技术领域

本发明涉及一种采用共焦成像系统自动测量微生物生物膜的发育 的方法，以及涉及确定测试化学物质对微生物基因表达和生物膜发育 的影响的方法。

本发明的背景技术

微生物生物膜由附着于表面或者界面并且通常嵌入细胞外多聚糖 基质的同类或异类微生物群体组成(Costerton等，1995，Annual Review of Microbiology，41，435-464)。这些生物膜可以在几乎 任何湿的表面上迅速形成，代表了该环境中微生物集落的正常模式 (Wood等，2000，Journal of Dental Research，79，21-27)。尽 管生物膜的发育通常与细菌有关，但是许多微生物包括真菌和藻类也 可以形成生物膜。

在工业中，微生物生物膜引发了普遍存在的问题，污染机器、堵塞 管道、附着于水上设备和运输船只的船体。生物膜在医药领域也是较 为严重的问题，大量的人类感染均涉及生物膜，例如龋齿、牙周炎以 及囊性纤维化肺炎(Costerton等，1999，Science，284，1318-1322)。 由于医疗设备污染而引发的感染通常是由以生物膜形式存在的细菌所 导致的(Gorman等，1994，Epidemiological Journal，112，551- 559)。

与自由游动的浮游细菌相比，生物膜中的细菌通常表现为显著不同 的表型，其在工业和医学上可以引发严重的问题。其中最重要的是， 这些细菌对抗生素治疗的耐药性增加。Soukos等(Pharmaceutical Research，2000，17，405-409)报道了，与相同种类的浮游细胞相 比，生物膜内的细菌对抗生素治疗的敏感性低1500倍。

近来的研究表明，在生成细胞外基质和形成生物膜的过程中所涉及 的微生物和活性基因持续分泌被称为“定额传感信号”的分子。目前 人们已经着手生产这些天然产生的信号的分子模拟物，使之与微生物 受体位点结合，从而控制生物膜的形成(Costerton & Stewart，2001， Scientific American，7月，61-65)。

因此，控制微生物生物膜向多种工业提出了重大的挑战，包括食 品、卫生、消费品、工程和制药工业。在最近十年，人们已经在该问 题上做了大量的工作，但是由于缺乏适当的筛选检测，发现和研究出 有效的抗生物膜的新型抗微生物制剂的尝试受到了阻碍。尽管可以通 过高通量的筛选技术很容易地对浮游微生物进行检测，但是，就生物 膜对抑制剂、定额传感信号模拟物或拮抗剂的敏感性的生成和评价需 要花费大量的劳动和时间，而且在技术上存在着困难。

确定一种因素对生物膜生长和发育的影响的检测或方法必须涉及 对生物膜的发育和结构的评价。由于电子显微技术具有高的分辨率， 其通常被选择作为研究生物膜的组成和结构的方法(Listgarten， 1976，Journal of Periodontology，47，1-18)。但是，该技术是 非常耗时的，其制备过程可能导致结构变形，而且不适用于高通量筛 选。

激光扫描共焦显微技术(LSCM)的出现解决了大量的上述与电子显 微技术有关的问题，所述激光扫描共焦显微技术能够对自然状态的生 物膜结构进行研究，不需要脱水、固定或染色。LSCM的光截面性能可 以在整个生物膜上沿着不断增加的深度得到非常薄的光截面(近似0.3 μm)，而不会产生由于焦点没有对准而导致的模糊。自发荧光的分子 (例如，绿色荧光蛋白)或荧光标记的探针被激发，通过光电倍增管 检测所得到的荧光，产生数字图像。所述数字化数据可以被重新组合 得到有关结构的三维信息。目前，共焦显微技术已经被用于研究生物 膜的结构(Wood等，2000，Journal of Dental Research 79，21- 27)、生理学和生物化学(Palmet & Sternberg，1999，Current opinion in biotechnology 10，263-268)。但是，上述研究需要花费大量的 时间，其具有高度的特异性，只能对一种或两种特定的生物膜结构进 行研究。

虽然LSCM提供了一种优异的研究生物膜形态学、结构和组成的工 具，但是由于其成像和数据获取过程非常缓慢，因此，其并不是一个 显而易见的用作高通量筛选平台的选择。Kuehn等(Applied and Environmental Microbiology，1998，64，4115-4172)报道了一种 分析生物膜的“自动”LSCM，所述发明的核心是用于半自动图像分析 的计算机程序。所述系统基于点扫描检测方法，并涉及需要用户输入 /干预的“离线”半自动图像分析。这些数据获取和分析方法以及采 用“玻璃液流单元”用于生物膜的生长严重限制了该方法在自动化和 高通量筛选上的应用。美国专利6326190中公开了其它评价试验因素 对生物膜的影响的筛选方法，在该申请中，采用了大量的方法例如菌 落计数和活体染色来确定生物膜的生长。但是，需要特别注意的是， 在采用共焦显微技术进行自动检测的问题较为突出。

本发明解决了上述与采用基于LSCM方法有关的问题，所述方法用 于分析生物膜的发育，可以进行自动检测。而且，本发明的方法提供 了一个平台，对生物膜生长和发育的新型调节剂进行高通量筛选。与 基于文献(例如WO9601438)所描述的图像内容分析的自动聚焦方法 相反，本发明采用了位置传感分析。

WO9947963中公开了一种“共焦显微成像系统”，采用线扫描共焦 成像系统和辅助的数据处理程序，在细胞提取物、细胞或高级生物体 的组织上进行各种检测，从而鉴别有助于疾病诊断和治疗的药物制 剂。所述成像系统可以对单个细胞和群体进行多参数荧光成像，从而 可以非常快速地进行化合物筛选。所述系统能够以高分辨率确定荧光 团的存在。但是，该申请中没有公开任何有关使用该系统表征微生物 群体、生成其三维图像或分析生物膜的发育的内容。而且，WO9947963 中描述的图像分析运算法则仅仅适合于分析来自单个平面的数据，而 不适用于来自多个平面的数据。

本申请人发现共焦成像系统，例如WO9947963中所描述的，当与本 发明的图像分析方法结合使用时，可以用于表征生物膜，并可作为对 调节生物膜发育的化合物进行高通量筛选的平台。Goodyer等人于 2001年在Society for Biomolecular Screening，7th Annual Conference and Exhibition，巴尔的摩，USA Screening and signaling events in live cells using novel GFP redistribution assays中报道了IN Cell Analyzer及其在高通量筛选中的应用。

本发明的简要描述

根据本发明的第一方面，提供了一种采用共焦成像系统在多表面上 测量生物膜发育的自动方法，所述共焦成像系统包括：

a)形成包括一个或多个波长的电磁辐射光束的装置；

b)将所述光束指向并聚焦于生物膜的一个或多个平面的装置；

c)检测由所述生物膜发出的电磁辐射的检测装置；以及

d)用所述电磁辐射在多个平面上扫描生物膜的扫描装置，

所述方法包括以下步骤：

i)在多个表面上生长生物膜；

ii)用电磁辐射在多个平面上扫描生物膜，检测生物膜内一个或多 个荧光部分的存在，从而生成多个图像；以及

iii)在计算机软件的控制下通过数据处理系统分析所述图像，从 而确定生物膜的结构。

生物膜是对周围环境产生响应的动态结构(Watnick & Kolter， 2000，Journal of Bacteriology，182，2675-2679)。在本发明上 下文中，当词语“发育”用于生物膜时，其用于描述生物膜的生长、 停滞或退化。

在优选实施方式中，提高数据获取速度的装置为：

a)光束形成装置，用于生成延长的包括一个或多个波长的电磁 辐射光束，所述光束横向延伸至辐射传播所沿的光轴；

b)指向和聚焦装置，将所述延长的光束聚焦至位于第一平面内 的第一延长区域上，所述生物膜位于第一平面内，并将生物膜发出的 电磁辐射指向一个或多个第二延长区域，其中每个第二延长区域位于 与第一平面共轭的不同的第二个平面上。

c)在至少一个第二共轭平面，或在与至少一个第二共轭平面共 轭的第三平面内，检测装置包括一个检测元件的矩形阵列，所述对象 发出的电磁辐射与其重合；以及

d)扫描装置，相对于所述生物膜移动延长光束或相对于延长光 束移动生物膜从而对生物膜进行扫描，发出的电磁辐射传送至检测元 件的矩形阵列，并通过检测元件转化为多个电信号，所述信号代表了 发出的与扫描同步的电磁辐射。

优选地，在进行图像分析之前，所述方法还另外包括恢复每个图像 的步骤。图像恢复是指为了提高图像质量或者获得不能从所观察的图 像轻易得到的信息而对模糊的具有噪声的观察图像进行恢复的问题。 影响空间分辨率的因素主要是发出的光子的散射和由于成像系统导致 的偏差和变形。如果需成像的对象相对于光源至准直器的距离较小， 所述退化现象可以认为是近似漂移恒定的，并且，忽略噪声，可以通 过未变形图像和成像系统的转移函数之间的卷积过程进行模拟。文献 中报道了许多图像恢复的方法。例如，Wiener滤波器、基于子波的规 则化、监督去卷积方法、迭代盲去卷积法等。不同方法之间的比较参 见例如Lixin Shen，2002，Journal of Electronic Imaging，11， 5-10或Mignotte等，2002，Journal of Electronic Imaging(2002)， 11，11-24。

适当地，所生成的电磁辐射光束包括一个或多个在350-700nm范 围内的波长。波长的优选范围为354-374nm，403-423nm，478-498nm， 560-580nm，637-657nm和680-700nm。优选波长包括364nm，413nm， 488nm，570nm，647nm和690nm。

适当地，所述荧光部分为生物膜内微生物的内在特征。

优选地，所述荧光部分是生物膜内微生物所表达的基因的产物。例 如，所述微生物可以通过基因转化从而以组成型或诱导性方式表达所 述基因。更优选地，所述基因可以含有已经被改变从而优化表达微生 物的荧光部分的密码子。

优选地，所述基因编码荧光蛋白。已经从多种生物体中分离出荧光 蛋白和生色蛋白的荧光蛋白衍生物，包括Aequoira Victoria，Anemonia种属，例如A.majano和A.sulcata，Renilla种 属，Ptilosarcus种属，Discosoma种属，Claularia种属， Dendronephthyla种属，Ricordia种属，Scolymia种属，Zoanthus 种属，Montastraea种属，Heteractis种属，Conylactic种属和 Goniopara种属。

衍生自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(GFP)的应用已经使 研究工作革命性地进展至细胞和分子生物过程。然而，由于野生型(天 然)GFP(wtGFP)的荧光特性，其用作细胞指针并不是很理想，人们 在制备不同的GFP变异形式方面作了很大的努力，所述变异形式的性 质更加适合用作细胞内指针(Heim等，1994，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，91，12501；Ehrig等，1995， FEBS Letters，367，163-6；WO9627675；Crameri，A等，1996，Nature Biotechnology，14，315-9；US6172188；Cormack，B.P.等，1996， Gene，1973，33-38；US6194548；US6077707以及英国专利申请号 0109858.1(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd))。英国专利 申请No.0109858.1中公开的优选实施方式包括选自由以下构成的组 的GFP衍生物：

F64L-V163A-E222G-GFP，F64L-S175G-E222G-GFP，F64L-S65T- S175G-GFP以及F64L-S65T-V163A-GFP。

优选地，所述荧光蛋白为具有一个或多个突变的经修饰的GFP，所 述突变选自由以下构成的组：Y66H，Y66W，Y66F，S65T，S65A，V68L， Q69K，Q69M，S72A，T203I，E222G，V163A，I167T，S175G，F99S， M153T，V163A，F64L，Y145F，N149K，T203Y，T203Y，T203H，S202F 和L236R。最优选地，所述荧光蛋白为具有三个突变的经修饰的GFP， 所述突变选自由以下构成的组，F64L-V163A-E222G，F64L-S175G- E222G，F64L-S65T-S175G以及F64L-S65T-V163。

优选地，所述荧光部分为能够监测生物膜内环境变化或酶活性的生 物传感器。例如，所述部分可以是荧光生物传感蛋白，其对生物膜内 PH的改变产生响应(例如，Llopisis等，1998，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)95，6803-6808)或对特定离 子浓度敏感，例如钙离子。

可选择地，所述荧光部分由酶对化合物的作用而产生。优选地，所 述酶选自由以下构成的组：β-半乳糖糖苷酶，硝基还原酶，碱性磷 酸酶和β-内酰胺酶。所述酶可以由微生物天然表达或者是微生物经 过遗传转化而以诱导型或组成型方式表达的酶。

在优选实施方式中，所述方法另外还包括在进行检测步骤之前将荧 光化合物添加至生物膜。

优选地，所述荧光化合物选自由以下构成的组：Hoechst 33342， Cy2，Cy3，Cy5，CytoCy5，CypHer，香豆素，FITC，DAPI，Alexa 633 DRAQ5，Alexa 488，吖啶酮，喹吖啶酮，荧光标记蛋白质，荧光标记 凝集素和荧光标记抗体。“吖啶酮”和“喹吖啶酮”是指WO02099424 和02099432中分别公开的荧光化合物。可选择地，在进行检测步骤之 前，可以将未结合的荧光化合物从每个容器中除去。

优选地，所述荧光化合物可以用于监测生物膜内环境的变化。因 此，例如，微生物生物膜的氧化还原电势和PH受到局部环境变化的影 响，所述变化可以通过本发明进行测量。pH敏感的染料，例如CyDye “CypHer”(参见Amersham Biosciences，基准PA15405)，可用于 确定生物膜内pH的变化。例如，与Cy5相比，CypHer在pH5.0时发 出95％的荧光，在pH7.4发出5％荧光，从而可以定量测量生物膜内 局部PH的变化。

可选择地，所述荧光化合物可用于测量生物膜内或周围的化学物质 的浓度，例如氧或钙的浓度，或特定蛋白质或核酸的浓度。

优选地，所述表面为容器形式。更优选地，所述容器为微滴定板。 所述微滴定板可以包括24、96、384个或更高密度的孔，例如864或 1536个孔。优选地，所述微滴定板具有透明的底部，从而可以通过底 部对生物膜进行成像(Gilbert等，2001，Journal of Applied Microbiology，91，248-254)。

适当地，通过对生物膜进行光学和共焦切割并随后进行3D体积分 析，所述方法能够确定生物膜内的微生物集落的大小。

适当地，通过对生物膜进行光学和共焦切割并随后进行3D体积分 析，所述方法能够确定生物膜的3D结构。

适当地，通过对生物膜进行光学和共焦切割并随后进行3D体积分 析，所述方法能够确定生物膜内微生物集落之间的距离分布。

适当地，所述方法能够确定生物膜结构内微生物集落的取向。所述 集落的取向可以受外力的影响，例如液流、重力、电场等。

适当地，所述方法能够确定生物膜结构内任意通道的存在和大小。 上述通道为营养物进入生物膜提供了进入路径，并为有毒废物离开生 物膜提供了出口路径。

因此，例如，从附图16A，C和D中可以看出，可以很容易地确定 生物膜结构内的通道，其中黑色区域代表通道。优选地，所述方法能 够确定生物膜结构内通道与其它通道之间的连接性，从而确定通道网 络。更优选地，所述方法能够确定所述通道网络的分形维数。

生物膜可以被认为是一种多孔介质，其中不同分子可以扩散进入位 于微生物集落之间的所述通道网络中。将网络的几何结构和扩散通过 网络的性能联系起来是非常重要的，这是因为其可以非常容易地指示 何种营养物可以进入生物膜，是氧气、抗生素还是其它分子。多孔介 质是一种随机多重连接的材料，其中随机地封闭通道。这些通道所占 据的自由空间部分称为孔隙。所述通道网络的Darcy渗透率等同于电 阻网络的导电率；其描述了液体流过所述网络的容易程度。在孔隙率 高于被称为临界孔隙率Ccr的值时，在网络中存在一连续通路，分子可 以从网络的一端扩散至另一端。如果通道的分布是随机的，而且可以 忽略长程相关性时，渗透率遵循接近于Ccr的普通指数定律，其不依赖 于微观细节、连接的性质等。液体在网络中的流动与网络的渗透率相 关，因此，最终依赖于网络的总的几何结构。在很多情况下，网络的 几何结构可以描述为一个分形，可以为网络限定分形维数。在临界值 时，包括在半径为R的球体内的通道的平均质量与RD成比例，其中 D＜3。因此，网络可以被认为是一多孔结构，与通常的三维固体相比， 其填充三维空间不够充分，这样所述网络具有分形维数，其低于通常 的欧几里德维数。总而言之，确定分形维数给出了关于网络几何形状 的描述，因此，可以得到有关生物膜孔隙率的指示。具体描述参见例 如Gouyet，Physique et Structure Fractales Publisher Mason， 1992，第三章。

在另一实施方式中，生物膜包括可光学区分的微生物群体。这些群 体可以例如包括相同或不同的微生物种类，当用荧光标记处理时，可 以基于不同的标记图案区分所述群体。优选地，该方法能够确定所述 群体的空间分布。

在另一实施方式中，所述生物膜包括遗传学上可区分的微生物群 体。这些群体包括不同的株或种属；例如，所述群体可以由野生型和 经遗传工程得到的菌株构成，所述经遗传工程得到的菌株可以组成型 表达GFP，或者由两个或多个菌株或种属构成，其以诱导型或组成型方 式表达光学上不同的荧光报道基因。优选地，所述方法能够确定基因 表达和群体的空间分布。

根据本发明的第二方面，提供了一种筛选试验因素的方法，确定所 述试验因素对生物膜的发育的影响，所述方法包括以下步骤：

i)存在所述试验因素时，实施前述的方法；

ii)对试验因素存在时所述生物膜的发育与不存在所述试验因素时 生物膜发育的一个已知值进行比较。

其中，试验因素存在时所述生物膜的发育与不存在所述试验因素时 生物膜发育的所述已知值的差异指示了所述试验因素对生物膜发育的 影响。

优选地，所述已知值储存于光学或电子数据库中。可选择地，可以 对该值进行标准化(例如，代表生物膜的100％发育)，并与试验因素 存在时所述生物膜的发育的标准化值比较。这样，只有以特定最小量 影响生物膜发育的试验因素被选择用于进一步的评价。

在本发明的第三方面，提供了一种筛选试验因素的方法，确定所述 试验因素对生物膜的发育的影响，所述方法包括以下步骤：

i)存在和不存在所述试验因素时，培育生物膜；以及

ii)根据前述的方法测量生物膜的发育，

其中，所述生物膜的发育在存在和不存在所述试验因素时的差异指 示所述试验因素对生物膜发育的影响。

因此，例如抗生素，如四环素、氨比西林和氯霉素可以显示出不同 程度地抑制生物膜的发育(见附图17和18)。

优选地，对不存在和存在所述试验因素时生物膜发育的差异进行标准 化，进行光学或电子存储，与参比化合物的值进行比较。因此，例如发 育的差值可以存储入电子数据库中作为抑制百分数(或刺激百分数)，该 值与所述生物膜的标准抑制剂的对应值进行比较。这样，只有满足特定 预定阈值的试验因素(例如，与参比化合物同样有效或更有效)才能被 选择用于进一步测试。

适当地，所述试验因素影响生物膜内的基因表达。优选地，所述试 验因素影响生物膜内特定微生物群体的基因表达。

适当地，所述试验因素抑制生物膜发育。

适当地，所述试验因素促进生物膜发育。在例如水处理工业和污水 工业中对所述化合物特别感兴趣。

优选地，所述试验因素为选自由以下构成的组中的物理因素：电磁 辐射、电离辐射、电场、声能和磨损。电磁辐射的适当形式包括紫外 辐射，而电离辐射的适当形式包括α-、β-和γ-辐射。磨损涉及用机械 物体例如刷子或颗粒材料的形式的物理实体来进行物理摩擦或刮擦以 磨损生物膜的表面。

优选地，所述试验因素为荧光化合物或荧光标记的化合物，从而有 利于测量其在整个生物膜中的分布。更优选地，所述试验因素选自由 以下构成的组：有机化合物、无机化合物、肽、蛋白质、碳水化合物、 脂类、核酸、多聚核苷酸和蛋白核酸。

根据本发明的第四方面，提供了一种如本文所述的共焦成像系统在 测量生物膜发育中的应用。

根据本发明的第五方面，提供了一种采用荧光成像系统对经扫描的 对象的三维结构进行分析的方法，包括：

a)辐射源系统，形成包括一个或多个波长的电磁辐射光束；

b)光学系统，将所述光束指向和聚焦于所述对象的一个或多个 平面；

c)检测系统，检测对象发出的电磁辐射并生成图像数据；以及

d)扫描系统，通过所述电磁辐射在多个平面上扫描所述对象，

该方法包括对所述图像数据进行处理，确定与所述对象的三维结 构有关的数据，该方法包括一自动图像数据阈值处理步骤，所述阈值 处理步骤包括：

i)分析图像数据内强度值；

ii)计算所述图像数据的阈值；以及

iii)采用所述阈值处理所述图像数据得到取阈值后的图像数据。

对多个不同图像中的每一个进行自动确定阈值能够得到高通量图 像分析系统，对由荧光成像系统生成的图像数据的三维结构进行分 析。该方面特别适用于但不局限于生物膜。在每个图像的基础上进行 自动阈值处理，或者在不同平面内对生物膜的一组图像中每一个进行 自动阈值处理，可以克服以下问题：具有例如不同实验参数的生物膜 的不同样品在平均图像强度上存在变化，例如不同的染料浓度、不同 的激光功率或不同的相机曝光时间；由于样品内平面深度之间的区别 导致生物膜样品的不同平面的图像在图像强度上存在不同；以及由于 例如样品不均匀的照明或样品厚度或密度的不均匀变化导致图像的区 域强度存在不同。

根据本发明的第六和第七方面，分别提供了一种计算机软件和存 储所述计算机软件的数据载体，用于执行如本文所述的本发明的方 法。

附图的简要说明

结合以下附图对本发明进行进一步描述，其中：

附图1为根据本发明对生物膜进行成像的线扫描共焦显微镜的示 意图。

附图2(a)和(b)分别为本发明的多种颜色实施方式的光路的顶视 图和侧视图，其中没有扫描镜。

附图2(c)为单光束自动聚焦系统的光路的顶视图。

附图3(a)和3(b)分别为本发明的多色实施方式的光路的顶视图和 侧视图，其具有扫描镜。

附图3(c)为单光束自动聚焦系统的光路的顶视图。

附图4为双光束自动聚焦系统的侧视图。

附图5(a)至5(c)描述了矩形CCD相机和读出寄存器。

附图6示意性地描述了成像数据处理系统的数据处理组件。

附图7表示根据本发明一个实施方式的图像分析程序的流程图。

附图8表示所述分析程序的数据二元化步骤的流程图。

附图9(a)和10(a)分别描述了在不同颜色通道进行扫描的生物膜 的一个平面的图像。

附图9(b)和10(b)分别描述了附图9(a)和10(a)的生物膜平面的 图像的强度直方图。

附图9(c)和10(c)分别描述了附图9(a)、9(b)、10(a)和10(b) 的生物膜平面的二元化图像。

附图11描述了所述分析程序的另一图像输出阈值处理步骤。

附图12描述了附图7中程序的子程序的流程图。

附图13为所述3D对象分析子程序的流程图。

附图14为所述3D对象互相关分析子过程的流程图。

附图15为显示用荧光染料Hoechst 33342染色的E.coli生物膜 的显微图。

附图16A-D为表达GFP的生物膜的3D分析；附图16A、C和D为4、 9&14μm的切片，附图16B为3D图像。附图16E描述了绿色和非绿 色细菌的体积变化，其为所述细胞在Z平面内位置的函数。

附图17描述了经选择的抗生素对附着的培养物的差别抑制。填满 的条代表了抗四环素的XL1-蓝色E.coli的附着培养物的体积。灰条 代表了表达GFP、抗氨比西林的CL182 E.coli的附着培养物的体积。 所示的为平均值+/-标准偏差(SD)，其中n＝4。

附图18描述了表达和不表达GFP的细胞的区别。发出绿色荧光的 附着生物量的体积与同时为蓝色和绿色的量相比较，发现它们相等。 空白条显示了附着培养物体积的平均绿色荧光，散列条显示了附着培 养物体积的总蓝色荧光，灰条显示了蓝色和绿色荧光重叠的附着培养 物的体积。其显示了所述分析对用Hoechst 33342染色的细菌的绿色 荧光进行了正确地上局部化。所示的为平均值+/-标准偏差(SD)，其 中n＝4。

本发明的详细描述

本发明可以在游离荧光团或本身发出荧光的化合物的存在下对来 自生物膜细胞的共焦平面的荧光信号进行成像，所述化合物包括潜在 的候选药物。这些检测可以利用任一已知的荧光团或荧光标记，包括 但不局限于荧光素、若丹明、Texas红、Amersham Biosciences染料 Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7、Hoechst的核染剂和香豆素染料。(参见， Haugland R.P.Handbook of fluorescent probes and research chemicals Ed.，1996，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon)。

光学结构

附图1显示了本发明的第一实施方式。所述显微镜包括光源100 或110，其电磁辐射的光学范围例如为350-750nm，柱面透镜120，第 一狭缝遮光板130，第一中继透镜140，分色镜150，物镜170，含有 两维样品孔182阵列的微滴定板180，镜筒透镜190，滤波器200，第 二狭缝遮光板210和检测器220。这些元件沿着光轴OA排列，其中遮 光板130、210的狭缝132、212延伸垂直于附图1的平面。透镜140、 170和190的焦距、所述透镜之间的间隔以及遮光板130和透镜140 之间、物镜170和微滴定板180之间、透镜190和遮光板210之间的 间隔提供了一共焦显微镜。在该实施方式中，来自灯100或激光110 的电磁辐射通过柱状透镜120聚焦于一条线上，其形状通过第一狭缝 遮光板130进行优化。

狭缝遮光板130描绘于所述光学系统的图像平面内，其位于与对 象平面共轭的平面内。由狭缝遮光板130的狭缝132形成的照射条纹 由透镜140、分色镜150和物镜170中继至微滴定板180上，所述微 滴定板含有样品孔182的二维阵列。为了便于描述，附图1中的所述 光学元件以横截面描述，微孔板以透视图表示。通过线184表示照明 线投射至微孔板180，其还应该理解为垂直于附图1的平面。如箭头A 和B所示，微孔板180可以通过图中未示出的装置在平行于阵列维数 的二维(X，Y)空间内移动。

在另一附加的实施方式中，狭缝遮光板130位于所述光学系统的 Fourier平面内，其位于与物镜后焦平面(BFP)160共轭的平面内。

在此情况下，狭缝132位于附图的平面内，透镜140将狭缝132 形成的照射条纹中继至物镜170的后焦平面160上，将所述照射条纹 转化为与附图1平面相垂直的对象平面内的线184。

在另一实施方式中，将狭缝遮光板130完全移走。根据该实施方 式，照射源为激光110，其发出的光聚焦于物镜170的后焦平面160。 其可以通过附图1所示的柱面透镜120和球面透镜140的结合来实 现，或者照明可以通过柱面透镜120直接聚焦于平面160内。

将照明光线投射至样品内的平面上，将其发出的荧光成像至检测 器220上，沿着垂直于照明光线的方向移动板180，可以获得样品区域 的成像，例如样品孔182内的样品，而且同步获得检测器220的读数。 在附图1所示的实施方式中，物镜170收集荧光发射，经二向色分色 镜150投射，经滤波器200和第二狭缝遮光板210由透镜190成像于 检测器220，例如适于具有经无限远校正的物镜170的共焦系统。二向 色分色镜150和滤波器200优选阻断在照明波长处的光。

检测器220示意性地为相机，可以是一维或二维的。如果采用一 维检测器，不需要狭缝遮光板210。持续进行照明、检测和转移过程， 直至预定区域被成像。如果以连续速率转移所述样品，则简化了机械 移动。如果与暴露时间相比，相机的读出时间较短，则连续移动是最 为有利的。在优选实施方式中，相机连续读出。在相连接的暴露时间 和读出时间内样品位移d可以大于或小于照明线W的波宽，例如 0.5W≤d≤5W。多孔板的所有孔能以类似方式成像。

或者，可将显微镜构造为照明线聚焦通过大量相邻的孔，主要受 限于所述光学系统的视野。最后，可以同时采用多于一个的显微镜。 照明条纹184的尺寸和形状由物镜后聚焦平面160的Fourier转化条纹 的宽度和长度决定。例如线184的长度由160的线的宽度决定，相反， 184的宽度由160的长度决定。由于衍射限制的性能，160处的照明条 纹的长度应选择填满物镜后狭缝。对于本领域技术人员来说，在物镜 偏差和物镜视野的限制范围内，照明条纹184的尺寸和形状显然可以 由柱面透镜120的焦距和120处的光束大小决定，即由每一维的有效 数值孔径决定。

选择照明线184的维数从而优化信噪比。因此，它们是依赖于样品 的。根据所述检测，分辨率可以在衍射限制和近似5μm之间变化。光 束长度优选由物镜视野决定，例如在0.5至1.5mm之间。例如，Nikon ELWD，0.6NA，40X物镜的视野大约为0.75mm。用该物镜对633nm 辐射的衍射限制的分辨率大约为0.6μm，或大约1100分辨元件。

有效深度分辨率主要由狭缝遮光板120的狭缝212的宽度决定，或 者由一维检测器的宽度以及由物镜170和透镜190的结合得到的图像 放大决定。共焦显微镜的最佳轴向分辨率接近1μm。The Confocal Handbook(共焦手册，编辑J.B.Pawley，Handbook of Biological Confocal Microscopy，第二版，Plenum，纽约，1995)给出了几个轴向分辨率dz 的表达式，但是其中有两个最为重要：

$d_z=\frac{1.77\lambda }{{\left(\mathrm{NA}\right)}^2}$

$d_z=\frac{0.22\lambda }{n.{\sin }^2\left(\frac{\alpha }{2}\right)}$

当λ为光的波长，NA为显微镜物镜的数值孔径，n是介质的折射 率，α是用于计算NA的角度。两个公式均假设了理想的或尺寸为零的 小孔。第一个等式沿着光轴(该方向通常是指z方向，而垂直于光轴 的平面为x-y平面)利用Rayleigh判据。显微镜物镜聚焦在空气中将 产生3D衍射限制的光斑，其具有位于x-y平面内焦点处的艾里斑横截 面和另一沿x-z或y-z平面的分布。该方程最佳地描述了光致发光成像 的轴向分辨率。第二个方程是采用轴旁(小角度)理论而衍生得到的， 其假设所观察的对象为理想的平面镜。在低NA时，除了镜面反射所导 致的因子2之外，第一个方程与第二个方程一致。应当认为这些方程 仅仅是近似的，在某些情况下，不能准确地预测分辨率。

通常较为优选地是实验确定有效深度分辨率。例如，可以采用作 为样品的荧光聚苯乙烯小珠得到，所述小珠的直径小于显微镜的分辨 率限值。因此，通过逐步将聚焦平面通过小珠而获得的对象图像为亚 分辨率对象的图像，可以作为对所述光学系统的点扩散函数的定义。Z 方向上(轴方向)最大值一半处的总宽度作为对所述光学系统的轴向 分辨率的定义。

照明的有效数值孔径(NA)小于物镜的NA。但是，由物镜的全 NA收集荧光辐射。必须增加狭缝212的宽度，从而检测来自更大照明 体积的发射光。在宽度比衍射限值大几倍的狭缝处，几何光学系统对 检测体积元件的大小进行较为适当的近似估计：

横宽：ad＝dd/m，

轴宽：zd，＝√2ad√tanα，

其中m为放大倍率，dd为狭缝212的宽度，α为物镜170对着的半 角。本发明的一个重要部分是照明狭缝132或在没有狭缝的实施方式 中的等同物以及检测狭缝212是可以独立控制的。

多波长结构

对于特定类型的检测，能够进行多波长荧光成像的实施方式是较为 优选的。通常较为有利而且必须的是，应当同时进行两个或多个测定， 这是由于生物响应中的一个重要参数是时间。

独立波长或颜色的数量依赖于所进行的特定检测。在一个实施方式 中，采用了三个照明波长。附图2(a)和2(b)分别描述了三种颜色的线扫 描共焦成像系统的光路的顶视图和侧视图。通常，所述系统包括几个 电磁辐射源Sn，准直透镜Ln，和用于生成准直光束的反射镜Mn，所述 光束通过柱面透镜CL在第一空间滤波器SF1处聚焦为一延长光束， 位于第一空间滤波器SF1和第二空间滤波器SF2之间的共焦显微镜， 成像透镜IL，分光器DM1，和DM2以及检测器Dn，用于分离和检测 样品发出的荧光辐射的不同波长组分。空间滤波器SF1和SF2优选为 狭缝遮光板。

尤其是，附图2(a)描述了产生颜色λ1、λ2和λ3的光源S1、S2，S3， 以及对各自光源发出的光进行准直的透镜L1、L2和L3。优选对透镜L1、 L2和L3进行调整，从而对系统中的其它透镜的色度进行补偿。反射镜 M1、M2和M3用于组合来自光源Sn的照明颜色。反射镜M1和M2是 部分透光、部分反射的，优选为二向色的。例如，M2应优选透射λ3， 优选反射λ2。因此，优选地，λ3大于λ2。共焦模式的显微镜操作需要 将来自光源Sn的组合激发光束在对象平面OP上形成一条“线”，或 高度偏心的椭圆形。结合上文对附图1的描述，可以采用不同的结构 以完成上述操作。在附图2所述的实施方式中，组合照明光束通过柱 面透镜CL聚焦成延长的椭圆形，其与空间滤波器SF1的狭缝一致。如 附图2a和2b所绘，狭缝遮光板SF1位于系统的成像平面内，与照明光 的传播方向垂直，其长轴位于附图2a页的平面内。透镜TL和OL将 照明光线从含有SF1的平面中继至对象平面OP。旋转镜TM是出于方 便。在另一实施方式中，DM3位于TL和OL之间，CL将照明光直接 聚焦于BFP。对于本领域技术人员来说，其它实施方式是显而易见的。

参照附图2(b)，样品发出的并由物镜OL收集的光通过镜筒透镜 TL成像在空间滤波器SF2上。SF2优选为狭缝，其延伸垂直于该页的 平面。因此，通过SF2的光基本上为照明线。SF2可以放于主成像平面 内或者任何与之共轭的平面。DM3是部分反射、部分透光的，优选为 “多色性的”。可以得到多波长“二向色”反射镜或“多向色”反射 镜，其优选反射特定波长的波段，优选透射其它波段。

在本文中，δλ1限定为由λ1激发的荧光。其通常为大于λ1的波长分 布，δλ2和δλ3也类似限定。DM3优选反射λn，优选透射δλn，其中n ＝1，2，3。SF2透射的光成像至检测装置，所述检测装置位于与主成 像平面共轭的平面内。在附图2(a)中，透镜IL在所有三个检测器Dn 上形成空间滤波器SF2的图像。在要求各自检测器产生的图像之间的近 乎完全配准的应用中，优选该实施方式。在另一实施方式中，单个透 镜ILn与检测装置结合，透镜对IL和ILn用于将空间滤波器SF2的图 像中继至各自的检测器Dn上。所述光通过反射镜DM1和DM2在检测 器中被分离。所述反射镜为部分透光，部分反射，优选为二向色的。 DM1优选反射δλ1，优选透射δλ2和δλ3。阻断滤波器BF1优选透射δλ1， 有效地阻断其它存在的波长。DM2优选反射δλ2，优选透射δλ3。阻断 滤波器BF2和BF3优选分别透射δλ2和δλ3，有效地阻断其它存在的波 长。

自动聚焦

根据本发明的实施方式，样品位于多个平面中的每一个，其可以通 过扫描装置移动至成像系统的对象平面内。因此，本发明提供了一种 自动聚焦机构，其使成像系统视野内的当前选择的样品平面位于该系 统的对象平面内。系统的视野深度决定了平面性的准确性。在优选实 施方式中，视野深度近似为10μm，视野大约为1mm2。

所述自动聚焦系统允许物镜以及其焦平面的精确移动。所述自动聚 焦系统的操作具有可忽略的延迟，也就是说，相对于图像获取时间， 响应时间较短，例如0.01-0.1s。此外，所述自动聚焦光源独立于照明 光源和样品性能。在其它优势中，该结构允许独立于对象平面的位置 确定沿着成像系统的光轴的样品载体位置。

附图2和3提供了一个关于单光束自动聚焦的实施方式，其中显示 了波长为λ4的独立光源S4和检测器D4。波长λ4必须区别于样品荧光， 优选地，其波长不能激发可感知的样品荧光。因此，λ4优选位于近红 外区域，例如800-1000nm。部分透光、部分反射的反射镜DM4优选为 二向色的，反射λ4，透射λn和δλn，其中n＝1，2，3。已知有适于本 应用的基于光学的自动聚焦机构。例如，Applied Optics23，565-570 (1984)中公开了用于生成适于进行伺服控制的位置错误信号的系 统，其基于象散透镜。SPIE 200，73-78(1979)中公开了一种利用“斜 光束”的聚焦错误检测系统。根据附图2和3很容易实施方式后一方 案，其中D4为分离(split)检测器。

对于在孔的底部具有生物膜的微滴定板的应用，必须中断伺服环 路，从而在孔之间移动。其可以导致大量的时间延迟，这是由于每次 将照明移至另一孔时需要重新聚焦。

在本发明的优选实施方式中提供了对样品平面和对象平面的相对 位置的连续闭合环路控制，如附图4所示。该系统利用两个独立电磁 辐射光束。一个来源于S5聚焦于连续表面上，例如微滴定板的底部。 另一个来源于S4聚焦于不连续平面上，例如微滴定板的孔底部。在一 个实施方式中，来自S4和S5的光束分别具有波长λ4和λ5。波长为λ4 的光束经L4准直，经过可变光阑I4的光圈，通过物镜OL聚焦于不连 续表面上。

波长为λ5的光束经L5准直，经过可变光阑I5的孔，通过透镜CFL 和物镜OL聚焦与连续表面上。反射光分别通过透镜IL4和IL5聚焦于 检测器D4和D5上。所述部分透光、部分反射的反射镜DM4优选为二 向色的，反射λ4和λ5，透射λn和δλn，其中n＝1，2，3。反射镜M4、 M5和M6部分透光、部分反射。当λ4和λ5不同时，M6优选为二向色 的。

根据生物膜位于微滴定板中的实施方式，λ4聚焦于孔底部。对象平 面可以通过可变的距离从孔底部发生偏移。其可通过调整λ4或者通过 对伺服控制环路进行偏移调整来实现。为了便于描述，假设λ4聚焦于 对象平面。

自动聚焦系统的操作如下所述。如果样品孔的底部不在物镜OL的 聚焦平面内，检测器D4产生出错信号，该信号通过开关SW传送至Z 控制。Z控制对电机(未示出)进行控制，从而将微滴定板移向或远离 物镜。

在单光束自动聚焦的优选实施方式中具有假闭合环路控制，所述实 施方式的操作如下所述。在扫描结束时，当SW转换恢复至D4，板移 至另一孔，计算机终端操控SW从而转换对取样固定装置的控制，所 述装置维持Z控制输出在恒定水平。

检测装置

所公开的设备的一个特征是采用了在于对象平面共扼的平面内具 有多个独立检测元件的检测装置。如上所述，线照明主要在要求快速 成像的应用中有利。与点照明相比，潜在速度的增加是线照明的平行 性所固有的，但是，只有当成像系统能够同时检测出从每个样品点沿 照明线发出的光时，才能实现。

一个实施方式中采用了连续读出线式相机，在一个优选实施方式 中，矩形CCD用作线式相机。这两个实施方式在一个图像内的各线之 间或者图像之间均没有死时间。本发明的另一优势是在如下所述的阶 段扫描实施方式中可以获得更大的有效视野。

通过以下优选实施方式，可以进一步阐明对检测装置的性能的要 求。物镜的分辨率限值小于1μm，通常为～0.5μm，检测器包括～1000 个独立元件的矩阵。分辨率、视野(FOV)以及图像获取速率均不是 独立变量，必须在这些性能参数之间进行折衷。通常，所述光学系统 的放大倍率应设置为成像具有尽可能大的FOV，同时不能牺牲分辨 率。例如，～1mm视野可以在像素为1μm时成像于多于1000个元件 的矩阵中。如果检测元件为20μm见方，所述系统的放大倍率可以设 为20X。应注意的是，其不能产生1μm的分辨率。

像素不等同于分辨率。例如，如果物镜的固有分辨率限值为0.5μ m，对象平面的每一0.5μm×0.5μm区域映射为一个像素，所得到 的数字图像的实际分辨率不是0.5μm。为了达到实际的0.5μm分辨 率，所述像素不需要对应于对象平面的～0.2μm×0.2的区域。在一 个优选实施方式中，成像系统的放大倍率设置为达到所述光学系统的 实际分辨率。

优选地，为了得到高检测效率、低噪声以及充分的读出速度，所使 用的检测器为CCD相机。在附图5中，矩形CCD相机描述成具有 m×n个检测器的阵列，其中m基本上小于n。荧光辐射的图像覆盖的 一行优选邻近读数记录器。这使传送时间最小，避免了将虚假计数累 计至位于被照射的行和读数记录器之间的行的信号上。

原则上，可以设置所述光学系统的放大倍率，从而狭缝SF2的图像 高度在CCD相机上为一个像素，如附图5所示。

在实践中很难使照明线和相机的行轴线之间保持完全对齐，而且更 难的是使三个相机和附图2及3所举例的多波长实施方式的照明对 齐。通过将一些检测元件装配在相机的每一栏中，例如2个至5个， 可以放宽对齐条件，同时使读出噪声或读出时间的损失最小。

以下优选实施方式的另外一个优势通过下文进行描述。所述实施方 式中具有一个或多个作为检测装置的矩形CCD相机和一个宽度可变的 检测用空间滤波器，附图2和3中为SF2，附图1中为210，其每个均 放置于与对象平面共扼的平面内。如上所述，在本发明的一个实施方 式中，检测用空间滤波器可以省略，线式相机用作联合的检测用空间 滤波器和检测装置。但是同样如上文所述，宽度可变的检测用空间滤 波器可以对检测体积进行最优化，从而优化依赖样品的信噪比。以下 优选实施方式保留了线式相机的优势，即速度，以及可变检测体积的 灵活性。设置放大倍率从而将衍射限制的线的高度h成像至相机的一 行上。所述检测用空间滤波器的宽度优选为可变的，其中：

h≤d≤10h

在读数之前，装配位于相机中被照射的栏的检测器，该操作需要的 时间与暴露时间和读出时间相比可忽略。

在一个优选实施方式中，相机为Princeton Instruments NTE/CCD-1340/100-EMD。在优选实施方式中的读数速率在几个电子 的读数噪声下为1MHz。所述象素格式为1340×100，可以对相机进行 连接，从而将大多数(80％)的行移离感兴趣的区域，从而使相机的 像素格式为有效的1340×20。

除了上文所述的连续读数相机的优势，即接连获取数据之间没有死 时间，其还具有另一个优势，即允许获得矩形图像，所述图像的长度 仅仅受限于样品的范围。所述长度由相机宽度和线照明的范围中较小 的一个所决定。在优选实施方式中，附着的生物膜位于96孔微滴定板 的孔底部，其直径为7mm。照射1μm×1mm的条带，所述被照射 区域产生的辐射成像于检测装置上。设计所述光学系统使得视野为 ～1mm2。可以在1×7mm的区域以1μm像素生成孔底部的图像。

环境控制

在本发明的一个实施方式中，在活的生物膜上进行检测。活细胞检 测通常要求适当地近似于生理条件，从而可以正确进行检测。其中一 个重要的参数为温度。较为可取的是，提供升高和降低温度的装置， 从而特别使样品的温度维持在37℃。在另一实施方式中，必须对相对 湿度，和/或CO2和/或O2进行控制从而维持活生物膜的生命力。此外， 对于小样品体积来说，控制湿度从而使蒸发最小是非常重要的。

使微滴定板位于升高的温度优选为37℃并与共焦成像系统相适应 的三个实施方式如下。

所述成像系统优选位于不透光的外壳内。在第一实施方式中，通过 维持外壳内的整个内部空间在所需的温度，使样品板维持在该温度 下。但是，在37℃下，除非有意维持升高的湿度，蒸发冷却将减少样 品体积，从而限制检测时间。

第二个实施方式为微孔板提供了加热盖子，允许板在所述静止盖子 下移动。所述盖子具有位于孔上方的单个开口，与显微镜的光轴对齐。 所述开口允许向工作孔内分配物质，同时维持加热并限制向板其余部 分的流通。加热覆盖板和微孔板之间大约为0.5mm的空间允许微孔板 自由移动，并使蒸发最小。当需检测的孔的内容物通过分配孔暴露于 周围条件至多数秒时，所述内容物在测量期间不发生显著的温度改 变。

在第三个实施方式中，经加热的薄的蓝宝石窗口用作板底部外壳。 沿着孔分隔物的电阻型加热器的模式使窗口温度维持在所需要的水 平。

在其它实施方式中，可以多种多样地结合所述三个公开的方法。

集成分配器

本发明的一个实施方式提供了集成分配器。为了在96孔或384孔 板上进行检测，需要在20-100ul范围内的添加体积。例如适于添加 离子通道活性拮抗剂的单头分配器为IVEKK Dispense2000。具有可比 性的元件可由CAVRO获得。一般来说，所需要的是能够将单一化合物 分配至每个孔中。一个实施方式中提供了位于机器人移动装置上的单 头分配器，其在分析站、含有所述单一化合物的源板和尖端清洗装置 之间来回移动分配头。后者为固定尖端的分配器的清洗站和用于一次 性尖端分配器的尖端更换站。所述系统相对便宜地提供了所需要的功 能，但是其是低通量的，每个化合物吸取-分配-清洗循环需要大约 30秒钟。通过将多头分配器结合于所述共焦成像系统中，例如 Hamliton Microlab MPH-96，得到另一实施方式。所述MPH-96包括 96个独立固定尖端的分配器，安装在能够进行如上所述吸取-分配- 清洗循环机器人移动装置上。

在本发明的另一优选实施方式中，在自动筛选检测中采用的成像系 统与板处理的自动装置例如Zymark Twister结合起来。

检测

可以根据本发明实施以下例1-3中描述的检测方法的大量变体。 通常，采用一个或多个经荧光标记的物质的特征强度和/或空间分布和 /或时间分布定量所述检测。

数据处理系统

附图6示意性地显示了根据本发明设置的系统的数据处理组件。所 述系统基于Amersham Biosciences IN Cell AnalyzerTM系统，包括 如上所述的共焦显微镜400，其包括了检测器D1，D2，D3，D4，D5，开关SW， 控制单元401，图像数据存储器402以及输入/输出(I/O)装置404。 应注意的是，还可以具有其它设置方式，包括省略D4和D5的设置，省 略D4的设置以及省略D5的设置。所述图像数据存储器402可以是任意 适当形式的存储装置或可以省略，传送输出数据并存储于辅助的计算 机终端405。所述辅助的计算机终端405包括中央处理单元(CPU)408， 内存410以及数据存储装置，例如硬盘驱动器412和I/O装置406， 其有利于计算机和显微镜400的连接，以及通过屏幕I/O装置430有 利于计算机和屏幕428的显示元件432的连接。操作系统程序414存 储在硬盘驱动器412上，以已知的方式控制计算机终端405的低级操 作。程序文件和数据420同样存储在硬盘驱动器412上，以已知方式 通过辅助装置和存储在硬盘驱动器上的输出数据控制输出至运算器 上。所述辅助装置包括作为屏幕元件428的显示器432，定点设备(未 示出)以及键盘(未示出)，其经过另外的I/O装置(未示出)接收 运算器的输入和输出信息至运算器。图像处理和分析应用程序416、检 测控制应用程序418、用于存储来自显微镜400的图像数据的数据库 422和数据处理过程中产生的输出文件存储在硬盘驱动器412上的程 序文件420内。所述图像处理和分析应用程序418可以是已知图像处 理和分析软件包的定制版本，例如来自Media Cybernetics的 Image-ProTM。

通过控制应用程序418控制采用共焦显微镜400得到的检测性 能，并获得图像数据。在通过至少一个检测器D1，D2，D3获取微滴定板上 至少一个孔的图像数据之后，图像数据被传送至计算机405，并存储在 位于计算机终端硬盘驱动器412上的数据库内，在此利用图像处理和 分析应用程序416处理图像数据，以下将对其进行详细描述。

数据分析

通常，数据的获取和分析包括大量的不连续步骤。荧光被转化为一 个或多个数字图像，其中数字值与入射至检测装置中每个像素的荧光 辐射的强度成比例。在该步骤中，对经过视野的成像系统的不均匀响 应进行校正，其中，减去背景的数据除以所谓的平面场文件。

通过图像处理和分析应用程序(416)进行如附图7-14所述的数 据分析。附图7表示了分析运算法则的流程图。分析从第一孔(i＝1) 的第一Z平面(Z＝1)开始(500)。第一孔的第一Z平面的图像装载 入计算机的内存中(510)。图像可以包括一个或多个彩色平面(例如 红(R)，绿(G)，蓝(B))，对应于所述设备的三个相机所记录的图 像。来自三个彩色平面的信息被分为(520)三个图像，对每个图像进 行单独处理。以相同方式处理所有三个图像。首先，恢复图像从而补 偿所述光学系统造成的变形和偏差(过程(541)中的红色图像；过程 (542)中的绿色图像和过程(543)中的蓝色图像)。所述图像恢复 可以例如是本领域公知的去卷积和其它任意图像恢复方法。图像恢复 技术通常要求输入有关成像系统的光学性能的某些信息(530)。例如， 如果采用去卷积技术，可能需要所述光学系统的点扩散函数(PSF)。

第二，在图像数据处理运算法则中的图像数据阈值处理步骤中对每 个图像进行阈值处理。在该实施方式中，阈值处理步骤涉及对每个图 像进行二元化(过程(551)、(552)和(553))，其目的是将灰度 图像转化为二元图像，例如1代表被生物膜中微生物占据的图像像素， 0代表被位于微生物之间的自由空间占据的图像像素。在本发明的该实 施方式中，二元化阈值的值确定不受用户的干预。单独为每个图像确 定二元化阈值的值。另外，可以对每个彩色通道单独计算单个阈值， 并用于每个孔的所有图像，也就是在不同平面的图像组。

附图8为分析运算法则的图像数据二元化过程(过程551，552和 553)的流程图。附图9(a)-(c)描述了红色平面图像的二元化过 程(551)的阶段，附图10(a)-(c)描述了绿色平面图像的二元化 过程(552)的阶段。

附图9(a)显示了红色(R)平面图像(614)，在该实施方式中 通过计算(602)强度直方图(616)在二元化过程中分析其强度值。 如附图9(b)所示。所述强度直方图(616)对位于第一轴(618)上 具有特定强度的图像的大量像素和位于第二轴(620)上的红色(614) 图像的强度进行作图。采用该强度直方图(616)，确定低于以下值的 强度值，即被分析的像素集的预定比例的强度值。设想所述预定分位 数的值在70％-95％，优选为85％-95％，较为优选地为大约90％ 的值(Q90)。90％分位数(Q90)代表位于图像(614)的90％总像素 位于的强度值以下的值。由90％分位数(Q90)表示的强度用于为红色 图像(614)设置最佳二元化阈值TR(606)。在该例中，二元化阈值 TR为强度值24。

然后采用阈值(TR)对红色图像(614)进行二元化(608)，从而 得到二元化图像。在该假图像(mask)上，红色图像(614)的强度大于 阈值(TR)的任意像素设置为1，红色图像(614)的强度等于或小于 阈值(TR)的任意像素设置为0。设为1的像素通常对应于红色图像 (614)中的细菌元素，设为0的像素通常对应于红色图像(614)中 的背景元素。附图9(c)描述了红色二元化图像(622)，其中设为1 的像素显示为白色，设为0的像素显示为黑色。然后该二元化过程 (551)结束(612)。

以如上所述对红色(R)平面图像(614)进行二元化步骤的类似 方式，对绿色(G)和蓝色(B)平面图像进行二元化(552，553)从 而形成蓝色和绿色二元化图像，采用相同的预定分位数设定阈值。附 图10(a)显示了绿色(G)平面图像(624)。附图10(b)显示了绿 色平面图像(624)的强度直方图(626)，与红色图像(614)相同， 在第一和第二轴(618，620)上作图。在该例中，所述二元化阈值TG 近似为强度值4，该值已经对绿色平面图像(624)进行了最优化。附 图10(c)显示了绿色二元化图像(628)。设为1的像素显示为白色， 设为0的像素显示为黑色。

附图11描述了另一可作为替换的图像二元化过程。该二元化过程 适于对强度发生局部变化的图像进行二元化。所述局部变化强度可以 是由经扫描的生物膜平面的不均匀照射，或者是由经扫描的生物膜的 厚度或密度的变化引起的。在不均匀照射的情况下，可以采用图像校 正的方法例如平面场校正使强度的局部变化最小。

在所述可作为替换的二元化过程中，选择(630)图像例如红色(R) 平面图像(614)的一个像素。具有固定面积的正方形的中心位于所选 择像素附近，然后选择(632)图像的所述像素的局部区域。在扫描样 品之前，确定正方形的面积。对于所选定的像素的局部区域，计算平 均强度(AI)和强度(636)的标准偏差(SD)。然后计算(638)像 素二元化阈值TP。所述像素二元化阈值(TP)的计算如下：

TP＝AI+(M×SD)

其中，M为常数，其优选值在0.2至4之间，优选在0.5至3之间， 更优选地大约为1。当对其它图像进行二元化过程时，M的值在初始时 是相同的，例如绿色和蓝色平面图像。

接下来，对所选择的像素进行二元化(640)。如果所选定的像素 的强度大于像素阈值(TP)，则将像素设为1。如果所选定的像素的强 度低于像素阈值(TP)，则将像素设为0。进行检测(642)从而确定 图像(614)中是否存在仍未进行二元化的其它像素。如果存在仍未进 行二元化的像素，通过选择另一不同的图像平面(630)的像素，重复 所述阈值处理步骤。在对图像平面的每一像素进行二元化之后，结束 (644)二元化步骤，产生二元化图像。

第三，在分析运算法则中，采用任一公知的图像分析方法(例如， 腐蚀扩大，采用例如Gaussian滤波器进行过滤)将杂散噪声从图像中 去除(过程(561)，(562)和(563))。第四，将所述三个彩色平 面的经处理的图像存储于存储器中(572)，(573)，(574)。保存 单个孔的每个Z平面的所有彩色平面的图像，从而在稍后阶段进行3D 分析(参见过程(581)至(584))。所述图像还用作子程序(570) 的输入。所述子程序(570)确定每个彩色平面内的生物膜体积，以及 彩色平面之间的重叠体积。

附图12显示了该子程序的流程图。第五，所述程序将体积测量结 果存储于盘(571)内。第六，所述程序确定是否有另一个所述孔(575) 的Z平面需要处理。如果有，采用来自下一Z平面(Z＝Z+1)的图像， 重复从过程(510)开始的整个过程。第七，如果没有其它的Z平面， 所述程序为该孔(580)计算最后结果。这些最终结果包括，例如不同 颜色平面的生物膜的总体积，或位于微生物之间的自由空间的总体 积。第八，该程序执行3D对象分析。单独处理每个彩色平面组。对每 个颜色组独立采用相同的子程序。在较早的阶段，将所述图像组存储 于程序中。过程(581)采用红色组(572)；过程(582)采用绿色组 (573)；过程(583)采用蓝色组(574)。所述子程序确定微生物集 落，和位于集落之间的通道。其还为微生物集落和通道确定几何形状 参数的统计分布。所述子程序的流程图显示于附图13中，每个彩色平 面具有相同的流程图。第九，来自3D对象分析子程序的结果用作对象 互相关子程序(584)的输入。所述子程序确定存在于不同颜色平面内 的对象之间的任意相关。该子程序的流程图显示于附图14中。

第十，该孔的所有结果显示于屏幕(590)上，并存储于盘(591) 上。在将结果显示于屏幕(590)之前，在验证过程中对结果进行验证 从而确定质量，从而表示二元化过程(551，552，553)成功，从整体 上确保图像像素没有被不正确地设置为1或0。如果例如没有对图像的 二元化阈值进行正确地优化，或者如果二元化图像的进一步图像处理 过程，例如除去散射(杂散)噪声(561，562，563)，将相对大数量的 设为1的像素错误地除去，将发生上述情况。

如果验证过程确定图像的二元化过程的质量差，由此是不成功的， 重复对该图像的分析运算法则。在重复所述分析运算法则过程中，二 元化阈值是变化的。因此，对于采用预定的分位数确定二元化阈值的 实施方式，根据需要通过逐步增加或减少对分位数的百分数进行修 饰。对于替代的二元化步骤，在重复分析过程中类似地对常数M的值 进行修饰。在重复分析运算法则之后，通过验证过程对结果进行重新 验证，从而确定二元化是否成功。如果二元化的结果再次被认为质量 差以及由此的不成功，则再次重复分析运算法则，对分位数的百分数 或者M值进行适当地进一步修饰。一旦验证过程认为二元化结果是成 功的，所述结果显示在屏幕(590)上。

所述验证过程涉及一个或多个步骤，其描述如下。可以在验证过程 中执行的步骤的例子涉及检查a，a不大于分析运算法则的最终处理图 像中被设置为1的像素的预定比例，例如大约80％。如果其大于被设 置为1的像素的预定比例，则所述验证过程指示所述阈值过低。因此， 所述结果被认为是不成功的，采用更大的阈值对所述图像重复所述分 析运算法则。当采用90％的分位数设置二元化阈值时，由此大约90％ 的具有最低图像强度的像素将设为0。对二元化图像的包括去除散射噪 声的进一步处理将设定从1至0的小比例像素，因此，低于大约10％ 的像素比例将设为1。如果在验证过程中，将大于大约80％的像素设 为1，其确定了应对所述二元化阈值进行修饰，并重复所述图像的分析 运算。

可以在验证过程中执行的步骤的另一例子涉及检查低于预定比例 的经处理图像的像素是否设为1，例如大约9％。如果低于9％的像素 被设为1，所述验证过程指示所述阈值设置过高。因此所述结果被认为 是不成功的，采用更低的阈值重复对该图像进行分析运算。

可以在验证过程中执行的步骤的另一例子涉及对样品一个平面图 像中设为1的像素比例和所述样品的第二不同平面的设为1的像素比 例进行比较。这两个比例之间不可能出现显著差别。如果与预定差值 进行比较，确定所述差值在统计学上具有显著意义，则采用经适当修 饰的阈值对所述图像重复进行分析运算，从而得到成功的结果。

可以在验证过程中执行的步骤的另一例子涉及对设为1的孤立像 素数量进行计数。孤立是指像素完全被设为0的像素环绕。如果该数 大于预定值，则所述验证过程指示将对应于图像的背景噪声的像素不 正确地设为1，应采用增加的阈值对该图像重复进行分析运算。

可以在验证过程中执行的步骤的另一例子为比较处理图像的经确 认的细菌的统计学特性，例如平均大小或最可能的大小，和该特性的 预定和期望值。如果在这些值之间存在显著差异，所述验证过程指示 应对该二元化阈值进行修饰，并重复进行分析运算。所述验证过程的 修饰形式的一个例子涉及比较一个样品图像平面内的经确认的细菌的 统计特性和第二个不同的样品图像平面内的经确认的细菌的统计特 性，从而检查其相似性。

接下来，所述程序确定是否还存在另一个孔需要经过程(592)处 理。如果存在另一个孔，则从过程(510)开始进行整个过程，采用另 一孔(i＝i+1)的第一Z平面(Z＝1)。如果没有孔需要进行所述过程， 则所述程序结束(593)。

附图12为附图7的子程序(570)的流程图。该子程序确定每个 颜色通道内的生物膜体积。该子程序在步骤686，687和688中接收作 为输入的来自过程(561)，(562)和(563)的每个颜色通道的图像。 首先，所述子程序计算用体积元素(体元)表示的三个新图像，它们 同时存在于两个彩色平面内(过程(690)中为红色和绿色，过程(691) 中为红色和蓝色，过程(692)中为绿色和蓝色)。其可以通过例如在 两个彩色平面的图像之间，即体元对体元，取逻辑AND来实现。第二， 计算六个不同的体积：生物膜在每个彩色平面内的体积(过程(693) 中为红色，过程(696)中为绿色，过程(698)内为蓝色)和位于两 个彩色平面之间的重叠体元的体积(过程(694)，(695)和(697))。 为了计算这些体积，需要知道体元的体积。其在之前的实验中已经确 定，体元的体积值存储在计算机存储器(689)中。接下来，子程序将 体积值返回至(699)主程序的过程(571)中。

附图13显示了3D对象分析子程序(581)的流程图，其确定生物 膜集落和位于集落之间的通道的几何形状参数的统计学分布。所述子 程序从其中一个来自程序(561)、(562)或(563)的彩色通道接收 作为输入(700)的Z图像组。对微生物集落和自由通道的分析在两个不 同的流程中进行：对于集落为(720)、(730)和(740)，对于通道 为(711)、(721)、(731)和(741)。对于集落分析，首先，在 过程(720)确认每个独立集落为独立的对象。对象定义为一组相邻的 体元，其与其它组的体元分隔开。该体元组在三维空间中占据一定的 体积。过程(720)建立对象数据库，包括该对象中含有的所有体元的 坐标。所述数据库输出至过程(584)供进一步分析。第二，在过程(730) 中确定所述数据库中每个对象的几何特性。这些特性可以包括例如对 象的体积、对象长轴和短轴的长度、对象的方向余弦、对象的纵横比。 第三，在过程(740)中对每个孔计算所述形状参数的统计学分布。第 四，在过程(590)中存储经计算的数据供进一步使用。另外，在自由 通道分析流程中，首先，过程(711)转化图像，即将1转化为0，以 及与之相反。第二，过程(721)确定通道网络中的节点和连接连线。 节点是指至少两个通道会合的点，连线是指连接两个节点的通道部 分。然后用由构成每个节点和连线的体元的坐标将图像转化为拓扑数 据库。第三，过程(731)计算所有节点和连线的几何特性，例如连接 在节点处的连线数量，连线的长度，连线的直径，连线的曲率等。第 四，过程(741)确定节点和连线特性的统计学分布。过程(741)还 计算网络的某些总体描述符，例如网络的连接性、弯曲度、分形维数 等。第五，所有的结果输出至过程(590)。

附图14为3D对象互相关分析子过程(584)的流程图。所述子过 程接收三个输入。它们为孔的三个彩色平面的Z组。红色组(801)预 先存储于(572)，绿色组(802)预先存储于(573)，蓝色组(803) 预先存储于(574)。首先，所述程序计算三个新的图像，所述新图像 对应于分别同时存在于过程(811)的红色和绿色图像、过程(812) 的红色和蓝色图像，过程(813)的绿色和蓝色图像的体元。这些新的 图像分别称为红绿重叠图像(RGO)，红蓝重叠图像(RBO)和绿蓝重 叠图像(BGO)。其通过例如在两个彩色平面的图像组之间就体元对体 元进行逻辑AND而实现。在过程(821)，(841)，(851)和(861) 中对RGO图像进行分析，以下将对其进行详细描述。在过程(822)， (842)，(852)和(862)中对RBO图像进行同样分析，以及在过程 (823)，(843)，(853)和(863)中对GBO图像进行同样分析。 就RGO图像而言，首先，在过程(821)中确认图像组中每个独立的体 元群为单独的对象。对象定义为一组与所有其它体元组分隔开的相邻 体元。该体元占据了由Z图像组限定的三维空间内的体积。过程(821) 建立了对象数据库，其含有包括在该对象内的所有体元的坐标。第二， 过程(841)比较三个数据库中含有的对象的体元坐标：由过程(821) 生成的数据库，过程(581)生成的红色对象(833)数据库和过程(582) 生成的绿色对象数据库。如果RGO数据库中的对象的体元坐标与红色 对象数据库(833)和绿色对象数据库(832)中的体元坐标一致，这 认为红色和绿色组之间的对象存在重叠。选择位于RGO数据库中的相 应对象。或者删除RGO数据库中的相应对象。第三，过程(851)测量 RGO数据库的对象的几何性质。所述性质可以包括例如对象体积、对象 长轴和短轴的长度、对象的方向余弦、对象的纵横比、其相对于图像 组的X，Y，Z轴的位置。第四，在过程(861)中计算该孔的形状参数的 统计学分布。对于RBO图像组和GBO图像组进行与(821)，(841)， (851)和(861)一致的过程。

最后，RGO数据库，RBO数据库和GBO数据库自过程(590)输出。

实施例1

通过荧光染色对细菌生物膜进行显像

在37℃将Escheriachia coli(E.coli，JM109)的非荧光菌株附 着于Packard微滴定板(参见，Packard的目录号6005182)的孔中3 个小时。通过清洗除去未吸附的细菌，附着的细胞在标准Luria培养 基(Amersham Bioscienee)中在37℃下过夜。然后，通过添加荧光 DNA染料Hoechst33342(1μM；Sigma)，使所述细菌显像。在成像系统 中显像时，细菌显示出较密集的但是不均匀的染色图案，指示生长呈 片状(见附图15)。对生物膜的深度进行荧光强度扫描，指示膜的厚 度为几微米。

实施例2

对附着的组成型表达GFP的E.coli集落进行3D显像

第二个实验是如上述例1在微滴定板上生长E.coli，但是所述 E.coli JM109可以组成型表达GFP，具有GFP-F64L-S175G-G222G突 变。通过清洗除去未附着的细胞，在37℃培养剩余细胞大约10小时， 不需要搅拌。对发育良好的生物膜进行扫描，所述生物膜既不生长过 度也不是仅仅只有一个细胞的厚度，认为该生物膜代表了典型的样 品。在488nm处进行扫描，使GFP显像。

附图16A-D所示的图像覆盖了0.75×0.75mm的面积。一步1μm， 将仪器的聚焦平面移动进入生物膜从而得到深度信息。附图16A，16C 和16D所显示的三个图像代表所取的切片以及在生物膜内各自的z位 置。附图16B显示的图像为3D图像，结合了所取的30个图像。水平 和垂直线代表软件“切割线”，在图像的左侧和底部具有相关的切割 轮廓。黑色区域指示不存在生物膜或者指示存在位于微生物集落之间 的实际通道，所述微生物集落见附图中所示的明亮区域。

附图16E用图表显示了作为Z平面的位置函数的图像总强度的变 化。

实施例3

所附着的E.coli培养物的差异3D分析

E.coli CL182具有低的拷贝数矢量(pGEX-6p-1)，其具有氨比 西林耐药性并由IPTG相应的tac启动子表达GFP

(F64L，S175G，E222G)。XL1-蓝色E.coli为具有转位子10的标准 菌株，具有四环素耐药性。混合上述菌株，在经选择的抗生素的存在 下(四环素、氨比西林和氯霉素)生长，采用IN Cell Ahalyzer显像。

E.coli培养物在37℃和经选择的压力下分批培养16小时。通过 离心使细胞成小球状，清洗，并在冷PBS中重新悬浮。对培养物和溶 液用OD600nm进行标准化(至1)，用冷PBS进行10倍稀释。使细胞 (100ul)沉淀，在4℃下附着于Packard微滴定板(Packard# 6005182)的表面1小时。用PBS(100ul)清洗附着的E.coli两次。 向附着细胞中加入含有或不含有IPTG(0.2μM)，氨比西林(100μ g/ml)，四环素(10μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的Luria肉汤 (100ul)，在37℃培养4小时和16小时。用PBS(100ul)清洗细胞 两次。在Hoechst33342(PBS中0.1μM)中培养10分钟。用PBS清 洗细胞，依次用UV(365纳米)和蓝色(488nm)激光分别激发Hoechst 33342和GFP并成像。用450BP65和565BP50滤波器捕获发出光，并 收集作为12位图像；以1μm为间隔在每个条件下获得24个切片。

采用附图7-14所描述的运算法则分析图像。在采用亚分辨率和超 分辨率小珠进行实验之前确定体元维数。然后，所述分析提供了关于 如前所述三维空间内的所有彩色平面内的生物膜数量的数据。此外， 在3D中计算绿色和蓝色荧光生物膜的重叠。

用氨比西林和四环素(附图13)清楚地显示和量化了对XL1-蓝色 和CL182细胞的生长的差异抑制。如所预计的，氯霉素强烈抑制了XL1- 蓝色和CL182的生长。此外，在不存在IPTG的情况下，观察到CL182 的由tac启动子表达的GPP减少了25％。通过分析体元，获得有关生 物膜的基因表达的重叠位置信息。附图17显示了在存在有抗生素时两 个不同E.coli菌株的平均附着培养物体积(mm3)。在四个独立孔中 重复该实验，计算这些孔之间的标准偏差。

当在LB+IPTG存在的条件下培养CL182细胞，绿色和蓝色辐射像 素的体积相等，其提示附着的生物量体积内的所有细胞均表达GFP(绿 色:蓝色＝9.72:9.71)。其得到了进一步分析的证实，所述分析显 示蓝色的所有像素实际上也是绿色的(附图18)。然而，不表达GFP 的XL1-蓝色细胞在Hoechst33342存在下在LB+IPTG中生长时显示强 烈的蓝色染色。其可以区分XL1-蓝色细胞和CL182细胞(表达GFP)。

上述实施例应理解为本发明的示例。可以预测出本发明的其它实施 例。应这样理解，任意实施例中描述的任意特征可以单独采用，或与 描述的其它特征结合采用，以及可以与任意其它实施例或任意其它实 施例的组合中一个或多个特征结合采用。而且，在不偏离本发明的范 围的情况下，可以采用上文没有描述的等同物和变化，其在以下的权 利要求中限定。