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用于癌症中免疫治疗的基因标签

阅读：173发布：2021-08-16

专利汇可以提供用于癌症中免疫治疗的基因标签专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且癌症的免疫应答亚型与DNA损伤相关，这允许针对特定 治疗 对对象进行分层，所述特定治疗包括可以与DNA损伤治疗剂组合的免疫治疗。预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性的方法包括确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达 水 平。所确定的表达水平用于预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。，下面是用于癌症中免疫治疗的基因标签专利的具体信息内容。

1.预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性的方法，其包括：
确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高预测具有针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
3.权利要求1或2所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)预测具有针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括：
(i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
(ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；
(iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，预测具有响应性。
5.预测针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性的方法，其包括：
确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于预测针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
6.权利要求5所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高预测具有针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
7.权利要求5或6所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)预测具有针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其包括：
(i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
(ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；
(iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，预测具有响应性。
9.鉴定可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症的方法，其包括：
确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于鉴定可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
10.权利要求9所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高鉴定为可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
11.权利要求9或10所述的方法，其包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)鉴定为可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
12.权利要求9至11中任一项所述的方法，其包括：
(i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
(ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；
(iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，鉴定为可有效治疗的癌症。
13.鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症的方法，其包括：
确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
14.权利要求13所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高鉴定为可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
15.权利要求13或14所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)鉴定为可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
16.权利要求13至15中任一项所述的方法，其包括：
(i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
(ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；
(iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，鉴定为可有效治疗的癌症。
17.针对癌症选择治疗的方法，其包括：
确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于选择用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
18.权利要求17所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高用于选择用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
19.权利要求17或18所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)用于选择用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
20.权利要求17至19中任一项所述的方法，其还包括使用所选择的拮抗剂和/或激动剂来治疗所述癌症。
21.权利要求17至20中任一项所述的方法，其包括：
(i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
(ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；
(iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，选择使用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂。
22.针对癌症选择治疗的方法，其包括：
确定来自对象的样品中选自2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于选择用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
23.权利要求22所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高用于选择用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
24.权利要求22或23所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)用于选择用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
25.权利要求22至24中任一项所述的方法，其还包括使用所选择的与DNA损伤治疗剂组合的拮抗剂和/或激动剂来治疗所述癌症。
26.权利要求22至25中任一项所述的方法，其包括：
(i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
(ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；
(iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，选择使用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂。
27.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR211P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
28.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR211P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
29.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
30.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定以下基因的表达水平：选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因。
31.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR211P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
32.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
33.前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B所示，或者其中每种基因的权重和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
34.前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定以下基因的表达水平：CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因。
35.前述权利要求中任一项所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
36.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合测试评分(或“标签评分”)根据下式推导：
其中wi是每种基因的权重，bi是基因特异性偏倚，gei是预处理后的基因表达，并且k是常值偏移。
37.治疗癌症的方法，其包括向对象施用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，其特征在于，在施用之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合测试评分，或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
38.治疗癌症的方法，其包括将与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂施用于对象，其特征在于，在施用之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因所确定的表达水平所推导的阳性组合测试评分，或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
39.用于在对象中治疗癌症的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，其中在施用所述拮抗剂和/或激动剂之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、
2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合测试评分，或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
40.用于在对象中治疗癌症的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，其中在施用所述拮抗剂和/或激动剂之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、
2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合测试评分，或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高，并且其中所述拮抗剂和/或激动剂与DNA损伤治疗剂组合施用。
41.用于在对象中治疗癌症的与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或与DNA损伤治疗剂组合的刺激性免疫检查点的激动剂，其中在施用所述拮抗剂和/或激动剂与DNA损伤治疗剂之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合测试评分，或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
42.权利要求37或38所述的方法或者权利要求39至41中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分(或“标签评分”)根据下式推导：
其中wi是每种基因的权重，bi是基因特异性偏倚，gei是预处理后的基因表达，并且k是常值偏移。
43.权利要求37、38或42中任一项所述的方法或者权利要求39至42中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自以下的至少6种基因确定的表达水平所推导：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR211P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
44.权利要求37、38、42或43中任一项所述的方法或者权利要求39至43中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因确定的表达水平所推导：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR211P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
45.权利要求37、38或42至44中任一项所述的方法或者权利要求39至44中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自表1的至少12种基因确定的表达水平所推导。
46.权利要求37、38或42至45中任一项所述的方法或者权利要求39至45中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由以下基因确定的表达水平所推导：选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因。
47.权利要求37、38或42至46中任一项所述的方法或者权利要求39至46中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由以下每一种确定的表达水平所推导：
CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR211P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
48.权利要求37、38或42中任一项所述的方法或者权利要求39至42中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由来自表4至45中任一个的基因确定的表达水平所推导。
49.权利要求37、38或42至48中任一项所述的方法或者权利要求39至48中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中每种基因的权重值如表2B所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
50.权利要求37、38或42至49中任一项所述的方法或者权利要求39至49中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由以下基因确定的表达水平所推导：
CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因。
51.权利要求37、38或42至50中任一项所述的方法或者权利要求39至50中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述表达水平使用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针来确定。
52.权利要求37、38或42至51中任一项所述的方法或者权利要求39至51中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述对象是根据权利要求1至36中任一项所述的方法来选择进行治疗的。
53.权利要求1至38或42至52中任一项所述的方法或者权利要求39至52中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述样品包含癌细胞。
54.权利要求1至38或42至53中任一项所述的方法或者权利要求39至53中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述样品是组织样品；任选地其中所述组织样品是经固定并包埋的组织样品。
55.权利要求1至38或42至54中任一项所述的方法或者权利要求39至54中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述癌症选自白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食管癌、胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌或头颈癌。
56.权利要求1至38或42至55中任一项所述的方法或者权利要求39至55中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述抑制性免疫检查点选自A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、PD-1/PD-L1、TIM-3和VISTA，任选地其中所述抑制性免疫检查点不是PD-1/PD-L1。
57.权利要求1至38或42至56中任一项所述的方法或者权利要求39至56中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述抑制性免疫检查点的拮抗剂选自：
(a)抗体和抑制性核酸分子；和/或
(b)MGA271(靶向B7-H3)、伊匹单抗(Yervoy-靶向CTLA-4)、indoximod(靶向IDO途径)、NLG919(靶向IDO途径)、利丽单抗(靶向KIR)、IMP321(靶向LAG3)、BMS-986016(靶向LAG3)、CT-011(PD-1阻断)、尼伏单抗/BMS-936558(PD-1阻断)、BMS-936559(PDL1阻断)和派姆单抗(Keytruda-靶向PD-1)，任选地其中所述拮抗剂不是派姆单抗；和/或其中抑制性免疫检查点的所述拮抗剂选自MGB453(靶向TIM-3)、LAG525(靶向LAG-3)和PDR001(PD1阻断)。
58.权利要求1至38或42至57中任一项所述的方法或者权利要求39至57中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述刺激性免疫检查点选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS。
59.权利要求1至38或42至58中任一项所述的方法或者权利要求39至58中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述刺激性免疫检查点的激动剂选自：
(a)抗体、脂质运载蛋白和细胞因子；和/或
(b)CDX-1127(CD27的激动剂)、NKTR-214(CD122的激动剂)、BMS-663513(CD137的激动剂)、TRX518(GITR的激动剂)、CP-870893(CD40的激动剂)、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383(OX40的激动剂)。
60.权利要求1至38或42至59中任一项所述的方法或者权利要求39至59中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述DNA损伤治疗剂选自DNA损伤剂、DNA修复靶向治疗、DNA损伤信号传导的抑制剂、DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂和间接导致DNA损伤的过程的抑制剂；任选地其中：
(a)所述DNA损伤剂选自烷化剂、拓扑异构酶抑制剂和辐射；任选地其中：
(i)所述烷化剂选自含铂剂、环磷酰胺和白消安；任选地其中所述含铂剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂；
(ii)所述拓扑异构酶抑制剂选自拓扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂；任选地其中：
(A)所述拓扑异构酶I抑制剂选自伊立替康和拓扑替康；和/或
(B)所述拓扑异构酶II抑制剂选自依托泊苷和蒽环类；任选地其中所述蒽环类选自多柔比星和表柔比星；
(iii)所述辐射是电离辐射；和/或
(b)所述DNA修复靶向治疗选自非同源末端连接的抑制剂、同源重组的抑制剂、核苷酸切除修复的抑制剂、碱基切除修复的抑制剂和范科尼贫血途径的抑制剂；任选地其中：
(i)所述非同源末端连接的抑制剂选自DNA-PK抑制剂、Nu7441和NU7026；
(ii)所述碱基切除修复的抑制剂选自PARP抑制剂、AG014699、AZD2281、ABT-888、MK4827、BSI-201、INO-1001、TRC-102、APEX 1抑制剂、APEX 2抑制剂和连接酶III抑制剂；
(iii)所述DNA损伤信号传导的抑制剂选自ATM抑制剂、CHK 1抑制剂和CHK 2抑制剂；任选地其中：
(A)所述ATM抑制剂选自CP466722和KU-55933；
(B)所述CHK 1抑制剂选自XL-844、UCN-01、AZD7762和PF00477736；
(C)所述CHK 2抑制剂选自XL-844、AZD7762和PF00477736；和/或
(c)所述DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂选自Weel激酶抑制剂和CDC25a、b或c抑制剂；和/或
(d)所述间接导致DNA损伤的过程的抑制剂选自组蛋白脱乙酰酶抑制剂和热休克蛋白抑制剂；任选地其中所述热休克蛋白抑制剂选自格尔德霉素和AUY922。

说明书全文

用于癌症中免疫治疗的基因标签

技术领域

[0001] 本发明涉及可用于诊断来自不同解剖部位的癌症的分子诊断测试，其包括使用与DNA损伤相关的免疫应答亚型。本发明包括使用44种基因的分类模型来鉴定与DNA损伤修复
缺陷分子亚型相关的这种免疫应答。一项应用是对针对治疗药物种类的响应进行分层并选
择患者，所述治疗药物种类包括抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激
动剂。另一项应用是将癌症患者分层为对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检
查点的激动剂作出响应的那些和对其不作出响应的那些。本发明提供了可以指导常规治疗
选择以及选择患者组用于在新治疗剂的临床试验评价期间进行富集策略的测试。可以由新
鲜/冷冻(fresh/frozen，FF)或福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin 
embedded，FFPE)患者样品鉴定先天性免疫途径STING/TBK1/IRF3活化的癌症亚型。

背景技术

[0002] 生物制药工业不断追求比当前施用的药物更有效、更具特异性或具有更少副作用效果的新药物治疗选择。由于人群中的遗传变异使得很多药物的有效性显著不同，因此正
不断开发新型或替选的药物治疗。因此，尽管当前有广泛多种药物治疗选择可供利用，但是
总是需要更多的药物治疗以防患者不能受益。
[0003] 传统上，医师使用的治疗模式一直是以对治疗疾病可产生最高成功率的一线药物治疗开处方。如果第一种无效的话，则以替选药物治疗开处方。这种治疗模式显然对于某些
疾病而言不是最佳的方法。例如，在如癌症的疾病中，第一治疗通常是最重要的，并且为成
功治疗提供最佳机会，因此非常需要选择对特定患者疾病最有效的初始药物。
[0004] 预期，今年美国将有207,090例新的女性乳腺癌诊断和39,840例女性乳腺癌相关死亡(American Cancer Society：Cancer Facts and Figures 2010)。标准的化学治疗通
常包括直接DNA损伤剂，例如蒽环类和烷化剂以及抗代谢物和抗微管剂。
[0005] 在西方国家，卵巢癌是所有妇科癌症中的主要死亡原因。这一高死亡率是由于大多数患者中的晚期诊断。上皮卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢恶性肿瘤
的90％，并且分类为不同的组织学类别，包括浆液性、黏液性、子宫内膜样、透明细胞性、过渡型、混合型和未分化型亚型。越来越多的证据表明，这些组织学由不同的病因引起。目前
卵巢癌的标准治疗是减积外科手术(debulking surgery)和基于铂剂紫杉烷的标准细胞毒
性化学治疗。但是，并不是所有的患者都对此作出响应，并且在作出响应的那些中，约70％
将经历复发。基于组织学或分子分类的针对卵巢癌的特定靶向治疗尚未进入市场。对于其
他类型的癌症同样如此，仍然没有选择合适的细胞毒性化学治疗剂的准确方式。
[0006] 微阵列和分子基因组学的出现可能对疾病的诊断能力和预后分类产生显著影响，这可有助于预测个体患者对确定治疗方案的响应。微阵列提供大量基因组信息的分析，从
而提供个体的基因组指纹。有很大希望，这是将提供定制药物治疗方案的必需工具的分子
技术之一。
[0007] 目前，医疗保健专业人员具有有限的选择来帮助他们鉴定将受益于化学治疗剂的癌症患者。鉴定最佳一线药物一直是困难的，因为没有准确预测哪种药物治疗对于特定患
者癌症最有效的方法可供使用。这导致相对差的单药剂响应率以及提高的癌症发病率和死
亡率。此外，患者常常不必要地经历无效的且通常具有毒性的药物治疗。
[0008] 分子标志物已被用于选择众多癌症类型的合适治疗。例如，不表达雌激素和孕酮激素受体以及HER2生长因子受体的乳腺肿瘤(称为“三阴性的”)显示对PARP-1抑制剂治疗
具有响应性(Linn，S.C.和Van′t Veer，L.，J.Eur J Cancer 45增刊1，11-26(2009)；O′
Shaughnessy，J.，等N Engl J Med 364，205-214(2011))。最近的研究表明乳腺肿瘤的三阴性状态可指示对包括PARP-1抑制剂的组合治疗的响应性，但可能不足以指示对单独PARP-1
抑制剂的响应性(O′Shaughnessy等，2011)。
[0009] 此外，还有其他研究曾尝试鉴定与分子亚型相关的基因分类器以指示化学治疗剂的响应性(Farmeret al.Nat Med 15，68-74(2009)；Konstantinopoulos，P.A.，等，J Clin Oncol 28，3555-3561(2010))。WO2012/037378描述了癌症的分子诊断测试，并且通过引用
并入本文。
[0010] 发明概述
[0011] 在权利要求书中对本发明进行限定。除治疗方法之外，还考虑相关治疗剂的医疗用途。在一些实施方案中，根据本发明的所有方面，免疫检查点不是PD1/PDL1(在本公开内
容通篇可分别互换地称为PD-1和PD-L1)检查点。在一些实施方案中，根据本发明的所有方
面，抑制性免疫检查点的拮抗剂不是派姆单抗(pembrolizumab)。
[0012] 本发明基于对与DNA损伤修复缺陷型(DNA damage repair deficient，DDRD)肿瘤相关的免疫应答的机制的阐明。DNA损伤修复缺陷型(DDRD)肿瘤激活免疫途径STING/TBK1/
IRF3，导致趋化因子的产生。因此，本发明部分地涉及使用癌症中基因表达标志物的集合的
方法，使得当一些或全部转录物过表达或表达不足时，其鉴定显示出与DNA损伤修复缺陷相
关的先天性免疫应答的癌症亚型。这种亚型的指示可以被视为一种诊断测试，因为其与任
何特定药物无关，而是以在筛选和选择合适癌症治疗方面具有实用性的方式描述癌症的生
物学。然而，与DNA损伤相关的免疫应答由于表达与T细胞耗竭和无反应性相关的免疫抑制
性分子(例如IDO1或PDL1(CD274))而不会产生活性T细胞抗肿瘤应答。因此，本发明还提供
了用于指示针对治疗(包括抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，
任选地与DNA损伤治疗剂组合)的响应性或抗性的方法。在一些不同方面，这种基因或基因
产物列表可形成可使用本领域已知方法递送的单参数或多参数预测测试的基础，所述方法
例如微阵列、核酸扩增(例如Q-PCR)、测序(包括下一代测序和RNAseq)、免疫组织化学、
ELISA或其他可以量化mRNA或蛋白质表达的技术。
[0013] 另外，本文所述的生物途径是癌症本身的特征，类似于分级和分期，并且因此不限于单一的癌症疾病类型。因此，基因或基因产物的集合可以用于预测癌症治疗剂在不同组
织中不同癌症类型中的响应性。在本发明的一个实施方案中，这些基因或基因产物可用于
评价乳腺癌和卵巢癌肿瘤二者。
[0014] 本文所述的发明不局限于任意一种药物；其可用于鉴定针对代表抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的多种药物中任一种的响应者和非响应者。
本文中提供了一些实例。这样的药物可以与直接或间接影响DNA损伤和/或DNA损伤修复的
药物组合施用，例如基于5-氟尿嘧啶、蒽环类和环磷酰胺的新辅助性方案，例如FEC(5-氟尿
嘧啶/表柔比星/环磷酰胺)和FAC(5-氟尿嘧啶/阿霉素/环磷酰胺)。
[0015] 本发明涉及使用对响应的不同分类来预测针对药物的响应，例如总体存活、无进展存活、放射性响应(如由RECIST限定的)、完全响应、部分响应、病情稳定和血清学标志物
(例如但不限于PSA、CEA、CA125、CA15-3和CA19-9)。另一方面，本发明涉及鉴定与癌症中DNA损伤响应缺陷型(DDRD)分子亚型相关的先天性免疫应答。这种分子亚型尤其可以通过使用
两个不同的基因分类器来检测-一个包含40种基因，另一个包含44种基因。DDRD分类器首先
通过由Almac乳腺疾病特异性阵列(DSATM)上53个探针组组成的分类器来确定。为了验证该
分类器在其预测针对含DNA损伤化学治疗方案之响应的能力方面的功能相关性，需要在基
因水平重新确定该分类器。这将有助于使用来自在不同于Almac Breast DSATM之微阵列平
台上谱绘制的独立数据集的微阵列数据来评价DDRD分类器。为了便于在基因水平确定分类
器，需要确定Almac Breast DSATM探针组所映射到的基因。这涉及利用可公开获得的基因组
浏览器数据库，例如Ensembl和NCBI参考序列。仅提供44基因DDRD分类器模型的结果，因为
该模型取代40基因DDRD分类器模型。这些结果表明该分类器模型是针对包含DNA损伤治疗
剂之化学治疗方案的响应的有效且显著的预测因子。
[0016] 可以使用通过40基因分类器模型和44基因分类器模型二者进行的亚型鉴定来预测针对癌症治疗药物种类，特别是抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的
激动剂(任选地与DNA损伤引发剂和DNA修复靶向治疗组合)的响应并选择患者。
[0017] 在另一方面，本发明涉及用于上文列出的常规诊断用途的试剂盒，所述用途例如qPCR、微阵列、测序(例如RNAseq)和免疫测定，例如免疫组织化学、ELISA、Western印迹等。
这样的试剂盒包括测定基因或基因产物的表达和量化mRNA或蛋白质表达的合适试剂和指
南。
[0018] 本发明还提供了用于鉴定免疫应答提高的DNA损伤响应缺陷型(DDRD)人肿瘤的方法。可能的是，本发明可用于鉴定对影响免疫检查点的药物敏感并作出响应或者对其具有
抗性而不作出响应的患者，所述药物例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检
查点的激动剂。这些药物可以与直接损伤DNA、间接损伤DNA或抑制正常DNA损伤信号传导
和/或修复过程的药物组合使用。
[0019] 本发明还涉及指导患者的常规治疗。本发明还涉及选择患者进行激动或拮抗特定免疫检查点的新类型药物的临床试验。
[0020] 本发明和方法适合使用存档的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)活检材料以及新鲜/冷冻(FF)组织来进行本发明中所有转录物的测定，并且因此与最广泛可用的活检材料类型
相容。表达水平可以使用从FFPE组织、新鲜冷冻组织或已经储存在例如 的溶
液中的新鲜组织获得的RNA来确定。
[0021] 附图简述
[0022] 图1提供了展示ER阴性(A)和ER阳性(B)BRCA1/2突变体以及散发性野生型对照乳腺样品的分层分析的图。探针组聚类组群注释在每幅图像的右手侧，并且对每个探针组聚
类组群的途径分析注释在每幅图像的左手侧。每幅图像的图注表示样品的突变状态以及分
配于每个样品用于分类器生成的标签组。
[0023] 图2提供了比较每种分类模型在10次重复5折交叉验证下对(A)组合样品组、(B)ER阴性样品组和(C)ER阳性样品组的AUC性能的盒形图的图。(D)用于选择阈值的交叉验证预
测的灵敏度加特异性图。最大灵敏度加特异性为1.682，其中相应的标签评分为约0.37。
[0024] 图3提供了通过交叉验证评估的使用44基因分类器模型预测BRCA状态的分类性能的ROC曲线的图。在应用分类器模型之后，AUC为约0.68。已经在1000次迭代下由自举
(bootstrap)估算95％置信限。
[0025] 图4提供了44基因分类器模型在用于预测针对基于蒽环类之化学治疗的响应的三个独立数据集(FEC、FAC1和FAC2)(Bonnefoi等，2007；Iwamoto等，J Natl Cancer Inst 
103，264-272(2011)；Lee，J.K.，等Clin Cancer Res 16，711-718(2010))的组合分析中的分类性能的ROC曲线的图。在应用分类器模型之后，AUC为约0.78。已经在1000次迭代下由自
举估算95％置信限。
[0026] 图5提供了44基因分类器模型在针对经T/FAC处理样品中响应的三个独立数据集(Hesset al.，J Clin Oncol 24，4236-4244(2006)；Lee等，2010；Tabchy，A.，等Clin 
Cancer Res 16，5351-5361(2010))的组合分析中的分类性能的ROC曲线的图。
[0027] 图6提供了44基因分类器模型在来自机构内部Almac Diagnostics的卵巢数据集针对经铂剂和紫杉醇处理样品中响应的259个浆液性卵巢癌样品中的分类性能的ROC曲线
的图。在应用分类器模型之后，AUC为约0.68。使用1000次自举迭代来确定95％置信限。
[0028] 图7提供了从健康供体和具有范科尼贫血(Fanconi Anaemia)突变的患者获取的骨髓样品中44基因DDRD分类器评分的直方图展示。在应用分类器模型之后，AUC为0.90。使
用1000次自举迭代来确定95％置信限。
[0029] 图8提供了使44基因分类器模型与BRCA1突变体和野生型细胞系中治疗响应相关联的图。(A)Western印迹分析确定与HCC1937-EV细胞相比，HCC1937-BR细胞中BRCA1的表达
提高。(B)经仅对照载体转染的HCC1937(HCC1937-EV)和具有恢复的BRCA1的外源表达的
HCC1937(HCC1937-BR)细胞系中的平均44基因模型(DDRD)分类器评分(±SEM)。在恒定暴露
于一系列浓度的PARP抑制剂KU0058948(C)和顺铂(D)下HCC1937亲本细胞和HCC1937-BR细
胞的细胞生存力的直方图展示。
[0030] 图9提供了显示DDRD肿瘤与淋巴细胞浸润相关的表格和图像。
[0031] 图10示出了DDRD亚型，I型干扰素图片。
[0032] 图11提供了显示DNA损伤诱导趋化因子(和其他DDRD测定基因)表达的图。数据的统计学显著性如下表示：*表示p值＜0.05，**表示p值＜0.01以及***表示p值＜0.001。
[0033] 图12提供了显示DNA修复缺陷的校正降低趋化因子(和其他DDRD测定基因)的表达的图和图像。
[0034] 图13显示DDRD阳性细胞释放趋化因子到吸引淋巴细胞的条件化培养基中。
[0035] 图14提供了显示DNA损伤剂诱导DDRD基因表达的图。
[0036] 图15提供了显示DDRD标签基因的表达是由细胞周期调节的图。
[0037] 图16提供了显示DDRD基因表达与经典DNA损伤感应子ATM、ATR和DNAPK无关的图。
[0038] 图17显示，STING激活的先天性免疫途径与DDRD标签基因相关。
[0039] 图18提供了显示胞质(cytosolic)DNA感应子被DNA损伤激活并且为DDRD信号传导所需的图像和图。
[0040] 图19提供了显示S期DNA损伤提高细胞质DNA的图像。
[0041] 图20提供了显示DDRD+在乳腺癌样品中显示出显著PD-L1水平的表格和图。
[0042] 图21提供了显示PDL1阳性肿瘤具有活性DDRD信号传导的图。
[0043] 图22提供了显示与淋巴细胞的共培养物提高PDL1表达(特别是在DDRD+模型中)的图。
[0044] 图23提供了显示DNA损伤提高PDL1表达的图和图像。数据的统计学显著性如下表示：*表示p值＜0.05，**表示p值＜0.01以及***表示p值＜0.001。
[0045] 图24提供了显示基因组不稳定性提高替选免疫检查点靶IDO1表达的图像。
[0046] 图25提供了显示与淋巴细胞的共培养物提高IDO1表达(特别是在DDRD+模型中)的图。
[0047] 图26提供了显示DDRD+细胞被保护免受淋巴细胞介导的细胞毒性的图。
[0048] 图27提供了显示IFN-γ驱动DDRD+中PDL-1表达并保护免受PBMC介导的细胞毒性的图和图像。
[0049] 图28提供了显示针对PDL-1的封闭抗体在单独DDRD+细胞中逆转了针对PBMC介导的细胞毒性的抗性的图。
[0050] 图29显示，DDRD鉴定MSI结直肠样品。
[0051] 图30示出了DNA损伤途径的模型。
[0052] 图31：Kaplan Meier分析，其示出了用基于免疫的治疗(免疫检查点调节剂，例如伊匹单抗(Ipilimumab)和派姆单抗)和/或DNA损伤剂处理的DDRD阳性患者和DDRD阴性患者
在局部复发存活率方面的差异。HR＝0.39[95％CI：0.18-0.84]，p＝0.0008。
[0053] 图32：Kaplan Meier分析，其示出了用基于免疫的治疗(免疫检查点调节剂，例如伊匹单抗和派姆单抗)和/或DNA损伤剂处理的DDRD阳性患者和DDRD阴性患者在远端复发存
活率方面的差异。HR＝0.44[95％CI：0.19-0.99]，p＝0.0095。
[0054] 图33：Kaplan Meier分析，其示出了用基于免疫的治疗(免疫检查点调节剂，例如伊匹单抗和派姆单抗)和/或DNA损伤剂处理的DDRD阳性患者和DDRD阴性患者在总体存活率
方面的差异。HR＝0.31[95％CI：0.12-0.81]，p＝0.0006。
[0055] 发明详述
[0056] 本发明提供了预测针对免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性的方法，其包括：确定来自对象的样品中选自表
2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于预测针对抑制性免疫检
查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。在本发明的任一种方法中，还可
以确定一种或更多种另外的基因(即，不同于表2B、2A或1中提供的那些的基因)的表达水
平，并用于预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应
性。
[0057] 在所述方法中，至少一种基因的表达水平提高可以预测具有针对免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性。
[0058] 所述方法可以包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平可以用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)预
测具有针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
[0059] 所述方法可以包括：推导捕获表达水平的组合测试评分；提供包含使组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；以及将组合测试评分与阈值评分进行比较；其中当
组合测试评分超过阈值评分时，预测具有响应性。
[0060] 所述方法可以包括确定选自以下的至少6种基因、至少7种基因、至少8种基因、至少9种基因、至少10种基因、至少11种基因、至少12种基因、至少13种基因、至少14种基因、至少15种基因、至少16种基因、至少17种基因、至少18种基因、至少19种基因、至少20种基因、至少21种基因、至少22种基因、至少23种基因、至少24种基因、至少25种基因、至少26种基
因、至少27种基因、至少28种基因、至少29种基因、至少30种基因、至少31种基因、至少32种基因、至少33种基因、至少34种基因、至少35种基因、至少36种基因、至少37种基因、至少38种基因、至少39种基因、至少40种基因、至少41种基因、至少42种基因或至少43种基因的表
达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0061] 所述方法可以包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因，以及选自以下的至少1种另外基因、至少2种另外基因、至少3种另外基因、至少4种另外基因、
至少5种另外基因、至少6种另外基因、至少7种另外基因、至少8种另外基因、至少9种另外基因、至少10种另外基因、至少11种另外基因、至少12种另外基因、至少13种另外基因、至少14种另外基因、至少15种另外基因、至少16种另外基因、至少17种另外基因、至少18种另外基
因、至少19种另外基因、至少20种另外基因、至少21种另外基因、至少22种另外基因、至少23种另外基因、至少24种另外基因、至少25种另外基因、至少26种另外基因、至少27种另外基
因、至少28种另外基因、至少29种另外基因、至少30种另外基因、至少31种另外基因、至少32种另外基因、至少33种另外基因、至少34种另外基因、至少35种另外基因、至少36种另外基
因、至少37种另外基因或至少38种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。优选地，所述方法包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及以下每一种的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0062] 所述方法可以包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少两种基因，以及选自以下的至少1种另外基因、至少2种另外基因、至少3种另外基因、至少4种另外基因、
至少5种另外基因、至少6种另外基因、至少7种另外基因、至少8种另外基因、至少9种另外基因、至少10种另外基因、至少11种另外基因、至少12种另外基因、至少13种另外基因、至少14种另外基因、至少15种另外基因、至少16种另外基因、至少17种另外基因、至少18种另外基
因、至少19种另外基因、至少20种另外基因、至少21种另外基因、至少22种另外基因、至少23种另外基因、至少24种另外基因、至少25种另外基因、至少26种另外基因、至少27种另外基
因、至少28种另外基因、至少29种另外基因、至少30种另外基因、至少31种另外基因、至少32种另外基因、至少33种另外基因、至少34种另外基因、至少35种另外基因、至少36种另外基
因、至少37种另外基因或至少38种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。优选地，所述方法包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少两种基因以及以下每一种的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0063] 所述方法可以包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少三种基因，以及选自以下的至少1种另外基因、至少2种另外基因、至少3种另外基因、至少4种另外基因、
至少5种另外基因、至少6种另外基因、至少7种另外基因、至少8种另外基因、至少9种另外基因、至少10种另外基因、至少11种另外基因、至少12种另外基因、至少13种另外基因、至少14种另外基因、至少15种另外基因、至少16种另外基因、至少17种另外基因、至少18种另外基
因、至少19种另外基因、至少20种另外基因、至少21种另外基因、至少22种另外基因、至少23种另外基因、至少24种另外基因、至少25种另外基因、至少26种另外基因、至少27种另外基
因、至少28种另外基因、至少29种另外基因、至少30种另外基因、至少31种另外基因、至少32种另外基因、至少33种另外基因、至少34种另外基因、至少35种另外基因、至少36种另外基
因、至少37种另外基因或至少38种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。优选地，所述方法包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少三种基因以及以下每一种的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0064] 所述方法可以包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少四种基因，以及选自以下的至少1种另外基因、至少2种另外基因、至少3种另外基因、至少4种另外基因、
至少5种另外基因、至少6种另外基因、至少7种另外基因、至少8种另外基因、至少9种另外基因、至少10种另外基因、至少11种另外基因、至少12种另外基因、至少13种另外基因、至少14种另外基因、至少15种另外基因、至少16种另外基因、至少17种另外基因、至少18种另外基
因、至少19种另外基因、至少20种另外基因、至少21种另外基因、至少22种另外基因、至少23种另外基因、至少24种另外基因、至少25种另外基因、至少26种另外基因、至少27种另外基
因、至少28种另外基因、至少29种另外基因、至少30种另外基因、至少31种另外基因、至少32种另外基因、至少33种另外基因、至少34种另外基因、至少35种另外基因、至少36种另外基
因、至少37种另外基因或至少38种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。优选地，所述方法包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少四种基因以及以下每一种的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0065] 所述方法可以包括确定CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1中每一种，以及选自以下的至少1种另外基因、至少2种另外基因、至少3种另外基因、至少4种另外基因、至少5种另外基因、至少6种另外基因、至少7种另外基因、至少8种另外基因、至少9种另外基因、至少10种另外基因、至少11种另外基因、至少12种另外基因、至少13种另外基因、至少14种另外基因、至少15种另外基因、至少16种另外基因、至少17种另外基因、至少18种另外基因、至少19种
另外基因、至少20种另外基因、至少21种另外基因、至少22种另外基因、至少23种另外基因、至少24种另外基因、至少25种另外基因、至少26种另外基因、至少27种另外基因、至少28种
另外基因、至少29种另外基因、至少30种另外基因、至少31种另外基因、至少32种另外基因、至少33种另外基因、至少34种另外基因、至少35种另外基因、至少36种另外基因、至少37种
另外基因或至少38种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A、和AL137218.1。
[0066] 所述方法可以包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0067] 所述方法可以包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基
因的表达水平。
[0068] 所述方法可以包括确定以下每一项的表达水平：
[0069] ●CXCL10；
[0070] ●CXCL10和MX1；
[0071] ●CXCL10，IDO1和MX1；
[0072] ●CXCL10，IDO1，IFI44L和MX1；
[0073] ●CD2，CXCL10，IDO1，IFI44L和MX1；
[0074] ●CD2，CXCL10，GBP5，IDO1，IFI44L和MX1；
[0075] ●CD2，CXCL10，GBP5，IDO1，IFI44L，MX1和PRAME；
[0076] ●CD2，CXCL10，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，MX1和PRAME；
[0077] ●CD2，CXCL10，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，LRP4，MX1和PRAME；
[0078] ●APOL3，CD2，CXCL10，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，LRP4，MX1和PRAME；
[0079] ●APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，LRP4，MX1和PRAME；
[0080] ●APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，LRP4，MX1和PRAME；
[0081] ●APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，LRP4，MX1，PRAME和TSPAN7；
[0082] ●APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0083] ●APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，IDO1，IFI44L，ITGAL，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0084] ●APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0085] ●AC138128.1，APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0086] ●AC138128.1，APOL3，CD2，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0087] ●AC138128.1，APOL3，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0088] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0089] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0090] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0091] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，OLFM4，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0092] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，OLFM4，PI15，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0093] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，OLFM4，PI15，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0094] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，OLFM4，PI15，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0095] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，RAC2和TSPAN7；
[0096] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2和TSPAN7；
[0097] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CXCL10，EGR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAG2和TSPAN7；
[0098] ●AC138128.1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2和TSPAN7；
[0099] ●AC138128.1，ADAMTS4，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2和TSPAN7；
[0100] ●AC138128.1，ADAMTS4，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，SP140L和TSPAN7；
[0101] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAG2，SP140L和TSPAN7；
[0102] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAG2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0103] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0104] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0105] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0106] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGFR，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0107] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGFR，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LRP4，MFAP5，MX1，NAT1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0108] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，EGFR，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LATS2，LRP4，MFAP5，MX1，NAT1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140和TSPAN7；
[0109] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，CYP2B6，EGFR，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LATS2，LRP4，MFAP5，MX1，NAT1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PRAME，PRICKLE1，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0110] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，CYP2B6，EGFR，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LATS2，LRP4，MFAP5，MX1，NAT1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PRAME，PRICKLE1，PTPRC，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；
[0111] ●AC138128.1，ADAMTS4，ANXA1，APOL3，CD109，CD2，CD274，CDR1，CLDN10，CXCL10，CYP2B6，EGFR，EGR1，ESR1，ETV7，FAM19A5，FOSB，FYB，GBP5，GRB14，IDO1，IFI44L，IKZF3，ITGAL，KIF26A，KLHDC7B，LATS2，LRP4，MFAP5，MX1，NAT1，NLRC5，OLFM4，OR2I1P，PI15，PPP1R1A，PRAME，PRICKLE1，PTPRC，RAC2，RSAD2，SP140L和TSPAN7；或者
[0112] ●CXCL10，MX1，IDO1，IFI44L，CD2，GBP5，PRAME，ITGAL，LRP4，APOL3，CDR1，FYB，TSPAN7，RAC2，KLHDC7B，GRB14，AC138128.1，KIF26A，CD274，CD109，ETV7，MFAP5，OLFM4，PI15，FOSB，FAM19A5，NLRC5，PRICKLE1，EGR1，CLDN10，ADAMTS4，SP140L，ANXA1，RSAD2，ESR1，IKZF3，OR2I1P，EGFR，NAT1，LATS2，CYP2B6，PTPRC，PPP1R1A，和AL137218.1.
[0113] 在所述方法中，每种基因的权重值可以如表2B中所示，或者每种基因的权重值和/或偏倚值可以如表3至45中任一个所示。
[0114] 所述方法可以包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基因)的至少
一种另外基因的表达水平。
[0115] 本发明提供了用于预测针对与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性的方法，其包括：确
定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平
用于预测针对与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗
剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性。所确定的表达水平可以用于预测针对与
DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免
疫检查点的激动剂)的同时、分开或依次施用(或使用)的响应性。
[0116] 在所述方法中，至少一种基因的表达水平提高可以预测具有针对与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的
激动剂)的响应性。
[0117] 所述方法可以包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平可以用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)预
测具有针对与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂
和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性。
[0118] 用于预测针对与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性的方法可以包括确定本文所述任
一种基因或基因集合的表达水平。
[0119] 本发明提供了用于鉴定可用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症的方法，其包括：
[0120] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于鉴定可用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激
性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症。
[0121] 在所述方法中，至少一种基因的表达水平提高可以鉴定为可用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症。
[0122] 所述方法可以包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平可以用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)鉴
定为可用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的
激动剂)有效治疗的癌症。
[0123] 所述方法可以包括：推导捕获表达水平的组合测试评分；提供包含使组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；以及将组合测试评分与阈值评分进行比较；其中当
组合测试评分超过阈值评分时，鉴定位可有效治疗的癌症。
[0124] 用于鉴定可用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症的方法可以包括确定本文所述任一种基因或基因集
合的表达水平。
[0125] 本发明提供了用于鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症的方法，其包
括：
[0126] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检
查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症。所确定的表达水平可以
用于鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗
剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的同时、分开或依次施用(或使用)有效治疗的癌症。
[0127] 在所述方法中，至少一种基因的表达水平提高可以鉴定为可用与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激
动剂)有效治疗的癌症。
[0128] 所述方法可以包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平可以用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)鉴
定为可用与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/
或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症。
[0129] 用于鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)有效治疗的癌症的方法可以包括确定本文
所述任一种基因或基因集合的表达水平。
[0130] 本发明提供了用于针对癌症选择治疗的方法，其包括：确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于选择用于治疗癌症
的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动
剂)。
[0131] 在所述方法中，至少一种基因的表达水平提高用于选择用于治疗癌症的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)。
[0132] 所述方法可以包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平可以用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)用
于选择用于治疗癌症的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性
免疫检查点的激动剂)。
[0133] 所述方法还可以包括使用所选择的拮抗剂和/或激动剂来治疗癌症。
[0134] 所述方法可以包括：推导捕获表达水平的组合测试评分；提供包含使组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；以及将组合测试评分与阈值评分进行比较；其中当
组合测试评分超过阈值评分时，选择使用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮
抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)。
[0135] 用于针对癌症选择治疗的方法可以包括确定本文所述任一种基因或基因集合的表达水平。
[0136] 本发明提供了用于针对癌症选择治疗的方法，其包括：确定来自对象的样品中选自2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于选择用于治疗癌症
的、与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺
激性免疫检查点的激动剂)。所确定的表达水平可以用于选择用于同时、分开或依次使用来
治疗癌症的、与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂
和/或刺激性免疫检查点的激动剂)。
[0137] 在所述方法中，至少一种基因的表达水平提高可以用于选择用于治疗癌症的、与DNA损伤治疗剂组合使用的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激
性免疫检查点的激动剂)。
[0138] 所述方法可以包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平可以用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于或高于阈值)用
于选择用于治疗癌症的、与DNA损伤治疗剂组合使用的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫
检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)。
[0139] 所述方法还可以包括将选择的调节剂(例如拮抗剂和/或激动剂)与DNA损伤治疗剂组合使用来治疗癌症。
[0140] 所述方法可以包括：推导捕获表达水平的组合测试评分；提供包含使组合测试评分与响应性相关联之信息的阈值评分；以及将组合测试评分与阈值评分进行比较；其中当
组合测试评分超过阈值评分时，选择与DNA损伤治疗剂组合使用的免疫检查点调节剂(例如
抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)。
[0141] 在所述方法中，组合测试评分(或“标签评分”)可以根据下式推导：
[0142]
[0143] 其中wi是每种基因的权重，bi是基因特异性偏倚，gei是预处理后的基因表达，并且k是常值偏移。
[0144] 组合测试评分可以使用本文所述任一种基因或基因集合的表达水平来推导。组合测试评分可以使用一种或更多种另外基因的表达水平来推导。
[0145] 本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向对象施用免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)，其特征在于，在施用之前来自
对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合
测试评分或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
[0146] 本发明提供了治疗癌症的方法，其包括将与DNA损伤治疗剂组合的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)施用于对象，其
特征在于，在施用之前来自对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表
达水平所推导的阳性组合测试评分或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)和
DNA损伤治疗剂可以同时、分开或依次施用于对象。
[0147] 治疗癌症的方法可以包括确定本文所述任一种基因或基因集合的表达水平。
[0148] 本发明提供了用于在对象中治疗癌症的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)，其中在施用拮抗剂和/或激动剂之前来自
对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合
测试评分或来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
[0149] 本发明提供了用于在对象中治疗癌症的免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)，其中在施用拮抗剂和/或激动剂之前来自
对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合
测试评分或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高，并且其中所述拮抗剂和/
或激动剂与DNA损伤治疗剂组合施用。免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂
和/或刺激性免疫检查点的激动剂)和DNA损伤治疗剂可以同时、分开或依次施用于对象。
[0150] 本发明提供了用于在对象中治疗癌症的免疫检查点调节剂(例如与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或与DNA损伤治疗剂组合的刺激性免疫检查点的
激动剂)，其中在施用拮抗剂和/或激动剂与DNA损伤治疗剂之前来自对象的样品显示出由
来自表2B、2A或1的至少两种基因确定的表达水平所推导的阳性组合测试评分或者来自表
2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。免疫检查点调节剂(例如抑制性免疫检查点的
拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)和DNA损伤治疗剂可以在对象的癌症治疗中同
时、分开或依次使用。
[0151] 确定表达水平的基因可以是本文所述的任一种基因或基因集合。
[0152] 可以根据本文所述的任一种方法来针对治疗选择对象。
[0153] 样品可以包含癌细胞。样品可以是组织样品，例如经固定并包埋的组织样品。
[0154] 癌症可以选自白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食管癌、胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌或头颈癌。
[0155] 抑制性免疫检查点可以是抑制免疫应答的调控途径或这样的途径中的分子。抑制性免疫检查点可以是由B细胞和/或T细胞表达的多肽。抑制性免疫检查点可以是抑制性受
体。抑制性免疫检查点可以是膜受体。优选地，抑制性免疫检查点是抑制性膜受体。抑制性
免疫检查点的配体可以是膜结合的或可溶性的。
[0156] 抑制性免疫检查点可以选自A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、PD-1/PD-L1、TIM-3和VISTA。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点不是PD-1/PD-L1。在一些实施方案中，该免疫检查点是IDO。
[0157] 抑制性免疫检查点的拮抗剂可以放大抗原特异性B细胞和/或T细胞应答。抑制性免疫检查点的拮抗剂可以抑制抑制性受体与其配体之间的相互作用。抑制性免疫检查点的
拮抗剂可以选自抗体和抑制性核酸分子。
[0158] 抗体可以是单克隆或多克隆来源的。也可以使用片段和衍生物抗体，包括但不限于保留肽特异性结合功能的Fab片段、ScFv、单结构域抗体、纳米抗体、重链抗体、适配体等，并且这些包括在“抗体”的定义之中。这样的抗体可用于实施本发明。用于产生特异性抗体
的方法是本领域技术人员已知的。抗体可以是人或非人来源的(例如啮齿动物，例如大鼠或
小鼠)并且可以是根据已知技术而人源化的，等等(Jones等，Nature(1986)5月29日-6月4
日；321(6069)：522-5；Roguska等，Protein Engineering，1996，9(10)：895-904；和
Studnicka等，Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D 
Structure.Protein Engineering，1994，第7卷，第805页)。
[0159] 抑制性核酸分子可以是单链或双链的。抑制性核酸分子的实例包括反义核酸、RNAi、siRNA、shRNA、miRNA、shmiRNA、或者其衍生物或前体。
[0160] 抑制性免疫检查点的拮抗剂可以选自MGA271(靶向B7-H3)、伊匹单抗(ipilimumab)(Yervoy-靶向CTLA-4)、indoximod(靶向IDO途径)、NLG919(靶向IDO途径)、利
丽单抗(靶向KIR)、IMP321(靶向LAG3)、BMS-986016(靶向LAG3)、CT-011(PD-1阻断)、尼伏单抗/BMS-936558(PD-1阻断)、BMS-936559(PDL1阻断)和派姆单抗(Keytruda-靶向PD-1)。优
选地，拮抗剂不是派姆单抗。另一些拮抗剂包括MGB453(靶向TIM-3)、LAG525(靶向LAG-3)和
PDR001(PD1阻断)。
[0161] 刺激性免疫检查点可以是激活免疫应答的调控途径或这样的途径中的分子。刺激性免疫检查点可以是由B细胞和/或T细胞表达的多肽。刺激性免疫检查点可以是膜受体。刺
激性免疫检查点可以是共刺激性受体。共刺激性受体可以是T细胞共刺激性受体或B细胞共
刺激性受体。刺激性免疫检查点的配体可以是膜结合的或可溶性的。
[0162] 刺激性免疫检查点可以选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS。
[0163] 刺激性免疫检查点的激动剂可以扩大抗原特异性B细胞和/或T细胞应答。刺激性免疫检查点的激动剂可以提高共刺激性受体与其配体之间的相互作用。刺激性免疫检查点
的激动剂可以包含与(共)刺激性受体结合的配体分子。刺激性免疫检查点的激动剂可以选
自抗体(如本文所述)、脂质运载蛋白(lipocalin)和细胞因子。
[0164] 脂质运载蛋白可以是引入脂质运载蛋白或者脂质运载蛋白的片段或衍生物的分子。这样的保留用作刺激性免疫检查点之激动剂的功能的分子包括在“脂质运载蛋白”的定
义之中。
[0165] 细胞因子可以是引入细胞因子或者细胞因子的片段或衍生物的分子。这样的保留用作刺激性免疫检查点之激动剂的功能的分子包括在“细胞因子”的定义之中。
[0166] 刺激性免疫检查点的激动剂可以选自CDX-1127(CD27的激动剂)、NKTR-214(CD122的激动剂)、BMS-663513(CD137的激动剂)、TRX518(GITR的激动剂)、CP-870893(CD40激动
剂)、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383(OX40激动剂)。
[0167] DNA损伤治疗剂可以选自DNA损伤剂、DNA修复靶向治疗、DNA损伤信号传导的抑制剂、DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂和间接导致DNA损伤的过程的抑制剂。
[0168] DNA损伤剂可以选自烷化剂、拓扑异构酶抑制剂和辐射。烷化剂可以选自含铂剂、环磷酰胺和白消安。含铂剂可以选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。拓扑异构酶抑制剂可以选自拓
扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂可以选自伊立替康和拓扑替
康。拓扑异构酶II抑制剂可以选自依托泊苷和蒽环类。蒽环类可以选自多柔比星和表柔比
星。所述辐射可以是电离辐射。
[0169] DNA修复靶向治疗可以选自非同源末端连接的抑制剂、同源重组的抑制剂、核苷酸切除修复的抑制剂、碱基切除修复的抑制剂和范科尼贫血途径的抑制剂。非同源末端连接
的抑制剂可以选自DNA-PK抑制剂、Nu7441和NU7026。碱基切除修复的抑制剂可以选自PARP
抑制剂、AG014699、AZD2281、ABT-888、MK4827、BSI-201、INO-1001、TRC-102、APEX 1抑制剂、APEX 2抑制剂和连接酶III抑制剂。
[0170] DNA损伤信号传导的抑制剂可以选自ATM抑制剂、CHK 1抑制剂和CHK 2抑制剂。ATM抑制剂可以选自CP466722和KU-55933。CHK 1抑制剂可以选自XL-844、UCN-01、AZD7762和
PF00477736。CHK 2抑制剂可以选自XL-844、AZD7762和PF00477736。
[0171] DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂可以选自Wee1激酶抑制剂和CDC25a、b或c抑制剂。
[0172] 间接导致DNA损伤的过程的抑制剂可以选自组蛋白脱乙酰酶抑制剂和热休克蛋白抑制剂。
[0173] 热休克蛋白抑制剂可以选自格尔德霉素(geldanamycin)和AUY922。
[0174] 除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中可以使用与本文所述的那些相
似或等同的任何方法、装置和材料，但是现在对一些优选的方法、装置和材料进行描述。
[0175] 本申请中引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请指示本申请所属领域的技术水平。本文引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请通过引用并入本文，程度如同每
篇单独的出版物、公开专利文件或专利申请具体地且单独地指示为通过引用并入。
[0176] 没有数量词修饰的名词在本文中用于指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)。举例来说，除非明确指示相反，否则“要素”是指一个要素或多于一个要素。
[0177] 当前癌症研究努力的主要目标是通过将分子参数纳入临床治疗决策来提高围手术期(perioperative)系统性治疗在患者中的效力。药物遗传学/基因组学是对参与个体针
对外源性化合物或药物的响应的遗传因子/基因组因子的研究。可以向个体施用对本发明
标志物的表达具有刺激性或抑制性作用的药剂或调节剂来在患者中治疗(预防性或治疗
性)癌症。还将个体的药物基因组学与这样的治疗联合考虑是理想的。治疗剂代谢的差异可
能通过改变药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系而导致严重毒性或治疗失效。因
此，了解个体的药物基因组学允许选择有效药剂(例如药物)用于预防性或治疗性治疗。这
样的药物基因组学可以进一步用于确定合适的剂量和治疗方案。因此，可以确定个体中本
发明标志物的表达水平，从而选择用于治疗性或预防性治疗个体的合适药剂。
[0178] 本发明涉及在癌组织中表达的基因或基因产物标志物(在下文称为“生物标志物”)的独特集合。在一些不同方面，该生物标志物列表可以形成可使用本领域已知方法递
送的单参数或多参数预测测试的基础，所述方法例如微阵列、Q-PCR、测序(例如RNA seq)、
免疫组织化学、ELISA或其他可以量化mRNA或蛋白质表达的技术。
[0179] 本发明还涉及可用于细胞毒性化学治疗后预后或针对癌症选择特定治疗的试剂盒和方法。提供了这样的方法，使得当一些或全部转录物过表达或表达不足时，表达谱指示
针对免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)
的响应性或抗性。这些试剂盒和方法使用在癌症患者的肿瘤中差异表达的基因或基因产物
标志物。在本发明的一个实施方案中，这些生物标志物的表达谱在统计学方法或关联模型
下与存档组织样品中的临床结果(响应或存活)相关联，从而建立使表达谱与针对一种或更
多种免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，
任选地与DNA损伤治疗剂组合)相关联的数据集或模型。预测模型然后可以用于预测针对免
疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应
性未知的患者中的响应性。在很多其他实施方案中，基于患者的临床结果、预后或针对免疫
检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应
性，可以将患者群体分为至少两个类别，并且生物标志物与这些患者类别之间的类别区别
显著相关。本文所述的生物学途径对于作为疾病的癌症而言是常见的，类似于分级和分期，
并且因此分类器和方法不限于单一癌症疾病类型。
[0180] 预测性标志物组/表达分类器
[0181] 提供了在癌症组织中表达的生物标志物的独特集合作为遗传分类器，其可用于确定针对用于治疗癌症的治疗剂(例如免疫检查点治疗，例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/
或刺激性免疫检查点的激动剂)的响应性或抗性。这样的集合可以被称为“标志物组”、“表达分类器”或“分类器”。
[0182] 表1中标识了可用于本发明方法的一些生物标志物。这些生物标志物被鉴定为具有确定存在针对治疗剂的患者响应或缺乏所述响应的预测价值。其表达与针对药剂并且更
特别地免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动
剂，任选地与DNA损伤治疗剂组合)的响应相关。通过检测所鉴定生物标志物的集合在肿瘤
中的表达，可以确定哪种治疗剂或药剂组合将最有可能降低癌症并且在一些实施方案中降
低乳腺癌或卵巢癌细胞的生长速率。通过检测所鉴定转录物基因或基因产物标志物的集
合，还可以确定哪种治疗剂或药剂组合将最不可能降低癌症的生长速率。通过检测生物标
志物集合的表达，因此可以消除无效或不合适的治疗剂。重要的是，在某些实施方案中，这
些确定可以针对每位患者或针对每种药剂逐一进行。因此，可以确定特定治疗方案是否可
能有益于特定患者或患者类型，和/或特定方案是否应继续进行下去。
[0183] 表1A
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188] 表1B
[0189]
[0190] 表1中所记载生物标志物的全部或一部分可以用于预测性生物标志物组使用。例如，可以使用本文提供的方法来生成选自表1中生物标志物的生物标志物组，并且其可以包
含表1中所示生物标志物中的一种至所有，以及介于之间的每一个组合(例如，4种所选生物
标志物、16种所选生物标志物、74种所选生物标志物等)。在一些实施方案中，预测性生物标志物组包含至少5、10、20、40、60、100、150、200、或300种或者更多种生物标志物。在另一些实施方案中，预测性生物标志物组包含不超过5、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500、
600或700种生物标志物。在一些实施方案中，预测性生物标志物组包含表1中所列的多种生
物标志物。在一些实施方案中，预测性生物标志物组包含表1中所列的至少约1％、约5％、约
10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约
97％、约98％或约99％的生物标志物。所选的预测性生物标志物组可以由使用本文所述方
法和本领域已知的类似方法提供的预测性生物标志物组装。在一个实施方案中，生物标志
物组包含表1中的全部203种生物标志物。在另一个实施方案中，生物标志物组包含表1或表
2中的40或44种生物标志物。
[0191] 预测性生物标志物组可以与具有不同幅度的实际标度上的对应标量权重组合限定，所述标量权重通过线性或非线性、代数、三角函数或关联手段进一步组合成单个标量
值，其通过代数、统计学学习、贝叶斯、回归或类似算法与标量值上的数学推导决策函数一
起提供可将来自样品的表达谱解析为以下离散类别的预测模型：针对指定药物或药物种类
的响应者或非响应者、抗性或非抗性的。这样的预测模型(包括生物标志物隶属关系)由来
自具有已知药物响应和/或抗性之历史患者样品的代表性表达谱的组通过学习权重和经在
交叉验证、自举或类似抽样技术下针对灵敏度、特异性、阴性和阳性预测值、风险比或其任
意组合优化的决策阈值开发。
[0192] 在一个实施方案中，生物标志物用于形成其信号的加权总和，其中单独权重可以是正值或负值。将所得总和(“决策函数”)与预定参考点或参考值进行比较。与参考点或参
考值的比较可以用于诊断或预测临床状况或结果。
[0193] 如上所述，本领域普通技术人员将理解，表1中所提供分类器中包含的生物标志物在用于针对治疗剂之响应性或抗性的分类器中携带不相等的权重。因此，虽然可以使用少
至一种序列来诊断或预测结果(例如针对治疗剂的响应性)，但是使用更多种序列可以提高
特异性和灵敏度或者诊断或预测准确性。
[0194] 本文使用的术语“权重”是指项目在统计学计算中的相对重要性。基因表达分类器中每种生物标志物的权重可以使用本领域已知的分析方法对患者样品的数据集确定。
[0195] 在一个实施方案中，生物标志物组涉及表2A中详述的40种生物标志物，其具有该表格中详述的对应排名和权重，或者基于例如疾病背景的替选排名和权重。在另一个实施
方案中，生物标志物组涉及表2B中详述的44种生物标志物，其具有该表格中详述的对应排
名和权重，或者基于例如疾病背景的替选排名和权重。表2A和2B以分类器中权重递减的顺
序对生物标志物进行排名，限定为在交叉验证下测量的复合决策评分函数中的平均权重的
排名。表2C提供了参考序列ID号表示表2A和2B中基因的探针组。表2D提供了阵列上存在的
针对标签中基因的反义探针序列。
[0196] 表2A
[0197] 具有相关排名和权重的40基因DDRD分类器模型的基因ID和EntrezGene ID
[0198]
[0199] 表2B
[0200] 具有相关排名和权重的44基因DDRD分类器模型的基因ID和EntrezGene ID
[0201]
[0202]
[0203]
[0204] 表2C
[0205] 40和44基因标签中所包含基因的探针组ID和SEQ号
[0206]
[0207]
[0208]
[0209] 表2D
[0210] 40基因标签中反义探针组的Almac ID和Almac基因代号以及SEQ ID号
[0211]
[0212]
[0213] 在一些不同实施方案中，表2A和表2B中所列生物标志物的亚组可以用于本文所述的方法。这些亚组包括但不限于表2A和表2B中排名1至2、1至3、1至4、1至5、1至10、1至20、1至30、1至40、1至44、6至10、11至15、16至20、21至25、26至30、31至35、36至40、36至44、11至
20、21至30、31至40和31至44的生物标志物。在一个方面，如下在个体中预测治疗响应性：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自对应于生物标志物GBP5、CXCL10、IDO1和MX1中至
少一种和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外的生物标志物的生物标志物值，其中N
等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35或36。本文使用的术语“生物标志物”可以指指示基因表达水平或蛋白质产生水平的基因、mRNA、cDNA、反义转录物、miRNA、多肽、蛋白质、蛋白质片段或者任何其他核酸序列或多肽序列。在一些实施方案中，当提及CXCL10、IDO1、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2I1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、或
AL137218.1的生物标志物时，该生物标志物分别包含CXCL10、IDO1、CD2、GBP5、PRAME、
ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2I1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、或
AL137218.1的mRNA。在另一些或其他实施方案中，当提及MX1、GBP5、IFI44L、BIRC3、IGJ、IQGAP3、LOC100294459、SIX1、SLC9A3R1、STAT1、TOB1、UBD、C1QC、C2orf14、EPSTI、GALNT6、HIST1H4H、HIST2H4B、KIAA1244、LOC100287927、LOC100291682、或LOC100293679的生物标志物时，该生物标志物分别包含MX1、IFI44L、GBP5、BIRC3、IGJ、IQGAP3、LOC100294459、SIX1、SLC9A3R1、STAT1、TOB1、UBD、C1QC、C2orf14、EPSTI、GALNT6、HIST1H4H、HIST2H4B、KIAA1244、LOC100287927、LOC100291682、或LOC100293679的反义转录物。
[0214] 在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自对应于生物标志物GBP5、CXCL10、IDO1和MX1以及选自表2B中生
物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一的生物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35或36。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的
生物样品进行测定并检测各自对应于生物标志物GBP5和选自表2B中生物标志物列表的至
少N种另外生物标志物之一的生物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或
39。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品
进行测定并检测各自对应于生物标志物CXCL10和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另
外生物标志物之一的生物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测
定并检测各自对应于生物标志物IDO1和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标
志物之一的生物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各
自对应于生物标志物MX-1和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一的
生物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39。
[0215] 在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自对应于生物标志物CXCL10、MX1、IDO1和IFI44L中至少两种以及
选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物的生物标志物值，其中N等于1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自对应于生物标志物CXCL10、MX1、
IDO1和IFI44L以及选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一的生物标志
物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自对应于生物标
志物CXCL10和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一的生物标志物
值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自对应
于生物标志物MX1和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一的生物标
志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各自
对应于生物标志物IDO1和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一的生
物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在另一个方面，如下在个体中预测治疗响应性或指示癌症诊断：对来自个体的生物样品进行测定并检测各
自对应于生物标志物IFI44L和选自表2B中生物标志物列表的至少N种另外生物标志物之一
的生物标志物值，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。
[0216] 在另一些实施方案中，表2C中列出的探针(SEQ ID NO：83至202)或其亚组可以用于本文所述的方法。这些亚组包括但不限于对应于GBP5、CXCL10、IDO1、MX1、IF1441、CD2、PRAME、ITGAL、LRP4和APOL3中一种或更多种的SEQ ID NO的亚组。在另一些实施方案中，探
针对应于所有以下生物标志物CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和
AL137218.1。应理解，每个亚组可以包括针对相同生物标志物的多种探针。例如，由SEQ ID NO：135、140、142和195表示的探针全部针对GBP5。因此，包含针对或对应于GBP5的探针的亚组包括SEQ ID NO：135、140、142和195中的一种或更多种。包含针对或对应于CXCL10的探针的亚组包括SEQ ID NO：131和160中的一种或更多种。
[0217] 在另一些实施方案中，可以使用特异性核酸扩增测定(例如PCR，例如qPCR)来确定本文所述一种或更多种基因或基因集合的表达水平。一种或更多种基因的表达水平可以使
用与这一种或更多种基因之序列杂交的引物(引物对)和/或探针来确定。表2E中提供了针
对44基因DDRD分类器模型中每一种基因的示例性引物对和探针。针对每一种基因提供的引
物对和/或探针可以单独使用，或者可以根据本文所述的任一基因集合组合使用两种或更
多种引物对和/或探针。例如，表2E中提供的引物对和/或探针可以用于确定表3至45中提供
的任一基因标签的表达水平。表2E中总结了用于44基因DDRD分类器模型中每一种基因的示
例性PCR测定。针对每一种基因提供的PCR测定可以单独使用，或者可以根据本文所述的任
一基因集合使用两种或更多种测定。例如，表格中提供的PCR测定可以用于确定表3至45中
提供的任一基因标签的表达水平。
[0218] 表2E-针对表2B中所列的44种基因中每一种设计的PCR测定
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223] 应注意，可以适当地采用本文所述的每种序列的互补物(例如用于设计杂交探针和/或引物，包括引物对)。
[0224] 代表44基因标签的选择方案的另外基因标签在本文中被描述，并且适用于本发明的所有方面。另外的基因标签与在计算最终标签评分(如本文进一步描述的)时可采用的合
适权重和偏倚评分一起示于表3至45中。一旦已经确定用于限定正标签评分的阈值，每种标
签的k值就可以被设置，如技术人员将容易理解的那样。类似地，标签中每种基因的排名可
以容易地通过查看归属于每种基因的权重来确定(其中权重越大表示在标签中排名越高-
关于40和44基因标签的排名顺序，分别参见表2A和2B)。
[0225] 虽然表3至45提供了每个标签中每一种基因的示例性的权重和偏倚，但是应理解，由这些表格提供的基因标签不限于给定的特定权重和偏倚。权重值可以指示根据本发明测
量以指示正标签评分的表达的方向性。因此，正权重表示基因表达的提高有助于正标签评
分/DDRD生物学鉴定，反之亦然。
[0226] 表2C和表2D中提供了研究表3至45中所包括基因的表达的合适探针和探针组。另外，表2E中提供了研究表3至45中所包括基因的表达的合适PCR测定。
[0227] 表3-一基因标签
[0228]基因名称 权重 偏倚
CXCL10 0.137044 2.03931
[0229] 表4-二基因标签
[0230]基因名称 权重 偏倚
CXCL10 0.081638 2.03931
MX1 0.080192 3.43549
[0231] 表5-三基因标签
[0232]
[0233]
[0234] 表6-四基因标签
[0235]
[0236] 表7-五基因标签
[0237]
[0238] 表8-六基因标签
[0239]
[0240] 表9-七基因标签
[0241]
[0242] 表10-八基因标签
[0243]
[0244] 表11-九基因标签
[0245]
[0246] 表12-十基因标签
[0247]
[0248] 表13-十一基因标签
[0249]
[0250]
[0251] 表14-十二基因标签
[0252]
[0253] 表15-十三基因标签
[0254]
[0255] 表16-十四基因标签
[0256]
[0257] 表17-十五基因标签
[0258]
[0259] 表18-十六基因标签
[0260]
[0261] 表19-十七基因标签
[0262]
[0263] 表20-十八基因标签
[0264]
[0265] 表21-十九基因标签
[0266]
[0267] 表22-二十基因标签
[0268]
[0269] 表23-二十一基因标签
[0270]
[0271] 表24-二十二基因标签
[0272]
[0273] 表25-二十三基因标签
[0274]
[0275] 表26-二十四基因标签
[0276]
[0277] 表27-二十五基因标签
[0278]
[0279] 表28-二十六基因标签
[0280]
[0281] 表29-二十七基因标签
[0282]
[0283] 表30-二十八基因标签
[0284]
[0285] 表31-二十九基因标签
[0286]
[0287] 表32-三十基因标签
[0288]
[0289] 表33-三十一基因标签
[0290]
[0291] 表34-三十二基因标签
[0292]
[0293] 表35-三十三基因标签
[0294]
[0295] 表36-三十四基因标签
[0296]
[0297] 表37-三十五基因标签
[0298]
[0299] 表38-三十六基因标签
[0300]
[0301] 表39-三十七基因标签
[0302]
[0303]
[0304] 表40-三十八基因标签
[0305]
[0306]
[0307] 表41-三十九基因标签
[0308]
[0309]
[0310] 表42-四十基因标签
[0311]
[0312]
[0313] 表43-四十一基因标签
[0314]
[0315]
[0316] 表44-四十二基因标签
[0317]
[0318]
[0319]
[0320] 表45-四十三基因标签
[0321]
[0322]
[0323] 使用分类器模型来测量基因表达
[0324] 已试图利用多种方法来鉴定生物标志物和诊断疾病。对于基于蛋白质的标志物，这些包括双向电泳、质谱和免疫测定方法。对于核酸标志物，这些包括mRNA表达谱、微RNA
谱、FISH、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)、甲基化谱和
大规模基因表达阵列。
[0325] 当生物标志物指示个体中异常过程、疾病或其他状况或者是其迹象时，该生物标志物一般被描述为与指示个体中正常过程、不存在疾病或其他状况或者是其迹象的生物标
志物的表达水平或值相比过表达或表达不足。“上调”、“上调的”、“过表达”、“过表达的”及其任何变化形式可互换使用，指生物样品中生物标志物的值或水平大于通常在来自健康或
正常个体的类似生物样品中检测到的该生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。这
些术语还可以指生物样品中生物标志物的值或水平大于可以在特定疾病的不同阶段检测
到的该生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。
[0326] “下调”、“下调的”、“表达不足”、“表达不足的”及其任何变化形式可互换使用，指生物样品中生物标志物的值或水平小于通常在来自健康或正常个体的类似生物样品中检测到的该生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。这些术语还可以指生物样品中生
物标志物的值或水平小于可以在特定疾病的不同阶段检测到的该生物标志物的值或水平
(或者值或水平的范围)。
[0327] 此外，与指示个体中正常过程或者不存在疾病或其他状况或者是其迹象的生物标志物的“正常”表达水平或值相比，过表达或表达不足的生物标志物还可以被称为“差异表
达的”或者称为具有“差异水平”或“差异值”。因此，生物标志物的“差异表达”也可以被称为与生物标志物的“正常”表达水平的变化。
[0328] 术语“差异生物标志物表达”和“差异表达”可互换使用，指以下生物标志物：相对于其在正常对象中的表达或者相对于其在对特定治疗作出不同响应或具有不同预后的患者中的表达，在患有特定疾病的对象中其表达被激活至更高或更低水平。这些术语还包括
在相同疾病的不同阶段表达被激活至更高或更低水平的生物标志物。还应理解，差异表达
的生物标志物可以在核酸水平或蛋白质水平被激活或被抑制，或者可以经受选择性剪接以
产生不同的多肽产物。这样的差异可以通过多种改变来证明，包括mRNA水平、miRNA水平、反义转录物水平、或者多肽的蛋白质表面表达、分泌或其他分配。差异生物标志物表达可以包
括比较两种或更多种基因或者其基因产物之间的表达；或者比较两种或更多种基因或者其
基因产物之间的表达比例；或者甚至比较相同基因在正常对象和患有疾病的对象之间或者
在相同疾病的多个阶段之间不同的两种不同加工产物。差异表达包括例如正常细胞和患病
细胞中或者已经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞中生物标志物的时间或细胞表达模式
的定量差异和定性差异。
[0329] 在某些实施方案中，获得的表达谱是其中样品中一种或更多种核酸的量或水平已确定的基因组或核酸表达谱。在这些实施方案中，被测定以产生用于诊断或预后方法的表
达谱的样品是作为核酸样品的样品。核酸样品包括核酸群体，其包括所分析细胞或组织的
表型决定性生物标志物的表达信息。在一些实施方案中，核酸可以包括RNA或DNA核酸，例如
mRNA、cRNA、cDNA等，只要样品保留从中获得该样品的宿主细胞或组织的表达信息即可。如
本领域已知的，可以以多种不同方式制备样品，例如通过从细胞中分离mRNA，其中分离的
mRNA按照分离时使用、扩增或用于制备cDNA、cRNA等，如差异基因表达领域中已知的。因此，确定样品中mRNA的水平包括由mRNA制备cDNA或cRNA，并随后测量cDNA或cRNA。样品通常使
用标准方案由从需要治疗的对象收获的细胞或组织(例如，通过组织活检)制备，其中可以
产生这样的核酸的细胞类型或组织包括其中存在决定表型的表达模式的任何组织，包括但
不限于患病细胞或组织、体液等。
[0330] 可以使用任何方便的方案由初始核酸样品产生表达谱。尽管产生表达谱的多种不同方式是已知的，例如在差异基因表达/生物标志物分析领域中使用的那些方式，但是用于
产生表达谱的一种代表性且方便的方案类型是基于阵列的基因表达谱产生方案。这样的应
用是杂交测定，其中采用展示待产生谱中所测定/谱绘制每一种基因的“探针”核酸的核酸。
在这些测定中，首先由测定的初始核酸样品制备靶核酸样品，其中制备可以包括用标记(例
如信号产生系统的成员)标记靶核酸。在靶核酸样品制备之后，在杂交条件下使样品与阵列
接触，由此在与附接至阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后，定性或定
量检测杂交复合物的存在。可以实施以产生用于本发明方法的表达谱的特定杂交技术包括
以下中所述的技术：美国专利No.5,143,854、5,288,644、5,324,633、5,432,049、5,470,
710、5,492,806、5,503,980、5,510,270、5,525,464、5,547,839、5,580,732、5,661,028、5,
800,992，其公开内容通过引用并入本文；以及WO 95/21265、WO 96/31622、WO 97/10365、WO 
97/27317、EP 373 203和EP 785 280。在这些方法中，如上所述，使包含针对测定表达的每
一种生物标志物的探针的“探针核酸”阵列与靶核酸接触。在杂交条件、例如上述严格杂交
条件下进行接触，然后除去未结合的核酸。所得的杂交核酸模式提供关于已经探测的每种
生物标志物的表达的信息，其中表达信息是关于基因是否表达，以及通常以什么水平表达，
其中表达数据(即表达谱)可以是定性的和定量的。
[0331] 产生生物标志物表达分类器
[0332] 在一个实施方案中，测量癌组织中生物标志物的相对表达水平以形成基因表达谱。来自患者组织样品的生物标志物组的基因表达谱以复合决策评分的形式进行总结，并
与由患者数据的训练集数学推导的评分阈值进行比较。评分阈值基于不同的特征分离患者
组，所述特征例如但不限于针对治疗的响应性/非响应性。患者训练集数据优选地由已经通
过预后、复发可能性、长期存活、临床结果、治疗响应、诊断、癌症分类或个性化基因组谱表征的癌症组织样品获得。可以使来自患者样品的表达谱和对应决策评分与训练集中患者样
品的特征相关联，所述特征与数学推导的评分决策阈值在同一侧。对线性分类器标量输出
的阈值进行优化，以最大化如在训练数据集中观察到的交叉验证下灵敏度和特异性的总
和。
[0333] 给定样品的总体表达数据使用本领域技术人员已知的方法进行归一化，以针对不同的起始材料的量、提取和扩增反应的变化效率等进行校正。对经归一化数据使用线性分
类器以产生诊断或预后调用(例如，针对治疗剂的响应性或抗性)有效地意指通过分离超平
面将数据空间(即分类器中所有基因的表达值的所有可能组合)拆分成两个不相交的半部。
这种拆分是对大量训练实例凭经验推导出的，所述训练实例例如来自对治疗剂表现出响应
性或抗性的患者。在不丧失一般性的情况下，可以假定除一种生物标志物之外的某一固定
值集合，其将自动地限定该剩余生物标志物的阈值，其中决策将从例如针对治疗剂的响应
性或抗性发生改变。高于该动态阈值的表达值则将指示针对治疗剂的抗性(对于具有负权
重的生物标志物)或响应性(对于具有正权重的生物标志物)。该阈值的准确值取决于分类
器中所有其他生物标志物的实际测量表达谱，但是某些生物标志物的一般性指示保持固
定，即高值或“相对过表达”总是促成响应性(具有正权重的基因)或抗性(具有负权重的基
因)。因此，在总体基因表达分类器的背景下，相对表达可以指示某种生物标志物的上调或
下调是否指示针对治疗剂的响应性或抗性。
[0334] 在一个实施方案中，通过线性分类器评价患者组织样品的生物标志物表达谱。本文使用的线性分类器指单独生物标志物强度到复合决策评分的加权总和(“决策函数”)。然
后，将决策评分与对应于关于灵敏度和特异性的特定设定点的预限定截止评分阈值进行比
较，这指示样品是否高于评分阈值(正决策函数)或低于评分阈值(负决策函数)。
[0335] 有效地，这意味着数据空间(即生物标志物表达值的所有可能组合的集合)被拆分成两个相互排斥的半部，其对应于不同的临床分类或预测，例如一个对应于针对治疗剂的
响应性，而另一个则对应于抗性。在总体分类器的背景下，某种生物标志物的相对过表达可
以增加决策评分(正权重)或减小决策评分(负权重)，并且由此有助于总体决策，例如针对
治疗剂响应性或抗性。
[0336] 术语“曲线下面积(area under the curve)”或“AUC”指接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线的曲线下面积，二者在本领域中都是公
知的。AUC量度可用于比较分类器在整个数据范围内的准确性。具有较大AUC的分类器在两
个目的组(例如，卵巢癌样品和正常或对照样品)之间正确分类未知物的能力较大。ROC曲线
可用于绘制特定特征(例如，本文所述的任何生物标志物和/或另外生物医学信息的任何项
目)在区分两个群体(例如，对治疗剂作出响应和不作出响应的个体)中的性能。通常来说，
整个群体(例如，病例和对照)的特征数据基于单个特征的值以升序排序。然后，针对该特征
的每个值，计算数据的真阳性率和假阳性率。真阳性率通过计算高于该特征之值的病例的
数目并随后除以病例总数来确定。假阳性率通过计数高于该特征之值的对照的数目并随后
除以对照总数来确定。尽管该定义指其中与对照相比特征在病例中升高的情况，但是该定
义也适用于其中与对照相比特征在病例中较低的情况(在这种情况下，将对低于该特征的
值的样品进行计数)。ROC曲线可以针对单个特征以及针对其他单个输出来生成，例如两个
或更多个特征的组合可以在数学上组合(例如，相加、相减、相乘等)以提供单个总和值，并
且可以在ROC曲线中绘制该单独总和值。此外，可以在ROC曲线中绘制其中组合推导单个输
出值的多个特征的任意组合。这些特征组合可以包括测试。ROC曲线是测试的真阳性率(灵
敏度)相对于测试的假阳性率(1-特异性)的图。
[0337] 该量(即针对治疗剂的截止阈值响应性或抗性)的解释从已知结果的患者组在开发阶段(“训练”)中推导。决策评分的对应权重和响应性/抗性截止阈值通过本领域技术人
员已知的方法由训练数据先验确定。在本发明方法的一个优选实施方案中，使用偏最小二
乘判别分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)来确定权重。(L.
S.Wold，J.Chemom.1(1987)185-196；D.V.Nguyen，D.M.Rocke，Bioinformatics 18
(2002)39-50)。当应用于癌症分类器的转录物时，本领域技术人员已知用于进行分类的其
他方法也可以用于本文所述的方法。
[0338] 可以使用不同的方法来将对这些生物标志物测量的定量数据转化为预后或其他预测用途。这些方法包括但不限于来自以下领域的方法：模式识别(Duda等Pattern 
Classification，第2版，John Wiley，New York 2001)、机器学习( 等Learning 
with Kernels，MIT Press，Cambridge 2002，Bishop，Neural Networks for Pattern 
Recognition，Clarendon Press，Oxford 1995)、统计学(Hastie等The Elements of 
Statistical Learning，Springer，New York 2001)、生物信息学(Dudoit等，2002，
J.Am.Statist.Assoc.97：77-87，Tibshirani等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6567-
6572)或化学计量学(Vandeginste，等，Handbook of Chemometrics and Qualimetrics，B
部分，Elsevier，Amsterdam 1998)。
[0339] 在训练步骤中，测量响应性/抗性两种情况的患者样品组，并使用来自该训练数据的固有信息来对预测方法进行优化以最优地预测训练集或未来样品组。在该训练步骤中，
使用的方法被训练或参数化以预测从特定强度模式到特定预测调用。可以在测量数据经受
预后方法或算法之前用其进行合适的转换或预处理步骤。
[0340] 在本发明的一个优选实施方案中，形成每种转录物的预处理强度值的加权总和，并与经对训练集优化的阈值进行比较(Duda等Pattern Classification，第2版，John 
Wiley，New York 2001)。可以通过多种线性分类方法来推导权重，包括但不限于偏最小二
乘法(PLS，(Nguyen等，2002，Bioinformatics 18(2002)39-50))或支持向量机(SVM
(Support Vector Machine)，( 等Learning with Kernels，MIT Press，
Cambridge 2002))。
[0341] 在本发明的另一个实施方案中，在应用如上所述的加权总和之前对数据进行非线性转换。这种非线性转换可以包括提高数据的维度。非线性转换和加权求和也可以隐式进
行，例如通过使用核函数(kernel function)。( 等Learning with Kernels，
MIT Press，Cambridge 2002)。
[0342] 在本发明的另一个实施方案中，将新数据样品与两个或更多个类别原型进行比较，所述原型是实际测量训练样品或人工产生原型。使用合适的相似性量度来进行该比较，
例如但不限于欧几里得距离(Euclidean distance)(Duda等Pattern Classification，第2
版，John Wiley，New York 2001)、相关系数(Van’t Veer，等2002，Nature 415：530)等。然后，将新的样品分配给具有最接近原型或大约最高原型数目的预后组。
[0343] 在本发明的另一个实施方案中，使用决策树(Hastie等，The Elements  of Statistical Learning，Springer，New York 2001)或随机森林(Breiman，Random 
Forests，Machine Learning 45：5 2001)来由针对转录物组或其产物测量的强度数据产生
预后调用。
[0344] 在本发明的另一个实施方案中，使用神经网络(Bishop，Neural Networks for Pattern Recognition，Clarendon Press，Oxford 1995)来由针对转录物组或其产物测量
的强度数据产生预后调用。
[0345] 在本发明的另一个实施方案中，使用判别分析(Duda等，Pattern Classification，第2版，John Wiley，New York 2001)来由针对转录物组或其产物测量的
强度数据产生预后调用，所述判别分析包括但不限于线性判别分析、对角线性判别分析、二
次判别分析和逻辑判别分析。
[0346] 在本发明的另一个实施方案中，使用微阵列预测分析(PAM(Prediction Analysis for Microarray)，(Tibshirani等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6567-6572))来由
针对转录物组或其产物测量的强度数据产生预后调用。
[0347] 在本发明的另一个实施方案中，使用聚类类独立软建模(SIMCA(Soft Independent Modelling of Class Analogy)，(Wold，1976，Pattern Recogn.8：127-139))来由针对转录物组或其产物测量的强度数据产生预测调用。
[0348] 治疗剂
[0349] 如上所述，本文所述的方法允许将患者分类为对治疗剂具有响应性或非响应性的，所述治疗剂靶向与异常DNA修复相关的免疫信号传导提高的肿瘤。特别地，治疗剂可以
是免疫检查点治疗，例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂。在
一些实施方案中，抑制性免疫检查点选自A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA
(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、PD-1/PD-L1、TIM-3和VISTA。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点不是PD-1/PD-L1。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点是IDO。在一些
实施方案中，抑制性免疫检查点的拮抗剂选自如本文所定义的抗体和抑制性核酸分子。在
一些实施方案中，抑制性免疫检查点的拮抗剂选自MGA271(靶向B7-H3)、伊匹单抗(Yervoy-
靶向CTLA-4)、indoximod(靶向IDO途径)、NLG919(靶向IDO途径)、利丽单抗(靶向KIR)、
IMP321(靶向LAG3)、BMS-986016(靶向LAG3)、CT-011(PD-1阻断)、尼伏单抗/BMS-936558
(PD-1阻断)、BMS-936559(PDL1阻断)和派姆单抗(Keytruda-靶向PD-1)，任选地其中拮抗剂
不是派姆单抗。在一些实施方案中，刺激性免疫检查点选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS。在一些实施方案中，刺激性免疫检查点的激动剂选自如本文所定义的抗
体、脂质运载蛋白和细胞因子。在一些实施方案中，刺激性免疫检查点的激动剂选自CDX-
1127(CD27的激动剂)、NKTR-214(CD122的激动剂)、BMS-663513(CD137的激动剂)、TRX518
(GITR的激动剂)、CP-870893(CD40的激动剂)、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383(OX40的激动
剂)。
[0350] 在一些实施方案中，免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)可以与“DNA损伤治疗剂”组合施用。本文使用的“DNA损伤治疗剂”包括已知直接损伤DNA的药剂、阻止DNA损伤修复的药剂、抑制DNA损伤信号传导的药剂、抑
制DNA损伤诱导的细胞周期停滞的药剂和抑制间接导致DNA损伤的过程药剂。目前用于治疗
癌症的一些这样的治疗剂包括但不限于以下DNA损伤治疗剂。
[0351] 1)DNA损伤剂：
[0352] a.烷化剂(含铂剂，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂；环磷酰胺；白消安)
[0353] b.拓扑异构酶I抑制剂(伊立替康、拓扑替康)
[0354] c.拓扑异构酶II抑制剂(依托泊苷；蒽环类，例如多柔比星和表柔比星)
[0355] d.电离辐射
[0356] 2)DNA修复靶向治疗
[0357] a.非同源末端连接的抑制剂(DNA-PK抑制剂、Nu7441、NU7026)
[0358] b.同源重组的抑制剂
[0359] c.核苷酸切除修复的抑制剂
[0360] d.碱基切除修复的抑制剂(PARP抑制剂、AG014699、AZD2281、ABT-888、MK4827、BSI-201、INO-1001、TRC-102、APEX 1抑制剂、APEX 2抑制剂、连接酶III抑制剂)
[0361] e.范科尼贫血途径的抑制剂
[0362] 3)DNA损伤信号传导的抑制剂
[0363] a.ATM抑制剂(CP466722、KU-55933)
[0364] b.CHK 1抑制剂(XL-844、UCN-01、AZD7762、PF00477736)
[0365] c.CHK 2抑制剂(XL-844、AZD7762、PF00477736)
[0366] 4)DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂
[0367] a.Wee1激酶抑制剂
[0368] b.CDC25a、b或c抑制剂
[0369] 5)间接导致DNA损伤的过程的抑制剂
[0370] a.组蛋白脱乙酰酶抑制剂
[0371] b.热休克蛋白抑制剂(格尔德霉素、AUY922)
[0372] 疾病和组织来源
[0373] 本文所述的预测性分类器可用于确定针对用于治疗癌症的治疗剂的响应性或抗性。本文所述的生物途径是癌症本身的特征，类似于分级和分期，并且因此不限于单一癌症
疾病类型。因此，基因或基因产物的集合可以用于预测癌症治疗剂在不同组织中不同癌症
类型之间的响应性。在一个实施方案中，基因或基因产物的这一集合可用于评价乳腺癌和
卵巢癌肿瘤二者。
[0374] 本文使用的癌症包括但不限于白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食管癌、胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌、头颈癌等。
[0375] 在一个实施方案中，本文所述的方法涉及用各类免疫检查点治疗的化学治疗剂(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂)治疗的癌症，所述治
疗剂任选地与DNA损伤剂、DNA修复靶向治疗、DNA损伤信号传导的抑制剂、DNA损伤诱导的细
胞周期停滞的抑制剂和间接导致DNA损伤的过程的抑制剂(即本文使用的术语“DNA损伤治
疗剂”)相组合。
[0376] “生物样品”、“样品”和“测试样品”在本文中可互换使用，指从个体获得或以其他方式来源于个体的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单个核细胞、血沉棕黄层、血浆和血清)、痰、泪、黏液、鼻洗液、鼻吸出物、呼出物、尿、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头吸出物、支气管吸出物、滑液、关节吸出物、腹水、细胞、细胞提取物和脑脊液。这也包括所有前述物质的实验分离级分。例如，可以将血液样品分级成血清或分级成包含特定类型血细胞(例如红细胞或白血细胞(白细胞))的级分。如
果需要的话，样品可以是来自个体的样品的组合，例如组织和流体样品的组合。例如，术语
“生物样品”还包括包含均化固体材料的材料，例如来自例如粪便样品、组织样品或组织活
检物的材料。术语“生物样品”还包括由组织培养物或细胞培养物获得的材料。可以采用用
于获得生物样品的任何合适的方法；示例性的方法包括例如静脉切开术、拭子(例如颊拭
子)和细针抽吸活检操作。还可以例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(laser 
capture micro dissection，LCM)或激光显微解剖(laser micro dissection，LMD))、膀胱
冲洗、涂片(例如PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或来源于个体的“生物样品”包括已在从个体获得之后以任何合适方式处理过的任何这样的样品。
[0377] 在这样的情况下，靶细胞可以是肿瘤细胞，例如结肠癌细胞或胃癌细胞。靶细胞从任何组织来源获得，包括人和动物组织，例如但不限于新获得的样品、冷冻样品、活检样品、体液样品、血液样品、保存的组织(例如石蜡包埋固定组织样品(即组织块))或细胞培养物。
[0378] 方法和试剂盒
[0379] 用于基因表达分析的试剂盒
[0380] 用于进行本文所述方法的试剂、工具和/或说明书可以在试剂盒中提供。例如，试剂盒可以包含用于确定癌症患者的合适治疗的试剂、工具和说明书。这样的试剂盒可以包
括用于例如通过活检从患者收集组织样品的试剂，以及用于处理组织的试剂。试剂盒还可
以包括一种或更多种用于进行生物标志物表达分析的试剂，例如用于进行RT-PCR、qPCR、
northern印迹、蛋白质组分析或免疫组织化学以确定患者样品中生物标志物的表达水平的
试剂。例如，用于进行RT-PCR的引物、用于进行northern印迹分析的探针和/或用于进行蛋
白质组分析(例如Western印迹、免疫组织化学和ELISA分析)的抗体可以包括在这样的试剂
盒中。也可以包括用于测定的合适缓冲液。也可以包括任何这些测定所需的检测试剂。下面
进一步详细描述合适的试剂和方法。
[0381] 本文所述的试剂盒还可以包括描述如何进行测量生物标志物表达的测定的说明书。说明书还可以包括如何确定参考组群的说明，包括如何确定参考组群中生物标志物的
表达水平，以及如何组装表达数据以建立与测试患者进行比较的参考。说明书还可以包括
用于在测试患者中测定生物标志物表达以及用于将该表达水平与参考组群中表达进行比
较以随后确定用于测试患者的合适化学治疗的说明。用于确定合适化学治疗的方法在上文
进行描述，并且可以在说明书中详细描述。
[0382] 包括在试剂盒中的信息材料可以是涉及本文所述方法和/或用于本文所述方法的试剂的使用的描述性材料、指导性材料、市场营销材料或其他材料。例如，试剂盒的信息材
料可以包含联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的使用
者可以获得关于进行基因表达分析和解释结果的实质性信息，特别是在其适用于人对特定
治疗剂具有积极响应的可能性时。
[0383] 本文所述的试剂盒还可以包含由生物标志物表达推断患者对特定治疗剂具有积极响应的可能性所必需的软件。
[0384] a)基因表达谱绘制方法
[0385] 测量生物样品中的mRNA可以用作检测生物样品中对应蛋白质的水平的替代方案。因此，本文所述的任何生物标志物或生物标志物组也可以通过检测合适RNA来检测。基因表
达谱绘制的方法包括但不限于微阵列、RT-PCT、qPCR、northern印迹、SAGE、质谱。
[0386] 通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，随后进行qPCR)来测量mRNA表达水平。使用RT-PCR由mRNA产生cDNA。可以将cDNA用于qPCR测定中以随着DNA扩增过程的进行产生荧
光。通过与标准曲线进行比较，qPCR可以产生绝对测量结果，例如每个细胞的mRNA拷贝数。
与毛细管电泳组合的Northern印迹、微阵列、侵入测定和RT-PCR全部已被用于测量样品中
mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling：Methods and Protocols，Richard 
A.Shimkets编辑，Humana Press，2004。
[0387] miRNA分子是非编码的小RNA，但是可以调节基因表达。任何适合测量mRNA表达水平的方法也可以用于对应的miRNA。最近许多实验室已经研究了使用miRNA作为疾病的生物
标志物。许多疾病涉及广泛的转录调控，并且miRNA可能会发现作为生物标志物的作用也就
不足为奇了。miRNA浓度与疾病之间的联系往往甚至不如蛋白质水平与疾病之间的联系清
楚，但miRNA生物标志物的价值可能是相当大的。当然，与在疾病期间差异表达的任何RNA一
样，开发体外诊断产品所面临的问题将包括以下要求：miRNA在患病细胞中存活并且容易提
取用于分析，或者miRNA被释放到血液或其他其必须存活足够长的时间以进行测量的基质
中。蛋白质生物标志物具有相似的要求，但是许多潜在的蛋白质生物标志物在疾病期间以
旁分泌方式故意分泌到病理学和功能部位。许多潜在的蛋白质生物标志物被设计成在其中
合成这些蛋白质的细胞以外发挥功能。
[0388] 还可以使用质谱法来评价基因表达。可以使用多种质谱仪配置来检测生物标志物值。有几种类型的质谱仪是可用的或可以以多种配置生产。一般来说，质谱仪具有以下主要
组件：样品入口、离子源、质量分析仪、检测器、真空系统和仪器控制系统以及数据系统。样品入口、离子源和质量分析仪的差异通常限定仪器的类型及其性能。例如，入口可以是毛细
管柱液相色谱源，或者可以是直接探针或级，例如基质辅助激光解吸中使用的。常见的离子
源是例如电喷雾，包括纳米喷雾和微喷雾或基质辅助激光解吸。常见的质量分析仪包括四
极杆质量过滤器、离子阱质量分析仪和飞行时间质量分析仪。另外的质谱法是本领域中公
知的(参见Burlingame等，Anal.Chem.70：647 R-716R(1998)；Kinter和Sherman，New York
(2000))。
[0389] 蛋白质生物标志物和生物标志物值可以通过以下任一种来检测和测量：电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/
(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption 
ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电
离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight 
mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/电离(desorption/ionization on 
silicon，DIOS)、二次离子质谱(secondary ion mass spectrometry，SIMS)、四极杆飞行时间(quadrupole time-of-flight，Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术(称为ultraflex 
III TOF/TOF)、大气压化学电离质谱(atmospheric pressure chemical ionization mass 
spectrometry，APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS).sup.N、大气压光电离质谱(atmospheric pressure photoionization mass spectrometry，APPI-MS)，APPI-MS/MS和APPI-(MS)
.sup.N、四极杆质谱、傅里叶变换质谱(Fourier transform mass spectrometry，FTMS)、定量质谱和离子阱质谱。
[0390] 在对蛋白质生物标志物进行质谱表征和确定生物标志物值之前使用样品制备策略来标记和富集样品。标记方法包括但不限于用于相对和绝对定量的同量异位素标签
(iTRAQ)和使用细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)。用于在质谱分析之前选择
性富集候选生物标志物蛋白质样品的捕获试剂包括但不限于适配体、抗体、核酸探针、嵌合
体、小分子、F(ab′)2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、affybody、纳米抗体、ankyrin、结构域抗体、替选抗体支架(例如双抗体等)印迹聚合物、avimer、肽模拟物、类肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成受体、以及这些的修饰物和片段。
[0391] 上述测定能够检测在预测癌症治疗剂的响应性的方法中有用的生物标志物值，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少N个生物标志物值，每个生物标志物值
对应于选自表1或表2中所提供生物标志物的生物标志物，其中如下详细描述的使用生物标
志物值的分类指示个体是否将对治疗剂具有响应性。虽然某些描述的预测性生物标志物可
单独用于预测针对治疗剂的响应性，但是本文还描述了用于对多个生物标志物亚组进行分
组的方法，每个亚组作为两种或更多种生物标志物的组都是可用的。因此，本申请的多个实
施方案提供了包含N种生物标志物的组合，其中N为至少三种生物标志物。应认识到，N可以
被选择为来自任何上述范围以及相似但更高阶范围的任意数。根据本文所述的任何方法，
生物标志物值可以被单独检测和分类，或者其可以被集体检测和分类，例如以多重测定形
式。
[0392] b)微阵列方法
[0393] 在一个实施方案中，本发明使用“寡核苷酸阵列”(在本文中也称为“微阵列”)。微阵列可以用于分析细胞中生物标志物的表达，并且尤其是用于测量癌症组织的生物标志物的表达。
[0394] 在一个实施方案中，生物标志物阵列如下产生：使代表存在于细胞中的mRNA转录物的经可检测标记多核苷酸(例如，由总细胞mRNA合成的经荧光标记cDNA或经标记cRNA)与
微阵列杂交。微阵列是具有细胞或生物体基因组中众多基因(优选大部分或几乎所有基因)
之产物的结合(例如杂交)位点的有序阵列的表面。微阵列可以以本领域已知的许多方式制
成。然而，产生的微阵列共有某些特征。这些阵列是可复制的，允许产生给定阵列的多个拷
贝并且容易彼此进行比较。优选地，微阵列较小，通常小于5cm2，并且其由在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中的给定结合位点或独特结合位点组将特异性结
合细胞中单一基因的产物。在一个具体实施方案中，使用在每个位置包含已知序列的固定
核酸的位置可寻址阵列。
[0395] 应理解，当制备与细胞的RNA互补的cDNA并使其在合适杂交条件下与微阵列杂交时，与阵列中对应于任何特定基因的位点杂交的水平将反映由该基因/生物标志物转录的
mRNA在细胞中的流行。例如，当使与总细胞mRNA互补的经可检测标记(例如经荧光团标记)
cDNA或cRNA与微阵列杂交时，阵列上对应于细胞中不转录的基因的位点(即，能够特异性结
合基因产物)将具有很少或没有信号(例如荧光信号)，并且所编码mRNA普遍存在的基因将
具有相对较强的信号。选择核酸杂交和洗涤条件使得探针与特定阵列位点“特异性结合”或
“特异性杂交”，即探针与具有互补核酸序的序列阵列位点杂交、形成双链体或结合，但不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如本文使用的，当如果多核苷酸中的较短者为少于或等
于25个碱基，使用标准碱基配对规则不存在错配，或者如果多核苷酸中的较短者长于25个
碱基，存在不超过5％错配，则认为一个多核苷酸序列与另一个互补。优选地，多核苷酸是完全互补的(没有错配)。可以证明，通过使用常规实验进行包括阴性对照的杂交测定，特定杂
交条件实现特异性杂交。
[0396] 最佳杂交条件将取决于经标记探针和固定化多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如，寡聚物相对于多于200个碱基的多核苷酸)和类型(例如RNA、DNA，PNA)。用于核酸的特定(即
严格)杂交条件的一般参数在Sambrook等，同上和Ausubel等，″Current Protocols in 
Molecular Biology″，Greene Publishing and Wiley-interscience，NY(1987)中进行了
描述，其出于所有目的而整体并入。当使用eDNA微阵列时，典型的杂交条件是在65℃下在5
×SSC加0.2％SDS中杂交4小时，然后在25℃下在低严格洗涤缓冲液(1×SSC加0.2％SDS)中
洗涤，然后在25℃下在高严格洗涤缓冲液(0.1SSC加0.2％SDS)中10分钟(参见Shena等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，第10614页(1996))。例如Tijessen，Hybridization 
With Nucleic Acid Probes″，Elsevier Science Publishers B.V(1993)和Kricka，″
Nonisotopic DNA Probe Techniques″，Academic Press，San Diego，Calif.(1992)中也提供了可用的杂交条件。
[0397] c)免疫测定方法
[0398] 免疫测定方法基于抗体与其对应靶标或分析物的反应，并且可以根据特定测定形式来检测样品中的分析物。为了提高基于免疫反应性的测定方法的特异性和灵敏度，通常
使用单克隆抗体，因为其具有特异性表位识别。多克隆抗体也已经成功地用于多种免疫测
定，因为与单克隆抗体相比其对靶标的亲和力提高。免疫测定已经被设计用于广泛范围的
生物样品基质。免疫测定形式已经被设计成提供定性、半定量和定量的结果。
[0399] 定量结果可以通过使用用已知浓度的待检测特定分析物产生的标准曲线来产生。来自未知样品的响应或信号被绘制到标准曲线上，并且确定与未知样品中靶标对应的量或
值。
[0400] 已经设计了许多免疫测定形式。ELISA或EIA可以定量用于检测分析物/生物标志物。这种方法依赖于将标签附接到分析物或抗体上，并且标记组分直接或间接地包括酶。可
以对ELISA测试进行格式化以便对分析物进行直接、间接、竞争性或夹心检测。另一些方法
依赖于标记，例如如放射性同位素(I125)或荧光。另外的技术包括例如凝集、浊度法、比浊
法、Western印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、Luminex测定等(参见ImmunoAssay：A Practical Guide，由Brian Law编辑，由Taylor & Francis，Ltd.出版，
2005版)。
[0401] 示例性测定形式包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定和荧光共振能量转移(FRET)免疫测定或时间分辨FRET(TR-FRET)免疫测
定。用于检测生物标志物的操作的实例包括生物标志物免疫沉淀，之后进行允许尺寸和肽
水平鉴别的定量方法，例如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱等。
[0402] 检测和/或量化可检测标记或信号产生材料的方法取决于标记的性质。由合适酶催化的反应产物(其中可检测标记是酶；参见上文)可以是但不限于荧光的、发光的或放射
性的，或者其可以吸收可见光或紫外光。适用于检测这样的可检测标记的检测器的实例包
括但不限于X射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、光度计和密度计。
[0403] 任何检测方法都可以以允许任何合适的制备、处理和反应分析的任何形式进行。这可以例如在多孔测定板(例如96孔或384孔)中或使用任何合适的阵列或微阵列来进行。
多种试剂的贮存溶液可以人工或自动制备，并且所有后续的移液、稀释、混合、分布、洗涤、孵育、样品读出、数据收集和分析都可以使用能够检测可检测标记的市售分析软件、机器人
和检测仪器自动完成。
[0404] d)测序
[0405] 还可以使用包括多种下一代测序技术的测序方法来确定基因表达。在一个具体实施方案中，可以使用RNAseq。
[0406] 临床用途
[0407] 在一些实施方案中，提供了用于鉴定和/或选择对治疗方案具有响应性的癌症患者的方法。特别地，所述方法涉及鉴定或选择对治疗方案具有响应性的癌症患者，所述治疗
方案包括施用免疫检查点治疗，例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点
的激动剂，任选地与直接或间接损伤DNA的药剂组合施用。还提供了用于鉴定对治疗方案无
响应性的患者的方法。这些方法通常包括：确定患者肿瘤(原发性肿瘤、转移性肿瘤或其他
来自肿瘤的衍生物，例如但不限于血液或血液中组分、尿、唾液和其他体液)(例如患者的癌
细胞)中预测性标志物之集合的表达水平；将表达水平与参考表达水平进行比较；以及鉴定
样品中的表达是否包括对应于针对治疗剂的响应或非响应的所选预测性生物标志物或生
物标志物组的表达模式或表达谱。
[0408] 在一些实施方案中，预测个体对免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，任选地与DNA损伤治疗剂组合)的响应性的方法包括
以下步骤：从个体获得测试样品；测量测试样品中一种或更多种生物标志物的表达水平，其
中该一种或更多种生物标志物选自CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4和APOL3；推导捕获表达水平的测试评分；提供包含使测试评分与响应性相关联的信息
的阈值评分；以及将测试评分与阈值评分进行比较；其中当测试评分超过阈值评分时，预测
响应性。本领域普通技术人员可以使用本文提供的教导(包括实施例1的教导)来确定合适
的阈值评分和合适的生物标志物权重。
[0409] 在另一些实施方案中，预测个体对免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，任选地与DNA损伤治疗剂组合)的响应性的方法包
括测量测试样品中一种或更多种生物标志物的表达水平，其中该一种或更多种生物标志物
选自CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。该方法可以包括推导捕获表达水平的测试评分；提供包含使测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；以及将
测试评分与阈值评分进行比较；其中当测试评分超过阈值评分时，预测响应性。表2A和2B提
供了示例性的基因标签(或基因分类器)，其中生物标志物分别由其中列出的40或44种基因
产物组成，并且其中阈值评分由其中列出的单独基因产物权重推导。在其中生物标志物由
表2B中所列44种基因产物组成并且生物标志物与表2B中所提供的权重相关的这些实施方
案之一中，超过0.3681的阈值评分的测试评分指示个体将对免疫检查点治疗(例如抑制性
免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，任选地与DNA损伤治疗剂组合)具
有响应性的可能性。
[0410] 如果与癌症在不存在与治疗剂接触的情况下的生长相比，癌症的生长速率由于与治疗剂接触而受到抑制，则癌症对治疗剂“具有响应性”。癌症的生长可以以多种方式测量，例如可以测量肿瘤的大小或适合于该肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。
[0411] 如果与癌症在不存在与治疗剂接触的情况下的生长相比，癌症的生长速率由于与治疗剂接触而未受到抑制或在非常低的程度上受到抑制，则癌症对治疗剂“具有非响应
性”。如上所述，癌症的生长可以以多种方式测量，例如，可以测量肿瘤的大小或适合于该肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。对治疗剂具有非响应性的质量是高度可变的，其中在不同的
条件下不同的癌症对给定治疗剂表现出不同水平的“非响应性”。更进一步，可以使用肿瘤
生长尺寸之外的另外标准来评估非响应性的量度，包括患者生命质量、转移程度等。
[0412] 该测试的应用将预测终点，包括但不限于总体存活、无进展存活、放射响应(如由RECIST限定的)、完全响应、部分响应、病情稳定和血清学标志物，例如但不限于PSA、CEA、CA125、CA15-3和CA19-9。
[0413] 或者，可以采用基于非阵列的方法来检测、量化和确定样品中的一种或更多种核酸或其生物衍生物(例如所编码蛋白质)的RNA、DNA或蛋白质，包括定量PCR(QPCR)、酶联免
疫吸附测定(ELISA)或免疫组织化学(IHC)等。
[0414] 在从所分析样品获得表达谱之后，将表达谱与参考或对照谱进行比较，以作出关于细胞或组织和由此从中获得样品的宿主的治疗响应性表型的诊断。本文涉及表达谱使用
的术语“参考”和“对照”意指用于解释给定患者的表达分类器并分配预后或预测类别的基
因或基因产物表达或者某些生物标志物之表达水平的标准化模式。参考或对照表达谱可以
是从已知具有所需表型例如响应性表型的样品获得的谱，并且因此可以是阳性参考或对照
谱。另外，参考谱可以来自已知不具有所需表型的样品，并且因此是阴性参考谱。
[0415] 如果使用定量PCR作为量化一种或更多种核酸的水平的方法，则该方法通过测量由双重标记荧光探针(即 探针)释放的荧光来量化PCR产物积聚。
[0416] 在某些实施方案中，将获得的表达谱与单个参考谱进行比较以获得关于所测定样品的表型的信息。在另一些实施方案中，将获得的表达谱与两个或更多个不同的参考谱进
行比较以获得关于所测定样品的表型的更深入信息。例如，可以将获得的表达谱与阳性和
阴性参考谱进行比较以获得关于样品是否具有目的表型的确认信息。
[0417] 所获得表达谱与一个或更多个参考谱的比较可以使用任何方便的方法来进行，其中多种方法是阵列领域技术人员已知的，例如通过比较表达谱的数字图像、通过比较表达
数据的数据库等。描述比较表达谱的方式的专利包括但不限于美国专利No.6,308,170和6,
228,575，其公开内容通过引用并入本文。上面还描述了比较表达谱的方法。
[0418] 比较步骤产生关于所获得的表达谱与一个或更多个参考谱有多么相似或不相似的信息，所述相似性信息被用于确定所测定样品的表型。例如，与阳性对照相似指示，所测
定样品具有与响应性参考样品类似的响应性表型。同样地，与阴性对照相似指示，所测定样
品具有非响应性参考样品的非响应性表型。
[0419] 还可以将生物标志物的表达水平与不同的参考表达水平进行比较。例如，参考表达水平可以是预定的标准参考表达水平，以便评价生物标志物或生物标志物组的表达是否
具有信息性，并进行评估以确定患者是响应性的还是非响应性的。另外，可以将确定生物标
志物的表达水平与在与生物标志物同时测量的内部参考标志物表达水平进行比较，以便进
行评估以确定患者是响应性的还是非响应性的。例如，不包含本发明生物标志物但已知显
示恒定表达水平的独特标志物组的表达可以作为内部参考标志物水平进行评估，并且与参
考比较地确定生物标志物表达的水平。在一个替选实例中，为非肿瘤样品的组织样品中所
选生物标志物的表达可以被评估为内部参考标志物水平。在某些方面，生物标志物的表达
水平可以被确定为具有提高的表达。在另一些方面，生物标志物的表达水平可以被确定为
具有降低的表达。表达水平可以被确定为与参考水平相比在表达方面没有信息性变化。在
另一些方面，相对于通过本文提供的方法确定的预定标准表达水平确定表达水平。
[0420] 本发明还涉及指导患者的常规治疗。其中诊断测试揭示其是免疫检查点治疗(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，任选地与其他组合)的响
应者的患者可以施用该治疗，并且患者和肿瘤学家都可以确信患者将会受益。通过诊断测
试指定为非响应者的患者可以被鉴定进行更可能为其提供益处的替选治疗。
[0421] 本发明还涉及选择患者进行免疫检查点治疗类型的新药物(例如抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，任选地与其他组合)的临床试验。用潜在响
应者富集试验群体将有助于根据相关标准对该药物进行更彻底的评价。
[0422] 本发明还涉及将患者诊断为患有与DNA损伤响应缺陷(DDRD)相关的先天性免疫应答提高的癌症的方法。DDRD在本文中定义为其中患者的一种或更多种细胞修复DNA损伤的
能力降低的任何病症，该降低的能力是肿瘤发生或生长的致病因素。DDRD诊断可能与范科
尼贫血/BRCA途径中的突变相关。DDRD诊断也可能与乳腺癌或卵巢癌相关。这些诊断方法包
括以下步骤：从个体获得测试样品；测量测试样品中一种或更多种生物标志物的表达水平，
其中所述一种或更多种生物标志物选自表2B、2A或1A，包括CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4和APOL3；推导捕获表达水平的测试评分；提供包含使测试评分和癌症的诊断相关联的信息的阈值评分；以及将测试评分与阈值评分进行比较；其中当测试
评分超过阈值评分时，个体被确定为患有癌症。本领域普通技术人员可以使用本文提供的
教导(包括实施例1的教导)来确定合适的阈值评分和合适的生物标志物权重。
[0423] 在另一些实施方案中，将患者诊断为发生与DDRD相关的先天性免疫应答提高的癌症的方法包括测量测试样品中一种或更多种生物标志物的表达水平，其中所述一种或更多
种生物标志物选自CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。该方法可以包括推导捕获表达水平的测试评分；提供包含使测试评分与癌症的诊断相关联的信息的阈值评
分；以及将测试评分与阈值评分进行比较；其中当测试评分超过阈值评分时，个体被确定为
患有癌症。表2A和2B提供了示例性的基因标签(或基因分类器)，其中生物标志物分别由其
中列出的40或44种基因产物组成，并且其中阈值评分由其中列出的单独基因产物权重推
导。在其中生物标志物由表2B中所列44种基因产物组成并且生物标志物与表2B中所提供的
权重相关的这些实施方案之一中，超过0.3681的阈值评分的测试评分指示癌症或容易发生
癌症的诊断结果。
[0424] 还在以下编号条款中对本发明进行限定：
[0425] 1.预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性的方法，其包括：
[0426] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的
响应性。
[0427] 2.根据条款1所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高预测针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
[0428] 3.根据条款1或2所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等
于或高于阈值)预测具有针对抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动
剂的响应性。
[0429] 4.根据任一前述条款所述的方法，其包括：
[0430] (i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
[0431] (ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；
[0432] (iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，预测具有响应性。
[0433] 5.根据任一前述条款所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0434] 6.根据任一前述条款所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、IFI44L、GBP5、
PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和
AL137218.1。
[0435] 7.根据任一前述条款所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0436] 8.根据任一前述条款所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中剩余基
因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0437] 9.根据任一前述条款所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0438] 10.根据条款1至4中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
[0439] 11.根据任一前述条款所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
[0440] 12.根据任一前述条款所述的方法，其包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的
组)(中剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0441] 13.根据任一前述条款所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
[0442] 14.预测针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂的响应性的方法，其包括：
[0443] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于预测针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激
性免疫检查点的激动剂的响应性。
[0444] 15.根据条款14所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高预测具有针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂
的响应性。
[0445] 16.根据条款14或15所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可
等于或高于阈值)预测具有针对与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或
刺激性免疫检查点的激动剂的响应性。
[0446] 17.根据条款14至16中任一项所述的方法，其包括：
[0447] (i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
[0448] (ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；
[0449] (iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，预测具有响应性。
[0450] 18.根据条款14至17中任一项所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0451] 19.根据条款14至18中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、
IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0452] 20.根据条款14至19中任一项所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0453] 21.根据条款14至20中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中
剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0454] 22.根据条款14至21中任一项所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0455] 23.根据条款14至17中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
[0456] 24.根据条款14至23中任一项所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
[0457] 25.根据条款14至24中任一项所述的方法，其包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种
基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0458] 26.根据条款14至25中任一项所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
[0459] 27.鉴定可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症的方法，其包括：
[0460] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于鉴定可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有
效治疗的癌症。
[0461] 28.根据条款27所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高鉴定为可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
[0462] 29.根据条款27或28所述的方法，其包括确定至少两种基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可等于
或高于阈值)鉴定为可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有
效治疗的癌症。
[0463] 30.根据条款27至29中任一项所述的方法，其包括：
[0464] (i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
[0465] (ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；
[0466] (iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，鉴定为可有效治疗的癌症。
[0467] 31.根据条款27至30中任一项所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0468] 32.根据条款27至31中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、
IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0469] 33.根据条款27至32中任一项所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0470] 34.根据条款27至33中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中
剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0471] 35.根据条款27至34中任一项所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0472] 36.根据条款27至30中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
[0473] 37.根据条款27至36中任一项所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
[0474] 38.根据条款27至37中任一项所述的方法，其包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种
基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0475] 39.根据条款27至38中任一项所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
[0476] 40.鉴定可用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂与DNA损伤治疗剂组合有效治疗的癌症的方法，其包括：
[0477] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于鉴定可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激
性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
[0478] 41.根据条款40所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高鉴定为可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂有
效治疗的癌症。
[0479] 42.根据条款40或41所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可
等于或高于阈值)鉴定为可用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺
激性免疫检查点的激动剂有效治疗的癌症。
[0480] 43.根据条款40至42中任一项所述的方法，其包括：
[0481] (i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
[0482] (ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；
[0483] (iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，鉴定为可有效治疗的癌症。
[0484] 44.根据条款40至43中任一项所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0485] 45.根据条款40至44中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、
IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0486] 46.根据条款40至45中任一项所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0487] 47.根据条款40至46中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中
剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0488] 48.根据条款40至47中任一项所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0489] 49.根据条款40至43中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
[0490] 50.根据条款40至49中任一项所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
[0491] 51.根据条款40至50中任一项所述的方法，其包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种、至多所有以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因
的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0492] 52.根据任一前述条款所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
[0493] 53.一种用于针对癌症选择治疗的方法，其包括：
[0494] 确定来自对象的样品中选自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于选择用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治
疗所述癌症。
[0495] 54.根据条款53所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高用于选择用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
[0496] 55.根据条款53或54所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可
等于或高于阈值)用于选择用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动
剂来治疗所述癌症。
[0497] 56.根据条款53至55中任一项所述的方法，其还包括使用选择的拮抗剂和/或激动剂来治疗所述癌症。
[0498] 57.根据条款53至56中任一项所述的方法，其包括：
[0499] (i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
[0500] (ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；
[0501] (iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，选择使用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点
的激动剂。
[0502] 58.根据条款53至57中任一项所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0503] 59.根据条款53至58中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、
IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0504] 60.根据条款53至59中任一项所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0505] 61.根据条款53至60中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中
剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0506] 62.根据条款53至61中任一项所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0507] 63.根据条款53至57中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
[0508] 64.根据条款53至63中任一项所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
[0509] 65.根据条款53至64中任一项所述的方法，其包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种
基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0510] 66.根据条款53至65中任一项所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
[0511] 67.针对癌症选择治疗的方法，其包括：
[0512] 确定来自对象的样品中选自2B、2A或1的至少一种基因的表达水平，其中所确定的表达水平用于选择用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免
疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
[0513] 68.根据条款67所述的方法，其中所述至少一种基因的表达水平提高用于选择用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂来
治疗所述癌症。
[0514] 69.根据条款67或68所述的方法，其包括确定至少两种所述基因的表达水平，并且所确定的表达水平用于生成组合测试评分，其中阳性组合测试评分(一般高于阈值，但是可
等于或高于阈值)用于选择用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺
激性免疫检查点的激动剂来治疗所述癌症。
[0515] 70.根据条款67至69中任一项所述的方法，其还包括使用所选择的与DNA损伤治疗剂组合的拮抗剂和/或激动剂来治疗所述癌症。
[0516] 71.根据条款67至70中任一项所述的方法，其包括：
[0517] (i)推导捕获所述表达水平的组合测试评分；
[0518] (ii)提供包含使所述组合测试评分与响应性相关联的信息的阈值评分；
[0519] (iii)以及将所述组合测试评分与所述阈值评分进行比较；其中当所述组合测试评分超过所述阈值评分时，选择使用与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂
和/或刺激性免疫检查点的激动剂。
[0520] 72.根据条款67至71中任一项所述的方法，其包括确定选自以下的至少6种基因的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0521] 73.根据条款67至72中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因的表达水平：MX1、
IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0522] 74.根据条款67至73中任一项所述的方法，其包括确定选自表1的至少12种基因的表达水平。
[0523] 75.根据条款67至74中任一项所述的方法，其包括确定选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的组)(中
剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0524] 76.根据条款67至75中任一项所述的方法，其包括确定以下每一种的表达水平：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0525] 77.根据条款67至71中任一项所述的方法，其包括确定来自表4至45中任一个的每一种基因的表达水平。
[0526] 78.根据条款67至77中任一项所述的方法，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所示。
[0527] 79.根据条款67至78中任一项所述的方法，其包括确定CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一种且多至全部的，以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种
基因的组)(中剩余基因)的至少一种另外基因的表达水平。
[0528] 80.根据条款67至79中任一项所述的方法，其中确定所述表达水平采用来自表2E的至少一种引物或引物对和/或来自表2E的至少一种探针。
[0529] 81.根据任一前述条款所述的方法，其中所述组合测试评分(或“标签评分”)根据下式推导：
[0530]
[0531] 其中wi是每种基因的权重，bi是基因特异性偏倚，gei是预处理后的基因表达，并且k是常值偏移。
[0532] 82.治疗癌症的方法，其包括向对象施用抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，其特征在于，在施用之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、2A
或1的至少两种基因的所确定表达水平推导的阳性组合测试评分或者来自表2B、2A或1的至
少一种基因的表达水平提高。
[0533] 83.治疗癌症的方法，其包括将抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂与DNA损伤治疗剂组合施用于对象，其特征在于，在施用之前来自所述对象的样
品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种基因的所确定表达水平推导的阳性组合测试评分
或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的表达水平提高。
[0534] 84.用于在对象中治疗癌症的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，其中在施用所述拮抗剂和/或激动剂之前来自所述对象的样品显示出由来自
表2B、2A或1的至少两种基因的所确定表达水平推导的阳性组合测试评分或来自表2B、2A或
1的至少一种基因的表达水平提高。
[0535] 85.用于在对象中治疗癌症的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或刺激性免疫检查点的激动剂，其中在施用所述拮抗剂和/或激动剂之前来自所述对象的样品显示出由来自
表2B、2A或1的至少两种基因的所确定表达水平推导的阳性组合测试评分或者来自表2B、2A
或1的至少一种基因的表达水平提高，并且其中所述拮抗剂和/或激动剂与DNA损伤治疗剂
组合施用。
[0536] 86.用于在对象中治疗癌症的与DNA损伤治疗剂组合的抑制性免疫检查点的拮抗剂和/或与DNA损伤治疗剂组合的刺激性免疫检查点的激动剂，其中在施用所述拮抗剂和/
或激动剂和DNA损伤治疗剂之前来自所述对象的样品显示出由来自表2B、2A或1的至少两种
基因的所确定表达水平推导的阳性组合测试评分或者来自表2B、2A或1的至少一种基因的
表达水平提高。
[0537] 87.根据条款82或83所述的方法或者根据条款84至86中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分(或“标签评分”)根据下式推导：
[0538]
[0539] 其中wi是每种基因的权重，bi是基因特异性偏倚，gei是预处理后的基因表达，并且k是常值偏移。
[0540] 88.根据条款82、83或87中任一项所述的方法或者根据条款84至87中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自以下的至少6种基因的所确定表
达水平推导：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0541] 89.根据条款82、83、87或88中任一项所述的方法或者根据条款84至88中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10和
IDO1的至少一种基因以及选自以下的至少一种另外基因所确定的表达水平推导：MX1、
IFI44L、GBP5、PRAME、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PPP1R1A和AL137218.1。
[0542] 90.根据条款82、83或87至89中任一项所述的方法或者根据条款84至89中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自表1的至少12种基因所确定
的表达水平推导。
[0543] 91.根据条款82、83或87至90中任一项所述的方法或者根据条款84至90中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由选自CD2、ITGAL、PTPRC、CXCL10、IDO1、CD3D、HLA-DPB1、CXCL9、CCL5、STAT1、IL2RG、CD3E、IRF1、IKZF3和IGJ的至少一种基因以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者选择表2B(44种基因的组)(中剩余基
因)的至少一种另外基因所确定的表达水平推导。
[0544] 92.根据条款82、83或87至91中任一项所述的方法或者根据条款84至91中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由以下每一种所确定的表达水平
推导：CXCL10、MX1、IDO1、IFI44L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A和AL137218.1。
[0545] 93.根据条款82、83或87中任一项所述的方法或者根据条款84至87中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由来自表4至45中任一个的基因所确定
的表达水平推导。
[0546] 94.根据条款82、83或87至93中任一项所述的方法或者根据条款84至93中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中每种基因的权重值如表2B中所示，或者其中每种基因
的权重值和/或偏倚值如表3至45中任一个所不。
[0547] 95.根据条款82、83或87至94中任一项所述的方法或者根据条款84至94中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组合测试评分由CCL5、CXCL9和CXCL10中至少一
种、至多所有以及选自表1(中剩余基因)的至少一种另外基因或者来自表2B(44种基因的
组)(中剩余基因)的至少一种另外基因所确定的表达水平推导。
[0548] 96.根据条款82、83或87至95中任一项所述的方法或者根据条款84至95中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述表达水平使用来自表2E的至少一种引物或引物
对和/或来自表2E的至少一种探针来确定。
[0549] 97.根据条款82、83或87至96中任一项所述的方法或者根据条款84至96中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述对象根据条款1至81中任一项所述的方法来针对
治疗选择。
[0550] 98.根据条款1至83或87至97中任一项所述的方法或者根据条款84至97中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述样品包含癌细胞。
[0551] 99.根据条款1至83或87至98中任一项所述的方法或者根据条款84至98中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述样品是组织样品。
[0552] 100.根据条款99所述的方法或者根据条款99所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述组织样品是经固定并包埋的组织样品。
[0553] 101.根据条款1至83或87至100中任一项所述的方法或者根据条款84至100中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述癌症选自白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食管癌、胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌或头颈癌。
[0554] 102.根据条款1至83或87至101中任一项所述的方法或者根据条款84至101中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述抑制性免疫检查点选自A2AR、B7-H3(CD276)、
B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、PD-1/PD-L1、TIM-3和VISTA，任选地其中所述抑制性免疫检查点不是PD-1/PD-L1。
[0555] 103.根据条款1至83或87至102中任一项所述的方法或者根据条款84至102中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中抑制性免疫检查点的所述拮抗剂选自抗体和抑制
性核酸分子。
[0556] 104.根据条款1至83或87至103中任一项所述的方法或者根据条款84至103中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中抑制性免疫检查点的所述拮抗剂选自MGA271(靶向
B7-H3)、伊匹单抗(Yervoy-靶向CTLA-4)、indoximod(靶向IDO途径)、NLG919(靶向IDO途
径)、利丽单抗(靶向KIR)、IMP321(靶向LAG3)、BMS-986016(靶向LAG3)、CT-011(PD-1阻断)、尼伏单抗/BMS-936558(PD-1阻断)、BMS-936559(PDL1阻断)和派姆单抗(Keytruda-靶向PD-
1)，任选地其中所述拮抗剂不是派姆单抗；和/或其中抑制性免疫检查点的所述拮抗剂选自
MGB453(靶向TIM-3)、LAG525(靶向LAG-3)和PDR001(PD1阻断)。
[0557] 105.根据条款1至83或87至104中任一项所述的方法或者根据条款84至104中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述刺激性免疫检查点选自CD27、CD28、CD40、
CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS。
[0558] 106.根据条款1至83或87至105中任一项所述的方法或者根据条款84至105中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中刺激性免疫检查点的所述激动剂选自抗体、脂质运
载蛋白和细胞因子。
[0559] 107.根据条款1至83或87至106中任一项所述的方法或者根据条款84至106中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中刺激性免疫检查点的所述激动剂选自CDX-1127
(CD27的激动剂)、NKTR-214(CD122的激动剂)、BMS-663513(CD137的激动剂)、TRX518(GITR
的激动剂)、CP-870893(CD40的激动剂)、MEDI0562、MEDI6469和MEDI6383(OX40的激动剂)。
[0560] 108.根据条款1至83或87至107中任一项所述的方法或者根据条款84至107中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述DNA损伤治疗剂选自DNA损伤剂、DNA修复靶向
治疗、DNA损伤信号传导的抑制剂、DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂和间接导致DNA损
伤的过程的抑制剂。
[0561] 109.根据条款108所述的方法或者根据条款108所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述DNA损伤剂选自烷化剂、拓扑异构酶抑制剂和辐射。
[0562] 110.根据条款109所述的方法或者根据条款109所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述烷化剂选自含铂剂、环磷酰胺和白消安。
[0563] 111.根据条款110所述的方法或者根据条款110所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述含铂剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。
[0564] 112.根据条款109所述的方法或者根据条款109所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述拓扑异构酶抑制剂选自拓扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂。
[0565] 113.根据条款112所述的方法或者根据条款112所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述拓扑异构酶I抑制剂选自伊立替康和拓扑替康。
[0566] 114.根据条款112所述的方法或者根据条款112所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述拓扑异构酶II抑制剂选自依托泊苷和蒽环类。
[0567] 115.根据条款114所述的方法或者根据条款114所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述蒽环类选自多柔比星和表柔比星。
[0568] 116.根据条款109所述的方法或者根据条款109所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述辐射是电离辐射。
[0569] 117.根据条款108至116中任一项所述的方法或者根据条款108至116中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述DNA修复靶向治疗选自非同源末端连接的抑制剂、
同源重组的抑制剂、核苷酸切除修复的抑制剂、碱基切除修复的抑制剂和范科尼贫血途径
的抑制剂。
[0570] 118.根据条款117所述的方法或者根据条款117所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述非同源末端连接的抑制剂选自DNA-PK抑制剂、Nu7441和NU7026。
[0571] 119.根据条款117所述的方法或者根据条款117所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述碱基切除修复的抑制剂选自PARP抑制剂、AG014699、AZD2281、ABT-888、MK4827、
BSI-201、INO-1001、TRC-102、APEX 1抑制剂、APEX 2抑制剂和连接酶III抑制剂。
[0572] 120.根据条款108至119中任一项所述的方法或者根据条款108至119中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述DNA损伤信号传导的抑制剂选自ATM抑制剂、CHK 1
抑制剂和CHK 2抑制剂。
[0573] 121.根据条款120所述的方法或者根据条款120所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述ATM抑制剂选自CP466722和KU-55933。
[0574] 122.根据条款120所述的方法或者根据条款120所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述CHK 1抑制剂选自XL-844、UCN-01、AZD7762和PF00477736。
[0575] 123.根据条款120所述的方法或者根据条款120所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述CHK 2抑制剂选自XL-844、AZD7762和PF00477736。
[0576] 124.根据条款108至123中任一项所述的方法或者根据条款108至123中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述DNA损伤诱导的细胞周期停滞的抑制剂选自Wee1激
酶抑制剂和CDC25a、b或c抑制剂。
[0577] 125.根据条款108至124中任一项所述的方法或者根据条款108至124中任一项所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述间接导致DNA损伤的过程的抑制剂选自组蛋白脱乙
酰酶抑制剂和热休克蛋白抑制剂。
[0578] 126.根据条款125所述的方法或者根据条款125所述应用的拮抗剂和/或激动剂，其中所述热休克蛋白抑制剂选自格尔德霉素和AUY922。
[0579] 127.如本文参考附图所述的方法。
[0580] 下面的实施例是以说明而非限制的方式提供的。实施例
[0581] 实施例1
[0582] 组织处理、分层聚类、亚型鉴定和分类器开发
[0583] 肿瘤材料
[0584] 确定可用于本发明方法的基因(表2)通过对来源于Mayo Clinic Rochester的107个整个切下(macrodissect)乳腺肿瘤FFPE组织样品的组群进行基因表达分析鉴定。本研究
的伦理批准获得自北爱尔兰机构审查委员会和伦理学研究办公室(Institutional Review 
Board and the Office of Research Ethics Northern Ireland)。
[0585] 该样品组群可以进一步描述如下：
[0586] ○47个样品对于BRCA1和BRCA2是野生型的，即表达生物功能性BRCA1和BRCA2蛋白。这些样品在下文称为散发性对照。
[0587] ○31个样品是BRCA1突变体，即不表达生物功能性BRCA1蛋白。
[0588] ○29个样品是BRCA2突变体，即不表达生物功能性BRCA2蛋白。
[0589] 基因表达谱绘制
[0590] 使用Roche高纯RNA石蜡试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)从整个切下的FFPE肿瘤样品提取总RNA。使用NuGEN WT-OvationTM FFPE系统(NuGEN 
Technologies Inc.，San Carlos，CA，USA)扩增总RNA。然后，将扩增的单链cDNA片段化并使用FL-OvationTM cDNA生物素模块V2(NuGEN Technologies Inc.)进行生物素标记。然后，使
其与Almac乳腺癌DSATM杂交。Almac乳腺癌DSATM研究工具已被优化用于分析FFPE组织样品，
使得能够使用有价值的存档组织库。Almac乳腺癌DSATM研究工具是一种创新的微阵列平台，
其代表正常和癌性乳腺组织二者中的转录物组。因此，乳腺癌DSATM提供了乳腺疾病和组织
环境中转录物组的综合表示，这是使用普通微阵列平台不能获得的。使用Affymentrix
扫描仪7G(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA)扫描阵列。
[0591] 数据准备
[0592] 使用MAS5预处理算法进行经谱绘制样品的质量控制(Quality Control，QC)。解决了不同技术方面：平均噪声和背景均一性、现时调用(present call)的百分比(阵列质量)、
信号质量、RNA质量和杂交质量。分析对应参数的分布和中值绝对偏差并用于鉴定可能的异
常值。
[0593] Almac卵巢癌DSATM包含主要靶向在距离多核苷酸的3’端300个核苷酸内的区域的探针。因此，标准的Affymetrix RNA质量测量针对3’端探针组的管家基因强度进行调整，其中除通常3’/5’比率之外，还使用3’端探针组强度与平均背景强度的比率。检查杂交控制以确保其强度和现时调用符合Affymetrix规定的要求。
[0594] 基于ESR1(雌激素受体1)的转录物水平将来自BRCA1/2突变体和散发性对照训练集的肿瘤样品分成2个数据集。每个样品的mRNA表达水平E.avg通过所有ESR1探针组
(BRAD.15436_s_at、BRAD.19080_s_at、BREM.1048_at、BRIH.10647C1n2_at、
BRIH.5650C1n2_at、BRPD.10690C1n5_at、BRRS.81_at和BRRS.81-22_at)的平均表达来确
定。计算所有样品的mRNA中值表达(E.med.all)。当E.avg-E.med.all＞0.5时，样品被认为是ER阳性的，并且当E.avg-E.med.all＜0.5时，被认为是ER阴性的。
[0595] 在具有稳健多阵列分析(RMA)的表达控制台V1.1(Irizarry等，2003)中进行预处理，得到分别由56和51个样品构成的ER阳性和ER阴性样品的2个数据矩阵。如Alter(Alter
等，2000)所述，进行另外的转换以移除与阵列质量相关的变化。
[0596] 特征选择
[0597] 对每个数据矩阵应用组合的背景和方差过滤器以鉴定最可变的探针组。背景过滤器基于选择表达式E和表达方差varE高于由背景标准偏差σBg(来自表达控制台软件)和在
指定显著性a下标准正态分布za的分位数限定的阈值的探针组，如果满足下式，则保留探针
组：
[0598]
[0599] 其中显著性阈值为a＝6.3.10-5，关于所选探针组及其基因注释的列表，参见表1。
[0600] 分层聚类分析
[0601] 向来自使用卵巢癌DSATM(疾病特异性阵列)平台分析的199个上皮浆液性卵巢肿瘤的微阵列数据应用分层聚类技术(图1)。使用标准的稳健多芯片算法(Robust Multichip 
Algorithm，RMA)操作对原始表达数据进行预处理。确定并去除数据集中的非生物系统方
差。确定表达水平在肿瘤之间显著变化的那些探针组。这些探针组形成固有列表。
[0602] 基于固有列表进行2-D聚类分析(肿瘤、探针组)以建立肿瘤关系。应用分层凝聚聚类(Pearson相关距离和Ward连锁)。使用GAP指数选择最佳分配数(Tibshirani等，2002，
J.R.Stat.Soc.，63：411-423)。将所有在子聚类中可用的探针组映射到基因名称。
[0603] 基因聚类的功能分析
[0604] 为了建立探针组聚类的功能显著性，将探针组映射到基因(Entrez基因ID)，并进行基于超几何函数的富集分析(应用假发现率(Benjamini和Hochberg，1995，
J.R.Stat.Soc.57：289：300))。使用来自 的MetacoreTM单实验分析工作流程对
通过对ER阳性和ER阴性样品进行分层聚类产生的每个基因集分析生物过程和途径的过度
表示。反义探针组被排除在分析之外。对每个富集的功能性实体类别评估超几何p值。选择
具有最高p值的功能性实体类别作为该集合的表示，并且基于表示的显著性(即p值)将代表
这些功能性实体的一般功能类别分配给基因聚类。
[0605] 将富集IFN/DD一般功能项的聚类中的基因分组为DNA损伤响应缺陷(DDRD)样品组，并用于分类器生成。选择来自由IFN/DD一般功能项表示的ER阳性和ER阴性数据集的样
品聚类用于分类并标记为DDRD。不是由这些功能项表示的那些被标记为非DDRD。
[0606] 在探针组水平的分类器开发
[0607] 在鉴定形成DDRD亚组的肿瘤种类之后，参照功能性DDRD基因列表(表1)进行这些肿瘤与肿瘤组群中所有其他肿瘤(非DDRD)的计算分类以确定对DDRD亚组进行分类的精细
基因分类模型。使用以下选择的所有组合(共18个)对此进行评价：
[0608] ●三个样品组
[0609] ○ER阴性和ER阳性样品的组合样品组(组合样品组)
[0610] ○单独的ER阴性样品
[0611] ○单独的ER阳性样品
[0612] ●两个特征组
[0613] ○具有75％方差/强度过滤和强制纳入DDRD列表的完整特征列表。在此，去除具有最低组合方差和强度的75％探针组，基于二者的平均排名。在使用时，术语“VarInt”指这一选择。
[0614] ○仅DDRD列表。在使用时，项“仅列表”指该选择。
[0615] ●三种分类算法
[0616] ○PLS(偏最小二乘法)(de Jong，1993)
[0617] ○SDA(收缩判别分析)(Ahdesmaki和Strimmer，2010)
[0618] ○DSDA(对角线SDA)(Ahdesmaki和Strimmer，2010)
[0619] 使用AUC来评估不同模型的性能。在每个模型的整个开发期间实施迭代特征消除(Iterative Feature Elimination，IFE)，其中最大AUC是在交叉验证下选择最佳特征数的
主要标准。在特征之间没有可见AUC差异的情况下，选择最小特征长度。
[0620] 在基因水平的分类器开发
[0621] 为了便于在多个阵列平台之间对分类器进行验证，在基因水平再生所选的探针组分类器。探针组分类器在基因水平的重建需要两个独立的步骤：
[0622] 1.由映射到每种基因的探针组(不包括反义探针组)的中值估算探针组分类器中独特基因的表达强度；
[0623] 2.重新估算用于分类的分类器参数。
[0624] 基于在所有交叉验证预测中的最大灵敏度和特异性来选择阈值。
[0625] 类似地，可以使用10种靠前基因(或当前44基因标签中存在的任意特征数)的基因水平定义表达强度来通过在训练数据集中在交叉验证中重新估算分类参数来仅基于这10
种基因(或当前44基因标签中存在的任意特征数)重新开发分类器以及通过评估和最大化
从所有交叉验证预测获得的灵敏度和特异性来重新建立阈值。该方法类似于从较大的特征
组(如上所述)工作时使用的方法，不同之处在于不涉及特征选择：特征将保持相同，但是将
被分配新的权重。
[0626] 计算验证数据集的分类器评分
[0627] 公开数据集
[0628] 用于该分析的数据集是：FAC1[GEO登录号GSE20271(Tabchy等，2010)]、FAC2[GEO登录号GSE22093，(Iwamoto等，2011)]、FEC[GEO登录号GSE6861，(Bonnefoi等，2007)]、T/FAC1[http：//bioinformatics.mdanderson.org/pubdata.html，(Hess等，2006)]、T/FAC2
[GEO登录号GSE16716，(Lee等，2010)]和T/FAC3[GEO登录号GSE20271(Tabchy等，2010)]。必须注意的是，在FAC1和FAC2数据集之间有31个样品存在重叠。将这些样品从FAC2数据集中
移除，并且因此仅在FAC1、FAC2和FEC数据集的组合分析中包括一次。此外，样品GSM508092
由于其是转移性淋巴结样品而从FAC1中移除。
[0629] 所有数据集使用RMA进行预处理(Irizarry等，2003)。对于每个验证集，确定映射到分类器基因的探针组，不包括反义探针组(如果适用的话)。Affymetrix X3P和U133A阵列
的注释可从Affymetrix网站获得。计算映射到分类器中每种基因的所有探针组的中值强
度，得到基因强度矩阵。然后，将分类器应用于该数据矩阵以产生每个样品的分类器评分/
预测。
[0630] 计算性能指标
[0631] 为了计算NPV和PPV，使用对应数据集中每个类别的比例来估算每个终点(BRCA状态/响应)的流行率。
[0632] 单变量和多变量分析
[0633] 进行单变量和多变量分析以分别评估DDRD分类器与响应之间的关联，并确定关联(如果有的话)是否独立于已知的临床预测因子。单变量分析的示于表47的p值使用MATLAB
中的逻辑回归进行计算。对于多变量分析，我们使用逐步逻辑回归(Dupont，2009)，其中p值代表变量的对数似然。对数似然是变量对模型的适合的重要性的量度，从而突出其相对于
其他预测因子作为预测因子的独立性。在单变量和多变量分析中，均使用p值＜0.05作为显
著性的标准。此外，该评估中排除临床因子未知的样品。
[0634] 结果
[0635] 用于生成分类器的样品的选择
[0636] 本研究的目的是在转录组水平表征能够确定致病性细胞对DNA损伤治疗剂的响应性或抗性的一组基因。考虑到这一点，选择Almac乳腺癌数据集中最能代表该生物学的那些
样品，并与用于分类器生成的剩余样品进行比较(参见下一部分)。确定，来自ER-ve样品组
中样品聚类2的样品是该选择的最相关样品，因为这些样品显示BRCA突变体样品的比例最
大(64％)，并且其显示出最主要的生物学(IFN/免疫应答)。从ER+ve样品组中，选择来自样
品聚类2和3的样品，因为这些样品聚类分别具有73％和67％的BRCA突变体肿瘤。此外，这些
聚类中最主要的生物学与细胞周期、DNA损伤响应和IFN/免疫应答相关。已报道，免疫信号
传导和细胞周期途径响应于DNA损伤而被调节(Jackson，S.P.，和Bartek，J.，Nature 461，
1071-1078(2009)；Rodier，F.，等，Nat Cell Biol 11，973-979(2009)；Xu，Y.，Nat Rev Immunol6，261-270(2006))，并且将这些亚组组合以形成推定的DDRD亚组。ER-ve样品组(下
文所述)的聚类2以及ER+ve样品组(下文描述)的聚类2和3中的那些样品是标记为DDRD(DNA
损伤响应缺陷型)的类别(参见图1A)，而ER-ve样品组的样品聚类1和3以及ER+ve样品组的
样品聚类1、4、5和6中的样品是标记为非DDRD的类别(参见1B)。
[0637] ER-ve样品组：在ER-ve样品组中，分层聚类分析限定三个样品聚类和六个探针组聚类组。探针组物类3被鉴定为ER-ve样品组中最显著的生物学特征，并且富集干扰素和免
疫应答信号传导。
[0638] ER+ve样品组：在ER+ve样品组中，分层分析限定6个样品组和6个探针组聚类组。探针组聚类5被鉴定为ER+ve样品组中最显著的生物学，并且富集细胞外基质重塑。ER+ve样品
组中下一个最显著的探针组聚类是探针组聚类6，并且也富集干扰素和免疫应答信号传导。
[0639] DDRD分类器模型的开发和验证
[0640] 在鉴定形成DDRD亚组的肿瘤种类之后，参照功能性DDRD(IFN/DNA损伤)基因列表进行这些肿瘤与肿瘤组群中所有其他肿瘤的计算分类以确定对DDRD亚组进行分类的精细
基因分类模型。
[0641] 使用分类流水线(classification pipeline)来使用组合ER-ve和ER+ve乳腺癌样品的组来推导模型。分类流水线已根据普遍认可的良好实践开发[MAQC Consortium，Nat 
Biotechnol 2010]。该过程将并行地：1)由经验数据推导基因分类模型；2)评估模型的分类
性能，二者均在交叉验证下进行。分类器生成的性能和成功取决于许多可以改变的参数，例
如分类方法或探针组过滤的选择。考虑到这一点，评价了两个特征组：(i)具有75％方差/强
度过滤的完整特征列表(强制纳入DDRD(IFN/DNA损伤)列表，表1)；和(ii)仅DDRD(IFN/DNA
损伤)列表；并对三种分类算法进行评价：即PLS(偏最小二乘法)、SDA(收缩判别分析)和
DSDA(对角线SDA)。在整个模型开发期间使用迭代特征消除(IFE)，这是在每次迭代时去除
一部分排名最差特征的迭代过程；当只剩下最少数量的特征时，停止。使用表示为AUC的接
受者操作特征曲线下面积(AUC-ROC)来评估分类性能，因为这一量度独立于组间截止值和
数据中的流行率。其也是分类性能的选择的公认量度之一。因此，基于交叉验证下的平均
AUC来选择每个模型的最佳特征数。
[0642] 如下对模型进行交叉比较：首先基于最高平均AUC选择每个模型的最佳特征数，然后使用盒形图来可视化每个模型的性能。这在图2中表明。从左到右，前三个图分别代表使
用探针组的初始过滤以去除具有最低平均方差和强度的75％(强迫纳入基因列表)开发的
PLS、SDA和DSDA分类器。接下来的三个图分别代表使用仅DDRD(IFN/DNA损伤)列表开发的
PLS、SDA和DSDA分类器。
[0643] 从图2可知，包含53个探针组的“PLS VarInt”分类模型是性能最高的模型，其中AUC显著高于其他5个模型中的大多数。然后，将该模型推进到下一个阶段用于在独立的外
部数据集上进行验证，以评估DDRD分类评分在响应和预后方面对患者进行分层的能力。
[0644] 由于以下事实而采用验证分类模型的非常规方法：验证数据集是不同阵列平台的公开数据或内部数据。通常使用的方法不被设计成适用于替选阵列平台，并且因此用于分
类模型开发和独立验证的分阶段方法如下：
[0645] 1.阶段I-在探针组水平生成模型，在交叉验证下选择最佳模型用于对DDRD亚组进行分类(如前所述)
[0646] 2.阶段II-将探针组水平分类模型转换为基因水平分类模型
[0647] 3.阶段III-使用外部数据集来验证重新开发的基因分类模型
[0648] 已选择进展至验证阶段的候选模型之后，需要在基因水平重建该模型(阶段II)。这涉及将分类模型中的探针组映射到基因水平并重新计算每肿基因的权重。所选模型中的
53个探针组映射到表2A中列出的40种基因，并且随后当通过进一步分析提高注释流水线的
准确度时映射到表2B中列出的44种基因。
[0649] 在重新开发基因分类模型中，为了确保使用与基因相关的所有信息，使用与每种基因相关的所有探针组(表2C)的中值强度作为基因表达值。对于所有样品计算这个值，得
到基因表达数据矩阵，如与在阶段I中针对模型开发和选择使用的探针组表达数据矩阵相
对。为了稳定不同批次之间的强度，从每个样品的每种基因的对应强度中减去该样品的所
有探针组的中值。
[0650] 使用PLS回归对每种基因计算新的权重，产生可用于在来自不同阵列平台的外部数据集上验证的最终基因分类器模型(40基因和44基因分类器模型)(阶段III)。
[0651] 在阶段III(使用可来自其他阵列平台的数据集验证分类器)中，采取以下步骤：
[0652] 1.确定映射到分类器中基因的探针组，不包括反义探针组(如果适用的话)
[0653] 2.计算与分类器中每种基因相关的所有探针组的中值强度，产生约化基因强度矩阵
[0654] a.如果特定阵列平台上的基因没有探针组，则将作为替代使用从训练数据中观察到的平均值
[0655] 3.计算每个样品的所有探针组的中值，并从约化基因强度矩阵中减去
[0656] 4.将每种基因的值乘以标签中该基因的“权重”
[0657] 5.将标签中每种基因在第4点中获得的值相加在一起以产生该样品的标签评分
[0658] 6.分类器为每个样品产生评分，其然后可以用于从例如更可能作出响应到较不可能作出响应对患者进行分层。
[0659] 实施例2
[0660] 44基因DDRD分类器模型的计算机验证
[0661] 在原始Almac乳腺数据集和三个独立数据集中通过ROC(接受者操作特征)曲线下面积(AUC)来验证44基因DDRD分类器模型的性能。AUC是在所观察疾病尺度上计算的统计
量，并且是使用分类器模型预测表型的有效性的量度(Wray等，PLoS Genetics第6卷，1-9)。
0.5的AUC是随机分类器所特有的，并且1.0的AUC将代表完全种类分离。因此，为了确定44基
因DDRD分类器模型是否能够预测针对标准乳腺癌和卵巢癌治疗药物种类(包括DNA损伤引
发剂和DNA修复靶向治疗)的响应并据此选择患者，假设是在这些数据集中应用之后AUC应
高于0.5，最低置信区间也高于0.5。
[0662] 44基因分类器模型使BRCA突变体与散发性肿瘤分离的能力的评估
[0663] 用于预测DDRD状态的分类器评分用于评估模型使BRCA突变体样品与散发性样品分离的能力。进行此分析以评估分类器模型与BRCA突变状态之间的关系。由于功能性
BRCA1/2的丧失使DNA损伤响应缺陷，BRCA突变体肿瘤表现出高度的基因组不稳定性。因此，
假设是DDRD分类器模型应能够使BRCA突变体样品与BRCA野生型散发性样品分离。
[0664] 图3显示，44基因分类器模型使BRCA突变体与散发性样品分类，其中AUC为约0.68，其中两个模型的较低置信区间为约0.56(表46A)；表明性能显著优于随机分类器。因此，该
分析证实44基因DDRD分类器模型能够鉴定由于不能够修复DNA损伤而具有高基因组不稳定
性的样品。
[0665] 分类器模型对独立微阵列临床数据集的应用
[0666] 独立的乳腺癌微阵列临床数据集
[0667] (1)44基因DDRD分类器模型对DNA损伤性化学治疗的预测力的评估
[0668] 为了评估44基因DDRD分类器模型预测针对DNA损伤性化学治疗剂的响应的能力，将其应用于由三个公开可用数据集组合的数据。在每项研究中，用基于5-氟尿嘧啶、蒽环类
和环磷酰胺的新辅助性方案(直接损伤DNA的药物)治疗乳腺癌患者。第一(Tabchy等，2010)
和第二(Iwamoto等，2011)数据集分别具有用氟尿嘧啶、多柔比星和环磷酰胺(FAC)进行新
辅助性治疗后87和50个ER阳性和ER阴性原发性乳腺肿瘤样品的响应数据。第三数据集
(Bonnefoi等，Lancet Oncol 8，1071-1078(2007))具有在新辅助性5-氟尿嘧啶、表柔比星
和环磷酰胺(FEC)治疗后66个ER阴性原发性乳腺肿瘤样品的响应数据。每项研究使用病理
学完全响应(pathological complete response，pCR)或残余疾病(residual disease，RD)
作为终点。由于每个数据集相对较小，因此将数据组合以提高分析力。
[0669] 分析揭示，44基因DDRD分类器模型与针对基于蒽环类的化学治疗的响应显著相关(相对风险(relative risk，RR)＝4.13，CI＝1.94-9.87；AUC＝0.78，CI＝0.70-0.85，P＝
0.001；表46B，图4)。分类器的阴性预测值(negative predictive value，NPV)显著高于阳
性预测值(positive predictive value，PPV)(0.90相对于0.44，表46B)，表明DDRD阴性肿
瘤不太可能对DNA损伤性化学治疗作出响应。
[0670] 使用逐步逻辑回归来确定44基因DDRD分类器模型在针对临床变量调整时预测组合数据集中的响应的能力(表47)。44基因DDRD分类器模型在单变量分析中被确定为最显著
的临床变量。多变量分析表明，44基因DDRD分类器模型的预测值与分期、分级和特别地ER状
态无关。
[0671] 针对雌激素、孕酮和HER2受体的阴性已被表明是异常DDR以及因此针对DNA损伤性治疗和DNA修复靶向治疗的响应的生物标志物(Foulkes等，2010)。然而，这种方法排除了报
道为ER阳性的20％的BRCA1突变体肿瘤和40％的BRCA2突变体肿瘤(Foulkes等，2004；Tung
等，2010)。相比之下，通过我们采用的分析方法，44基因DDRD分类器检测ER阳性和ER阴性肿瘤二者中的DDRD亚组，如通过对44基因DDRD分类器在FEC和FAC数据集的组合分析中的预测
值进行多变量分析验证的，证明其与ER状态的独立性。在临床上，这是DDRD分类器的翻译应
用的一个重要方面，因为表明其可以应用于所有乳腺癌患者，而不论ER状态如何，以确定其
针对DNA损伤形治疗剂的预测响应性。
[0672] (2)44基因DDRD分类器模型对含紫杉烷化学治疗方案的预测力的评估
[0673] 评估了44基因DDRD分类器模型预测针对包含非DNA损伤剂(例如紫杉烷类)的化学治疗方案的响应的能力。数据由3个数据集组合，所述数据集具有321个原发性乳腺癌患者
在用紫杉醇和FAC(T/FAC)进行新辅助性治疗后的响应数据，在此响应被限定为pCR(Hess
等，2006；Lee等，2010；Tabchy等，2010)。尽管44基因DDRD分类器模型与响应均相关(AUC＝
0.61，CI＝～0.52-0.69，表46B，图5)，但是与在经仅FAC/FEC处理的样品中的性能相比，该性能显著降低。此外，多变量分析显示，DDRD分类器在预测针对T/FAC之响应的能力方面与
其他临床参数不独立(P＝0.21)(表47)。这表明，由DDRD分类器检测到的亚组对仅DNA损伤
的方案更敏感，而不是还包含抗微管剂的方案。
[0674] 独立的卵巢微阵列临床数据集
[0675] 决定探索44基因DDRD分类器模型在另一个疾病领域的性能。因此，在259个具有浆液性组织学的FFPE原发性卵巢癌样品的组中评估分类器模型的性能。这些样品来自接受辅
助性铂剂治疗或辅助性铂剂和紫杉烷治疗的患者，并在卵巢癌DSATM上进行谱绘制。响应数
据由RESIST和/或血清标志物CA125水平确定。对这些样品应用44基因DDRD分类器模型证明
显著地将响应者与非响应者分开，其中AUC为约0.68且置信度下限为约0.59(图6)。44基因
DDRD分类器模型检测范科尼贫血/BRCA途径的功能障碍。
[0676] 包括BRCA1和BRCA2的范科尼贫血/BRCA(FA/BRCA)途径在DNA修复中发挥整合作用，并且可由于突变或表观遗传沉默而在乳腺癌中丧失(Kennedy和D′Andrea，2006)。因此，确定44基因DDRD分类器模型是否可以检测该途径中除BRCA1和BRCA2之外的成员的消除。用
由携带FA/BRCA途径中一系列突变的21位FA患者和具有功能性FA/BRCA途径的11位健康对
照的骨髓产生的微阵列数据鉴定公开数据集(Vanderwerf，S.M.，等，Blood 114，5290-5298(2009))。44基因DDRD分类器模型显著区别FA/BRCA突变体与正常样品，其中AUC为0.90(CI
＝0.76-1.00，P＜0.001，图7)，证明DDRD分类器与FA/BRCA途径通过多种机制的功能障碍之
间的强相关性。
[0677] 对44基因DDRD分类器模型的计算机验证的总结
[0678] 以下示出了44基因DDRD分类器模型的计算机验证：
[0679] (a)44基因DDRD分类器模型能够使BRCA突变体乳腺肿瘤样品与野生型BRCA(散发性)乳腺肿瘤样品显著分离。这意味着DDRD分类器模型能够检测与具有高水平基因组不稳
定性的肿瘤(例如BRCA突变体肿瘤)相关的生物学。这些肿瘤通常对DNA损伤性化学治疗方
案作出更佳响应。
[0680] (b)44基因DDRD分类器模型能够在用FAC和FEC(Bonnefoi等，2007；Iwamoto等，2011；Tabchy等，2010)以及T/FAC(Hess等，2006；Lee等，2010；Tabchy等，2010)进行新辅助性治疗后在三个独立乳腺数据集的组合中将限定的响应者(表现出pCR的那些)与非响应者
(未表现出pCR的那些)分离。发现44基因DDRD分类器模型独立于其他临床因子并且是FAC/
FEC组合分析中响应的最显著独立预测因子。这些研究使用新鲜冷冻(FF)的样品和使用两
个不同的微阵列平台(即Affymetrix X3P微阵列和Affymetrix U133A微阵列)来进行。这些
结果验证了44基因DDRD分类器模型使用不同样品材料(FF代替FFPE)和利用来自两个不同
微阵列平台的微阵列数据在独立乳腺数据集中的性能。
[0681] (c)44基因DDRD分类器模型能够在用基于铂剂或铂剂/紫杉烷的治疗进行辅助性治疗后在独立Almac卵巢数据集中使响应者与非响应者显著分离。该数据是使用在Almac 
Ovarian DSATM上进行谱绘制的FFPE样品产生的。
[0682] (d)44基因DDRD分类器模型能够显著区别使用骨髓组织样品的FA/BRCA突变体和正常样品，证明DDRD分类器与FA/BRCA途径通过多种机制的功能障碍之间的强相关性。
[0683] 总之，DDRD分类器模型已在三个不同疾病领域(乳腺癌、卵巢癌和FA)中独立地验证并表现出性能稳健性，证明能够利用来自四个不同微阵列平台(Almac Breast DSATM和
Almac Ovarian DSATM、Affymetrix X3P微阵列和Affymetrix U133A微阵列)在两种不同类
型样品(FFPE和FF)中针对四种不同化学治疗方案(FAC、FEC、T/FAC和铂剂/紫杉烷)使响应
者与非响应者分离。已经证明，DDRD是针对DNA损伤治疗剂之响应的独立预测因子，并且可
以预测FA/BRCA途径中的突变。这种性能的可塑性和可重复性意味着，在通过44基因分类器
模型鉴定的DDRD亚组中鉴定的生物学与预测针对DNA损伤引发剂之响应性显著且稳健相
关，并且因此支持本发明鉴定亚型的权利要求，所述亚型可用于预测针对标准乳腺癌和卵
巢癌治疗药物种类之响应并据此选择患者，所述种类包括直接损伤DNA、间接损伤DNA或抑
制正常DNA损伤信号传导和/或修复过程的药物。
[0684] 表46：
[0685] 44基因DDRD分类器模型在乳腺数据集中的性能指标和独立性评估括号中的数字表示来自交叉验证(A)或1000次重复自举(B)的与+/-2SD的95％置信限。AUC＝接受者操作
特征曲线下面积；ACC＝准确度；SENS＝灵敏度；SPEC＝特异性；PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值；RR＝相
[0686] 对风险，pCR＝病理学完全响应，RD＝残余疾病。
[0687]
[0688] 表47
[0689] 44基因DDRD分类器模型的单变量和多变量分析
[0690] 44基因DDRD分类器模型在独立验证集中与标准病理学参数的比较。
[0691] DDRD分类器模型的预测值以及显著性临床参数使用逻辑回归模型在单变量和多变量分析中进行评价，其中p值来自对数似然检验。
[0692]
[0693] 实施例3
[0694] 44基因DDRD分类器模型的体外验证
[0695] 为了评估包含在44基因分类器模型中的基因潜在的生物学，使用一组乳腺细胞系在体外进行许多研究。
[0696] 方法
[0697] 细胞系的维持
[0698] HCC1937亲本的HCC1937-EV和HCC1937-BR细胞系由贝尔法斯特女王大学(Queen’s University College Belfast，QUB)的Paul Harkin教授慷慨捐赠。将细胞系常规维持在补
充有50U青霉素/ml、50μg链霉素/ml、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和20％(v/v)胎牛血清
(FBS)的RPMI-1640培养基中。HCC1937-EV和HCC937-BR细胞系也需要0.2ml/mg遗传霉素。将
细胞系在37℃下在5％CO2的潮湿气氛下进行培养。
[0699] 克隆发生测定-PARP-1抑制剂/敏感性的确定
[0700] 为了测量对PARP-1抑制剂(KU0058948)的敏感性，将指数生长细胞接种到6孔板中。在接种后24小时，使细胞暴露于包含递增剂量药物的培养基。每4至5天补充细胞培养
基。在12至14天后，将细胞固定在甲醇中，用结晶紫染色并计数。针对给定剂量的对照的百
分比存活作为针对该剂量的铺平板效率除以经载剂处理细胞的铺平板效率计算。使用
GraphPad Prism计算存活曲线和半最大抑制浓度(IC50)值。
[0701] 细胞生存力测定-顺铂灵敏性的确定
[0702] 为了测量对顺铂的敏感性，将指数生长细胞接种到96孔板中。在接种后24小时，使细胞暴露于包含递增剂量的顺铂的培养基。将细胞在药物存在下孵育96小时，在该时间之
后使用Promega CellTitre-Glo发光细胞生存力测定评估细胞的生存力。作为载剂(DMSO)
对照的百分比计算细胞的敏感性。使用GraphPad Prism计算存活曲线和半最大抑制浓度
(IC50)值。
[0703] 结果
[0704] 可以在乳腺癌细胞系模型中鉴定DDRD亚组
[0705] 使用临床前模型系统来确定44基因DDRD分类器是异常DDR的量度。由于BRCA1突变，HCC1937乳腺癌细胞系是DDRD(Tomlinson等，1998)。将44基因分类器应用于HCC1937空
载体对照细胞(HCC1937-EV)和其中BRCA1功能性被校正的HCC1937细胞(HCC1937-BR)(图
8A)。发现，相对于HCC1937-BR细胞，DDRD 44基因分类器评分在HCC1937-EV中更高，其中平
均评分分别为0.5111和0.1516(图8B)。与DDRD 44基因分类器评分一致，相对于BRCA1校正
的细胞系，HCC1937BRCA1突变细胞系对PARP-1抑制剂KU0058948(图8C)和顺铂(图8D)更敏
感。这些临床前数据表明，DDRD 44基因分类器测量DDRD阳性肿瘤细胞中的免疫信号传导，
并且与针对DNA损伤剂(顺铂)和DNA修复靶向剂(PARP-1抑制剂)的响应都相关。
[0706] DDRD 44基因分类器检测范科尼贫血/BRCA途径的功能障碍
[0707] 包括BRCA1和BRCA2的范科尼贫血/BRCA(FA/BRCA)途径在DNA修复中发挥整合作用，并且可由于突变或表观遗传沉默而在乳腺癌中丧失((Kennedy，R.D.和D′Andrea，A.D.，J Clin Oncol 24，3799-3808(2006))。确定DDRD 44基因分类器是否可以检测该途径中除
BRCA1和BRCA2之外的成员的消除。用由携带FA/BRCA途径中一系列突变的21位FA患者和具
有功能性FA/BRCA途径的11位健康对照的骨髓产生的微阵列数据鉴定公开数据集
(Vanderwerf等，2009)。DDRD 44基因分类器显著区别FA/BRCA突变体与正常样品，其中AUC
为0.90(CI＝0.76-1.00，P＜0.001)，证明DDRD分类器与FA/BRCA途径通过多种机制的功能
障碍之间的强相关性。
[0708] 结论
[0709] 相对于同基因的经BRCA1校正细胞系，DDRD 44基因分类器评分在BRCA1突变体并且因此DDRD、HCC1937乳腺癌细胞系中显著更高。由于44基因分类器评分与这些细胞中的
DDR功能障碍相关，因此证明由DDRD分类器检测到的免疫信号传导是细胞固有的，而不是淋
巴细胞浸润的功能。BRCA1和BRCA2代表FA/BRCA DDR网络的一部分，该网络包含大量已报道
在约33％乳腺癌中突变或表达不足的其他蛋白质(Kennedy，R.D.和D′Andrea，A.D.，J Clin Oncol 24，3799-3808(2006))。如前所述，DDRD 44基因分类器使来自具有FA突变的患者的
骨髓样品与正常对照显著分离。这表明DDRD分类器能够检测途径中的任何异常，而不是特
别地BRCA1或BRCA2功能障碍。可能的是，DDRD 44基因分类器可以鉴定具有由其他机制引起
的DDR缺陷的肿瘤，所述其他机制例如PTEN丧失、细胞周期检查点功能障碍或由代谢紊乱引
起的活性氧物类增加。由于组成型DNA损伤，这些肿瘤可能对DNA修复靶向治疗(例如PARP-1
或CHK1/2抑制剂)作出响应。
[0710] 实施例4
[0711] 内源性和外源性DNA损伤通过cGAS-STING途径激活先天性免疫基因的表达
[0712] 方法
[0713] 免疫组织化学
[0714] 所有的免疫组织化学都使用Ventana 自动化染色器来进行。在从FFPE块取得的4μm切片上进行免疫组织化学应用。将IHC的切片在旋转切片机上以4μm切
割，在37℃下干燥过夜，然后用于IHC测定。先前描述的191个N0-N1ER阳性和ER阴性FFPE乳
腺肿瘤样品的组群的组织微阵列以一式三份评分用于免疫表达分析。将CD4(4B12，M7310，
Dako)以1∶50稀释，并将CD8(C8/144B，M7103，Dako)以1∶50稀释以使得能够可视化免疫细胞浸润。将CD274(PDL1)(Roche，SP142)以1∶40稀释，并使用OptiView扩增试剂盒(Roche)进行
8分钟扩增步骤。采用半定量评分系统来进行CD4和CD8表征。简言之，3的评分指示强CD4或
CD8表达，2指示中等表达并且1指示低或弱表达。如果不存在CD4或CD8表达，则应用评分0。
评分由两位独立观察者针对在TMA可视化的芯的间质和肿瘤内组分确定。对于CD274
(PDL1)，使用先前公开的截止值＞1％和＞5％对TMA上的阳性芯进行评分。在芯的肿瘤和间
质二者中研究CD274(PDL1)染色。
[0715] 反向siRNA转染
[0716] 根据制造商的说明将siRNA寡核苷酸(MWG Eurofins)重悬至浓度为100μM。以下序列用于siRNA：
[0717] STING_a    5’CAGCGGCUGUAUAUUCUCCUCCCUU 3’
[0718] STING_b    5’GGUCAUAUUACAUCGGAUAUU 3’
[0719] TBK1_a     5′GGAAAUAUCAUGCGUGUUAUU 3′
[0720] TBK1_b     5′UGGUGCAGCUAGAGAAUUAUU 3′
[0721] IRF3_a     5′CCUCUGAGAACCCACUGAAUU 3′
[0722] IRF3_b     5′GGACAAUCCCACUCCCUUCUU 3’
[0723] cGAS_a     5′AGAGAAAUGUUGCAGGAAAUU 3′
[0724] cGAS_b     5’CAGCUUCUAAGAUGCUGUCAAAGUU 3′
[0725] BRCA1_a    5′CCUAUCGGAAGAAGGCAAGUU 3′
[0726] BRCA1_b    5′CAUACAGCUUCAUAAAUAAUU 3
[0727] BRCA2_a    5′GGACACAAUUACAACUAAAUU 3′
[0728] BRCA2_b    5′GGAGGAAUAUCGUAGGUAAUU 3′
[0729] FancD2_a   5′GCAGAUUCAUGAAGAGAAAUU 3′
[0730] FancD2_b   5′GGUUAAAGCACAUUGUAGAUU 3′
[0731] 在6孔板中，将20μl的2μM  siRNA贮存液重悬于500μl的1∶100RNAiMax(Life Technologies)中，在室温下孵育5分钟。然
后，将其在室温下孵育20分钟，在此期间对细胞进行胰蛋白酶消化，并使用Countess自动化
细胞计数器(Life Technologies)进行计数。然后，将细胞重悬于不含抗生素的培养基中至
确定向每个板添加1.5ml细胞悬浮液在24小时时产生50％汇合的浓度。在24小时时更换培
养基，并且如果指示，则在此点添加药物处理。然后，将细胞再孵育48小时，然后收获RNA和蛋白质。
[0732] 定量实时PCR(qRT-PCR)
[0733] 使用第一链cDNA合成试剂盒(Roche)进行逆转录。根据制造商的说明对500ng的RNA进行逆转录。使用Roche通用探针文库测定设计中心来设计横跨外显子的qPCR引物并以
0.5μM的浓度使用。使用以下引物序列：
[0734] CXCL10
[0735] 正向      5′GGC CAT CAA GAA TTT ACT GAA AGC A 3′
[0736] 反向      5′TCT GTG TGG TCC ATC CTT GGA A 3′
[0737] CCL5
[0738] 正向      5′TGC CCA CAT CAA GGA GTA TTT 3′
[0739] 反向      5’CTT TCG GGT GAC AAA GAC G 3’
[0740] IDO1
[0741] 正向      5’CAT CTG CAA ATC GTG ACT AAG 3’
[0742] 反向      5’CAG TCG ACA CAT TAA CCT TCC TTC 3’
[0743] PDL1
[0744] 正向      5’GGC ATC CAA GAT ACA AAC TCA AAG A 3’
[0745] 反向      5’AGT TCC AAT GCT GGA TTA CGT CT 3’
[0746] PUM1   (管家基因)
[0747] 正向      5’CCA GAA AGC TCT TGA GTT TAT TCC 3’
[0748] 反向      5’CAT CTA GTT CCC GAA CCA TCT C 3’
[0749] 为了由qPCR进行绝对定量，我们使用标准曲线方法。每个引物组的效率使用以下等式由标准曲线推导：
[0750] E＝10^(-1/斜率)。
[0751] 将逆转录的产物在无核酸酶水(Nuclease Free Water，NFW)中以1∶10稀释。每个10μl PCR反应物由以下组成：0.5μl的10μM正向引物、0.5μl的10μM反向引物、5μl的2X
480 SYBR Green I主混合物(Roche)、1.5μl NFW和2.5μl的经稀释逆转录
产物。将这些10μl反应物移液到 480多孔96板(Roche)的孔中，然后使用透
明黏合膜(Roche)密封该板。将板放入 (Roche)中，并按照以下方案运
行。(95℃10分钟；45个以下循环：95℃15秒，55℃30秒和72℃30秒)，随解链曲线完成以确定引物特异性。所有的qPCR数据均使用由Roche提供的 软件进行分析。对
于分析，计算技术重复的Cp值，并根据运行内标准曲线由Cp值计算基因的相对量。然后，如
下将每个平均值相对于对应样品中管家基因PUM1的年均浓度归一化：将靶基因的浓度除以
管家基因的浓度。相对表达指已相对于管家基因归一化并相对于相关对照样品产生的基因
表达水平。从这些归一化值，计算每种基因的倍数变化，并且由三个独立实验重复推导三个
单独倍数变化的平均值。使用GraphPad Prism 5.0软件上可用的未配对双尾students T检
验来检测统计学显著性。
[0752] Western印迹
[0753] 黏附细胞形成悬浮在包含磷酸酶和蛋白酶抑制剂(Roche抑制剂混合物，Germany)的RIPA缓冲液中的全细胞裂解物。然后，旋转裂解物以消除细胞碎片。使用读板器根据制造
商的说明使用BCA测定(Pierce，Rockford，IL，USA)量化蛋白质。在巯基乙醇蛋白上样缓冲
液中制备每个样品的等量蛋白质，并使用梯度4-12％ Tris-Bis加聚丙烯酰胺凝胶
(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific Inc.)或梯度3-8％
Tris-醋酸盐凝胶(仅用于BRCA1；Life Technologies，Thermo Fisher 
Scientific Inc.)根据尺寸分离，通过电印迹转移至PVDF 0.45μm膜(Immoblion-P，
Millipore)。为了研究PDL1表达，将膜在3％BSA/TBST中封闭并用经以1∶500在3％BSA/TBST
中稀释的抗PDL1抗体(目录号#13684，Cell Signaling，Technology，MA，USA)探测过夜。为了研究BRCA1(HPA034966，Sigma Aldrich)、Lamin B1(ab16048，Abcam)、cGAS(HPA031700，Sigma Aldrich)、组蛋白H3(ab1791，Abcam)、MHC I类/HLA A/HLA B(ab134189，Abcam)和
HLA G(ab52455，Abcam)，将膜在3％无脂乳/TBST中封闭，并用经以1∶1000在3％乳/TBST中
稀释的抗体探测过夜。为了研究IDO1表达(目录号#12006，Cell Signaling Technology)，
将膜在5％BSA/TBST中封闭，并用经以1∶500在5％ BSA/TBST中稀释的抗体探测过夜。对于
上样对照，将膜在3％乳/TBST中封闭，并用经以1∶10,000在3％乳/TBST中稀释的抗β-肌动
蛋白(Sigma Aldrich)或经以1∶2000在3％乳/TBST中稀释的黏着斑蛋白(sc-73614，Santa 
Cruz)探测，之后添加合适的HRP缀合的二抗。然后，使用Luminata Crescendo Western HRP
底物(Millipore，UK)和α成像仪可视化结果并记录。
[0754] 侵入测定
[0755] 为了测试细胞分泌物的侵入特性，从转染有和未转染有敲低物(knockdown)的指定细胞系收集条件化培养基。将细胞在第0天接种和/或处理，在第1天将培养基更换为
Optimem，并在第3天收集。然后，将培养基以800g离心5分钟以除去细胞碎片。使用
聚碳酸酯膜5μm 24孔细胞培养物插入物(Sigma，MO，USA)进行侵
入测定。对PBMC进行计数，并以5×106个细胞/ml的密度重悬于Optimem 0.5％BSA中。将100
μl的细胞悬浮液置于transwell板的顶室中，相当于5×105个细胞。将600μl的条件化培养
基置于底室中，并将测定物孵育16小时。在16小时后，从底室移出100μl培养基，并根据制造商的说明进行 (Promega，PA，USA)测定。侵入细胞的数目由用
测定产生的标准曲线和用countess(Life technologies，Paisley，UK)
计数的细胞样品推导。
[0756] 细胞毒性
[0757] 使用 细胞介导的细胞毒性试剂盒(Life  technologies，Paisley，UK.)来测量淋巴细胞对癌细胞的细胞毒性作用。对RKO亲本细胞和Fanc G细胞进
行胰蛋白酶消化，计数并用绿色荧光膜染剂DiOC18在PBS中以2μl染剂/ml的浓度染色。将细
胞与染剂在37℃下孵育20分钟，之后以每孔1×105个细胞的密度接种到12孔板中并使其黏
附过夜。第二天，对PMBC计数并以指定比例添加到RKO细胞培养物中。对于1∶1的比例，添加1×105个PBMC，对于5∶1的比例，添加5×105个PBMC。将共培养物孵育4小时，之后收集细胞用
于通过流式细胞术进行分析。使用BD FACSCaliburTM(BD Biosciences，CA，USA)分析样品，并使用Flow Jo软件进行数据分析。将细胞用干扰素-γ以20ng/ml的浓度处理16小时。在添
加PBMC之前将细胞用LEAF纯化抗人CD274(克隆29E.2A3)抗体(BioLegend，CA，USA)以100μ
g/ml的浓度处理16小时。
[0758] 小分子抑制剂和化学治疗剂
[0759] 为了分析ATM、ATR和DNAPK对细胞因子表达的作用，将细胞在约60％汇合时接种在6孔板中。在孵育过夜后，添加以下小分子抑制剂：1μm剂量的ATM(Ku60019，Selleck Chem)、
5μm剂量的ATR(ETP46464，Selleck Chem)和5μm剂量的DNAPK(Nu7441，Selleck Chem)。在24小时时，获得RNA和蛋白质样品用于分析。为了分析DNA损伤剂和紫杉醇对细胞因子表达的
作用，将细胞在约60％汇合时接种在6孔板中。在孵育过夜后，添加IC50剂量的顺铂和紫杉
醇(从新鲜药房贮存液获得)以及羟基脲(Sigma Aldrich)24小时至48小时。在合适的时间
点，获得RNA和蛋白质样品用于分析。
[0760] 细胞周期分析
[0761] 对细胞进行胰蛋白酶消化并固定在70％乙醇中，与RNA酶A和碘化丙锭(PI)一起孵育，并使用BD FACSCaliburTM(BD Biosciences，CA，USA)进行分析。使用Flow Jo软件分析数据以进行细胞周期分析。
[0762] 免疫沉淀
[0763] 如在Western印迹部分中那样制备和量化全细胞裂解物。对于免疫沉淀，将500μg蛋白质与2μg TBK1(sc-52957，Santa Cruz Biotechnology)或IRF3(目录号#4302，Cell 
Signaling Technology)一起在4℃下旋转过夜。用RIPA缓冲液预洗涤合适的第二抗小鼠或
抗兔 (Invitrogen)，并将等量添加到样品中。在4℃下旋转2小时后，使用
Dynamag磁性架用RIPA洗涤样品。然后，将样品在NuPAGE  LDS样品缓冲液(Life 
Technologies)和NuPAGE还原剂(Life Technologies)中于95℃下煮沸15分钟。使用梯度
Tris-Bis加聚丙烯酰胺凝胶(Life  Technologies，Thermo Fisher 
Scientific Inc)使等量的还原样品根据大小分离。如前所述，之后进行Western印迹操作。
将膜在室温下在5％BSA/TBST中封闭1小时，并用pTBK1(Ser172)(目录号#5483，Cell 
Signaling Technology)或pIRF3(Ser396)(目录号#4947，Cell Signaling Technology)在
4℃下探测过夜。然后，用合适的HRP缀合的二抗(抗兔IgG，目录号#7074，Cell Signaling 
Technology，针对pTBK1；抗兔轻链特异性IgG，211-032-171，Jackson ImmunoResearch 
Laboratories Inc.，针对pIRF3)探测膜。然后，使用Luminata Crescendo Western HRP底
物(Millipore，UK)和α成像仪使结果可视化并记录。
[0764] 细胞分级
[0765] 使用缓冲液A(10mM Hepes pH7.4；1.5nM MgCl2，10mM NaCl，0.1％NP-40，蛋白酶和磷酸酶抑制剂)和缓冲液C(10mM Hepes pH7.4；1.5nM MgCl2，420mM NaCl，0.1％NP-40，
蛋白酶和磷酸酶抑制剂)来对细胞进行分级。以约70％汇合培养细胞。然后，使用细胞刮刀
将细胞移出在PBS中并转移至Eppendorf。在4℃下以1000rpm离心5分钟后，将细胞沉淀物重
悬于350μl缓冲液A中。将细胞在冰上裂解20分钟，随后将样品在12000rpm下离心2分钟。去
除上清液，并以12000rpm再旋转两次，每次2分钟。小心地移出上清液(细胞质级分)并保存
在-80℃，直到使用读板器根据制造商的说明使用BCA测定(Pierce，Rockford，IL，USA)量
化。将剩余的沉淀物在缓冲液A中洗涤x1，然后以12000rpm离心2分钟。将沉淀物重悬于缓冲
液C中，在冰上裂解10分钟，并以20K循环/秒声处理30秒。然后，将样品以12000rpm离心2分
钟以去除碎片，并将上清液(细胞核级分)储存在-80℃直至如上所述进行量化。
[0766] 免疫共沉淀
[0767] 如上所述制备细胞质级分。将500μg蛋白质与重悬于Pierce IP裂解缓冲液(Thermo Scientific)中的2μg组蛋白H3抗体(ab1791，Abcam)一起在4℃下旋转过夜。用
Pierce IP裂解缓冲液预先洗涤第二抗兔 (Invitrogen)，并将等量添加到样
品中。在4℃下旋转2小时后，使用Dynamag Magnetic Rack用Pierce IP裂解缓冲液洗涤样
品。然后，将样品在NuPAGE LDS样品缓冲液(Life Technologies)和NuPAGE还原剂(Life 
Technologies)中于95℃下煮沸15分钟。将等量的还原样品使用梯度4-12％ Tris-
Bis加聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific Inc)根据大小分
离。如前所述之后进行Western印迹操作。将膜在室温下在5％ BSA/TBST中封闭1小时，并用
cGAS抗体(HPA031700，Sigma Aldrich)在5％BSA/TBST中在4℃下探测过夜。用HRP缀合的二
抗(抗兔IgG，目录号#7074，Cell Signaling Technology)探测膜。然后，使用Luminata 
Crescendo Western HRP底物(Millipore，UK)和α成像仪使结果可视化并记录。
[0768] 结果
[0769] CD4+和CD8+T淋巴细胞与DDRD测定阳性肿瘤相关
[0770] 由于我们已在DDRD肿瘤中观察到干扰素相关基因(包括T细胞特异性配体)的上调，我们研究了这些是否与T细胞免疫应答相关。先前已经将肿瘤内CD4+和CD8+T淋巴细胞
的存在描述为对乳腺癌具有预后性。使用0至3的半定量评分通过IHC评估肿瘤内和基质CD4
+和CD8+T淋巴细胞的存在，其中评分越高代表存在的T淋巴细胞的数目越大。使用DDRD测定
将191名N0-N1ER阳性和ER阴性乳腺癌者的总组群评分为DDRD阳性或阴性的。鉴定出CD4+和
CD8+肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(iTIL)和基质肿瘤浸润淋巴细胞(sTIL)与DDRD阳性的显著
相关性(图9)。这通过在DDRD阳性CD8+(DDRD pos CD8)和DDRD阳性CD4+(DDRD pos CD4)群
体中具有较大IHC评分的肿瘤样品核心的比例增加来证明(p＜0.0001)(图9A)。CD4+和CD8+
T淋巴细胞与DDRD阳性之间的关联通过IHC图像得以确定，其中提高的染色强度指示肿瘤内
iTIL和sTILS的更大存在(图9B)。
[0771] 趋化因子的产生与DNA损伤修复缺陷相关
[0772] CXCL10是DDRD测定中最具有区别性的基因，并且之前已经报道其为乳腺癌的预后1
因子。CCL5(RANTES)被鉴定为DDRD阳性ER阴性肿瘤中差异表达靠前的基因(表48)。大部分
差异表达基因被鉴定为由曲线下面积(AUC)大于0.5指示的干扰素响应性的。这与富含趋化
因子的炎性肿瘤微环境保持一致(图10A)。对差异表达基因的进一步干扰素组分析显示，这
些基因中的53.1％是干扰素驱动的，与I型干扰素具有显著相关性(图10B)。据报道，
CXCL10/CXCR3轴是CD4+和CD8+T淋巴细胞对炎症部位的趋化性的关键2。CXCL10和CCL5过度
表达与黑素瘤、胃癌和结直肠癌中CD8+淋巴细胞的存在相关3-5。因此，我们试图鉴定DNA损
伤修复缺陷型肿瘤中这些关键趋化因子(CXCL10和CCL5)的产生机制。
[0773] 表48-ER阴性DDRD阳性肿瘤中的差异表达基因(FC＞3)
[0774]
[0775]
[0776] 我们接下来研究了DNA损伤响应的丧失是否可以产生观察到的DDRD测定免疫应答。我们在T47D细胞中使用siRNA敲低构建体来抑制BRCA1、BRCA2和FANCD2功能以解决固有
DNA损伤修复缺陷和其中DDRD生物学在趋化因子产生中的作用。CXCL10和CCL5被鉴定为响
应于DNA修复蛋白的损失而显著上调。在T47D细胞中与对照杂乱序列siRNA(AS)相比在抑制
BRCA1(使用BRCA1_a/b siRNA)、BRCA2(使用BRCA2_c/d siRNA)和FANCC(FancC_1/2 siRNA)
之后CXCL10和CCL5的相对表达提高确定DNA损伤诱导趋化因子的表达(图11)。使用同基因
细胞系HCC1937EV(DDRD Pos)和HCC1937+BRCA1(DDRD Neg)以及MDA-436 EV(DDRD Pos)和
MDA-436+BRCA1(DDRD Neg)，我们再次观察到与修复校正细胞系相比在DNA损伤修复缺陷型
细胞中CXCL10和CCL5显著上调。因此，图12A显示，在通过BRCA1的重新表达校正DNA修复缺
陷之后，CXCL10和CCL5二者的相对表达显著降低(图12A)。Western印迹确定，与空载体
(empty vector，EV)配对等同物相比，在校正细胞系模型中BRCA1的蛋白质都表达(图12B)。
为了解决CXCL10和CCL5的上调是否有助于淋巴细胞浸润，我们利用用来自MDA436-EV和+
BRCA1细胞的条件化培养基对活化外周血单个核细胞(PBMC)进行迁移测定(图13A和B)。在
共培养4小时后，我们观察到PBMC向来自DNA损伤修复缺陷型细胞系的条件化培养基的迁移
显著提高加。与DDRD阴性的表达BRCA1的校正细胞系对(DDRD-ve)相比，DDRD阳性的MDA436-
EV(DDRD+ve)在细胞侵袭方面显示出更大的倍数变化(图13C)(p＜0.001)。因此，内源性DNA
损伤修复缺陷导致趋化因子产生和随后的免疫细胞浸润。与DDRD阴性的表达BRCA1的校正
细胞系对(DDRD-ve)相比，DDRD阳性的MDA436-EV(DDRD+ve)在细胞侵袭方面显示出更大的
倍数变化(图13D)(p＜0.001)。此外，siRNA介导的CXCL10和CCL5敲低降低PBMC迁移，表明其
对于淋巴细胞浸润的重要性(p＜0.05；图13E)。
[0777] 趋化因子表达以细胞周期特异性方式进行控制
[0778] 用IC-50剂量的DNA损伤剂顺铂和羟基脲以及微管稳定剂紫杉醇处理HeLa、HCC1937EV和MDA-MB-436EV细胞。如通过与DMSO对照相比提高的相对表达所证明的，在用顺
铂和羟基脲处理后在所有细胞系中均刺激CXCL10和CCL5表达的上调。然而，在任一细胞系
模型中，在紫杉醇处理下CXCL10和CCL5表达均未显著提高(图14)。顺铂和羟基脲的处理导
致在S期细胞比例增加(图14)。然而，另一种抗有丝分裂剂诺考达唑的处理导致在细胞周期
的M期停滞，如通过CXCL10的mRNA表达降低所观察到的(图15A)。M期阻断通过图15所示的细
胞周期谱的变化确定(图15B)。这些数据一起支持用于激活针对DNA损伤的免疫应答的S期
特异性信号。
[0779] 趋化因子表达与DNA损伤感应子ATM、ATR和DNAPK无关
[0780] 激酶共济失调性毛细血管扩张突变(ATM)、ATM和RAD3相关(ATR)和DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)响应于DNA损伤而被激活。之前已报道，ATM的激活导致免疫基因
的上调，表明ATM可能是响应于DNA损伤修复缺陷的趋化因子产生所必需的6。我们用ATM
(Ku60019)、ATR(ETP-46464)和DNAPK(Nu7440)的小分子抑制剂处理DDRD阳性细胞(MDA-MB-
436EV)。与DMSO对照相比，在用ATM抑制剂(ATMi)、ATR抑制剂(ATRi)或DNAPK抑制剂
(DNAPKi)处理后鉴定到CXCL10和CCL5趋化因子产生未显著降低(图16)。然而，与DMSO对照
相比，DNAPK的抑制(DNAPKi)显著提高CXCL10和CCL5趋化因子表达水平(图16)。这些数据一
起表明这些DNA损伤响应激酶不是干扰素对内源DNA损伤修复缺陷的响应所必需的。
[0781] STING/TBK1/IRF3途径在DDRD肿癌细胞中具有组成型活性
[0782] 接下来，我们进行了转录因子分析以鉴定可以激活DDRD肿瘤中上调的基因的那些。IRF(干扰素调节因子)基因靶标在此列表中显著富集。此外，先天性免疫途径STING/
TBK1/IRF3的刺激(图17A)已被报道为CXCL10表达的驱动因子7。IRF3被认为响应于DNA损伤
剂而具有活性8，因此我们假设IRF3将在DDRD阳性细胞中具有活性。支持这一点，我们观察
到：与其BRCA1校正同基因细胞系(MDA-436+BRCA1和HCC1937+BRCA1)相比，来自BRCA1缺陷
型细胞MDA-436EV和HCC1937EV的全细胞裂解物的IRF3磷酸化(pIRF3)增强(图17B)。类似
地，与经修复校正的DDRD阴性细胞系(BRCA1)相比，在修复缺陷型细胞(EV)中观察到TBK1组
成型磷酸化(图17B)。使用siRNA介导的敲低，我们抑制了MDA-436和HCC1937细胞中STING
(Sting_a/b)、TBK1(TBK1_a/b)和IRF3(IRF3_a/b)的功能。与对照(AS)相比，STING、TBK1和
IRF3的敲低显著降低CXCL10和CCL5二者的相对表达(图17C)。
[0783] 这些数据表明针对DNA损伤响应缺陷的免疫应答需要STING、TBK1和IRF3。
[0784] 内源性或外源性DNA损伤导致胞质DNA增加
[0785] 胞质DNA感应子cGAS已被描述为STING途径的最有效激活物。因此，我们研究了胞质DNA是否与观察到的针对S期特异性DNA损伤的免疫应答相关9。使用免疫共沉淀(co-IP)，
我们在DDRD阳性细胞MDA-436EV和HCC1937的胞质级分中鉴定到cGAS为与组蛋白H3结合(图
18A，上面的印迹图)。双链DNA与cGAS的结合导致通过cGAMP激活STING和免疫基因表达。另
外，在用顺铂(Cisp)或羟基脲(HU)处理的HeLa细胞中，co-IP显示cGAS也与组蛋白H3结合。
在经DMSO处理的对照中未观察到cGAS与组蛋白H3的结合(图18B，上面的印迹图)。在MDA-
436和HCC1937细胞中使用siRNA介导的敲低构建体(cGAS_a/b)清除cGAS功能导致在内源性
DDRD的情况下并且响应于DNA损伤剂CXCL10和CCL5趋化因子相对表达水平显著降低(图
18C)。因此，cGAS是响应于DNA损伤从肿瘤细胞表达趋化因子所必需的。
[0786] 胞质DNA响应于内源性和外源性DNA损伤而存在
[0787] 我们探测了DDRD阳性细胞MDA-436-EV和+BRCA1以及HCC1937-EV和+BRCA1细胞的胞质级分的组蛋白H3的存在，并且发现组蛋白H3蛋白表达在修复缺陷型细胞系(EV)中提高
(图19A，上面的印迹图)。我们还确定，与DMSO对照处理相比，在用顺铂(Cisp)和羟基脲(HU)处理的HeLa细胞中响应于DNA损伤提高组蛋白H3蛋白水平(图19B，上面的印迹图)。使用
PicoGreen荧光染色来检测双链DNA(ds-DNA)。当通过共焦显微术检查时，经IC50剂量的DNA
损伤剂顺铂(HeLa+顺铂IC50)和羟基脲(HeLa+羟基脲IC50)处理的HeLa细胞显示胞质DNA增
加。然而，未观察到响应于用紫杉醇处理(HeLa+紫杉醇IC50)胞质DNA增加(图19C)。
[0788] DDRD阳性肿瘤与PDL1的表达相关
[0789] DDRD阳性肿瘤中化学引诱物的上调和随后淋巴细胞浸润的明显矛盾潜在地通过免疫检查点靶标PDL1的上调来解释。已知该靶标导致淋巴细胞耗竭并且有效地关闭对癌细
胞的免疫细胞毒性响应。使用针对PDL1的Roche SP142抗体，我们对之前针对CD4+和CD8+T
淋巴细胞浸润的乳腺肿瘤的原始组群进行了IHC分析。先前报道的＞1％和＞5％的截止值
用于在浸润性肿瘤免疫细胞和肿瘤细胞PDL1表达两方面限定PDL1阳性10(图20)。在分别由
在＞1％和＞5％下对DDRD(DDRD pos)和PDL1(PDL1 pos)二者都呈阳性的肿瘤群体的
46.2％和21.5％阳性展示的DDRD阳性肿瘤中鉴定到PDL1表达在两个预定截止值下显著关
联(p＜0.0001，p＝0.0004)(图20A，肿瘤)。另外，浸润性免疫细胞PDL1阳性还与DDRD阳性相关，如分别在＞1％和＞5％下淋巴细胞的75.4％和40％阳性所证明的(p＜0.0001)(图20A，
淋巴细胞)。免疫组织化学染色证实肿瘤内的强PDL1表达，其中在淋巴细胞浸润下具有另外
的PDL1表达，如通过染色模式和强度所示的(图20B)。总之，肿瘤细胞PDL1阳性和浸润性免
疫细胞PDL1表达与DDRD阳性显著相关(图20)。
[0790] 另外，基于肿瘤的DDRD评分分析肿瘤，所述DDRD评分基于限定在基因标签中的截止值将每个肿瘤样品分配至DDRD阳性或DDRD阴性亚组。使用预定＞1％和＞5％截止值基于
聚集体肿瘤和淋巴细胞染色的PDL1阳性组群(PDL1pos)的DDRD评分显示出比PDL1阴性组群
(PDL1neg)显著更高的DDRD评分(p＜0.001)(图21)。该数据表明PDL1蛋白表达与阳性DDRD
测定结果相关，并且同样地PDL1阳性肿瘤具有活性DDRD信号传导。
[0791] DNA损伤修复缺陷型细胞系响应于与PBMC共培养而被启动以表达PDL1
[0792] 将MDA-436EV和MDA-436+BRCA1细胞(经修复校正)与活化的PBMC共培养。在共培养物中，在修复缺陷型细胞(436EV+Act)(p＝0.0001)和经BRCA1修复校正MDA-436细胞
(436BRCA1+Act)(p＝0.0359)中PDL1相对表达水平均显著上调。此外，与DDRD阴性细胞
(436BRCA1+Act)相比，在共培养的DDRD阳性细胞模型(436EV+Act)中提高的PDL1表达水平
更加增强(p＝0.0033)(图22)。因此，通过与淋巴细胞共培养提高PDL1表达，尤其是在DDRD
阳性模型中。
[0793] DNA损伤诱导PDL1的表达
[0794] 通过Q-PCR分析，用DNA损伤性顺铂(Cisp)或羟基脲(HU)而不是紫杉醇处理的HHC1937EV、MDA-MB436EV和HeLa细胞的处理诱导CD274(PDL1)的表达(图23A)。这一效果通
过western印迹分析在蛋白质水平得到确定(图23B)。
[0795] 另一些潜在免疫检查点靶标响应于DNA损伤而被激活
[0796] 为了确定另一些潜在免疫检查点靶标的参与，我们检查了MDA-436和HCC1937同基因细胞系对中替选免疫检查点靶标IDO1的蛋白质表达。相应地，DDRD阳性细胞(MDA-436EV
和HCC1937EV)证明与经校正DDRD阴性同基因对(MDA-436+BRCA1和HCC1937+BRCA1)相比
IDO1蛋白水平提高(图24，上面的印迹图)。此外，在与淋巴细胞的共培养物中，在修复缺陷
型细胞(436EV+Act)(p＝0.0002)和经BRCA1修复校正MDA-436细胞(436BRCA1+Act)(p＝
0.0660)中，IDO1相对表达水平均显著上调。此外，与DDRD阴性细胞(436BRCA1+Act)(p＝
0.0013)相比，在共培养的DDRD阳性细胞模型(436EV+Act)中提高的IDO1表达水平增加增强
(图25)。因此，与PDL1类似，与淋巴细胞的共培养也提高IDO1表达，尤其是在DDRD阳性模型
中。
[0797] DDRD+细胞被提供针对淋巴细胞介导的细胞毒性的保护
[0798] 将PBMC与RKO亲本和RKO FANCG-/-共培养4小时，并用5-(6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记以标记癌细胞，与7-AAD组合以标记死亡的癌细胞和PBMC。与RKO亲
本细胞(亲本1∶1和亲本5∶1)相比，RKO FANCG-/-在两种比率(FANCG-/-1∶1和FANCG-/-5∶1)下显示降低的淋巴细胞介导的毒性，如通过较低的细胞毒性百分比显示的。这种毒性降低
与这些细胞中PDL1的表达一致。显然，DDRD阳性细胞显示出针对淋巴细胞介导的毒性的保
护(图26)。此外，用干扰素-γ预处理癌细胞(Fanc G IFN 5∶1)扩大RKO FANCG-/-与RKO亲
本细胞之间的差异细胞毒性(p值＜0.05)(图27A)。另外，如由RKO Par IFN、RKO Fanc C 
IFN和RKO Fanc G IFN的倍数变化的差异所表明的，用干扰素-γ处理RKO细胞显著提高
PDL1基因表达水平(图27B)。通过western印迹在蛋白质水平确定在干扰素-γ预处理后提
高的PDL1水平(RKO Par IFN和RKO Fanc G IFN)(图27C，上图)。总之，这些数据表明，DDRD
阳性细胞显著过表达PDL1，其保护DDRD阳性细胞免于淋巴细胞介导的细胞死亡。
[0799] PDL1功能的阻断逆转DDRD对淋巴细胞介导的细胞毒性的抗性
[0800] 为了进一步评估针对抗淋巴细胞介导的毒性的保护特性，引入PDL1阻断抗体以抑制PDL1功能。在使用PMBC进行细胞毒性测定之前用与PDL1阻断抗体组合的干扰素-γ来预
处理RKO亲本细胞和RKO FANCG-/-细胞在DDRD阳性RKO FANCG-/-中产生显著更高的细胞毒
性。这通过以下得到证明：与仅干扰素-γ的Fanc G(Fanc G IFN 5∶1)相比，经干扰素-γ和PDL1抗体二者处理的Fanc G(Fanc G IFN 5∶1+PDL1AB)的百分比细胞毒性提高(p＜0.01)
(图28)。值得注意的是，在经IFN处理的亲本RKO(Par IFN 5∶1)与经IFN和PDL1抗体组合处
理的亲本RKO(Par IFN5∶1+PDL1AB)之间未观察到细胞毒性的显著差异(图28)。
[0801] DDRD亚型在多种适应证中具有多个免疫检查点靶标的上调
[0802] 为了评估另一些免疫检查点靶标是否上调并且由此保护DDRD阳性肿瘤免于免疫介导的细胞毒性，我们进行了以下两个乳腺癌数据集11的差异基因表达分析：公共可获得的
结直肠癌数据集12和黑素瘤数据集13。在每种情况下，利用使用从乳腺癌发现组群鉴定的
DDRD基因的分层聚类来限定类别标记。与DDRD阴性肿瘤相比，包括PDL1、IDO1、LAG3、HAVCR2和CTLA4在内的多种另外免疫检查点靶标在DDRD阳性肿瘤中上调(表49)。这些免疫检查点
基因中的多种具有针对其鉴定的治疗靶标。
[0803] 表49-DDRD阳性肿瘤的多个免疫检查点靶标的表达提高
[0804]
[0805] DDRD生物学在微卫星不稳定性(Microsatellite Instable，MSI)结直肠癌中显著富集
[0806] 迄今为止，针对PDL1抑制的响应的唯一已知遗传分层是微卫星不稳定性(MSI)14，其由DNA错配修复(DNA mismatch repair，MMR)受损引起。我们假设：DDRD生物学将代表MSI
癌症，并且可以用作改进的分层工具。我们使用由乳腺癌分析推导的固有DDRD生物学对公
开基因表达数据集进行半监督聚类(Mayo临床数据，Marisa数据集)。该过程鉴定了一组具
有DDRD生物学活化的结直肠样品，并且在MSI肿瘤中高度富集(图29A，概述在框内)。在该鉴
定的组中，特别地80％的MSI肿瘤存在于DDRD阳性组中，如具有缺陷型MMR(dMMR)的病例的
百分比所示(图29B)。单独地，分析我们先前进行谱绘制的II期结直肠癌样品的组群15表明，具有已知MSI状态的样品(MSI-H)具有显著高于微卫星稳定性(MSS)样品的DDRD评分(p＞
0.05)(图29C)。
[0807] 我们目前的模型，内在或外在DNA损伤导致胞质DNA的积累，这导致先天性免疫STING介导的途径的激活，其负责趋化因子产生，从而在DNA损伤修复缺陷型乳腺肿瘤中产
生炎性微环境。PD-L1的表达也与DNA损伤修复缺陷型肿瘤相关，并且阻止T细胞介导的细胞
毒性(图30)。
[0808] 讨论
[0809] DDRD分子亚型代表已丧失FA/BRCA途径(针对DNA损伤的主要响应机制)的功能并且使DNA复制停滞在细胞周期的S期的肿瘤。我们的新数据表明，在不存在功能性FA/BRCA途
径下或由于外源性S期DNA损伤，存在胞质DNA的积累激活STING/TBK1/IRF3先天性免疫应答
的机制。
[0810] 以前的研究已表明，基因组不稳定性可以通过产生新抗原来激活免疫信号传导3。我们的模型提出胞质DNA作为响应于细胞周期S期的DNA损伤的重要免疫刺激因子。这种免
疫信号来自细胞的上皮组分，并且不需要免疫识别异常蛋白。虽然尚不清楚S期DNA损伤为
什么应产生胞质DNA，但是我们推测这可能是复制叉处理的副产物。事实上，有一些证据表
明，细胞可以主动从细胞核中输出DNA片段，可能是为了防止错误引入到基因组DNA中16。在
正常情况下，胞质DNA由细胞质DNA酶II处理，然而可能的是，这种机制由于不能对内源性
DNA损伤作出响应或在外源性DNA损伤之后被压制，从而触发cGAS介导的先天性免疫应答。
事实上，已在系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythramatosis，SLE)疾病中观察到类似
的响应于胞质DNA的异常积累的STING途径激活17。
[0811] 我们的DDRD基因测定包含2个代表治疗靶标的免疫检查点基因：PD-L1和IDO1。PD1/PD-L1轴的抑制已在患有晚期实体瘤(包括黑素瘤和非小细胞肺癌)的患者的亚组中产
[18]
生显著反应 。重要的是，我们DDRD阳性肿瘤与PD-L1表达相关的观察结果提供了在该分
子亚群中探索免疫检查点治疗的基本原理。使用分离的淋巴细胞，我们已经证明阻断PD-L1
导致在DDRD阳性肿瘤中淋巴细胞介导的毒性的显著提高。
[0812] 进一步支持这种方法的是关于PD-L1抑制剂在错配修复缺陷型结直肠癌中的活性的最近报道(REF ASCO)。已报道，错配修复蛋白在针对S期复制叉停滞的反应中起作用19，我们的研究表明这应激活STING/TBK/IRF3途径并上调PD-L1表达。重要的是，我们已经证明
DDRD测定对于检测结直肠MSI肿瘤是灵敏的。
[0813] 免疫信号的S期特异性性质也提出了围绕与免疫检查点抑制剂联合治疗的潜在重要问题。有趣的是，已经报道使用合成的环状二核苷酸分子直接激活STING途径增强针对
PD1抗体的响应，这与我们的数据保持一致20。另一个逻辑组合可以是S期特异性DNA损伤剂
例如顺铂与PD-L1抑制剂。然而，抗微管剂可以通过使细胞周期停滞在分裂期来拮抗PD-L1
抑制剂，从而阻止STING介导的免疫应答。另外，我们还预期这些效应不是PD-L1特异性的，
因为我们已经证实DDRD阳性肿瘤中多个另外免疫检查点靶标的活化。
[0814] 总之，我们已经确定了DNA修复缺陷型乳腺肿瘤中的免疫应答机制。先天性免疫STING介导途径的激活负责响应于体外DNA损伤的趋化因子产生，在DNA损伤修复缺陷型乳
腺肿瘤中产生炎性微环境。PD-L1的表达与DNA损伤修复缺陷型肿瘤相关，并且我们提供了
研究免疫治疗在内源性或外源性S期DNA损伤情况下的作用的基本原理。
[0815] 参考文献
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[0836] 实施例5
[0837] 对44基因标签进行递归特征消除以限定包含一种基因至多43种基因的标签的亚组。
[0838] 样品
[0839] 包括107个具有已知DDRD状态的样品的DDRD训练集用于该分析。
[0840] 方法
[0841] 使用长度为44的DDRD标签作为该分析的起点，其中44种基因的绝对权重被认为是用于对单独基因进行排名的手段。从标签中除去排名最低的基因，即具有最低绝对权重的
基因，并针对DDRD类别标记用43基因表达数据使用偏最小二乘法(PLS)回归重新训练模型
参数。如前所述，使用43基因标签的加权参数来使标签减少一种基因，并且重复该过程直到
只剩下一种基因。使用留一交叉验证来对所评价的每个标签长度计算性能评估。使用接受
者操作特征曲线(AUC)下面积来测量标签的性能，其评估标签在考虑的每个特征长度下区
分DDRD阳性样品与DDRD阴性样品的能力。表3至45中提供了每个子标签的详细信息。
[0842] 结果
[0843] 表50示出了使用最少1种基因至多43种基因来预测亚型的AUC性能(关于子标签的详细信息，参见表3至45)。在最少一种基因时，AUC性能显著大于0.5，因此用最少一种基因
可以比随机显著更佳地预测DDRD分子亚组。
[0844] 表50-使用1至43种基因的子标签预测亚型的AUC性能
[0845]
[0846]
[0847] 实施例6
[0848] 在用免疫检查点调节剂和/或DNA损伤剂治疗的黑素瘤患者的组群中DDRD测定的计算机验证
[0849] 方法
[0850] 本研究分析了来自474例皮肤黑素瘤患者的TCGA组群的RNAseq基因表达数据。从TCGA数据入口下载3级归一化基因表达数据，并将数据矩阵减少到只包括DDRD基因。为了去
除数据矩阵中的零计数，向所有基因表达值添加0.01的恒定值，并且对所得数据矩阵进行
对数转换(使用自然对数)。
[0851] 生成DDRD测定评分(如Mulligan等，2014中所述)，并进行二分，使得75％的样品(具有最高DDRD评分)被分类为DDRD阳性的，25％的样品(具有最低DDRD评分)被分类为DDRD
阴性的。
[0852] 随后，基于其DDRD分类分析已经接受基于免疫的治疗(免疫检查点调节剂，例如伊匹单抗或派姆单抗)和/或DNA损伤剂的患者的存活结果差异。Kaplan Meier图用于可视化
DDRD阳性与DDRD阴性的存活概率差异，并且使用对数秩检验来评估存活曲线是否显著不
同。还计算了DDRD测定的风险比，以估计与DDRD阴性组相比在DDRD阳性组中发生的事件的
相对风险。用于该分析的终点是局部复发时间、远距复发时间、死亡时间(总体存活)。
[0853] 结果
[0854] 图31、32和33分别是针对以下根据DDRD状态举例说明存活概率差异的Kaplan Meier存活图：局部复发时间(图31)、远距复发时间(图32)和总体存活时间(图33)。每个终
点的所得分析结果表明，在用基于免疫的治疗(免疫检查点调节剂，例如伊匹单抗或派姆单
抗)和/或DNA损伤剂治疗的组群中，与DDRD阴性组患者相比，DDRD阳性组的患者在治疗后具
有显著更低的事件发生风险：
[0855] ●局部复发时间；HR＝0.39[95％CI：0.18-0.84]，p＝0.0008
[0856] ●远距复发时间：HR＝0.44[95％CI：0.19-0.99]，p＝0.0095
[0857] ●总体存活时间；HR＝0.31[95％CI：0.12-0.81]，p＝0.0006
[0858] 总结
[0859] 该数据表明，DDRD测定鉴定了一组在用已被许可用于黑素瘤的基于免疫的治疗(免疫检查点调节剂，例如伊匹单抗或派姆单抗)和/或DNA损伤剂治疗之后存活显著改善的
黑素瘤患者。
[0860] 参考文献
[0861] Mulligan JM，Hill LA，Deharo S，et al.Identification and validation of an anthracycline/cyclophosphamide-based chemotherapy response assay in breast 
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