猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量测定方法
阅读：1023发布：2020-05-30
专利汇可以提供猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时 荧光 鉴别 及定量测定方法，通过处理待检样品，制取样品的RNA，反转录得到样品的cDNA、分别设计引物对样品cDNA进行PCR反应，扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的非缺失变异株与缺失变异株、将PCR扩增体系放入到荧光PCR检测仪中，设置循环条件，在每次循环的延伸时收集荧光 信号 ，循环结束后根据收集的扩增曲线和Ct值判断结果等步骤实现所述病毒鉴别及定量测定。本发明确定了 猪繁殖与呼吸综合症 病毒缺失变异株与非缺失变异株的荧光定量 鉴别诊断 方法并能准确定量病毒在 机体 组织内的感染量。本发明操作简单，检测结果准确。，下面是猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量测定方法专利的具体信息内容。
1、一种猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量测 定方法，包括以下步骤：
(1)处理待检样品，制取样品的RNA，反转录得到样品的cDNA；
(2)分别设计引物对样品cDNA进行PCR反应，扩增猪繁殖与 呼吸综合征病毒的非缺失变异株与缺失变异株；
(3)将PCR扩增体系放入到荧光PCR检测仪中，设置循环条 件，在每次循环的延伸时收集荧光信号，循环结束后根据收集的扩增 曲线和Ct值判断结果。
2、根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧 光鉴别及定量测定方法，其特征在于步骤(1)所述待检样品为组织 样品、棉拭子、猪排泄物或细胞培养物。
3、根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧 光鉴别及定量测定方法，其特征在于步骤(2)所述对待检测样品 cDNA进行荧光定量PCR扩增的引物为：
P1：5-GTTCCTGCACCGCGTAGAA-3；
P2：5-TGATGACACAGGTGCAGGGT-3；
P3：5-AGCCGATGACACCTCTGA-3；
P4：5-GGATICGCTTCTICCACC-3。
4、根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧 光鉴别及定量测定方法，其特征在于步骤(3)所述循环条件为：95 ℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 40s；共40个循环。
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病 毒变异株实时荧光鉴别及定量测定方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征又称猪蓝耳病，是由动脉炎病毒科中的猪繁 殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，由国外传入我国，是一种严 重影响养猪业的传染病，以繁殖障碍、呼吸困难、耳朵蓝紫、并发其 他传染病为主要特征，猪蓝耳病常继发猪瘟、附红细胞体等病，如果 治疗不及时，猪只死亡率较高，加之目前尚无特效治疗药物，因此， 做好猪繁殖与呼吸综合征的预防十分必要，而猪繁殖与呼吸综合征病 毒变异株的实时鉴别及测定对猪繁殖与呼吸综合征的预防和治疗十 分重要。
目前对猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的研究主要集中于诊断监 测，例如公开号为CN101063173的专利申请公开了一种猪繁殖与呼吸 综合征病毒超强变异株RT-PCR试剂盒，对猪繁殖与呼吸综合征病毒 超强变异株进行诊断监测，但未见猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实 时荧光鉴别及定量测定方法的相关技术报道。
目前对猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的研究主要集中于诊断监 测，例如公开号为CN101063173的专利申请公开了一种猪繁殖与呼吸 综合征病毒超强变异株RT-PCR试剂盒，对猪繁殖与呼吸综合征病毒 超强变异株进行诊断监测，但未见猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实 时荧光鉴别及定量测定方法的相关技术报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种猪繁殖与呼吸综 合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量测定方法。
本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：
提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量 测定方法，包括以下步骤：
(1)处理待检样品，制取样品的RNA，反转录得到样品的cDNA；
(2)分别设计引物对样品cDNA进行PCR反应，扩增猪繁殖与 呼吸综合征病毒的非缺失变异株与缺失变异株；
(3)将PCR扩增体系放入到荧光PCR检测仪中，设置循环条 件，在每次循环的延伸时收集荧光信号，循环结束后根据收集的扩增 曲线和Ct值判断结果。
步骤(1)所述待检样品为组织样品、棉拭子、猪排泄物或细胞 培养物。
步骤(2)所述对待检测样品cDNA进行PCR扩增的引物为
P1：5-GTTCCTGCACCGCGTAGAA-3；
P2：5-TGATGACACAGGTGCAGGGT-3；
P3：5-AGCCGATGACACCTCTGA-3；
P4：5-GGATTCGCTTCTTCCACC-3。
步骤(3)所述循环条件为：95℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 15s， 72℃ 40s；共40个循环。
步骤(3)所述判断结果包括实时荧光鉴别和定量测定：
荧光PCR扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光 信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产 物量的对数值与起始模板量之间存在明显线性关系，选择在这个阶段 进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术 中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧 光扩增曲线上任意设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶 段任意位置上，在本实验中荧光阈值是通过ABI 7500 system SDS software(Sequence Detection Software--Version 1.2.2)软件自动优化 选择的。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值 与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标 代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因此只要获得未知样品 的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
本发明所述实时荧光鉴别是根据一份样品分别以P1、P2和P3、 P4为引物扩增后均无Ct值或无扩增曲线为阴性，表示样品中无猪繁 殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；以P1、P2和P3、P4为引物扩增后， 均出现典型的扩增曲线，且Ct值小于等于30，表示样品中有猪繁殖 与呼吸综合征病毒(PRRSV)且为非缺失变异株；一份样品分别以P1、 P2和P3、P4为引物扩增后，但仅P1、P2为引物时，出现典型的扩增 曲线，且Ct值小于等于30，表示样品中有PRRSV且为缺失变异株； 一份样品分别以P1、P2和P3、P4为引物扩增后，Ct值大于30，或 仅P3、P4为引物时，出现典型的扩增曲线，结果无效，从做后Ct值 仍大于30，或仅P3、P4为引物时，出现典型的扩增曲线，结果为阴 性，否则判为阳性。
本发明所述定量测定是当判定样品为为非缺失变异株PRRSV 时，计算其Ct值带入非缺失变异株检测回归方程如：Y非缺失变异 株＝-3.16 X+37.67，其中-3.16为斜率，37.67为截距，y为Ct 值，X为样品的拷贝数，计算其感染量。
当判定样品为为缺失变异株PRRSV时，计算其Ct值带入缺失变 异株检测回归方程如：Y缺失变异株＝-3.15 X+38.19，其中-3.15 为斜率，38.19为截距，y为Ct值，X为样品的拷贝数，计算其感染 量。
同时Ct值大于30的样品重做，重做无数值者为阴性，否则为阳 性。仅以P3、P4为引物时，出现典型的扩增曲线的样品重做，重做 后以P1、P2、P3、P4为引物出现扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
上述检测回归方程通过绘制标准曲线可以求得。以含有目的片段 的样品pMD18-CHR、pMD18-NJ作为标准品，将其10倍系列稀释成1.0 ×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、 1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μL，作为模板进行AQ-PCR， 生成PRRSV非缺失变异株与缺失变异株检测的标准曲线。例如：
CtpMD18-CHR＝-3.16log(DNAConcentrate)+37.67
CtpMD18-NJ＝-3.15log(DNA Concentrate)+38.19
仪器上读取回归方程的斜率及截距，建立非缺失变异株与缺失变 异株检测回归方程。
例如：Y非缺失变异株＝-3.16X+37.67，其中-3.16为斜率，37.67 为截距，Y为Ct值，X为样品的拷贝数；
Y缺失变异株＝-3.15X+38.19，其中-3.15为斜率，38.19 为截距，Y为Ct值，X为样品的拷贝数。
本发明的有益效果是：确定了国内猪(美洲型PRRSV)繁殖与呼 吸综合症病毒缺失变异株与非缺失变异株的荧光定量鉴别诊断方法 并能准确定量病毒在机体组织内的感染量。本发明操作简单，检测结 果准确。
本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：
提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光鉴别及定量 测定方法，包括以下步骤：
(1)处理待检样品，制取样品的RNA，反转录得到样品的cDNA；
(2)分别设计引物对样品cDNA进行PCR反应，扩增猪繁殖与 呼吸综合征病毒的非缺失变异株与缺失变异株；
(3)将PCR扩增体系放入到荧光PCR检测仪中，设置循环条 件，在每次循环的延伸时收集荧光信号，循环结束后根据收集的扩增 曲线和Ct值判断结果。
步骤(1)所述待检样品为组织样品、棉拭子、猪排泄物或细胞 培养物。
步骤(2)所述对待检测样品cDNA进行PCR扩增的引物为
P1：5-GTTCCTGCACCGCGTAGAA-3；
P2：5-TGATGACACAGGTGCAGGGT-3；
P3：5-AGCCGATGACACCTCTGA-3；
P4：5-GGATTCGCTTCTTCCACC-3。
步骤(3)所述循环条件为：95℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 15s， 72℃ 40s；共40个循环。
步骤(3)所述判断结果包括实时荧光鉴别和定量测定：
荧光PCR扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光 信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产 物量的对数值与起始模板量之间存在明显线性关系，选择在这个阶段 进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术 中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧 光扩增曲线上任意设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶 段任意位置上，在本实验中荧光阈值是通过ABI 7500 system SDS software(Sequence Detection Software--Version 1.2.2)软件自动优化 选择的。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值 与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标 代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因此只要获得未知样品 的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
本发明所述实时荧光鉴别是根据一份样品分别以P1、P2和P3、 P4为引物扩增后均无Ct值或无扩增曲线为阴性，表示样品中无猪繁 殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；以P1、P2和P3、P4为引物扩增后， 均出现典型的扩增曲线，且Ct值小于等于30，表示样品中有猪繁殖 与呼吸综合征病毒(PRRSV)且为非缺失变异株；一份样品分别以P1、 P2和P3、P4为引物扩增后，但仅P1、P2为引物时，出现典型的扩增 曲线，且Ct值小于等于30，表示样品中有PRRSV且为缺失变异株； 一份样品分别以P1、P2和P3、P4为引物扩增后，Ct值大于30，或 仅P3、P4为引物时，出现典型的扩增曲线，结果无效，从做后Ct值 仍大于30，或仅P3、P4为引物时，出现典型的扩增曲线，结果为阴 性，否则判为阳性。
本发明所述定量测定是当判定样品为为非缺失变异株PRRSV 时，计算其Ct值带入非缺失变异株检测回归方程如：Y非缺失变异 株＝-3.16 X+37.67，其中-3.16为斜率，37.67为截距，y为Ct 值，X为样品的拷贝数，计算其感染量。
当判定样品为为缺失变异株PRRSV时，计算其Ct值带入缺失变 异株检测回归方程如：Y缺失变异株＝-3.15 X+38.19，其中-3.15 为斜率，38.19为截距，y为Ct值，X为样品的拷贝数，计算其感染 量。
同时Ct值大于30的样品重做，重做无数值者为阴性，否则为阳 性。仅以P3、P4为引物时，出现典型的扩增曲线的样品重做，重做 后以P1、P2、P3、P4为引物出现扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
上述检测回归方程通过绘制标准曲线可以求得。以含有目的片段 的样品pMD18-CHR、pMD18-NJ作为标准品，将其10倍系列稀释成1.0 ×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、 1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μL，作为模板进行AQ-PCR， 生成PRRSV非缺失变异株与缺失变异株检测的标准曲线。例如：
CtpMD18-CHR＝-3.16log(DNAConcentrate)+37.67
CtpMD18-NJ＝-3.15log(DNA Concentrate)+38.19
仪器上读取回归方程的斜率及截距，建立非缺失变异株与缺失变 异株检测回归方程。
例如：Y非缺失变异株＝-3.16X+37.67，其中-3.16为斜率，37.67 为截距，Y为Ct值，X为样品的拷贝数；
Y缺失变异株＝-3.15X+38.19，其中-3.15为斜率，38.19 为截距，Y为Ct值，X为样品的拷贝数。
本发明的有益效果是：确定了国内猪(美洲型PRRSV)繁殖与呼 吸综合症病毒缺失变异株与非缺失变异株的荧光定量鉴别诊断方法 并能准确定量病毒在机体组织内的感染量。本发明操作简单，检测结 果准确。
具体实施方式
下面结合具体实施里来进一步详细说明本发明。
实施例1
(1)处理待检样品，制取样品的RNA，反转录得到样品的cDNA；
1、准备待检样品，例如猪的肺脏或肾脏等组织样品、棉拭子、猪 排泄物或细胞培养物，保证新鲜待用或者置于低温冰箱(-70℃)保 存。
2、材料准备
A待检样品的处理：
组织样品的处理
往1～3g组织样品中加适量灭菌的0.9％生理盐水研磨成10倍悬 浮液，反复冻融2～3次后，4000g离心10min，取上清液作核酸抽 提用。
棉拭子的处理
将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，0.5mL样品液经4000g离 心10min，取上清液作核酸抽提用。
细胞培养物的处理
取1.5mL细胞培养物反复冻融2～3次后，4000g离心10min， 取上清液作核酸抽提用。
阴性对照：健康猪组织样品，处理方法同上。
B其他实验材料：
标准阳性样品样品：pMD18-CH、pMD18-NJ。
RNA分离试剂盒，华美生物工程公司的RNA分离试剂盒(III) (目录号MK0043)，或Invitrogen公司的Trizol LS Reagent(目录 号10296010)
灭菌1.5mL离心管
RNase-Free水
纯氯仿(分析纯以上级)
RNase-Free水配制的75％乙醇
反转录酶Reverse transcriptase XL(AMV)[目录号D2620]、核 糖核酸酶抑制剂(RNasin)[目录号D2310A]、dNTP Mixture[目录 号D4030A]均来自宝生物(大连)有限公司。
1.5mL灭菌EP管。
3、操作方法 以华美生物工程公司的RNA分离试剂盒(III) 为例
制取样品的RNA：取200μL A项所述的上清液或病毒液置于 一灭菌的1.5mL离心管中，同时设立阴性对照或阴性细胞培养液和 阳性病毒液为对照，再分别加入750μL冰冷的裂解液，剧烈混合样 品15s，室温放置5min；加入200μL纯氯仿，颠倒离心管混合2次， 剧烈混合15s，4℃ 10000g离心15min；吸取500μL上层水相于 新1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，4℃静置10min，4℃ 10000g离心15min；小心弃去全部上清液，加入1mL RNase-Free 水配制的75％乙醇，上下轻缓颠倒两次，4℃ 7500g离心7min；弃 去全部上清液，自然风干5～10min，当管壁肉眼看不到小液滴时即 可，离心管底部即为所获RNA。
反转录(RT)得到样品的cDNA：
反转录引物是由随机引物和oligo(T)按3:1比例混合制备。
在一个洁净的1.5mL灭菌EP管中依次加入RNase-Free水9.5 μL，5×AMV buffer 4μL，dNTP Mixture 4μL，反转录引物(CU) 1μL(20pmol)，核糖核酸酶抑制剂RNasin 0.5μL(10U)，反转录 酶AMV 1μL(2.5U)，轻缓混匀得反转录混合液；将所述反转录混 合液重悬上述制备得到的RNA，置于室温10min；放入42℃水浴 1h，取出冰浴2min，所得的反应液即为反转录产物cDNA。然后将 cDNA置于-20℃保存或直接用于下一步试验。
(2)分别设计引物对样品cDNA进行荧光定量聚合酶链反应或 聚合酶链反应(PCR)反应，扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的非缺失 变异株与缺失变异株；
1、材料准备
荧光定量PCR仪
Green I Realtime PCR Master Mix、EX-Taq酶[目录号 DRR001A]来自宝生物(大连)有限公司；
dNTP Mixture(目录号D4030A)，100bp DNA分子量标准(目 录号D505A)来自宝生物(大连)有限公司；
2、PCR扩增引物
荧光定量RT-PCR引物分别为20pmol/μL：
P1：5-GTTCCTGCACCGCGTAGAA-3
P2：5-TGATGACACAGGTGCAGGGT-3
扩增PRRSV的非缺失变异株与缺失变异株，预计扩增非缺失变 异株片段约为213bp，扩增缺失变异株片段约为126bp；
P3：5-AGCCGATGACACCTCTGA-3
P4：5-GGATTCGCTTCTTCCACC-3
仅扩增PRRSV的非缺失变异株，预计扩增片段约为256bp。
在反应混合配制区进行扩增试剂准备：从试剂盒中取出相应的荧 光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所 需要荧光PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阴性样品与标准阳 性样品，其中标准阳性样品包括以下几个稀释度：1.0×108、1.0 ×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、 1.0×101、1.0×100拷贝/μL，分别作为模板进行荧光定量RT-PCR 反应)，每个样品分别以P1、P2和P3、P4为引物进行反应，测试反 应体系配制表如下：
实时定量PCR反应体系
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加到与体系体积 相适配的荧光PCR管中，充分混匀，向每管中分装23μL反应混合物 液体(cDNA模板除外)，转移至样品处理区准备加样；
加样在样本处理区进行，在各设定的荧光PCR管中放入制备的 cDNA溶液各2μL，盖紧管盖，500r/m离心30s。
(3)将PCR扩增体系放入到荧光PCR检测仪中，设置循环条 件，在每次循环的延伸时收集荧光信号，循环结束后根据收集的荧光 曲线和Ct值判断结果。
步骤(3)在检测区进行。将步骤(2)离心后的荧光PCR管放入 到荧光PCR检测仪中，记录样品摆放顺序。
循环条件设置：95℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 40s； 共40个循环。在每次循环的延伸时收集荧光信号。试验检测结束后， 根据收集的荧光曲线和Ct值判断结果。直接读取检测结果。阈值设 定原则根据仪器躁声情况进行调整，以阈值线落在样品的指数增长区 且刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
结果判定方法：
阴性样品无Ct值或无扩增曲线。阳性对照的Ct值应小于30，并 出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
标准曲线的生成
以含有目的片段的样品pMD18-CHR、pMD18-NJ作为标准品，将其 10倍系列稀释成1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0 ×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μL， 作为模板进行AQ-PCR，生成PRRSV非缺失变异株与缺失变异株检测 的标准曲线。例如：CtpMD18-CHR＝-3.16log(DNA Concentrate)+37.67、 CtpMD18-NJ＝-3.15log(DNA Concentrate)+38.19。
回归方程的建立
仪器上读取回归方程的斜率及截距，建立非缺失变异株与缺失变 异株检测回归方程。例如：Y非缺失变异株＝-3.16X+37.67，其中-3.16 为斜率，37.67为截距，Y为Ct值，X为样品的拷贝数；Y缺失变异株 ＝-3.15X+38.19，其中-3.15为斜率，38.19为截距，Y为Ct值，X为 样品的拷贝数。
阴性：以P1P2和P3P4为引物均无Ct值或无扩增曲线，表示样品 中无PRRSV。
阳性：分别以P1、P2和P3、P4为引物，均出现典型的扩增曲线， 且Ct值小于等于30，表示样品中有PRRSV且为非缺失变异株。仅以 P1P2为引物时，出现典型的扩增曲线，且Ct值小于等于30，表示样 品中有PRRSV且为缺失变异株。
感染量的计算
当判定样品为为非缺失变异株PRRSV时，计算其Ct值带入非缺 失变异株检测回归方程如：Y非缺失变异株＝-3.16X+37.67，其中 -3.16为斜率，37.67为截距，y为Ct值，X为样品的拷贝数，计算 其感染量。
当判定样品为为缺失变异株PRRSV时，计算其Ct值带入缺失变异 株检测回归方程如：Y缺失变异株＝-3.15X+38.19，其中-3.15为斜 率，38.19为截距，y为Ct值，X为样品的拷贝数，计算其感染量.
有效原则：Ct值大于30的样品建议重做，重做无数值者为阴性， 否则为阳性。仅以P3P4为引物时，出现典型的扩增曲线的样品建议 从做，重做后P1P2、P3P4为引物出现扩增曲线者为阳性，否则判为 阴性。
实施例1
(1)处理待检样品，制取样品的RNA，反转录得到样品的cDNA；
1、准备待检样品，例如猪的肺脏或肾脏等组织样品、棉拭子、猪 排泄物或细胞培养物，保证新鲜待用或者置于低温冰箱(-70℃)保 存。
2、材料准备
A待检样品的处理：
组织样品的处理
往1～3g组织样品中加适量灭菌的0.9％生理盐水研磨成10倍悬 浮液，反复冻融2～3次后，4000g离心10min，取上清液作核酸抽 提用。
棉拭子的处理
将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，0.5mL样品液经4000g离 心10min，取上清液作核酸抽提用。
细胞培养物的处理
取1.5mL细胞培养物反复冻融2～3次后，4000g离心10min， 取上清液作核酸抽提用。
阴性对照：健康猪组织样品，处理方法同上。
B其他实验材料：
标准阳性样品样品：pMD18-CH、pMD18-NJ。
RNA分离试剂盒，华美生物工程公司的RNA分离试剂盒(III) (目录号MK0043)，或Invitrogen公司的Trizol LS Reagent(目录 号10296010)
灭菌1.5mL离心管
RNase-Free水
纯氯仿(分析纯以上级)
RNase-Free水配制的75％乙醇
反转录酶Reverse transcriptase XL(AMV)[目录号D2620]、核 糖核酸酶抑制剂(RNasin)[目录号D2310A]、dNTP Mixture[目录 号D4030A]均来自宝生物(大连)有限公司。
1.5mL灭菌EP管。
3、操作方法 以华美生物工程公司的RNA分离试剂盒(III) 为例
制取样品的RNA：取200μL A项所述的上清液或病毒液置于 一灭菌的1.5mL离心管中，同时设立阴性对照或阴性细胞培养液和 阳性病毒液为对照，再分别加入750μL冰冷的裂解液，剧烈混合样 品15s，室温放置5min；加入200μL纯氯仿，颠倒离心管混合2次， 剧烈混合15s，4℃ 10000g离心15min；吸取500μL上层水相于 新1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，4℃静置10min，4℃ 10000g离心15min；小心弃去全部上清液，加入1mL RNase-Free 水配制的75％乙醇，上下轻缓颠倒两次，4℃ 7500g离心7min；弃 去全部上清液，自然风干5～10min，当管壁肉眼看不到小液滴时即 可，离心管底部即为所获RNA。
反转录(RT)得到样品的cDNA：
反转录引物是由随机引物和oligo(T)按3:1比例混合制备。
在一个洁净的1.5mL灭菌EP管中依次加入RNase-Free水9.5 μL，5×AMV buffer 4μL，dNTP Mixture 4μL，反转录引物(CU) 1μL(20pmol)，核糖核酸酶抑制剂RNasin 0.5μL(10U)，反转录 酶AMV 1μL(2.5U)，轻缓混匀得反转录混合液；将所述反转录混 合液重悬上述制备得到的RNA，置于室温10min；放入42℃水浴 1h，取出冰浴2min，所得的反应液即为反转录产物cDNA。然后将 cDNA置于-20℃保存或直接用于下一步试验。
(2)分别设计引物对样品cDNA进行荧光定量聚合酶链反应或 聚合酶链反应(PCR)反应，扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的非缺失 变异株与缺失变异株；
1、材料准备
荧光定量PCR仪
Green I Realtime PCR Master Mix、EX-Taq酶[目录号 DRR001A]来自宝生物(大连)有限公司；
dNTP Mixture(目录号D4030A)，100bp DNA分子量标准(目 录号D505A)来自宝生物(大连)有限公司；
2、PCR扩增引物
荧光定量RT-PCR引物分别为20pmol/μL：
P1：5-GTTCCTGCACCGCGTAGAA-3
P2：5-TGATGACACAGGTGCAGGGT-3
扩增PRRSV的非缺失变异株与缺失变异株，预计扩增非缺失变 异株片段约为213bp，扩增缺失变异株片段约为126bp；
P3：5-AGCCGATGACACCTCTGA-3
P4：5-GGATTCGCTTCTTCCACC-3
仅扩增PRRSV的非缺失变异株，预计扩增片段约为256bp。
在反应混合配制区进行扩增试剂准备：从试剂盒中取出相应的荧 光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所 需要荧光PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阴性样品与标准阳 性样品，其中标准阳性样品包括以下几个稀释度：1.0×108、1.0 ×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、 1.0×101、1.0×100拷贝/μL，分别作为模板进行荧光定量RT-PCR 反应)，每个样品分别以P1、P2和P3、P4为引物进行反应，测试反 应体系配制表如下：
实时定量PCR反应体系
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加到与体系体积 相适配的荧光PCR管中，充分混匀，向每管中分装23μL反应混合物 液体(cDNA模板除外)，转移至样品处理区准备加样；
加样在样本处理区进行，在各设定的荧光PCR管中放入制备的 cDNA溶液各2μL，盖紧管盖，500r/m离心30s。
(3)将PCR扩增体系放入到荧光PCR检测仪中，设置循环条 件，在每次循环的延伸时收集荧光信号，循环结束后根据收集的荧光 曲线和Ct值判断结果。
步骤(3)在检测区进行。将步骤(2)离心后的荧光PCR管放入 到荧光PCR检测仪中，记录样品摆放顺序。
循环条件设置：95℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 40s； 共40个循环。在每次循环的延伸时收集荧光信号。试验检测结束后， 根据收集的荧光曲线和Ct值判断结果。直接读取检测结果。阈值设 定原则根据仪器躁声情况进行调整，以阈值线落在样品的指数增长区 且刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
结果判定方法：
阴性样品无Ct值或无扩增曲线。阳性对照的Ct值应小于30，并 出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
标准曲线的生成
以含有目的片段的样品pMD18-CHR、pMD18-NJ作为标准品，将其 10倍系列稀释成1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0 ×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μL， 作为模板进行AQ-PCR，生成PRRSV非缺失变异株与缺失变异株检测 的标准曲线。例如：CtpMD18-CHR＝-3.16log(DNA Concentrate)+37.67、 CtpMD18-NJ＝-3.15log(DNA Concentrate)+38.19。
回归方程的建立
仪器上读取回归方程的斜率及截距，建立非缺失变异株与缺失变 异株检测回归方程。例如：Y非缺失变异株＝-3.16X+37.67，其中-3.16 为斜率，37.67为截距，Y为Ct值，X为样品的拷贝数；Y缺失变异株 ＝-3.15X+38.19，其中-3.15为斜率，38.19为截距，Y为Ct值，X为 样品的拷贝数。
阴性：以P1P2和P3P4为引物均无Ct值或无扩增曲线，表示样品 中无PRRSV。
阳性：分别以P1、P2和P3、P4为引物，均出现典型的扩增曲线， 且Ct值小于等于30，表示样品中有PRRSV且为非缺失变异株。仅以 P1P2为引物时，出现典型的扩增曲线，且Ct值小于等于30，表示样 品中有PRRSV且为缺失变异株。
感染量的计算
当判定样品为为非缺失变异株PRRSV时，计算其Ct值带入非缺 失变异株检测回归方程如：Y非缺失变异株＝-3.16X+37.67，其中 -3.16为斜率，37.67为截距，y为Ct值，X为样品的拷贝数，计算 其感染量。
当判定样品为为缺失变异株PRRSV时，计算其Ct值带入缺失变异 株检测回归方程如：Y缺失变异株＝-3.15X+38.19，其中-3.15为斜 率，38.19为截距，y为Ct值，X为样品的拷贝数，计算其感染量.
有效原则：Ct值大于30的样品建议重做，重做无数值者为阴性， 否则为阳性。仅以P3P4为引物时，出现典型的扩增曲线的样品建议 从做，重做后P1P2、P3P4为引物出现扩增曲线者为阳性，否则判为 阴性。
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