表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒受体CD163的猪永生化肺泡巨噬细胞细胞系及其应用
阅读：249发布：2020-05-22
专利汇可以提供表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒受体CD163的猪永生化肺泡巨噬细胞细胞系及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)受体CD163的猪永生化的 肺 泡巨噬细胞细胞系，所述的细胞系命名为PAM-Tang-20，保藏在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.13591。实验证明，本发明建立的细胞系能够高表达CD163受体，是PRRSV的易感细胞，可以广泛应用于PRRSV的增殖、PRRSV临床毒株的分离、 疫苗 生产以及PRRSV相关 基础 研究等。本发明的提出为猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒的体外培养提供了一种有效的技术手段。，下面是表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒受体CD163的猪永生化肺泡巨噬细胞细胞系及其应用专利的具体信息内容。
表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒受体CD163的猪永生化肺
泡巨噬细胞细胞系及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种可用于体外培养猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒的细胞系及其 应用，特别涉及一种能够高效表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒受体CD163的猪永 生化肺泡巨噬细胞细胞系及其应用，本发明属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是危害全世界养猪业的重要病原，特别是在高致病性PRRSV出现 之后，我国养猪业面临问题更加严重。
[0003] PRRSV是单股正链RAN病毒，基因组大约15kb属于动脉炎病毒属。根据最 新的病毒分类，动脉炎病毒属还包括其它3种病毒：马动脉炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)，小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus， LDV)和猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus，SHFV)。在病毒的细胞嗜 性方面，该属病毒除了EAV具有相对广泛的细胞嗜性之外，其它病毒只有少数细胞 能够支持病毒复制。PRRSV在体内的靶细胞目前已知仅限于猪肺泡巨噬细胞 (Porcine alveolar macrophages，PAMs)，分化的血液单核细胞(Blood monocytes， BMo)，树突状细胞(Dendritic cells，DC)以及一些特定的骨髓细胞(Bone marrow cells，BM)。虽然体外细胞系MA-104(来源于非洲绿猴肾细胞)与MARC-145 (MA-104的克隆株)是PRRSV的易感细胞，也被广泛应用于PRRSV的相关研究。 但是这些细胞系起源于非洲绿猴细胞，能否真实反映其宿主感染细胞的情况值得商 榷。原代PAM细胞是PRRSV感染的主要靶细胞，PAM细胞是作为研究PRRSV的 最佳细胞模型。但是体外获取并培养PAM价格昂贵，且步骤繁琐，不同猪只之间 差异也较大。
[0004] 近年来研究表明CD163、CD151、vimetin、DC-SIGN和CD169是潜在的PRRSV 病毒受体。这些受体在PRRSV进入细胞的过程中发挥作用。越来越多的研究显示， 在众多假定受体中，CD163、CD151和CD169研究的较多，并且显示CD163为最 关键受体。以前有研究表明，应用SV40的Large T抗原可以使原代PAM细胞永生 化，但是永生化之后不能表达CD163，所以不能支持PRRSV病毒在细胞中的复制， 必须通过重新导入CD163受体才能介导PRRSV病毒感染。
[0005] 王向鹏等(王向鹏，魏蕊芳，肖书奇，周恩民，慢病毒载体介导稳定表达CD163 的PAM细胞系的建立及对PRRSV感染的研究，畜牧兽医学报2013,44(11)：1797 至1804年)通过慢病毒载体系统将猪源CD163转染入永生化的猪肺泡巨噬细胞 (PAM)系(CRL-2843)，建立稳定表达CD 163的PAM细胞系(PAM-CD 163)， 从中筛选出1株能稳定表达CD 163的PAM细胞系，命名为PAM-CD 163。应用得 到的细胞系进行PRRSV感染试验，表明该株细胞对PRRSV高度易感，PRRSV在 PAM-CD 163细胞上的毒价可以达到105.0TCID50/mL-1以上。本发明公开的一种能够 高效表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(PRRSV)受体CD163的猪永生化的肺泡 巨噬细胞(PAM)细胞系是通过流式细胞仪对永生化PAM细胞系进行筛选从而得 到的自然存在的高表达CD163的细胞系，实验证明，本发明得到的高效表达猪繁殖 障碍与呼吸综合症病毒(PRRSV)受体CD163的猪永生化的肺泡巨噬细胞(PAM) 细胞系相较于PAM-CD 163对PRRSV更易感，接种病毒的细胞系PAM-Tang-20的 病毒滴度可以达到107.0TCID50/ml。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种能够高效表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒 (PRRSV)受体CD163的猪永生化的肺泡巨噬细胞(PAM)细胞系及其构建方法 和应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0008] 本发明通过慢病毒载体介导，构建了含有SV40 Large T抗原的PAM永生化细 胞系，并成功筛选到一株可以高效表达CD163受体，高效繁殖PRRSV的猪肺泡巨 噬细胞永生化细胞系。该细胞系可以广泛应用于临床毒株的分离，疫苗生产以及 PRRSV相关基础研究。
[0009] 本发明分离的到的一株表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)受体CD163的猪永生化的肺泡巨噬细胞细 胞系，所述的细胞系命名为PAM-Tang-20，分类命名为高效繁殖PRRSV的猪肺泡 巨噬细胞永生化细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编 号为：CGMCC No.13591，保藏时间为2017年1月11日。
[0010] 用PE标记的CD163抗体检测PAM-Tang-20细胞克隆传代细胞的CD163表达 情况，结果显示，68.40％以上的细胞呈CD163阳性。
[0011] 进一步的，本发明还提出了所述的细胞系在体外培养猪繁殖障碍与呼吸综合症 病毒中的应用。以及
[0012] 所述的细胞系在分离猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒中的应用。
[0013] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0014] 本发明建立了能够高效表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(PRRSV)受体 CD163的猪永生化的肺泡巨噬细胞(PAM)细胞系，该细胞系能够高表达CD163 受体，是PRRSV的易感细胞，可以广泛应用于PRRSV的增殖、PRRSV临床毒株 的分离、疫苗生产以及PRRSV相关基础研究等。本发明的提出为猪繁殖障碍与呼 吸综合症病毒的体外培养提供了一种有效的技术手段。附图说明
[0015] 图1为永生化细胞系的建立；
[0016] 图2为原代PAM细胞接种慢病毒后15d之后可见岛状细胞群的出现；
[0017] 图3为分选单克隆细胞的增殖；
[0018] 图4为分选克隆细胞株的CD163表达检测；
[0019] 图5为PAM-Tang-20细胞株感染PRRSV-HuN4-EGFP报告病毒；
[0020] 图6为PAM-Tang-20细胞株感染PRRSV-HuN4与PRRSV-SC-D病毒后的 RT-PCR检测；
[0021] 图7为细胞系PAM-Tang-20以及细胞系PAM-CD163感染PRRSV-SC-D病毒后 的滴度检测。
具体实施方式
[0022] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明创造的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明创造的范围构成任何 限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明创造的精神和范围下可以对 本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改的替换均落入本发明创 造的保护范围内。
[0023] 实施例1高效表达猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(PRRSV)受体CD163的猪 永生化的肺泡巨噬细胞(PAM)细胞系的建立
[0024] 1材料与方法
[0025] 1.1材料
[0026] 1.1.1实验动物
[0027] 实验用猪为哈尔滨兽医研究所提供6周龄SPF猪，PRRSV、PCV2、CSFV、PPV、 PRV、SIV和猪肺炎支原体的抗原和抗体均为阴性。高致病性猪繁殖与呼吸综合征 病毒(HP-PRRSV)HuN4-F5，HuN4-F5-EGFP以及PRRSV-SC-D病毒株由本实验 室保存。
[0028] 1.1.2细胞质粒
[0030] 1.1.3抗体及流式分析分选
[0031] PE标记抗猪CD163抗体以及同型对照抗体购自ANTIGENIX AMERICA公司。 细胞标记抗体参照抗体说明书进行，细胞分析仪为贝克曼库尔特FC 500流式X细 胞仪,细胞分选仪为贝克曼库尔特MoFlo XDP流式细胞仪。
[0032] 1.1.4病毒核酸提取及引物
[0033] DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒购自全式金公司。
[0034] PRRSV检测引物由吉林库美公司合成：
[0035] F：GTTAAATATGCCAAATAACAACG，
[0036] R：TGAATAGGTGACTTAGAGGCACA
[0037] 1.2方法
[0038] 1.2.1猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离培养
[0039] 原代PAM的获取需要采取灌肺的方式获取，具体步骤见参考文献 (Thanawongnuwech,R.,E.L.Thacker,and P.G.Halbur,Effect of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)(isolate ATCC VR-2385)infection on bactericidal activity of porcine pulmonary intravascular macrophages(PIMs):in vitro comparisons with pulmonary alveolar macrophages(PAMs).Vet Immunol Immunopathol, 1997.59(3-4):p.323-35.)。PAM-CD163细胞(王向鹏，魏蕊芳，肖书奇，周恩民， 慢病毒载体介导稳定表达CD163的PAM细胞系的建立及对PRRSV感染的研究， 畜牧兽医学报2013，44(11)：1797-1804)由西北农林大学周恩民教授提供。
[0040] 1.2.2慢病毒包装
[0041] (1)pSFG-SV40-Large质粒的构建
[0042] SV40Large T antigen扩增于293T细胞，上游引物序列： TACCATGGATAAAGTTTTAAACAG，下游引物序列： GCCCATGGTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAG，扩增得到的Large T antigen的序 列如SEQ ID NO.1所示。PCR扩增之后，用NcoI单酶切连接至pSFG载体上(图 1)，得到的载体命名为pSFG-SV40-Large。
[0043] (2)慢病毒包装
[0044] 待293E细胞生长汇合至50％，采用磷酸钙转染试剂将pVSV-G， pSFG-SV40-Large质粒按照1﹕3的比率进行转染，转染程序按试剂要求进行。收集 转染48、72h后细胞上清，上清液10000r/min离心5min，细胞及碎片沉淀后，将 上清分装，于-80℃保存备用。
[0045] 1.2.3慢病毒感染及永生化细胞系的建立
[0046] 将分离培养的原代PAM细胞铺6孔板，待原代PAM细胞完全贴壁后，接种1ml 慢病毒液，每个2～3d观察1次，直至观察到岛状细胞群的形成。
[0047] 1.2.4表面CD163检测
[0048] 将细胞消化后，10000r/min离心5min，去上清，孵育CD163抗体1小时，2 小时后经流式细胞仪检测。
[0049] 1.2.5 PRRSV病毒感染检测
[0050] 将细胞铺板，接种0.01MOI病毒。每隔12h观察细胞病变或荧光，检测病毒 感染。病毒核酸提取参照试剂盒说明书进行。
[0051] 1.2.6 PRRSV病毒感染滴度检测
[0052] 将细胞铺板，接种0.01MOI PRRSV-SC-D毒株。48h进行病毒TCID50滴定。
[0053] 2结果
[0054] 2.1永生化PAM细胞系的构建
[0055] 将分离的原代PAM细胞铺6孔板，待原代细胞贴壁后接种包装好的含有SV40 Large T抗原的慢病毒，经过15d之后可见岛状细胞群的出现(图2)，表明细胞永 生化成功。将该永生化的细胞群命名为PAM-Tang。
[0056] 2.2单克隆细胞的分离培养
[0057] 通过流式细胞分选技术分选细胞并培养，至15d观察，可见1株由单细胞生长 的单克隆细胞株(图3)，并将该单克隆细胞株命名为PAM-Tang-20，该细胞株保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.13591，保 藏日期为2017年1月11日。
[0058] 接下来用PE标记的CD163抗体检测PAM-Tang-20细胞克隆株传代细胞的 CD163表达情况，结果显示，68.40％的细胞呈CD163阳性(图4)。表明细胞经多 次传代后绝大部分细胞是高表达CD163受体的，能够成为PRRSV易感细胞。
[0059] 2.3 PRRSV HuN4-EGFP病毒增殖
[0060] 为了验证PAM-Tang-20细胞能否成为PRRSV的易感细胞，本研究接种 PRRSV-HuN4-EGFP报告病毒，结果表明，4d可见该细胞系出现明显细胞病变，并 且在荧光显微镜下可见标签病毒绿色荧光(图5)。证实该细胞系可以很好的用于 PRRSV病毒的繁殖与扩增。
[0061] 2.4 PRRSV HuN4与PRRSV-SC-D毒株增殖
[0062] 为了进一步验证该细胞系具有原代PAM扩增PRRSV的能力，本研究选取一株 PRRSV-SC-D毒株进行研究，该毒株经实验室验证只能在原代PAM细胞中扩增， 不能在常规分离培养细胞MARC145中增殖。选取PRRSV-HuN4毒株作为对照毒株， 分别接种0.01MOI的PRRSV-HuN4与PRRSV-SC-D病毒，3d之后提取细胞病毒 RNA进行检测，通过RT-PCR进行检测，表明两种病毒均能在PAM-Tang-20细胞中 增殖(图6)。表明该细胞株具有巨大的临床PRRSV细胞分离潜力。
[0063] 2.5 PRRSV-SC-D毒株增殖
[0064] 为了进一步验证该细胞系PAM-Tang-20扩增PRRSV的能力，本研究选取一株 PRRSV-SC-D毒株进行研究，将细胞铺板，接种0.01MOI PRRSV-SC-D毒株。48h 进行病毒TCID50滴定。同时应用一株已知能够感染PRRSV的PAM细胞系 PAM-CD163作为对照。结果表明，48h后，接种病毒的细胞系PAM-Tang-20的病 毒滴度可以达到107.0TCID50/ml，滴度显著高于PAM-CD163细胞系(图7)。
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