一种抗猪瘟的转移因子
专利汇可以提供一种抗猪瘟的转移因子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种天然高效抗 猪瘟 病的转移因子，使用本发明的转移因子可以起到 预防 猪瘟病、保护正常机 体细胞 免受猪瘟病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪瘟病 病毒感染 的猪使用该转移因子进行 治疗 ，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。其制备方法包括：制备病毒 抗原 、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪、从免疫猪的脾脏中提取抗猪瘟病转移因子等步骤。，下面是一种抗猪瘟的转移因子专利的具体信息内容。
1、一种抗猪瘟病的转移因子。
2、权利要求1所述的转移因子，其制备方法包括：
(1)先用注射用水洗净用猪瘟病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面 的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用 高速组织捣碎机1000～3000rpm捣碎3～5次，每次3～5min，制得猪脾匀浆 液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5～10min；
(4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％ 柠檬酸，4℃，3000～8000rpm离心10～30min，收集上清液；
(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000 道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；
(6)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪瘟 病病毒转移因子原液，4℃保存。
3、权利要求2的转移因子，其中在实施上述步骤之前，还包括制备病毒抗 原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪等步骤。
4、权利要求3的转移因子，其中所述的制备病毒抗原步骤，包括：将猪瘟 病病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊液30～40℃培养24～72h。取鸡胚尿囊液， -20℃反复冻融4～8次，3000～8000rpm离心10～30min，弃去沉淀收集上清 液。
5、权利要求3的转移因子，其中所述的提取病毒抗原步骤，包括：上清液 用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10％～80％， 150000～200000rpm离心2～4小时，根据猪瘟病病毒分子量确定猪瘟病病毒 所在离心管的位置，吸出备用。
6、权利要求3的转移因子，其中所述的病毒抗原免疫猪步骤，包括：挑选 健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3～5次。 每次免疫间隔一周，最后一次免疫7～10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或 ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后， 宰杀猪，取脾脏于-20℃保存，备用。
7、权利要求1或2或3的转移因子，其中猪瘟病毒株选自本申请人保藏的 CSFV 39(Genbank accession NO.J04358)和/或BVDV(Genbank accession NO. U63479)。
技术领域
本发明涉及药物及其制剂领域，更具体地说，是涉及一种抗猪瘟的转 移因子。
背景技术
猪瘟临床症状主要有一下几种：
1、急性猪瘟。病猪体温升高至40—42℃，精神沉郁、怕冷、嗜睡；病 初便秘，随后出现糊状或水样并混有血液的腹泻，大便恶臭；结膜炎、口 腔粘膜不洁、齿龈和唇内以及舌体上可见有溃疡或出血斑；后期鼻端、唇、 耳、四脚、腹下及腹内侧等处皮肤上有出血点或斑。常继发细菌感染，以 肺炎或坏死性肠炎多见。
2、慢性猪瘟。病猪体温升高不明显；贫血、消瘦和全身衰弱，一般病 程超过一个月；食欲时好时坏，便秘和腹泻交替发生；耳尖、尾根和四肢 皮肤坏死或脱落。慢性猪瘟存活者严重发育不良，成为僵猪。
3、非典型猪瘟。又称亚临床猪瘟。临床症状与解剖病变不典型，发病 率与死亡率显著降低，病程明显延长，新生仔猪感染死亡率较高，大猪一 般能耐过；怀孕母猪感染出现流产，出现胎儿干尸，死胎及畸形胎。
4、迟发型猪瘟。是先天感染的后遗症，感染猪出生后一段时间内不表 现症状，数月后出现轻度厌食、不活泼、结膜炎、后躯麻痹，但体温正常， 可存活半年左右后死亡。怀孕母猪感染低毒力猪瘟病毒可表现群发性流产、 死产、胎儿干尸化、畸形和产出震颤的弱仔猪或外观健康实际已感染的仔 猪。
尽管目前市场上有一些抗猪瘟的临床用药，但是现有药剂的争对性不 强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是发病后采用的，不能起到预防的作 用。对于易感染猪瘟的猪群。每年定期的对猪接种猪瘟病毒疫苗是预防猪 瘟的有效方法，其次应增强营养或药物干预，提高自身免疫力，通过药物 提高机体抵抗力或免疫力也是一种预防猪瘟的有效方法。
转移因子(TF，Transfer Factor)是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽 与核苷酸复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、 增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细 胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。转移因子分子量 小、无毒、无抗原性、不起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越种系界限 应用等优点。自美国著名的免疫学专家Lawrence发现和研究转移因子以来， 世界各国不但进行了许多理论研究，而且进行了大量的临床应用研究，使 得转移因子成为目前应用广泛的增强免疫制剂。
目前已报道的提取的转移因子大多数都是关于非特异性转移因子的制 备方法。本发明采用特殊病毒株病毒免疫抗原的方法提取特异性的转移因 子，提取方法在已报道的传统方法基础上加以改进，缩短生产时间，简化 生产工艺。
采用特殊病毒株免疫抗原提取抗猪瘟病毒的转移因子，具有重要的理 论和现实意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种简单有效的抗猪瘟病转移因子的制备 方法，步骤包括：
(1)先用注射用水洗净用猪瘟病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面 的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用 高速组织捣碎机1000～3000rpm捣碎3～5次，每次3～5min，制得猪脾匀浆 液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5～10min；
(4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％ 柠檬酸，4℃，3000～8000rpm离心10～30min，收集上清液；
(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000 道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；
(6)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪瘟 病病毒转移因子原液，4℃保存。
在具体实施方案中，实施上述步骤之前，步骤还包括制备病毒抗原、 提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪的步骤。这些步骤，可选用常规技术实施。 其中，所述的制备病毒抗原步骤，优选：将猪瘟病病毒接种于9～11日龄鸡 胚尿囊液30～40℃培养24～72h。取鸡胚尿囊液，-20℃反复冻融4～8次， 3000～8000rpm离心10～30min，弃去沉淀收集上清液。其中，所述的猪瘟病 病毒株来自病毒株E2或CSFV39株或BVDV株等。在一个优选实施方案中， 猪瘟病病毒株选自本申请人保藏的CSFV39(Genbank accession NO.J04358) 和/或BVDV(Genbank accession NO.U63479)。
所述的提取病毒抗原步骤，优选：上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提 取病毒，蔗糖浓度为10％～80％，150000～200000rpm离心2～4小时，根据猪 瘟病病毒分子量确定猪瘟病病毒所在离心管的位置，吸出备用；
所述的病毒抗原免疫猪步骤，优选：挑选健康免疫猪，将上述提取的 病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3～5次。每次免疫间隔一周，最后 一次免疫7～10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的 特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保 存，备用。
本发明的第二个目的在于提供通过上述方法所制备的转移因子。
在一个优选实施方案中，上述方法使用的猪瘟病病毒株选自本申请人 保藏的CSFV39(Genbank accession NO.J04358)和/或BVDV(Genbank accession NO.U63479)。
由于转移因子是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物， 目前并没有明确的组分或结构，制备方法或所用病毒株的不同，所得的转 移因子也会差异，因此通常在生产过程中是通过限定制备方法和所用病毒 株来明确转移因子。在本发明中，由于限定了具体的制备方法和特异的病 毒株，因此所得到的转移因子具有组分稳定、纯度高、活性好等特点，具 有很好的应用前景。
技术效果
本发明的一种抗猪瘟病毒转移因子的制备方法，具有以下优点：
1、猪脾脏属于屠宰场的下脚料，原料来源容易；
2、组织经组织捣碎机捣碎后，采用大功率的超声波设备处理，缩短反 复冻融时间，而且也避免了因高压均质机破壁处理时由于筋膜的存在而 堵塞高压均质机；
3、离心前用稀盐酸调节pH，使大部分蛋白絮凝，使得离心后的上清液 的澄清度明显好于以前的方法；而且有利用后续的微滤、超滤操作；
4、在匀浆液中加入0.1～0.3％柠檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，简化后 面的离心处理；
5、本发明既可基于前期的常规病毒抗原免疫步骤，又可优选本发明的 免疫步骤，具有灵活高效的优点。
6、所述转移因子的提取方法，显著地缩短了生产时间，简化了生产工 艺。
7、提取物经体外生物活性试验及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、 免疫活性起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗 效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服、 注射、喷雾等剂型，便于使用。
8、本发明所用的病毒株，属于申请人保藏的CSFV 39(Genbank accession NO.J04358)和/或BVDV(Genbank accession NO.U63479)，与常规猪瘟病 毒株相比，具有更高的免疫原性，因而采用该病毒株免疫抗原的方法所 提取的转移因子，包含特异性好和纯度高的低分子肽与核苷酸复合物， 其活性水平明显优于常规方法和常规病毒株所制备的转移因子。
具体实施方式
实施例1：抗猪瘟转移因子的制备
1、将猪瘟病毒株CSFV39(Genbank accession NO.J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO.U63479)接种于9～11日龄鸡胚尿囊液37℃培养 48h。取鸡胚尿囊液，-20℃反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉 淀收集上清液；
2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，150000rpm离心4小 时，根据猪瘟病毒分子量确定猪瘟病毒所在离心管的位置，吸出备用；
3、得到的猪瘟病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒 抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次 免疫7天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异 性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保存， 备用；
4、从得到的猪脾脏提取抗猪瘟转移因子：
(1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，冉用生 理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高 速组织捣碎机2000rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀浆液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5min；
(4)将(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0，4℃，5000rpm离心30min， 收集上清液；
(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，收集滤出液；
(6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集 滤出液；
(7)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；
(8)分装，4℃保存，即得到抗猪瘟病毒转移因子原液。
实施例2：抗猪瘟转移因子的制备
1、将猪瘟病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊液37℃培养72h。取鸡胚尿囊 液，-20℃反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液；
2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为 15％、30％、45％、60％、75％，180000rpm离心3小时，根据猪瘟病毒 分子量确定猪瘟病毒所在离心管的位置，吸出备用；
3、得到的猪瘟病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒 抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次 免疫10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特 异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20℃保 存，备用；
4、从得到的猪脾脏提取抗猪瘟转移因子：
(1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生 理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高 速组织捣碎机1500rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀浆液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理10min；
(4)将(3)中得到的匀浆液用加入0.1％柠檬酸，混匀，4℃，6000rpm 离心30min，收集上清液；
(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，收集滤出液；
(6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集 滤出液；
(7)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；
(8)分装，4℃保存，即得到抗猪瘟病毒转移因子原液。
实施例3：对本发明所述工艺制备的抗猪瘟转移因子的检测
对实施例1、2所述工艺制备的抗猪瘟转移因子进行以下检测：
1、紫外分光光度测定：上述所得样品在252±2nm处有一吸收峰，且 ABS260/ABS280>2.0。
2、标准液为淡黄色，pH值在6.0～8.0之间。
3、细菌学检验：上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
4、20％磺基水杨酸检测：上述所得样品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白 反应均成阴性，其不含大分子蛋白质。
5、核酸含量测定：上述所得样品经地衣酚法测定核酸含量分别为 578.53μg/mL、521.68μg/mL。
6、多肽含量测定：上述所得样品经Lowry法测定多肽含量分别为： 6.89mg/mL、6.45mg/mL。
7、转移因子活性测定：根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢 复其受体功能，从而反应转移因子的生物活性。上述所得样品形成E玫瑰 花结的百分率分别为28.6％、26.9％，比对照组分别增加18.5％、16.8％ (P≤0.01)。
8、过敏性、毒性试验：取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品浓 缩液，相当于正常口服剂量的100倍，观察小白鼠的生存能力的变化，结 果：无任何过敏、毒性反应，也无任何死亡出现，说明本品是安全的，无 任何毒性和副作用。
9、用猪瘟抗原做皮试检测，有弱的阳性反应，说明本品具有良好的转 移活性和特异性。
通过上述实施例，我们发现所提取的抗猪瘟病转移因子可以全面抑制 猪瘟病病毒，能保护正常机体细胞免受猪瘟病病毒的感染。因此使用本发 明的转移因子可以起到预防猪瘟病、保护正常机体细胞免受猪瘟病病毒侵 害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪瘟病病毒感染的猪使用该 转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
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