非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽及疫苗
阅读：611发布：2020-06-14
专利汇可以提供非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽及疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，公开了一种非人灵长类食蟹猴乙型 肝炎 病毒效应T细胞特异的 抗原 多肽及其在 诊断 试剂 盒 上的应用和 疫苗 。通过对乙型肝炎病毒功能蛋白结构的拓扑构像分析，得出非人灵长类乙型肝炎病毒效应T细胞特异的多肽，随后对相关多肽组合重排后的结构分析，筛选出能用于非人灵长类乙型肝炎 疾病 诊断的全新肽段。在ELISpot实验中，利用得到的肽段通过刺激乙型肝炎感染的非人灵长类疾病中的效应T细胞分泌γ‑IFN，证实了该肽段在此类疾病诊断中的可行性和 治疗 价值。该方法特异性强，灵敏度高，操作简便，可发展成为诊断试剂盒用于临床检测灵长类动物的乙型肝炎诊断和 鉴别 诊断 ，为 人畜共患病 的筛查和治疗奠定了 基础 。，下面是非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽及疫苗专利的具体信息内容。
非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽
及疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于医学免疫学诊断技术领域，涉及一种非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽及其在诊断试剂盒上的应用和疫苗，具体涉及运用ELISpot方法对非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒感染进行诊断。
背景技术
[0002] 乙型肝炎在发展中国家发病率较高，世界60亿人口，有2.5亿人是乙型肝炎病毒(HBV)携带者，并诱发肝细胞癌(HCC)，也是一种传染性严重的人畜共患病。HBV发现以来，在野生啮齿动物、野生鸟类和非人灵长类中已经相继分离出多种与此相关的嗜肝病毒，这几种动物病毒与人类乙型肝炎病毒组成一个独特的嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。目前已经发现的非人灵长类动物HBV株有，猩猩HBV株(Warren，1999),长臂猿HBV株(Norder,1996),黑猩猩HBV株(MacDonaid,2000)等。这些病毒株在DNA序列和蛋白结构上不同于其它野生动物嗜肝病毒毒株，它们与人乙型肝炎病毒株极其相似，病毒形态与乙型肝炎病毒(HBV)相似。一些研究表明，非人灵长类嗜肝病毒感染后，其病毒形态与人HBV相似，经HBV表面抗原(HBsAg)试验，结果在表面抗原阳性的血清包含其病毒的DNA聚合酶，并具有活性。这些说明乙型肝炎病毒表面抗原与非人灵长类嗜肝表面抗原结构相似，存在交叉反应。因此，非人灵长类HBV的研究对人类乙型肝炎的诊断和治疗具有重要意义。
[0003] 非人灵长类动物(黑猩猩、长臂猿，食蟹猴，恒河猴等)可以感染HBV，且感染的HBV基因型与感染人类的基本一样，其感染HBV后的血清学和肝脏病理组织学改变与人较接近。HBV只有3200bp，是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白(L，M，S)。Core是核衣壳蛋白；Pre-core现在不知道有何功能，它对病毒的复制不是必要的，但是可能与抑制宿主的免疫反应有关；X蛋白对病毒复制是重要的，还与肝癌的发生有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关。HBV的抗原有3种：表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。表面抗原大量存在于感染者血液中，是HBV感染以及检测的主要标志。核心抗原由183个或185个氨基酸组成，高度磷酸化，具有强免疫原性，可诱导很强的体液免疫和细胞免疫，刺激机体产生抗体。
[0004] 1983年建立的酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot，ELISpot)技术具有高度的敏感性和应用的广泛性，已成为免疫检测抗原特异性免疫反应的重要检测手段之一。
[0005] 在运用4个氨基酸的多肽叠加依次进行HBV蛋白的免疫原性分析发现，HBV不同的肽段对T细胞的免疫原性不同，其中核心蛋白(65-75和86-95)和聚合酶功能区蛋白(385-391和401-411)氨基酸均具有较强的T细胞免疫原性。本发明即是结合HBV抗原结构特点，根据软件对这些选出的氨基酸序列进行抗原性分析和二级结构预测，把其细胞免疫原性强的多肽重新组合成两段多肽序列，构建出非人灵长类HBV病毒效应T细胞特异的抗原多肽，利用ELISpot方法对HBV的非人灵长类疾病进行诊断和治疗。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽，用于检测非人灵长类HBV感染后外周血中分泌的特异性γ-IFN的T细胞，提高非人灵长类HBV的灵敏度和特异性，辅助人畜共患病的诊断和鉴别诊断。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] 非人灵长类食蟹猴乙型肝炎病毒效应T细胞特异的抗原多肽，包括多肽1和多肽2，多肽1具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，多肽2具有如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
[0009] 本发明通过对乙型肝炎病毒功能蛋白结构的拓扑构像分析，得出非人灵长类乙型肝炎病毒效应T细胞特异的多肽，随后对相关多肽组合重排后的结构分析，筛选出能用于非人灵长类乙型肝炎疾病诊断的全新肽段。
[0010] 作为优选，所述多肽1是对非人灵长类食蟹猴乙型肝炎核心蛋白的氨基酸序列进行组合重排后得到的。
[0011] 作为优选，所述多肽2是对非人灵长类食蟹猴乙型肝炎包膜蛋白的氨基酸序列进行组合重排后得到的。
[0012] 本发明还提供了上述抗原多肽在诊断试剂盒上的应用和疫苗。
[0013] 所述的抗原多肽在非人灵长类食蟹猴乙型肝炎诊断试剂盒上的应用。采用多肽1和多肽2作为刺激抗原，通过检测该多肽特异的T细胞来对非人灵长类乙型肝炎进行诊断。
[0014] 优选地，所述诊断试剂盒中含有ELISpot检测板、γ-IFN捕获抗体、多肽1、多肽2、生物素标记的γ干扰素(γ-IFN)检测抗体、亲和素-HRP结合物和TMB显色液。
[0015] 一种疫苗，包括佐剂、多肽1和多肽2。
[0016] 所述佐剂优选福斯完全佐剂。
[0017] 所述的疫苗在治疗非人灵长类食蟹猴乙型肝炎的药物上的应用。采用多肽1和多肽2作为多肽药物，与佐剂形成多肽治疗性疫苗，注射后可激活非人灵长类动物体内的T细胞产生特异性的γ干扰素来杀灭乙肝病毒。
[0019] 图1是实施例的检测图谱示例图。其中，A行为阴性对照孔，B行为多肽1检测孔，C行为多肽2检测孔，D行为多肽1+多肽2检测孔，E行为抗CD3抗体阳性对照孔。
[0020] 图2是实施例检测结果的统计图。
[0021] 图3是多肽疫苗对不同剂量HBV接种的食蟹猴机体γ-IFN水平的影响。
具体实施方式
[0022] 下面将结合附图说明和实施例对本发明作进一步详细描述。
[0023] 实施例
[0024] 本发明对8例健康食蟹猴对照组(Control组)、16例食蟹猴HBV接种组(105VP和107VP的无繁殖能力的HBV接种组，每组8只)进行鉴别诊断，从而初步判断本发明在食蟹猴HBV感染诊断中的特异性和敏感性。
[0025] 具体步骤如下：
[0026] (一)包被：
[0029] (二)动物试验：
[0030] 本试验分为三组：生理盐水溶媒对照组，105VP的无繁殖能力的HBV接种组(1.0×105VP/只)和107VP的无繁殖能力的HBV接种组(1.0×107VP/只)；每组8只，雌雄各半，皮下注射接种。每周给药1次，连续3次，最后一次给药后抽外周肝素抗凝血4-5ml，常温保存，在6h内检测。
[0031] (三)ELISpot检测：
[0032] A).ELISpot板准备：
[0033] 1)ELISpot板准备：取出预包被的ELISpot板后，在超净工作台用无菌PBS洗涤4次，200μL/孔；弃去PBS液后，用AIM-V无血清培养基(200μL/孔)预孵育30min，室温；
[0034] 2)HBV多肽稀释：分别按照2个多肽各自的质检报告进行溶解，溶解后每组取10mLAIM-V培养基，按照试验设置多肽1组、多肽2组和多肽1+2组，吸取10μL每个多肽溶液进行混合，混合后每个多肽的浓度为10μg/mL。阴性对照组：10mLAIM-V培养基。阳性对照：在
10mL的AIM-V培养基中加入10μL的抗CD3-1抗体(1:1000)；
10mL的AIM-V培养基中加入10μL的抗CD3-1抗体(1:1000)；
[0035] 3)弃去预孵育培养板中的AIM-V培养基，按照每只动物分别设CD3阳性对照、阴性对照(PBS)、多肽1组、多肽2组和多肽1+2组，在板上分别加入这些多肽和对照组的AIM-V混合液，50μL/孔，设双重对照。
[0036] 多肽片段1具有如下氨基酸序列：Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly，该序列是对非人灵长类食蟹猴乙型肝炎核心蛋白的氨基酸序列进行组合重排后得到的。
[0037] 多肽片段2具有如下氨基酸序列：Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Arg Val Pro，该序列是对非人灵长类食蟹猴乙型肝炎包膜蛋白的氨基酸序列进行组合重排后得到的。
[0038] B).淋巴细胞孵育：
[0039] 1)外周血淋巴细胞制备：每个动物取外周肝素抗凝血3mL，在15mL离心管中与等体积的1640培养基混合，在另外1只15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液，把外周血的混合液缓慢加到淋巴细胞分离液的上面，室温，400g离心20min；
[0040] 2)离心后，用无菌吸管吸出淋巴细胞层至另一新离心管内，加入10mL 1640培养基混匀后，250g离心10min洗涤；
[0041] 3)弃上清后，加入10mLAIM-V培养基混匀后，250g离心10min洗涤后，加入1mLAIM-V培养基混匀后，吸取10μL细胞悬液与40μL的0.4％的台酚蓝混匀染色后，用细胞计数板进行计数。母液中每毫升细胞数量＝细胞计数×5×104；
[0042] 4)用AIM-V培养基把细胞调至4×106个细胞/mL后，在上述准备好的ELISpot的板中每孔加入50μL细胞混悬液，即每孔2×105个细胞，在37℃，5％CO2培养箱中孵育40h。
[0043] C).斑点检测：
[0044] 1)倒去培养板中的培养基和细胞，用PBS洗涤5次，每次5min；
[0045] 2)用含有0.5％BSA的PBS稀释生物素标记的γ干扰素(γ-IFN)检测抗体溶液，加入96孔ELISpot板中，每孔100μL，室温孵育2h；
[0046] 3)倒去培养板中的溶液，用PBS洗涤5次，每次5min；
[0047] 4)每孔加入100μL亲和素-HRP结合物，室温孵育1h后，倒去培养板中的溶液，用PBS洗涤5次，每次5min；
[0048] 5)每孔加入100μL的TMB显色液底物，室温显色30min；
[0049] 6)终止：显色后，倒去培养板中的溶液，用双蒸水洗涤2次后，放在37℃恒温箱中晾干后，进行计数。
[0050] D).结果分析：用电子放大镜拍取照片，并读取每个孔的斑点数目后，取双复孔的平均值×5，求得每106个细胞中效应T细胞的数量。
[0051] 根据图1和图2可知，所有检测结果均可以判断其阴性或阳性结果，在16例不同剂7
量HBV接种的食蟹猴中，使用本发明的检出例13例，检出率为81.25％(其中10VP组检出率
8/8，105VP组检出率5/8)。因此本发明的多肽1和多肽2可以用于食蟹猴HBV疾病的诊断和鉴别诊断。
量HBV接种的食蟹猴中，使用本发明的检出例13例，检出率为81.25％(其中10VP组检出率
8/8，105VP组检出率5/8)。因此本发明的多肽1和多肽2可以用于食蟹猴HBV疾病的诊断和鉴别诊断。
[0052] 经多次试验表明，运用本发明对于食蟹猴HBV感染诊断的检出率为87％，特异性为95％，敏感性为85％。
[0053] (四)、第三次接种后1周，每个剂量组动物分为对照组和治疗组，进行皮下注射，1周后取血清用ELISA检测食蟹猴血清中γ-IFN的水平。
[0054] 对照组：4只，仅注射福斯完全佐剂，皮下注射；
[0055] 治疗组：4只，用福斯完全佐剂与多肽溶液等体积混合成油包水的白色乳白状悬浊液(其中，多肽1和多肽2剂量分别为10μg/kg)，皮下注射。
[0056] 结果显示，相对于佐剂对照组，治疗组可以增加食蟹猴体内γ-IFN的水平，说明多肽1和多肽2可以刺激乙型肝炎感染的非人灵长类疾病中的效应T细胞分泌γ-IFN，证实了该肽段在此类疾病诊断中的可行性和治疗价值。
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