一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因及其制备方法
专利汇可以提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种 猪繁殖与呼吸综合症 病毒重组ORF5基因及其制备方法，重组ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，本发明利用DNA shuffling技术，对不同遗传分支的PRRSV ORF5基因进行重组，获得重组的ORF5基因，再将重组ORF5基因连接原核表达载体进行原核蛋白表达，重组后的ORF5基因表达蛋白对大部分甚至所有亲本PRRSV均有免疫反应的中和 抗体 。，下面是一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因，其特征在于，所述重组ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据PRRSV标准序列，设计两对特异性引物ORF5和△ORF5，分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的ORF5基因，扩增ORF5基因的引物序列为：P1：CACTTCATGACACCTGAGAC， P2：AAGGCATATATCATTATTGGCGT；扩增△ORF5的引物序列为：P3：ATAGGATCCGGGAACAGCAGCTC，P4：ATGCTCGAGAGGGGTAGCCGCGG；
2）ORF5引物用于扩增所选取处于不同进化分支上的8株PRRSV ORF5目的基因，8株PRRSV毒株氨基酸序列分别为FJ01 FJ08；
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3）DNA Shuffling
3.1）以选取的各组ORF5基因质粒为模板进行常规PCR扩增，1 %凝胶电泳分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带片段的PCR产物；
3.2）将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化；
3.3）凝胶电泳分析酶切产物，在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带，切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.4）无引物扩增片段化基因：混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增，凝胶电泳分析PCR产物，在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.5）有引物扩增：以无引物扩增片段的回收产物为模板，用特异性引物△ORF5进行PCR扩增，配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
4)、重组ORF5基因的筛选
将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化，涂布到LB平板上，置于37 ℃恒温箱中培养过夜，在1.5 mL EP管中加入1 ml LB培养基，挑取单菌落于管中37℃过夜培养，对重组菌液进行PCR鉴定，并通过测序筛选出几个重组ORF5基因片段进行原核表达；
5）、重组ORF5基因的连接转化鉴定
将筛选后的重组DNA用T4 DNA连接酶与PET-32a载体连接，全量的连接产物转化至BL21感受态细胞中，后将其涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，置于恒温箱中培养过夜，第二天挑取单菌落，在 EP管中加入含氨苄青霉素的LB培养基，每个EP管中挑取一个单菌落，震荡培养；培养后用质粒小提试剂盒对培养的菌液进行质粒抽提，用BamHⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶对抽提的质粒双酶切鉴定，重组质粒核苷酸序列SEQ ID NO 1。
一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
2）ORF5引物用于扩增所选取处于不同进化分支上的8株PRRSV ORF5目的基因，8株PRRSV毒株氨基酸序列分别为FJ01 FJ08；
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3）DNA Shuffling
3.1）以选取的各组ORF5基因质粒为模板进行常规PCR扩增，1 %凝胶电泳分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带片段的PCR产物；
3.2）将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化；
3.3）凝胶电泳分析酶切产物，在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带，切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.4）无引物扩增片段化基因：混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增，凝胶电泳分析PCR产物，在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
3.5）有引物扩增：以无引物扩增片段的回收产物为模板，用特异性引物△ORF5进行PCR扩增，配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒进行回收；
4)、重组ORF5基因的筛选
将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化，涂布到LB平板上，置于37 ℃恒温箱中培养过夜，在1.5 mL EP管中加入1 ml LB培养基，挑取单菌落于管中37℃过夜培养，对重组菌液进行PCR鉴定，并通过测序筛选出几个重组ORF5基因片段进行原核表达；
5）、重组ORF5基因的连接转化鉴定
将筛选后的重组DNA用T4 DNA连接酶与PET-32a载体连接，全量的连接产物转化至BL21感受态细胞中，后将其涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，置于恒温箱中培养过夜，第二天挑取单菌落，在 EP管中加入含氨苄青霉素的LB培养基，每个EP管中挑取一个单菌落，震荡培养；培养后用质粒小提试剂盒对培养的菌液进行质粒抽提，用BamHⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶对抽提的质粒双酶切鉴定，重组质粒核苷酸序列SEQ ID NO 1。
图3：有引物PCR扩增产物；
图4：重组质料的双酶切鉴定结果；
图5：重蛋白SDS-PAGE分析结果。
具体实施方式
1、PCR引物
根据Gene Bank登陆的PRRSV标准序列，设计两对特异性引物ORF5和△ORF5，分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的ORF5基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增ORF5基因的引物序列：P1：CACTTCATGACACCTGAGAC， P2：
AAGGCATATATCATTATTGGCGT；扩增△ORF5的引物序列：P3：ATAGGATCCGGGAACAGCAGCTC，P4：
ATGCTCGAGAGGGGTAGCCGCGG。
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（2）将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化成大小约为50-150 bp左右的片段;
（3）凝胶电泳分析酶切产物：配置2 %琼脂糖凝胶，加入5 μL 10×Loading Buffer混匀后加入样孔中，电泳20 40min，在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带。切割目的~
条带，用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
（4）无引物扩增片段化基因：混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增。凝胶电泳分析PCR产物，在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带。用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
（5）有引物扩增：以无引物扩增片段的回收产物为模板，用特异性引物△ORF5进行PCR扩增。配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒进行回收。
Aacagcagctcaaatttacagttgatttataacttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaattttgactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgttttgactcacaatgtttcctatggggcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctggctactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggtatgtcttgagtagcatttacgcagtctgtgccctggctgcgttggcttgcttcgccattaggttggtgaaaaattgtatatcctggcgctactcatgcactagatacactaattttcttctggatactaagggcaaactctaccgttggcggtcacccgtcatcatagagaaggggggtaaggttgacgttgagggtcatttaattgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggctacccct。
100 μL上样缓冲液，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白的表达情况。
的96孔细胞培养板，每孔100 μL，每个梯度做4个重复，37 °C吸附1 h，弃去病毒液，每孔加入100 μL维持液，置于37 °C 、5% CO2继续培养4~6 d，每日观察细胞病变。根据Reed-Muench方法计算待测血清的中和效价。以 1：6 的血清滴度能中和100 TCID 50 的 PRRSV 为阳性。
不同遗传分支PRRSV ORF5基因经PCR扩增后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，结果显示扩增后片段与目的片段大小一致，约为750 bp。图1：M: Marker DL2000；1：阴性对照；2-
6：ORF5目的基因。
50-150 bp左右的片段，琼脂糖凝胶凝胶电泳（图2的M: Marker DL2000；1-3：DNase Ⅰ酶切产物）；将所有纯化回收后的所有小片段DNA混合作为模板，进行无引物PCR，以无引物PCR产物为模板进行一次有引物PCR，获得大小500 bp左右的重组ORF5基因片段（图3：M: Marker DL2000；1-6：有引物 PCR产物；7：阴性对照）。
PRRSV（FJ01 FJ08）的中和抗体（≥8），表明重组蛋白对亲本毒株具有一定的抗病毒活性。
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