一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三联病毒样颗粒疫苗及其制备方法
阅读：925发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三联病毒样颗粒疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 目的在于公开一种猪 圆环病毒 、猪细小病毒、 猪繁殖与呼吸综合症 病毒三联病毒样颗粒 疫苗 及其制备方法。本发明所述的三联病毒样颗粒疫苗(Triple VLP疫苗)含有PCV-2的主要结构蛋白CAP蛋白、PPV VP2蛋白 抗原 表位、以及PRRSV Gp5蛋白抗原表位组成的VLP。经实验，该疫苗可以激发良好的双重的细胞及体液免疫应答。药效试验表明，经此形成的VLP抗原加入或不加佐剂，制备的注射剂型、滴鼻剂型、饮 水 剂型免疫不同动物群体后，可安全、有效的防治PCV-2、PPV、PRRSV感染，为不同种群的母猪、小猪、育肥猪安全、有效免疫防控PCV-2、PPV、PRRSV混合感染提供了理想的疫苗。，下面是一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三联病毒样颗粒疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三联病毒样颗粒疫苗，(简称Triple VLP疫苗)，其特征在于该疫苗含有2-型猪圆环病毒(PCV-2)主要结构蛋白CAP蛋白，猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2的抗原表位，与B亚群猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)结构蛋白GP5的抗原表位组成的VLP。
2.如权利要求1所述的Triple VLP疫苗，其特征在于该疫苗涉及PCV-2主要结构蛋白CAP蛋白，PPV结构蛋白VP2的表位的1-57核酸序列，PRRSV结构蛋白GP5的表位的88-156核酸序列；其中，所述CAP蛋白核酸序列包括来自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ亚型的CAP蛋白核酸序列，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402亚型的CAP蛋白核酸序列，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白核酸序列，以及来自PCV-2e的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白核酸序列；其中，所述PPV VP2蛋白的1-57核酸序列包括来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白的1-57核酸序列；其中所述PRRSV GP5蛋白88-156核酸序列包括来自PRRSV的CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的88-156核酸序列。
3.如权利要求1-2任一所述的Triple VLP疫苗，其特征在于该疫苗含有涉及PCV-2的CAP蛋白，并携带有PPV的VP2蛋白抗原表位、以及PRRSV的Gp5蛋白抗原表位，所述CAP蛋白包括来自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ、亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402、亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2e的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白；其中，所述PPV VP2蛋白的抗原表位包括来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白1-19位肽段；其中所述PRRSV GP5蛋白的抗原表位包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的30-52位肽段。
4.如权利要求3所述的Triple VLP疫苗，其特征在于该疫苗包含一个携带有PCV-2CAP蛋白、PPV VP2蛋白抗原表位、PRRSV GP5蛋白抗原表位的重组真核表达载体、鸡成纤维细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞；其中，所述真核表达载体选自：①pHWD2000；②pOPI3CAT；
③pCAGGS；④pcDNA6/TR；⑤pCMV-HA。所述鸡成纤维细胞选自：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞。所述哺乳动物细胞选自：①PK-15细胞；②VERO细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；所述昆虫细胞选自：①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。
5.如权利要求4所述的Triple VLP疫苗，其特征在于其中所述的pHWD2000载体是由pHW2000载体改造得到，包括去掉pHW2000载体上游的pCMV启动子，并用鸡β-actin蛋白启动子替换，同时在鸡β-actin蛋白启动字上游插入hCMV-IE增强子，改造后的pCWD2000可以在真核系统中高效表达外源基因，同时pCWD2000有着较小的分子量，可以携带较大的外源基因片段。
6.如权利要求1-5任一所述的Triple VLP疫苗，其特征在于该疫苗不含有佐剂，或含有如下佐剂中的一种或几种：①新型纳米铝佐剂；②铝盐：氢氧化铝或磷酸铝；③水凝胶佐剂：季胺化的壳聚糖、④rLT：重组不耐热性肠毒素。其特征在于该疫苗制成多种临床适用的剂型：注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型。
7.如权利要求6所述的Triple VLP疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
①构建pHWD2000真核表达载体；②含有编码CAP-epitope(VP2)-epitope(GP5)的串联表达载体，并包含BsmB I酶切位点；③提供一种用于表达的细胞系，经转染后可以释放Triple VLP；④提供用于纯化Triple VLP的方法，方法包括蔗糖梯度离心纯化方法以及柱层析纯化方法。
8.如权利要求7所述的Triple VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的表达宿主细胞系中所指细胞为：鸡成纤维细胞或哺乳动物细胞，所述鸡成纤维细胞选自：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；所述哺乳动物细胞选自：①PK-15细胞；②VERO细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；所述昆虫细胞选自：①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。
9.如权利要求7所述的Triple VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中细胞培养方法包括如下步骤：在细胞培养基中加入浓度为2-100μg/mL的糖胺聚糖；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素。
10.如权利要求9所述的Triple VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的蔗糖梯度离心的步骤为：①收集规模化生产的Triple VLP细胞培养液，4℃ 5000rmp离心10min，去除细胞及杂质；②取上清液100000g 4℃离心2h，沉淀用HNE buffer悬浮，HNE buffer的组成为25mM Tris-HCl pH 7.4，150mMNaCl，5mM EDTA；③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL；0.45g/mL蔗糖3mL；1.37g/mL蔗糖
1mL；4℃ 100000g离心2h；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰；杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有
0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS；杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的VLP原液为疫苗原液。
一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三
联病毒样颗粒疫苗及其制备方法
发明领域
[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及一种猪圆环病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒三联病毒样颗粒疫苗及其制备方法，特别涉及一种以含有2-型猪圆环病毒的核衣壳蛋白、猪细小病毒VP2蛋白抗原表位、以及猪繁殖与呼吸综合症病毒Gp5蛋白组成的三联病毒样颗粒疫苗(Trivalent VLP)及其制备方法。
背景技术
[0002] 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)将导致猪群免疫力下降，并与猪断奶后多系统衰弱综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)、猪皮炎及肾病综合症(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome，PDNS)、猪繁殖障碍(Porcine reproductive failure)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine Respiratory Disease Syndrome，PRDC)、猪增生性坏死性肺炎(Porcine Necrotizing Pneumonia，PNP)、猪先天性振颤(Porcine Congenital Tremor，CT)等多种疾病有联系。猪圆环病毒(PCV)是1974年在一种体外培养的猪肾细胞系PK-15中首次发现的，当时认为是一种细胞培养的污染物，因为其并不具有导致细胞病变等典型的病毒样作用，所以称为小病毒样核酸污染物。随后陆续有报道指出这种小病毒样核酸污染物其实是一种病毒，这种病毒是一种小型无包膜的12面体病毒，核心包含一个单股环状DNA基因组，不导致动物发病及传代培养的细胞发生病变，并正式将其命名为猪圆环病毒(Procine Circovirus，PCV)。但1994年Hines等首先报道了在患有先天性振颤(Congenital Tremor)的仔猪中发现了PCV样病毒(PCV-like Virus)，1995年Allan等人也在几例猪的死胎中发现了PCV的抗体，这将PCV与各种疾病联系到了一起。之后对PCV的报道渐渐指向了一种分离自病猪而不是细胞培养物的“新型猪圆环病毒(Novel PCV)”。随着对该新型PCV的深入研究，发现从基因组到血清型都与传统的PCV存在差异，随之国际上将这种新型的、可以致病的猪圆环病毒命名为2-型猪圆环病毒(PCV-2)，同时将细胞培养物中发现的非致病性猪圆环病毒命名为1-型猪圆环病毒(PCV-1)。 在临床中，PCV-2主要感染5-12周龄的小猪，病猪表现为生长缓慢、被毛粗乱、营养不良、呼吸困难、黄胆、粘膜苍白，可成为僵猪，严重可导致死亡。有证据表明，PCV-2的致病性主要是由于其对免疫系统的损伤造成的，研究发现，感染PCV-2的病猪淋巴细胞会发生明显减少。Darwich等报道，患有猪断奶后多系统衰弱综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的病猪出现CD3+、CD4+T淋巴细胞减少，CD8+T淋巴细胞没有发生明显变化，而典型的由PCV-2感染而引起PMWS病症的患猪出现了CD8+T淋巴细胞的减少。而且有证据表明PCV-2在淋巴器官中的数量与患猪淋巴细胞的消耗以及外周血中IgM及CD8+T淋巴细胞的减少有着直接的关系。Nielsen等人报道，患猪在PCV-2感染10天后淋巴细胞开始减少，在第14天时出现显著下降，且这种下降会一直持续到患猪死亡。而且通过试验证实，所有的T淋巴细胞亚群都会由于PCV-2的感染而出现数量上的减少。Sarli等人报道，PCV-2对淋巴细胞的消耗还包括树突状细胞和B淋巴细胞，同时Chianini等人根据B淋巴细胞及T淋巴细胞数量的下降程度，将其分为轻度损伤、中度损伤以及重度损伤，其中重度损伤可致淋巴细胞彻底消失。这充分说明了PCV-2的感染可导致免疫机能下降，同时也为患猪由于PCV-2的感染并与其他病原体的并发感染而导致诸如PMWS一类疾病的发生提供了理论依据。研究发现，PCV-2的感染通常伴随猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、衣原体(Chlamydia spp.)、肺曲霉病(pulmonary aspergillosis)、隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)等共同感染而引起疾病的发生。其中PCV-2感染作为主要病因的疾病是猪断奶后多系统衰弱综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)，在PCV-2感染的同时通常伴随有PRRSV及PPV的感染，而且在实验室中PCV-2的单独感染也可造成PMWS的典型症状。 [0003] PCV-2是一类无包膜、十二面体、包含一个单股环状DNA基因组的、目前发现最小的病毒，直径17nm，与鸡贫血病毒(cAV)、鹦鹉喙羽病毒(PBFDAV)等共属于圆环病毒科，圆环病毒属。有证据表明PCV与来自植物的矮小病毒(Nano Virus)亲缘关系非常接近，推测PCV是植物病毒侵染脊椎 动物后发生重组与突变而发生的宿主迁移。PCV-2在pH3环境、氯仿处理及56-70℃内都有活性。PCV-1基因组全长1759nt、PCV-2基因组全长1768nt，PCV-1编码7个开放阅读框(ORF)，PCV-2有11个潜在开放阅读框(ORF)，编码2-36kD的蛋白质，但只有6个ORF得到证实。其中主要的ORF有三个，分别是ORF-1、ORF-2和ORF-3，ORF-1编码复制酶(rep)，ORF-2编码PCV-2的主要结构蛋白(cap)，同时也是主要免疫原性蛋白，ORF-3编码蛋白与PCV-2介导的细胞凋亡有直接关系。另外，基于cap蛋白核酸序列的生物信息学分析，可将PCV-2分为PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c三个亚型。有文献报道，在中国发生的PCV-2感染主要集中在PCV-2b亚型，但FangWang等人报道，在中国还存在PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e亚型的感染，而且PCV-2d、PCV-2e两个亚型是2009年FangWang等人首次在中国发现的。
[0004] 猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)是一种引起母猪繁殖障碍的，其主要特征是导致母猪发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡。Mary和Mahnel于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的，并认为是培养细胞内潜伏感染的病毒。随后相继从一些正常猪肾细胞培养物和感染猪瘟病毒的猪肾细胞中发现直径为22～23nm的病毒粒子，并认为与Kilham(1959)发现的大鼠细小病毒相似。通过核酸鉴定证明为DNA型。Cartwright等(1967)在对猪的不孕症和流产、死产的病原学研究中，从病料中分离出了猪细小病毒，从而首次证明了它的致病作用。通过血清学鉴定证实，所有上述分离毒株，包括从一些传代细胞系中分离的类似病毒均与PPV同属一型，尽管名称各异。从六十年代中期分离病毒和逐步明确其致病作用以来，已相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分到病毒或查出抗体。它在猪群中检出率甚高：如美国一些猪群的血清抗体阳性率达50％～80％，丹麦12％～42％，澳大利亚52％，英国19％～56％，德国54％。在日本，据估计约10％的猪流产是由本病毒引起的。我国已先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川和淅江等地分离到了PPV，血清学调查的阳性率为80％。PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为4个类型。第1类是以NADI-2株为代表，口服接种不能穿过胎盘屏障，不能形成病毒血症，可以用作弱毒疫苗来防制PPV感染；第2类是以NADL 8株为代表的强毒株，口服接种能够穿过胎盘屏障，造成胎儿 感染，形成病毒血症；第3类是以Kresse株为代表的皮炎型强毒株，有报道称其毒力比NADL-8株还要强；第4类为肠炎型毒株，其主要引起肠道的病变。虽然已经分离出了多株PPV，但是目前认为PPV只有一个血清型。
[0005] PPV病毒外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径20～23nm，二十面体等轴立体对称，衣壳由32个壳粒组成。PPV为细小病毒科细小病毒属的成员。与多数细小病毒一样，PPV对加热具有强大的抵抗力。据Cartwright等的试验资料(1967)，当56℃30分钟加热处理时，无论病毒的传染性还是凝集红细胞的能力，都无明显改变。在70℃经2小时加热处理后，其感染力虽有所下降，但并不丧失。但80℃经5分钟加热即可使其失去活性。病毒对酸有较强的抵抗性，在pH3～9间稳定。病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂有抵抗力。短时间的(如1小时)胰酶处理对病毒悬液感染性不仅没有影响，而且能提高其感染效价，这可能是由于胰酶使病毒粒子在悬液中进一步分散的缘故。组织培养的病毒悬液或保存在pH9甘油缓冲盐水中的病毒，在-20℃和-70℃下，经一年以上的保存，无论其感染效价和血凝性都不减弱。PPV基因组为单股负链DNA，大小约为5000bp，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组[9]。PPV基因组有两个主要的开放阅读框架，3端编码结构蛋白(VP)，5端编码非结构蛋白(NS)，即调节蛋白。基因组共编码3种结构蛋白和两种非结构蛋白，即VP1、VP2、VP3、NS1和NS2。整个编码区基因相互重叠，结构蛋白和非结构蛋白有各自独立的启动子区域，具有真核启动子的一般特征。结构蛋白和非结构蛋白的mRNAs共同终止于94～96bp。PPV基因组编码两条结构多肽，即VP1和VP2。另有一条结构多肽VP3由VP2水解而产生。结构多肽形成后，装配成病毒粒子。编码PPV结构多肽和非结构多肽的基因几乎贯穿整个DNA序列，这样，就使形成的病毒粒子能以极小的空问存在。VP1蛋白C端氨基酸与VP2的N端氨基酸序列相互重叠，其N端富含碱性残基。其中VP2蛋白既是主要的结构蛋白也是主要的免疫原蛋白，Soren等发现其N末端19个氨基酸是其中和表位，能够诱导机体产生有效的中和抗体。
[0006] 猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是导致母猪流产和小猪呼吸系统疾病的一种病毒，1991年在荷兰被分 离出来并命名为莱利斯塔德病毒(Lelystad Virus)，1992年在美国也分离出一株能造成相同症状的病毒，随后该病毒被正式命名为猪繁殖与呼吸综合症病毒，并确立了以Lelystad Virus(LV)为代表的欧洲株、和以ATCC VR2332株为代表的美洲株。在1995年末在中国大陆也出现了一种临床表现为体温升高、皮肤发红，并伴随高致病率和死亡率的疫情，当时被称作“猪高热病”。当1996年该病毒被分离出来后证实该疫情是由变异的美洲株PRRSV引起的，遂确定为猪繁殖与呼吸综合症，又称“蓝耳病”。在2006-2007年，在中国大陆爆发的大规模蓝耳病疫情，致病率与死亡率远高于以往疫情，这导致了当时中国猪肉价格的飞涨，并对生猪养殖产业造成严重打击。当该高致病性蓝耳病病毒被分离出来，并利用分子生物学方法研究后，发现造成这次疫情的PRRSV在Nsp2编码区缺少90个核苷酸，相应编码蛋白有30个氨基酸的却失，并且有证据表明这是在中国大陆发生突变的一类毒株，其30个氨基酸的缺失虽然与其高致病性没有关系，却是高致病性毒株的一个明显标志。同时在中国爆发的高致病性蓝耳病的另一个特征是多种病原体的共同感染与继发感染，有证据表明，在PRRSV感染的同时也发现了猪瘟、猪伪狂犬病、猪流感、猪细小病毒、猪链球菌的共同感染，以及继发的猪霍乱沙门氏菌、猪胸膜肺炎放线菌肺炎、副猪嗜血杆菌感染。其中最重要的一点是高致病性PRRSV与可以造成仔猪多系统综合症的猪2型圆环病毒(PCV-2)的双重感染，这些共同感染和继发感染造成了病猪的主要临床症状与疫情的大规模传播。
[0007] PRRSV是一类小型有包膜病毒，直径45nm-65nm。属于单股正链RNA病毒，基因组全长15Kb，除去5’端和3’端两个非转录区(5’UTR、3’UTR)，共有8个开放阅读框(ORF)。其中ORF1占基因组全长80％，分为ORF1a和ORF1b两个部分，共编码12个非结构蛋白(NSP)，包括RNA依赖的RNA聚合酶(反转录酶)以及其他未知蛋白。基因组余下的20％包含ORF2-ORF7六个开放阅读框，其中ORF2编码糖基化结构蛋白GP2、ORF3编码糖基化结构蛋白GP3、ORF4编码糖基化结构蛋白GP4、ORF5编码糖基化结构蛋白GP5、ORF6编码非糖基化结构蛋白M、ORF7编码核蛋白N。其中最主要的结构蛋白为GP5、M、N三种。其中N蛋白长15kD，至少有5个抗原 决定簇，其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇，具有一个糖基化位点，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys和His 3种碱性氨基酸组成，可能和RNA基因组间的相互作用有关。N蛋白之间形成同源二聚体，对病毒的组装至关重要。M蛋白约18kD，在PRRSV中非常保守，在病毒包膜表面三次跨膜，并且N末端的16个氨基酸残基暴露在膜外，虽然M蛋白的功能还没有完全研究清楚，但已有研究推测，M蛋白在PRRSV的组装和出芽时扮演重要角色。同时M蛋白能刺激T淋巴细胞的增生，诱导产生的抗体具有中和作用。GP5蛋白约25kD，是一个糖基化蛋白，含有4个糖基化位点，且非常不保守，三次跨膜，并有一个70个氨基酸残基的胞外区。有6个抗原决定簇，有证据表明GP5与PRRSV的抗体识别过程中起关键作用，是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性，同时GP5还可诱导细胞凋亡，是公认的PRRSV的主要保护性抗原。
[0008] 疫苗是防治病毒感染的有效手段，目前已经面世的针对PCV-2、PPV、PRRSV的疫苗主要包括灭活疫苗、重组病毒疫苗、亚单位疫苗。这些单价疫苗仅能诱导抵抗相应病毒的抗体，未能达到交叉保护的目的。由于一般情况下，引起猪患病的不仅仅是感染上述病毒的一种，而是由多种病毒或主或次的协同感染，最后诱发猪发病。比如猪断奶后多系统衰弱综合症(PMWS)，PCV-2是PMWS的主要病原。但研究发现PCV-2经常与其它病原协同作用。这些病原包括猪生殖-呼吸综合征病毒(PRRSV)、细小病毒、肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌、链球菌和巴氏杆菌等，使疾病复杂化，给养猪业造成了巨大的经济损失。因此克服目前活苗、灭活苗、以及基因工程疫苗的低安全性、低保护力等缺点，寻求研发一种安全、高效、非复制的病毒疫苗，在能较好地保护病毒攻击的同时，并能较好地避免共同感染和继发感染的发生，是安全、有效免疫防控PCV-2、PPV、PRRSV的重大科学课题。 [0009] 病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)是由病毒主要结构蛋白组成不含病毒核酸的病毒粒子空壳。由于VLP大小、结构及表面抗原和多肽表位与真正的病毒几乎没有区别，因此能被宿主抗原提呈细胞所识别，引起免疫应 答和效应，且无潜在的副作用。首先，与活苗及灭活苗相比，病毒样颗粒疫苗没有不安全因素；与亚单位疫苗相比，VLP是多个抗原蛋白组成，具有很强的免疫原性；与有良好口碑的病毒体(Virosome)相比，VLP既不是由活病毒制备而来，没有潜在的危险性、也不需要大量的繁殖病毒，没有安全性低、成本高以及制备周期长等不足；由此VLP疫苗被当今誉为病毒类疫苗发展的新里程碑。目前的乙肝VLP疫苗(Recombivax HB，Merck)、乳头瘤VLP疫苗(Gardisil，Merck)和流感VLP疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多个品种在临床研究中。另外VLP疫苗是由病毒蛋白自组装成天然结构，由于其特殊的三维结构可作为一个药物传递系统或抗原表位锚定位点，目前研究最多的是PPV VLP，其内部可以包埋一些小分子的核酸，表面可以锚定一些抗原表位。虽然目前对这些重组VLP形成的机制与效率问题还不明确，但已有证据表明病毒的结构蛋白可以独立包装成病毒空壳的同时，也能够将适宜的抗原表位富集在其表面。同时在本实验室的前期工作中以证明利用动物细胞表达的PCV-2的CAP蛋白，PRRSV结构蛋白GP5的表位，PPV结构蛋白VP2的表位可以组装VLP，并能诱导实验动物良好的免疫应答。
发明内容
[0010] 本发明属于生物制药领域，涉及一种猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)三联病毒样颗粒疫苗(Triple VLP疫苗)及其制备方法。 [0011] 本发明目的是通过如下方案实现的：
[0012] 本发明Triple VLP疫苗含有2型猪圆环病毒(PCV-2)主要结构蛋白CAP蛋白，猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2的表位，与B亚群猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)结构蛋白GP5的表位。
[0013] 本发明Triple VLP疫苗涉及以下核酸序列：①PCV-2 CAP蛋白的核酸序列；②PPV VP2蛋白的1-57核酸序列；③PRRSV GP5蛋白的88-156核酸序列；其中，所述CAP蛋白核酸序列包括来自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ、亚型的CAP蛋白核酸序列，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402、亚型的CAP蛋白核酸序列，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白核酸序列，以及来自PCV-2e的 GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白核酸序列；其中，所述PPV VP2蛋白的1-57核酸序列包括来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白的1-57核酸序列；其中所述PRRSVGP5蛋白88-156核酸序列包括来自PRRSV的CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的88-156核酸序列。
[0014] 本发明Triple VLP疫苗涉及以下氨基酸序列：①PCV-2CAP蛋白的氨基酸序列；②PPV VP2蛋白的1-19氨基酸序列；③PRRSV GP5蛋白的30-52氨基酸序列；其中，所述CAP蛋白氨基酸序列包括来自PCV-2a的PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ、亚型的CAP蛋白氨基酸序列，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402亚型的CAP蛋白氨基酸序列，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白氨基酸序列，以及来自PCV-2e的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白氨基酸序列；其中，所述PPV VP2蛋白的1-19氨基酸序列包括来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白1-19蛋白氨基酸序列；其中所述PRRSV GP5蛋白的30-52氨基酸序列包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的30-52氨基酸序列。 [0015] 本发明Triple VLP疫苗含有PCV-2的主要结构蛋白CAP蛋白，并携带有PPV VP2蛋白的表位肽，以及PRRSV GP5蛋白的表位肽。①其中所述CAP蛋白包括来自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2e的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白；其中，所述PPV VP2蛋白的表位肽包括来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白1-19表位肽；其中，所述PRRSV GP5蛋白的30-52表位肽包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的30-52表位肽。
[0016] 本发明Triple VLP疫苗包含一个携带有PCV-2主要结构蛋白CAP蛋白，PPV VP2蛋白抗原表位，PRRSV GP5蛋白抗原表位的重组真核表达载体、 鸡成纤维细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞；其中，所述真核表达载体选自：①pHWD2000；②pOPI3CAT；③pCAGGS；④pcDNA6/TR；⑤pCMV-HA；所述鸡成纤维细胞选自：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；所述哺乳动物细胞选自：①PK-15细胞；②VERO细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤；BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；所述昆虫细胞选自：
①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。
①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。
[0017] 其中，本发明pHWD2000载体是由pHW2000载体改造得到，包括去掉pHW2000载体上游的pCMV启动子，并用鸡β-actin蛋白启动子替换，同时在鸡β-actin蛋白启动子上游插入hCMV-IE增强子，改造后的pCWD2000可以在真核系统中高效表达外源基因，同时pCWD2000有着较小的分子量，可以携带较大的外源基因片段。
[0018] 其中，本发明Triple VLP疫苗可不含有佐剂，也可以含有如下佐剂中的一种或几种：①新型纳米铝佐剂；②氢氧化铝或磷酸铝；③水凝胶佐剂：季胺化的壳聚糖。④rLT(重组不耐热性肠毒素)等。
[0019] 本发明Triple VLP疫苗可制成多种临床适用的剂型，包含但不限于注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型。
[0020] 本发明Triple VLP疫苗的制备方法包括如下步骤：
[0021] 以构建重组pHWD2000真核表达载体为例：①构建pHWD2000真核表达载体；②含有编码PCV-2CAP蛋白核酸序列、PPV VP2蛋白表位核酸序列、PRRSV GP5蛋白表位核酸序列的重组真核表达载体；③提供一种用于表达的细胞系，将含有编码PCV-2CAP蛋白核酸序列、PPV VP2蛋白表位核酸序列、PRRSV GP5蛋白表位核酸序列的重组真核表达载体转化用于表达的细胞系，经转染后可以释放Triple VLP；④提供用于纯化Triple VLP的方法，方法包括蔗糖梯度离心纯化方法以及柱层析纯化方法。
[0022] 其中该方法所述Triple VLP可激发体液与细胞双重的免疫应答；其中，所述Triple VLP所包含CAP蛋白包括来自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2e的GX0602、JX0602、 HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白；其中，所述PPV VP2蛋白的表位肽包括来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白1-19表位肽；其中，所述PRRSV GP5蛋白的30-52表位肽包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的30-52表位肽。其中，本发明方法涉及一个Triple VLP表达宿主细胞系，其中，所指细胞为鸡成纤维细胞或哺乳动物细胞，鸡成纤维细胞有：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；哺乳动物细胞选自：①PK-15细胞；②VERO细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤；
BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；⑨Tn5细胞；⑩SF9 Cell细胞。 [0023] 其中，本发明制备Triple VLP细胞培养方法包括如下步骤：在细胞培养基中加入浓度为2-100μg/mL的糖胺聚糖，优选10μg/mL；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素，优选硫酸肝素或硫酸软骨素B。
BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；⑨Tn5细胞；⑩SF9 Cell细胞。 [0023] 其中，本发明制备Triple VLP细胞培养方法包括如下步骤：在细胞培养基中加入浓度为2-100μg/mL的糖胺聚糖，优选10μg/mL；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素，优选硫酸肝素或硫酸软骨素B。
[0024] 其中，本发明制备Triple VLP时的纯化方法包括如下步骤：①蔗糖梯度离心法，所述蔗糖梯度离心法选用最佳蔗糖浓度为1.37g/mL；②柱层析纯化方法，用Sepharose6FFTM分子筛并进行DEAE-SepharoseFFTM离子交换。
[0025] 其中，蔗糖梯度离心的步骤为：①收集规模化生产的Triple VLP细胞培养液，4℃ 5000rmp离心10min，去除细胞及杂质；②取上清液100000g 4℃离心2h，沉淀用HNE buffer悬浮，HNE buffer的组成为25mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA；③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNEbuffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL；0.45g/mL蔗糖3mL；1.37g/mL蔗糖1mL；4℃ 100000g离心2h；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰；
杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS；杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的Triple VLP原液为疫苗原液。
杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS；杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的Triple VLP原液为疫苗原液。
[0026] 本发明产品及方法中所述的百分含量均为质量体积百分含量。
[0027] 本发明涉及一种猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸 综合症病毒(PRRSV)三联病毒样颗粒疫苗(Triple VLP疫苗)。该VLP疫苗包含有PCV-2的主要结构蛋白也是主要表面抗原CAP蛋白、PPV的主要结构蛋白也是主要表面抗原VP2蛋白的表位肽，PRRSV主要结构蛋白也是主要表面抗原GP5蛋白的表位肽。该VLP疫苗可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答。经此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐剂后制备的注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型免疫接种不同动物群体后，可安全、有效预防PCV-2，PPV，PRRSV感染，为不同种群母猪、小猪、育肥猪安全、有效免疫防控PCV-2，PPV，PRRSV感染提供了理想疫苗。本发明进行了药效实验，分别通过注射、滴鼻、饮水等途径免疫小猪与怀孕母猪产生好的体液免疫与细胞免疫应答及天然免疫与获得性免疫应答以及黏膜免疫应答效果，没有发现免疫损伤或由疫苗接种而导致的发病迹象，具有安全性。本发明Triple VLP疫苗免疫无PCV-2，PPV，PRRSV免疫背景的小猪、母猪与育肥猪两次，进一步通过PCV-2，PPV，PRRSV疫苗用毒株以及我国不同地区临床分离的PCV-2，PPV，PRRSV野毒株攻毒，有95％以上的免疫保护效果。用本发明Triple VLP疫苗接种不同地区、种群的母猪、小猪，0，21天免疫两次，分别采用注射、滴鼻、饮水剂型疫苗免疫，均显示各地区、各种群母猪、小猪没有出现由疫苗接种引发的发病现象，具有安全性。并能产生好的双重免疫应答和免疫保护力，其保护率达90％以上。由此表明研发的Triple VLP疫苗在含有或不含有佐剂的情况下，对不同地区、种群的猪群都具有较好的免疫保护效果。
[0028] 下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0029] 实验例1：本发明Triple VLP疫苗检定实验
[0030] 本发明实施例8制备的Triple VLP疫苗注射剂、滴鼻剂、饮水剂型外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过3日龄乳鼠脑内接种，以及3日龄小猪颈部肌肉注射试验无发病现象；通过Lorry法测定蛋白含量均在剂量范围；通过电镜观察VLP直径约17nm，与天然病毒一致；ELISA测定DNA含量均在50EU以下；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在3200以上。
[0031] 实验例2：本发明Triple VLP疫苗对实验猪体内的免疫应答效果实验 [0032] 本发明实施例8制备的Triple VLP疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水疫苗剂型，并用PBS、铝盐、纳米铝、rLT、为对照组，分别按各自途径免疫3日龄小猪，以及后备母猪其免疫剂量按实施例8疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天采集各组小猪及母猪的外周血、分离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在6400以上，采用MTT法测定中和抗体效价在3200以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在160以上。结果显示，本发明Triple VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量好于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；制备的Triple VLP疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂型血清抗体效价高于滴鼻、饮水剂型，滴鼻、饮水剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型。
[0033] 实验例3：本发明Triple VLP疫苗对实验猪体内的免疫保护效果实验 [0034] 本发明实施例8制备的Triple VLP疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水剂型为实验组，并用PBS、铝盐、纳米铝、rLT、及PCV-2，PPV，PRRSV甲醛灭活病毒为对照组，分别按各自途径免疫3日龄小猪、后备母猪，其免疫剂量按实施例8疫苗低剂量5.0
组，免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天各试验组、对照组实验猪用10 TCID50临床分离PCV-2，PPV，PRRSV毒株分别颈部肌肉注射攻毒观察保护效果。结果显示，本发明Triple VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，而对照组PCV-2，PPV，PRRSV甲醛灭活病毒疫苗保护率达60％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的Triple VLP疫苗在小猪和母猪体内具有高效的免疫保护效果。
组，免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天各试验组、对照组实验猪用10 TCID50临床分离PCV-2，PPV，PRRSV毒株分别颈部肌肉注射攻毒观察保护效果。结果显示，本发明Triple VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，而对照组PCV-2，PPV，PRRSV甲醛灭活病毒疫苗保护率达60％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的Triple VLP疫苗在小猪和母猪体内具有高效的免疫保护效果。
[0035] 实验例4：本发明Triple VLP疫苗对怀孕母猪的免疫应答及免疫保护效果实验 [0036] 本发明实施例8制备的Triple VLP疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注 射、滴鼻、饮水剂型，并用PBS、铝盐、纳米铝、rLT和PCV-2，PPV，PRRSV甲醛灭活病毒疫苗为对照组，分别按各自途径免疫怀孕60天母猪，其免疫剂量按实施例8疫苗高剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天采集各组母猪的外周血、分离血清和免疫细胞。一部分母猪处死后采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在12800以上，采用MTT法测定中和抗体效价在6400以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在200以上。另一部分母猪继续饲养，当母猪分娩后观察没有早产、流产、弱仔情况。结果显示，本发明Triple VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量高于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；本发明Triple VLP疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于滴鼻、饮水剂型，滴鼻、饮水剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型。由此制备的Triple VLP疫苗在怀孕母猪体内具有好的免疫应答效果。
[0037] 上述Triple VLP疫苗通过各自方法免疫配种前母猪，配种后21天进行2次免疫，5.0
在怀孕80天各试验组、对照组怀孕母猪用10 TCID50临床分离PCV-2毒株分别颈部肌肉注射攻毒，待母猪自然生产后观察保护效果。结果显示，本发明Triple VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，而对照组PCV-2，PPV，PRRSV甲醛灭活病毒疫苗保护率达78％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的Triple VLP疫苗对怀孕母住具有高效的免疫保护效果。
在怀孕80天各试验组、对照组怀孕母猪用10 TCID50临床分离PCV-2毒株分别颈部肌肉注射攻毒，待母猪自然生产后观察保护效果。结果显示，本发明Triple VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，而对照组PCV-2，PPV，PRRSV甲醛灭活病毒疫苗保护率达78％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的Triple VLP疫苗对怀孕母住具有高效的免疫保护效果。
[0038] 实验例5：本发明Triple VLP疫苗的安全性实验
[0039] (1)无菌、支原体试验：将实施例8制备的Triple VLP疫苗接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25℃、35℃。结果显示，Triple VLP疫苗都未见细菌生长。将Triple VLP疫苗用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示Triple VLP疫苗 无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色。结果显示Triple VLP疫苗无支原体生长。 [0040] (2)溶血性试验：选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释Triple VLP疫苗(由实施例8制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明Triple VLP疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，Triple VLP疫苗无溶血反应。
[0041] (3)急性毒性试验：取实施例8制备的Triple VLP疫苗0.5ml腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明Triple VLP疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且
14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例8制备的Triple VLP疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，Triple VLP疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。 [0042] (4)过敏试验研究：取实施例8制备的Triple VLP疫苗皮下接种体重为250～
350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉分别给予相同Triple VLP疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，Triple VLP疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，Triple VLP疫苗在动物体内无过敏反应。
14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例8制备的Triple VLP疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，Triple VLP疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。 [0042] (4)过敏试验研究：取实施例8制备的Triple VLP疫苗皮下接种体重为250～
350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉分别给予相同Triple VLP疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，Triple VLP疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，Triple VLP疫苗在动物体内无过敏反应。
[0043] (5)兔热源质试验：取预检合格的体重为2～3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，各家兔 2次平均温度在38.6-39.5℃。将实施例8制备的Triple VLP疫苗预热至38℃，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉分别缓缓注入0.5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示：Triple VLP疫苗给予家兔个体升温均未超过0.2℃，3只家兔升温总和未超过0.4℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的Triple VLP疫苗无热源质。 [0044] (6)免疫病理损伤试验：由实施例8制备的Triple VLP疫苗通过小猪、母猪、种猪及育肥猪外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，Triple VLP疫苗免疫接种在实验乳猪、母猪、种猪及育肥猪体内Th2/Th1免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象，因此具有安全性。
[0045] 实验例6：本发明Triple VLP疫苗稳定性实验
[0046] 由实施例8制备的Triple VLP疫苗，分别置于2-8℃、室温(20-25℃)、37℃环境，分别放置1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、测pH值；无菌、电镜观察粒径；免疫动物观察安全性。结果显示：Triple VLP疫苗放置2-8℃下24个月内均无变色分层等现象，pH值在7.0-7.2之间无变化，电镜观察粒径大小保持一致，且注射或滴鼻给小鼠或实验猪表现正常；Triple VLP疫苗放置室温25℃下3个月内均有好的稳定性；Triple VLP疫苗放置室温37℃下1个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，Triple VLP疫苗放置2-8℃理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。 [0047] 下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
[0048] 实施例1：本发明Triple VLP三联疫苗的基因及蛋白构成
[0049] 以来自①PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2b的BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亚型的CAP蛋白，以及来自PCV-2e的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亚型的CAP蛋白的核酸与蛋白序列。②来自PPV的NADL-2、Kresse、POVG、Challenge、VRI-1亚型VP2蛋白1-57核酸序列与1-19位氨基酸序列。③来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、Em2007、JXA1亚型GP5蛋白的88-156核酸序列与30-52氨基酸序列见表所示。 [0050] 实施例2.本发明Triple VLP疫苗的表达载体构建
[0051] 以构建重组pHWD2000表达载体为例：利用PCR的方法扩增PCV-2 CAP蛋白基因片段、PPV VP2蛋白表位肽基因片段、PRRSV GP5蛋白表位基因片段插入到pHWD2000载体中，构成重组pHWD2000-CA-epitope(VP2)-epitope(GP5)表达载体，并包含BsmB I酶切位点。 [0052] 实施例3.细胞培养及细胞批库建立
[0053] 以UMNSAH/DF-1细胞培养并建库为例：UMNSAH/DF-1细胞来源于American Type Culture Collection(ATCC)。培养基采用Dulbecco′s modified Eagle medium(DMEM)，添加青霉素及链霉素，不加或加入一定量胎牛血清(10-2％)在细胞工厂或细胞发酵罐进行培养，建立细胞工作种子批库，并对传代后的外源因子、致瘤性及稳定性等全面检定，细胞使用代数控制在60代以内，均符合疫苗生产介质的要求。
[0054] 所述细胞培养及细胞批库建立包括但不限于：①UMNSAH/DF-1细胞；②PK-15细胞；③VERO细胞；④COS细胞；⑤人二倍体细胞；⑥BHK细胞；⑦CHO细胞；⑧MDCK细胞；⑨Hep-G2细胞。
[0055] 实施例4.质粒转染及稳定高表达细胞系筛选与建库
[0056] Triple VLP疫苗：选用实施例3细胞库中UMNSAH/DF-1细胞，采用脂质体法将实施例2构建的表达质粒转染UMNSAH/DF-1细胞，并筛选稳定高表达Triple VLP的细胞系，具体是：①在35mm孔中，加入pHWD2000-CA-epitope(VP2)-epitope(GP5)1.5μg；②加入5μL OptiMEM配置的脂质体，室温孵育45min。然后加入到被OptiMEM润洗过的宿主细胞中，孵育5h；③离心去除载体-脂质体混合物，并向细胞中加入DMEM进行培养；④pHWD2000-CA-epitope(VP2)-epitope(GP5)重组载体在细胞系中表达，可自组装Triple VLP；⑤通过加压筛选表达Triple VLP的UMNSAH/DF-1细胞株。结果显示，在UMNSAH/DF-1细胞10代内筛选到稳定高表达Triple VLP的细胞株，经细胞系稳定表达与产量、VLP大小与结构、外源因子与致瘤性、染色体完整性等传代至40代没有表型改变。由此，建立了稳定高表达Triple VLP的UMNSAH/DF-1细胞系。进一步建立具有Triple VLP的三级细胞种 子批库，经对全面检定符合疫苗生产要求，放置液氮中保存备用。
[0057] 所述稳定高表Triple VLP的细胞系包括但不限于：①UMNSAH/DF-1细胞；②PK-15细胞；③VERO细胞；④COS细胞；⑤人二倍体细胞；⑥BHK细胞；⑦CHO细胞；
⑧MDCK细胞；⑨Hep-G2细胞。
⑧MDCK细胞；⑨Hep-G2细胞。
[0058] 实施例5.Triple VLP规模化生产
[0059] 以UMNSAH/DF-1细胞培养并规模化生产Triple VLP为例：取稳定表达Triple VLP的UMNSAH/DF-1工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入10-2％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体30L细胞发酵罐放大培养生产使得细胞密度达到1×107-8以上时，收集细胞培养Triple VLP疫苗原液。
[0060] 所述可规模化生产的Triple VLP细胞系包括但不限于：①UMNSAH/DF-1细胞；②PK-15细胞；③VERO细胞；④COS细胞；⑤人二倍体细胞；⑥BHK细胞；⑦CHO细胞；
⑧MDCK细胞；⑨Hep-G2细胞。
⑧MDCK细胞；⑨Hep-G2细胞。
[0061] 实施例6.Triple VLP疫苗的纯化
[0062] ①收集规模化生产的Triple VLP细胞培养液，4℃ 5000rmp离心10min，去除细胞及杂质；②取上清液100000g 4℃离心2h，沉淀用少量HNE buffer(25mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA)悬浮。③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL；0.45g/mL蔗糖3mL；1.37g/mL蔗糖1mL；4℃ 100000g离心2h；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰。杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS。杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的VLP原液为疫苗原液。
[0063] 实施例7.Triple VLP疫苗原液的检定
[0064] Triple VLP原液的外观为澄清液体；pH值为7.0-7.2；通过血平板进行杂菌鉴定结果为阴性；通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性；通过PAGE-SDS电泳检测结果显示目的条带清晰、无其他杂带；采用Reed&Muench法计算抗血清中和效价均高于1∶2800。
[0065] 实施例8.Triple VLP疫苗剂型配制
[0066] ①注射剂型配制：将纯化Triple VLP不加佐剂，配制10μg/0.5ml的低剂量、20μg/1.0ml高剂量的无佐剂Triple VLP注射剂型；将纯化Triple VLP蛋白加入氢氧化铝或磷酸铝配置7.5μg(蛋白)/0.5mg(铝盐)/0.5ml低剂量、15μg(蛋白)/1.0mg(铝盐)/0.5ml高剂量的有佐剂Triple VLP疫苗注射剂型；将纯化Triple VLP蛋白加入纳米铝佐剂，分别配制5.0μg/0.5ml低剂量、10μg/1.0ml高剂量的有佐剂Triple VLP注射剂型。以上注射疫苗溶液装入吸顶瓶，放2-8℃备用。
[0067] ②喷鼻剂型配制：将纯化Triple VLP不加佐剂吸附，配制7.5μg/0.2ml低剂量、15μg/0.2ml高剂量的无佐剂Triple VLP喷鼻剂型；将纯化的Triple VLP加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶黏膜佐剂与传递系统，配制5.0μg/0.2ml低剂量、10μg/0.2ml高剂量
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