猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法
阅读：799发布：2020-06-08
专利汇可以提供猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的猪带瓣血管去细胞的 支架 的超高压制备方法，主要包括备料和超高压去细胞两个步骤，采用多次逐步 增压 ，用超高压在较短时间内既可将细胞完全去除，又能使层粘连蛋白(Ln)和 纤维 粘连蛋白(Fn)免受到破坏，使之符合移植要求。并能同时将各种细菌、病毒、芽胞等 微 生物 全部灭活，消除 人畜共患病 的可能。同时由于超高压方法是一种物理方法，完全避免使用化学方法造成化学物质残留所引起的诸多不良后果。用本发明的方法制得的猪带瓣血管脱 细胞支架 具有良好的 生物相容性 ，适度的 生物降解 速率，机械强度高，易于缝合固定等优点，有利于人 体细胞 的定植和生长，并能随着真的瓣膜或血管的再生而被逐渐降解和吸收。，下面是猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法专利的具体信息内容。
1.一种猪带瓣血管去细胞的支架的超高压制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A)备料：取健康猪的升主动脉和主动脉弓及不短于5mm冠状动脉，用PBS溶液清洗 后放入二氧化碳干冰培养箱内消毒，装入真空包装袋中密封即为猪带瓣血管；
B)超高压去细胞：将猪带瓣血管连同真空包装袋，放入预热25℃后的超高压机的传 压介质中，先将传压介质加压到600MPa并保压5±2分钟后泄压；然后将传压介质加压到 800MPa并保压5±2分钟后泄压；再将传压介质第三次加压达到1000MPa并保压5±2分钟 后泄压，得猪带瓣血管去细胞的支架。
2.如权利要求1所述的猪带瓣血管去细胞的支架的超高压制备方法，其特征在于所 述传压介质选用双蒸水。
技术领域
本发明涉及一种医用材料，特别是将猪带瓣血管制备为人的瓣膜和血管的替代材料。 属于医用假体材料领域。
背景技术
复杂心脏大血管畸形常需要使用生物血管或带瓣管道，目前临床上应用较多的是带瓣 血管，是同种异体或异种异体二类，后者主要来自纯种猪。生物带瓣血管具有天然支架结 构，最佳血流动力学，不需抗凝，其保存技术和临床应用成为复杂心脏外科治疗的热点。其中 同种异体保存和应用技术较为成熟，但我国没有脑死亡法的规定，加之东方人的传统观念， 同种异体带瓣管道几乎无法取得。而异种异体带瓣血管保存和应用处于起步研究阶段。
猪与人同源性较好，异种带瓣血管异于取得，可以制备多种型号，较小的型号比机械瓣 或生物瓣更适于儿童特别是婴幼儿心脏外管道的建立.异种瓣膜及血管的免疫原性强，主要 来源于上皮细胞，细胞外基质的组织结构和同种的相似，且二者免疫原性都很弱。因此对异 种瓣膜及血管进行恰当的脱细胞处理，脱去上皮细胞和成纤维细胞，保留完整的细胞外基质， 得到脱细胞的支架，为种植受体细胞，构建出完整的组织工程带瓣血管创造条件。
脱细胞猪带瓣血管支架的要点为：(I)防止动物源性致病微生物特别是病毒的感染。(2) 采用适宜的脱细胞方法，即能够脱细胞彻底，又能保持细胞外基质结构、功能的完整。(3) 减少界面活性剂的使用降低其对人体的毒性等。
目前最常用的去细胞方法是联合应用表面活性剂、胰酶、核酸酶等脱去生物瓣膜及血 管支架中的细胞成分。如曲拉通X-100和核酸酶消化方法，通过调整溶液的渗透压，达到 去细胞的目的。但是曲拉通X-100去细胞需孵育振荡172小时以上，其结果用HE染色方 法检测还可见极少量的蓝紫色的细胞核。德国Haverich的研究小组和英国Ingham研究小 组采用各种表面活性剂分别和蛋白分解酶联合除去支架上的供体细胞，发现存在很多问 题：(I)低浓度胰酶不能去除动脉壁深部的细胞成份，高浓度的胰酶可以引起支架结构的破 坏。对于一定厚度的组织，很难除去其内部的细胞；(2)这些表面活性剂本身都是化学物 质，对人体也有毒性，洗净后仍会有一定浓度的残留；(3)由于洗净需要数周以上的时间， 可能会改变生物力学特性并可能增加感染机会等缺陷。
猪与人同源性较好，异种带瓣血管异于取得，可以制备多种型号，较小的型号比机械瓣 或生物瓣更适于儿童特别是婴幼儿心脏外管道的建立.异种瓣膜及血管的免疫原性强，主要 来源于上皮细胞，细胞外基质的组织结构和同种的相似，且二者免疫原性都很弱。因此对异 种瓣膜及血管进行恰当的脱细胞处理，脱去上皮细胞和成纤维细胞，保留完整的细胞外基质， 得到脱细胞的支架，为种植受体细胞，构建出完整的组织工程带瓣血管创造条件。
脱细胞猪带瓣血管支架的要点为：(I)防止动物源性致病微生物特别是病毒的感染。(2) 采用适宜的脱细胞方法，即能够脱细胞彻底，又能保持细胞外基质结构、功能的完整。(3) 减少界面活性剂的使用降低其对人体的毒性等。
目前最常用的去细胞方法是联合应用表面活性剂、胰酶、核酸酶等脱去生物瓣膜及血 管支架中的细胞成分。如曲拉通X-100和核酸酶消化方法，通过调整溶液的渗透压，达到 去细胞的目的。但是曲拉通X-100去细胞需孵育振荡172小时以上，其结果用HE染色方 法检测还可见极少量的蓝紫色的细胞核。德国Haverich的研究小组和英国Ingham研究小 组采用各种表面活性剂分别和蛋白分解酶联合除去支架上的供体细胞，发现存在很多问 题：(I)低浓度胰酶不能去除动脉壁深部的细胞成份，高浓度的胰酶可以引起支架结构的破 坏。对于一定厚度的组织，很难除去其内部的细胞；(2)这些表面活性剂本身都是化学物 质，对人体也有毒性，洗净后仍会有一定浓度的残留；(3)由于洗净需要数周以上的时间， 可能会改变生物力学特性并可能增加感染机会等缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了避免上述化学方法对猪带瓣血管进行的脱细胞的不足之处，提供 一种与人体具有良好的生物相容性，适度的生物降解速率，有利于人体细胞的定植和生长 的猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法。
本发明的猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法，主要包括以下步骤：
A)备料：取健康猪的升主动脉和主动脉弓及不短于5mm冠状动脉，用PBS溶液清洗 后放入二氧化碳干冰培养箱内消毒，装入真空包装袋中密封即为猪带瓣血管；
B)超高压脱细胞：将猪带瓣血管连同真空包装袋，放入预热后的超高压机的传压介 质中，先将传压介质加压到600MPa并保压5±2分钟后泄压；然后将传压介质加压到800MPa 并保压5±2分钟后泄压；再将传压介质第三次加压达到1000MPa并保压5±2分钟后泄压， 得猪带瓣血管脱细胞的支架。所述传压介质最好选用经过两次蒸馏的双蒸水。
本发明使用超高压方法制备的猪带瓣血管脱细胞的支架，由于采用多次逐步增压，可 使高压在较短时间内即可将细胞完全去除，又能使层粘连蛋白(Ln)和纤维粘连蛋白(Fn)不 受到破坏，使之符合移植要求。该方法能将猪带瓣血管中的细胞完全去除，使之失去免疫 源性，并能同时将各种细菌、病毒、芽胞等微生物全部灭活，消除人畜共患病的可能。由 于层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在脱细胞过程中未受到破坏，有利于人体细胞在支架上进行 粘附、定植和生长。同时由于超高压方法是一种物理方法，完全避免使用化学方法造成化 学物质残留所引起的诸多不良后果。用本发明的方法制得的猪带瓣血管脱细胞支架具有良 好的生物相容性，适度的生物降解速率，机械强度高，易于缝合固定等优点，有利于人体 细胞的定植和生长，并能随着真的瓣膜或血管的再生而被逐渐降解和吸收。
附图说明
附图1是超高压前的瓣膜扫描电镜图；
附图2是超高压后的瓣膜扫描电镜图；
附图3是超高压后的瓣膜纤维粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图4是超高压后的瓣膜层粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图5是超高压前的血管扫描电镜图；
附图6是超高压后的血管扫描电镜图；
附图7是超高压后的血管纤维粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图8是超高压后的血管层粘连蛋白的免疫组化染色图。
本发明的猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法，主要包括以下步骤：
A)备料：取健康猪的升主动脉和主动脉弓及不短于5mm冠状动脉，用PBS溶液清洗 后放入二氧化碳干冰培养箱内消毒，装入真空包装袋中密封即为猪带瓣血管；
B)超高压脱细胞：将猪带瓣血管连同真空包装袋，放入预热后的超高压机的传压介 质中，先将传压介质加压到600MPa并保压5±2分钟后泄压；然后将传压介质加压到800MPa 并保压5±2分钟后泄压；再将传压介质第三次加压达到1000MPa并保压5±2分钟后泄压， 得猪带瓣血管脱细胞的支架。所述传压介质最好选用经过两次蒸馏的双蒸水。
本发明使用超高压方法制备的猪带瓣血管脱细胞的支架，由于采用多次逐步增压，可 使高压在较短时间内即可将细胞完全去除，又能使层粘连蛋白(Ln)和纤维粘连蛋白(Fn)不 受到破坏，使之符合移植要求。该方法能将猪带瓣血管中的细胞完全去除，使之失去免疫 源性，并能同时将各种细菌、病毒、芽胞等微生物全部灭活，消除人畜共患病的可能。由 于层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在脱细胞过程中未受到破坏，有利于人体细胞在支架上进行 粘附、定植和生长。同时由于超高压方法是一种物理方法，完全避免使用化学方法造成化 学物质残留所引起的诸多不良后果。用本发明的方法制得的猪带瓣血管脱细胞支架具有良 好的生物相容性，适度的生物降解速率，机械强度高，易于缝合固定等优点，有利于人体 细胞的定植和生长，并能随着真的瓣膜或血管的再生而被逐渐降解和吸收。
附图说明
附图1是超高压前的瓣膜扫描电镜图；
附图2是超高压后的瓣膜扫描电镜图；
附图3是超高压后的瓣膜纤维粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图4是超高压后的瓣膜层粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图5是超高压前的血管扫描电镜图；
附图6是超高压后的血管扫描电镜图；
附图7是超高压后的血管纤维粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图8是超高压后的血管层粘连蛋白的免疫组化染色图。
具体实施方式
本发明的猪带瓣血管脱细胞的支架的超高压制备方法，经过使用不同压力和施压时间 等长期实验，发现当一次施压的压力达到1000Mpa和施压时间较长，虽然也能将细胞完全 去除，但同时会使层粘连蛋白(Ln)和纤维粘连蛋白(Fn)受到破坏。当一次施压的压力低于 1000MPa时，尽管施压时间较长也不能将细胞完全去除，但不会使层粘连蛋白(Ln)和纤维 粘连蛋白(Fn)受到破坏。为了获得既能将细胞完全去除，又能使层粘连蛋白(Ln)和纤维粘 连蛋白(Fn)不受到破坏，使之更符合移植需要，本发明的脱细胞支架的最佳的制备方法如 下述步骤：
A)备料：将健康猪麻醉成功后按无菌手术要求取出猪的升主动脉和主动脉弓及不短 于5mm冠状动脉，保留二尖瓣前叶和厚约3mm室间隔肌肉，用生理盐水冲洗，测量瓣环内 径(瓣叶下缘最低点)，瓣环上10mm、30mm处的动脉内径。用PBS溶液清洗后放入二氧化碳 干冰培养箱内消毒。在超净工作台上取出消毒好的材料，装入真空包装袋中密封即为猪带 瓣血管，注明带瓣血管名称、编号、带瓣血管内径、瓣环内径、取材时间。
B)超高压脱细胞：将猪带瓣血管连同真空包装袋，放入设置在常温下的超高压机的 传压介质中，先将传压介质加压到600MPa并保压5±2分钟后泄压；然后将传压介质加压 到800MPa并保压5±2分钟后泄压；再将传压介质第三次加压达到1000MPa并保压5±2 分钟后泄压，得猪带瓣血管脱细胞的支架。
所述传压介质最好选用经过两次蒸馏的双蒸水。
用本发明的超高压制备方法制成的猪带瓣血管脱细胞的支架，其脱细胞结果和层粘连 蛋白(Ln)及纤维粘连蛋白(Fn)的完好程度经下述多种检测结果足以表明完全符合移植要 求。
一、脱细胞检测
1)用HE染色方法检测：脱细胞后的带瓣血管经4％的多基甲醛固定，石蜡包埋，4um切 片，苏木素、伊红染色，置光学显微镜下观察可见正常结构，未见蓝紫色细胞核或碎片，说 明细胞已完全脱去。
2)用DAPI染色方法检测：脱细胞后的带瓣血管经DAPI染色免疫荧光染色检测，未见 蓝紫色细胞核或碎片，说明细胞已完全脱去。
二、扫描电子显微镜检查
带瓣血管脱细胞支架用扫描电子显微镜下观察：脱细胞前、后的瓣膜或血管内膜面以 戊二醛固定，按电镜标本制作常规处理，观察脱细胞前后的瓣膜或血管内膜面的结构，脱 细胞前瓣膜或血管内膜表面细胞紧密排列，结构清晰，如图1和图5所示。脱细胞后瓣膜 和血管未见细胞或其碎片残留，细胞外基质(也称为支架)结构完整、清晰，无破坏，胶 原纤维清晰可见，没有断裂或异常交联，如图2和图6所示。
三、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的检测
用免疫组化染色方法测试：脱细胞后的带瓣血管经4％多基甲醛固定，石蜡包埋后4um 切片，抗原修复(纤维粘连蛋白采用微波热修复抗原，层粘连蛋白采用胃蛋白酶消化法修复)， DAB显色，常规树胶封片后光学显微镜发现层粘连蛋白存在，参见附图4和附图8，图中的 黑点为层粘连蛋白。也发现纤维粘连蛋白存在，参见附图3和附图7，图中的黑点为纤维 粘连蛋白。如超高压的压力达800MPa作用时间超过15min或者压力达1000MPa作用时 间超过10min，蛋白染色面积减少，颜色变淡。每张免疫组化染色切片随机选择10个视野， 用捷达801图像分析仪测量系统准确测量免疫染色阳性区域测量面积，测量该区域的平均 光密度值，二者的乘积表示蛋白的总含量，如表一和表二所示：
统计学方法：分析免疫组化定量结果，组间采用t检验，数据以表示。采用SPSS 软件统计处理，检验水准α＝0.05。
表一
(带瓣血管脱细胞后血管支架内膜面层粘连蛋白、纤维粘连蛋白免疫组化染色)
脱细胞分组 超高压前血管内膜 面 800MPa 脱细胞15min 1000MPa 脱细胞10min 本专利中的超高压 得到的血管内膜面 Ln的阳性面积× 平均光密度 0.0176±0.0025 0.0034±0.007 # 0.0029±0.007 # 0.0174±0.0020 * Fn的阳性面积× 平均光密度 0.0159±0.0031 0.0056±0.011 # 0.0063±0.009 # 0.0155±0.0036 * 结果(与超高压前相比#P＜0.05，*P＞0.05) 明显减少 明显减少 未见减少
表二
(带瓣血管脱细胞后瓣膜支架层粘连蛋白、纤维粘连蛋白免疫组化染色)
脱细胞分组 超高压前瓣膜 800MPa 脱细胞15min 1000MPa 脱细胞10min 本专利中的超高压 后得到的瓣膜 Ln的阳性面积× 平均光密度 0.0124±0.0017 0.0019±0.003 # 0.0020±0.002 # 0.0140±0.0023 * Fn的阳性面积× 平均光密度 0.0107±0.0012 0.0033±0.004 # 0.0057±0.004 # 0.0091±0.0012 * 结果(与超高压前相比#P＜0.05，*P＞0.05) 明显减少 明显减少 未见减少
四、热皱缩变形温度测试
带瓣血管脱细胞支架的热皱缩变形温度测试：脱细胞前后的瓣膜或血管以蒸馏水为加 温介质，采用热皱缩温度仪，用数字温度计测定瓣膜或血管热皱缩变形时的温度。如热皱缩 温度降低反映胶原出现异常交联。该支架在脱细胞前、后的瓣膜或血管皱缩变形时的温度 没有明显变化，说明胶原交联正常，其结果如表三和表四中的第二行所示。
五、力学性能测试
带瓣血管脱细胞支架的力学性能测试：脱细胞前后的瓣膜或血管用力学测试仪测量瓣 膜或血管的最大负荷(支架断裂时的负荷)、伸长比(支架断裂时的长度和原长度的比值)。 该支架在脱细胞前、后的瓣膜或血管的这些生物力学指标没有明显变化，说明力学性能正 常，其结果如表三和表四中第三行和第四行所示。
表三
脱细胞分组 超高压前血管 本专利中的超高压后 得到的血管支架 热皱缩变形温度 (℃) 64.8±0.9 61.9±0.7 最大负荷 (MPa) 0.82±0.16 0.79±0.28 伸长比 1.87±0.25 1.83±0.34
表四
脱细胞分组 超高压前瓣膜 本专利中的超高压后 得到的瓣膜支架 热皱缩温度 (℃) 68.1±1.3 66.3±0.8 最大负荷 (MPa) 1.23±0.17 1.14±0.16 伸长比 1.35±0.12 1.29±0.21
综上所述，用本超高压方法制备的猪带瓣血管脱细胞的支架符合医用移植要求。
A)备料：将健康猪麻醉成功后按无菌手术要求取出猪的升主动脉和主动脉弓及不短 于5mm冠状动脉，保留二尖瓣前叶和厚约3mm室间隔肌肉，用生理盐水冲洗，测量瓣环内 径(瓣叶下缘最低点)，瓣环上10mm、30mm处的动脉内径。用PBS溶液清洗后放入二氧化碳 干冰培养箱内消毒。在超净工作台上取出消毒好的材料，装入真空包装袋中密封即为猪带 瓣血管，注明带瓣血管名称、编号、带瓣血管内径、瓣环内径、取材时间。
B)超高压脱细胞：将猪带瓣血管连同真空包装袋，放入设置在常温下的超高压机的 传压介质中，先将传压介质加压到600MPa并保压5±2分钟后泄压；然后将传压介质加压 到800MPa并保压5±2分钟后泄压；再将传压介质第三次加压达到1000MPa并保压5±2 分钟后泄压，得猪带瓣血管脱细胞的支架。
所述传压介质最好选用经过两次蒸馏的双蒸水。
用本发明的超高压制备方法制成的猪带瓣血管脱细胞的支架，其脱细胞结果和层粘连 蛋白(Ln)及纤维粘连蛋白(Fn)的完好程度经下述多种检测结果足以表明完全符合移植要 求。
一、脱细胞检测
1)用HE染色方法检测：脱细胞后的带瓣血管经4％的多基甲醛固定，石蜡包埋，4um切 片，苏木素、伊红染色，置光学显微镜下观察可见正常结构，未见蓝紫色细胞核或碎片，说 明细胞已完全脱去。
2)用DAPI染色方法检测：脱细胞后的带瓣血管经DAPI染色免疫荧光染色检测，未见 蓝紫色细胞核或碎片，说明细胞已完全脱去。
二、扫描电子显微镜检查
带瓣血管脱细胞支架用扫描电子显微镜下观察：脱细胞前、后的瓣膜或血管内膜面以 戊二醛固定，按电镜标本制作常规处理，观察脱细胞前后的瓣膜或血管内膜面的结构，脱 细胞前瓣膜或血管内膜表面细胞紧密排列，结构清晰，如图1和图5所示。脱细胞后瓣膜 和血管未见细胞或其碎片残留，细胞外基质(也称为支架)结构完整、清晰，无破坏，胶 原纤维清晰可见，没有断裂或异常交联，如图2和图6所示。
三、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的检测
用免疫组化染色方法测试：脱细胞后的带瓣血管经4％多基甲醛固定，石蜡包埋后4um 切片，抗原修复(纤维粘连蛋白采用微波热修复抗原，层粘连蛋白采用胃蛋白酶消化法修复)， DAB显色，常规树胶封片后光学显微镜发现层粘连蛋白存在，参见附图4和附图8，图中的 黑点为层粘连蛋白。也发现纤维粘连蛋白存在，参见附图3和附图7，图中的黑点为纤维 粘连蛋白。如超高压的压力达800MPa作用时间超过15min或者压力达1000MPa作用时 间超过10min，蛋白染色面积减少，颜色变淡。每张免疫组化染色切片随机选择10个视野， 用捷达801图像分析仪测量系统准确测量免疫染色阳性区域测量面积，测量该区域的平均 光密度值，二者的乘积表示蛋白的总含量，如表一和表二所示：
统计学方法：分析免疫组化定量结果，组间采用t检验，数据以表示。采用SPSS 软件统计处理，检验水准α＝0.05。
表一
(带瓣血管脱细胞后血管支架内膜面层粘连蛋白、纤维粘连蛋白免疫组化染色)
脱细胞分组 超高压前血管内膜 面 800MPa 脱细胞15min 1000MPa 脱细胞10min 本专利中的超高压 得到的血管内膜面 Ln的阳性面积× 平均光密度 0.0176±0.0025 0.0034±0.007 # 0.0029±0.007 # 0.0174±0.0020 * Fn的阳性面积× 平均光密度 0.0159±0.0031 0.0056±0.011 # 0.0063±0.009 # 0.0155±0.0036 * 结果(与超高压前相比#P＜0.05，*P＞0.05) 明显减少 明显减少 未见减少
表二
(带瓣血管脱细胞后瓣膜支架层粘连蛋白、纤维粘连蛋白免疫组化染色)
脱细胞分组 超高压前瓣膜 800MPa 脱细胞15min 1000MPa 脱细胞10min 本专利中的超高压 后得到的瓣膜 Ln的阳性面积× 平均光密度 0.0124±0.0017 0.0019±0.003 # 0.0020±0.002 # 0.0140±0.0023 * Fn的阳性面积× 平均光密度 0.0107±0.0012 0.0033±0.004 # 0.0057±0.004 # 0.0091±0.0012 * 结果(与超高压前相比#P＜0.05，*P＞0.05) 明显减少 明显减少 未见减少
四、热皱缩变形温度测试
带瓣血管脱细胞支架的热皱缩变形温度测试：脱细胞前后的瓣膜或血管以蒸馏水为加 温介质，采用热皱缩温度仪，用数字温度计测定瓣膜或血管热皱缩变形时的温度。如热皱缩 温度降低反映胶原出现异常交联。该支架在脱细胞前、后的瓣膜或血管皱缩变形时的温度 没有明显变化，说明胶原交联正常，其结果如表三和表四中的第二行所示。
五、力学性能测试
带瓣血管脱细胞支架的力学性能测试：脱细胞前后的瓣膜或血管用力学测试仪测量瓣 膜或血管的最大负荷(支架断裂时的负荷)、伸长比(支架断裂时的长度和原长度的比值)。 该支架在脱细胞前、后的瓣膜或血管的这些生物力学指标没有明显变化，说明力学性能正 常，其结果如表三和表四中第三行和第四行所示。
表三
脱细胞分组 超高压前血管 本专利中的超高压后 得到的血管支架 热皱缩变形温度 (℃) 64.8±0.9 61.9±0.7 最大负荷 (MPa) 0.82±0.16 0.79±0.28 伸长比 1.87±0.25 1.83±0.34
表四
脱细胞分组 超高压前瓣膜 本专利中的超高压后 得到的瓣膜支架 热皱缩温度 (℃) 68.1±1.3 66.3±0.8 最大负荷 (MPa) 1.23±0.17 1.14±0.16 伸长比 1.35±0.12 1.29±0.21
综上所述，用本超高压方法制备的猪带瓣血管脱细胞的支架符合医用移植要求。
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