
[0300] 用于n[陷阱]质粒的质粒载体可能适合用于原核或真核宿主。例如载体可能适合用于原核细胞，比如细菌，例如放线菌宿主。例如，质粒载体可能适合用于链霉菌或大肠杆菌菌株，例如天蓝色链霉菌的一或多个菌株(例如A3(2)，或菌株M145或M600)、大肠杆菌、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneous)。文中进一步描述了合适的宿主。
[0301] 一般来说，载体是广宿主范围的和/或穿梭载体，因此可以在一个以上宿主中维持和增殖。质粒可以是接合型质粒。这使得很容易通过接合从一个细胞转移到另一个细胞。
[0302] 优选质粒是自身复制型。一般来说质粒是高拷贝数质粒。例如，质粒可以保持在每个细胞例如20-100拷贝，例如每个细胞20、30、40、50、60、70、80、90和95或100个拷贝。高拷贝数提高陷阱中诱饵序列的抢夺能量。
[0303] 通常n[陷阱]质粒包含复制起点。合适的复制起点是本领域已知的。一般质粒还包含一或多个可检测的标记基因，例如一或多个编码抗生素抗性的基因，例如编码阿普拉霉素(apramycin)抗性的aac基因。标记基因的表达使得能够对质粒保持在宿主细胞中进行筛选。
[0304] 合适的质粒载体的实例包括例如pIJ86。合适的载体是本领域已知的。
[0305] 陷阱可以包含来源于或者分离自基因组或基因组片段的序列。基因组片段可以包含编码特定目的功能或表现型的基因。陷阱可以包含例如来源于或者分离自这类基因的启动子区域的序列或者周围的序列，例如比启动子距离基因更远的序列。陷阱可以包含如文中所述与这一类序列竞争结合转录因子的序列。制备所述陷阱的方法在本文和同时待审的申请PCT/GB2008/003353中有描述。
[0306] 诱饵多核苷酸可以通过任何合适的方法制备。
[0307] 例如，哑铃可以制备为线性寡核苷酸，然后用T4连接酶连接。替代地，可以如实施例1的描述，使用合适的引物通过PCR制备哑铃诱饵。每个引物通常含有将形成哑铃结构中的茎环的部分。实施例1中给出了这类引物的实例。利用引物进行PCR扩增后一般将扩增产物经限制消化，连接形成闭合的环形哑铃。
[0308] 替代地，可以如实施例的描述，通过限制消化质粒来制备哑铃结构。消化后连接形成闭合的环形哑铃结构。
[0309] 制备n[陷阱]质粒和n[陷阱]质粒文库的方法在本文和同时待审的申请PCT/GB2008/003353中有描述。
[0310] 本方法可以包括向细胞内引入一种以上的诱饵序列。例如，可以使用诱饵序列混合液，所述混合液包含用于结合不同菌株(例如不同临床菌株)中的调控因子的变体序列。混合液中的诱饵序列可以处于与临床上不同菌株的出现比例相同的比例。另一个实施例中，可以靶向一个以上的调控因子。
[0311] 一个方面中，本文描述的方法包括体外方法。
[0312] 本文提到的宿主细胞可以是希望利用诱饵发展改变其基因表达(和表现型)的细胞，例如病原细菌。
[0313] 一般地，方法被用于改变细胞表现型的情况中，宿主细胞在没有诱饵时显示该表现型。用于改变医学或医疗相关表现型(例如增强的抗生素敏感性)的诱饵可以在一系列细胞中进行筛选。例如，可以首先在该表现型的细菌模型(例如抗生素抗性模型)中测试诱饵，然后在例如病原菌或临床分离株中进一步验证。诱饵可以进一步在动物模型，例如小鼠模型中进行验证。
[0314] 诱饵是质粒的情况中，通常宿主细胞与质粒载体相容和/或是质粒可以在其中稳定维持和复制的宿主细胞。宿主细胞通常也和质粒中的任何可检测标记基因相容。
[0315] 一般来说，宿主细胞包含目的顺式调控序列，即要筛选的顺式调控序列，或者被导入细胞的诱饵序列意图竞争的顺式调控序列，可操纵地连接着基因。对基因表达的调整可以(例如通过表现型的改变)直接或间接地检测.
[0316] 通常细胞包含启动子，所述启动子含有可操纵地连接着基因的顺式调控序列。可操纵地连接意味着顺式调控序列和/或启动子与基因的连接方式使得所述序列和/或启动子能够(在合适的条件下，例如有必需转录因子存在的情况下)发挥作用从而调控基因的表达。因此，结合了相应转录因子时，顺式调控序列发挥作用来调控(抑制或激活)基因的表达。
[0317] 顺式调控序列在细胞内的功能可以通过监测相连基因的表达来确定。这可以通过直接监测基因的表达，或者通过监测与基因表达相关的特定表现型来实现。例如，功能筛选可以包括筛选对一或多种抗生素的抗性、应激反应、毒力因子的表达或必要基因的表达。筛选方法在同时待审的申请PCT/GB2008/003353中有描述。
[0318] 宿主细胞可以包含与其天然(相应)基因可操纵地连接的顺式调控序列(例如含有该序列的启动子)，即连接着的基因的表达是所述序列(或启动子)在天然环境中调控的。顺式调控序列和被调控的基因可以是细胞内源的，例如抗生素抗性病原细菌中编码内在抗性机制的基因。
[0319] 合适的宿主细胞是本领域已知的，在本文实施例中有描述。
[0320] 本方法通常适用于原核细胞。具体来说，方法可以用于病原菌，特别是病原细菌，例如影响人类的病原细菌。它们包括以下属的细菌(按照革兰氏染色结果列出)：
[0321] 革兰氏阴性：不动杆菌、博德特氏菌(Bordetella)、疏螺旋体(Borrelia)、布鲁氏菌(Brucella)、弯曲杆菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌(Francisella)、嗜血菌、螺杆菌、克雷伯氏菌、军团菌、钩端螺旋体(Leptospira)、耐瑟氏球菌、变形菌(Proteobacteria)、假单胞菌、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏菌、密螺旋体(Treponema)、弧菌、耶尔森氏菌。
[0322] 革兰氏阳性：芽孢杆菌、梭菌、棒杆菌、肠球菌、李斯特氏菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌。
[0323] 不染色的：衣原体、支原体。
[0324] 革兰氏阴性病原菌种实例以及它们引起的疾病包括：鲍氏不动杆菌(A.barumannii)(肺炎、菌血症)、百日咳博德特氏菌(百日咳)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病Lyme’s disease)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)(布鲁氏菌病)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(急性肠炎)、大肠埃希氏菌(败血症和肺炎)、兔热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)(兔热病)、流感嗜血菌(流感)、幽门螺杆菌(消化性溃疡病)、肺炎克雷伯氏菌(肺炎)、嗜肺军团菌(军团病)、淋病奈瑟球菌(淋病)、不动杆菌(医院内感染)、铜绿假单胞菌(脓毒症)、立克氏立克次氏体(立克次氏病)、鼠伤寒沙门氏菌(伤寒)、痢疾志贺氏菌(痢疾)、霍乱弧菌(霍乱)、鼠疫耶尔森氏菌(鼠疫)。
[0325] 革兰氏阳性病原菌种实例以及它们引起的疾病包括：炭疽芽孢杆菌(炭疽病)、艰难梭菌(假膜性结肠炎)、白喉棒杆菌(白喉)、粪肠球菌(医院内感染)、单核细胞增多性李斯特氏菌(李斯特氏菌病)、结核分枝杆菌(结核)、金黄色葡萄球菌(败血症)、肺炎链球菌(肺炎)。
[0326] 以下属(包括上文提及的种)的细菌尤其适合本方法使用：埃希氏菌、螺杆菌、克雷伯氏菌、奈瑟氏菌、变形菌、假单胞菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、梭菌、肠球菌、葡萄球菌、志贺氏菌。
[0327] 一个方面中，发明涉及包含本文描述的(例如，通过本文的任何方法导入细胞的)诱饵多核苷酸(诱饵分子)的宿主细胞。具体来说，发明涉及这样的宿主细胞，所述细胞由于诱饵多核苷酸的存在，与没有质粒/诱饵分子的细胞相比，展示出改变的基因表达和/或表现型，例如对抗生素易感性增加、毒性下降、适应性反应受损。例如，发明涉及用本文描述的诱饵多核苷酸使其活力降低的病原菌或临床分离株。
[0328] 诱饵多核苷酸可以通过合适的手段导入宿主细胞。例如，转化、转染、接合。例如，多核苷酸包含接合型质粒的情况中，可以通过接合导入宿主细胞。例如环形哑铃结构的诱饵多核苷酸可以通过转染导入细胞。细胞可以处于液体培养基中，诱饵被加入液体。替代地，细胞可以培养在固体培养基上，将浸透诱饵的吸水圆纸片覆盖在培养基上来转染诱饵。一般来说，将诱饵多核苷酸加入培养基中被细胞摄取。细胞培养在固体培养基的情况中，诱饵多核苷酸可以加到滤纸盘上，然后被细胞从纸盘上吸收。可以利用渗透缓冲液来协助转染。
[0329] 一个方面中，诱饵多核苷酸的转染可以包括利用胆固醇。具体来说，方法可以利用一个或两个5’端带有胆固醇修饰的线性诱饵多核苷酸。该修饰被认为能够促进细胞的摄取。
[0330] 可以另外在诱饵的例如5’端标记上可检测标记，比如荧光染料，例如Cy5。这将协助监测诱饵被摄取和在细胞中的维持。
[0331] 如实施例1的描述，可以利用胆固醇和/或可检测标记引物来制备胆固醇修饰和/或可检测标记的诱饵。
[0332] 诱饵多核苷酸转染到细胞内可以包括利用R9-胆固醇，该物质由附着胆固醇分子的9个D-精氨酸线性链构成(Kim W.J.et al，Mol.Ther.(2006)14：343-350)。
[0333] 总的来说，细胞对诱饵多核苷酸或质粒文库的摄取和/或维持受到监测。例如质粒诱饵可以包含可检测标记物(例如编码抗生素抗性的)，使得可以对质粒的存在进行正选择，并监测质粒繁殖。诱饵多核苷酸的存在还可以通过qrt-PCR监测。
[0334] 一般来说，诱饵序列包含转录因子的结合位点，该结合位点与胞内转录因子结合位点竞争结合转录因子。通过从胞内位点抢夺转录因子，诱饵打断与胞内结合位点可操纵地连接的基因的表达。
[0335] 诱饵序列可以包含转录因子的天然胞内结合位点。天然序列是本领域已知的，本文提供了特定调控因子的内源结合位点的实例。
[0336] 诱饵序列可以包含给定调控因子的共有结合位点。同样，这种共有位点是本领域已知的，文中给出了某些特定调控因子的例子。
[0337] 替代地，诱饵序列可包含保留了诱饵功能的天然或共有结合序列的变体。
[0338] 可以通过改变亲本序列中的例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸来制备变体。例如，足迹法实验可能表明某具体核苷酸对转录因子的结合不是太重要，因此可以被改变。
[0339] 通过将包含诱饵序列的诱饵多核苷酸引入合适的宿主细胞可以测试公认的诱饵序列与给定转录因子结合位点竞争的能力。宿主细胞包含与基因可操纵地连接的靶转录因子结合位点，所述基因的表达可以通过例如筛选表现型的变化来直接或间接地确定。测试序列的诱饵功能可以通过筛选基因表达的变化或者表现型的改变来确定。
[0340] 可以使用本文描述的任何诱饵多核苷酸。可以使用本文描述的任何宿主细胞。
[0341] 例如，可以首先将测试序列引入合适的报告细胞，监测报告基因的表达来评估诱饵功能。可以使用PCT/GB2008/003353所述用“死亡或活的”报告细胞进行的基于报告基因的通用检验系统。这一方法解决了需要可打分的表现型的问题，因为正常情况下每个报告基因都会导致细胞死亡，只有当诱饵通过抢夺转录因子解除了这种情况，细胞才能够生长。因此要依赖于细胞的存活来选择两个报告基因，这极大地加速了筛选过程。该系统的另一个特性是这种死亡-或-活的筛选可以容易地自动化作为快速、广泛或高通量筛选的基础。
还可能用于鉴定控制启动子的调控序列，这种调控序列在天然情况下没有容易打分的表现型。
还可能用于鉴定控制启动子的调控序列，这种调控序列在天然情况下没有容易打分的表现型。
[0342] 替代地或者另外地，可以在包含靶结合位点的宿主细胞中检测诱饵序列，所述结合位点可操纵地连接着其对应基因，因此可以确定诱饵序列打断基因表达的能力。意图用诱饵引起表现型改变的情况中，筛选中使用的宿主细胞显示该特定表现型。
[0343] 例如，文所述用于靶向调控因子的诱饵序列可以通过筛选宿主细胞对抗生素敏感性的提高来检测。抗生素可以按照本文描述来选择。
[0344] 某些情况中，可以通过筛选对靶调控因子适合的另一种表现型来测试诱饵序列。例如，可以通过检测被削弱的应激反应来对靶向应激反应调控因子的诱饵进行评估(通过测量对生理胁迫的耐受性)。靶向毒力因子调控蛋白的诱饵可以通过确定毒性机制被破坏来评估。后种情况的一个例子可以是由冷冻管重悬浮后活力低或者甚至是特定基因表达下调(通过qRT-PCR测量的)。
[0345] 例如，可以在有作用于脂肪酸合成过程的抗生素(例如浅蓝菌素)的情况下，相对合适的菌株(例如生长在例如Luria-Bertani LB培养基(1％[w/v]Bacto-蛋白胨、0.5％[w/v]酵母提取物、1％[w/v]NaCl)上的大肠杆菌)，检验靶向脂肪酸合成关键基因调控的FabB诱饵。例如，在浅蓝菌素浓度为10μg/ml，未处理的细菌生长正常，并作为用诱饵处理过的细菌的参照物，其中处理过的细菌生长明显缓慢且最终浓度较低。
[0346] 例如，可以通过在胁迫条件(例如碱性条件)下在例如LB培养基中生长来诱导合适菌株(例如金黄色葡萄球菌)中的应激反应。例如，可以使用含有例如30mM KOH的LB培养基。未处理过的细菌因为碱性条件诱导的应激反应在该培养基中生长良好，而那些用SA_sigB诱饵(靶向sigB的调控，而sigB是对胁迫的调节性反应的主要部分)处理过的细菌生长很差。
[0347] 某些情况中，筛选相关基因的表达包括确定合适培养条件下宿主细胞的生命力。例如，当待评估的表现型是抗生素抗性时，筛选可以包括在有抗生素的情况下培养细胞并确定细胞是否有活力。在包含“死的或活的”报告宿主细胞的筛选中，筛选细胞包括在这样的条件下培养细胞并分离活细胞，所述条件下报告基因(目的顺式调控序列可操纵地连接的基因)的表达决定着宿主细胞的活力。
[0348] 本方法可以包括如本文所述，在液体培养基中培养宿主细胞，如果例如要确定的细胞表现型是细胞活力。这样的优势是只剩下少量细胞进行分析。
[0349] 本文描述的n[陷阱]质粒可以通过这样的方法进行制备，所述方法包括：
[0350] -提供包含一或多个拷贝的单体序列的多核苷酸，和
[0351] -将所述多核苷酸克隆到合适的质粒载体中。
[0352] 单体的组成如本文对n[陷阱]质粒的描述。合适的质粒载体也已描述过。
[0353] 可以通过以下方法提供包含一或多个拷贝的单体序列的多核苷酸，所述方法包括：
[0354] (1)提供环形寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：
[0355] (i)目的序列；和
[0356] (ii)适用于滚环扩增的引物的结合位点；
[0357] 其中单体序列包含(i)和(ii)；以及
[0358] (2)利用环形寡核苷酸作为模板进行滚环扩增，从而提供包含单体序列重复的多核苷酸。
[0359] 所述方法的步骤(1)还可以包括通过PCR扩增滚环扩增产物，并分离所需大小的多核苷酸片段，例如包含30-50个单体序列重复的片段。这可以通过例如PAGE分析实现。
[0360] 环形寡核苷酸可以通过以下方法制备，所述方法包括：
[0361] -提供线性单链寡核苷酸，其包含：待测试的目的序列(i)和适用于滚环扩增的引物的结合位点(ii)；
[0362] -通常在有通用连接寡核苷酸的情况下，利用例如Taq连接酶将寡核苷酸环化；
[0363] -任选地用核酸外切酶消化剩下的线性DNA；以及
[0364] -利用例如PAGE回收单体环形寡核苷酸。
[0365] 适用于滚环扩增的引物是本领域已知的。例如可以使用T7引物。
[0366] 实施滚环扩增的方法是本领域已知的。例如可以使用BstI聚合酶。
[0367] 在一个实施例中，利用滚环扩增中使用的相同引物(例如T7引物)将滚环扩增产物选行PCR扩增。
[0368] 一般来说，单体中的序列(i)包含本文描述的陷阱序列。
[0369] 如文中所述，陷阱序列可以分离自基因组DNA，例如分离自完整基因组，或者基因组片段。陷阱序列一经分离好可以用于通过同时待审的申请PCT/GB2008/003353所述方法形成n[陷阱]质粒。
[0370] PCT/GB2008/003353中描述了由基因组或基因组片段制备陷阱序列的实验方案。
[0371] 如文中所述，陷阱序列可以包含随机化的核苷酸序列。一般陷阱包含n个核苷酸的随机化(或可变的)核苷酸序列。通常，n可以在5-50个核苷酸的范围，例如10-50，例如20-40，例如25-35，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
[0372] 包含随机化序列(和任选所述恒定序列)的寡核苷酸可以利用本领域已知方法合成。
[0373] 可以给寡核苷酸的随机化(或者可变)区引入核苷酸偏性。例如如果适宜，可以引入GC偏性。
[0374] 上述方法中的单体可以包含这样制备的寡核苷酸。然后可以制备n[陷阱]质粒。
[0375] 如上所述，本发明的一个方面是提高原核细胞对抗生素的易感性。例如这可能涉及靶向细胞中的内在抗性机制或者胞内适应性反应，这就意味着细胞在抗生素诱导的胁迫条件下的存活能力下降。
[0376] 一个方面中，本方法适用于普通地提高抗生素药效(Alekshun and Levy，Cell(2007)128：1037-1050)。这包括抑菌和杀菌性抗生素。实例包括以下类型的抗生素：氨基糖苷类(比如卡那霉素)、碳青霉烯类(比如美罗培南)、头孢菌素类(比如头孢吡肟)、糖肽(比如万古霉素和达托霉素)、青霉素类(比如氨苄西林、羧苄西林和盘尼西林)、多肽抗生素(比如多粘菌素B)、喹啉(比如levaquin)、磺胺类(比如复方新诺明)、四环素类(比如四环素)、以及各种氯霉素、利福平和斯沃。
[0377] 一个方面中，导致细胞中应激反应被抑制的方法，或者导致细胞受到胁迫的方法特别适用于增强杀菌性抗生素的效果(Kohanski et al，Cell(2007)130：797-810)。
[0378] 杀菌抗生素可以包括：
[0379] β-内酰胺类
[0380] (a)青霉素类
[0381] (b)碳青霉烯类
[0382] (c)单内酰环类
[0383] (d)头孢菌素类
[0384] 第一代：头孢乙腈(Cefacetrile)(氰乙酰头孢菌素cephacetrile)、头孢羟氨苄(Cefadroxil)(cefadroxyl；Duricef)、头孢氨苄(Cefalexin)(cephalexin；Keflex)、头孢甘氨酸(Cefaloglycin)(头孢来星cephaloglycin)、头孢洛宁(Cefalonium)(cephalonium)、头孢噻啶(Cefaloridine)(cephaloradine)、头孢噻吩(Cefalotin)(cephalothin；开 弗 林(Keflin))、头孢 吡 硫(Cefapirin)(cephapirin；Cefadryl)、头孢三嗪(Cefatrizine)、头孢氮氟(Cefazaflur)、头孢西酮(Cefazedone)、头孢唑啉(Cefazolin)(cephazolin；Ancef，Kefzol)、头孢环 己烯(Cefradine)(cephradine；
Velosef)、头孢甲氧环烯氨(Cefroxadine)、头孢替唑(Ceftezole)；
Velosef)、头孢甲氧环烯氨(Cefroxadine)、头孢替唑(Ceftezole)；
[0385] 第二代：氯头孢菌素(Cefaclor)(希克 劳(Ceclor)，Distaclor，Keflor，Raniclor)、头 孢尼 西(Cefonicid)(Monocid)、头孢 丙烯 (Cefprozil)(头孢 罗 奇cefproxil；Cefzil)、头孢呋肟(Cefuroxime)(Zinnat，Zinacef，Ceftin，Biofuroksym)、头孢唑南(Cefuzonam)、头孢美唑(Cefmetazole)、头孢替坦(Cefotetan)、头孢噻吩(Cefoxitin)、碳青霉烯类：氯碳头孢(loracarbef)(Lorabid)、头霉素类(Cephamycins)：头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢美唑(Zefazone)、头孢米诺(cefminox)、头孢替坦(Cefotan)、头孢噻吩(cefoxitin)(美福仙Mefoxin)
[0386] 第三代：头孢卡品(Cefcapene)、头孢达肟(Cefdaloxime)、头孢地尼(Cefdinir)(Omnicef)、头孢托仑(Cefditoren)、头孢他美(Cefetamet)、头孢克肟(Cefixime)(Suprax)、头孢甲肟(Cefmenoxime)、头孢地嗪(Cefodizime)、头孢噻肟(Cefotaxime)(Claforan)、头 孢 米 唑(Cefpimizole)、Cefpodoxime(Vantin，PECEF)、头 孢 特 仑(Cefteram)、头 孢布 烯(Ceftibuten)(Cedax)、头孢 噻呋(Ceftiofur)、头孢 噻 林(Ceftiolene)、头孢唑肟(Ceftizoxime)(Cefizox)、头孢曲松(Ceftriaxone)(罗氏芬Rocephin)、头孢哌酮(Cefoperazone)(先锋必Cefobid)、头孢他啶(Ceftazidime)(复达欣(Fortum)，Fortaz)、氧头孢烯类(Oxacephems)：拉氧头孢(latamoxef)(moxalactam)[0387] 第 四 代：Cefclidine、头 孢 吡 肟 (Cefepime)(Maxipime)、头 孢 瑞 南(Cefluprenam)、头孢噻利(Cefoselis)、头孢唑兰(Cefozopran)、头孢匹罗(Cefpirome)、头孢喹肟(Cefquinome)、氧头孢烯类：氟氧头孢(flomoxef)
[0388] 待分类的：Ceftobiprole、头孢氯嗪(Cefaclomezine)、头孢洛仑(Cefaloram)、头孢帕罗(Cefaparole)、头孢卡奈(Cefcanel)、头孢屈洛(Cefedrolor)、头孢吡酮(Cefempidone)、头孢三 唑(Cefetrizole)、头孢维 曲(Cefivitril)、头孢替林(Cefmatilen)、Cefmepidium、头孢维星(Cefovecin)、头孢唑(Cefoxazole)、头孢罗替(Cefeotil)、头孢舒米(Cefsumide)、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢噻氧(Ceftoxide)、头孢呋汀(Cefuracetime)
[0389] 氨基糖苷类：
[0390] (a)丁胺卡那霉素(amikacin)、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星(netilmicin)、巴龙霉素(paromomycin)、rhodostreptomycin、链霉素、妥布拉霉素、阿普拉霉素；
[0391] (b)蒽环类(Anthracyclines)，例如多柔比星(doxorubicin)
[0392] 喹诺酮类(Ouinolones)：
[0393] (a)氟喹诺酮；
[0394] 第一代；
[0395] 第二代；
[0396] 第三代；
[0397] 第四代。
[0398] 糖肽抗生素：
[0399] (a)万古霉素、替考拉宁(teicoplanin)、telavancin、博莱霉素、雷莫拉宁(ramoplanin)、decaplanin和dalbavancin。
[0400] 肽抗生素类：
[0401] (a)羊毛硫抗生素(Lantibiotics)；
[0402] 耐久霉素(Duramycin)、乳链菌肽(nisin)、表皮素(epidermin)、actagardine、microbisporicin和mersacidin；
[0403] (b)脂肽类；
[0404] Cubicin。
[0405] 链阳菌素类(Streptogramins)：
[0406] 奎奴普丁(Quinupristin)+达福普汀(dalfopristin)
[0407] 但所述诱饵和方法也可以用于提高抑菌抗生素，比如大环内酯类、酮内酯类、四环素类、林可酰胺类(例如氯洁霉素)、噁唑烷酮类(Oxazolidinones)(利奈唑胺(Linezolid))的效力。
[0408] 所述方法用于治疗的情况中，诱饵多核苷酸可以与一或多种抗生素，通常是诱饵使细胞更易感的抗生素组合使用。可以从以上描述的抗生素中选择。
[0409] 某些情况中，适合根据细菌的种类和要针对的细菌感染来选择抗生素。
[0410] 例如，结核分枝杆菌是结核病的致病菌，结核病目前使用异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺(pyrazinimide)治疗。因此，在靶向结核分枝杆菌的方法中，可以选择这些药物中的一或多种与诱饵多核苷酸一起使用。类似的，金黄色葡萄球菌感染一般用青霉素治疗，产生广谱β-内酰胺酶的细菌(例如大肠杆菌或反应克雷伯氏菌)的革兰氏阴性感染经常用β-内酰胺质粒。
[0411] 某些情况中，诱饵多核苷酸的类型和表达被它打断的基因决定了细胞变得更敏感的抗生素的类型，因此该抗生素可以与诱饵联用。例如，文所述FabB TFD，靶向脂肪酸合成所需要的关键酶调控因子(FadR)的结合位点。因此，用诱饵处理过的细胞会变得对能够抑制脂肪酸合成的抗生素尤其易感。文中还提供了关于特定目标的其他信息。
[0412] 所述诱饵可以用于改变细胞适应性或生理反应，例如本文描述的任何反应。诱饵还可以用于改变关键基因的表达，从而改变所述基因关键的条件下细胞的活力。诱饵还可以用于改变细胞的毒力。
[0413] 诱饵还可以用于例如通过引起细胞壁或膜组成的变化来提高对抗生素的摄取。
[0414] 诱饵还可以靶向未知遗传系统的调控，特别是PCT/GB2008/003353所述n[陷阱]过程所发现的诱饵。这些例子中，用诱饵处理细菌的后果可以通过例如抗生素易感性来测量，而易感性变化的遗传机制仍是未知的。
[0415] 某些情况中，用靶向已知基因的调控(比如WhiB7及其在分枝杆菌中的同源物)的诱饵处理使得细胞对抗生素的易感性增加，而该变化的表现型机制仍是未知的。
[0416] 某些情况中，靶向基因的调控的诱饵能够提高细胞对抗生素的易感性，而该变化的表现型机制仍是未知的，其中所述基因被生物信息学方法认为决定着抗生素敏感性(比如经转录谱鉴定到的那些参与金黄色葡萄球菌糖肽抗性的基因)，并且发现其中部分在其启动子内有共有顺式调控基序。
[0417] 所述诱饵多核苷酸有许多应用，包括医疗用途(例如医学或兽医学)和其他离体的例如非治疗应用，例如应用在消毒和清洁产品中。所述诱饵可以应用于需要降低原核细胞活力、杀死细胞、抑制其生长或减弱毒性的方法中。
[0418] 如上所述，所述诱饵多核苷酸和方法可以用于提高原核细胞对抗生素的易感性。因此，诱饵可以用于强化一或多种诸如文所述抗生素的效果。这可以是用于医学或兽医学用途，例如治疗或预防人或动物中的细菌感染；或者体外使用，例如用在清洁组合物中。因此，诱饵可以用在杀菌或抑菌组合物中。
[0419] 替代地，诱饵多核苷酸和方法可以用于给原核细胞提供或提高对致死环境因子或抗菌剂的易感性。
[0420] 因此，一个方面中，发明提供了治疗受试对象中细菌感染的方法，所述方法包括给予文所述诱饵多核苷酸。受试对象可以是人或动物。发明还提供了本文描述的用于医学上的诱饵多核苷酸，例如用于治疗或预防受试对象中的细菌感染；以及诱饵在制备治疗细菌感染的药物中的用途。
[0421] 诱饵可以与抗生素和/或另一种抗菌剂组合使用，所述抗生素是诱饵使细胞对其更敏感的抗生素。合适的抗生素如文中所述。抗生素可以与诱饵同时给予，或者在诱饵之前或之后给予。抗生素和诱饵可以在相同或分开的组合物中给予。因此发明包括联合治疗，其中将鉴定到的和/或如文所述诱饵多核苷酸与一或多种抗生素或其它抗菌治疗剂联合给予受试对象。
[0422] 一个方面中，发明涉及包含诱饵多核苷酸和生理可接受的载体或赋形剂的药物组合物或药物。所述组合物还可以如文中所述包含一或多种抗生素或其它抗菌剂。
[0423] 治疗 用 途可 接受 的 载体 或 稀释 剂是 医 药领 域已 知 的，在 例 如Remington’Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中有描述。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期给药途径和常规药学实践进行。药物组合物可以包含任何合适的粘着剂、润滑剂、悬浮剂、包衣、助溶剂，作为载体、赋形剂或稀释剂，或者附加于载体、赋形剂或稀释剂之外。
[0424] 许多方法可以用于将本发明的诱饵递送至细菌感染位点。体内和/或体外递送的方法包括，但不限于脸颊或口腔递送、静脉内递送、直接注射到感染内或者间接注射(例如，皮下、腹膜内、肌内或其他注射方法)、局部施用、直接在液体或培养液中接触、转染(例如，磷酸钙、电穿孔、基于DEAE-葡聚糖的以及液体介导的)、转基因表达(例如，通过显微注射、胚胎干细胞产生、或者逆转录病毒转移递送的诱饵表达系统)，或者任何其他本领域已知的常用核酸递送系统。给药可以与合适剂量的抗生素组合，其中抗生素与诱饵同时或分开给予。
[0425] 正如以下实施例所述，要显示对靶基因表达有可预期效果和有抑菌效果所需的TFD数量可以只有每细胞大约5000个分子。实施例讨论的标准体外检测方法中显示仅用1nM TFD即可有效杀死多达1,000,000个细菌细胞，这表明低于0.001％的转染效率即足以实现杀灭细菌细胞。利用荧光显微镜测量荧光标记的TFD的摄取对转染进行定量显示视野内的全部金黄色葡萄球菌均被转染。与解决细菌感染的其他基于核酸的策略(比如反义策略)相比，杀死细胞所需的这个分子数量少100到1000倍。这部分反映了尽管反义方法和TFD都是对基因进行抑制，TFDs作用于早期步骤从而防止转录，而反义方法在最常见的循环中立体阻碍转录产物：几千mRNAs分子。第二，TFDs被设计成靶向可被正诱导的关键基因，因此存活需要它们的启动和正调控(转录因子驱动自身的产生)。在体外，后一个特点意味着当基因不被诱导时，可能存在的转录因子相对较少，因此少量TFD就能阻断诱导。可能在治疗情景中，由于细菌群体或者已经被诱导的基因的天然多样性，每个细胞有更多转录因子。这种情况中，预期需要更多TFDs以便看到治疗效果，估计将剂量提高100倍(达到100nM)或者提高转染效率(两个数量级)足够看到有益效果。
[0426] 某些诱饵可以不与抗生素一起使用来治疗或预防细菌感染。例如本文描述的某些诱饵会降低细胞在胁迫条件下存活、或表达必要基因或获取关键营养的能力。某些诱饵会中和细胞毒力，例如通过阻止毒力因子的表达。因此用于靶向必要基因的诱饵可以单独使用来防止特定病原细菌的生长，即本身作为一种疗法或者作为预防性药物的形式在细菌成为感染之前解决。类似的，靶向毒性决定基因的那些诱饵可以单独使用来防止感染的扩散。另一个实施例中，本文列举的对抗幽门螺杆菌的诱饵可以提供抗胃溃疡/消化性癌症(peptic cancer)发展的独立疗法。
[0427] 类似的，能够防止变异链球菌生长的诱饵可以用于治疗或预防牙齿变色。
[0428] 诱饵被用来治疗的具体感染或相关状况通常取决于诱饵所靶向的病原细胞。文中和图2联系具体细菌，列出了可以利用本方法靶向的细菌感染和相关疾病。
[0429] 本文所述诱饵多核苷酸还可以体外使用，例如用在抗细菌产品中，比如用于清洁产品(例如消毒剂)来杀死细菌或预防细菌的生长或传染性。诱饵提高了对抗生素的易感性的情况中，一般抗细菌组合物还包含一或多种抗生素和/或一或多种抗菌剂。本发明一个方面涉及这类清洁组合物。
[0430] 本发明的诱饵多核苷酸还可以用在产品中，所述产品在能够减少或防止微生物生长和/或杀死微生物的条件下，施加到表面(比如试验台或手)一段时间，从而减少或防止微生物的生长或者杀死微生物。例如，可以将一或多种诱饵喷在表面。这种喷洒可以用于例如准备进行食品加工的表面或者给要插入患者体内的物品消毒。由于喷洒诱饵制剂减少了接触表面或物品，因此进一步减少了污染的风险。洗手液和漱口液应用也在发明范围的考虑内。
[0431] 以上情形中，诱饵可以配置成合适的水性形式。这种情况中，所述制剂可以包含产泡泡的水(water to forma)和水组合物。水组合物还可以进一步包含水和有机溶剂以及它们的组合。
[0432] 本发明还涉及抗细菌用途的试剂盒，所述试剂盒包含如文所述诱饵多核苷酸以及一或多种抗生素或者其他抗菌剂，联用于杀死细菌或者抑制细菌的生长或毒性。试剂盒一般包含使用说明。同样试剂盒可以用于治疗用途，例如抗细菌感染；或者非治疗用途，例如用于清洁或消毒。
[0433] 文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
[0435] 图1.来自Poole J.(Antimicrobial Chemother.(2005)56，22-24)的表1的复印件，表中分别列出了外排泵介导的对非氟喹诺酮类抗生素和氟喹诺酮类抗生素的抗性。右手一栏中的代号对应论文中给的代号。
[0436] 图2.来自Poole J.(同上)的表2的复印件，表中列出了根据本方法可以靶向的调控因子和调控序列的例子。该表还提供了所述调控因子或序列出现的细菌菌株的例子和与这些细菌相关联的疾病指征的例子。
[0437] 图3.提供了如何使用n[陷阱]质粒来影响基因表达的示意图。由于阻遏性转录因子(B)结合到基因(A)的启动子内的顺式调控序列(C)上，基因(A)没有转录活性。当被引入细胞时，n[陷阱]质粒通过将转录因子B从基因组启动子上抢夺下来，解除对下游基因(D)的转录抑制，从而影响靶基因的表达。
[0438] 图4.显示了利用SEQ ID NOS：3 & 4中的引物和合适的载体物质获得的扩增产物(实施例1.2)。
[0439] 图5.显示了在有亚抑制浓度的异烟肼(IZ)或利福平(RF)的情况下培养的耻垢分枝杆菌的生长曲线，其中如实施例2所述，细菌用WhiB7诱饵序列(+)或者阴性对照序列(-)处理过。
[0440] 图6.显示了在有浅蓝菌素的情况下培养的大肠杆菌的生长曲线，其中如实施例3所述，细菌用FabB诱饵(靶向FadR结合位点)或者阴性对照序列处理过。
[0441] 图7.显示了在有由电穿孔引起的胁迫的情况下金黄色葡萄球菌的生长曲线，其中如实施例4所述，细菌未处理(第一条曲线)，或者用SsaA诱饵(第二条曲线)或者LytM诱饵(第三条曲线)处理过。
[0442] 图8.显示了金黄色葡萄球菌的生长曲线，分别是：没有接种的培养基(BHI阴性对照)；转染了带有乱序的TFD序列的对照TFD并生长在BHI培养基中；转染了SsaA TFD(含有WalR位点)并生长在BHI培养基中；转染了fhu TFD(设计用于阻断铁的摄取)并生长在BHI培养基中；转染了sig TFD并生长在BHI培养基中；转染了无关TFD并生长在NRPMI培养基(与BHI相比，铁限制培养基)中；以及转染了fhu TFD并生长在NRPMI培养基中。
[0443] 图9.显示了在非铁限制培养基中，Fur_TFDs不干扰金黄色葡萄球菌的生长。金黄色葡萄球菌生长在BHI培养基中，转染剂中含有Fur_TFD但不含短杆菌肽(单独TFD；空心圆)；或者60nM短杆菌肽组合1nM对照TFD(对照TFD；空心三角)或者Fur_TFD(Fur_TFD；实心方形)，其中Fur_TFD是设计用于操控fhu操纵子的表达。结果是三次重复的平均值，误差条显示标准误差。
[0444] 图10.显示了Fur_TFD解除了fhu基因受到的抑制。(A).短杆菌肽介导的金黄色葡萄球菌转染。用单独TFD，或者短杆菌肽和对照或Fur_TFD处理过的细胞进行收集、洗涤和裂解。利用qPCR确定TFD相对基因组数的平均数。(B).Fur_TFD的转染抑制了金黄色葡萄球菌中的fur基因。使用平行样品经qPCR确定fhu的相对表达水平。
[0445] 图11.显示了Fur_TFDs阻止金黄色葡萄球菌在铁限制培养基中的生长。金黄色葡萄球菌生长在铁选择培养基NRPMI中，转染剂中含有Fur_TFD但没有浅蓝菌素(单独TFD；空心圆)；或者60nM浅蓝菌素组合1nM对照TFD(对照TFD；空心三角)或者Fur_TFD(Fur_TFD；实心方形)。结果是三次重复的平均值，误差条显示标准误差。
[0446] 图12.显示了基因分析结果，该项分析用于确定金黄色葡萄球菌靶向Fur的TFD(SAfhu)的可能有效宿主范围。图中上面的部分显示的MEME来源的共有序列是由下面给出的序列产生的金黄色葡萄球菌Fur结合位点基序。
[0447] 图13.显示了三个MRSA菌株在有对照TFD或者这样的TFD(SA3TFD)的情况下的生长曲线，SA3TFD含有金黄色葡萄球菌选择性σ因子SigB的-10/-35识别序列。
[0448] 图14.显示了哑铃构型中的Sig TFDs抑制临床分离的MRSA菌株MRSA-5的生长。
[0449] 图15.显示了哑铃构型中的WalR TFD阻止EMRSA15的生长。fhu TFD被用作对照。
[0450] 图16.显示的金黄色葡萄球菌生长在BHI培养基中，转染剂含有1nM WalR_TFD/DOTAP混合物但没有溶葡萄球菌素(单独TFD；空心圆)；或者62μg/ml浅蓝菌素(gramicidin)组合1nM对照TFD(Scr_TFD；空心三角)或者WalR_TFD(实心方形)，其中WalR_TFD涉及来操控WalKR操纵子的表达。
[0451] 图17.没有检测到抗性机制。(A).EMRSA-16在完成图1描述的体外生长实验后，总的活菌计数。(B).没有被WalR_TFD处理杀死的细胞做次级培养，在体外生长实验中进行测试。WalR_TFD有效地杀死了次级培养的细胞。依次进行了5轮次级培养，通过测量总活菌数没有看到用WalR_TFD处理过的那些细胞有再生长。(C)细菌的简单生长曲线。类似的，先前接触了四轮TFD选择的细菌的生长曲线没有显示抗性迹象，因为它们都被有效地杀死。细胞生长通过记录30个小时内培养物的A420来测量，细胞是未处理的(单独培养基；空心圆)；用对照TFD加上转染混合物处理过(空心三角)或者WalR_TFD加上转染混合物处理过(实心方形)。
[0452] 图18.微量稀释实验显示只需有限接触WalR_TFD即可杀死EMRSA-16。细胞是未处理的(单独培养基；空心圆)；用对照TFD加上转染混合物处理过(空心三角)或者WalR_TFD加上转染混合物处理过(实心方形)，温育30分钟后100倍稀释至不含转染剂或TFD复合体的培养基中。只有先前用WalR_TFD处理过的细胞不能生长。
[0453] 图19.在小鼠脓毒症模型中，WalR_TFD杀死EMRSA-16与万古霉素一样有效。小鼠系统感染和用对照TFD(Scr_TFD、1nM WalR_TFD、万古霉素和单独媒介)处理后，测量EMRSA-16的肾载菌量。
[0454] 图20.显示大肠杆菌转染FabB TFD使得细菌对抑制脂肪酸合成的抗生素(浅蓝菌素)敏感化。WhiB7 TFD用作阴性对照，因为它是带有大肠杆菌基因组中不存在的序列的FD。
[0455] 图21.显示转染TFD延缓了细菌生长，所述TFD含有肺炎克雷伯氏菌的σ54因子的识别序列。WhiB7 TFD用作阴性对照。
[0456] 图22.显示用于发现金黄色葡萄球菌和其他生物中相近的被鉴定为WalR结合位点的序列。图中显示了一部分命中序列，由这些序列得到一个共有序列。
[0457] 图23.部分A显示金黄色葡萄球菌SigB结合位点的来源于MEME的共有序列。部分B列出了芽孢杆菌目中共有序列的相近序列的发生率(E值＜100)(革兰氏阳性感染，其中的代表性属包括芽孢杆菌、李斯特氏菌和葡萄球菌)。
[0458] 图24.部分A显示KP_Sig TFD体外杀死肺炎克雷伯氏菌。含有KP_Sig序列的TFD阻止细胞体外生长(KP_Sig，实心方形)。使用了两种对照：未处理的细胞(肺炎克雷伯氏菌，空心圆)和含有乱序序列的对照TFD(KP-对照TFD，空心三角)。部分B显示来源于MEME的肺炎克雷伯氏菌Sig结合位点的共有序列。
[0459] 序列简述
[0460] SEQ ID NOS：1 & 2-如实施例1.1中，用于由pGEMT-Easy载体扩增靶序列的寡核苷酸引物
[0461] SEQ ID NOS：3 & 4-如实施例1.2中，在制备哑铃诱饵时，用于由pGEMT-Easy载体扩增靶序列的寡核苷酸引物
[0462] SEQ ID NO：5-用于实施例2的WhiB7诱饵
[0463] SEQ ID NO：6-用于实施例3的FabB诱饵
[0464] SEQ ID NO：7-用于实施例4的LytM诱饵
[0465] SEQ ID NO：8-用于实施例4的SsaA诱饵
[0466] SEQ ID NO：9-耻垢分支杆菌菌株MC2 155中的天然WhiB7结合位点
[0467] SEQ ID NO：10-大肠杆菌K12中的天然FadR结合位点
[0468] SEQ ID NO：11-金黄色葡萄球菌中YycF/YycG的天然结合位点
[0469] SEQ ID NO：12-金黄色葡萄球菌中YycF/YycG的天然结合位点
[0470] SEQ ID NO：13-金黄色葡萄球菌中SigB的天然结合位点
[0471] SEQ ID NO：14-肺炎克雷伯氏菌中SigB的天然结合位点
[0472] SEQ ID NO：15-金黄色葡萄球菌中Fur结合的共有序列
[0473] SEQ ID NO：16-大肠杆菌中Fur结合的共有序列
[0474] SEQ ID NO：17-幽门螺杆菌中Fur的天然结合序列
[0475] SEQ ID NO：18-艰难梭菌中TcdR的共有结合位点
[0476] SEQ ID NO：19-铜绿假单胞菌中Vfr的共有结合位点
[0477] SEQ ID NO：20-铜绿假单胞菌中Vfr的天然结合位点
[0478] SEQ ID NO：21-铜绿假单胞菌中Vfr的天然结合位点
[0479] SEQ ID NO：22-肺炎克雷伯氏菌中NtrC的天然结合位点
[0480] SEQ ID NO：23-幽门螺杆菌中ArsR的天然结合序列
[0481] SEQ ID NO：24-幽门螺杆菌中ArsR的天然结合序列
[0482] SEQ ID NO：25-金黄色葡萄球菌中的糖肽抗性共有序列
[0483] SEQ ID NO：26-金黄色葡萄球菌中的Agr结合基序
[0484] SEQ ID NO：27-金黄色葡萄球菌中的Agr结合基序
[0485] SEQ ID NO：28-PCR制备SasigB TFD的正向引物序列
[0486] SEQ ID NO：29-PCR制备SasigB TFD的反向引物序列
[0487] SEQ ID NO：30-PCR制备SAfhu TFD的正向引物序列
[0488] SEQ ID NO：31-PCR制备SAfhu TFD的反向引物序列
[0489] SEQ ID NO：32-PCR制备SsaA TFD的正向引物序列
[0490] SEQ ID NO：33-PCR制备SsaA TFD的反向引物序列
[0491] SEQ ID NO：34-对照序列
[0492] SEQ ID NO：35-对照序列
[0493] SEQ ID NO：36-PCR扩增16s rRNA的正向引物序列
[0494] SEQ ID NO：37-PCR扩增16s rRNA的反向引物序列
[0495] SEQ ID NO：38-PCR定量fhu基因的正向引物序列
[0496] SEQ ID NO：39-PCR定量fhu基因的反向引物序列
[0498] SEQ ID NO：41-磷酸化Sig哑铃TFD寡核苷酸序列
[0499] SEQ ID NO：42-哑铃TFD的磷酸化引物，所述TFD含有乱序的Sig结合位点[0500] SEQ ID NO：43-哑铃TFD的磷酸化引物，所述TFD含有乱序的Sig结合位点[0501] SEQ ID NO：44-整合了WalR的结合序列的磷酸化哑铃寡核苷酸
[0502] SEQ ID NO：45-整合了WalR的结合序列的磷酸化哑铃寡核苷酸
[0503] SEQ ID NO：46-整合了乱序的WalR结合位点的磷酸化哑铃寡核苷酸
[0504] SEQ ID NO：47-整合了乱序的WalR结合位点的磷酸化哑铃寡核苷酸
[0505] SEQ ID NO：48-整合了WalR结合位点的磷酸化寡核苷酸
[0506] SEQ ID NO：49-整合了WalR结合位点的磷酸化寡核苷酸
[0507] SEQ ID NO：50-FabB启动子的正向引物
[0508] SEQ ID NO：51-FabB启动子的反向引物
[0509] SEQ ID NO：52-WhiB7TFD的正向引物
[0510] SEQ ID NO：53-WhiB7TFD的反向引物
[0511] SEQ ID NO：54-TFD的正向引物，该TFD含有肺炎克雷伯氏菌的σ54因子的识别序列
[0512] SEQ ID NO：55-TFD的反向引物，该TFD含有肺炎克雷伯氏菌的σ54因子的识别序列
[0513] SEQ ID NO：56-细胞穿透肽的序列
[0514] SEQ ID NO：57-WalR TFD共有序列
[0515] SEQ ID NO：58-SigB TFD共有序列
[0516] SEQ ID NO：59-KP_Sig TFD序列
[0517] SEQ ID NO：60-KP_Sig TFD共有序列。实施例
[0518] 虽然总的来说本文提及的许多技术是本领域熟知的，可以参考特别是Sambrook rdand Russell，3 Edition 2001，Molecular Cloning：a laboratory manual。
[0519] 实施例1
[0520] 1.1在有链球菌溶血素O的情况下，胆固醇标记TFD
[0521] 利用寡核苷酸引物，经PCR制备TFD，引物中一个带有5’胆固醇修饰，另一个在其5’末端有类似修饰或其他修饰(比如荧光染料，比如Cy5，这样可以容易地测量转录因子诱饵(TFD)的摄取)。如果TFD已被克隆到载体中，引物设计成能够退火到紧临插入片段的载体序列上，例如：
[0522] SEQ ID NO：1 Chol_TEf：5’胆固醇-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGGAAT TC[0523] SEQ ID NO：2 Cy5_TEr：5’Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG
[0524] 如果用于制备TFD的序列还没有考虑，可以直接合成(如果够短)并退火形成TFD，或者用与TFD内部退火的引物由基因组DNA直接扩增。
[0525] 将PCR产物乙醇沉淀，以500-1000ng/μl的浓度重悬于TE缓冲液(10mM Tris.HCl，1mM EDTA pH8.0)中。通常利用96孔板进行抗生素敏感性检测，每个孔中含有200ml培养液。例如，对于粪肠球菌，该培养液是补充了0.2U/ml链球菌溶血素O(Sigma)和5μg/ml万古霉素抗生素的BHI(脑心浸液Brain Heart Infusion)培养基(Becton Dickinson)，并接种万古霉素抗性粪肠球菌菌株。
[0526] 1.2经PCR制备哑铃
[0527] 哑铃诱饵是共价闭合的单链DNA，其特征在于含有目标因子的结合位点的双链中心，旁侧连接茎环结构。茎环通过阻止否则会降解诱饵多核苷酸的外切核酸酶的作用使诱饵稳定。因此，由于它们的特征性形状被称为哑铃TFDs(DB)。
[0528] 如1.1节所述，用含有目标结合位点的pGEMTEasy来源质粒作为模板，经PCR制备DBs。扩增使用的引物是：
[0529] SEQ ID NO：3DBTEf：5’P-CTTGG TTTTT CCAAG AGAAGAGC CCG CCATGG CGG CCG CGG GAATTC
[0530] SEQ ID NO：4DBTEr：P-CCG TCT TTT TGA CGG CGA AGA GCA GGC GGC CGC GAATTCACTAGT GA
[0531] 引物中将形成茎环的部分加有下划线。用合适载体进行的扩增产生如图4所示的DNA产物，DB中将与转录因子结合的部分显示为‘NNN NNN’。粗体显示的序列代表切口限制性内切酶Nt.BspQ1的结合位点。在图4的第二部分显示了Nt.BspQ1消化PCR产物的结果，该部分显示茎环结构为单链区域，这些区域将形成茎环并能随后通过用T4 DNA连接酶处理而连接形成共价闭合的环和DB。
[0532] 1.3通过质粒的限制性消化制备哑铃寡核苷酸
[0533] 替代地，哑铃的制备还可以通过将图4中显示的钝末端PCR产物克隆到合适的PCR克隆载体中，证实其身份和制备质粒。然后可以消化质粒释放插入片段，后者进一步用Nt.BspQ1消化以释放图4中第二部分显示的片段。该片段可以类似地用T4 DNA连接酶处理从而使DNA分子共价闭合并形成DB。
[0534] 这种方法的优势是从实践和经济角度更易于扩大规模，如果需要大量的哑铃。
[0535] 1.4用R9-胆固醇试剂进行转染
[0536] R9-胆固醇曾被描述能够协助真核细胞内siRNA分子的转染(或其他基于核酸的疗法)等(美国专利申请2007-0207966)。这里我们要描述它在给各种细菌转染TFD中的用途。
[0537] 如前所述(Kim W.J.et al，Mol.Ther.(2006)14：343-350)合成R9-胆固醇，该物质由附着在9个D-精氨酸线性链上的胆固醇分子构成。TFD与含量逐渐升高的R9-胆固醇在补充有5％葡萄糖的基于TE的缓冲液中混合。混合物在室温温育1小时，然后直接用于转染或者通过琼脂糖凝胶电泳分析。一般使用能够导致与DNA的复合体不在凝胶中跑的最小用量，即核酸骨架的电荷被所结合的多精氨酸所中和。胆固醇分子帮助TFD与细菌膜关联，并进入细胞。
[0538] TFD/R9-胆固醇偶联以多种浓度混合在96孔板的200μl培养液中。例如，对于粪肠球菌，培养液是补充了0.2U/ml链球菌溶血素O(Sigma)和5μg/ml万古霉素抗生素的BHI培养基，并接种万古霉素抗性粪肠球菌菌株。
[0539] 实施例2
[0540] WhiB7诱饵使耻垢分枝杆菌对抗生素敏感化
[0541] WhiB7是耻垢分枝杆菌中被显示参与决定该细菌对抗生素敏感性的一个基因。将该基因功能性删除导致细菌对抗生素高度敏感(PNAS(2005)102：12200)。WhiB7被认为是一种转录调控因子，文献中已描述过多个这类基因。病原菌结核分枝杆菌(结核病的致病原)中存在WhiB7的一个相近同源物。
[0542] 如实施例1.1所述制备含有WhiB7诱饵序列的诱饵多核苷酸，使用多种浓度在(含有钢丝的200ml摇瓶中的)20ml培养液中转染耻垢分枝杆菌。所用培养基是补充了10％ ODAC(Becton Dickinson)和亚抑制浓度的抗生素异烟肼(IZ)或利福平(RF)的9H11(Becton Dickinson)。摇瓶在37℃震荡温育，不同间隔取样品并测量吸光度(来监测细胞生长)。摇瓶用100nM的WhiB7 TFD(+)或阴性对照TFD(-)处理。明显在用WhiB7 TFD而不是对照TFD处理过的摇瓶中，细胞变得对测试过的两种抗生素都敏感(参见图5)。
[0543] SEQ ID NO：5-WhiB7 TFD 5’TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3’
[0544] 实施例3
[0545] FabB诱饵下调大肠埃希氏菌必要基因
[0546] FabB诱饵含有FadR调控因子的结合位点，所述调控因子控制参与脂肪酸合成关键途径的基因(包括fabA和fabB)的表达。已有报道功能性敲除fadR基因产生的大肠埃希氏菌菌株在脂肪酸合成方面有缺陷，不能在有抗生素浅蓝菌素(靶向脂肪酸合成)的情况下生长(J.Bacteriol.(2005)183：5292))。
[0547] FabB诱饵含有以下序列：
[0548] SEQ ID NO：6 FabB TFD 5’TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA3’
[0549] 如实施例1.1所述制备诱饵，以各种浓度用于转染96孔板的每个孔，孔中含有200μl补充了1μg/ml浅蓝菌素(Sigma)的Rich培养基(每升含有10g蛋白胨、5g NaCl、
1g酵母提取物，补充有终浓度0.2％葡萄糖和0.4％醋酸盐)。培养板在37℃震荡温育，用读板仪取(595nM处)吸光度读数。所有数据点进行三次。细菌是未用TFDs处理的(未处理)、转染FabB TFD(FabB)或者转染阴性对照的(Van)，所述阴性对照由其序列在大肠杆菌中没有的TFD构成。
1g酵母提取物，补充有终浓度0.2％葡萄糖和0.4％醋酸盐)。培养板在37℃震荡温育，用读板仪取(595nM处)吸光度读数。所有数据点进行三次。细菌是未用TFDs处理的(未处理)、转染FabB TFD(FabB)或者转染阴性对照的(Van)，所述阴性对照由其序列在大肠杆菌中没有的TFD构成。
[0550] 很显然在图6中，未处理样品和阴性对照样品在培养液中生长速度相当，而用FabB TFD处理使得细胞基本不生长。
[0551] 实施例4
[0552] 使金黄色葡萄球菌对应激反应敏感化的诱饵
[0553] 诱饵多核苷酸经电穿孔转染到金黄色葡萄球菌中。通过标准方法制备细菌细胞。简单地说，细胞在LB培养基中于37℃生长至对数早期，即420nM处的吸光度达到0.3。通过低速离心收集将细胞冷却到4℃并收集，在类似体积的无菌冰冷10％(v/v)甘油中洗三次。最后，细胞重悬于最初体积十分之一的10％甘油中。电穿孔的进行是将50μl细胞与
1μl TFD(通常100ng到1μg的DNA)在电穿孔小池中混合，然后在BioRad Genepulser中穿孔，仪器设置为2.5kEV、100Ω和25μF，得到时间常数在3.8到4.8ms的范围内。一般使用50μl电穿孔细胞接种含有30mM KOH(诱导应激反应)的10ml BHI或LB培养基。将
200μl细胞分到96孔板的小孔内，培养板在37℃中等震荡温育，通过测量吸光度监测生长。生长曲线图显示了特定TFD与对照(经过模拟电穿孔，没有转染DNA；或者转染了无关序列)相比，降低生长速度的效果(图7)。以下诱饵序列能够降低金黄色葡萄球菌在胁迫条件下的生长速度：
1μl TFD(通常100ng到1μg的DNA)在电穿孔小池中混合，然后在BioRad Genepulser中穿孔，仪器设置为2.5kEV、100Ω和25μF，得到时间常数在3.8到4.8ms的范围内。一般使用50μl电穿孔细胞接种含有30mM KOH(诱导应激反应)的10ml BHI或LB培养基。将
200μl细胞分到96孔板的小孔内，培养板在37℃中等震荡温育，通过测量吸光度监测生长。生长曲线图显示了特定TFD与对照(经过模拟电穿孔，没有转染DNA；或者转染了无关序列)相比，降低生长速度的效果(图7)。以下诱饵序列能够降低金黄色葡萄球菌在胁迫条件下的生长速度：
[0554] SEQ ID NO：7：LytM TFD 5’GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAAAA3’
[0555] SEQ ID NO：8 SsaA TFD 5’ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A3’.[0556] 实施例5
[0557] Sig TFD抑制金黄色葡萄球菌的生长
[0558] Sig_TFD含有金黄色葡萄球菌SigB蛋白的结合位点。该蛋白是控制大量胁迫相关基因的选择性σ因子(Wigneshawerajaj，Molecular Microbiology(2008)68：538)。通过用该TFD转染金黄色葡萄球菌细胞并在96孔板中规定培养基中培养细胞，TFD明显能够抑制细胞生长。Fhu DNA含有Fur转录因子的结合位点，Fur在铁限制情况下调节铁的摄取(Horsburgh et al，J.Bacteriol.(2001)183：468)。SsaA含有双组分调控因子WalR的结合位点，WalR被证实调控影响生长速度的12个基因(Dubrac & Msadek，J.Bacteriology(2004)186：1175)。
[0559] 5.1通过PCR制备TFDs
[0560] 按照同时待审的申请PCT/GB2008/003353中的描述通过PCR制备TFDs。用于PCR反应的寡核苷酸引物一般在5’端被修饰，其中一个含有5’胆固醇修饰。其他所用修饰包括生物素、胺、细胞穿透肽、荧光染料(比如Cy5或荧光素)，从而可以容易地测量TFD的摄取。考虑到的其他用于测试的修饰包括病原细菌细胞膜特有的脂类。因此可以给经PCR产生的TFDs的5’端修饰多种分子，作用在于：提高TFD的体内稳定性、提高摄取效率、能够通过荧光进行检测。如果TFD已被克隆到载体(pGEMT-Easy)中，引物要设计成与紧邻插入片段的载体序列退火，例如：
[0561] SEQ ID NO：1-Chol_TEf：5’胆固醇-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC3’
[0562] SEQ ID NO：2-Cy5_TEr：5’Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG 3’.[0563] 将PCR产物乙醇沉淀，以500-1000ng/μl的浓度重悬于TE缓冲液中。
[0564] 通过将含有带检验的结合位点的合成磷酸化寡核苷酸对退火来克隆TFDs。每对寡核苷酸3’端含有腺嘌呤，以方便克隆到带有5’胸腺嘧啶突出的pGEM_Teasy载体中(从而加速PCR产物的克隆)。
[0565] 为Sig TFD使用的引物序列是：
[0566] SEQ ID NO：28-SasigB FOR：GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA ATA A
[0567] SEQ ID NO：29-SASigB REV：TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C A
[0568] 为Fhu TFD使用的引物序列是：
[0569] SEQ ID NO：30-SAfhu FOR：ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA[0570] SEQ ID NO：31-SAfhu REV：AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA[0571] 为SsaA TFD使用的引物序列是：
[0572] SEQ ID NO：32-SsaA FOR：ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A
[0573] SEQ ID NO：33-SsaA REV：AAA ATA AGT CTG TTA CAA ATT TGT A AT A
[0574] 5.2在96孔板中进行生长研究.
[0575] 如5.1部分制备胆固醇/Cy5标记的诱饵多核苷酸。然后通常将1μg TFD与0.3μl脂质体转染剂DOTAP(Roche)混合，室温下温育10分钟。确定诱饵多核苷酸对细菌细胞生长的效果的检验用96孔板进行，每个孔含有200μl培养液，培养液由不是铁限制的BHI培养基(购自Becton Dickinson)补充60nM短杆菌肽(购自Sigma Corporation.Cat# G5002)构成，或者由类似地补充了短杆菌肽的缺铁培养基(NRPMI)构成。去除铁的方法其他地方有详细描述(Science(2004)305：1626-1628)。每个孔中加入1μl各种浓度的胆固醇/Cy5标记的诱饵-TFD复合体，在温育过程中通过测量不同时间培养液的吸光度监测它们对葡萄球菌细菌生长的效果。平板于37℃震荡温育，用读板仪取(450nM处的)吸光度读数。测试了多个诱饵：Sig、Fhu和SsaA。
[0576] 由图8可见，很明显用只有10nM Sig TFD进行的处理阻止了在BHI培养基中的生长，而类似用量的fhu TFD对细菌在该培养基，即不是铁限制的培养基中的生长没有影响。10nM SsaA TFD造成细菌生长有可测量到的延缓。
[0577] 使用铁限制培养基时，证明10nM fhu TFD能够阻止生长，而类似用量的对照TFD(SsaA)在这些条件下对细菌生长没有影响。
[0578] 实施例6
[0579] Fur TFDs控制fhu的表达，阻止金黄色葡萄球菌在铁限制培养基中的生长。
[0580] 设计TFDs与Fur转录因子结合，该转录因子在控制细菌摄取铁(Somerville and Proctor(2009)Microbiol.Mol.Biol.Rev.73：233-248)、负调控fhu操纵子中发挥核心作用，所述fhu操纵子控制被清出的铁(scavenged iron)的运输。铁对生长很重要-它为电子传递所需要并且在许多酶学过程中作为辅助因子。但是在宿主中，铁以限制量存在，通常通过合并到诸如转铁蛋白和乳铁蛋白的宿主载体蛋白中而不能被细菌获得。针对这一点，金黄色葡萄球菌合成高亲和力的铁螯合剂-铁载体来结合铁并利用(比如fhuCBG编码的)ABC转运蛋白将铁-铁载体复合体运输到细胞质中。因为输入过多的铁会导致经费顿反应(Fenton reaction)形成自由基，随后引起细胞损伤(Wandersman and Delepelaire，Ann Rev Microbiol(2004)58：611-647)，铁摄取必须受到严格的调控。Fur敲除菌株在体外铁限制培养基中生长不良并在动物模型中丧失致病性(Horsburgh，et al.J.Bacteriol(2001)183：468-475)，这表明了Fur有作为治疗目标物的潜能。
[0581] 6.1方法
[0582] 6.1.1细菌菌株和培养条件
[0583] 金黄色葡萄球菌ATCC 6538NA培养物生长和维持在BHI培养基(BectonDickenson)中。冷冻菌种的制备是将对数早期(A600的OD为0.3)的培养物和相同体积的
50％甘油混合并冷冻在-80℃。BHI是用于非铁限制条件的培养基，如前所述(Skaar et al.2004)制备的NRPMI用于铁限制的生长条件。
50％甘油混合并冷冻在-80℃。BHI是用于非铁限制条件的培养基，如前所述(Skaar et al.2004)制备的NRPMI用于铁限制的生长条件。
[0584] 6.1.2制备TFD
[0585] 制备含有TFD序列的质粒是通过将以下序列退火，所述序列分别是：含有Fur结合位点的寡核苷酸(SAFur1，5’P-ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA-3’(SEQ ID NO：30)和SAFur2，5’P-AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA-3’(SEQ ID NO：31))；对照序列(Con1，5’P-TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TA-3’(SEQ ID NO：34)和Con2，5’P-ACG GAC CCG CAG TCA CCC GGA TCC GTG GCC AA-3’(SEQ ID NO：35)；
将它们连接至pGEMTEasy载体(Promega)并转化到大肠杆菌DH5α(Invitrogen)中。然后利用针对pGEMTeasy的标记引物chol-Tef(5’-胆固醇-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC-3’(SEQ ID NO：1))和cy5-Ter(5’-Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TGA-3’(SEQ ID NO：2))经PCR扩增TFDs并通过乙醇沉淀纯化。
将它们连接至pGEMTEasy载体(Promega)并转化到大肠杆菌DH5α(Invitrogen)中。然后利用针对pGEMTeasy的标记引物chol-Tef(5’-胆固醇-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC-3’(SEQ ID NO：1))和cy5-Ter(5’-Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TGA-3’(SEQ ID NO：2))经PCR扩增TFDs并通过乙醇沉淀纯化。
[0586] 6.1.3转染程序
[0587] 将21mg短杆菌肽溶解在1ml甲醇中新鲜制备短杆菌肽储液。使用前在水中稀释并进一步1/100稀释到生长培养基中得到终浓度60nM。用冷冻的金黄色葡萄球菌菌种1/100接种补充培养基，室温下温育10分钟。TFD-DOTAP复合体的形成是将1ug TFD与2μg DOTAP(Roche)混合并在实验台上于室温温育10分钟。然后将TFD复合体与接种了的培养基混合，分样到96孔平底板中，在37℃震荡培养，用BioTek读板仪分析生长情况。
[0588] 6.1.4通过实时qPCR定量TFD的数量
[0589] 从每个孔得到的细胞在PBS(磷酸缓冲盐水)中洗两次，重悬于100μl水中。每个qPCR反应中使用1μl各个样品，将DNA标准或者样品与引物混合，分别在补充了0.5μl ROX的12.5ul SYBR Green DNA混合液(Invitrogen)中扩增TFD(Tef和Ter；SEQ ID NOs 1 & 2)或者16S rRNA(stypF，5’-ACG GTC TTG CTG TCA CTT ATA-3’(SEQ ID NO：36)；stypR，5’-TAC ACA TAT GTT CTT CCC TAA TAA-3’(SEQ ID NO：37))。得到的数据用于计算每个基因组中存在的TFD数量。
[0590] 6.1.5RNA分析
[0591] 培养物用RNA Protect试剂(Qiagen)处理，按照描述收集细胞并保存在-80℃。将细胞重悬于含有100μg/ml溶葡萄球菌素的100μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)中，在37℃温育30分钟来裂解细胞。加入700μl RLT缓冲液(Qiagen RNA提取试剂盒)，按照生产商的实验方案收集RNA。用Invitrogen DNase I将任何残留的DNA消化掉-2.5μg RNA样品与1.25U DNAseI混合在25μl中，室温放置15分钟。加入2.5μl 25mM EDTA并在65℃加热10分钟来灭活DNAseI酶，处理过的RNA利用随机引物合成进行cDNA合成(NEB Protoscript)。利用标准实时PCR方法，使用cDNA来定量相对转录，为fhu基因使用的引物qSAfhuF，5’-CGT CAA TCA TTG GTC CTA ACG GCT GC-3’(SEQ ID NO：38)；qSAfhuR，5’-GCC ATC TGC TAC TTC AGG TGA TTG AGG-3’(SEQ ID NO：39)；归一化利用16s rRNA水平(使用的引物为stypF和stypR；SEQ ID NOs：36 & 37)。
[0592] 6.2结果
[0593] 6.2.1Fur TFD在非铁限制性培养基中的转染。
[0594] 铁的可得性影响着59个金黄色葡萄球菌基因的调控，其中17个显示是Fur调控的(Allard et al，Microbiol.Infect.(2006)8：1679-1690；Xiong et al，J.Infect.Dis.(2000)181：1020-1026；Horsburgh et al，J.Bacteriol.(2001a)183：468-475)。Fur还作为某些Per调控的基因，包括katA(编码氧化胁迫抗性所需的催化剂)的正调控因子(Horsburgh et al，Infect.Immun.(2001b)69：3744-3754；Morrissey et al，Infect.Immun.(2004)72：972-979)，因此fur突变体防止毒性羟基形成的能力受到损害。这些多样化而复杂的调控特性可能是造成金黄色葡萄球菌fur突变体毒性下降的原因。为了评估TFD方法在调控Fur活性中的可行性，设计整合了Fur结合位点的TFD，其中所述结合位点是先前在金黄色葡萄球菌fhu启动子上进行的足迹法实验鉴定到的(Xiong et al.2000)。对照TFD由核苷酸组成类似的金黄色葡萄球菌基因组中没有的无关序列构成，这是为了确认Fur TFD的作用是否是序列特异的，以及是否转染程序本身造成了杀菌效果。将每个核苷酸序列连接到大肠埃希氏菌载体pGEMTEasy中，得到的质粒用侧接插入位点的引物经PCR制备TFDs。常规地将引物5’端修饰，这部分地是为了通过使TFD免于核酸外切酶的作用而提高TFD的稳定性，但也是为了使所述分子用胆固醇(正向引物)和cy5染料(反向引物)而功能化。因此，Fur TFD的总长度是60bp，对照TFD的总长度是62bp。
[0595] 为了实现转染，将TFDs与商品脂质制品DOTAP混合形成稳定的复合体，屏蔽磷酸骨架的阴离子。然后将TFD-DOTAP复合体与金黄色葡萄球菌在非铁限制性的BHI培养基中混合，所述培养基中补充有60nM短杆菌肽。短杆菌肽是一种抗微生物肽，具有抗革兰氏阳性细菌的膜的活性(Herrell and Heilman，J.Clin.Invest.(1941)20：583-591)。发明人以前的实验已证实亚致死浓度的短杆菌肽能够使得TFD-DOTAP复合体与细菌膜融合并摄取TFD。加入转染试剂与对照TFD造成金黄色葡萄球菌生长速度下降。这可能是由于弱化细胞壁而导致的某些杀菌活性。用1nM Fur或对照TFD进行的转染导致在铁富集培养基中有非常类似的生长曲线(图9)。有趣的是，fur敲除表现出在富集培养基中的生长缺陷(Horsburgh et al，2001)而对照和Fur TFD测试样品之间没有可见的差别。这种不同的一个解释可能是因为生长条件(例如，96孔板上通气不好)和培养基不同，但更恰当的原因可能是基因敲除和TFD处理效果之间的本质不同。Fur_TFD会阻止任何能够结合该位点的转录因子，不仅是Fur蛋白，还有与同一位点结合的其他蛋白。人们逐渐认识到细菌中的转录调控比先前认为的要复杂的多，而且与真核细胞中一样，影响表达的转录因子有一个以上，有来自许多调控网络的参与，因此是组合式的(Barnard et al，Curr.Opin.Microbiol.(2004)7：102-108).
[0596] 进行定量PCR来证实细胞是否发生了转染以及是否每个基因组中有许多TFD进入。在没有短杆菌肽和DOTAP的情况下，没有检测到TFDs在细菌细胞内部或者附着在细胞上，这表明TFDs不会自发进入细胞，清洗程序成功地除去了与细胞表面非特异关联的任何TFDs。在有转染剂存在的情况下，检测到每个基因组中Fur和对照TFD分别有4500和5340个TFDs(图10A)。因此，转染程序将相当多数量的两种TFDs递送到细菌细胞内，对细胞在铁富集培养基上的生长没有任何可观察到的效果差别。
[0597] 6.2.2TFD调控的fhu表达
[0598] 如果Fur_TFD结合Fur，则阻止它与fhu启动子的结合预期会解除对fhu基因的抑制。为了检验这一点，将Fur_TFD处理过的样品中存在的fhu转录产物的拷贝数(标准化为核糖体DNA)与对照样品进行比较(图10B)。对分离自样品的RNA进行的定量实时RT-PCR如图9所示证明Fur_TFD给fhu转录造成了与预期一致的变化：比对照样品高5倍。因此，特异TFD的转染可以用于调整金黄色葡萄球菌中已知对致病性关键的基因的表达方式。
[0599] 6.2.3Fur TFD在铁限制培养基中对生长的影响
[0600] 使用相同的转染方案将Fur和对照TFDs引入培养在铁限制性培养基中的金黄色葡萄球菌(Skaar et al，Science(2004)305：1626-8)。正如预期的，与在BHI中生长情况相比，在该培养基中的生长被延缓。但是，用Fur TFD转染过的培养物在整个试验过程中未能显示任何生长迹象(图11)，表明干扰铁限制情况下铁的调控对生长是有害的，这再现了在Fur敲除突变体中看到的结果(Horsburgh et al，2001a)。
[0601] Fur转录因子通常被认为是一个作用于全局的阻遏物，在铁过量的情况下它下调铁摄取基因的转录，从而防止费顿反应造成的铁中毒(Wandersman& Delepelaire，Ann.Rev.Microbiol.(2004)58：611-647)。金黄色葡萄球菌fur突变对毒性也有不利影响，在铁限制条件下不能生长，导致在体内的毒性减弱(Horsburgh et al.2001a)。这种现象的原因还不清楚，但可能反映了Fur在帮助细菌适应环境变化中的核心作用，和受损的应答氧化胁迫的能力。对毒性的这种影响似乎不是金黄色葡萄球菌所特有的。fur突变也导致霍乱弧菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在体内的毒力减弱(Mey et al，Infect.Immun.(2005)73：8167-8178；Palyada et al，J.Bacteriol.(2004)186：4714-4729；Bury-Mone et al，Mol.Microbiol.(2004)53：623-638；Jacobsen et al，Infect.Immun.(2005)73：3740-3744；Harvie et al，Microbiol.(2005)151：569-577)。对金黄色葡萄球菌Fur共有序列和以前鉴定到的序列(Horsburgh et al.2001a)进行生物信息学分析(利用MEME软件(http://meme.sdsc.edu/meme4 1/intro.html)显示该序列在蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌中高度保守(图12)，预示了抗其他芽孢杆菌目细菌的活性。
[0602] 反义分子已被用于治疗病原细菌。最值得注意的使用诸如肽核酸(Good& Nielsen，Nat.Biotech.(1998)16：355-358)和吗啉基寡核苷酸(Shen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2009)106：8163-8168)的修饰骨架，并用阳离子肽实现递送。它们在微摩浓度下调目标mRNA的翻译从而抑制微生物的体外和体内生长。转换为修饰骨架具有的优势是提高了寡核苷酸在生物液体中的稳定性并且减少或去除了磷酸骨架的负电荷。后一种效果的优势是修饰寡核苷酸更容易穿过带负电的细菌外膜进行转染。但是，因为TFD通过干扰DNA-蛋白质相互作用发挥作用，磷酸骨架可能对蛋白识别很重要，不能轻易替换。
[0603] 本实施例显示TFDs，作为含有天然骨架的较大寡核苷酸，可以有效地利用肽和脂质体组合递送到细胞内，从而在纳摩浓度下杀死细菌。TFDs因为阻断酶促过程(转录)，因此在低的多的浓度即很有效，而反义分子作为转录产物(mRNA)的空间障碍发挥作用。使用TFD的再一优势是它们阻断许多关键基因的表达，而不是只有一个目的物，这使它们对抗性机制较不易感。
[0604] 实施例7
[0605] Sig TFD抑制MRSA菌株的生长
[0606] 如实施例5.1所述制备胆固醇/Cy5标记的诱饵多核苷酸。然后一般取1μg Sig TFD与0.3μl脂质体转染剂DOTAP(1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane；Roche)复合，室温下温育10分钟。确定它们对细菌细胞生长的影响的检验用96孔板进行，培养板中每孔含有由补充了60nM短杆菌肽(Sigma Corporation.Cat# G5002)的BHI培养基(Becton Dickinson)构成的200μl培养液。向每个孔加入1μl各种浓度的胆固醇/Cy5标记诱饵-TFD复合体，监测对已被证实是甲氧西林抗性菌株(MRSA)的金黄色葡萄球菌临床分离株生长的影响。通过在温育过程不同时间测量培养液的吸光度来监测生长情况。培养板在37℃震荡温育，用读板仪获取(450nM处的)吸光度读数。
[0607] 如图13所示，很显然用只有10nM的Sig阻止了MRSA菌株在BHI培养基中的生长。类似用量的对照TFD(含有长度类似的金黄色葡萄球菌基因组中不存在的无关序列)对细菌在该培养基中的生长没有影响。
[0608] 实施例8
[0609] Sig TFD强化抗生素抗EMRSA15(临床分离的流行株)的作用
[0610] 如实施例9.1所述制备Sig哑铃TFD(见下文)。用研究成熟的MRSA菌株-EMRSA15A，如实施例5.2所述进行生长分析。该菌株表现出对甲氧西林(能够在2mg/ml抗生素中生长)、0.5mg/ml红霉素和0.5mg/ml环丙沙星(Porter and Damani，J.Hospital Infection(2007)65：88)的抗性。
[0611] 如下表1所示，通过确定细菌培养物生长过程中的延迟时间，测量到EMRSA15菌株在有10nM Sig TFD的情况下，重新对甲氧西林、红霉素和环丙沙星敏感。这种试验中，用对照TFD(如实施例5.1所述)和抗生素处理过的培养基的延迟时间为0表明培养物和生长在补充了抗生素的培养基中的未处理细菌在相同的时间点开始生长。对于Sig TFD处理过的培养物，延迟时间是与有抗生素情况下对照TFD中看到的相比在生长上的滞后。因此，延迟时间6.4小时(在有2mg/ml甲氧西林的情况下)、8.2小时(在有0.5mg/ml红霉素的情况下)和8.3小时(在有0.5mg/ml环丙沙星的情况下)表明Sig TFD与这些抗生素协同作用延缓生长。
[0612] 该效果的机制可能是Sig TFD阻止或下调了应激反应调节子的抗生素介导的诱导，使得细胞更敏感。因为多数抗生素能够引起应激反应，如果组合使用TFD，我们预计能提高所有或大部分这类抗生素的药效。
[0613] 表1
[0614]
[0615] 延迟时间定义为由于TFD处理造成的(与模拟转染培养物相比的)生长滞后。
[0616] 实施例9
[0617] 哑铃构型中的Sig TFDs抑制临床分离的MRSA菌株的生长
[0618] 9.1通过连接(DB-TFD)制备TFD哑铃
[0619] 合成两个寡核苷酸，每个含有金黄色葡萄球菌选择性σ蛋白的识别位点的一条链。分子的任一端有小的发卡环用于保护分子不被降解。每个寡核苷酸以250pmol/μl的浓度重悬于dH2O中。
[0620] 为了形成Sig哑铃TFD(被称为SA3TFD)，合成了以下磷酸化寡核苷酸：
[0621] SEQ ID NO：40-SigDB_SA3：CTTGG TTTTT CCAAG GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA ATA
[0622] SEQ ID NO：41-SigDB_SA3：P-CCG TCT TTT TGA CGG TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C
[0623] 退火时，它们形成了以下分子：
[0624]
[0625] 一般取每种寡核苷酸30μl与27μl dH2O混合，并利用以下PCR程序退火：退火：95℃ 3分钟，以-0.1℃/s冷却到8℃，接受。这之后，加入10μl10xNEB连接酶缓冲液和
3μl HC T4 DNA连接酶(NEB)。混合液在16℃温育过夜。然后材料用T7核酸外切酶(NEB)广泛消化来除去任何没有连接的寡核苷酸，然后经两轮乙醇沉淀回收。
3μl HC T4 DNA连接酶(NEB)。混合液在16℃温育过夜。然后材料用T7核酸外切酶(NEB)广泛消化来除去任何没有连接的寡核苷酸，然后经两轮乙醇沉淀回收。
[0626] 还制备了含有乱序版本的Sig结合位点的DB_TFD。这种情况中，使用的磷酸化引物是：
[0627] SEQ ID NO：42-SigScr_SA1：CTTGG TTTTT CCAAG TAG AAA GAA GAT TTA GGG CGA T TTT ATAATA TAT
[0628] SEQ ID NO：43-SigScr_SA2：CCG TCT TTT TGA CGG ATA TAT TAT AAA ATC GCC CTA AAT CTT CTT TCT A
[0629] 9.2在96孔板中进行生长研究
[0630] 用哑铃构型的Sig TFD和临床分离的MRSA菌株，如实施例5.1所述进行生长分析。
[0631] 如图14所示，只有10nM的Sig TFD浓度即可抑制细胞生长，而类似浓度的对照TFD不能。
[0632] 实施例10
[0633] WalR DB-TFD阻止EMRSA15的生长
[0634] 10.1制备含有WalR结合位点的DB TFDs
[0635] 将WalR的结合序列引入哑铃寡核苷酸中并如实施例9.1所述制备。这些磷酸化寡核苷酸的序列是：
[0636] SEQ ID NO：44-WalRDB2.1：CTTGG TTTTT CCAAG TAA TGA ATG A GTT TAA AGC CCA TGT AAA AG GGG TAT CAG TAC
[0637] SEQ ID NO：45-WalRDB2.2：CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT TTA CAT GGG CTT TAA ACT CAT TCA TTA
[0638] 含有乱序的(scrambled)WalR结合位点的第二对寡核苷酸被用来制备对照哑铃(Scr.WalR)。这些磷酸化寡核苷酸的序列是：
[0639] SEQ ID NO：46-WalRDB3.1：P-CTTGG TTTTT CCAAG GTA ATA TGA C AAG ATT GTA AAT GAC CTA GTT GAG AG ATGCCA
[0640] SEQ ID NO：47-WalRDB3.1：P-CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TAC
[0641] 10.2通过用溶葡萄球菌素共处理来转染EMRSA15
[0642] 如实施例7.1所述进行生长分析，唯一的不同是培养基补充了0.5到2.5pg/ml的溶葡萄球菌素，而非短杆菌肽。溶葡萄球菌素是溶菌酶样的一种酶，特异作用于金黄色葡萄球菌细胞壁。
[0643] 正如图15中可以看到的，10nM Sig DB-TFD即可抑制细菌生长，而类似量的对照DB-TFD没有效果。
[0644] 实施例11
[0645] WalR TFD抑制MRSA在小鼠脓毒症模型中的生长
[0647] 11.1方法
[0648] 11.1.1细菌菌株和生长
[0649] 金黄色葡萄球菌EMRSA16培养物生长和保持在BHI培养基(Becton Dickenson)中。冷冻菌种的制备是将对数早期(A600的OD为0.3)的培养物与等体积50％甘油混合并冷冻在-80℃。
[0650] 11.1.2TFD的制备
[0651] 按照以前的描述制备哑铃构型的TFDs(Ahn et al，2003)。TFDs的制备包括：将磷酸化的寡核苷酸对连接形成含有WalR蛋白的结合位点(与发生在lytM启动子中的情况一样)的TFD(WalR_TFD)或者含有所述结合位点的乱序版本的TFD(Scr_TFD)。将寡核苷酸以100pmol/ul的终浓度重悬于T4DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400U T4DNA连接酶中，16℃温育过夜。第二天早晨给反应缓冲液补充10 U Exonuclease I(NEB)并在
37℃消化30分钟，然后通过酚-氯仿萃取和乙醇沉淀来纯化。TFDs以1mM的浓度重悬于水中。
37℃消化30分钟，然后通过酚-氯仿萃取和乙醇沉淀来纯化。TFDs以1mM的浓度重悬于水中。
[0652] 用于形成WalR_TFD的一对寡核苷酸的序列是：
[0653] SEQ ID NO：48-WalR1：5’-P-CTT GGT TTT TCC AAG TAA TGA ATG AGT TTA AAG CCC ATG TAA AAG GGG TAT CAG TAC-3’和
[0654] SEQ ID NO：49-WalR2：5’-P-CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT TTA CAT GGG CTT TAA ACT CAT TCA TTA-3’.
[0655] 对Scr_TFD，序列是：
[0656] SEQ ID NO：46-WalRDB3.1：5’-P-CTT GGT TTT TCC AAG GTA ATA TGA CAA GAT TGT AAA TGA CCT AGT TGA GAG ATG CCA-3’和
[0657] SEQ ID NO：47-WalRDB3.1：5’-P-CCC TCT TTT TGA GGG TGG CAT CTC TCA ACT AGG TCA TTT ACA ATC TTG TCA TAT TAC-3’.
[0658] 11.1.3MRSA的体外转染
[0659] 将1ug TFD与2μg DOTAP(Roche)混合并放在实验台上室温温育10分钟形成TFD-DOTAP复合体。然后TFD复合体与补充有10ng/ml溶葡萄球菌素(Sigma；L9043)的接好种的培养基混合，分液到96孔平底培养板中，通过在BioTek读板仪中37℃震荡培养分析生长情况。
[0660] 11.1.4小鼠脓毒症模型
[0661] 小鼠脓毒症研究由Euprotec(UK)执行。这项研究中使用的小鼠是由Charles River(Margate UK)提供的无特定病原雄性CD1小鼠(送达时16-18g)。所有小鼠在试验开始时重22-25g。
[0662] 11.1.5耐药性研究
[0663] 为了进行耐受性研究，动物分成每个处理组2只小鼠的组进行处理，因此研究总共使用10只。所有小鼠在研究第一天称重，随机放到盒子中。用10ml/kg静脉内给予小鼠以下处理，五个处理组是：100μM WalR_TFD、2.5mMDOTAP、6.3μg/ml溶葡萄球菌素、TFD/DOTAP/溶葡萄球菌素混合液、盐水。小鼠每天在处理后称重，共100小时后被安乐死，取肺、肝、脾和肾，目测并称重。
[0664] 11.1.6PK研究
[0665] 对于PK研究，每个时间点3只一组处理动物，因此本项研究共用24只。静脉内递送5nM/kg WalR_TFD、25nM/kg DOTAP、31.5m/kg溶葡萄球菌素混合液来处理小鼠。将小鼠组在处理后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时异氟烷麻醉，之后通过心脏穿刺取血。所有样品采集血浆(用肝素抗凝集并在分离前保存在冰上)。采血后取出肾，在1ml冰冷的PBS中均质化。利用qPCR检测生物样品中的TFDs。
[0666] 11.1.7组织载菌量研究
[0667] 对于组织载菌量研究，动物分成每个处理组8只小鼠的组进行处理，因此研究总共使用48只。制备2x10ml金黄色葡萄球菌EMRSA 16培养物，放在定轨振荡器(220rpm)上37℃过夜。第二天，从振荡器取下金黄色葡萄球菌EMRSA 16培养物，沉淀并洗涤两次，然后
8
重悬于盐水中至OD 0.132(1.5x10cfu/ml)。然后将这个金黄色葡萄球菌EMRSA 16储液在
7
盐水中进一步1∶1.5稀释(1x108cfu/ml)，即每只小鼠2.0x10 个细菌。48只小鼠然后用
0.2ml 1.0x108/mL悬液感染。接种后剩余悬液中每mL的金黄色葡萄球菌EMRSA 16细菌数量也进行了计数来证实感染菌量。感染后1、9和17小时，用化合物或媒介物处理小鼠，但万古霉素仅在1小时后给予。处理与先前一样是TFD/DOTAP/溶葡萄球菌素混合液，使用
1nM/kg浓度的TFD与DOTAP 5∶1摩尔比率和63μg/kg溶葡萄球菌素。感染25小时后，将所有小鼠称重，然后安乐死。立即取出肾，在冰冷的无菌磷酸盐缓冲液+0.05％ Tween 80中均质化。器官均浆在CLED琼脂上定量培养，于37℃温育最多3天，计数菌落。用Stats Direct通过Kruskal-Wallis检验分析来自培养物载菌量的数据。
8
重悬于盐水中至OD 0.132(1.5x10cfu/ml)。然后将这个金黄色葡萄球菌EMRSA 16储液在
7
盐水中进一步1∶1.5稀释(1x108cfu/ml)，即每只小鼠2.0x10 个细菌。48只小鼠然后用
0.2ml 1.0x108/mL悬液感染。接种后剩余悬液中每mL的金黄色葡萄球菌EMRSA 16细菌数量也进行了计数来证实感染菌量。感染后1、9和17小时，用化合物或媒介物处理小鼠，但万古霉素仅在1小时后给予。处理与先前一样是TFD/DOTAP/溶葡萄球菌素混合液，使用
1nM/kg浓度的TFD与DOTAP 5∶1摩尔比率和63μg/kg溶葡萄球菌素。感染25小时后，将所有小鼠称重，然后安乐死。立即取出肾，在冰冷的无菌磷酸盐缓冲液+0.05％ Tween 80中均质化。器官均浆在CLED琼脂上定量培养，于37℃温育最多3天，计数菌落。用Stats Direct通过Kruskal-Wallis检验分析来自培养物载菌量的数据。
[0668] 11.2结果
[0669] 11.2.1WalR_TFD在体外迅速杀死MRSA
[0670] 基因敲除实验中显示高度保守的双组分系统WalK/WalR(又称为YycG/YycF)对于金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性病原菌的活力很关键。在调控子几个基因，包括lytM/SA0265的启动子中都鉴定到转录因子WalR的结合位点(Dubrac，Boneca et al.2007)。该版本被用于WalR_TFD和序列被随机重新排列的乱序版本Scr_TFD。
[0671] 研究中使用了英国医院流行的MRSA菌株-EMRSA-16(Cox，Mallaghan etal.1995)。TFDs与商品脂质制品DOTAP混合，然后与接种了EMRSA-16的培养基和溶葡萄球菌素混合。溶葡萄球菌素是作用于金黄色葡萄球菌壁的一种溶解酶试剂，它在本试验中的用途是使细菌的外肽聚糖层变薄，从而允许TFD在DOTAP载体与暴露出来的细菌内膜融合后转染细胞。利用这个转染方案，观察到与未处理样品相比，用对照TFD，即Scr_TFD处理对细菌生长没有可检测到的效果。但是WalR_TFD在浓度1nM即阻止了EMRSA-16的体内生长(图16)。总的活菌计数证实了这一结果，用WalR_TFD进行的处理将活菌数量减少了
5个数量级(图17A)。将未被WalR_TFD处理杀死的细菌进行次级培养，以便确定是否存在任何抗性。这个过程总共重复了4次，记录活菌计数的减少(图17B)和体外生长曲线(图
17C，黑色方形：第四次传代的细菌)。因此，没有证据表明发展了对TFD介导的杀伤的抗性机制。
5个数量级(图17A)。将未被WalR_TFD处理杀死的细菌进行次级培养，以便确定是否存在任何抗性。这个过程总共重复了4次，记录活菌计数的减少(图17B)和体外生长曲线(图
17C，黑色方形：第四次传代的细菌)。因此，没有证据表明发展了对TFD介导的杀伤的抗性机制。
[0672] 为了确定TFD对细菌的杀伤是一接触即可还是需要较长接触时间，给EMRSA-16转染1nM WalR_TFD/DOTAP复合体，温育30分钟，之后微量稀释到不含有任何TFD复合体或溶葡萄球菌素的新鲜培养基中。再进行体外生长48小时(图18)，明显没有观察到生长，证实TFDs能够一接触即杀死细胞。
[0673] 11.2.2耐药性研究
[0674] IV给药后所有药物都被很好地耐受；没有急性事件要报道。处理后，小鼠正常摄食饮水，没有任何痛苦的迹象。处理小鼠与媒介物对照小鼠的体重增加相同。尸检显示肾、肺、肝或GI道中没有严重的异常。肾、肺和肝的重量在正常范围内。所有测试化合物都耐受，适合进一步加量到本项耐药性研究使用的最大剂量。
[0675] 11.2.3组织载菌量研究
[0676] 给予的感染剂量目标定在每只小鼠2.0x107个细菌以保证建立相对温和的感染(这样对处理更敏感)。小鼠的处理通过系统注射媒介物、1nMScr_TFD复合体、1nM WalR_TFD复合体或者万古霉素，所用浓度足够使菌落形成单位(cfu)降低2倍。处理后，小鼠被处死，测量肾内发现的载菌量(图19)。对结果进行的统计分析表明与Scr_TFD对照相比，WalR_TFD处理的小鼠载菌量的下降与万古霉素达到的载菌量下降类似(以下表2)。
[0677] 表2.体外结果的统计学分析。Kruskal-Wallis：Scr_TFD的所有配对比较(Dwass-Steel-Chritchlow-Fligner)
[0678]
[0679]
[0680] 我们发现这个试验中的WalR_TFD在纳摩浓度对MRSA在体外和体内都有快速的杀菌活性。
[0681] 实施例12
[0682] 用FabB TFD转染大肠杆菌使细菌对抑制脂肪酸合成的抗生素敏感化
[0683] 12.1制备FabB TFD
[0684] 设计FabB TFDs给它引入脂肪酸合成酶转录调控因子FadR的结合位点，该结合位点在大肠埃希氏菌中位于FabB基因的上游。FabB基因编码参与脂肪酸合成的酶(J.Bacteriology(2005)183：5292)。
[0685] 如实施例4.1所述制备PCR TFDs，不同之处是有FabB启动子的一个60碱基对的部分被克隆到pGEMT-Easy载体中。扩增启动子序列所用的寡核苷酸是：
[0686] SEQ ID NO：50-fabBf：TCT TTA AAT GGC TGA TCG GAC TTG
[0687] SEQ ID NO：51-fabBr：AGT AAG TTT CGA ATG CAC AAT AGC GTA
[0688] 还制备了对照TFD，该对照TFD的序列在用于和分离自耻垢分枝杆菌的基因组DNA进行扩增反应时，产生类似大小的PCR片段。这些寡核苷酸的序列是：
[0689] SEQ ID NO：52-WhiB7.f：CAC CAG CCG AAA AGG CCA CGG
[0690] SEQ ID NO：53-WhiB7.r：CAA AAA TGG CCA CGG ATC CGG GTG
[0691] 12.2生长分析
[0692] 按照实施例4.1的描述测量TFDs对大肠杆菌细菌培养物生长的影响，几处改动是：所用培养基是LB；所用共转染剂是40nM多粘菌素，而非短杆菌肽；培养基中还补充了10μg/ml浅蓝菌素(CER)。CER是作用于脂肪酸合成的抗生素。在所用浓度，它对大肠杆菌的生长没有可见的影响。
[0693] 图20显示用10nM FabB TFD处理大肠杆菌使得细菌对浅蓝菌素的作用敏感，而对照TFD(WhiB7，所含序列已知在大肠杆菌基因组中不存在)不能。使用的抗生素浅蓝菌素(CER)在20ug/ml时的确开始抑制细胞在对照TFD存在的情况下的生长，但这个时候FabB TFD的协同作用已经能够杀死细胞。
[0694] 因为FabB TFD被设计成能够下调脂肪酸合成操纵子的基因，我们的设想是该TFD可以与任何抗生素组合使用，这种组合或者直接或间接地干扰脂肪酸合成，从而提高所述抗生素的效力，或者抵消抗性机制。
[0695] 实施例13
[0696] 转染含有肺炎克雷伯氏菌σ54因子识别序列的TFD延缓细菌生长
[0697] 制备并测试含有来自病原生物肺炎克雷伯氏菌的选择性σ因子(σ54)的结合位点的PCR TFD。与无关对照TFD的活性相比，Sig TFD抑制了细胞的生长。σ54是控制细菌中应激反应的调控的另一例σ因子。
[0698] 13.1制备TFD
[0699] 如实施例5.1所述制备TFD。所用退火的寡核苷酸序列是：
[0700] SEQ ID NO：54-Ks54f：P-CCG ATA AGG GCG CAC GGT TTG CAT GGT TAT A[0701] SEQ ID NO：55-Ks54r：P-ATA ACC ATG CAA ACC GTG CGC CCT TAT CGG A[0702] 13.2转染肺炎克雷伯氏菌
[0703] 如4.1部分所述进行生长分析，不同之处是使用M9培养基(Sambrook etnd
al(1989)Molecular Cloning.2 Edition vol.3p.A3)。该培养基中没有补充任何共转染剂。
al(1989)Molecular Cloning.2 Edition vol.3p.A3)。该培养基中没有补充任何共转染剂。
[0704] 通过将TFD与细胞穿透肽复合实现转染。所述肽由两部分构成：9个D-精氨酸的线性链和一个以前描述过的能够穿透肺炎克雷伯氏菌膜的肽序列(Vaara，Antimicrobial Agents and Chemotherapy(1996)40：1801)。带正电荷的精氨酸(R9)用于借助电荷相互作用结合TFD的磷酸骨架。利用这种R9尾巴与转染部分复合以便转染细菌以前已有描述(Kim，Molecular Therapy(2006)14：343)。所用肽的完整序列是：
[0705] SEQ ID NO：56-IKFLKFLKFL-(D-精氨酸)9
[0706] TFD与含量逐渐升高的IKFLKFLKKL-R9肽在补充有5％葡萄糖的基于TE的缓冲液中混合。混合液在室温温育1小时，然后直接用于转染或者通过琼脂糖凝胶电泳分析。一般使用能够导致与DNA的复合体在凝胶中不动的最小用量，即核酸骨架的电荷被结合多精氨酸所中和。IKFLKFLKKL-R9-TFD偶联物以各种浓度混合到96孔板的200μl培养物中。
[0707] 图21显示10nM Sig TFD足以抑制肺炎克雷伯氏菌培养物的生长，而用对照TFD没有看到抑制。
[0708] 实施例14
[0709] 生物信息学分析检测WalR结合位点在金黄色葡萄球菌中的存在并推断其共有序列
[0710] 利用MEME检索(http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi-bin/meme.cgi)寻找已发布的金黄色葡萄球菌(SA)和其他发现过WalR结合位点的病原生物(比如粪肠球菌EF、肺炎链球菌SP、单核细胞增多性李斯特氏菌LM和变异链球菌SM)中存在的其他WalR结合位点。
[0711] 检索得到的命中的一部分如图22所示。由全部序列得出具有以下序列的共有位点：
[0712] TGT WAW NNN NNT GTAAW[SEQ ID NO：57]
[0713] 使用IUPAC单字母代码，其中W是A或T。
[0714] 因此预期WalR TFD共有序列影响以上列举的生物体的生长。
[0715] 实施例15
[0716] 生物信息学分析检测SigB结合位点在金黄色葡萄球菌中的存在并推断其共有序列
[0717] 利用MEME检索(http://meme.sdsc.edu/meme4/cgi-bin/meme.cgi)寻找芽孢杆菌目(革兰氏阳性感染)中与金黄色葡萄球菌的SigB结合位点共有序列匹配(E-值＜100)的例子，其中所述芽孢杆菌目的代表属包括芽孢杆菌、李斯特氏菌和葡萄球菌。
[0718] 检索得到的命中的一部分如图23所示。由全部序列得出具有以下序列的共有位点：
[0719] GKT TWA NNN NNN NNN NNN NNK GGT AW[SEQ ID NO：58]
[0720] 使用IUPAC单字母代码，其中K是G或T；W是A或T。
[0721] 实施例16
[0722] 生物信息学分析检测肺炎克雷伯氏菌中的Sig结合位点并推断其共有序列[0723] 按照Barrios et al.1999(Nucl.Acids Res.22：4305-4313)的描述，从肺炎克雷伯氏菌glnA基因的启动子区得到含有选择性σ因子(σ54)结合位点的TFD，当整合到PCR_TFD中时，显示能够体外杀死肺炎克雷伯氏菌细胞(参见图24A)。
[0724] 所用TFD序列是：
[0725] SEQ ID NO：59-KP_Sig TGG CAC aga ttT CGC T
[0726] 用细胞穿透肽如实施例13所述转染细胞。含有KP_Sig序列的TFD阻止细胞在体外的生长，而两种对照未显示对细胞生长的影响。所用的两种对照是：未处理细胞(肺炎克雷伯氏菌)和由乱序序列构成的对照TFD。
[0727] 其他肺炎克雷伯氏菌基因(nifB、nifE、nifH、nifJ、nifL、nifM和nifU)中发现的类似结合位点被用于界定共有序列：
[0728] SEQ ID NO：60-TGG NNN NNN WTT TGC W
[0729] 使用IUPAC单字母代码，其中W是A或T。
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