一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法
阅读：686发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 猪繁殖与呼吸综合症 病毒M蛋白与CD40L融合 疫苗 及制备方法，猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要 氨 基酸序列；用基因重组技术将M基因与免疫共刺激分子CD40配体(CD40L)连接成重组融合蛋白，并将融合基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，IPTG诱导并表达重组融合蛋白，通过包涵体纯化重组蛋白。本发明的有益效果为：重组融合蛋白可用于PRRSV感染的 预防 及 治疗 。，下面是一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法专利的具体信息内容。
一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及
制备方法
技术领域
背景技术
[0002] M蛋白是PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白，它有一个短肽段(18aa)暴露于病毒粒子表面，可能与病毒的聚集和结合有关。M蛋白聚集于粗面型内质网上，并与GP5形成异源二聚体，在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染过程中起重要作用。M蛋白具有很强的免疫原性，感染后10d即可激发产生可检测的抗体应答，表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原和亚单位疫苗，M蛋自在细胞免疫中起重要作用。CD40L具有刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，诱导B淋巴细胞分化。此外，它还作用于抗原呈递细胞(APC)，促进CD28、B7-1和B7-2等免疫共刺激分子的表达，提高APC的抗原递呈能力，增强免疫应答反应。 发明内容
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
[0005] 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列。
[0006] 上述猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 1)采用基因重组技术将PRRSV的M基因与CD40L的cDNA基因连接形成融合基因； [0008] 2)将融合基因克隆到原核表达载体pET30a的克隆位点上，通过IPTG诱导表达，液相色谱纯化重组融合蛋白。
[0009] 本发明的有益效果为：用重组融合蛋白的混合弗氏免疫佐剂皮下接种猪，检测特异性IgG抗体和中和抗体滴度，验证重组融合蛋白的体液免疫水平；细胞免疫是抗细胞内感染免疫的主要形式，此重组PRRSV疫苗通过将M蛋白与CD40L的融合，能刺激机体产生抗PRRSV的细胞免疫；免疫后进行攻毒实验，结果证实可以有效地抑制PRRSV感染，降低受感染的猪的死亡率；此外，该融合蛋白抗原特异性高，不会引起非特异性免疫反应，可作为预防和治疗性疫苗在临床的应用。附图说明
[0011] 图2为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M基因核苷酸序列；
[0012] 图3为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的CD40L蛋白质氨基酸序列；
[0013] 图4为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的CD40L基因核苷酸序列；
[0014] 图5为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M-CD40L融合蛋白质氨基酸序列；
[0015] 图6为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M-CD40L融合基因核苷酸序列。
具体实施方式
[0016] 本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附图1所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附图3所示；M基因核苷酸序列如附图2所示，CD40L基因核苷酸序列如附图4所示，M-CD40L融合蛋白氨基酸序列如附图5所示，M-CD40L融合基因核苷酸序列如附图6所示。
[0017] 实施例1M基因克隆到原核表达载体pET30a
[0018] 1、设计M基因引物
[0019] 参考PRRSV的M基因序列(GenBank号：DQ379480)设计扩增PRRSV病毒的M基因引物如下，引入酶切位点为EcoR I和Xho I(用斜体表示)：
[0020] M-F-E：GC ATGGGGTCGTCCTTAGATGA，
[0021] M-R-X：GC TTATTTGGCATATTTGACAAG。
[0022] 2、提取PRRS病毒RNA
[0024] 3、PRRSV的M基因的反转录及PCR
[0025] 根据invitrogen公司的RT-PCR试剂盒进行反转录，获得M-mRNA的cDNA。然后根据上述引物为PCR扩增M基因。
[0026] PCR反应条件如下：94℃4分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒；共30循环；72℃10分钟。结果得PCR产物约为525bp的目的片段。
[0027] 4、阳性重组质粒pET30a-M的获取
[0028] 1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收PCR产物及载体pET30a质粒：
[0029]PCR产物(M基因)或pET30a质粒 30μL
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
10×H buffer 4μL
H2O 4
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
10×H buffer 4μL
H2O 4
[0030] 37℃酶切反应2小时后，电泳回收目的条带，按下列体系连接载体与PCR片段： [0031]PCR产物(M基因) 7μL
pET30a质粒 1μL
T4 ligase 1μL
10×T4buffer 1μL
pET30a质粒 1μL
T4 ligase 1μL
10×T4buffer 1μL
[0032] 16℃反应5小时后，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有M基因的载体命名为pET30a-M。
[0033] 实施例2CD40L基因克隆到原核表达载体pET30a
[0034] 1、设计CD40L基因引物
[0035] 参考猪CD40L基因序列(GenBank号：AB040443)设计扩增CD40L基因引物如下，引入酶切位点为EcoR I和Xho I(用斜体表示)：
[0036] CD40L-F-E：GC ATGATCGAAACGTACAGC；
[0037] CD40L-R-X：GC TCAGAGTTTGAGGAGGCC。
[0038] 2、提取CD40L总RNA
[0039] 根据invitrogen公司的RNA提取试剂盒，从猪肾细胞系PK15细胞中提取总RNA。 [0040] 3、CD40L基因的反转录及PCR
[0041] 根据invitrogen公司的RT-PCR试剂盒进行反转录，获得M-mRNA的cDNA。然后根据上述引物为PCR扩增CD40L基因。
[0042] PCR反应条件如下：94℃4分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃60秒；共30循环；72℃10分钟。结果得PCR产物约为786bp的目的片段。
[0043] 4、阳性重组质粒pET30a-CD40L的获取
[0044] 1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收PCR产物及载体pET30a质粒：
[0045]PCR产物(CD40L基因)或pET30a质粒 30μL
EcoR I 1μL
XhoI 1μL
10×H buffer 4μL
H2O 4
EcoR I 1μL
XhoI 1μL
10×H buffer 4μL
H2O 4
[0046] 37℃酶切反应2小时后，电泳回收目的条带，按下列体系连接载体与PCR片段： [0047]PCR产物(CD40L基因) 7μL
pET30a质粒 1μL
T4 ligase 1μL
10×T4buffer 1μL
pET30a质粒 1μL
T4 ligase 1μL
10×T4buffer 1μL
[0048] 16℃反应5小时后，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有M基因的载体命名为pET30a-CD40L。
[0049] 实施例3M-CD40L融合基因克隆到原核表达载体pET30a
[0050] 1、引物设计
[0051] 通过设计Linker序列(5段重复序列GGGGS)将M和CD40L基因连接起来，设计如下引物：
[0052] M-F-E：GCGAATTCATGGGGTCGTCCTTAGATGA；
[0053] M-R-GGGGS：
[0054] GGACCCGCCTCCACCGGACCCGCCTCCACCGGACCCGCCTCCACCTTTGGCATATTTG； [0055] GGGGS-CD40L-F：
[0056] GGTGGAGGCGGGTCCGGTGGAGGCGGGTCCGGTGGAGGCGGGTCCATCGAAACGTACAG； [0057] CD40L-R-X：GCCTCGAGTCAGAGTTTGAGGAGGCC。
[0058] 2、PCR扩增融合基因M-CD40L
[0059] 以M和CD40L的PCR产物为模板，通过上述4条引物扩增得到融合基因M-CD40L，PCR反应条件如下：94℃4分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃90秒；共30循环；72℃10分钟。结果得PCR产物约为1350bp的融合基因M-CD40L目的片段。
[0060] 3、阳性重组质粒pET30a-M-CD40L的获取
[0061] 1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收PCR产物及载体pET30a质粒：
[0062]M-CD40L基因或pET30a质粒 30μL
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
10×H buffer 4μL
H2O 4
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
10×H buffer 4μL
H2O 4
[0063] 37℃酶切反应2小时后，电泳回收目的条带，按下列体系连接载体与PCR片段： [0064]M-CD40L基因 7μL
pET30a质粒 1μL
T4 ligase 1μL
10×T4buffer 1μL
pET30a质粒 1μL
T4 ligase 1μL
10×T4buffer 1μL
[0065] 16℃反应5小时后，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有M基因的载体命名为pET30a-M-CD40L。
[0066] 实施例4蛋白(M、CD40L、M-CD40L)的诱导表达及纯化
[0067] 将pET30a-M，pET30a-CD40L及pET30a-M-CD40L阳性重组质粒转化表达菌株-大肠杆菌BL21(DE3)，获得的含有pET30a-M，pET30a-CD40L及pET30a-M-CD40L的阳性克隆命名为BL21-pET30a-M，BL21-pET30a-CD40L及BL21-pET30a-M-CD40L。
[0068] 扩增培养工程菌BL21-pET30a-M、BL21-pET30a-CD40L及BL21-pET30a-M-CD40L，37℃，200转/分(旋转半径为13mm)振摇培养菌液OD600至1.0，在16℃下加入IPTG(0.25mM)诱导10～14小时。培养结束后，进行如下处理：10000g、离心10分钟收集菌体经PBS重悬，超声破菌，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果显示，分别在26、33、55kDa左右处出现一条蛋白条带，与M、CD40L和M-CD40L蛋白大小相符，表明重组M、CD40L和M-CD40L蛋白在大肠杆菌中正确表达。
[0069] 另将沉淀进行一系列纯化后，SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图3所示，条带单一，表明获得纯度极高的重组M、CD40L和M-CD40L蛋白，可以进行下一步的动物免疫试验。 [0070] 实施例5动物实验——免疫猪及攻毒
[0071] 选取50头4周龄PRRSV病毒阴性和抗体阴性小猪作为实验动物，随机均分为如下5组：
[0072]
[0073] 将各组蛋白与弗氏佐剂(第一次为弗氏完全佐剂，第二、三次为弗氏不完全佐剂)混合乳化后，按上面的方法免疫小猪。1～4组在免疫了3次后的第14天采集全血15ml，6
同时攻毒VR2332-PRRSV，剂量为10TCID50/头，采集攻毒后第0、3、7、11、14、21天猪血，分离血清，并记录猪死亡情况。
同时攻毒VR2332-PRRSV，剂量为10TCID50/头，采集攻毒后第0、3、7、11、14、21天猪血，分离血清，并记录猪死亡情况。
[0074] 实施例6体液免疫水平检测实验——IgG抗体和中和抗体检测
[0075] 采集3免后第14天的猪血，分离血清，用ELISA检测M-特异性抗体和用血清-病毒中和实验检测PRRSV-中和抗体滴度，确定该疫苗的体液免疫水平。
[0076] 结果显示，M蛋白能激发猪产生特异性抗体和PRRSV-中和抗体，并且CD40L能显著提高抗体滴度3～4倍，说明该疫苗M-CD40L能显著诱发机体的体液免疫。 [0077] 实施例7细胞免疫水平检测实验——外周血单核淋巴细胞(PBMC)增殖实验 [0078] 采集3免后第14天的猪血，分离外周血单核淋巴细胞(PBMC)，做淋巴细胞增殖实验，检测该疫苗的细胞免疫水平。
[0079] 结果显示，单独的M蛋白免疫能够产生特异性细胞免疫，M-CD40L融合蛋白免疫所产生特异性细胞免疫效应更强，说明该疫苗M-CD40L能显著诱发机体的细胞免疫。 [0080] 实施例8攻毒后，猪体内病毒滴度检测
[0081] 采集攻毒后第0、3、7、11、14、21天猪血，分离血清，提取RNA，用Real-timeRT-PCR定量检测病毒的N基因的RNA水平，用以代表猪体内的病毒含量：
[0082] 引物-5’：AAT AACAACGGCAAGCAGCAG；
[0083] 引物-3’：CCT CTGGACTGGTTTTGTTGG。
[0084] 结果显示，免疫了疫苗M-CD40L的猪体内病毒含量明显低于疫苗M组，而这两组猪体内病毒含量明显低于PBS和CD40L组，说明该疫苗M-CD40L能保护小猪免受病毒攻击。 [0085] 实施例9攻毒后，猪死亡率/存活率检测
[0086] 攻毒后记录猪死亡情况，结果如表1，免疫了疫苗M-CD40L组的死亡率仅为10％，PBS和CD40L组为90％，M组为50％，说明基于蛋白M的疫苗能显著降低死亡率，提高小猪存活率。
[0087] 表1，攻毒后检测猪死亡率及存活率
[0088]
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