检测6种人畜共患病病毒的基因芯片及其应用
阅读：414发布：2020-05-12
专利汇可以提供检测6种人畜共患病病毒的基因芯片及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种检测6种 人畜共患病 病毒 基因芯片 及其应用。本发明的人畜共患病病毒基因芯片是检测戊型 肝炎 病毒、尼帕病毒、狂犬病毒、裂谷热病毒、 口 蹄 疫 病毒和 水 泡性口炎病毒这6种病毒中至少一种病毒的基因芯片，它固定有戊型肝炎病毒检测探针、尼帕病毒检测探针、狂犬病毒检测探针、裂谷热病毒检测探针、口蹄疫病毒检测探针和水泡性口炎病毒检测探针。本发明还公开了一种检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的方法。本发明的检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的方法。可稳定而特异地实现6种人兽共患病病毒的通用检测，具有简便、快捷，良好的特异性和高度敏感性，可用于对临床样本的检测。，下面是检测6种人畜共患病病毒的基因芯片及其应用专利的具体信息内容。
1.检测戊型肝炎病毒、尼帕病毒、狂犬病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒这6种病毒中至少一种病毒的基因芯片，它固定有戊型肝炎病毒检测探针、尼帕病毒检测探针、狂犬病毒检测探针、裂谷热病毒检测探针、口蹄疫病毒检测探针和水泡性口炎病毒检测探针；
所述戊型肝炎病毒检测探针由从下述a1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述a2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述a3的两个DNA片段中任选一个DNA片段所得到的3个DNA片段组成：
a1：核苷酸序列是SEQ ID NO：41的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：41的反向互补序列的单链DNA片段；
a2：核苷酸序列是SEQ ID NO：42的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：42的反向互补序列的单链DNA片段；
a3：核苷酸序列是SEQ ID NO：43的单链的DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：43的反向互补序列的单链DNA片段；
所述尼帕病毒检测探针由从下述b1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述b2
的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述b3的两个DNA片段中任选一个DNA片段所得到的3个DNA片段组成：
b1：核苷酸序列是SEQ ID NO：44的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：44的反向互补序列的单链DNA片段；
b2：核苷酸序列是SEQ ID NO：45的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：45的反向互补序列的单链DNA片段；
b3：核苷酸序列是SEQ ID NO：46的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：46的反向互补序列的单链DNA片段；
所述狂犬病毒检测探针由从下述c1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述c2
的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述c3的两个DNA片段中任选一个DNA片段所得到的3个DNA片段组成：
c1：核苷酸序列是SEQ ID NO：47的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：47的反向互补序列的单链DNA片段；
c2：核苷酸序列是SEQ ID NO：48的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：48的反向互补序列的单链DNA片段；
c3：核苷酸序列是SEQ ID NO：49的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：49的反向互补序列的单链DNA片段；
所述裂谷热病毒检测探针由从下述d1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述d2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述d3的两个DNA片段中任选一个DNA片段所得到的3个DNA片段组成：
d1：核苷酸序列是SEQ ID NO：50的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：50的反向互补序列的单链DNA片段；
d2：核苷酸序列是SEQ ID NO：51的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：51的反向互补序列的单链DNA片段；
d3：核苷酸序列是SEQ ID NO：52的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：52的反向互补序列的单链DNA片段；
所述口蹄疫病毒检测探针由从下述e1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述e2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述e3的两个DNA片段中任选一个DNA片段所得到的3个DNA片段组成：
e1：核苷酸序列是SEQ ID NO：53的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：53的反向互补序列的单链DNA片段；
e2：核苷酸序列是SEQ ID NO：54的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：54的反向互补序列的单链DNA片段；
e3：核苷酸序列是SEQ ID NO：55的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：55的反向互补序列的单链DNA片段；
所述水泡性口炎病毒检测探针由从下述f1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述f2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述f3的两个DNA片段中任选一个DNA片段所得到的3个DNA片段组成：
f1：核苷酸序列是SEQ ID NO：56的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：56的反向互补序列的单链DNA片段；
f2：核苷酸序列是SEQ ID NO：57的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：57的反向互补序列的单链DNA片段；
f3：核苷酸序列是SEQ ID NO：58的单链DNA片段和核苷酸序列是SEQ ID NO：58的反向互补序列的单链DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述基因芯片上还固定有用于杂交质控的阳性对照探针和阴性对照探针。
3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：所述阴性对照探针为核苷酸序列是SEQ ID NO：59的单链DNA片段或核苷酸序列是SEQ ID NO：59的反向互补序列的单链DNA片段；所述阳性对照探针为核苷酸序列是SEQ ID NO：60的单链DNA片段或核苷酸序列是SEQ ID NO：60的反向互补序列的单链DNA片段。
4.一种检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组，是由如下20个引物对组成：第一个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的两个单链DNA片段组成，第二个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的两个单链DNA片段组成，第三个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的两个单链DNA片段组成，第四个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的两个单链DNA片段组成，第五个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的两个单链DNA片段组成，第六个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的两个单链DNA片段组成，第七个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的两个单链DNA片段组成，第八个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的两个单链DNA片段组成，第九个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的两个单链DNA片段组成，第十个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的两个单链DNA片段组成，第十一个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的两个单链DNA片段组成，第十二个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的两个单链DNA片段组成，第十三个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两个单链DNA片段组成，第十四个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的两个单链DNA片段组成，第十五个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的两个单链DNA片段组成，第十六个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：
5和SEQ ID NO：6的两个单链DNA片段组成，第十七个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的两个单链DNA片段组成，第十八个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的两个单链DNA片段组成，第十九个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的两个单链DNA片段组成，第二十个引物对分别由核苷酸序列是SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的两个单链DNA片段组成；所述20个引物对的每个引物对均独立包装。
5.一种检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组，是由如下40条引物组成：核苷酸序列是SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：
24、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38；所述40条引物的每条引物均独立包装。
6.检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的试剂盒，包括如下A或B；所述A为权利要求1至3中任一所述的基因芯片和权利要求4所述的检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组；所述B为权利要求1至3中任一所述的基因芯片和权利要求5所述的检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括进行PCR反应所需的PCR反应试剂，以及PCR产物和芯片进行杂交所需的芯片杂交试剂。
检测6种人畜共患病病毒的基因芯片及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及检测6种人畜共患病病毒的基因芯片及其应用。
背景技术
[0002] 裂谷热病毒(RVFV)、尼帕病毒(NiV)、口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、戊型肝炎病毒(HEV)及狂犬病毒(RV)是近年来流行范围较广，危害比较严重的动物源性人兽共患病病毒，对社会公共卫生造成很大的影响，且易感动物谱有所重叠，给预防和控制这些病毒导致的疫情造成很大的障碍。基因芯片是近几年来发展起来的一种快速高通量的新
技术。它是利用原位合成技术或微量点样技术将大量特定的寡核苷酸片段或靶基因有序
地、高密度地排列在玻璃、硅、尼龙膜等固相支持物表面，从而制成二维的DNA微阵列。将待测的标记样品分子与芯片上固定的探针片段进行杂交，用芯片扫描仪检测荧光信号后，通
过计算机软件进行数据比较和分析，一次试验就可以对成千上万种基因进行快速、准确、高效的检测，具有高通量、微型化和自动化等优势。
技术。它是利用原位合成技术或微量点样技术将大量特定的寡核苷酸片段或靶基因有序
地、高密度地排列在玻璃、硅、尼龙膜等固相支持物表面，从而制成二维的DNA微阵列。将待测的标记样品分子与芯片上固定的探针片段进行杂交，用芯片扫描仪检测荧光信号后，通
过计算机软件进行数据比较和分析，一次试验就可以对成千上万种基因进行快速、准确、高效的检测，具有高通量、微型化和自动化等优势。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种检测裂谷热病毒(RVFV)、尼帕病毒(NiV)、口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、戊型肝炎病毒(HEV)及狂犬病毒(RV))这6种人畜共患病
病毒中至少一种病毒的基因芯片及其应用。
病毒中至少一种病毒的基因芯片及其应用。
[0004] 本发明所提供的检测戊型肝炎病毒、尼帕病毒、狂犬病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒这6种人畜共患病病毒中至少一种病毒的基因芯片，它固定有戊型肝炎病毒检测探针、尼帕病毒检测探针、狂犬病毒检测探针、裂谷热病毒检测探针、口蹄疫病毒检测探针和水泡性口炎病毒检测探针；
[0005] 所述戊型肝炎病毒检测探针由从下述a1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述a2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述a3的两个DNA片段中任选一个DNA
片段所得到的3个DNA片段组成：a1核苷酸序列是序列表中序列41的单链DNA片段和核苷
酸序列是序列表中序列41的反向互补序列的单链DNA片段；a2核苷酸序列是序列表中序
列42的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列42的反向互补序列的单链DNA片段；
a3核苷酸序列是序列表中序列43单链的DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列43的反向
互补序列的单链DNA片段；
片段所得到的3个DNA片段组成：a1核苷酸序列是序列表中序列41的单链DNA片段和核苷
酸序列是序列表中序列41的反向互补序列的单链DNA片段；a2核苷酸序列是序列表中序
列42的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列42的反向互补序列的单链DNA片段；
a3核苷酸序列是序列表中序列43单链的DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列43的反向
互补序列的单链DNA片段；
[0006] 所述尼帕病毒检测探针由从下述b1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述b2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述b3的两个DNA片段中任选一个DNA片段
所得到的3个DNA片段组成：b1核苷酸序列是序列表中序列44的单链DNA片段和核苷酸
序列是序列表中序列44的反向互补序列的单链DNA片段；b2核苷酸序列是序列表中序列
45的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列45的反向互补序列的单链DNA片段；b3
核苷酸序列是序列表中序列46的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列46的反向互
补序列的单链DNA片段；
所得到的3个DNA片段组成：b1核苷酸序列是序列表中序列44的单链DNA片段和核苷酸
序列是序列表中序列44的反向互补序列的单链DNA片段；b2核苷酸序列是序列表中序列
45的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列45的反向互补序列的单链DNA片段；b3
核苷酸序列是序列表中序列46的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列46的反向互
补序列的单链DNA片段；
[0007] 所述狂犬病毒检测探针由从下述c1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述c2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述c3的两个DNA片段中任选一个DNA片段
所得到的3个DNA片段组成：c1核苷酸序列是序列表中序列47的单链DNA片段和核苷酸
序列是序列表中序列47的反向互补序列的单链DNA片段；c2核苷酸序列是序列表中序列
48的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列48的反向互补序列的单链DNA片段；c3
核苷酸序列是序列表中序列49的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列49的反向互
补序列的单链DNA片段；
所得到的3个DNA片段组成：c1核苷酸序列是序列表中序列47的单链DNA片段和核苷酸
序列是序列表中序列47的反向互补序列的单链DNA片段；c2核苷酸序列是序列表中序列
48的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列48的反向互补序列的单链DNA片段；c3
核苷酸序列是序列表中序列49的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列49的反向互
补序列的单链DNA片段；
[0008] 所述裂谷热病毒检测探针由从下述d1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述d2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述d3的两个DNA片段中任选一个DNA片
段所得到的3个DNA片段组成：d1核苷酸序列是序列表中序列50的单链DNA片段和核苷
酸序列是序列表中序列50的反向互补序列的单链DNA片段；d2核苷酸序列是序列表中序
列51的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列51的反向互补序列的单链DNA片段；
d3核苷酸序列是序列表中序列52的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列52的反向
互补序列的单链DNA片段；
段所得到的3个DNA片段组成：d1核苷酸序列是序列表中序列50的单链DNA片段和核苷
酸序列是序列表中序列50的反向互补序列的单链DNA片段；d2核苷酸序列是序列表中序
列51的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列51的反向互补序列的单链DNA片段；
d3核苷酸序列是序列表中序列52的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列52的反向
互补序列的单链DNA片段；
[0009] 所述口蹄疫病毒检测探针由从下述e1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述e2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述e3的两个DNA片段中任选一个DNA片
段所得到的3个DNA片段组成：e1核苷酸序列是序列表中序列53的单链DNA片段和核苷
酸序列是序列表中序列53的反向互补序列的单链DNA片段；e2核苷酸序列是序列表中序
列54的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列54的反向互补序列的单链DNA片段；
e3核苷酸序列是序列表中序列55的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列55的反向
互补序列的单链DNA片段；
段所得到的3个DNA片段组成：e1核苷酸序列是序列表中序列53的单链DNA片段和核苷
酸序列是序列表中序列53的反向互补序列的单链DNA片段；e2核苷酸序列是序列表中序
列54的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列54的反向互补序列的单链DNA片段；
e3核苷酸序列是序列表中序列55的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列55的反向
互补序列的单链DNA片段；
[0010] 所述水泡性口炎病毒检测探针由从下述f1的两个DNA片段中任选一个DNA片段、从下述f2的两个DNA片段中任选一个DNA片段和从下述f3的两个DNA片段中任选一个
DNA片段所得到的3个DNA片段组成：f1核苷酸序列是序列表中序列56的单链DNA片段和
核苷酸序列是序列表中序列56的反向互补序列的单链DNA片段；f2核苷酸序列是序列表
中序列57的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列57的反向互补序列的单链DNA片
段；f3核苷酸序列是序列表中序列58的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列58的
反向互补序列的单链DNA片段。
DNA片段所得到的3个DNA片段组成：f1核苷酸序列是序列表中序列56的单链DNA片段和
核苷酸序列是序列表中序列56的反向互补序列的单链DNA片段；f2核苷酸序列是序列表
中序列57的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列57的反向互补序列的单链DNA片
段；f3核苷酸序列是序列表中序列58的单链DNA片段和核苷酸序列是序列表中序列58的
反向互补序列的单链DNA片段。
[0011] 所述基因芯片上还固定有用于杂交质控的阳性对照探针和阴性对照探针。当然，该基因芯片上固定的探针可只由上述戊型肝炎病毒检测探针、尼帕病毒检测探针、狂犬病
毒检测探针、裂谷热病毒检测探针、口蹄疫病毒检测探针、水泡性口炎病毒检测探针、阳性对照探针和阴性对照探针组成。
毒检测探针、裂谷热病毒检测探针、口蹄疫病毒检测探针、水泡性口炎病毒检测探针、阳性对照探针和阴性对照探针组成。
[0012] 所述阴性对照探针具体可为核苷酸序列是序列表中序列59的单链DNA片段或核苷酸序列是序列表中序列59的反向互补序列的单链DNA片段；所述阳性对照探针具体可为
核苷酸序列是序列表中序列60的单链DNA片段或核苷酸序列是序列表中序列60的反向互
补序列的单链DNA片段。
核苷酸序列是序列表中序列60的单链DNA片段或核苷酸序列是序列表中序列60的反向互
补序列的单链DNA片段。
[0013] 本发明所提供的检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的方法，是对待测样品分别进行四个多重PCR扩增，将得到的四个多重PCR扩增产物混合后与上述任一种基因芯片进行杂交，根据杂交结果确定待检测生
物样品中是否含有裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒；
物样品中是否含有裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒；
[0014] 所述四个多重PCR扩增的引物分别为引物组1、引物组2、引物组3和引物组4；
[0015] 引物组1：分别以核苷酸序列是序列表中序列23、24、11、12、29、30、17、18、35和36的10个单链DNA片段为引物；
[0016] 引物组2：分别以核苷酸序列是序列表中序列19、20、3、4、25、26、9、10、39和40的10个单链DNA片段为引物；
[0017] 引物组3：分别以核苷酸序列是序列表中序列27、28、15、16、1、2、33、34、21和22的10个单链DNA片段为引物；
[0018] 引物组4：分别以核苷酸序列是序列表中序列5、6、7、8、13、14、31、32、37和38的10个单链DNA片段为引物。
[0019] 上述方法中，所述四种多重PCR扩增的产物可以等摩尔混合。
[0020] 本发明还提供了一种检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组。
[0021] 本发明所提供的检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组，有如下两个引物套组，第一个引物套组是由如下20个引物对组成：第一个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列23和24的两个单链DNA
片段组成，第二个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列11和12的两个单链DNA片段
组成，第三个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列29和30的两个单链DNA片段组成，
第四个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列17和18的两个单链DNA片段组成，第五
个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列35和36的两个单链DNA片段组成，第六个引
物对分别由核苷酸序列是序列表中序列19和20的两个单链DNA片段组成，第七个引物对
分别由核苷酸序列是序列表中序列3和4的两个单链DNA片段组成，第八个引物对分别由
核苷酸序列是序列表中序列25和26的两个单链DNA片段组成，第九个引物对分别由核苷
酸序列是序列表中序列9和10的两个单链DNA片段组成，第十个引物对分别由核苷酸序列
是序列表中序列39和40的两个单链DNA片段组成，第十一个引物对分别由核苷酸序列是
序列表中序列27和28的两个单链DNA片段组成，第十二个引物对分别由核苷酸序列是序
列表中序列15和16的两个单链DNA片段组成，第十三个引物对分别由核苷酸序列是序列
表中序列1和2的两个单链DNA片段组成，第十四个引物对分别由核苷酸序列是序列表中
序列33和34的两个单链DNA片段组成，第十五个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序
列21和22的两个单链DNA片段组成，第十六个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列
5和6的两个单链DNA片段组成，第十七个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列7和8
的两个单链DNA片段组成，第十八个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列13和14的
两个单链DNA片段组成，第十九个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列31和32的两
个单链DNA片段组成，第二十个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列37和38的两个
单链DNA片段组成；所述20个引物对的每个引物对均独立包装。
片段组成，第二个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列11和12的两个单链DNA片段
组成，第三个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列29和30的两个单链DNA片段组成，
第四个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列17和18的两个单链DNA片段组成，第五
个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列35和36的两个单链DNA片段组成，第六个引
物对分别由核苷酸序列是序列表中序列19和20的两个单链DNA片段组成，第七个引物对
分别由核苷酸序列是序列表中序列3和4的两个单链DNA片段组成，第八个引物对分别由
核苷酸序列是序列表中序列25和26的两个单链DNA片段组成，第九个引物对分别由核苷
酸序列是序列表中序列9和10的两个单链DNA片段组成，第十个引物对分别由核苷酸序列
是序列表中序列39和40的两个单链DNA片段组成，第十一个引物对分别由核苷酸序列是
序列表中序列27和28的两个单链DNA片段组成，第十二个引物对分别由核苷酸序列是序
列表中序列15和16的两个单链DNA片段组成，第十三个引物对分别由核苷酸序列是序列
表中序列1和2的两个单链DNA片段组成，第十四个引物对分别由核苷酸序列是序列表中
序列33和34的两个单链DNA片段组成，第十五个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序
列21和22的两个单链DNA片段组成，第十六个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列
5和6的两个单链DNA片段组成，第十七个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列7和8
的两个单链DNA片段组成，第十八个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列13和14的
两个单链DNA片段组成，第十九个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列31和32的两
个单链DNA片段组成，第二十个引物对分别由核苷酸序列是序列表中序列37和38的两个
单链DNA片段组成；所述20个引物对的每个引物对均独立包装。
[0022] 第二个引物套组一种检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组，是由如下40条引物组成：核苷酸序列是序列表中序列23、24、11、12、29、30、17、18、35、36、19、20、3、4、25、26、9、10、39、40、27、28、15、16、1、
2、33、34、21、22、5、6、7、8、13、14、31、32、37和38；所述40条引物的每条引物对均独立包装。
2、33、34、21、22、5、6、7、8、13、14、31、32、37和38；所述40条引物的每条引物对均独立包装。
[0024] 本发明所提供的检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的试剂盒，包括如下A或B；所述A为上述任一种基因芯片和第一个检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组；所述B为上述任一种基因芯片和第二个检测裂谷热病毒、尼帕病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、戊型肝炎病毒和/或狂犬病毒的引物套组。
[0025] 所述试剂盒中还可包括进行PCR反应所需的PCR反应试剂，以及PCR产物和芯片进行杂交所需的芯片杂交试剂。其中，所述PCR反应试剂不包括引物。
[0026] 用本发明的方法对10份RV已知阳性样本和7份HEV已知阳性样本进行检测，检测结果均呈阳性，表明该方法可稳定而特异地实现6种人兽共患病病毒的通用检测，具有
简便、快捷，良好的特异性和高度敏感性，可用于对临床样本的检测。
附图说明
简便、快捷，良好的特异性和高度敏感性，可用于对临床样本的检测。
附图说明
[0027] 图1为人畜共患病病毒基因芯片12×12矩阵点样模式。
[0028] 图2为对裂谷热病毒(RVFV)、尼帕病毒(NiV)、口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、戊型肝炎病毒(HEV)及狂犬病毒(RV)的检测结果。
[0029] 图3为黄热病毒(YFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、牛出血热病毒(BEFV)、登革病毒(DV)和新城疫病毒F48E9的检测结果。
具体实施方式
[0030] 下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
[0031] 新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)(国家兽医微生物菌种保藏管理中心，商品目录号为CVCC AV120)、FMDV Asia1型毒株购自哈尔滨维科生物技术开发公司、
VSV-Indiana型毒株购自哈尔滨维科生物技术开发公司和狂犬病毒ERA株((刘忠钰；袁慧
君；朱武洋；姜涛；陈水平；于曼；秦成峰；秦鄂德；狂犬病毒载体的构建与鉴定，中国人兽共患病学报2008年11期2008，24(11))(军事医学科学院微生物流行病研究所)。
VSV-Indiana型毒株购自哈尔滨维科生物技术开发公司和狂犬病毒ERA株((刘忠钰；袁慧
君；朱武洋；姜涛；陈水平；于曼；秦成峰；秦鄂德；狂犬病毒载体的构建与鉴定，中国人兽共患病学报2008年11期2008，24(11))(军事医学科学院微生物流行病研究所)。
[0032] RNA Rnase inhibitor，AMV反转录酶，TaKaRa Ex TaqTM、dNTP Mixture、99.9％DMSO，DNA Maker DL2000、随机六聚体引物均购于大连宝生物工程有限公司。
[0033] 醛基化玻片CSS-100 Silylated购自CEL公司.荧光素Cy5购自美国GE公司，SHEL-LAB杂交箱购自Hybaid Limited公司。
[0034] Scanarray Gx Plus扫描仪、Spotarray 24芯片点样仪购自PerkinElmer公司。
[0035] RNA easy MiniKit、QIA quick PCR purification kit、QIAquick GelExtractionKit均购自QIAGEN。
[0036] 氨基丙烯-dUTP(Aminoallyl-dUTP，aa-dUTP)购自Sigma公司。
[0037] 实施例1、用人畜共患病病毒基因芯片检测6种人畜共患病病毒
[0038] 一、制备人畜共患病病毒基因芯片
[0039] 根据GenBank提供的RVFV、NIV、FMDV、VSV、RV和HEV病毒的基因序列，通过Bioedit和DNAman等生物分析软件进行多序列比对分析，结合相关文献资料[Han X Q，Lin X M，1，Liu B H，et al.Simultaneously subtyping of all influenza A virusesusing DNA microarrays[J].Journal of Virological Methods，2008，152()17-121.Guillaume V，Lefeuvre A，Faure C，et al.Specific detection of Nipah virususing real-time RT-PCR[J].J Virol Methods 2004，120：229-237.]，选择每种病毒的高度保守区来设计探针，分别是FMDV的非结构蛋白3ABCD区域、RV和VSV的N蛋白区域、RVFV的M蛋白区域、
NIV的P蛋白区域及HEV的结构蛋白ORF2区域。选用与以上病毒基因同源性较远的两段植
物基因分别设计阳性对照探针和阴性对照探针。探针长度选择150～500bp。探针的核苷
酸序列如表1所示。
NIV的P蛋白区域及HEV的结构蛋白ORF2区域。选用与以上病毒基因同源性较远的两段植
物基因分别设计阳性对照探针和阴性对照探针。探针长度选择150～500bp。探针的核苷
酸序列如表1所示。
[0040] 戊型肝炎病毒(HEV)的检测探针有三条，均为单链DNA片段，名称为HE1、HE2和HE3。HE1的核苷酸序列如序列表中序列41所示，HE2的核苷酸序列如序列表中序列42所
示，HE3的核苷酸序列如序列表中序列43所示.
示，HE3的核苷酸序列如序列表中序列43所示.
[0041] 尼帕病毒(NiV)的检测探针有三条，均为单链DNA片段，名称为NI1、NI2和NI3。NI1的核苷酸序列如序列表中序列44所示，NI2的核苷酸序列如序列表中序列45所示，NI3
的核苷酸序列如序列表中序列46所示.
的核苷酸序列如序列表中序列46所示.
[0042] 狂犬病毒(RV)的检测探针有三条，均为单链DNA片段，名称为R1、R2和R3。R1的核苷酸序列如序列表中序列47所示，RF2的核苷酸序列如序列表中序列48所示，RF3的核
苷酸序列如序列表中序列49所示.
苷酸序列如序列表中序列49所示.
[0043] 裂谷热病毒(RVFV)的检测探针有三条，均为单链DNA片段，名称为RF1、RF2和RF3。RF1的核苷酸序列如序列表中序列50所示，RF2的核苷酸序列如序列表中序列51所
示，RF3的核苷酸序列如序列表中序列52所示.
示，RF3的核苷酸序列如序列表中序列52所示.
[0044] 口蹄疫病毒(FMDV)的检测探针有三条，均为单链DNA片段，名称为FM1、FM2和FM3。FM1的核苷酸序列如序列表中序列53所示，FM2的核苷酸序列如序列表中序列54所
示，FM3的核苷酸序列如序列表中序列55所示.
示，FM3的核苷酸序列如序列表中序列55所示.
[0045] 水泡性口炎病毒(VSV)的检测探针有三条，均为单链DNA片段，名称为VS1、VS2和VS3。VS1的核苷酸序列如序列表中序列56所示，VS2的核苷酸序列如序列表中序列57所
示，VS3的核苷酸序列如序列表中序列58所示.
示，VS3的核苷酸序列如序列表中序列58所示.
[0046] 阴性对照探针为单链DNA片段，名称为N，它的核苷酸序列如序列表中序列59所示.
[0047] 阳性对照探针为单链DNA片段，名称为P，它的核苷酸序列如序列表中序列60所示.
[0048] 人工合成上述探针，用50％DMSO稀释为最佳浓度350ng/μL，用Spotarray 24芯片点样仪进行点样。点样模式为12×12矩阵(见图1)，点样后常温干燥12h，获得人畜共
患病病毒基因芯片。图1中P：阳性对照探针；N：阴性对照探针；HE1，HE2，HE3：戊型肝炎病毒探针；NI1，NI2，NI3，尼帕病毒探针；R1，R2，R3：狂犬病毒探针；RF1，RF2，RF3，裂谷热病毒探针；FM1，FM2，FM3：口蹄疫病毒探针；VS1，VS2，VS3，水疱性口炎病毒探针；“-”为未固定探针的空白点。
患病病毒基因芯片。图1中P：阳性对照探针；N：阴性对照探针；HE1，HE2，HE3：戊型肝炎病毒探针；NI1，NI2，NI3，尼帕病毒探针；R1，R2，R3：狂犬病毒探针；RF1，RF2，RF3，裂谷热病毒探针；FM1，FM2，FM3：口蹄疫病毒探针；VS1，VS2，VS3，水疱性口炎病毒探针；“-”为未固定探针的空白点。
[0049] 二、用步骤一的芯片检测病毒
[0050] 1、病毒基因的提取及反转录：
[0051] 利用RNA easy Mini Kit提取待测病毒FMDV Asia1型毒株、狂犬病毒ERA株及VSV Indiana型毒株的RNA(提取过程按说明书方法进行)，同时提取其他几种病毒RNA，包
括黄热病毒(YFV)(彭文明，邓永强，于曼等，黄热病毒的一步RT-PCR法检测)，微生物学报，
2003年第四期)、日本乙型脑炎病毒(JEV)(从感染的猪脑组织中分离获得，杨银辉，朱晓
光，张永国，康晓平等。利用基因芯片技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志，2007，30(12)：1360-1363)、牛出血热病毒(Bovineephemeral fever virus，BEFV)(购自哈尔滨兽医研究所维科公司)、登革病毒(DV)(胡志君，杨敬，赵卫等。我国2株登革2型病
毒基因组的全序列分析。中国病毒学。2002，17：17-21)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)(国家兽医微生物菌种保藏管理中心，商品目录号为CVCC AV120)，作为阴性对照病毒以验证该方法的特异性。
括黄热病毒(YFV)(彭文明，邓永强，于曼等，黄热病毒的一步RT-PCR法检测)，微生物学报，
2003年第四期)、日本乙型脑炎病毒(JEV)(从感染的猪脑组织中分离获得，杨银辉，朱晓
光，张永国，康晓平等。利用基因芯片技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志，2007，30(12)：1360-1363)、牛出血热病毒(Bovineephemeral fever virus，BEFV)(购自哈尔滨兽医研究所维科公司)、登革病毒(DV)(胡志君，杨敬，赵卫等。我国2株登革2型病
毒基因组的全序列分析。中国病毒学。2002，17：17-21)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)(国家兽医微生物菌种保藏管理中心，商品目录号为CVCC AV120)，作为阴性对照病毒以验证该方法的特异性。
[0052] 用随机引物(5’-GTT TCC CAG TCA CGA TCN NNN NNN NN-3’)对以上病毒RNA进行反转录，将提取的RNA5uL和随机引物六聚体(PROMEGA公司产品)1uL，在65℃条件下作
用10min，冰浴5min，再加5×RT buffer 4uL，RNase Inhibitor(5U/uL)0.5uL，10mmol/L
dNTPs 2uL，AMV RNase Reverse Transcriptase(5U/uL)1uL，灭菌双蒸水补足至20uL，42℃水浴60min，反转录得到cDNA，然后94℃5min灭活AMV RNase Reverse Transcriptase，4℃保存待用。
用10min，冰浴5min，再加5×RT buffer 4uL，RNase Inhibitor(5U/uL)0.5uL，10mmol/L
dNTPs 2uL，AMV RNase Reverse Transcriptase(5U/uL)1uL，灭菌双蒸水补足至20uL，42℃水浴60min，反转录得到cDNA，然后94℃5min灭活AMV RNase Reverse Transcriptase，4℃保存待用。
[0053] 2、多重PCR扩增与标记
[0054] 化学合成HEV、RVFV及NIV病毒如下序列(上海生工公司合成)：HEV病毒的序列如Genbank Acession Number DQ279091.2的自5′末端第5521-7130位所示，RVFV病毒
的基因序列如Genbank Acession NumberDQ380208.1的自5′末端第540-1997位所示，及
NIV病毒的基因序列如Genbank Acession NumberAY029768.1的自5′末端第2695-3794
位所示。分别以HEV、RVFV、NIV病毒的基因序列、FMDV Asia1型毒株、狂犬病毒ERA株及
VSV Indiana型毒株、黄热病毒(YFV)、日本乙型脑炎病毒(JBEV)、牛出血热病毒(Bovine
ephemeral fever virus，BEFV)、登革病毒(DV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)F48E9的cDNA为模板，每个模板分别进行如下四个多重PCR扩增：
的基因序列如Genbank Acession NumberDQ380208.1的自5′末端第540-1997位所示，及
NIV病毒的基因序列如Genbank Acession NumberAY029768.1的自5′末端第2695-3794
位所示。分别以HEV、RVFV、NIV病毒的基因序列、FMDV Asia1型毒株、狂犬病毒ERA株及
VSV Indiana型毒株、黄热病毒(YFV)、日本乙型脑炎病毒(JBEV)、牛出血热病毒(Bovine
ephemeral fever virus，BEFV)、登革病毒(DV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)F48E9的cDNA为模板，每个模板分别进行如下四个多重PCR扩增：
[0055] 第一个多重PCR所用的引物是引物组1，引物组1由用于扩增裂谷热病毒的RVFV3、用于扩增尼帕病毒的NIV3、用于扩增口蹄疫病毒的FMDV3、用于扩增狂犬病毒的RV3和用于
扩增水泡性口炎病毒的VSV3组成。RVFV3由核苷酸序列分别是序列表中序列23和24的两
个单链DNA片段组成；NIV3由核苷酸序列分别是序列表中序列11和12的两个单链DNA片
段组成；FMDV3由核苷酸序列分别是序列表中序列29和30的两个单链DNA片段组成；RV3由
核苷酸序列分别是序列表中序列17和18的两个单链DNA片段组成；VSV3由核苷酸序列分
别是序列表中序列35和36的两个单链DNA片段组成。
扩增水泡性口炎病毒的VSV3组成。RVFV3由核苷酸序列分别是序列表中序列23和24的两
个单链DNA片段组成；NIV3由核苷酸序列分别是序列表中序列11和12的两个单链DNA片
段组成；FMDV3由核苷酸序列分别是序列表中序列29和30的两个单链DNA片段组成；RV3由
核苷酸序列分别是序列表中序列17和18的两个单链DNA片段组成；VSV3由核苷酸序列分
别是序列表中序列35和36的两个单链DNA片段组成。
[0056] 第二个多重PCR所用的引物是引物组2，引物组2由用于扩增裂谷热病毒的RVFV1、用于扩增尼帕病毒的NIV2、用于扩增口蹄疫病毒的FMDV1、用于扩增戊型肝炎病毒的HEV2和用于扩增一段水稻VRN1基因的阴性对照组成。RVFV1由核苷酸序列分别是序列表中序列19
和20的两个单链DNA片段组成；NIV2由核苷酸序列分别是序列表中序列9和10的两个单
链DNA片段组成；FMDV1由核苷酸序列分别是序列表中序列25和26的两个单链DNA片段组
成；HEV2由核苷酸序列分别是序列表中序列3和4的两个单链DNA片段组成；阴性对照的
核苷酸序列分别是序列表中序列39和40的两个单链DNA片段组成。。
和20的两个单链DNA片段组成；NIV2由核苷酸序列分别是序列表中序列9和10的两个单
链DNA片段组成；FMDV1由核苷酸序列分别是序列表中序列25和26的两个单链DNA片段组
成；HEV2由核苷酸序列分别是序列表中序列3和4的两个单链DNA片段组成；阴性对照的
核苷酸序列分别是序列表中序列39和40的两个单链DNA片段组成。。
[0057] 第三个多重PCR所用的引物是引物组3，引物组3由用于扩增狂犬病毒的RV2、用于扩增水泡性口炎病毒的VSV2、用于扩增口蹄疫病毒的FMDV2、用于扩增戊型肝炎病毒的HEV1和用于扩增裂谷热病毒的RVFV2组成。RV2由核苷酸序列分别是序列表中序列15和16的两
个单链DNA片段组成；VSV2由核苷酸序列分别是序列表中序列33和34的两个单链DNA片
段组成；FMDV2由核苷酸序列分别是序列表中序列27和28的两个单链DNA片段组成；HEV1
由核苷酸序列分别是序列表中序列1和2的两个单链DNA片段组成；RVFV2由核苷酸序列分
别是序列表中序列21和22的两个单链DNA片段组成。
个单链DNA片段组成；VSV2由核苷酸序列分别是序列表中序列33和34的两个单链DNA片
段组成；FMDV2由核苷酸序列分别是序列表中序列27和28的两个单链DNA片段组成；HEV1
由核苷酸序列分别是序列表中序列1和2的两个单链DNA片段组成；RVFV2由核苷酸序列分
别是序列表中序列21和22的两个单链DNA片段组成。
[0058] 第四个多重PCR所用的引物是引物组4，引物组4由用于扩增戊型肝炎病毒的HEV3、用于扩增狂犬病毒的RV1、用于扩增尼帕病毒的NIV1、用于扩增水泡性口炎病毒的VSV1和用于扩增ACTIN基因的阳性对照组成。HEV3由核苷酸序列分别是序列表中序列5和6的
两个单链DNA片段组成；NIV1由核苷酸序列分别是序列表中序列7和8的两个单链DNA片
段组成；RV1由核苷酸序列分别是序列表中序列13和14的两个单链DNA片段组成；VSV1由
核苷酸序列分别是序列表中序列31和32的两个单链DNA片段组成；阳性对照由核苷酸序
列分别是序列表中序列37和38的两个单链DNA片段组成。
两个单链DNA片段组成；NIV1由核苷酸序列分别是序列表中序列7和8的两个单链DNA片
段组成；RV1由核苷酸序列分别是序列表中序列13和14的两个单链DNA片段组成；VSV1由
核苷酸序列分别是序列表中序列31和32的两个单链DNA片段组成；阳性对照由核苷酸序
列分别是序列表中序列37和38的两个单链DNA片段组成。
[0059] 这四个多重PCR的扩增体系如下：取病毒的反转录产物或合成的全基因片段3ul，2+
在同一管内同时加入相应的引物组进行PCR扩增，dNTP混合物浓度150mmol/L、Mg 浓度为
2mmol/L，2.5U Taq DNA聚合酶，1×反应缓冲液，1％DMSO，加水补足至50uL。其中，各引物组中，用于扩增RVFV的引物浓度为0.6μmol/L、用于扩增FMDV的引物浓度为0.2μmol/L、
用于扩增VSV的引物浓度为0.2μmol/L、用于扩增RV的引物浓度为0.6μmol/L、用于扩增
HEV的引物浓度为0.4μmol/L，用于扩增尼帕病毒的引物浓度为0.4μmol/L、用于扩增N的
引物浓度为0.2μmol/L、用于扩增P的引物浓度为0.2μmol/L。
在同一管内同时加入相应的引物组进行PCR扩增，dNTP混合物浓度150mmol/L、Mg 浓度为
2mmol/L，2.5U Taq DNA聚合酶，1×反应缓冲液，1％DMSO，加水补足至50uL。其中，各引物组中，用于扩增RVFV的引物浓度为0.6μmol/L、用于扩增FMDV的引物浓度为0.2μmol/L、
用于扩增VSV的引物浓度为0.2μmol/L、用于扩增RV的引物浓度为0.6μmol/L、用于扩增
HEV的引物浓度为0.4μmol/L，用于扩增尼帕病毒的引物浓度为0.4μmol/L、用于扩增N的
引物浓度为0.2μmol/L、用于扩增P的引物浓度为0.2μmol/L。
[0060] 反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增结束后取5μl扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0061] 将同一种病毒的四个多重PCR扩增产物混合，进而耦联荧光染料物Cy5(耦联过程按说明书操作进行)。最后将耦合荧光素的产物用QIA quick PCR purification kit进行
纯化，纯化后用杂交液混合，于95℃变性5min后于冰上冷却后用于杂交反应。
纯化，纯化后用杂交液混合，于95℃变性5min后于冰上冷却后用于杂交反应。
[0062] 3、芯片预杂交：先将所述的芯片点上50μl预杂交液(5×SSC，0.1％SDS，0.1％BSA)，盖上盖玻片，置42℃水浴锅中预杂交1-1.5h。然后用水洗涤两次，用离心机甩干芯
片。
片。
[0063] 4、芯片杂交：向纯化后的荧光染料标记的PCR产物中加入35μl杂交液(50％去离子甲酰胺，5×SSC，0.1％SDS，0.5μg/μl鲑鱼精DNA)，置PCR仪中95℃变性5min，
取40μl加于芯片上，盖上盖片。置杂交盒中42℃杂交2～4h。取出杂交后的芯片，轻轻
除去盖片。芯片分别于洗液I(2×SSC，0.1％SDS)、洗液II(0.2×SSC，0.1％SDS)、洗液
III(0.2×SSC)中洗涤5min，最后用无水乙醇漂洗2min，用离心机甩干芯片。
取40μl加于芯片上，盖上盖片。置杂交盒中42℃杂交2～4h。取出杂交后的芯片，轻轻
除去盖片。芯片分别于洗液I(2×SSC，0.1％SDS)、洗液II(0.2×SSC，0.1％SDS)、洗液
III(0.2×SSC)中洗涤5min，最后用无水乙醇漂洗2min，用离心机甩干芯片。
[0064] 5、芯片扫描：取出杂交后的芯片用芯片扫描仪进行扫描，CY5荧光染料用635nm波长。然后判断结果。扫描后将所得tif图像用GenePix 5.0软件进行分析，同时满足
F635Median-B635＞1000及SNR(信噪比)＞1.0，即可判定为阳性信号。
F635Median-B635＞1000及SNR(信噪比)＞1.0，即可判定为阳性信号。
[0065] 裂谷热病毒(RVFV)、尼帕病毒(NiV)、口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、戊型肝炎病毒(HEV)及狂犬病毒(RV)的检测结果如图2，口蹄疫病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、FM1、FM2和FM3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂
交信号或信号很弱；戊型肝炎病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、HE1、HE2和HE3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂交信号或信号很弱；尼帕病毒的PCR扩
增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、NI1、NI2和NI3的探针点上出现了阳性信号，其余
探针均无杂交信号或信号很弱；狂犬病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、
R1、R2和R3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂交信号或信号很弱；裂谷热病毒
的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、RF1、RF2和RF3的探针点上出现了阳性信
号，其余探针均无杂交信号或信号很弱；水泡性口炎病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、VS1、VS2和VS3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂交信号或信号
很弱。图2中，1：口蹄疫病毒检测结果；2：戊型肝炎病毒检测结果；3：尼帕病毒检测结果；
4：狂犬病毒检测结果；5：裂谷热病毒检测结果；6：水泡性口炎病毒检测结果。
交信号或信号很弱；戊型肝炎病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、HE1、HE2和HE3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂交信号或信号很弱；尼帕病毒的PCR扩
增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、NI1、NI2和NI3的探针点上出现了阳性信号，其余
探针均无杂交信号或信号很弱；狂犬病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、
R1、R2和R3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂交信号或信号很弱；裂谷热病毒
的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、RF1、RF2和RF3的探针点上出现了阳性信
号，其余探针均无杂交信号或信号很弱；水泡性口炎病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明，芯片上只有P、VS1、VS2和VS3的探针点上出现了阳性信号，其余探针均无杂交信号或信号
很弱。图2中，1：口蹄疫病毒检测结果；2：戊型肝炎病毒检测结果；3：尼帕病毒检测结果；
4：狂犬病毒检测结果；5：裂谷热病毒检测结果；6：水泡性口炎病毒检测结果。
[0066] 黄热病毒(YFV)、日本乙型脑炎病毒(JBEV)、牛出血热病毒(Bovineephemeralfever virus，BEFV)、登革病毒(DV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)F48E9的检测结果如图3，这5种病毒的PCR扩增产物的杂交结果表明除了阳性对照探
针出现显著的杂交信号，检测病毒探针并未杂交出特异性信号，说明该方法具有较好的特
异性。图3中，：1：黄热病毒YFV；2：日本乙型脑炎病毒JBEV；3：牛出血热病毒BEFV；4：登革病毒DV；5：新城疫病毒NDV。三、用步骤一的芯片检测临床样本
针出现显著的杂交信号，检测病毒探针并未杂交出特异性信号，说明该方法具有较好的特
异性。图3中，：1：黄热病毒YFV；2：日本乙型脑炎病毒JBEV；3：牛出血热病毒BEFV；4：登革病毒DV；5：新城疫病毒NDV。三、用步骤一的芯片检测临床样本
[0067] 用步骤一的人畜共患病病毒基因芯片检测7份HEV阳性粪便样本和5份未知血清样本(见表20，以及10份由军事医学科学院军事兽医研究所提供的RV阳性样本(其样本
编号如表1的第三列)RNA。对粪便样本用PBS稀释成10％的悬液，离心过滤除菌后，进行
基因扩增及杂交检测。除基因的提取及反转录外，多重PCR扩增与标记、芯片预杂交、芯片杂交和芯片扫描的方法与上述步骤二相同。其中，临床样本基因的提取及反转录的方法为：
利用RNA easy Mini Kit提取待测临床样本的RNA(提取过程按说明书方法进行)，用随机
引物(5’-GTT TCC CAG TCA CGA TCN NNN NNN NN-3’)对以上临床样本的RNA进行反转录，将提取的RNA5uL和随机引物六聚体(PROMEGA公司产品)1uL，在65℃条件下作用10min，
冰浴5min，再加5×RT buffer 4μL，RNaseInhibitor(5U/μL)0.5μL，10mmol/L dNTPs
2μL，AMV RNase ReverseTranscriptase(5U/μL)1μL，灭菌双蒸水补足至20μL，42℃水浴60min，反转录得到cDNA，然后94℃5min灭活AMV RNase Reverse Transcriptase，4℃
保存待用。
编号如表1的第三列)RNA。对粪便样本用PBS稀释成10％的悬液，离心过滤除菌后，进行
基因扩增及杂交检测。除基因的提取及反转录外，多重PCR扩增与标记、芯片预杂交、芯片杂交和芯片扫描的方法与上述步骤二相同。其中，临床样本基因的提取及反转录的方法为：
利用RNA easy Mini Kit提取待测临床样本的RNA(提取过程按说明书方法进行)，用随机
引物(5’-GTT TCC CAG TCA CGA TCN NNN NNN NN-3’)对以上临床样本的RNA进行反转录，将提取的RNA5uL和随机引物六聚体(PROMEGA公司产品)1uL，在65℃条件下作用10min，
冰浴5min，再加5×RT buffer 4μL，RNaseInhibitor(5U/μL)0.5μL，10mmol/L dNTPs
2μL，AMV RNase ReverseTranscriptase(5U/μL)1μL，灭菌双蒸水补足至20μL，42℃水浴60min，反转录得到cDNA，然后94℃5min灭活AMV RNase Reverse Transcriptase，4℃
保存待用。
[0068] 同时对上述临床标本进行如下常规RT-PCR检测：
[0069] 分别用HEV1引物对及引物RV1引物对扩增临床标本的反转录产物cDNA。
[0070] 扩增条件为：RV1引物对的引物各0.6μmol/L或HEV1引物对各0.4μmol/L，dNTP2+
混合物浓度150mmol/L、Mg 浓度为2mmol/L，2.5U Taq DNA聚合酶，1×反应缓冲液，1％
DMSO，加水补足至50μL。
混合物浓度150mmol/L、Mg 浓度为2mmol/L，2.5U Taq DNA聚合酶，1×反应缓冲液，1％
DMSO，加水补足至50μL。
[0071] 反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。
[0072] PCR扩增结束后取5μl扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0073] RV临床标本的检测结果如表1所示，HEV临床标本的检测结果如表2所示，表明，RV阳性样本的芯片检测结果与常规的RT-PCR方法检测结果一致，阳性符合率达100％，HEV
对阳性粪便样本芯片检测结果与常规的RT-PCR方法检测结果也是完全一致，阳性符合率
达100％，对未知血清HEV的检测，该检测结果与常规RT-PCR检测一致。说明人畜共患病病
毒基因芯片可以用于临床样本的检测。
对阳性粪便样本芯片检测结果与常规的RT-PCR方法检测结果也是完全一致，阳性符合率
达100％，对未知血清HEV的检测，该检测结果与常规RT-PCR检测一致。说明人畜共患病病
毒基因芯片可以用于临床样本的检测。
[0074] 表1、RV阳性样本RT-PCR与芯片检测结果
[0075]
[0076] 表2HEV阳性粪便样本及未知血清样本的RT-PCR与芯片检测结果
[0077]
[0078] 序列表
[0079] <110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
[0080] <120>检测6种人畜共患病病毒的基因芯片及其应用
[0081] <130>CGGNAR92566
[0082] <160>60
[0083] <210>1
[0084] <211>22
[0085] <212>DNA
[0086] <213>人工序列
[0087] <400>1
[0088] gctggtcatc gtgtctgtat tt 22
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[0090] <211>21
[0091] <212>DNA
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[0093] <400>2
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[0109] <212>DNA
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[0112] tcctgacacc gctccagt 18
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[0115] <212>DNA
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[0148] tggacccagt ggttacag 18
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[0199] <212>DNA
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[0203] <210>21
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[0205] <212>DNA
[0206] <213>人工序列
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[0208] gggtctggaa gaagccttta 20
[0209] <210>22
[0210] <211>18
[0211] <212>DNA
[0212] <213>人工序列
[0213] <400>22
[0214] gtgacgcaaa ctccgcta 18
[0215] <210>23
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[0217] <212>DNA
[0218] <213>人工序列
[0219] <400>23
[0220] caggacccgt gtttagtg 18
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[0225] <400>24
[0226] tctggcaacc atcttcttat 20
[0227] <210>25
[0228] <211>18
[0229] <212>DNA
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[0243] <400>27
[0244] agcaagaggg accttacgc 19
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[0250] cggtggagca ccatgagt 18
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[0253] <212>DNA
[0254] <213>人工序列
[0255] <400>29
[0256] atactgctcg tgcgtttcc 19
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[0259] <212>DNA
[0260] <213>人工序列
[0261] <400>30
[0262] actgtacgcc cttgattgc 19
[0263] <210>31
[0264] <211>18
[0265] <212>DNA
[0266] <213>人工序列
[0267] <400>31
[0268] cagatccacc agagcaag 18
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[0278] <213>人工序列
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[0280] atggatgggc tgacaaat 18
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[0284] <213>人工序列
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[0290] <213>人工序列
[0291] <400>35
[0292] ggaataaaca tcgggaaag 19
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[0295] <212>DNA
[0296] <213>人工序列
[0297] <400>36
[0298] cactctgtat aagccaagta ga 22
[0299] <210>37
[0300] <211>20
[0301] <212>DNA
[0302] <213>人工序列
[0303] <400>37
[0304] tatggtcaag gctgggttcg 20
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[0310] ccatgctcga tggggtactt 20
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[0313] <212>DNA
[0314] <213>人工序列
[0315] <400>39
[0316] ccaaacggga caagcgagac g 21
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[0322] gcgggacgaa agaggaaatg c 21
[0323] <210>41
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[0325] <212>DNA
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[0327] <400>41
[0328] gctggtcatc gtgtctgtat ttctacttac actactaatt tgggttctgg gcctgtttct 60[0329] atttctgctg tgggtgtttt agcgccccac tctgttctgg ctgttttgga ggacacggcc 120[0330] gattatccag cccgtgccca tacttttgat gatttttgcc ctgagtgccg tgcgcttggc 180[0331] ctccagggct gtgcttttca atctactgtc gctgagctg 219[0332] <210>42
[0333] <211>386
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[0337] taccgtaatc agggttggcg ctcggttgag acttcaggcg ttgctgagga ggaggccacc 60[0338] tccggccttg tcatgctttg tattcatgga tcacctgtaa attcctacac taatacacct 120[0339] tatactggtg ccctcggcct gcttgatctt gcactcgagc tcgagtttcg caacttgaca 180[0340] cctggtaata cgaatacgcg tgtctctcgt tattcaagta gcgcgcgtca taagttgcgc 240[0341] cgagggcctg acggcacagc ggagttaact actactgctg ccacacgctt tatgaaagat 300[0342] cttcatttta ctgggactaa tggcgttggt gaagtcggcc gtggtatagc actgaccctg 360[0343] ttcaatcttg ctgatacgct tctcgg 386[0344] <210>43
[0345] <211>194
[0346] <212>DNA
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[0348] <400>43
[0349] tcctgacacc gctccagtcc ctgatgttga ttcacgtggt gctattttgc gccgtcaata 60[0350] taatttgtct acatccccgc ttacgtctac cattgctact ggcactaatc ttgtgttgta 120[0351] tgctgcccct ctcagccctc tgctcccact tcaggatggg accaatacac atattatggc 180[0352] aactgaggct tcaa 194[0353] <210>44
[0354] <211>233
[0355] <212>DNA
[0356] <213>人工序列
[0357] <400>44
[0358] gcagtaccgt tcactctgag aaacctgtct gatcctgcaa aagactctcc tgtgattgct 60[0359] gaacactact acggactagg agttaaagag caaaacgttg gccctcagac tagcagaaat 120[0360] gtcaatttgg acagcatcaa attgtacaca tcagatgacg aagaggcaga tcagcttgaa 180[0361] ttcgaagatg agtttgcagg aagctcaagt gaagtgatag tcggcatttc tcc 233[0362] <210>45
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[0364] <212>DNA
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[0366] <400>45
[0367] caggcaaaga ccaggaactc cgatgccaaa gtcccgaggt attcccatta aaaaggggca 60[0368] cagacgcgaa atatccatct gctgggacgg aaaacgtgcc tgggtcgaag agtggtgcaa 120[0369] cccggcatgt tcgaggatca cccccctacc aagaaggcaa gagtgtcaat gcggagaatg 180[0370] tccaactgaa tgcttccact gcggttaa 208[0371] <210>46
[0372] <211>200
[0373] <212>DNA
[0374] <213>人工序列
[0375] <400>46
[0376] tggacccagt ggttacagac gttgtatacc atgatcatgg aggagaatgt accggatatg 60[0377] gatttacttc aagccctgag agagggtgga gtgattacac atcaggagca aacaatggga 120[0378] atgtatgtct tgtatctgat gcaaagatgc tgtcctatgc tcccgaaatt gcagtttcta 180[0379] aagaagatcg ggaaactgat 200[0380] <210>47
[0381] <211>189
[0382] <212>DNA
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[0384] <400>47
[0385] gcactggcag atgatggaac tgtcaactct gacgacgagg actacttctc aggtgaaacc 60[0386] agaagtccgg aggctgttta tactcgaatc atgatgaatg gaggtcgact aaagagatct 120[0387] cacatacgga gatatgtctc agtcagttcc aatcatcaag cccgtccaaa ctcattcgcc 180[0388] gagtttcta 189[0389] <210>48
[0390] <211>266
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[0393] <400>48
[0394] ttcatccact tccgttcact aggcttgagt gggaaatctc cttattcatc aaatgctgtt 60[0395] ggtcacgtgt tcaatctcat tcactttgta ggatgctata tgggtcaagt cagatcccta 120[0396] aatgcaacgg ttattgctgc atgtgctcct catgaaatgt ctgttctagg gggctatctg 180[0397] ggagaggaat tcttcgggaa agggacattt gaaagaagat tcttcagaga tgagaaagaa 240[0398] cttcaagaat acgaggcggc tgaact 266[0399] <210>49
[0400] <211>274
[0401] <212>DNA
[0402] <213>人工序列
[0403] <400>49
[0404] tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 60[0405] cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 120[0406] ttttgttaaa atcgtagaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 180[0407] gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt ttctcccgga 240[0408] ttgagcatct atattcagca atcagagtgg gcac 274[0409] <210>50
[0410] <211>499
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[0413] <400>50
[0414] aggcagttca cgacaccatc attgcaaagg ctgatccacc tagctgtgac cttcagagtg 60[0415] ctcatgggaa cccctgcatg aaagagaaac tcgtgatgaa gacacactgt ccaaatgact 120[0416] accagtcagc tcattacctc aacaatgacg ggaaaatggc ttcagtcaag tgccctccta 180[0417] agtatgggct cactgaggac tgcaactttt gtaggcagat gacaggtgct agcctgaaga 240[0418] aggggtctta tcctctccaa gacttgtttt gtcagtcaag tgaggatgat ggatcaaaat 300[0419] taaaaacaaa aatgaaaggg gtctgcgaag tgggggttca agcactcaaa aagtgtgatg 360[0420] gccaactcag cactgcacat gaggttgtgc cctttgcagt gtttaagaac tcaaagaagg 420[0421] tttatcttga taagcttgac cttaagactg aggagaatct gctaccagac tcatttgtct 480[0422] gtttcgagca taagggaca 499[0423] <210>51
[0424] <211>193
[0425] <212>DNA
[0426] <213>人工序列
[0427] <400>51
[0428] gggtctggaa gaagccttta tgtgtagggt atgagagagt ggttgtgaag agagaactct 60[0429] ctgccaagcc catccagaga gttgagcctt gcacaacttg tataaccaaa tgtgagcctc 120[0430] atggattggt tgtccgatca acagggttca agatatcatc agcagttgct tgtgctagcg 180[0431] gagtttgcgt cac 193[0432] <210>52
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[0434] <212>DNA
[0435] <213>人工序列
[0436] <400>52
[0437] caggacccgt gtttagtgca tggctgcata gtgtgtgctc atggcctgat aaattaccag 60[0438] tgtcacactg ctctcagtgc ctttgttgtt gtgtttgtat tcagttctat tgcaataatt 120[0439] tgtttagctg ttctttatag ggtgcttaag tgcctgaaga ttgccccaag gaaagttctg 180[0440] aatccactaa tgtggatcac agccttcatc agatggatat ataagaagat ggttgccaga 240[0441] <210>53
[0442] <211>298
[0443] <212>DNA
[0444] <213>人工序列
[0445] <400>53
[0446] cgaggctgcc ataaagctcg tggagaaaag agaatacgag tttgcttgtc agacctcctg 60[0447] aaggacgaga ttccccggat ggagaaacta cgtgccggca agactcgcat tttcgatgtc 120[0448] ttgcctgttg aacacattct ttacaccagg atgatgattg gcagattttg tgctcaaatg 180[0449] cactcaaaca acggaccgca aattggctcg gcggtcggtt gcaaccctga tattgattgg 240[0450] caaagatttg gcacacattt tgcccagtac agaaacgtgt gggatgtgga ctattcgg 298[0451] <210>54
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