用于使用电子射线来病毒灭活的方法
阅读：818发布：2020-07-23
专利汇可以提供用于使用电子射线来病毒灭活的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于灭活病毒的方法，其特征在于，用 电子 射线来辐照含有至少一种病毒的一种免疫原成分或 疫苗 ，其中包含至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗(i)是一种液体，尤其是一种悬浮液，并且(ii)包含有至少一种病毒免疫原，其中优选地该 抗原 结构基本保留。，下面是用于使用电子射线来病毒灭活的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于灭活病毒的方法，其特征在于，
用电子射线来辐照含有至少一种病毒的免疫原成分或疫苗，其中包含至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗
(i)是液体，尤其是悬浮液，并且
(ii)包含有至少一种病毒免疫原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒由以下项来选择：
(i)包膜病毒或无包膜病毒，和/或
(ii)双链DNA病毒、双链RNA病毒、单链RNA病毒、或单链DNA病毒，和/或(iii)人类致病病毒和/或动物致病病毒,
优选的是，所述至少一种病毒从人类致病的和/或动物致病的包膜双链RNA病毒、包膜负单链RNA病毒、或包膜正单链RNA病毒中来选择，
尤其优选的是，
a)所述至少一种病毒从人类致病的和/或动物致病的正单链RNA病毒中来选择，特别优选的是所述至少一种病毒从动脉炎病毒科的病毒中来选择，还更优选的是所述至少一种病毒是猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRS病毒)，或者
b)所述至少一种病毒从动物致病病毒、A和B型流感病毒、FSME病毒、IPV病毒和A型肝炎病毒中来选择。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述疫苗或免疫原成分包含(i)一种病毒或(ii)两种或多种不同病毒。
4.根据权利要求1至3之一所述的方法，其特征在于，电子射线被低能或中能地加速，优选以在150keV和700keV之间的加速能被加速，更优选地以在200keV和500keV之间的加速能被加速，还更优选地在250keV和400keV之间被加速，和/或基本在常压大气下来实施，优选地其中所述常压大气可以作为大气中的氧气、氮气或二氧化碳气体而存在。
5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，含有至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗以50kGy至300kGy范围内、优选50kGy至200kGy范围内、极其优选50kGy至
150kGy范围内、更优选50kGy至120kGy范围内、还更优选50kGy至110kGy范围内的电子射线剂量被辐照。
6.根据权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于，优选作为TCID 50值测量的所述至少一种病毒的活性在辐照之后小于辐照之前活性的5％、优选1％、更优选0.1％，还更优选的是，在辐照之后，所述至少一种病毒的活性不再能够被检测到。
7.根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于，所述至少一种病毒是包膜病毒。
8.根据权利要求1至7之一所述的方法，其特征在于，该免疫原成分或疫苗的病毒抗原结构在辐照之后基本保留，
优选的是，针对未灭活病毒的多克隆血清与被辐照免疫原成分或疫苗的所述至少一种病毒之间的结合至少为辐照之前所述多克隆血清与免疫原成分或疫苗的所述至少一种病毒之间结合的40％，优选至少为70％，更优选为至少80％，还更优选至少为90％,尤其其中所述多克隆血清与该免疫原成分或疫苗的所述至少一种病毒之间的结合借助ELISA来确定。
9.根据权利要求1至8之一所述的方法，其特征在于，该病毒的病毒结构在辐照之后基本保留。
10.根据权利要求1至9之一所述的方法，其特征在于，
(a)采用用于生成电子射线的装置来实施辐照，
(i)其中该装置优选连续地运行或快速脉冲地运行，和/或
(ii)该装置优选地按照冷阴极原理或热阴极原理来提供电子，和/或
(iii)该装置优选地作为轴辐照器(扫描器)或线性宽带辐照器来实施，和/或(iv)优选地电子在从该装置的真空发生器室出射之后穿过出射窗口施加到该免疫原成分或疫苗上，其中该免疫原成分或疫苗优选地位于容器中，和/或
(v)优选地该免疫原成分或疫苗静止地容纳于该装置中，或者连续地被传送穿过电子射线，和/或
(b)剂量率在1kGy/0.1秒至150kGy/1000秒的范围内,和/或
(c)辐照时间在0.1秒至1000秒之间的范围内，优选在1至100秒之间,和/或(d)该免疫原成分或疫苗的温度在辐照之前在1℃与40℃之间、优选在5℃与37℃之间、极其优选在10℃与32℃之间，更极其优选在15℃与30℃之间,和/或
(e)该免疫原成分或疫苗在辐照之后与辐照之前相比的温度提升在1℃与15℃之间、优选在2℃与10℃之间,和/或
(f)该免疫原成分或疫苗的温度在辐照之后在2℃与41℃之间、优选在6℃与38℃之间、极其优选在11℃与33℃之间，更极其优选在16℃与31℃之间,和/或
3 3
(g)该免疫原成分或疫苗的密度在0.9与2g/cm之间，优选在1.0与1.8g/cm 之间,和/或
(h)包含至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗是一种包含水的液态悬浮液，优选地是所述至少一种病毒在水溶液中的悬浮液，其中该水溶液尤其优选地包含一种或多种缓冲物质。
11.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，该免疫原成分或疫苗含有(a)一种或多种佐剂、和/或
(b)药学上可接受的载体物质和/或辅料、和/或
(c)一种或多种其他免疫原。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述一种或多种其他免疫原从以下项中来选择：
(a)有机物质、尤其可以是糖化或非糖化的蛋白质、核酸、毒素、或可选地连接到载体上的糖分子，以及
(b)病毒或生物、尤其是细菌，其中该病毒或生物可以是活性的或灭活的。
13.一种用于制造包含至少一种病毒免疫原的疫苗的方法，尤其用于制造包含病毒全颗粒疫苗的疫苗的方法，其特征在于：
(a)实施根据权利要求1至11之一所述的方法，
(b1)给包含至少一种病毒的该免疫原成分可选地增加一种或多种佐剂，和/或(b2)给包含至少一种病毒的该免疫原成分可选地增加一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅料，和/或
(b3)给包含至少一种病毒的该免疫原成分可选地增加一种或多种其他免疫原，其中步骤(a)至(b3)以任意的顺序来实施。
14.根据权利要求13所述的用于制造疫苗的方法，其特征在于，还实施以下另外的步骤：
(c)将该免疫原成分消毒，和/或
(d)把该免疫原成分灌装到容器中，
其中步骤(a)至(d)可以以任意的顺序来实施，
以及接着步骤(a)至(d)该疫苗可选地被干燥、冻干或冻结。
15.一种可通过权利要求1至14所述的方法来制造的免疫原成分或疫苗、优选疫苗、尤其优选包含灭活病毒全颗粒疫苗的疫苗。
16.一种免疫原成分或疫苗、优选包含有针对包膜或无包膜病毒的灭活病毒全颗粒疫苗的疫苗，其特征在于，
(a)在该免疫原成分或疫苗中病毒的活性小于相同数量的未灭活病毒的活性的10％，优选小于其1％，更优选小于其0.1％，以及
(b)在该免疫原成分或疫苗中该灭活病毒的抗原结构与相同数量的未灭活病毒相比基本相同。
17.根据权利要求16所述的免疫原成分或疫苗，
(a)其中该灭活病毒的病毒结构与相同数量的未灭活病毒相比基本相同，和/或(b)其中利用电子射线来辐照该免疫原成分或疫苗，和/或
(c)其中在该免疫原成分或疫苗中不再能够检测到所述至少一种病毒的活性。
18.根据权利要求15至17之一所述的免疫原成分或疫苗，其中该免疫原成分或疫苗以
50kGy至300kGy、优选50kGy至200kGy、极其优选50kGy至150kGy、更优选50kGy至120kGy、还更优选50kGy至110kGy范围中的电子射线剂量被辐照。
19.根据权利要求15至18之一所述的免疫原成分、优选疫苗，其用作疫苗、尤其用于预防或治疗由该病毒所引起的病毒感染或疾病。
20.一种电子射线的应用，用于
(a)在包含至少一种病毒的免疫原成分或疫苗中来灭活病毒，其中该免疫原成分或疫苗
(i)是液态的，尤其是悬浮液，以及
(ii)包含有至少一种病毒免疫原，和/或
(b)制造灭活病毒全颗粒疫苗。
21.根据权利要求20所述的应用，
其中
所述电子射线被低能或中能地加速，优选以在150keV和700keV之间的加速能被加速，更优选地以在200keV和500keV之间的加速能被加速，还更优选地在250keV和400keV之间被加速，和/或基本在常压大气下来实施，其中优选地所述常压大气作为大气中的氧气、氮气或二氧化碳气体而存在，
和/或电子射线剂量处于50kGy至300kGy范围内、优选在50kGy至200kGy范围内、极其优选在50kGy至150kGy范围内、更优选在50kGy至120kGy范围内、还更优选在50kGy至
110kGy范围内。
22.一种用于生成电子射线的装置的应用，
(a)用于在液态免疫原成分中、极其优选在液态疫苗中灭活病毒，和/或
(b)用于制造灭活病毒全颗粒疫苗。
23.根据权利要求22所述的应用，
其中该装置
(a)适于发射低能或中能加速的电子射线，优选以在150keV和700keV之间的加速能被加速，更优选地以在200keV和500keV之间的加速能被加速，还更优选地在250keV和
400keV之间被加速，和/或适于基本在常压大气下施加电子射线和/或
(b)适于提供50kGy至300kGy之间的电子射线剂量，优选在50kGy至200kGy之间，极其优选在50kGy至150kGy之间，更优选在50kGy至120kGy之间，还更优选在50kGy至110kGy之间。
24.使用根据权利要求1至14之一所述的方法来制造灭活病毒全颗粒疫苗。
用于使用电子射线来病毒灭活的方法
[0001] 本发明涉及一种用于病毒灭活的方法，其特征在于，利用电子射线来辐照含有至少一种病毒的免疫原成分或疫苗，其中包含至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗(i)是一种液体，尤其是一种悬浮液，并且(ii)包含有至少一种病毒免疫原。
[0002] 在人类医学和兽医中通过采用疫苗可以成功抵御许多传染病。但还是非常需要疫苗技术，所述疫苗技术有效而持久地防御感染，但在此对于疫苗接种的个体是无风险的。在制造所谓灭活疫苗时显然的是：对于病毒灭活采用诸如甲醛的有毒化学品，其然后必须通过耗费的方法再次从疫苗中去除。在兽医中甲醛灭活的疫苗占全部疫苗的大部分，在人类医学中其比如用于抵御FSME、流感、脊髓灰质炎或A型肝炎。使用甲醛导致病毒抗原的化学变化(交联)。这又导致疫苗效果下降，这必须通过提高感染原料和增强剂(佐剂)的量来补偿。避开该问题的技术明显不满足疫苗工业的要求。
[0003] 研究得知，甲醛破坏了对疫苗接种成功重要的抗原直至30％-80％(Amanna等，自然医学2012年第18期)。该问题是疫苗工业所已知的，并且人们在寻找替代方案。从而用UV射线、提高温度、伽马射线或过氧化物来试验。但目前为止该技术还停留在实验室试验阶段。
[0004] 另外已公开的是，采用高能电子射线可以降低沙门氏菌群体(US 8,173,139B1)。但其没有阐述抗原的结构受损到什么程度。另外沙门氏菌是具有自身新陈代谢的生物。把电子射线应用于除了其宿主细胞还不具有自身新陈代谢的病毒从而还不能被接受。
[0005] 本发明现在令人惊讶地发现，利用电子射线可以灭活病毒，而在此不破坏病毒结构蛋白。从而利用电子射线进行辐照令人惊讶地尤其适于制造病毒灭活的全颗粒疫苗。
[0006] 病毒的灭活想必通过破坏核酸来进行，其中病毒结构以及尤其抗原结构不会或者几乎不会受损。在例1和2以及图1至3中示出了比如猪致病PRRSV病毒的结果。在此用电子射线来处理该病毒在缓冲水溶液中的液体、也即悬浮液。该悬浮液具有免疫性的，并适于作为抵御猪PRRSV的疫苗。
[0007] 在例3和图4和5中示出了A型流感病毒的结果。用电子射线来处理该病毒在缓冲水溶液中的液体、也即悬浮液。该悬浮液具有免疫性，并适于作为抵御A型流感的疫苗。
[0008] 在一种实施方式中，本发明涉及一种用于病毒灭活的方法，其特征在于，利用电子射线来辐照包含至少一种病毒的免疫原成分或疫苗，其中包含至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗(i)是一种液体，尤其是一种悬浮液，并且(ii)包含有至少一种病毒免疫原。
[0009] 在一种优选的实施方式中，所述至少一种病毒在辐照之前是有活性的，和/或该免疫原成分或疫苗包含一些活性病毒。在对液态成分或疫苗进行辐照之前活性病毒的浓度4
按照每毫升液体的TCID50值(50％组织培养物感染剂量)来测量而尤其为每毫升至少10、
5 6
10、或10。
按照每毫升液体的TCID50值(50％组织培养物感染剂量)来测量而尤其为每毫升至少10、
5 6
10、或10。
[0010] 在另一实施方式中，本发明涉及一种用于病毒灭活的方法，其特征在于，利用电子射线来辐照包含有至少一种病毒的一种成分，其中包含至少一种病毒的该成分(i)是一种液体，尤其是一种悬浮液，和/或(ii)是免疫原成分。
[0011] 该方法可以应用于任意的病毒，尤其包膜病毒或无包膜病毒。
[0012] 在一种优选的实施方式中，其对于包膜病毒是合适的，因为包膜蛋白是接种反应的合适抗原。利用本发明的方法仍然获得该抗原构造，而病毒本身被灭活(见图1、2和3)。从而利用本发明的方法令人惊讶地尤其能够制造用于包膜病毒的病毒灭活的全颗粒疫苗。
[0013] 在另一优选的实施方式中，可以制造无包膜病毒的病毒灭活的全颗粒疫苗。在无包膜病毒中接种反应的合适抗原尤其是该病毒的衣壳蛋白。
[0014] 以下病毒比如可以根据本发明来进行辐照：
[0015] 包膜病毒，比如：
[0016] 双链DNA病毒，比如：
[0017] 天花病毒(引起天花)；
[0018] 疱疹病毒(比如单纯疱疹(HSV)(引起口唇疱疹或生殖器疱疹)；水痘带状疱[0019] 疹病毒(VZV)(引起水痘和带状疱疹)
[0020] 爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)(引起普费弗腺热)
[0021] 巨细胞病毒(CMV)(引起巨细胞病毒病)
[0022] 人类疱疹病毒67型(引起三天发烧)
[0023] 人类疱疹病毒8型(HHV 8)(引起卡波西肉瘤)
[0024] 嗜肝DNA病毒，比如：
[0025] B型肝炎病毒(引起B型肝炎)
[0026] 正链RNA病毒，比如：
[0027] 黄病毒，比如：
[0028] C型肝炎病毒(引起C型肝炎)
[0029] 披膜病毒，比如：
[0030] 风疹病毒(引起风疹)
[0031] 冠状病毒(引起肠胃炎症，SARS)
[0032] 负链RNA病毒，比如：
[0033] 正粘病毒，比如：
[0034] A、B、或C型流感病毒(引起流感)
[0035] 负粘病毒，比如：
[0036] 副流感病毒(引起副流感)
[0037] 麻疹病毒(引起麻疹)
[0038] 腮腺炎病毒(引起腮腺炎)
[0039] 呼吸道合胞病毒(RSV)
[0040] 肺病毒，比如属：肺病毒、偏肺病毒
[0041] 弹状病毒，比如：
[0042] 狂犬病毒(引起狂犬病)
[0043] 逆转录酶病毒，比如：
[0045] HTLV(引起白血病)
[0046] 无包膜病毒，比如：
[0047] 双链DNA病毒，比如：
[0048] 腺病毒(引起鼻炎性感冒)
[0049] 乳多空病毒(引起疣)
[0050] 单链DNA病毒，比如：
[0051] 细小病毒，比如：
[0052] B19细小病毒(引起第五病)
[0053] 双链RNA病毒，比如：
[0054] 轮状病毒(腹泻)
[0055] 正链RNA病毒，比如：
[0056] 小核糖核酸病毒，比如：
[0057] 脊髓灰质炎病毒(引起脊髓灰质炎)
[0058] 柯萨奇病毒
[0059] 埃可病毒
[0060] A型肝炎病毒(引起A型肝炎)
[0061] 鼻病毒(引起鼻炎性感冒)
[0062] 杯状病毒(引起腹泻)
[0063] 在一种优选的实施方式中，所述至少一种病毒从而由以下来选择：
[0064] (i)包膜病毒或无包膜病毒，尤其是包膜病毒，和/或
[0065] (ii)双链DNA病毒、双链RNA病毒、单链RNA病毒，或单链DNA病毒，和/或[0066] (iii)人类致病病毒和/或动物致病病毒。
[0068] 在一种极其优选的实施方式中，所述至少一种病毒从人类致病的和/或动物致病的包膜双链RNA病毒、包膜负单链RNA病毒、或包膜正单链RNA病毒中来选择。
[0069] 在该例子中示出：PRRS病毒(porcine respiratory and reproductive failure syndrome virus,猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒)、感染猪的来自动脉炎病毒科属的单正链RNA病毒利用本发明的方法如此被灭活，使得病毒结构和抗原结构很大程度上被保留。从而能够制造对抗PRRS病毒的灭活病毒全颗粒疫苗。
[0070] 在又一极其优选的实施方式中，所述至少一种病毒从人类致病的和/或动物致病的正单链RNA病毒中来选择，特别优选的是从动脉炎病毒科属的病毒中来选择，更优选的是所述至少一种病毒是猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRS病毒)。
[0071] 在另一优选的实施方式中，所述至少一种病毒从埃可病毒、H1病毒、轮状病毒、伪狂犬病毒、细小病毒、猪细小病毒、H5N1病毒、H1N1病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腮腺炎病毒、A和B型流感病毒、FSME病毒、IPV病毒和A型肝炎病毒中来选择。
[0072] 在另一优选的实施方式中，所述至少一种病毒从动物致病病毒、A和B型流感病毒、FSME病毒、IPV病毒和A型肝炎病毒中来选择。尤其优选的是A和B型流感病毒。
[0073] 利用本发明的方法，可以对含有一种(1)病毒的免疫原成分或疫苗进行辐照，如在该例子中用PRRSV所示。但是该免疫原成分或疫苗也可以含有2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的病毒。这比如可以有助于制造联合疫苗。所述两种或多种不同的病毒可以是相同病毒种的变种，或者不同种、科或属的病毒。因此，在一种优选的实施方式中，所述免疫原成分或疫苗包含(i)一种病毒或(ii)两种或多种不同病毒。但也可以制造一种联合疫苗，其中两种或多种病毒被单独地辐照，并在辐照之后才被组合。
[0074] 在该例子中，利用加速为小于300KeV、比如150KeV的电子来辐照PRRSV病毒的悬浮液(见图1至5)。这些电子是低能加速的。
[0075] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法其特征在于，电子射线被低能或中能地加速，优选以在150keV和700keV之间的加速能被加速，更优选地以在200keV和500keV之间的加速能被加速，还更优选地在250keV和400keV之间被加速。
[0076] 在此可以在常压下、或者基本在常压大气下来处理，并从而电子射线可以优选地基本在常压大气下来实施。基本常压大气可理解为1巴+/-0.1巴。所述常压大气在此比如可以作为大气中的氧气、氮气或二氧化碳气体而存在。
[0077] 如在该例子中所示，该PRRSV病毒可以采用50kGy、100kGy或200kGy的剂量而被灭活。另外可以示出，用200kGy剂量在悬浮液中该A型流感病毒被完全灭活。
[0078] 已发现，至少50kGy的剂量有利于达到病毒尽可能完全的灭活。
[0079] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，含有至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗以至少50kGy、至少60kGy、至少70kGy、至少80kGy、至少90kGy、至少100kGy、至少110kGy、至少120kGy、至少130kGy、至少140kGy、至少150kGy、至少160kGy、至少170kGy、至少180kGy、至少190kGy、至少200kGy或至少250kGy的电子射线剂量被辐照。
[0080] 另外还发现，300kGy或更少的剂量有利于避免对成分的可能破坏。
[0081] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，含有至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗以最高300kGy、最高250kGy、最高200kGy、最高190kGy、最高180kGy、最高170kGy、最高160kGy、最高150kGy、最高140kGy、最高130kGy、最高120kGy、最高110kGy、最高100kGy、最高90kGy、最高80kGy、最高70kGy或最高60kGy的电子射线剂量被辐照。
[0082] 在一种优选的实施方式中，从而电子射线剂量处于50kGy至300kGy的范围中。含有至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗比如以50kGy、60kGy、70kGy、80kGy、90kGy、100kGy、110kGy、120kGy、130kGy、140kGy、150kGy、160kGy、170kGy、180kGy、190kGy、200kGy、210kGy、
220kGy、230kGy、240kGy、250kGy、260kGy、270kGy、280kGy、290kGy或300kGy的电子射线剂量被辐照。
220kGy、230kGy、240kGy、250kGy、260kGy、270kGy、280kGy、290kGy或300kGy的电子射线剂量被辐照。
[0083] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，含有至少一种病毒的该免疫原成分或疫苗以50kGy至300kGy范围内、优选50kGy至200kGy范围内、极其优选50kGy至150kGy范围内、更优选50kGy至120kGy范围内、还更优选50kGy至110kGy范围内的电子射线剂量被辐照。
[0084] 在根据本发明方法的另一实施方式中，所述至少一种病毒以1kGy至300kGy的电子射线剂量、极其优选以1kGy至150kGy的电子射线剂量、更极其优选以10kGy至120kGy的电子射线剂量、最极其优选以15kGy至110kGy的电子射线剂量被辐照。
[0085] 在例1中可以示出，借助本发明的方法可以实现通过电子射线2.5对数级的灭活(图1)。灭活通过测量TCID 50的值来确定。
[0086] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，优选作为TCID 50值(50％组织培养物感染剂量)测量的所述至少一种病毒的活性在辐照之后小于辐照之前活性的5％、优选1％、更优选0.1％，还更优选的是，在辐照之后，所述至少一种病毒的活性不再能够检测到。该TCID 50值从而可以如在例2中所述来确定。专业人员在此将为某一病毒来选择一种合适的组织培养物。在例2中，对于PRRSV病毒在Marc145细胞中来确定TCID 50值。在例3中对于A型流感病毒在MDCK细胞中来确定TCID 50值。
[0087] 对于包膜病毒PRRSV，在该例子中可以示出，在所给定的条件下，基本保留了抗原结构：针对未灭活病毒的多克隆血清与被辐照成分的所述至少一种病毒之间的结合超过与未灭活病毒之间结合的90％(见图1)。利用200kGy电子射线剂量处理的流感病毒的抗原结构也基本保留(图5)。A型流感感染人的多克隆血清与用200kGy辐照的病毒之间的结合约等于与未灭活病毒之间结合的80％。
[0088] 在另一实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，所述至少一种病毒是包膜病毒，并且免疫原成分或疫苗的病毒抗原结构在辐照之后基本保留。
[0089] 在又一实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，所述至少一种病毒是无包膜病毒，并且免疫原成分或疫苗的病毒抗原结构在辐照之后基本保留。
[0090] 抗原是能够专门与抗体相结合的、尤其诸如蛋白质的物质。为了作为抗原来使用，抗原或其中所含的表位必须是化学和结构完整的。在此通常需要保留抗原或其中所含的用于与抗体结合的表位的二维和/或三维结构。现在令人惊讶地发现，通过利用电子射线进行幅照，被辐照病毒的抗原结构基本保留，并从而被辐照的液态成分可以被用作疫苗，以在人或动物中、尤其哺乳动物中触发特定的免疫反应。
[0091] 表位是抗原的、其上与抗体相特定结合的区域。
[0092] 在一种尤其优选的实施方式中，在此针对未灭活病毒的多克隆血清与被辐照免疫原成分或疫苗的所述至少一种病毒之间的结合至少为辐照之前多克隆血清与免疫原成分或疫苗的至少一种病毒之间结合的40％，优选至少为70％，更优选为至少80％，还更优选至少为90％。
[0093] 多克隆血清与免疫原成分或疫苗的所述至少一种病毒之间的结合在此优选地借助ELISA来确定。借助ELISA对结合的确定在此优选地如在这些例子中所示来实施。
[0094] ELISA(酶联免疫吸附试验)表示一种基于抗体的指示方法，这是专业人员几十年来所熟知的。借助ELISA可以指示诸如蛋白质的物质。在此，利用了特定抗体与要指示的物质、抗原相结合的特性。首先用一种酶来标记抗体。通过报告酶所催化的反应用于指示抗原的存在。通过酶来对基质进行转化，并然后就可以比如通过测量吸收或化学发光来指示反应产物。
[0095] 在另一实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，所述至少一种病毒是包膜病毒，并且该成分的病毒抗原结构在辐照之后基本保留。
[0096] 在又另一实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，所述至少一种病毒是无包膜病毒，并且该成分的病毒抗原结构在辐照之后基本保留。
[0097] 在另一实施方式中，针对未灭活病毒的多克隆血清与被辐照成分的所述至少一种病毒之间的结合至少为辐照之前多克隆血清与该成分的至少一种病毒之间结合的40％，优选至少为70％，更优选至少为80％，还更优选至少为90％。
[0098] 多克隆血清与该成分的所述至少一种病毒之间的结合在此优选地借助ELISA来确定。借助ELISA对结合的确定在此优选地如在该例子中所示来实施。
[0099] 如果病毒的病毒结构在辐照之后基本保留，那么这对于无包膜病毒和包膜病毒的免疫原成分或疫苗(痘苗)的制造是进一步有利的。如果期望的是一种全疫苗尤其灭活的全疫苗，那么这是尤其适合的。全疫苗所具有的优点是，其包含有该病毒的不同抗原，并从而能够触发全面的免疫反应。在所述例子中，对于包膜病毒可以示出，针对该病毒的一种抗原、也即该PRRSV的N蛋白质的抗体的结合在成分被辐照以及负对照的情况下是基本相同的，其中该抗原在该病毒包膜完整的情况下对于该抗体是不可接触的，而在成分被过氧化物处理的情况下确定结合有400％的提高。
[0100] 全疫苗或全颗粒疫苗是包含病毒的疫苗，其中该病毒的颗粒结构基本保留。
[0101] 灭活的全疫苗或全颗粒疫苗是包含病毒的灭活疫苗，其中该病毒的病毒结构基本保留。
[0102] 灭活疫苗包含有灭活的或杀死的病毒或菌、或病毒或菌成分、或毒素。其不再能够在体内增殖。
[0103] 根据本发明的一种免疫原是一种抗原，其基于其免疫性而能够触发免疫反应。
[0104] 免疫原成分是能够在人或哺乳动物中触发免疫反应的一种成分。免疫原成分包含有至少一种免疫原。在一种优选的实施方式中，免疫原成分适于提供给人或动物，并从而准备施用于动物或人。该成分从而优选地不包含不允许或不适于提供给人或哺乳动物的物质，尤其不包含致癌的、高度过敏的或有毒的物质。
[0105] 根据本发明的疫苗或痘苗包含有至少一种抗原和/或免疫原，其基于其免疫性而能够触发免疫反应，并准备用于动物或人。疫苗适于提供给人或动物。疫苗从而不包含不允许或不适于提供给人或哺乳动物的物质，尤其不包含致癌的、高度过敏的或有毒的物质。
[0107] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，病毒的病毒结构在辐照之后基本保留。
[0108] 在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，所述至少一种病毒是包膜病毒，并且该病毒的病毒结构在辐照之后基本保留。
[0109] 在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法从而其特征在于，所述至少一种病毒是无包膜病毒，并且该病毒的病毒结构在辐照之后基本保留。
[0110] 如果在辐照之后针对病毒抗原的抗体与该成分、尤其免疫原成分或疫苗的至少一种病毒之间的结合比在辐照之前该抗体与该成分、尤其免疫原成分或疫苗的至少一种病毒之间的结合少于400％，尤其少于200％、更优选少于150％，还更优选少于120％，那么在本发明意义上，病毒结构就基本保留，其中该抗原在该病毒包膜完整的情况下对于该抗体是不可接触的。这优选地通过ELISA来确定，如在该例子中所示。在图3中令人惊讶地发现，在对包含PRRSV病毒的液态免疫原成分进行辐照的情况下，在ELISA中该外壳(N-)蛋白采用针对该抗原的抗体是不能接触的。
[0111] 在另一实施方式中，从而本发明另外还涉及采用本发明的方法来制造灭活病毒全颗粒疫苗。
[0112] 在本发明的方法中采用了电子射线。在技术生成电子时，在接通电流后，在其发射时在阴极和阳极之间所施加的加速电压决定了其以电子伏特eV为单位的能量。电子伏特越高，具有更多能量的电子就能够越深地侵入到物质中。辐照功率是辐照电流(所生成电子的数量)与加速电压的乘积(以千瓦(kW)来表示)。在高辐照功率下，用于触发辐照化学反应所需的能量剂量就可以以非常短的时间(分数秒)来生成和施加。总之，尽管穿透深度较小，电子射线尤其在生产量高的连续过程中有利的是：能够开始并实现在技术上可良好调节的物理-化学过程。一个重要的优点是，该辐照过程在实际中可以通过按钮来接通和断开(比如与伽马辐照相反)。
[0113] 用于生成电子射线的合适装置和用于实施该方法的装置在现有技术中是公开的(A.Heger：Technologie der Strahlenchemie von Polymeren，卡尔汉斯出版社，慕尼黑，维也纳，1990.ISBN 3-446-15630-5；第二部分：一般原则；25-39页和第四部分：工业辐照设备；69-149页；DE 196 389 25 A1)。
[0114] 电子射线相对于伽马辐照也是有利的：因为常规的伽马源通常仅提供约2至6kGy每小时，较高的剂量仅可以以长的时间过程来实现，而电子辐射器以较少的秒将其实现(高剂量率)并从而基本是可进行生产的。
[0115] 在空气中进行常规伽马辐照时，在商业在用的设备中在所处理的材料上或者说在反应过程中附加了长期伴随的氧化效应(空气中的臭氧或水的OH根)，这在所期望的意义上通常不会或仅偶尔带来产品变化或产品结果。在借助电子射线设备进行短剂量冲击情况下，其中该电子射线设备大多还设计用于在惰性气体下工作，在较长影响时间上避免了这种副作用。
[0116] 优选地根据本发明的方法采用一种用于生成电子射线的装置来实施，其中该装置连续地运行或快速脉冲地运行。
[0117] 在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法采用一种用于生成电子射线的装置来实施，其中该装置按照冷阴极原理或热阴极原理来提供电子。
[0118] 在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法采用一种用于生成电子射线的装置来实施，其中该装置作为轴辐照器(扫描器)或线性宽带辐照器来实施。
[0119] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，电子在从该装置的真空发生器室出射之后穿过出射窗口施加到该成分上。在此该成分、尤其免疫原成分或疫苗优选地在一个容器中。
[0120] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，该成分、尤其免疫原成分或疫苗静止地容纳于该装置中，或者连续地被传送穿过该电子射线。
[0121] 另外还可以匹配剂量率(辐照电流/时间)。在此通常应考虑的是，关于所期望的最终所施加的剂量，大的辐照电流需要短的辐照时间，并且小的辐照电流需要长的辐照时间。该剂量率由专业人员考虑到比如在容器中液体介质的流速以及辐照器类型在来匹配。
[0122] 比如剂量可以在直至1000秒的时间内在10至300kGy范围内、尤其在50至300kGy范围内被施加；在1至25kGy内的低的剂量可以优选地在0.1至100秒的时间内被施加。优选的高于50kGy的剂量典型地需要10秒至1000秒的施加时间。因为施加时间优选地为
10秒至1000秒。
10秒至1000秒。
[0123] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该剂量率在1kGy/0.1秒至150kGy/1000秒范围内。
[0124] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该辐照时间在0.1秒至1000秒范围内，优选在1秒至100秒之间。
[0125] 在辐照时，典型地进行温度提升。为了避免变性过程，如果温度仅微小地升高，那么从而这是有利的。
[0126] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，该成分、尤其免疫原成分或疫苗的温度在辐照之前在1℃与40℃之间、优选在5℃与37℃之间、极其优选在10℃与32℃之间，更极其优选在15℃与30℃之间。
[0127] 在另一优选实施方式中，在辐照之前该成分的温度小于1℃的情况下来实施辐照，比如冻结的成分。在这种情况下，该成分在辐照之后同样具有小于1℃的温度，或者该成分的温度在辐照之后可以为1℃或更高。
[0128] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，该成分、尤其免疫原成分或疫苗在辐照之后的温度提升与辐照之前相比在1℃与15℃之间、优选在2℃与10℃之间。
[0129] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该成分、尤其免疫原成分或疫苗的温度在辐照之后在2℃与41℃之间、优选在6℃与38℃之间、极其优选在11℃与33℃之间，更极其优选在16℃与31℃之间。
[0130] 包含至少一种病毒的该成分、尤其免疫原成分或疫苗是液态的。在此这种液体优选地作为病毒的悬浮液存在于水溶液中，如在例子中所示；但也可以存在更高密度的悬浮液。
[0131] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该成分、尤其免疫原成分或疫苗3 3
的密度在0.9与2g/cm之间，优选在1.0与1.8g/cm 之间。
的密度在0.9与2g/cm之间，优选在1.0与1.8g/cm 之间。
[0132] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而包含至少一种病毒的该成分、尤其免疫原成分或疫苗是包含水的液态悬浮液，尤其是所述至少一种病毒在水溶液中的悬浮液，其中该水溶液尤其优选地包含一种或多种缓冲物质。该水缓冲溶液比如可以是PBS。这种溶液的pH优选地在pH5.5至8.5的范围内，极其优选在pH6.5至8.0的范围内。
[0133] 利用本发明的方法可以辐照一种此外已准备好的疫苗，其已获得合适的辅料和/或佐剂。
[0134] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该免疫原成分或疫苗含有(a)一种或多种佐剂、和/或(b)药学上可接受的载体物质和/或辅料、和/或(c)一种或多种其他免疫原。
[0135] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该免疫原成分或疫苗由至少一种病毒尤其一种(1)病毒、以及如下项：
[0136] (a)一种或多种佐剂，和/或
[0137] (b)药学上可接受的载体物质和/或辅料，诸如水或一种合适的水溶液，其尤其优选地包含有一种或多种缓冲物质，
[0138] 以及(c)可选的一种或多种其他病毒或免疫原
[0139] 来组成。
[0140] 在根据本发明方法的另一优选实施方式中，从而该成分是一种疫苗，其包含有至少一种病毒免疫原，并可选地包含有(a)一种或多种佐剂，和/或(b)药学上可接受的载体物质和/或辅料，和/或(c)一种或多种其他免疫原。
[0141] 合适的载体物质和辅料和/或其他的佐剂是专用人员所熟知的。合适的佐剂是用于充分增强对免疫原的免疫反应的那些物质。合适的佐剂比如是铝盐如磷酸铝或氢氧化铝、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰二肽、皂角苷衍生物、结核分枝杆菌细胞壁制剂、单磷酸脂A、霉菌酸衍生物、非离子型嵌段共聚物表面活性物质、奎尔A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈及其衍生物和免疫刺激复合物(ISCOM)，诸如在Takahashi等(1990)的Nature 344：873-875所述的那些物质。
[0142] 合适的载体物质和辅料比如是水或适于进行处理的水溶液，其尤其优选地包含有一种或多种缓冲物质。
[0143] 其他合适的免疫原是专业人员所熟知的，并尤其包括
[0144] (a)有机物质、尤其可以是糖化或非糖化的蛋白质、核酸、毒素、或糖分子、尤其能够可选地连接到载体上的糖类，以及
[0145] (b)病毒或生物尤其细菌，其中该病毒或生物可以是活性的或灭活的。
[0146] 其他合适的免疫原尤其是在相同的动物中或在人中对病原或疾病因素触发免疫反应的那些物质，如该成分的至少一种病毒。如果比如所述至少一种病毒是人类致病病毒，那么其他的免疫原就优选地如此来选择，使得其对人类致病病原体触发免疫反应和/或预防或减轻人类疾病。
[0147] 在冻干疫苗的情况下，可以增加稳定剂来作为载体物质和辅料，比如多元醇、如蔗糖或海藻糖。
[0148] 如在所有的免疫原成分或疫苗中，通常必须在经验上来确定免疫有效剂量。在此应该考虑的因素是，免疫原是否应该与佐剂或载体分子相复合或是否应该与之共价结合，用药的方式、以及应该提供的免疫剂量的数量。这些因素在疫苗研发领域中是熟知的，并且在该领域中的专业人员可以容易地确定这些因素。
[0149] 所述至少一种病毒以及必要时的一种或多种其他免疫原可以以不同的浓度包含在本发明的免疫原成分或疫苗中。在一种疫苗中的最小浓度通常是足以进行所计划的接种用途的那种浓度，其中在根据本发明的方法进行辐照的情况下，还可以采用更小的浓度，并且然后在完成的疫苗中可以调节为较高的浓度，或者在根据本发明的方法进行辐照的情况下，也可以采用较高的浓度，并然后在完成的疫苗中可以调节为较低的浓度。用于根据本发明的方法进行辐照的最大浓度通常是其中所述至少一种病毒在辐照期间保持均匀悬浮的浓度，和/或必要时溶解一种或多种其他免疫原或在辐照期间保持均匀悬浮的浓度。在一种疫苗中的最大浓度通常是其中所述至少一种灭活病毒保持均匀悬浮的浓度，和/或必要时溶解一种或多种其他免疫原或保持均匀悬浮的浓度。
[0150] 本发明的疫苗可以用于通过提供、尤其通过全身用药或粘膜用药来保护或治疗人或动物、尤其哺乳动物。用药的方式可以由专业人员来选择，并比如包括肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下途径，或者通过口腔、呼吸道或生殖道的粘膜用药。
[0151] 疫苗的制造通常在《疫苗设计》(“The subunit and adjuvant approach”(Hsg.Powell M.F.和Newman MJ.)(1995)纽约Plenum出版社)中有阐述。
[0152] 但或者也可以首先根据本发明来辐照包含至少一种病毒的成分、尤其免疫原成分，并接着必要时增加合适的辅料和/或佐剂。也可以增加其他的免疫原以制造联合疫苗。
[0153] 在另一实施方式中，本发明从而涉及一种方法，以用于制造包含至少一种病毒免疫原的疫苗，尤其用于制造包含病毒全颗粒疫苗的疫苗，其特征在于：
[0154] (a)如上所述来实施根据本发明的方法，
[0155] (b1)给包含至少一种病毒的该成分、尤其免疫原成分可选地增加一种或多种佐剂，和/或
[0156] (b2)给包含至少一种病毒的该成分、尤其免疫原成分可选地增加一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅料，和/或
[0157] (b3)给包含至少一种病毒的该成分、尤其免疫原成分可选地增加一种或多种其他免疫原，其中该步骤(a)至(b3)以任意的顺序来实施。
[0158] 为了适于应用于动物或人，并且为了保证可靠的运送以及以限定的剂量来应用，这种疫苗通常是无菌的，并以合适的容器来灌装。这种容器可以包含多个剂量或单个剂量。
[0159] 在另一优选的实施方式中，根据本发明的用于制造疫苗的方法其特征在于，另外还实施以下的步骤：
[0160] (c)该免疫原成分的消毒，和/或
[0161] (d)把该免疫原成分灌装到一个容器中，
[0162] 其中该步骤(a)至(d)可以以任意的顺序来实施，并接着步骤(a)至(d)该疫苗可选地被干燥、冻干或冻结。
[0163] 在根据本发明方法的另一实施方式中，从而包含至少一种病毒的该成分此外还[0164] (c)被消毒，和/或
[0165] (d)被灌装到容器中，
[0166] 其中该步骤(a)至(d)可以以任意的顺序来实施，并接着该疫苗可选地被干燥、冻干或冻结。
[0167] 利用本发明的方法所获得的免疫原成分和疫苗明显优于现有技术中的成分，因为其不含有化学灭活物质(诸如甲醛)的残留，和/或其特征是在同时灭活所述至少一种病毒时病毒的完整抗原结构。尤其在全颗粒疫苗和/或灭活疫苗中是这种情况。
[0168] 从而本发明另外还涉及可通过本发明的方法来制造的一种免疫原成分或疫苗、优选涉及尤其优选地包含有灭活病毒全颗粒疫苗的疫苗。
[0169] 在另一实施方式中，本发明涉及一种免疫原成分或疫苗、优选包含有针对包膜或无包膜病毒、优选包膜病毒的灭活病毒全颗粒疫苗的疫苗，其特征在于，
[0170] (a)在该免疫原成分或疫苗中病毒的活性小于相同数量的未灭活病毒的活性的10％，优选小于其1％，更优选小于其0.1％，以及
[0171] (b)在该免疫原成分或疫苗中该灭活病毒的抗原结构与相同数量的未灭活病毒相比基本相同。
[0172] 在根据本发明的免疫原成分或疫苗的一种优选实施方式中，灭活病毒的病毒结构与相同数量的未灭活病毒相比基本相同。
[0173] 在另一优选实施方式中，根据本发明的免疫原成分或疫苗如上所述地利用电子射线来进行辐照。
[0174] 在另一优选实施方式中，根据本发明的免疫原成分或疫苗以50kGy至300kGy、优选50kGy至200kGy、极其优选50kGy至150kGy、更优选50kGy至120kGy、还更优选50kGy至110kGy的电子射线剂量被辐照。该剂量允许有效地灭活病毒，其中同时该病毒结构以及包膜或无包膜病毒、优选包膜病毒的抗体结构被保留。
[0175] 在另一优选实施方式中，在该成分、尤其免疫原成分或疫苗中不再能够检测到所述至少一种病毒的活性。这尤其对于灭活疫苗和/或灭活病毒全颗粒疫苗是有意义的。
[0176] 在另一实施方式中，本发明涉及一种根据本发明的免疫原成分优选疫苗，以用作疫苗、尤其用于预防或治疗、尤其用于降低由该病毒所引起的病毒感染或疾病。
[0177] 在另一实施方式中，本发明涉及在包含至少一种病毒的免疫原成分或疫苗中使用电子射线来灭活病毒，其中该免疫原成分或疫苗(i)是液态的，尤其是一种悬浮液，以及(ii)包含有至少一种病毒免疫原。
[0178] 在另一实施方式中，本发明涉及在液态成分中、优选在液态免疫原成分或疫苗中、极其优选在疫苗中使用电子射线来灭活病毒。
[0179] 在另一实施方式中，本发明涉及使用电子射线来制造一种灭活病毒全颗粒疫苗。
[0180] 在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，电子射线被低能或中能地加速，优选以在150keV和700keV之间的加速能被加速，更优选地以在200keV和500keV之间的加速能被加速，还更优选地在250keV和400keV之间被加速，和/或基本在常压大气下来实施，其中优选地所述常压大气作为大气中的氧气、氮气或二氧化碳气体而存在。
[0181] 在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，电子射线剂量处于50kGy至300kGy范围内、优选在50kGy至200kGy范围内、极其优选在50kGy至150kGy范围内、更优选在50kGy至120kGy范围内、还更优选在50kGy至110kGy范围内。
[0182] 在另一实施方式中，本发明涉及使用一种装置以生成电子射线以在液态成分中、优选液态免疫原成分中、极其优选在疫苗中、尤其液态疫苗中灭活病毒。
[0183] 在另一实施方式中，本发明涉及一种用于生成电子射线以制造灭活病毒全颗粒疫苗的装置的应用。
[0184] 在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，该装置适于发射低能或中能加速的电子射线，优选适于发射加速能在150keV与700keV之间的加速电子射线，更优选适于发射加速能在200keV与500keV之间的加速电子射线，还更优选适于发射加速能在250keV与400keV之间的加速电子射线。
[0185] 在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，该装置适于基本在常压大气下施加电子射线。
[0186] 在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，该装置适于提供50kGy至300kGy之间的电子射线剂量，优选在50kGy至200kGy之间，极其优选在50kGy至150kGy之间，更优选在50kGy至120kGy之间，还更优选在50kGy至110kGy之间。
[0187] 在根据本发明的应用的一种优选实施方式中，该装置适于提供1至300kGy之间的电子射线剂量，极其优选在1至150kGy之间，还极其优选在10至120kGy之间的电子射线剂量，最极其优选在15至110kGy之间的电子射线剂量。
[0189] 图1示出了在利用电子射线处理之后(灰色)以及没有辐照(黑色)的PRRS病毒活性。表示的是每mL病毒溶液的TCID50的值。剂量：100kGy。
[0190] 图2示出了在处理之后抗原完整性的结果。PRRS病毒利用电子射线(灰色)、甲醛(条纹)或完全没有(黑色)被处理。抗原的完整性利用由PRRSV感染的猪的多克隆血清通过培养来确定。表示的是在ELISA中的OD值(Optische Dichte,光密度)。剂量：100kGy。
[0191] 图3示出了在处理之后病毒包膜的完整性结果。PRRS病毒利用电子射线(灰色)、过氧化物(条纹)或完全没有(黑色)被处理。病毒包膜的完整性利用针对PRRSV壳(N-)蛋白的一种抗体来分析。表示的是在ELISA中的OD值。剂量：100kGy。
[0192] 图4示出了利用200kGy(E)或0kGy(NC)的低能电子来处理H3N8病毒，并通过TCID50测定来测量其活性。
[0193] 图5示出了利用流感阳性人的血清通过培养来确定抗原的完整性。值是在ELISA测试中的吸收信号。E:利用200kGy的电子射线剂量来处理H3N8病毒；NC:利用0kGy处理H3N8病毒(对照)。
具体实施方式
[0194] 例1：实验总结
[0195] 该实验比如利用PRRS病毒(porcine respiratory and reproductive failure syndrome virus,猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒)来实施。该病毒是来自动脉炎病毒科的一种单正链RNA病毒。该病毒感染猪，并在养猪工业中造成十亿数额的年损失。PRRSV在4
100μL液体介质中穿过电子射线，并以100kGy被辐照。所使用的病毒量是2*10TCID50每批。之后检查病原体的活性以及其抗原的保护。
100μL液体介质中穿过电子射线，并以100kGy被辐照。所使用的病毒量是2*10TCID50每批。之后检查病原体的活性以及其抗原的保护。
[0196] 对于活性确定，该病毒(以及未处理的对照)被提供于Marc145细胞，并在三天之后探测TCID50值。通过辐照获得了相对于对照的2.5对数级的活性降低(图1)。抗原的质量利用抗体通过测量来检查。为此检查已感染PRRSV疫苗株的猪的血清。这种利用活病毒的免疫接种导致在其完好的原始状态中针对该抗原的全面体液免疫反应。从而与来自如此免疫动物的多克隆抗体与抗原之间的结合程度是对于抗原完整性的直接指示。图2明确示出，猪血清与通过病毒辐照的PRRS病毒的结合特性几乎不发生变化。因此如所有抗原一样仍旧良好地处于其完好的原始状态中，虽然该病毒已被灭活了2.5对数级。为了进行比较，PRRS病毒还利用甲醛被灭活。该过程导致ELISA信号的明显降低，并从而导致抗原的明确的损坏。
[0197] 另外还检查该灭活过程在多大程度上损坏了病毒结构。这利用针对PRRSV的壳蛋白(N-)的一种抗体来测量。该蛋白质通过完整的病毒包膜而被保护，并且是抗体不可接触的。因此一个信号指示受损的病毒包膜。如图3所示，该病毒包膜在辐照之后保持完整，而在按照Amanna等人的(如上)的过氧化物激活情况下导致结构的明显损坏。这些数据表明，在电子射线情况下，灭活想必首先基于的是核酸的破坏，而抗原和病毒结构很大程度上保持不变。
[0198] 因此所述的用于制造灭活病毒颗粒的方法比如适于制造疫苗，其中其相对于甲醛具有明确的优点：抗原被更好地保存，并且可以放弃添加有毒的化学品。
[0199] 例2：材料和方法
[0200] 病毒结构、灭活以及辐照
[0201] Marc145细胞的细胞结构利用PRRSV(疫苗株DV)被感染。在三天之后活物质被取出，并在4℃下4,000x g被离心15分钟。如此被澄清的活物质被涂覆到15％蔗糖垫上，并在100,000x g下被超离心三个小时。活物质被取出，并且颗粒在无菌PBS(phosphate buffered saline,磷酸盐缓冲液pH 7.4)中再悬浮。在确定感染之后，该病毒悬浮液被调5
节到2*10TCID50/mL的浓度。该溶液的各100μL被放到6孔板中(其事先用0.5％琼脂糖涂覆)，并在50、100和200kGy下被辐照。负对照除了辐照之外都被相同地处理。
节到2*10TCID50/mL的浓度。该溶液的各100μL被放到6孔板中(其事先用0.5％琼脂糖涂覆)，并在50、100和200kGy下被辐照。负对照除了辐照之外都被相同地处理。
[0202] 在辐照之后，含病毒的溶液被取出，并被继续用于TCID50测量和抗原测量。PRRSV利用0.3％的甲醛被灭活22小时。之后甲醛通过透析再次从病毒悬浮液中被去除。通过过氧化物的灭活按照Amanna等的(如上)在H2O2中进行22小时，接着进行透析。
[0203] TCID50测量
[0204] 为了检查被辐照病毒的活性，病毒悬浮液的稀释系列(分别以1：10的倍比间隔)被放到96孔板中Marc145细胞上。三天后确定细胞病变效应(CPE)。该TCID50对应于其中50％的被感染细胞培养孔还具有CPE的稀释。
[0205] 抗原测量
[0206] 该病毒悬浮液(被辐照的和对照样本)的1.5μL在夜里在4℃下在96孔微孔板上被培养。在下一天按照标准协议来实施ELISA(酶联免疫吸附试验)。为了探测抗原而使用了PRRSV(疫苗株DV)感染的猪的血清(稀释1：100)。为进行探测而使用了一种二级抗-猪IgG抗体(缀合辣根过氧化物酶，Zymed)，稀释1：5000。
[0207] 用电子辐照
[0208] 包含PRRSV病毒的该成分为了进行辐照而薄薄地涂覆在一个大的琼脂糖平面上。具体按照如下来实施：
[0209] 1.)在PBS中形成0.5％的琼脂糖凝胶，
[0210] 2.)以1mm的层厚度把凝胶倒到凝胶浇注设备中，
[0211] 3.)把凝胶切出3.5cm直径的圆形，
[0213] 5.)放弃100μL的病毒悬浮液(剂量测量负对照是单纯的PBS，作用时间约15分钟)，
[0214] 6.)用PET/PE薄膜进行封装，
[0215] 7.)在如下所述条件下进行辐照。
[0216] 通过在空气中对各个100ml介质的准稳态辐照来进行辐照。
[0217] 采用了连续运行的电子带状辐照器(Navarone型，生产商：COMET)。电子被加速到150keV，辐照电流为5mA。在包含PRRSV病毒的成分与该电子出射窗口之间的空气间距：45mm。
[0218] 以分别25kGy的单步来进行50、100和200kGy能量剂量的施加(对应于以各115mm/秒情况下2、4或8个样本行程或线性通行距离)。可以在常压大气中以约±10％的精确度来达到目标剂量。
[0219] 在光谱学上借助副品红氰化物剂量测量薄膜和 系统在554nm测量波长下来进行所施加剂量的记录。对于100kGy的辐照，该剂量测量薄膜被向后变换(gewechselt)50kGy，因为前述的剂量测量方式具有最大80kGy的测量范围。对于200kGy的目标剂量，该剂量测量薄膜被相应地向后变换50、100和150kGy。
[0220] 零样本表示没有剂量记录，也即所施加的剂量仅仅通过电子射线处理而回收，并且与PBS以及琼脂糖凝胶的接触不造成剂量测量条的变化。
[0221] 例3：流感病毒的辐照
[0222] A型流感病毒(马流感H3N8、株A/马2/迈阿密/1/63)被加到MDCK细胞上，并与PRRS病毒类似(例1和2)通过超离心而浓缩。
[0223] 同样与例1和2类似地进行电子射线的辐照，但剂量为0kGy(对照)和200kGy。
[0224] 通过TCID50终点测定来进行活性测量。该抗原利用A型流感感染人的血清以ELISA格式而被检查。
[0225] 如在PRRSV中一样进行了该流感病毒的灭活。在200kGy的剂量下，在细胞结构中不再能够检测到活性病毒(图4)。但抗原仍旧存在并很大程度上保持不变(图5)。
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