针对受体的双重可变结构域免疫球蛋白
阅读：489发布：2021-09-08
专利汇可以提供针对受体的双重可变结构域免疫球蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的经工程改造的多价的和多特异性的双重可变结构域结合蛋白、以及制备方法和在 疾病 的 预防 、诊断和/或 治疗 中的用途。，下面是针对受体的双重可变结构域免疫球蛋白专利的具体信息内容。
1.包含第一和第二多肽链的结合蛋白，所述多肽链各自独立地包含VD1-(X1)
n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一可变结构域；
VD2是第二可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头，前提条件是，它不是CH1；
X2是Fc区；
n是0或1，
其中在所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性靶结合位点，且在所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性靶结合位点，且其中：
（a）所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
3个来自SEQ ID NO: 30的CDR和3个来自SEQ ID NO: 31的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 32的CDR和3个来自SEQ ID NO: 33的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 34的CDR和3个来自SEQ ID NO: 35的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 36的CDR和3个来自SEQ ID NO: 37的CDR，
（b）所述结合蛋白能够结合RON和RON，其中：
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
3个来自SEQ ID NO: 54的CDR和3个来自SEQ ID NO: 55的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 56的CDR和3个来自SEQ ID NO: 57的CDR，
（c）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和IGF-1R，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
3个来自SEQ ID NO: 48的CDR和3个来自SEQ ID NO: 49的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 50的CDR和3个来自SEQ ID NO: 51的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 52的CDR和3个来自SEQ ID NO: 53的CDR，
（d）所述结合蛋白能够结合Erb-B3和Erb-B3，其中：
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
3个来自SEQ ID NO: 38的CDR和3个来自SEQ ID NO: 39的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 40的CDR和3个来自SEQ ID NO: 41的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 42的CDR和3个来自SEQ ID NO: 43的CDR，
（e）所述结合蛋白能够结合EGFR和HER2，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 30的CDR和3个来自SEQ ID NO: 31的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 32的CDR和3个来自SEQ ID NO: 33的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 34的CDR和3个来自SEQ ID NO: 35的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 36的CDR和3个来自SEQ ID NO: 37的CDR，且
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 44的CDR和3个来自SEQ ID NO: 45的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 46的CDR和3个来自SEQ ID NO: 47的CDR，
（f）所述结合蛋白能够结合EGFR和IGF-1R，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 30的CDR和3个来自SEQ ID NO: 31的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 32的CDR和3个来自SEQ ID NO: 33的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 34的CDR和3个来自SEQ ID NO: 35的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 36的CDR和3个来自SEQ ID NO: 37的CDR，且
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 48的CDR和3个来自SEQ ID NO: 49的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 50的CDR和3个来自SEQ ID NO: 51的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 52的CDR和3个来自SEQ ID NO: 53的CDR，
（g）所述结合蛋白能够结合EGFR和Erb-B3，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 30的CDR和3个来自SEQ ID NO: 31的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 32的CDR和3个来自SEQ ID NO: 33的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 34的CDR和3个来自SEQ ID NO: 35的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 36的CDR和3个来自SEQ ID NO: 37的CDR，且
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 38的CDR和3个来自SEQ ID NO: 39的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 40的CDR和3个来自SEQ ID NO: 41的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 42的CDR和3个来自SEQ ID NO: 43的CDR，
（h）所述结合蛋白能够结合EGFR和RON，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 30的CDR和3个来自SEQ ID NO: 31的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 32的CDR和3个来自SEQ ID NO: 33的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 34的CDR和3个来自SEQ ID NO: 35的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 36的CDR和3个来自SEQ ID NO: 37的CDR，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 54的CDR和3个来自SEQ ID NO: 55的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 56的CDR和3个来自SEQ ID NO: 57的CDR，
（i）所述结合蛋白能够结合HER2和RON，其中：
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 44的CDR和3个来自SEQ ID NO: 45的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 46的CDR和3个来自SEQ ID NO: 47的CDR，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 54的CDR和3个来自SEQ ID NO: 55的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 56的CDR和3个来自SEQ ID NO: 57的CDR，
（j）所述结合蛋白能够结合Erb-B3和RON，其中：
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 38的CDR和3个来自SEQ ID NO: 39的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 40的CDR和3个来自SEQ ID NO: 41的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 42的CDR和3个来自SEQ ID NO: 43的CDR，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 54的CDR和3个来自SEQ ID NO: 55的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 56的CDR和3个来自SEQ ID NO: 57的CDR，
（k）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和RON，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 48的CDR和3个来自SEQ ID NO: 49的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 50的CDR和3个来自SEQ ID NO: 51的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 52的CDR和3个来自SEQ ID NO: 53的CDR，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 54的CDR和3个来自SEQ ID NO: 55的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 56的CDR和3个来自SEQ ID NO: 57的CDR，
（l）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和Erb-B3，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 48的CDR和3个来自SEQ ID NO: 49的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 50的CDR和3个来自SEQ ID NO: 51的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 52的CDR和3个来自SEQ ID NO: 53的CDR，且
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 38的CDR和3个来自SEQ ID NO: 39的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 40的CDR和3个来自SEQ ID NO: 41的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 42的CDR和3个来自SEQ ID NO: 43的CDR，
（m）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和HER2，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 48的CDR和3个来自SEQ ID NO: 49的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 50的CDR和3个来自SEQ ID NO: 51的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 52的CDR和3个来自SEQ ID NO: 53的CDR，且
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 44的CDR和3个来自SEQ ID NO: 45的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 46的CDR和3个来自SEQ ID NO: 47的CDR，
或者
（n）所述结合蛋白能够结合Erb-B3和HER2，其中：
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 38的CDR和3个来自SEQ ID NO: 39的CDR；
3个来自SEQ ID NO: 40的CDR和3个来自SEQ ID NO: 41的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 42的CDR和3个来自SEQ ID NO: 43的CDR，且
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
3个来自SEQ ID NO: 44的CDR和3个来自SEQ ID NO: 45的CDR；或者
3个来自SEQ ID NO: 46的CDR和3个来自SEQ ID NO: 47的CDR。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含2个第一和2个第二多肽链，所述多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一可变结构域；
VD2是第二可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头，前提条件是，它不是CH1；
X2是Fc区；
n是0或1，
其中在所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性靶结合位点，且在所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性靶结合位点，共计4个功能性靶结合位点。
3.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一重链可变结构域；
VD2是第二重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是第一接头，前提条件是，它不是CH1；
X2是Fc区；
n是0或1；且
其中所述第二多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一轻链可变结构域；
VD2是第二轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是第二接头，前提条件是，它不是CH1；
X2不包含Fc区；
n是0或1，
其中在所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性靶结合位点，且在所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性靶结合位点。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的结合蛋白，其中
（a）X1是SEQ ID NO 1-27中的任一个，
（b）X1不是CL，
（c）(X1)n是(X1)0和/或(X2)n是(X2)0，
（d）所述结合蛋白包含2个第一多肽链和2个第二多肽链，
（e）所述Fc区是变体序列Fc区，
（f）所述Fc区是得自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区，和/或（g）所述结合蛋白是结晶的结合蛋白。
5.结合蛋白缀合物，其包含根据权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白，所述结合蛋白缀合物还包含试剂，其中所述试剂是免疫粘附分子分子、成像剂、治疗剂或细胞毒性剂，
任选地，其中所述成像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性
3 14 35 90 99 111 125 131 177 166
标记或生物素，任选地，其中所述放射性标记是 H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho
153
或 Sm，或者
任选地，其中所述治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类抗生素、毒素或细胞凋亡剂。
6.分离的核酸，其编码根据权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白。
7.载体，其包含根据权利要求6所述的分离的核酸，任选地，其中所述载体是pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6、pHybE、TOPO或pBJ。
8.宿主细胞，其包含根据权利要求7所述的载体，任选地，其中所述宿主细胞是原核细胞、大肠杆菌、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、Sf9细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、CHO细胞或COS细胞。
9.生产结合蛋白的方法，所述方法包括：在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养根据权利要求8所述的宿主细胞。
10.药物组合物，其包含权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种额外的治疗剂，
其中所述额外的治疗剂任选地是成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、抗-细胞因子抗体或其功能片段、甲氨蝶呤、环孢素、雷帕霉素、FK506、可检测标记或报告分子、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉弛缓剂、麻醉药、非类固醇消炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、刺激剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
12.根据权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗对象的疾病或障碍，其中通过将所述结合蛋白施用给所述对象从而实现治疗，任选地，其中所述障碍是类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎病、格雷夫斯氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、施密特氏综合征、成人（急性）呼吸窘迫综合征、脱发、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、赖特尔病、银屑病性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见变异型免疫缺陷(常见变异型低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、斯耶格伦病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎（传统自身免疫性或狼疮样肝炎）、2型自身免疫性肝炎（抗LKM抗体肝炎）、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型银屑病、2型银屑病、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化（所有亚型）、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、肺出血肾炎综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、斯蒂尔病、全身性硬皮病、舍格伦综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退（桥本病）、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁淤积、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌（GBS）感染、精神障碍（例如抑郁症和精神分裂症）、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性疼痛（不同形式的疼痛）、和癌症（诸如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌）和造血恶性肿瘤（白血病和淋巴瘤）、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓细胞样白血病（AML）、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和外周性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动（持续性或阵发性）、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植（BMT）排斥、束支传导阻滞、伯基特淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏性眩晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病（CML）、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、弗里德赖希共济失调症、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、桥本甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性阿狄森氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流感、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性（Mencel Dejerine-Thomas Shy-Drager和Machado-Joseph）、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰腺癌、副癌综合征/恶性肿瘤的高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征（多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合征）、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、雷诺现象和疾病、Raynoud氏病、植烷酸贮积症、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-KorsaKoff综合征、肝豆状核变性、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人斯蒂尔病、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征（ALPS）、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征（cis）、儿童期发病性精神病、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合征（GBS）、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、库斯毛尔病或Kussmaul-Meier病、兰德里瘫痪、Langerhan 氏细胞组织细胞增生症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、外周动脉闭塞性疾病（PAOD）、外周血管疾病（PVD）、外周动脉疾病（PAD）、静脉炎、结节性多动脉炎（或结节性动脉外膜炎）、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、泵后综合征、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌和造血恶性肿瘤（白血病和淋巴瘤）、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho（滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎）、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征（SJS）、全身炎症反应综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS（肿瘤坏死因子受体，I型变态反应、II型糖尿病、普通型间质性肺炎（UIP）、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、伏格特-小柳-原田三氏综合征（VKH综合征）、湿黄斑变性或伤口愈合。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述药物被配制用于胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内或透皮施用。
14.通过免疫测定法确定试验样品中的至少一种靶标或其片段的存在、量或浓度的体外方法，
其中所述免疫测定法包括：使所述试验样品接触至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记物，
其中所述至少一种结合蛋白包含根据权利要求1-4中任一项所述的结合蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括：
（i）使所述试验样品与所述至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白与在所述靶标或其片段上的表位结合，从而形成第一复合物；
（ii）使所述复合物与所述至少一种可检测标记物接触，其中所述可检测标记物与所述结合蛋白结合，或者与在所述靶标或其片段上的未被所述结合蛋白结合的表位结合，以形成第二复合物；和
（iii）基于在所述第二复合物中的可检测标记物生成的信号，检测试验样品中的所述靶标或其片段的存在、量或浓度，其中所述靶标或其片段的存在、量或浓度与所述可检测标记物生成的信号直接相关。
16.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括：
（i）使所述试验样品与所述至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白与在所述靶标或其片段上的表位结合，从而形成第一复合物；
（ii）使所述复合物与所述至少一种可检测标记物接触，其中所述可检测标记物与所述靶标或其片段竞争结合所述结合蛋白，从而形成第二复合物；和
（iii）基于在所述第二复合物中的可检测标记物生成的信号，检测所述试验样品中的所述靶标或其片段的存在、量或浓度，其中所述靶标或其片段的存在、量或浓度与所述可检测标记物生成的信号间接相关。
17.根据权利要求14-16中的任一项所述的方法，其中所述试验样品是来自患者，且所述方法
（a）另外包括诊断、预后、或评估所述患者的治疗性/预防性处理的有效性，并且其中如果所述方法另外包括评估所述患者的治疗性/预防性处理的有效性，那么所述方法任选地另外包括：根据需要调整所述患者的治疗性/预防性处理以提高有效性，（b）适合用于自动化系统或半自动化系统中，和/或
（c）确定所述样品中超过一种靶标的存在、量或浓度。
18.用于针对靶标或其片段的存在、量或浓度来测定体外试验样品的试剂盒，所述试剂盒包括：（a）关于测定所述试验样品的靶标或其片段的说明书，和（b）至少一种结合蛋白，其包含权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白。
19.根据权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白，其中
（a）所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31；
SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；或者
SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37，
（b）所述结合蛋白能够结合RON和RON，其中：
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；或者
SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57，
（c）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和IGF-1R，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；或者
SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，
（d）所述结合蛋白能够结合Erb-B3和Erb-B3，其中：
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域独立地包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39；
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；或者
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，
（e）所述结合蛋白能够结合EGFR和HER2，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31；
SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；或者
SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37，且
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45；或者
SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47，
（f）所述结合蛋白能够结合EGFR和IGF-1R，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31；
SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；或者
SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37，且
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；或者
SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，
（g）所述结合蛋白能够结合EGFR和Erb-B3，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31；
SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；或者
SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37，且
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39；
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；或者
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，
（h）所述结合蛋白能够结合EGFR和RON，其中：
形成EGFR的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31；
SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；或者
SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；或者
SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57，
（i）所述结合蛋白能够结合HER2和RON，其中：
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45；或者
SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；或者
SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57，
（j）所述结合蛋白能够结合Erb-B3和RON，其中：
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39；
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；或者
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；或者
SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57，
（k）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和RON，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；或者
SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，且
形成RON的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；或者
SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57，
（l）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和Erb-B3，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；或者
SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，且
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39；
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；或者
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，
（m）所述结合蛋白能够结合IGF-1R和HER2，其中：
形成IGF-1R的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；或者
SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，且
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45；或者
SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47，
或者
（n）所述结合蛋白能够结合Erb-B3和HER2，其中：
形成Erb-B3的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39；
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41；或者
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，且
形成HER2的功能性靶结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45；或者
SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47。
20.根据权利要求1-4中的任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包
含 DVD2206-DVD2219、DVD2226-DVD2231、DVD2238-DVD2249、DVD2266-DVD2311、DVD2314-DVD2343或DVD2346-DVD2349中的任一个。
针对受体的双重可变结构域免疫球蛋白
技术领域
[0001] 本申请要求2011年12月30日提交的美国临时申请号61/581,963的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
[0003] 经工程改造的蛋白诸如能够结合2种或更多种抗原的多特异性结合蛋白是本领域已知的。使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术，可以产生此种多特异性结合蛋白。存在本领域已知的多种多特异性结合蛋白结构，且许多结构和方法具有独特的缺点。
[0004] 已使用四源杂交瘤（quadroma）技术生产了双特异性抗体。但是，利用该技术时错配副产物的存在和显著降低的生产收率意味着需要复杂的纯化规程。通过2个不同mAb的化学缀合也可以生产双特异性抗体。但是，该方案不会产生均质制剂。
[0005] 以前使用的其它方案包括：用杂双功能交联剂偶联2个亲本抗体，生产串联的单链Fv分子、双体、双特异性的双体、单链双体和二-双体。但是，这些方案中的每一个都具有缺点。另外，已经描述了多价抗体构建体，其包含在IgG的重链中的2个Fab重复且能够结合4个抗原分子（参见PCT公开号WO 0177342和Miller等人(2003) J. Immunol. 170(9):4854-61）。
[0006] 配体-受体系统已经共进化以维持特异性。它们的相互作用会活化特定信号传递以实现特定生物活性。但是，非-配体-受体结合蛋白诸如单-特异性抗体、双-或多-特异性的结合蛋白、非竞争性抗体组合或针对受体的细胞外结构域（ECD）的其它受体结合蛋白可以识别与受体配体-结合部位不同的表位。与受体的ECD上的这样的一个或多个不同表位的结合，可以将构象变化转导至细胞内结构域，这可以产生新的意外的信号传递级联。
[0007] 美国专利号7,612,181提供了一个新的结合蛋白家族，所述结合蛋白能够以高亲和力结合2种或更多种抗原，它们被称作双重可变结构域结合蛋白（DVD结合蛋白）或双重TM可变结构域免疫球蛋白（DVD-Ig ）。DVD-Ig分子是能够同时结合相同分子上的2个不同表位或2个不同分子的四价双特异性Ig-样蛋白。DVD-Ig是包含与二价抗体的N-端融合的
2个可变结构域的独特结合蛋白。所述可变结构域可以直接地彼此融合或经由具有相配长度和氨基酸组成的合成肽接头连接。可以用完整的和功能性的Fc结构域工程改造DVD-Ig，从而允许它们介导适当的效应子功能。由于它的抗体对选择的灵活性、2个抗原-结合结构域的取向和连接它们的接头的长度，DVD-Ig形式可以揭示受体生物学的一些独特方面，且可能揭示新的治疗模态。
2个可变结构域的独特结合蛋白。所述可变结构域可以直接地彼此融合或经由具有相配长度和氨基酸组成的合成肽接头连接。可以用完整的和功能性的Fc结构域工程改造DVD-Ig，从而允许它们介导适当的效应子功能。由于它的抗体对选择的灵活性、2个抗原-结合结构域的取向和连接它们的接头的长度，DVD-Ig形式可以揭示受体生物学的一些独特方面，且可能揭示新的治疗模态。
[0008] 尽管在本领域提供了多种结构，一些具有优点和缺点，但是需要特定构建体用于制备具有特定特性且结合特定靶标的多价结合蛋白。另外，新可变结构域序列可以进一步改善结合蛋白的特性。具体地，利用某些现有技术DVD-Ig构建体，一定量的空间位阻已经影响了靶标与那些现有技术DVD-Ig构建体的结合。
[0009] 本领域需要改进的多价结合蛋白，其能够结合相同受体的2种不重叠表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。提供了结合相同受体的2种不重叠表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的新结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR、RON和RON、IGF-1R和IGF-1R、Erb-B3和Erb-B3、EGFR和HER2、EGFR和IGF-1R、EGFR和Erb-B3、EGFR和RON、RON和HER2、RON和Erb-B3、RON和IGF-1R、IGF-1R和Erb-B3、IGF-1R和HER2、或HER2和Erb-B3。发明内容
[0010] 提供了能够靶向相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的结合蛋白。在一个实施方案中，提供了能够以高亲和力结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的结合蛋白。
[0011] 在一个实施方案中，提供了包含结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区，且n是0或1。在一个实施方案中，所述结合蛋白中的VD1和VD2是重链可变结构域。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合相同受体的2种不重叠表位。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合在相同细胞上表达的2种不同受体。在另一个实施方案中，C是重链恒定结构域。例如，X1是接头，前提条件是，X1不是CH1。
[0012] 在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白包含结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，且X2是Fc区。在一个实施方案中，X1是接头，前提条件是，它不是CH1。在一个实施方案中，VD1和VD2重链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56的CDR。在另一个实施方案中，所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR、RON和RON、IGF-1R和IGF-1R、Erb-B3和Erb-B3、EGFR和HER2、EGFR和IGF-1R、EGFR和Erb-B3、EGFR和RON、RON和HER2、RON和Erb-B3、RON和IGF-1R、IGF-1R和Erb-B3、IGF-1R和HER2、或HER2和Erb-B3。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56。
[0013] 在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白包含结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，且X2不包含Fc区。在一个实施方案中，X1是接头，前提条件是，它不是CL。在一个实施方案中，所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57的CDR。在另一个实施方案中，所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR、RON和RON、IGF-1R和IGF-1R、Erb-B3和Erb-B3、EGFR和HER2、EGFR和IGF-1R、EGFR和Erb-B3、EGFR和RON、RON和HER2、RON和Erb-B3、RON和IGF-1R、IGF-1R和Erb-B3、IGF-1R和HER2、或HER2和Erb-B3。在一个实施方案中，所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57。
[0014] 在另一个实施方案中，提供了结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的结合蛋白，所述结合蛋白包含2个多肽链，其中第一多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是第一接头，且X2是Fc区；且第二多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是第二接头，且X2不包含Fc区。在某些实施方案中，所述第一个和第二个X1是相同的。在其它实施方案中，所述第一个和第二个X1是不同的。在某些实施方案中，所述第一个X1不是CH1结构域和/或所述第二个X1不是CL结构域。在一个实施方案中，所述第一个X1和所述第二个X1是短（例如，6个氨基酸）接头。在另一个实施方案中，所述第一个X1和所述第二个X1是长（例如，大于6个氨基酸）接头。在另一个实施方案中，所述第一个X1是短接头且所述第二个X1是长接头。在另一个实施方案中，所述第一个X1是长接头且所述第二个X1是短接头。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56的CDR，且所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57的CDR。在另一个实施方案中，所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR、RON和RON、IGF-1R和IGF-1R、Erb-B3和Erb-B3、EGFR和HER2、EGFR和IGF-1R、EGFR和Erb-B3、EGFR和RON、RON和HER2、RON和Erb-B3、RON和IGF-1R、IGF-1R和Erb-B3、IGF-1R和HER2、或HER2和Erb-B3。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56，且所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57。
[0015] 在一个实施方案中，所述双重可变结构域（DVD）结合蛋白包含4个多肽链，其中前2个多肽链中的每一个包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是第一接头，且X2是Fc区；且后2个多肽链中的每一个包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是第二接头，且X2不包含Fc区。这样的DVD结合蛋白具有4个抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第一个和第二个X1是相同的。
在其它实施方案中，所述第一个和第二个X1是不同的。在某些实施方案中，所述第一个X1不是CH1结构域和/或所述第二个X1不是CL结构域。在另一个实施方案中，本文公开的结合蛋白能够结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。因此，在某些实施方案中，所述结合蛋白包含至少2个处于任意取向的可变结构域序列（例如，VD1和VD2），所述可变结构域序列能够结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。在某些实施方案中，独立地选择VD1和VD2。因此，在某些实施方案中，VD1和VD2包含相同的SEQ ID NO，且在其它实施方案中，VD1和VD2包含不同的SEQ ID NO。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56的CDR，且所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、
43、45、47、49、51、53、55或57的CDR。在另一个实施方案中，所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR、RON和RON、IGF-1R和IGF-1R、Erb-B3和Erb-B3、EGFR和HER2、EGFR和IGF-1R、EGFR和Erb-B3、EGFR和RON、RON和HER2、RON和Erb-B3、RON和IGF-1R、IGF-1R和Erb-B3、IGF-1R和HER2、或HER2和Erb-B3。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56，且所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57。
在其它实施方案中，所述第一个和第二个X1是不同的。在某些实施方案中，所述第一个X1不是CH1结构域和/或所述第二个X1不是CL结构域。在另一个实施方案中，本文公开的结合蛋白能够结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。因此，在某些实施方案中，所述结合蛋白包含至少2个处于任意取向的可变结构域序列（例如，VD1和VD2），所述可变结构域序列能够结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。在某些实施方案中，独立地选择VD1和VD2。因此，在某些实施方案中，VD1和VD2包含相同的SEQ ID NO，且在其它实施方案中，VD1和VD2包含不同的SEQ ID NO。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56的CDR，且所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含3个选自SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、
43、45、47、49、51、53、55或57的CDR。在另一个实施方案中，所述结合蛋白能够结合EGFR和EGFR、RON和RON、IGF-1R和IGF-1R、Erb-B3和Erb-B3、EGFR和HER2、EGFR和IGF-1R、EGFR和Erb-B3、EGFR和RON、RON和HER2、RON和Erb-B3、RON和IGF-1R、IGF-1R和Erb-B3、IGF-1R和HER2、或HER2和Erb-B3。在一个实施方案中，所述VD1和VD2重链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56，且所述VD1和VD2轻链可变结构域独立地包含SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57。
[0016] 在另一个实施方案中，所述结合蛋白包含如在表1中所示的重链和轻链序列。
[0017] 所述重链、轻链、2个链或4个链实施方案中的任一个的另一个实施方案包括至少一个X1接头，所述X1接头包含：或
或基于G/S的序列（例如，G4S和G4S重复；SEQ ID NO: 29）。在一个
实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。
或基于G/S的序列（例如，G4S和G4S重复；SEQ ID NO: 29）。在一个
实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。
[0018] 在另一个实施方案中，如果存在于第一多肽中的话，所述Fc区是天然序列Fc区或变体序列Fc区。在另一个实施方案中，所述Fc区是：得自IgG1的Fc区、得自IgG2的Fc区、得自IgG3的Fc区、得自IgG4的Fc区、得自IgA的Fc区、得自IgM的Fc区、得自IgE的Fc区或得自IgD的Fc区。
[0019] 提供了制备结合蛋白的方法，所述结合蛋白结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。在一个实施方案中，制备结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体的结合蛋白的方法包括以下步骤：a）得到结合第一表位或受体的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b）得到结合第二表位或受体的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c）制备编码本文描述的任意结合蛋白的一个或多个构建体；和d）表达所述多肽链，从而产生结合第一和第二表位或受体的结合蛋白。
[0020] 在本文的任意实施方案中，VD1重链可变结构域（如果存在的话）和轻链可变结构域（如果存在的话）可以得自第一亲本抗体或其抗原结合部分；VD2重链可变结构域（如果存在的话）和轻链可变结构域（如果存在的话）可以得自第二亲本抗体或其抗原结合部分。所述第一和第二亲本抗体可以相同或不同。
[0021] 在一个实施方案中，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一抗原，且所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原。在一个实施方案中，所述第一和第二抗原是相同抗原。在另一个实施方案中，所述亲本抗体结合相同抗原上的不同表位。在另一个实施方案中，所述第一和第二抗原是不同的抗原。在另一个实施方案中，所述第一和第二抗原得自在相同细胞上表达的2种不同受体。在另一个实施方案中，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分与第一抗原结合的效价不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分与第二抗原原结合的效价。在另一个实施方案中，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分与第一抗原结合的亲和力不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分与第二抗原结合的亲和力。
[0022] 在另一个实施方案中，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是人抗体、CDR移植抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟的抗体。
[0023] 在另一个实施方案中，所述结合蛋白具有由所述第一亲本抗体或其抗原结合部分或所述第二亲本抗体或其抗原结合部分表现出的至少一种所需特性。可替换地，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分具有由所述结合蛋白表现出的至少一种所需特性。在一个实施方案中，所需特性是一种或多种抗体参数。在另一个实施方案中，所述抗体参数是抗原特异性、对抗原的亲和力、效价、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、或直系同源抗原结合。在一个实施方案中，所述结合蛋白是多价的。在另一个实施方案中，所述结合蛋白是多特异性的。本文所述的多价的和/或多特异性的结合蛋白具有特别从治疗观点来看需要的特性。例如，多价的和/或多特异性的结合蛋白可以（1）比二价抗体更快速地被细胞内在化（和/或分解代谢），所述细胞表达抗体与其结合的抗原；（2）是激动剂结合蛋白；和/或（3）诱导表达多价结合蛋白能够与其结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价的和/或多特异性的结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，经由表达抗体与其结合的抗原的细胞内在化（和/或分解代谢）的抗体；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文所述的多价的和/或多特异性的结合蛋白可以展示这些特性中的一种或多种中的一个或多个改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的任意一种或多种，但如本文所述构建为多价结合蛋白时可以获得这些特性中的一种或多种。
[0024] 在另一个实施方案中，通过表面等离子体共振测得，所述结合蛋白对一种或多种2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1
靶标具有下述的结合速率常数（Kon）：至少约10M s ；至少约10M s ；至少约10M s ；至
5 -1 -1 6 -1 -1
少约10M s ；或至少约10M s 。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测得，结合蛋
2 -1 -1 3 -1 -1 3 -1 -1
白对一种或多种靶标具有下述的结合速率常数（Kon）：约10M s 至约10M s ；约10M s
4 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
至约10M s ；约10M s 至约10M s ；或约10M s 至约10M s 。
靶标具有下述的结合速率常数（Kon）：至少约10M s ；至少约10M s ；至少约10M s ；至
5 -1 -1 6 -1 -1
少约10M s ；或至少约10M s 。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测得，结合蛋
2 -1 -1 3 -1 -1 3 -1 -1
白对一种或多种靶标具有下述的结合速率常数（Kon）：约10M s 至约10M s ；约10M s
4 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
至约10M s ；约10M s 至约10M s ；或约10M s 至约10M s 。
[0025] 在另一个实施方案中，通过表面等离子体共振测得，所述结合蛋白对一种或多种-3 -1 -4 -1 -5 -1靶标具有下述的解离速率常数（Koff）：至多约10 s ；至多约10 s ；至多约10 s ；或至多-6 -1
约10 s 。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测得，所述结合蛋白对一种或多种靶-3 -1 -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1
标具有下述的解离速率常数（Koff）：约10 s 至约10 s ；约10 s 至约10 s ；约10 s-6 -1
至约10 s 。
约10 s 。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测得，所述结合蛋白对一种或多种靶-3 -1 -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1
标具有下述的解离速率常数（Koff）：约10 s 至约10 s ；约10 s 至约10 s ；约10 s-6 -1
至约10 s 。
[0026] 在另一个实施方案中，所述结合蛋白对一种或多种靶标具有下述的解离常数（Kd）：-7 -8 -9 -10 -11 -12
至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；或至-13 -7
多10 M。在一个实施方案中，所述结合蛋白对它的靶标具有下述的解离常数（Kd）：约10 M-8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11
至约10 M；约10 M至约10 M；约10 M至约10 M；约10 M至约10 M；约10 M至约
-12 -12 -13
10 M；约10 M约10 M。
至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；或至-13 -7
多10 M。在一个实施方案中，所述结合蛋白对它的靶标具有下述的解离常数（Kd）：约10 M-8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11
至约10 M；约10 M至约10 M；约10 M至约10 M；约10 M至约10 M；约10 M至约
-12 -12 -13
10 M；约10 M约10 M。
[0027] 在另一个实施方案中，所述结合蛋白是进一步包含试剂的缀合物。在一个实施方案中，所述试剂是免疫粘附分子、成像剂、治疗剂或细胞毒性剂。在一个实施方案中，所述成像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在另一个3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
实施方案中，所述放射性标记是：H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho或 Sm。在另一个实施方案中，所述治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素或细胞凋亡剂。
实施方案中，所述放射性标记是：H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho或 Sm。在另一个实施方案中，所述治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素或细胞凋亡剂。
[0028] 在另一个实施方案中，所述结合蛋白是结晶的结合蛋白且作为晶体存在。在一个实施方案中，所述晶体是无载体的药学控释晶体。在另一个实施方案中，所述结晶的结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性相应物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，所述结晶的结合蛋白保留生物学活性。
[0029] 在另一个实施方案中，本文描述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化模式是人糖基化模式。
[0030] 还提供了编码本文公开的任一种结合蛋白的分离的核酸。另一个实施方案提供了包含本文公开的分离的核酸的载体，其中所述载体是：pcDNA; pTT（Durocher等人(2002) Nucleic Acids Res. 30(2)；pTT3（具有另外的多克隆位点的pTT; pEFBOS (Mizushima和Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO；pEF6 TOPO；pBOS；pHybE；或pBJ。在一个实施方案中，所述载体是在美国专利公开号20090239259中公开的载体。
[0031] 在另一个方面，用本文公开的载体转化宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如，原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是：哺乳动物细胞，包括、但不限于，CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6，或真菌细胞，诸如酿酒酵母，或昆虫细胞，诸如Sf9。在一个实施方案中，在单个重组宿主细胞中生产2种或更多种结合蛋白，例如，其具有不同的特异性。例如，抗体的混合物的表达已经被称作OligoclonicsMerus B.V.,荷兰）美国专利号7,262,028和7,429,486。
[0032] 提供了生产本文公开的结合蛋白的方法，所述方法包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养本文公开的任一种宿主细胞。在一个实施方案中，通过这种方法生产的50％-75％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在另一个实施方案中，通过这种方法生产的75％-90％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在另一个实施方案中，所述生产的90％-95％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。
[0033] 一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含结晶的结合蛋白、成分和至少一种聚合载体。在一个实施方案中，所述聚合载体是聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚缩酚酸肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二噁烷酮、聚乙二醇、聚（羟丙基）甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、普卢兰尼克多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖（glycaminoglycans）、硫酸化多糖、或它们的掺合物或共聚物。在一个实施方案中，所述成分是白蛋白、蔗糖、海藻糖、拉克替醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇。
[0034] 另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的本文公开的组合物的步骤。
[0035] 提供了药物组合物，其包含如本文公开的结合蛋白和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种用于治疗病症的另外的治疗剂。例如，所述额外试剂可以是：治疗剂，化学治疗剂；成像剂，细胞毒性剂，血管生成抑制剂（包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap）；激酶抑制剂（包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂）；共刺激分子阻断剂（包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20）；粘附分子阻断剂（包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂）；抗细胞因子抗体或其功能片段（包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/细胞因子受体抗体）；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报告分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，麻醉药，非甾体类抗炎药（NSAID），止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂；抗微生物剂，抗银屑病剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，或细胞因子拮抗剂。
[0036] 提供了用于诊断和/或治疗患有病症的人对象的方法，在所述病症中能够由本文公开的结合蛋白结合的一种或多种靶标是有害的，所述方法包括给人受试者施用本文公开的结合蛋白，使得人受试者中的一种或多种靶标的活性被抑制，并且减轻一种或多种症状或实现治疗。本文提供的结合蛋白可以用于诊断和/或治疗遭受原发性和转移性癌症的人类，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道（包括肾、膀胱和尿道上皮）、女性生殖道（包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病）、男性生殖道（包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤）、内分泌腺（包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体）和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤（包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤），脑、神经、眼和脑膜（包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、许旺细胞瘤和脑膜瘤）的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤（霍奇金与非霍奇金淋巴瘤）产生的实体瘤。
[0038] 本文提供的结合蛋白可以用于治疗神经障碍。在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分被用于治疗神经变性疾病和涉及神经元再生和脊髓损伤的病症。
[0039] 另一个实施方案提供了结合蛋白在疾病或障碍的治疗中的用途，其中所述疾病或障碍是：类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎病、格雷夫斯氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、阿狄森氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、施密特氏综合征、成人（急性）呼吸窘迫综合征、脱发、斑秃、关节病、赖特尔病、银屑病性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、动脉粥样化病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐发性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷相关的疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见变异型免疫缺陷(常见变异型低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐发性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、斯耶格伦病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎（传统自身免疫性或狼疮样肝炎）、2型自身免疫性肝炎（抗LKM抗体肝炎）、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型银屑病、2型银屑病、特发性白细胞减少（idiopathic leucopaenia）、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎（glomerulonephritides）、肾显微血管炎（vasulitis）、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化（所有亚型）、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、肺出血肾炎综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、斯蒂尔病、全身性硬皮病、舍格伦综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性（goitrous）自身免疫性甲状腺功能减退（桥本病）、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性（phacogenic）葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁淤积（choleosatatis）、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌（GBS）感染、精神障碍、抑郁症、精神分裂症、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛、不同形式的疼痛、癌症、肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、造血恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、无β脂蛋白血症（Abetalipoprotemia）、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓细胞样白血病（AML）、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房（aerial）异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤（aneuryisms）、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动（持续性或阵发性）、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植（BMT）排斥、束支传导阻滞、伯基特淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病（CML）、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆（Dementia pugilistica）、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症（diabetes）、糖尿病（diabetes mellitus）、糖尿病性动脉硬化性（ateriosclerotic）疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性（hematophagocytic）淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、弗里德赖希共济失调症、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、桥本甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常（arrythmias）、HIV感染/HIV神经病、霍奇金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性阿狄森氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流感、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿（lymphederma）、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性疾病、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph）、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非霍奇金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎（epidydimitis）、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰腺癌、副癌综合征/恶性肿瘤的高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化（atherlosclerotic）疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征（多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征）、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上（supranucleo）麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、雷诺现象和疾病、Raynoud氏病、植烷酸贮积症、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常（arrythmias）、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应（anaphalaxis）、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞（hemaphagocytic）综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、肝豆状核变性、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人斯蒂尔病、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征（ALPS）、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征（clinically isolated syndrome）（cis）、儿童期发病性精神病（childhood onset psychiatric disorder）、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病视网膜病变、椎间盘突出（disk herniation）、盘脱垂（disk prolaps）、药物诱导的免疫性溶血性贫血、子宫内膜异位症、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合征（GBS）、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎（keratojuntivitis sicca）、库斯毛尔病或Kussmaul-Meier病、兰德里瘫痪、Langerhan 氏细胞组织细胞增生症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、少关节的JRA、外周动脉闭塞性疾病（PAOD）、外周血管疾病（PVD）、外周动脉疾病（PAD）、静脉炎、结节性多动脉炎（或结节性动脉外膜炎）、多软骨炎、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌病（PMR）、原发性帕金森综合征、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho（滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎）、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎（spondilitis ankylosans）、Stevens-Johnson综合征（SJS）、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS（肿瘤坏死因子受体，I型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎（UIP）、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、伏格特-小柳-原田三氏综合征（VKH综合征）、湿黄斑变性或伤口愈合。
[0040] 在一个实施方案中，使用所述结合蛋白或其抗原结合部分来治疗癌症或者预防或抑制来自本文描述的肿瘤的转移灶，无论是单独使用，还是与放射疗法和/或化学治疗剂联合使用。
[0041] 在一个实施方案中，可以与本文提供的结合蛋白相组合的化学治疗剂包括以下的：13-顺式-视黄酸；2-CdA；2-氯脱氧腺苷；5-阿扎胞苷；5-氟尿嘧啶；5-FU；6-巯基嘌呤；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤；注射用紫杉醇；Accutane®；放线菌素-D；阿霉素；Adrucil®；Afinitor®；Agrylin®；Ala-Cort®；阿地白介素；阿仑珠单抗；力比泰；阿利维A酸；Alkaban-AQ®；爱克兰；全反式视黄酸；α干扰素；六甲蜜胺；甲氨蝶呤；氨磷汀；氨鲁米特；阿那格雷；尼鲁米特；阿那曲唑；阿糖胞嘧啶；Ara-C Aranesp®；阿可达；瑞宁得；阿诺新；Arranon®；三氧化二砷；ArzerraATRA；阿伐他汀；阿扎胞苷；卡介苗；BCNU；苯达莫司汀；贝伐珠单抗；贝沙罗汀；BEXXAR®；比卡鲁胺；BiCNU；硫酸博来霉素；博来霉素；硼替佐米；白消安；白舒非；C225；亚叶酸钙；Campath®；Camptosar®；喜树碱-11；卡培他滨；
Carac；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；红卫霉素；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；
噬橙菌因子；克拉屈滨；可的松；更生霉素；CPT-11；环磷酰胺；氨鲁米特；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；Cytosar-U®；环磷酰胺；达卡巴嗪；Dacogen；更生霉素；达促红素α；达沙替尼；道诺霉素；柔红霉素；盐酸柔红霉素；柔红霉素脂质体；DaunoXome®；地卡特隆；地西他滨；泼尼松龙；Deltasone®；地尼白介素；Diftitox；DepoCytDexasone；右丙亚胺；DHAD；
DIC；Diodex；多西他赛；Doxil®；多柔比星；多柔比星脂质体；DroxiaDTIC；DTIC-Dome®；
Duralone®；Efudex®；醋酸亮丙瑞林™；盐酸表柔比星™；Eloxatin；Emcyt®；表柔比星；促红素α；爱必妥；厄洛替尼；欧文氏菌属L-天门冬酰胺酶；雌莫司汀；阿密磷定；凡毕复；依托泊苷；磷酸依托泊苷；Eulexin®；依维莫司；易维特；依西美坦；法乐通；Faslodex®；弗隆；非格司亭；氟尿苷；福达华；氟达拉滨；Fluoroplex®；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶（乳膏剂）；氟甲睾酮；氟他胺；亚叶酸；FUDR®；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥珠单抗奥加米星；健择；格列卫™；Gliadel®糯米纸囊剂；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）；
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（G-MCSF）；Halotestin®；赫赛汀；地塞米松；克瘤灵；六甲蜜胺；HMM；和美新；羟基脲；Hydrocort Acetate®；氢化可的松；氢化可的松磷酸钠；氢化可的松琥珀酸钠；磷酸氢化可的松；羟基脲；替伊莫单抗；替伊莫单抗；依达比星；Idarubicin Ifex®；干扰素-α；干扰素-α-2b（PEG缀合物）；异环磷酰胺；白介素-11（IL-11）；白介素-2（IL-2）；甲磺酸伊马替尼；咪唑羧酰胺；甘乐能；易瑞沙；伊立替康；异维A酸；
伊沙匹隆；IxempraKidrolase (t) Lanacort®；拉帕替尼；L-天门冬酰胺酶；LCR；来那度胺；来曲唑；亚叶酸；留可然；LeukineLiquid Pred®；洛莫司汀；L-PAM；L-沙可来新；醋酸亮丙瑞林；醋酸亮丙瑞林贮库；甲苯肼；Maxidex；氮芥；盐酸氮芥；Medralone®；美卓乐；
梅格施；甲地孕酮；乙酸甲地孕酮；美法仑；巯嘌呤；美司钠；MesnexMeticorten®；丝裂霉素；丝裂霉素-C；Mitoxantrone M-Prednisol®；MTC；MTX；氮芥；氮芥；突变霉素；马利兰；
Mylocel；诺维本；奈拉滨；Neosar®；NeulastaNeumega®；优保津；多吉美；Nilandron®；尼洛替尼；尼鲁米特；Nipent®；Nitrogen Mustard Novaldex®；诺肖林；Nplate；奥曲肽；醋酸奥曲肽；奥法木单抗；Oncospar®；安可平；Ontak®；OnxalOrapred®；Orasone®；奥沙利铂；紫杉醇；结合蛋白的紫杉醇；帕米膦酸盐；帕木单抗；Panretin®；伯尔定；帕唑帕尼；
Pediapred®；PEG干扰素；培门冬酶；培非司亭；佩乐能™；PEG-L-天门冬酰胺酶；培美曲塞；
喷司他丁；苯丙氨酸芥；顺氯氨铂；顺氯氨铂-AQ®；泼尼松龙；泼尼松；Prelone®；丙卡巴肼；PROCRIT®；阿地白介素；具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20；巯基嘌呤；雷洛昔芬；Revlimid®；Rheumatrex®；Rituxan®；利妥昔单抗；罗荛愫；罗米司亭；Rubex®；盐酸红比霉素；善宁；善龙；沙格司亭；Solu-Cortef®；甲强龙；索拉非尼；SPRYCELSTI-571；链佐星；SU11248；舒尼替尼；索坦；Tamoxifen Tarceva®；Targretin®；Tasigna®；泰素；泰索帝；Temodar®；替莫唑胺坦罗莫司；替尼泊苷；塞替派；沙利度胺；Thalomid®；TheraCys®；
硫鸟嘌呤；硫鸟嘌呤片剂；Thiophosphoamide；Thioplex®；塞替派；TICE®；拓扑杀；托泊替康；托瑞米芬；Torisel®；托西莫单抗；曲妥珠单抗；Treanda®；维A酸；TrexallTrisenox®；
TSPA；TYKERB®；VCR；VectibixVelban®；万珂；凡毕士；Vesanoid®；ViadurVidaza®；长春碱；硫酸长春碱；Vincasar Pfs®；长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏林司他；Votrient；VP-16；卫萌；希罗达；Zanosar®；泽娃灵™；右雷佐生；诺雷德；唑来膦酸；
Zolinza；或择泰。
Carac；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；红卫霉素；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；
噬橙菌因子；克拉屈滨；可的松；更生霉素；CPT-11；环磷酰胺；氨鲁米特；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；Cytosar-U®；环磷酰胺；达卡巴嗪；Dacogen；更生霉素；达促红素α；达沙替尼；道诺霉素；柔红霉素；盐酸柔红霉素；柔红霉素脂质体；DaunoXome®；地卡特隆；地西他滨；泼尼松龙；Deltasone®；地尼白介素；Diftitox；DepoCytDexasone；右丙亚胺；DHAD；
DIC；Diodex；多西他赛；Doxil®；多柔比星；多柔比星脂质体；DroxiaDTIC；DTIC-Dome®；
Duralone®；Efudex®；醋酸亮丙瑞林™；盐酸表柔比星™；Eloxatin；Emcyt®；表柔比星；促红素α；爱必妥；厄洛替尼；欧文氏菌属L-天门冬酰胺酶；雌莫司汀；阿密磷定；凡毕复；依托泊苷；磷酸依托泊苷；Eulexin®；依维莫司；易维特；依西美坦；法乐通；Faslodex®；弗隆；非格司亭；氟尿苷；福达华；氟达拉滨；Fluoroplex®；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶（乳膏剂）；氟甲睾酮；氟他胺；亚叶酸；FUDR®；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥珠单抗奥加米星；健择；格列卫™；Gliadel®糯米纸囊剂；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）；
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（G-MCSF）；Halotestin®；赫赛汀；地塞米松；克瘤灵；六甲蜜胺；HMM；和美新；羟基脲；Hydrocort Acetate®；氢化可的松；氢化可的松磷酸钠；氢化可的松琥珀酸钠；磷酸氢化可的松；羟基脲；替伊莫单抗；替伊莫单抗；依达比星；Idarubicin Ifex®；干扰素-α；干扰素-α-2b（PEG缀合物）；异环磷酰胺；白介素-11（IL-11）；白介素-2（IL-2）；甲磺酸伊马替尼；咪唑羧酰胺；甘乐能；易瑞沙；伊立替康；异维A酸；
伊沙匹隆；IxempraKidrolase (t) Lanacort®；拉帕替尼；L-天门冬酰胺酶；LCR；来那度胺；来曲唑；亚叶酸；留可然；LeukineLiquid Pred®；洛莫司汀；L-PAM；L-沙可来新；醋酸亮丙瑞林；醋酸亮丙瑞林贮库；甲苯肼；Maxidex；氮芥；盐酸氮芥；Medralone®；美卓乐；
梅格施；甲地孕酮；乙酸甲地孕酮；美法仑；巯嘌呤；美司钠；MesnexMeticorten®；丝裂霉素；丝裂霉素-C；Mitoxantrone M-Prednisol®；MTC；MTX；氮芥；氮芥；突变霉素；马利兰；
Mylocel；诺维本；奈拉滨；Neosar®；NeulastaNeumega®；优保津；多吉美；Nilandron®；尼洛替尼；尼鲁米特；Nipent®；Nitrogen Mustard Novaldex®；诺肖林；Nplate；奥曲肽；醋酸奥曲肽；奥法木单抗；Oncospar®；安可平；Ontak®；OnxalOrapred®；Orasone®；奥沙利铂；紫杉醇；结合蛋白的紫杉醇；帕米膦酸盐；帕木单抗；Panretin®；伯尔定；帕唑帕尼；
Pediapred®；PEG干扰素；培门冬酶；培非司亭；佩乐能™；PEG-L-天门冬酰胺酶；培美曲塞；
喷司他丁；苯丙氨酸芥；顺氯氨铂；顺氯氨铂-AQ®；泼尼松龙；泼尼松；Prelone®；丙卡巴肼；PROCRIT®；阿地白介素；具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20；巯基嘌呤；雷洛昔芬；Revlimid®；Rheumatrex®；Rituxan®；利妥昔单抗；罗荛愫；罗米司亭；Rubex®；盐酸红比霉素；善宁；善龙；沙格司亭；Solu-Cortef®；甲强龙；索拉非尼；SPRYCELSTI-571；链佐星；SU11248；舒尼替尼；索坦；Tamoxifen Tarceva®；Targretin®；Tasigna®；泰素；泰索帝；Temodar®；替莫唑胺坦罗莫司；替尼泊苷；塞替派；沙利度胺；Thalomid®；TheraCys®；
硫鸟嘌呤；硫鸟嘌呤片剂；Thiophosphoamide；Thioplex®；塞替派；TICE®；拓扑杀；托泊替康；托瑞米芬；Torisel®；托西莫单抗；曲妥珠单抗；Treanda®；维A酸；TrexallTrisenox®；
TSPA；TYKERB®；VCR；VectibixVelban®；万珂；凡毕士；Vesanoid®；ViadurVidaza®；长春碱；硫酸长春碱；Vincasar Pfs®；长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏林司他；Votrient；VP-16；卫萌；希罗达；Zanosar®；泽娃灵™；右雷佐生；诺雷德；唑来膦酸；
Zolinza；或择泰。
[0042] 在另一个方面，提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括下述步骤：在第二试剂施用之前、同时或之后，施用本文公开的任一种结合蛋白。在一个实施方案中，所述第二试剂是：布地奈德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂氧合酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉秦，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗-IL-1βmAb，抗-IL-6或IL-6受体mAb，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，甲氨蝶呤，环孢素，FK506，雷帕霉素，吗替麦考酚酯，来氟米特，NSAID，布洛芬，泼尼松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓形成的试剂，补体抑制剂，肾上腺素能剂，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα-转换酶抑制剂，T-细胞信号传递抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性的细胞因子受体，可溶性的p55 TNF受体，可溶性的p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13，或TGFβ。在一个特定实施方案中，通过胃肠外的、皮下的、肌肉内的、静脉内的、关节内的、支气管内的、腹内的、囊内的、软骨内的、腔内的、体腔内的、小脑内的、脑室内的、结肠内的、颈内的、胃内的、肝内的、心肌内的、骨内的、骨盆内的、心包内的、腹膜内的、胸膜内的、前列腺内的、肺内的、直肠内的、肾内的、视网膜内、椎管内的、滑膜内的、胸腔内的、子宫内的、膀胱内的、推注、阴道、直肠的、含服的、舌下、鼻内的或透皮的施用，将本文公开的药物组合物施用给患者。
[0043] 还提供了本文公开的结合蛋白的抗-独特型抗体。抗-独特型抗体包括包含免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白或含肽分子，例如但不限于，重链或轻链的至少一个互补性决定区（CDR）或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架区，或其可以掺入本文提供的结合蛋白内的任何部分。
[0044] 提供了确定试验样品中的一种或多种抗原或其片段的存在、量或浓度的方法，其中所述一种或多种抗原是EGFR、RON、IGF-1R、Erb-B3和/或HER2。所述方法包括：通过免疫测定法测定试验样品的抗原或其片段。所述免疫测定法（i）采用至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记物，且（ii）包括：将试验样品中由可检测标记物生成的、作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行对比。所述校准物任选地是一系列校准物的部分，其中每种校准物与系列中的其它校准物的差别在于抗原或其片段的浓度。该方法可以包括：（i）将试验样品与结合抗原或其片段上的表位的至少一种捕获试剂接触，从而形成捕获试剂/抗原或其片段复合物，（ii）将捕获试剂/抗原或其片段复合物与至少一种检测试剂接触，所述检测试剂包含可检测标记物且结合抗原或其片段上未被捕获试剂结合的表位，以形成捕获试剂/抗原或其片段/检测试剂复合物，和（iii）基于在（ii）中形成的捕获试剂/抗原或其片段/检测试剂复合物中的可检测标记物生成的信号，确定试验样品中抗原或其片段的存在、量或浓度，其中至少一种捕获试剂和/或至少一种检测试剂是至少一种结合蛋白。
[0045] 可替换地，该方法可以包括：（i）将试验样品与结合抗原或其片段上的表位的至少一种捕获试剂接触，从而形成捕获试剂/抗原或其片段复合物，并同时或以任何顺序依次将试验样品与可检测地标记的抗原或其片段接触，所述可检测地标记的抗原或其片段可与试验样品中的任何抗原或其片段竞争结合所述至少一种捕获试剂，其中试验样品中存在的任何抗原或其片段和可检测地标记的抗原彼此竞争，以分别形成捕获试剂/抗原或其片段复合物和捕获试剂/可检测地标记的抗原或其片段复合物，和（ii）基于在（ii）中形成的捕获试剂/可检测地标记的抗原或其片段复合物中的可检测标记物生成的信号，确定试验样品中抗原或其片段的存在、量或浓度，其中至少一种捕获试剂是至少一种结合蛋白，并且其中捕获试剂/可检测地标记的抗原或其片段复合物中的可检测标记物生成的信号与试验样品中的抗原或其片段的量或浓度成反比。
[0046] 试验样品可以得自患者，在这种情况下，该方法可以另外包括诊断、预后、或评估患者的治疗性/预防性处理的功效。如果方法另外包括评估患者的治疗性/预防性处理的功效，则方法任选另外包括：根据需要修改患者的治疗性/预防性处理以改善功效。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统。因此，本文所述的方法也可以用于确定对象是否患有给定疾病、障碍或病症或者处于发展给定疾病、障碍或病症的风险中。具体地，这样的方法可以包括以下步骤：（a）确定来自对象的试验样品中分析物或其片段的浓度或量（例如，使用本文所述的方法或本领域已知的方法）；和
（b）将在步骤（a）中确定的分析物或其片段的浓度或量与预定水平进行对比，其中，如果在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是有利的，则将该对象确定为未患有给定疾病、障碍或病症或没有给定疾病、障碍或病症的风险。但是，如果在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是不利的，则将该对象确定为患有给定疾病、障碍或病症或具有给定疾病、障碍或病症的风险。
（b）将在步骤（a）中确定的分析物或其片段的浓度或量与预定水平进行对比，其中，如果在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是有利的，则将该对象确定为未患有给定疾病、障碍或病症或没有给定疾病、障碍或病症的风险。但是，如果在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是不利的，则将该对象确定为患有给定疾病、障碍或病症或具有给定疾病、障碍或病症的风险。
[0047] 另外，本文提供了监测对象中疾病进展的方法。最佳的，所述方法包括以下步骤：（a）确定来自对象的试验样品中分析物的浓度或量；
（b）确定来自所述对象的较晚试验样品中分析物的浓度或量；和
（c）将在步骤（b）中确定的分析物的浓度或量与在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量进行对比，其中，如果在步骤（b）中确定的浓度或量当与在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量对比时是无变化的或是不利的，则确定对象中的疾病继续、进展或恶化。比较而言，如果在步骤（b）中确定的分析物的浓度或量当与在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量对比时是有利的，则确定对象中的疾病停止、消退或改善。
（b）确定来自所述对象的较晚试验样品中分析物的浓度或量；和
（c）将在步骤（b）中确定的分析物的浓度或量与在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量进行对比，其中，如果在步骤（b）中确定的浓度或量当与在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量对比时是无变化的或是不利的，则确定对象中的疾病继续、进展或恶化。比较而言，如果在步骤（b）中确定的分析物的浓度或量当与在步骤（a）中确定的分析物的浓度或量对比时是有利的，则确定对象中的疾病停止、消退或改善。
[0048] 任选地，所述方法另外包括：将在步骤（b）中确定的分析物的浓度或量与例如预定水平进行对比。另外，所述方法任选地包括：如果对比显示，在步骤（b）中确定的分析物的浓度或量例如相对于预定水平不利地改变，则用一种或多种药物组合物对对象治疗一段时间。
[0049] 还提供了用于测定试验样品中的一种或多种抗原或其片段的试剂盒，其中所述一种或多种抗原是EGFR、RON、IGF-1R、Erb-B3和/或HER2。所述试剂盒包括：用于测定试验样品的抗原或其片段的至少一种组分，和关于测定试验样品的抗原或其片段的说明书，其中所述至少一种组分包括至少一种包含本文公开的结合蛋白的组合物，其中所述结合蛋白任选地被可检测地标记。附图说明
[0050] 图1是双重可变结构域（DVD）结合蛋白构建体的示意图，且显示了从2个亲本抗体制备DVD结合蛋白的策略。
具体实施方式
[0051] 提供了多价的和/或多特异性的结合蛋白，其能够结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的2种不同受体。还提供了双重可变结构域结合蛋TM白（DVD结合蛋白）或双重可变结构域免疫球蛋白（DVD-Ig ）、及其药物组合物、以及用于制备这样的DVD结合蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还提供了使用所述DVD结合蛋白在体外或在体内检测特定抗原的方法。
[0052] 除非在本文中另外定义，否则在本文中使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果有任何潜在歧义，本文中提供的定义优先于任何词典或外来定义。除非上下文有其它规定，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。除非另外说明，“或”的使用是指“和/或”。术语“包括”及其它形式的使用是非限制性的。
[0053] 通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交结合使用的命名法是本领域中众所周知且普遍使用的那些。除非另外指出，否则本文提供的方法和技术通常按照本技术领域中众所周知的以及如贯穿本说明书中所引用和讨论的各种一般性的以及更具体的参考文献中所记载的常规方法进行。如本领域中通常所完成的或如本文所述的，根据制造商的说明书，进行酶反应和纯化技术。与本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学结合使用的命名以及其实验室操作和技术是本领域中众所周知且普遍使用的那些。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送及患者治疗。
[0055] 术语“抗体”表示通常由4个多肽链（2个重（H）链和2个轻（L））链构成的免疫球蛋白（Ig）分子，或它们的保留Ig分子的表位结合特征的功能片段、突变体、变体或衍生物。这样的片段、突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知的。在全长抗体的一个实施方案中，每个重链由1个重链可变区（VH）和1个重链恒定区（CH）构成。所述CH由3个结构域（CH1、CH2和CH3）构成。每个轻链由1个轻链可变区（VL）和1个轻链恒定区（CL）构成。所述CL由单个CL结构域构成。所述VH和VL可以进一步细分成被称为互补性决定区（CDR）的高变区，其间散布被称为框架区（FR）的更保守的区域。通常，每个VH和VL由3个CDR和
4个FR组成，以下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。
4个FR组成，以下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。
[0056] 术语“双特异性抗体”表示这样的抗体：其在它的2个结合臂（一对HC/LC）之一上结合一个抗原（或表位），并在它的第二个结合臂（一对不同的HC/LC）上结合不同的抗原（或表位）。双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂（在特异性和CDR序列方面），且对于它所结合的每个抗原而言是单价的。双特异性抗体包括通过以下技术制备的那些：四源杂交瘤技术（Milstein和Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40），2个不同的单克隆抗体的化学缀合（Staerz等人(1985) Nature 314(6012): 628-31），或凸起-进入-孔洞或在Fc区中引入突变的类似方案（Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14):6444-6448）。
[0057] “亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一种或多种改变的抗体，与不具有那些一种或多种改变的亲本抗体相比，所述改变导致所述抗体对抗原的亲和力改善。示例性的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的规程来产生亲和力成熟的抗体。Marks等人(1992) BioTechnology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。以下文献描述了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等人(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813; Schier等人(1995) Gene 169:147-155; Yelton等人(1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson等人(1995) J. Immunol. 154(7):3310-9; Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；
以及在美国专利号6,914,128中所述的由增强活性的氨基酸残基在选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
以及在美国专利号6,914,128中所述的由增强活性的氨基酸残基在选择性诱变位置、接触或高变位置处的突变。
[0058] 术语“CDR-移植抗体”表示包含重链和轻链可变区序列的抗体，在所述重链和轻链可变区序列中，VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列被另一种抗体的CDR序列替换，例如，2种抗体可以来自不同的物种，诸如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDR已被人CDR序列替换。
[0059] 术语“人源化抗体”表示包含来自非人物种的抗体，其已被改变成更“人样”，即更类似于人种系序列。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中将非人CDR序列引入人VH和VL序列中以替换对应的人CDR序列。“人源化抗体”也是抗体或它的变体、衍生物、类似物或片段，其包含与人抗体的氨基酸序列具有基本上例如，至少80%, 至少85%, 至少90%, 至少95%, 至少98%或至少99%同一性的框架区（FR）序列和至少一个基本上具有非人抗体的氨基酸序列的CDR。人源化抗体可以包含基本上所有的至少一个且通常2个可变结构域（Fab、Fab’、F(ab’) 2、FabC、Fv），其中所有的或基本上所有的CDR区域的序列对应于非人免疫球蛋白（即，供体抗体）的那些，且所有的或基本上所有的FR区域的序列是人免疫球蛋白的那些。人源化抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。在一个实施方案中，人源化抗体还包含人免疫球蛋白Fc区的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化的轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化的重链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或重链的人源化可变结构域。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。在某些实施方案中，人源化抗体含有重链以及至少轻链的可变结构域。
[0060] 术语“双重可变结构域结合蛋白”和“双重可变结构域免疫球蛋白”表示这样的结合蛋白：其在它的2个结合臂（例如，一对HC/LC）中的每一个中具有2个可变结构域（参见PCT公开号WO 02/02773），其中的每一个能够结合抗原。在一个实施方案中，每个可变结构域结合不同的抗原或表位。在另一个实施方案中，每个可变结构域结合相同的抗原或表位。在另一个实施方案中，双重可变结构域结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，它们具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于它所结合的每个抗原而言是二价的。在一个实施方案中，所述DVD结合蛋白可以是单特异性的（即，能够结合一种抗原）或多特异性的（即，能够结合2种或更多种抗原）。包含2个重链DVD多肽和2个轻链DVD多肽的DVD结合蛋白TM被称作DVD-Ig 。在一个实施方案中，四链DVD结合蛋白的每一半包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽和2个抗原结合位点。在一个实施方案中，每个结合位点包含1个重链可变结构域和1个轻链可变结构域，每个抗原结合位点共有6个CDR参与抗原结合。
[0061] 术语“抗独特型抗体”表示针对另一种抗体的抗原结合位点的氨基酸序列产生的抗体。可以施用抗独特型抗体来增强针对抗原的免疫应答。
[0062] 术语“生物活性”表示分子的任意一种或多种生物学特性（无论天然地存在于体内，还是通过重组方式提供或实现）。生物学特性包括、但不限于：结合受体，诱导细胞增殖，抑制细胞生长，诱导其它细胞因子，诱导细胞凋亡，和酶活性。
[0063] 术语“中和”表示，当结合蛋白特异性地结合抗原时，抵消所述抗原的生物活性。在一个实施方案中，中和性结合蛋白结合抗原（例如，细胞因子）并使它的生物活性降低了至少约20%、40%、60%、80%、85%或更多。
[0064] “特异性”表示结合蛋白的选择性地结合抗原的能力。
[0065] “亲和力”是结合蛋白和抗原之间的相互作用的强度，且由结合蛋白的CDR的序列以及抗原的性质，诸如它的大小、形状和/或电荷确定。可以关于亲和力来选择提供期望的治疗终点并同时使消极副作用最小化的结合蛋白。使用本领域技术人员已知的方法（US20090311253），可以测量亲和力。
[0066] 术语“效价”表示结合蛋白的实现预期效应的能力，且是它的治疗效果的测量。使用本领域技术人员已知的方法（US 20090311253），可以评估效价。
[0067] 术语“交叉反应性”表示结合蛋白的结合靶标的能力，所述靶标不是它产生时所针对的靶标。通常，结合蛋白以适当高亲和力结合它的一个或多个靶组织/抗原，但是对非靶正常组织表现出适当低亲和力。通常选择个别结合蛋白来满足2个标准。（1）对于已知的抗体靶标表达而言适当的组织染色。（2）得自相同器官的人和tox物种（小鼠和食蟹猴）组织之间的类似染色模式。这些和其它评估交叉反应性的方法是本领域技术人员已知的（US20090311253）。
[0068] 术语“生物学功能”是指结合蛋白的特异性体外或体内作用。结合蛋白可以靶向几类抗原并通过多种作用机制实现期望的治疗结果。结合蛋白可以靶向可溶性的蛋白、细胞表面抗原、以及细胞外蛋白沉着物。结合蛋白可以激动、拮抗或中和它们的靶标的活性。结合蛋白可以辅助清除它们所结合的靶标，或者当与细胞结合时可以导致细胞毒性。可以将2个或更多个抗体的部分整合成多价形式以在单个结合蛋白分子中实现不同功能。用于评估生物学功能的体外测定和体内模型是本领域技术人员已知的（US 20090311253）。
[0069] “稳定的”结合蛋白是这样的：其中所述结合蛋白在贮存后基本上保留它的物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性。在不同温度在体外稳定长时间段的多价结合蛋白是合乎需要的。稳定化结合蛋白并评估它们在不同温度的稳定性的方法是本领域技术人员已知的（US 20090311253）。
[0070] 术语“可溶性”表示蛋白保持分散在水溶液内的能力。蛋白在水性制剂中的可溶性取决于疏水和亲水氨基酸残基的适当分布，且因此，可溶性可以与正确折叠的蛋白的生产相关联。本领域技术人员使用常规HPLC技术和本领域技术人员已知的方法能够检测结合蛋白的可溶性的增加或下降（US 20090311253）。
[0071] 可以使用多种宿主细胞生产结合蛋白，或者可以在体外生产结合蛋白，且每次努力的相对收率决定了“生产效率”。影响生产效率的因素包括、但不限于：宿主细胞类型（原核或真核）、表达载体的选择、核苷酸序列的选择和采用的方法。在结合蛋白生产、以及生产效率测量中使用的材料和方法是本领域技术人员已知的（US 20090311253）。
[0072] 术语“免疫原性”是指物质的诱导免疫应答的能力。治疗性结合蛋白的施用可以导致免疫应答的某种发生。在选择亲本抗体的过程中可以分析可能以多价形式诱导免疫原性的潜在要素，并且可以采取减少这样的风险的步骤来优化亲本抗体，然后将它们的序列整合进多价结合蛋白形式中。降低抗体和结合蛋白的免疫原性的方法是本领域技术人员已知的（US 20090311253）。
[0073] 术语“标记物”和“可检测标记物”是指这样的部分：其连接至特异性结合对（诸如抗体或它的分析物）的一个成员，以使特异性结合对的成员之间的反应（例如，结合）是可检测的。特异性结合对的标记的成员被称为“可检测地标记的”。因而，术语“标记的结合蛋白”表示具有掺入的标记物的蛋白，所述标记物提供了结合蛋白的鉴定。在一个实施方案中，所述标记物是可以产生通过肉眼或仪器工具可检测的信号的可检测标志物，例如，放射性地标记的氨基酸的掺入或可以被标记的抗生物素蛋白检测到的生物素基部分（例如，含有可以通过光学或比色测量方法检测到的荧光标志物或酶活性的抗生蛋白链菌素）与多肽的连接。用于多肽的标记物的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素（例如，3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho或 Sm）；色原、荧光标记（例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体），酶促标记（例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）；化学发光标记；生物素基基团；由次级报告分子识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）；和磁性试剂，例如钆螯合物。免疫测定常用的标记的代表性例子包括产生光的部分，例如吖啶鎓（acridinium）化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。在这点上，所述部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。
H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho或 Sm）；色原、荧光标记（例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体），酶促标记（例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）；化学发光标记；生物素基基团；由次级报告分子识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）；和磁性试剂，例如钆螯合物。免疫测定常用的标记的代表性例子包括产生光的部分，例如吖啶鎓（acridinium）化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。在这点上，所述部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。
[0074] 术语“缀合物”表示与第二化学部分（例如治疗剂或细胞毒性剂）化学连接的结合蛋白（诸如抗体）。术语“试剂”包括化合物、化合物的混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。在一个实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂包括、但不限于：百日咳毒素、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷（tenoposide）、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。当用在免疫测定的上下文中时，缀合抗体可以是用作检测抗体的可检测地标记的抗体。
[0075] 术语“晶体”和“结晶的”表示以晶体形式存在的结合蛋白（例如抗体）或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其它形式诸如无定形固态或液晶态。晶体由原子、离子、分子（例如，蛋白诸如抗体）、或分子组合（例如，抗原/抗体复合物）的规则的、重复的、三维阵列构成。这些三维阵列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或结构单元被称为不对称单位。符合给定的、明确定义的晶体学对称性的排列中的不对称单位的重复会提供晶体的“晶胞”。通过在所有3个维度中的规则平移实现的晶胞重复会提供晶体。参见Giege, R. 和Ducruix, A. Barrett, 第2版，第20 1-16
页, Oxford University Press, New York, New York, (1999)。
页, Oxford University Press, New York, New York, (1999)。
[0076] 术语“载体”表示能够运输它已经连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，它表示在其中可以连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中可以将额外DNA区段连接到病毒基因组内。其它载体包括RNA载体。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞的基因组内，且由此与宿主基因组一起复制。某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称作“重组表达载体”（或简单地称作“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，也包括表达载体的其它形式，例如提供等价功能的病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。将一组pHybE载体（美国专利申请系列号61/021,282）用于亲本抗体和DVD-结合蛋白克隆。将衍生自pJP183; pHybE-hCg1,z,non-a V2的V1用于克隆具有野生型恒定区的抗体和DVD重链。将衍生自pJP191; pHybE-hCk V3的V2用于克隆具有κ恒定区的抗体和DVD轻链。将衍生自pJP192; pHybE-hCl V2的V3用于克隆具有λ恒定区的抗体和DVD轻链。将用λ信号肽和κ恒定区构建的V4用于克隆具有λ-κ杂种V结构域的DVD轻链。将用κ信号肽和λ恒定区构建的V5用于克隆具有κ-λ杂种V结构域的DVD轻链。将衍生自pJP183; pHybE-hCg1,z,non-a V2的V7用于克隆具有（234,235 AA）突变恒定区的抗体和DVD重链。
[0077] 术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”表示其中已经引入了外源DNA的细胞。这样的术语不仅表示特定的受试细胞，还表示这样的细胞的后代。因为由于突变或者环境影响而造成某些修饰可能在继代中存在，实际上所述后代可能不同于母代细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括原核和真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括、但不限于：原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。
[0078] 术语“转染”包括多种常用于将外源核酸（例如，DNA）引入宿主细胞中的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
[0079] 术语“细胞因子”表示由一个细胞群体释放的蛋白，所述蛋白作为细胞间介质作用于另一个细胞群体。术语“细胞因子”包括得自天然来源的蛋白或得自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物学上有活性的等效物。
[0080] 术语“生物样品”是指得自活物或以前的活物的一定量的物质。这样的物质包括、但不限于：血液、（例如，全血）、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其它细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
[0081] 术语“组分”表示组合物的要素。与诊断试剂盒有关，例如，组分可以是捕获抗体、检测或缀合抗体、对照、校准物、一系列校准物、灵敏度实验对象组（sensitivity panel）、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物（例如作为溶液）、终止液等，其可以被包括在用于测定试验样品的试剂盒中。因而，“组分”可以包括如上的多肽或其它分析物，其被固定化在固体支持物上，例如通过与抗分析物（例如，抗多肽）抗体结合。一些组分可以是在溶液中或者被低压冻干以重构用于测定。
[0082] “对照”表示已知不是分析物（“阴性对照”）或含有分析物（“阳性对照”）的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。“对照”、“阳性对照”和“校准物”可以在本文中互换使用，表示包含已知浓度的分析物的组合物。“阳性对照”可以用于确立测定性能特性，并且是试剂（例如分析物）的完整性的有用指示物。
[0083] “预定截止值”和“预定水平”通常表示测定截止值，其用于通过将测定结果与预定截止值/水平进行对比来评估诊断/预后/治疗效果，其中预定截止值/水平已经与各种临床参数（例如，疾病的严重程度、进展/非进展/改进等）联系或相关。虽然本公开内容可以提供示例性的预定水平，但众所周知，截止值可能随免疫测定的性质（例如，采用的抗体等）而变化。另外，完全在本领域技术人员的一般技能内的是，改进本文公开内容用于其它免疫测定以获得关于那些基于本公开内容的其它免疫测定的免疫测定特异性的截止值。尽管测定之间的预定截止值/水平的精确值可能变化，但本文所述的相关性（如果存在的话）可以是普遍适用的。
[0084] 如在本文所述的诊断测定中所用的，“预处理试剂”，例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是将存在于试验样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物溶解的试剂。如本文进一步所述，不是所有样品都需要预处理。除了别的以外，溶解分析物（例如，目的多肽）可能引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的（不要求分离步骤）或异质的（要求分离步骤）。使用异质性预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤前，从试验样品取出任何沉淀的分析物结合蛋白。
[0085] 在本文所述免疫测定和试剂盒的上下文中，“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照、和灵敏度实验对象组。为了确立校准（标准）曲线以内插分析物如抗体的浓度或分析物，通常使用“校准物”或“标准品”（例如，一种或多种，例如多种）。可替换地，可以使用接近预定阳性/阴性截止值的单个校准物。可以联合使用多种校准物（即，多于一个校准物或不同量的一个或多个校准物），从而构成“灵敏度实验对象组”。
[0086] 术语“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同的分子，它们通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除了抗原和抗体特异性结合以外，其它特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白（或抗生蛋白链菌素）、碳水化合物和凝集素、互补的核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等。另外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性的特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物、片段和变体（包括变体的片段），无论是分离的还是重组产生的。
[0087] 术语“Fc区”定义了免疫球蛋白重链的C-端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域：CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。Fc部分中的改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的（例如，美国专利号5,648,260和5,624,821）。Fc区介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性（ADCC）、吞噬作用、补体依赖性的细胞毒性（CDC）以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在某些情况下，这些效应子功能对于治疗性免疫球蛋白而言是合乎需要的，但在其它情况下可能是不必要的或甚至有害的。
[0088] 术语结合蛋白的“抗原结合部分”是指结合蛋白（例如，抗体）的保留特异性地结合抗原的能力的一个或多个片段。结合蛋白的抗原结合部分可以由全长抗体的片段、以及特异性地结合2种或更多种不同抗原的双特异性形式、双重特异性形式或多特异性形式执行。被包括在术语结合蛋白的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括：（i）Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab’)2片段，即包含2个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，v）dAb片段，其包含单个可变结构域；和（vi）分离的互补性决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由单独的基因编码，使用重组方法用合成的接头可以将它们连接，所述接头使它们成为单个蛋白链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子（被称作单链Fv（scFv））。这样的单链抗体也意图被包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包括单链抗体的其它形式，诸如双体。另外，单链抗体也包括包含一对串联的Fv区段（VH-CH1-VH-CH1）的“线性抗体”，所述Fv区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区域。
[0089] 术语“多价结合蛋白”是指包含2个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在一个实施方案中，所述多价结合蛋白被工程改造成具有3个或更多个抗原结合位点，且不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”表示能够结合2种或更多种有关的或无关的靶标的结合蛋白。在一个实施方案中，本文提供的双重可变结构域（DVD）结合蛋白包含2个或更多个抗原结合位点，且是四价或多价结合蛋白。
[0090] 术语“接头”是指用于连接2个多肽（例如，2个VH结构域或2个VL结构域）的氨基酸残基或包含2个或更多个通过肽键连接的氨基酸残基的多肽。这样的接头多肽是本领域众所周知的（参见，例如，Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448; Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123）。
[0091] 术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语表示氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体的重链和轻链可变区或其抗原结合部分中的其它氨基酸残基更可变（即高变）（Kabat等人(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391和, Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公开号91-3242）。对于重链可变区，高变区范围对于CDR1为氨基酸位置31-35，对于CDR2为氨基酸位置50-65，且对于CDR3为氨基酸位置95-102。对于轻链可变区，高变区范围对于CDR1为氨基酸位置24-34，对于CDR2为氨基酸位置50-56，且对于CDR3为氨基酸位置89-97。
[0092] 术语“CDR”是指在免疫球蛋白可变区序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDR，所述CDR对于每个重链和轻链可变区被命名为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR集合”表示在能够结合抗原的单个可变区中出现的3个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat（Kabat等人(1987)和(1991)）描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且提供了限定3个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事（Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人(1989) Nature 342:877-883）发现，Kabat CDR内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分被命名为L1、L2和L3、或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDR，所述Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。限定与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界已由Padlan (1995) FASEB J.9:133-139和MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45)描述。其它的CDR边界定义可能不严格地遵循本文所述系统之一，但尽管如此仍将与Kabat CDR重叠，尽管考虑到以下预测或实验发现，可以缩短或加长它们：特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任一种限定的CDR，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。
[0093] 术语“表位”是指被结合蛋白结合的抗原的区域，例如，能够特异性地结合免疫球蛋白或T-细胞受体的多肽和/或其它决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子（例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基）的化学活性表面分组（grouping），且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。在一个实施方案中，表位包含抗原（或其片段）的已知结合具体结合配偶体上的互补位点的区域的氨基酸残基。抗原片段可以含有超过一个表位。在某些实施方案中，当结合蛋白识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中的它的靶抗原时，所述结合蛋白特异性地结合抗原。如果抗体交叉竞争（一种抗体阻止另一种抗体的结合或调节作用），那么结合蛋白“结合相同表位”。另外，表位（重叠的、类似的、相同的）的结构定义会提供信息；且功能定义包括结构（结合）和功能（调节、竞争）参数。蛋白的不同区域可能执行不同的功能。例如细胞因子的特定区域与它的细胞因子受体相互作用以实现受体活化，而蛋白的其它区域可能是稳定细胞因子所需要的。为了废除细胞因子信号传递的负面效应，可以用特异性地结合一个或多个受体相互作用区域的结合蛋白靶向细胞因子，由此阻止它的受体的结合。可替换地，结合蛋白可以靶向负责细胞因子稳定的区域，由此指定蛋白进行降解。观察表位识别和将表位识别模型化的方法是本领域技术人员已知的（US 20090311253）。
[0094] “药代动力学”表示生物体吸收、分布、代谢和排泄药物的过程。为了制备具有期望的药代动力学分布的多价结合蛋白分子，选择具有类似地期望的药代动力学分布的亲本单克隆抗体。使用本领域技术人员已知的方法（US 20090311253），可以在啮齿类动物中容易地确定选择的亲本单克隆抗体的PK分布。
[0095] “生物利用度”表示在施用后到达它的靶标的活性药物的量。生物利用度是几种前述特性（包括稳定性、可溶性、免疫原性和药代动力学）的函数，且可以使用本领域技术人员已知的方法来评估（US 20090311253）。
[0096] 术语“表面等离子体共振”是指通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的改变，例如使用BIAcore®系统（BIAcore International AB, GE Healthcare公司, Uppsala, Sweden和Piscataway, NJ），允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见Jönsson等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26。术语“Kon”是指结合蛋白（例如，抗体或DVD-Ig）与抗原结合以形成例如DVD-Ig/抗原复合物的结合速率常数。术语“Kon”也是指在本文中互换使用的“结合速率常数”或“ka”。以下方程式也显示了指示结合蛋白与它的靶抗原的结合速率或者结合蛋白（例如，抗体）和抗原之间的复合物形成速率的该值：。
[0097] 术语“Koff”是指结合蛋白（例如，抗体或DVD-Ig）从例如本领域已知的DVD-Ig/抗原复合物解离的解离速率常数或“解离速率常数”。该值指示结合蛋白（例如，抗体）从它的靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随时间分离成游离的抗体和抗原，如以下方程式所示：。
[0098] 术语“Kd”和“平衡解离常数”是指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数（Koff）除以结合速率常数（Kon）所获得的值。使用结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数来表示结合蛋白（例如，抗体或DVD-Ig）对抗原的结合亲和力。用于确定结合和解离速率常数的方法是本领域众所周知的。使用基于荧光的技术会提供高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。可以使用其它实验方案和仪器例如BIAcore®（生物分子相互作用分析）测定（例如，可以从BIAcore International AB，GE Healthcare公司，Uppsala，瑞典获得的仪器）。另外，也可以使用可以从Sapidyne Instruments（Boise, Idaho）获得的KinExA®（动态排阻测定（Kinetic Exclusion Assay））测定。
[0099] 术语“变体”是指这样的多肽：其通过氨基酸的添加（例如，插入）、缺失或保守置换而在氨基酸序列上不同于给定多肽，但其保留所述给定多肽的生物学活性（例如，变体EGFR抗体可以与抗-EGFR抗体竞争结合EGFR）。氨基酸的保守置换，即将氨基酸用具有相似特性（例如，亲水性和带电区域的程度和分布）的不同氨基酸替换，在本领域中被公认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些微小变化（参见，例如，Kyte等人(1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132）。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以置换蛋白中具有相似亲水指数的氨基酸，并且所述蛋白仍然保持蛋白功能。在一个方面，置换具有±2的亲水指数的氨基酸。也可以使用氨基酸的亲水性来揭示将引起保留生物学功能的蛋白的置换。在肽的上下文中，对氨基酸的亲水性的考虑允许对该肽的最大局部平均亲水性的计算，这是据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用的量度（参见，例如，美国专利号4,554,101）。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的置换可以产生保留生物学活性（例如免疫原性）的肽。在一个方面，用具有彼此在±2以内的亲水性值的氨基酸来实施置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的具体侧链影响。与该观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸置换理解为取决于氨基酸（尤其是那些氨基酸的侧链）的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性所揭示的。术语“变体”也包括已经经过不同加工（例如，通过蛋白酶解、磷酸化或其它翻译后修饰）而仍然保留其生物学活性或抗原反应性（例如，结合EGFR的能力）的多肽或其片段。除非另外定义，否则术语“变体”包括变体的片段。变体可以与野生型序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%同一性。
[0100] I. 结合蛋白的制备提供了能够结合相同受体的2种不同的（例如，不重叠的）表位或在相同细胞上表达的
2种不同受体的结合蛋白和制备它们的方法。使用多种技术，可以制备结合蛋白。提供了用于制备结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法，且它们是本领域众所周知的。
2种不同受体的结合蛋白和制备它们的方法。使用多种技术，可以制备结合蛋白。提供了用于制备结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法，且它们是本领域众所周知的。
[0101] A. 亲本单克隆抗体的制备DVD结合蛋白的可变结构域可以得自亲本抗体，包括能够结合目标抗原的多克隆Ab和mAb。这些抗体可以是天然存在的，或者可以通过重组技术制备。本领域普通技术人员熟知许多用于生产抗体的方法，包括、但不限于：使用杂交瘤技术，选择的淋巴细胞抗体方法（SLAM），使用噬菌体、酵母或RNA-蛋白融合体展示或其它文库，免疫包含至少一些人免疫球蛋白基因座的非人动物，和制备嵌合抗体、CDR移植抗体和人源化抗体。参见，例如，美国专利公开号20090311253 A1。使用亲和力成熟技术也可以制备可变结构域。
[0102] B. 选择亲本单克隆抗体的标准提供了一个实施方案，其包括选择具有至少一种或多种在DVD结合蛋白分子中期望的特性的亲本抗体。在一个实施方案中，期望的特性是一种或多种抗体参数，例如，抗原特异性、对抗原的亲和力、效价、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、或直系同源抗原结合。参见，例如，美国专利公开号20090311253。
[0103] C. 结合蛋白分子的构建可以设计结合蛋白，使得来自2种不同亲本单克隆抗体的2个不同轻链可变结构域
（VL）通过重组DNA技术直接或经由接头串联连接，随后为轻链恒定结构域CL。类似地，重链包含直接地或经由接头串联连接的2个不同重链可变结构域（VH），随后为恒定结构域CH1和Fc区（图1A）。
（VL）通过重组DNA技术直接或经由接头串联连接，随后为轻链恒定结构域CL。类似地，重链包含直接地或经由接头串联连接的2个不同重链可变结构域（VH），随后为恒定结构域CH1和Fc区（图1A）。
[0104] 可变结构域可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗体通过本文所述方法中的任何一种生成。在一个实施方案中，所述可变结构域是鼠重链或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，所述可变结构域是CDR移植的或人源化的可变重链或轻链结构域。
在一个实施方案中，所述可变结构域是人重链或轻链可变结构域。
在一个实施方案中，所述可变结构域是人重链或轻链可变结构域。
[0105] 所述接头序列可以是单个氨基酸或多肽序列。在一个实施方案中，接头序列的选择是基于几种Fab分子的晶体结构分析。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性连接。这种天然连接包含大约10-12氨基酸残基，由来自V结构域的C-端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N-端的4-6个残基促成。使用CL或CH1的N-端5-6氨基酸残基或11-12氨基酸残基分别作为轻链和重链中的接头，制备DVD结合蛋白。CL或CH1结构域的N-端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，可以采取没有强二级结构的环构象，因此可以充当2个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N-端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是Ig序列的部分，因此它们的应用会使可能由接头和接点引起的任何免疫原性大程度地最小化。
[0106] 在重链、轻链、2个链或4个链实施方案中的任一个的另一个实施方案中，包括至少一个接头，所述接头包括：或
或基于G/S的序列（例如，G4S重复; SEQ ID NO: 29）。在一个实施
方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。
或基于G/S的序列（例如，G4S重复; SEQ ID NO: 29）。在一个实施
方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。
[0107] 其它接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基；轻链接头可以来自Cκ或Cλ；且重链接头可以来源于任何同种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cµ。接头序列还可以来源于其它蛋白例如Ig样蛋白（例如，TCR、FcR、KIR）；基于G/S的序列（例如，G4S重复; SEQ ID NO: 29）；铰链区衍生的序列；和来自其它蛋白的其它天然序列。
[0108] 在一个实施方案中，使用重组DNA技术使恒定结构域与2个连接的可变结构域连接。在一个实施方案中，将包含连接的重链可变结构域的序列与重链恒定结构域连接，且将包含连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域连接。在一个实施方案中，所述恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施方案中，DVD重链进一步与Fc区连接。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
[0109] 在另一个实施方案中，将2个重链DVD多肽和2个轻链DVD多肽组合以形成DVD结合蛋白。表1列出了可用于治疗疾病的示例性抗体的VH和VL区域的氨基酸序列。在一个实施方案中，提供了这样的DVD：其包含处于任意取向的、在表1中列出的至少2个VH和/或VL区域。在某些实施方案中，独立地选择VD1和VD2。因此，在某些实施方案中，VD1和VD2包含相同的SEQ ID NO，且在其它实施方案中，VD1和VD2包含不同的SEQ ID NO。下面提供的VH和VL结构域序列包含本领域已知的或使用本领域已知的方法可容易地辨别的互补性决定区（CDR）和框架序列。在某些实施方案中，这些CDR和/或框架序列中的一个或多个没有功能损失地被得自本领域已知会结合相同抗原的结合蛋白的其它CDR和/或框架序列替代。
[0110] 在下文实施例部分中提供了能够结合特定靶标的特异性DVD结合蛋白的详细描述及其制备方法。
[0111] D. 结合蛋白的生产本文提供的结合蛋白可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种来生产。例如，来自宿主细胞的表达，其中通过标准技术将编码DVD重链和DVD轻链的一个或多个表达载体转染到宿主细胞内。尽管在原核或真核宿主细胞中都可能表达本文提供的DVD结合蛋白，但是在真核细胞（例如，哺乳动物宿主细胞）中表达DVD结合蛋白，因为此种真核细胞（且特别是哺乳动物细胞）比原核细胞更可能装配和分泌适当地折叠的和免疫学上有活性的DVD结合蛋白。
[0112] 在用于重组表达DVD蛋白的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码DVD重链和DVD轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，将DVD重链和轻链基因各自可操作地连接到CMV增强子/AdMLP启动子调节元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达DVD重链和轻链，且从培养基中回收完整的DVD蛋白。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收DVD蛋白。本文提供了合成DVD蛋白的方法，所述方法包括：在合适的培养基中培养本文提供的宿主细胞，直至DVD蛋白被合成。该方法可以另外包括从培养基中分离DVD蛋白。
[0113] DVD结合蛋白的一个重要特征是，它可以以与常规抗体相似的方式生产和纯化。DVD结合蛋白的生产会产生具有所需双重特异性活性的均质、单一的主要产物，无需恒定区的任何序列修饰或化学修饰。其它先前描述的制备“双特异性的”、“多特异性的”和“多特异性的多价的”全长结合蛋白的方法可以导致装配的无活性的、单特异性的、多特异性的、多价的、全长结合蛋白和多价全长结合蛋白（其具有不同结合位点的组合）的混合物的细胞内生产或分泌性生产。
[0114] 令人惊讶的是，本文中提供的“双特异性的多价全长结合蛋白”的设计会导致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，它们主要装配成期望的“双特异性的多价全长结合蛋白”。
[0115] 至少50%、至少75%和至少90%的装配的且表达的双重可变结构域免疫球蛋白分子是期望的双特异性的四价蛋白，且因此具有增强的商业实用性。因而，提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链从而导致“双特异性的四价全长结合蛋白”的单一主要产物的方法。
[0116] 提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链从而导致“双特异性的四价全长结合蛋白”的“主要产物”的方法，其中“主要产物”占所有装配的蛋白的超过50%，诸如超过75%和超过90%，其包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
[0117] II. 结合蛋白的用途鉴于它们的与2种或更多抗原结合的能力，本文提供的结合蛋白可以用于检测抗原（例如，在生物样品诸如血清或血浆中），其中使用常规免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）或组织免疫组织化学。结合蛋白用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰基氯或藻红蛋白；发光材料的一个例子是鲁米诺，且合适放射性材料的例子包
3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
括 H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho和 Sm。
3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
括 H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho和 Sm。
[0118] 在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白能够在体外和在体内中和它们的抗原靶标的活性。因此，此种结合蛋白可以用于抑制抗原活性，例如，在包含抗原的细胞培养物中、在人对象中或在具有本文提供的结合蛋白可与其交叉反应的抗原的其它哺乳动物对象中。在另一个实施方案中，提供了用于减少对象中的抗原活性的方法，所述对象患有其中抗原活性是有害的疾病或障碍。可以将本文提供的结合蛋白施用给人对象用于治疗目的。
[0119] 术语“其中抗原活性是有害的障碍”意图包括这样的疾病和其它障碍：其中抗原在患有该障碍的对象中的存在已被证实和或疑似负责该障碍的病理生理学或者是促进该障碍的恶化的因素。因此，其中抗原活性是有害的障碍是其中预期抗原活性的减少会减轻该障碍的症状和/或进展的障碍。此种障碍可以例如由患有该障碍的对象的生物流体中抗原浓度的增加（例如，对象的血清、血浆、滑液等中的抗原浓度的增加）来证实。可以用本文提供的结合蛋白治疗的障碍的非限制性例子包括在下面以及在关于包含结合蛋白的药物组合物的部分中讨论的那些障碍。
[0120] DVD结合蛋白可用作治疗剂以同时阻断2种不同靶标，从而增强效力/安全性和/或增加患者覆盖度。
[0121] 另外，本文提供的DVD结合蛋白可以用于组织特异性递送（靶向组织标记和疾病介质用于增强局部PK，从而达到较高的功效和/或较低的毒性），包括细胞内递送（靶向内化受体和细胞内分子），递送至脑内（靶向转铁蛋白受体和CNS疾病介质用于穿过血脑屏障）。DVD结合蛋白也可以充当载体蛋白，以经由与该抗原的非中和性表位结合而将抗原递送至特定位置，并且也增加抗原的半衰期。此外，可以将DVD结合蛋白设计成与植入患者内的医疗装置物理上连接，或靶向这些医疗装置（参见Burke等人(2006)Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand等人(2006) Surface and Coatings Technol.200(22-23): 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467; Mediation of the cytokine network in theimplantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397）。简而言之，将适当类型的细胞导向医学植入物部位可以促进愈合和恢复正常组织功能。可替代地，也提供了通过偶联或靶向装置的DVD的装置植入后释放的介质（包括但不限于细胞因子）的抑制。
[0122] A. 结合蛋白在不同疾病中的用途本文提供的结合蛋白分子可用作治疗分子来治疗多种疾病，例如，其中被所述结合蛋白识别的靶标是有害的。这样的结合蛋白可以结合在特定疾病中涉及的一种或多种靶标。
还已经证实，EGFR、RON、IGF-1R、Erb-B3和/或HER2的抑制会在动物模型中增强抗肿瘤治疗，且可以在原发性和转移性癌症的治疗中是有益的。
还已经证实，EGFR、RON、IGF-1R、Erb-B3和/或HER2的抑制会在动物模型中增强抗肿瘤治疗，且可以在原发性和转移性癌症的治疗中是有益的。
[0123] 不限制本公开内容，提供了关于某些疾病状况的其它信息。
[0124] 1. 人自身免疫和炎症应答跨膜受体已经涉入一般的自身免疫和炎症应答，包括、例如，哮喘、变态反应、变应性肺病、变应性鼻炎、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、纤维化、囊性纤维化（CF）、纤维化肺病、特发性肺纤维化、肝纤维化、狼疮、乙型肝炎相关的肝疾病和纤维化、脓毒病、系统性红斑狼疮（SLE）、肾小球肾炎、炎症性的皮肤疾病、银屑病、糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、炎性肠病（IBD）、溃疡性结肠炎（UC）、克罗恩氏病（CD）、类风湿性关节炎（RA）、骨关节炎（OA）、多发性硬化（MS）、移植物抗宿主病（GVHD）、移植排斥、缺血性心脏病（IHD）、乳糜泻、接触性超敏反应、酒精性肝病、贝切特氏病、动脉粥样硬化性血管疾病、眼的表面炎性疾病或莱姆病。
[0125] 本文提供的结合蛋白可以用于治疗神经障碍。在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分被用于治疗神经变性疾病以及涉及神经元再生和脊髓损伤的病症。
[0126] 2. 哮喘变应性哮喘的特征在于存在嗜曙红细胞增多、杯形细胞组织转化、上皮细胞改变、气道高反应性（AHR）、和Th2和Th1细胞因子表达、以及升高的血清IgE水平。皮质类固醇是目前用于哮喘的最重要抗炎治疗，但是，它们的作用机理是非特异性的，且存在安全性担忧，尤其是在青少年患者群体中。因此更特异性的和靶向的疗法的开发是有正当理由的。
[0127] 动物模型诸如OVA诱导的哮喘小鼠模型（可以在其中评估炎症和AHR）是本领域已知的，且可以用于确定各种结合蛋白分子的治疗哮喘的能力。用于研究哮喘的动物模型公开在以下文献中：Coffman, 等人(2005) J. Exp. Med. 201(12):1875-1879; Lloyd等人(2001) Adv. Immunol. 77: 263-295; Boyce等人(2005) J. Exp. Med.201(12):1869-1873；和Snibson等人(2005) J. Brit. Soc. Allergy Clin. Immunol.
35(2):146-52。除了这些靶标对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性试验在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的（参见Luster等人(1994) Toxicol.
92(1-3):229-43; Descotes等人(1992) Dev. Biol. Standard. 77:99-102; Hart等人(2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108(2):250-257）。
35(2):146-52。除了这些靶标对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性试验在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的（参见Luster等人(1994) Toxicol.
92(1-3):229-43; Descotes等人(1992) Dev. Biol. Standard. 77:99-102; Hart等人(2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108(2):250-257）。
[0128] 3. 类风湿性关节炎类风湿性关节炎（RA，一种全身性疾病）的特征在于关节滑膜中的慢性炎症反应，且与软骨变性和近关节骨的侵蚀有关。许多促炎细胞因子、趋化因子和生长因子在患病关节中表达。使用临床前动物RA模型诸如胶原诱导的关节炎小鼠模型，可以评估结合蛋白分子是否可用于治疗类风湿性关节炎。其它有用的模型也是本领域众所周知的（参见Brand (2005) Comp. Med. 55(2):114-22）。基于亲本抗体对人和小鼠直系同源物的交叉反应性（例如，对人和小鼠TNF、人和小鼠IL-15等的反应性），可以用“匹配的替代抗体”衍生的结合蛋白分子进行在小鼠CIA模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上将基于两个（或更多个）小鼠靶标特异性抗体的结合蛋白与用于人结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配（例如，相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等）。
[0129] 4.系统性红斑狼疮（SLE）SLE的免疫病原性标志是多克隆B细胞活化，这导致血球蛋白过多症、自身抗体产生和免疫复合物形成。基于亲本抗体对人和小鼠直系同源物的交叉反应性（例如，对人和小鼠CD20、人和小鼠干扰素α等的反应性），可以用“匹配的替代抗体”衍生的结合蛋白分子进行在小鼠狼疮模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上将基于两个（或更多个）小鼠靶标特异性抗体的结合蛋白与用于人结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配（例如，相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等）。
[0130] 5. 多发性硬化多发性硬化（MS）是具有主要未知病因的复杂人自身免疫型疾病。遍及神经系统的髓磷脂碱蛋白（MBP）的免疫学破坏是多发性硬化的主要病理学。主要考虑是促成自身免疫发展的免疫学机制。具体地，抗原表达、细胞因子和白细胞相互作用、以及帮助平衡/调节其它T细胞的调节性T-细胞（诸如Th1和Th2细胞）是治疗靶标鉴定的重要领域。用于评估结合蛋白的治疗MS的有用性的几种动物模型是本领域已知的（参见Steinman等人 (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin 等 人(1985) Springer Semin. Immunopathol.8(3):197-208; Genain 等 人 (1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97; Tuohy等人(1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42; Owens等人(1995)Neurol. Clin.
13(1):51-73；和Hart等人(2005) J. Immunol. 175(7):4761-8）。基于亲本抗体对人和动物物种直系同源物的交叉反应性，可以用“匹配的替代抗体”衍生的结合蛋白分子进行在小鼠EAE模型中的验证研究。简而言之，可以在可能的程度上将基于两个（或更多个）小鼠靶标特异性抗体的结合蛋白与用于人结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配（例如，相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等）。将同样的概念应用于其它非啮齿类动物物种中的动物模型，其中将选择“匹配的替代抗体”衍生的结合蛋白用于预期的药理学和可能的安全性研究。除了这些靶标对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性试验在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的（参见Luster等人(1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes等人(1992) Devel. Biol. Standard.
77: 99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6）。
13(1):51-73；和Hart等人(2005) J. Immunol. 175(7):4761-8）。基于亲本抗体对人和动物物种直系同源物的交叉反应性，可以用“匹配的替代抗体”衍生的结合蛋白分子进行在小鼠EAE模型中的验证研究。简而言之，可以在可能的程度上将基于两个（或更多个）小鼠靶标特异性抗体的结合蛋白与用于人结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配（例如，相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等）。将同样的概念应用于其它非啮齿类动物物种中的动物模型，其中将选择“匹配的替代抗体”衍生的结合蛋白用于预期的药理学和可能的安全性研究。除了这些靶标对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性试验在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的（参见Luster等人(1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes等人(1992) Devel. Biol. Standard.
77: 99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6）。
[0131] 6. 脓毒病压倒性的炎症应答和免疫应答是脓毒性休克的基本特征，且在由脓毒病诱导的组织损伤、多器官功能衰竭和死亡的发病机理中起重要作用。已经证实细胞因子是脓毒性休克的介质。这些细胞因子对组织具有直接的毒性作用；它们还激活磷脂酶A2。一个实施方案涉及能够结合在脓毒病中涉及的一种或多种靶标的结合蛋白。可以在本领域已知的临床前动物模型中评估这样的结合蛋白用于治疗脓毒病的效力（参见Buras等人(2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10):854-65和Calandra等人(2000) Nat. Med. 6(2):164-70）。
[0132] 7. 神经障碍a. 神经变性疾病
神经变性疾病是慢性的（在这种情况中其通常是年龄依赖性的）或急性的（例如，中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤等）。其特征在于神经元功能的渐进性丧失（例如，神经元细胞死亡、轴突丧失、神经炎的营养不良、脱髓鞘），活动度丧失和记忆丧失。这些慢性神经变性疾病代表多种细胞类型和介质之间的复杂相互作用。关于此种疾病的治疗策略是有限的，且主要构成用非特异性抗炎剂（例如，皮质类固醇、COX抑制剂）或试剂阻断炎症性过程，以阻止神经元丧失和/或突触功能。这些治疗不能阻止疾病进展。靶向超过一种疾病介质的特异性疗法，可以提供比使用靶向单一疾病机制时观察到的甚至更好的对慢性神经变性疾病的治疗效果（参见Deane等人(2003) Nature Med. 9:907-13；和Masliah等人(2005) Neuron. 46:857）。
神经变性疾病是慢性的（在这种情况中其通常是年龄依赖性的）或急性的（例如，中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤等）。其特征在于神经元功能的渐进性丧失（例如，神经元细胞死亡、轴突丧失、神经炎的营养不良、脱髓鞘），活动度丧失和记忆丧失。这些慢性神经变性疾病代表多种细胞类型和介质之间的复杂相互作用。关于此种疾病的治疗策略是有限的，且主要构成用非特异性抗炎剂（例如，皮质类固醇、COX抑制剂）或试剂阻断炎症性过程，以阻止神经元丧失和/或突触功能。这些治疗不能阻止疾病进展。靶向超过一种疾病介质的特异性疗法，可以提供比使用靶向单一疾病机制时观察到的甚至更好的对慢性神经变性疾病的治疗效果（参见Deane等人(2003) Nature Med. 9:907-13；和Masliah等人(2005) Neuron. 46:857）。
[0133] 本文中提供的结合蛋白分子可以结合在慢性神经变性疾病（例如阿尔茨海默病）中涉及的一种或多种靶标。在临床前动物模型（例如过表达淀粉样蛋白前体蛋白或RAGE且发展阿尔茨海默氏病样症状的转基因小鼠）中，可以验证结合蛋白分子的效力。此外，可以构建结合蛋白分子并在动物模型中测试效力，并且可以选择最佳的治疗性结合蛋白用于在人患者中试验。结合蛋白分子还可以用于治疗神经变性疾病诸如帕金森病。
[0134] b. 神经元再生和脊髓损伤尽管发病机制的知识增加，但脊髓损伤（SCI）仍是破坏性病症且代表特征在于高医学需要的医学适应症。大多数脊髓损伤是挫伤或压迫损伤，并且原发性损伤通常跟随着继发性损伤机制（炎症介质例如细胞因子和趋化因子），所述继发性损伤机制使最初的损伤恶化且导致损害区域的显著放大，有时超过10倍。在脊髓损伤的临床前动物模型中可以验证结合蛋白分子的效力。此外，可以构建这些结合蛋白分子并在动物模型中测试效力，并且可以选择最佳的治疗性结合蛋白用于在人患者中试验。一般而言，抗体不以有效和相关方式穿过血脑屏障（BBB）。但是，在某些神经学疾病（例如，中风、创伤性脑损伤、多发性硬化等）中，BBB可能受损，并允许增加的结合蛋白和抗体向脑内的渗透。在其它不发生BBB渗漏的神经学病症中，可以采用内源性运输系统的靶向，包括在BBB的血管内皮处的载体介导的转运蛋白（诸如葡萄糖和氨基酸载体）和受体介导的胞吞转运作用介导的细胞结构/受体，从而使得能够进行结合蛋白的跨BBB运输。在BBB处能够进行此种运输的结构包括、但不限于：胰岛素受体、转铁蛋白受体、LRP和RAGE。另外，策略也使得能够将结合蛋白用作将潜在药物运输进CNS中的穿梭物，所述潜在药物包括低分子量药物、纳米颗粒和核酸（Coloma等人(2000) Pharm Res. 17(3):266-74; Boado等人(2007) Bioconjug. Chem.
18(2):447-55）。
18(2):447-55）。
[0135] 8. 肿瘤学障碍单克隆抗体治疗已经作为癌症的重要治疗模态出现（von Mehren等人（2003）Annu. Rev. Med. 54:343-69）。与单特异性治疗相比，靶向2种单独肿瘤介质的双特异性抗体的使用将可能产生额外利益。
[0136] 在一个实施方案中，可以用本文提供的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括、但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道（包括肾、膀胱和尿道上皮）、女性生殖道（包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病）、男性生殖道（包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤）、内分泌腺（包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体）和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤（包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤），脑、神经、眼和脑膜（包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、许旺细胞瘤和脑膜瘤）的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤（霍奇金与非霍奇金淋巴瘤）产生的实体瘤。
[0137] 在一个实施方案中，在单独使用或与放射疗法和/或其它化学治疗剂联合使用时，将本文提供的抗体或其抗原结合部分用于治疗癌症、或用于预防本文所述肿瘤的转移。
[0138] 9. 基因治疗在一个具体实施方案中，通过基因治疗施用编码本文提供的结合蛋白或本文提供的另一种预防或治疗剂的核酸序列来治疗、预防、控制或改善障碍或其一种或多种症状。基因治疗表示通过给对象施用表达的或可表达的核酸而执行的疗法。在该实施方案中，所述核酸产生它们的编码的抗体或本文中提供的介导预防或治疗效果的预防或治疗剂。
[0139] 用于在本领域中可利用的基因治疗的任意方法可以用在本文提供的方法中。关于基因治疗的方法的一般综述，参见Goldspiel等人(1993) Clin. Pharmacy 12:488-505; Wu 和 Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926- 932; Morgan和Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；和May (1993) TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的本领域通常已知的重组DNA技术的方法描述在：Ausubel等人(编), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993)；和Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)。在美国专利公开号US20050042664中公开了不同基因治疗方法的详细描述。
[0140] III. 药物组合物提供了药物组合物，其包含单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的一种或多种结合蛋白。包含本文提供的结合蛋白的药物组合物被用于但不限于，诊断、检测、或监测障碍，用于预防、治疗、控制或改善障碍或其一种或多种症状，和/或用在研究中。单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的药物组合物的制剂是本领域技术人员已知的（美国专利公开号20090311253 A1）。
[0141] 施用本文提供的预防或治疗剂的方法包括、但不限于：胃肠外施用（例如，真皮内施用、肌肉内施用、腹膜内施用、静脉内施用和皮下施用）、硬膜外施用、肿瘤内施用、粘膜施用（例如，鼻内和口腔途径）和肺施用（例如，用吸入器或喷雾器施用的气雾化的化合物）。本领域技术人员可得到且已知用于特定施用途径的药物组合物制剂以及各种施用方法所需的材料和技术（美国专利公开号20090311253 A1）。
[0142] 可以调整剂量方案以提供最适期望的应答（例如，治疗或预防应答）。例如，可施用单次大剂量递送，可随时间施用几个分份剂量，或可根据治疗形势的急迫性所指示而按比例降低或提高所述剂量。为了易于施用和剂量一致，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的。术语“剂量单位形式”表示指适合作为单位剂量用于待治疗的哺乳动物对象的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药用载体组合的经计算会产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。关于本文提供的剂量单位形式的规范取决于且直接依赖于：（a）活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗或预防效果，和（b）配制这样的活性化合物以治疗个体的敏感性的本领域的固有限制。
[0143] 本文提供的结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性的、非限制性的范围是0.1-20 mg/kg，例如，1-10 mg/kg。应当指出，剂量值可以随待减轻的病症的类型和严重程度而变化。进一步应当理解，对于任何特定对象，根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人的专业判断，可以随时间调整具体剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅仅是示例性的，且无意限制要求保护的组合物的范围或实践。
[0144] IV. 联合治疗本文提供的结合蛋白也可以与一种或多种可用于治疗不同疾病的额外治疗剂一起施用，所述额外试剂由技术人员为它的预期目的来选择。例如，所述额外试剂可以是本领域认可的治疗剂，如可用于治疗由本文提供的抗体治疗的疾病或病症。所述组合还可以包括超过一种额外试剂，例如，2种或3种额外试剂。
[0145] 联合治疗试剂包括、但不限于：抗肿瘤剂、放射疗法、化学疗法诸如DNA烷化剂、顺铂、卡铂、抗-微管蛋白试剂、紫杉醇、多西他赛、泰素、多柔比星、吉西他滨、健择、蒽环类抗生素、阿霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶（5-FU）、亚叶酸、伊立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂（例如，厄洛替尼、吉非替尼）、COX-2抑制剂（例如，塞来考昔）、激酶抑制剂和siRNA。
[0146] 可以与本文提供的结合蛋白组合的化学治疗剂的非限制性例子包括以下的：13-顺式-视黄酸；2-CdA；2-氯脱氧腺苷；5-阿扎胞苷；5-氟尿嘧啶；5-FU；6-巯基嘌呤；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤；注射用紫杉醇；Accutane®；放线菌素-D；阿霉素；
Adrucil®；Afinitor®；Agrylin®；Ala-Cort®；阿地白介素；阿仑珠单抗；力比泰；阿利维A酸；Alkaban-AQ®；爱克兰；全反式视黄酸；α干扰素；六甲蜜胺；甲氨蝶呤；氨磷汀；氨鲁米特；阿那格雷；尼鲁米特；阿那曲唑；阿糖胞嘧啶；Ara-C Aranesp®；阿可达；瑞宁得；阿诺新；Arranon®；三氧化二砷；ArzerraATRA；阿伐他汀；阿扎胞苷；卡介苗；BCNU；苯达莫司汀；贝伐珠单抗；贝沙罗汀；BEXXAR®；比卡鲁胺；BiCNU；硫酸博来霉素；博来霉素；硼替佐米；白消安；白舒非；C225；亚叶酸钙；Campath®；Camptosar®；喜树碱-11；卡培他滨；e Carac；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；红卫霉素；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；
噬橙菌因子；克拉屈滨；可的松；更生霉素；CPT-11；环磷酰胺；氨鲁米特；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；Cytosar-U®；环磷酰胺；达卡巴嗪；Dacogen；更生霉素；达促红素α；达沙替尼；道诺霉素；柔红霉素；盐酸柔红霉素；柔红霉素脂质体；DaunoXome®；地卡特隆；地西他滨；泼尼松龙；Deltasone®；地尼白介素；Diftitox；DepoCytDexasone；右丙亚胺；DHAD；
DIC；Diodex；多西他赛；Doxil®；多柔比星；多柔比星脂质体；DroxiaDTIC；DTIC-Dome®；
Duralone®；Efudex®；醋酸亮丙瑞林™；盐酸表柔比星™；Eloxatin；Emcyt®；表柔比星；促红素α；爱必妥；厄洛替尼；欧文氏菌属L-天门冬酰胺酶；雌莫司汀；阿密磷定；凡毕复；依托泊苷；磷酸依托泊苷；Eulexin®；依维莫司；易维特；依西美坦；法乐通；Faslodex®；弗隆；非格司亭；氟尿苷；福达华；氟达拉滨；Fluoroplex®；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶（乳膏剂）；氟甲睾酮；氟他胺；亚叶酸；FUDR®；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥珠单抗奥加米星；健择；格列卫™；Gliadel®糯米纸囊剂；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）；
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（G-MCSF）；Halotestin®；赫赛汀；地塞米松；克瘤灵；六甲蜜胺；HMM；和美新；羟基脲；Hydrocort Acetate®；氢化可的松；氢化可的松磷酸钠；氢化可的松琥珀酸钠；磷酸氢化可的松；羟基脲；替伊莫单抗；替伊莫单抗；依达比星；Idarubicin Ifex®；干扰素-α；干扰素-α-2b（PEG缀合物）；异环磷酰胺；白介素-11（IL-11）；白介素-2（IL-2）；甲磺酸伊马替尼；咪唑羧酰胺；甘乐能；易瑞沙；伊立替康；异维A酸；伊沙匹隆；IxempraKidrolase（t）Lanacort®；拉帕替尼；L-天门冬酰胺酶；LCR；来那度胺；
来曲唑；亚叶酸；留可然；LeukineLiquid Pred®；洛莫司汀；L-PAM；L-沙可来新；醋酸亮丙瑞林；醋酸亮丙瑞林贮库；甲苯肼；Maxidex；氮芥；盐酸氮芥；Medralone®；美卓乐；梅格施；甲地孕酮；乙酸甲地孕酮；美法仑；巯嘌呤；美司钠；MesnexMeticorten®；丝裂霉素；丝裂霉素-C；Mitoxantrone M-Prednisol®；MTC；MTX；氮芥；氮芥；突变霉素；马利兰；
Mylocel；诺维本；奈拉滨；Neosar®；NeulastaNeumega®；优保津；多吉美；Nilandron®；尼洛替尼；尼鲁米特；Nipent®；Nitrogen Mustard Novaldex®；诺肖林；Nplate；奥曲肽；醋酸奥曲肽；奥法木单抗；Oncospar®；安可平；Ontak®；OnxalOrapred®；Orasone®；奥沙利铂；紫杉醇；结合蛋白的紫杉醇；帕米膦酸盐；帕木单抗；Panretin®；伯尔定；帕唑帕尼；
Pediapred®；PEG干扰素；培门冬酶；培非司亭；佩乐能™；PEG-L-天门冬酰胺酶；培美曲塞；
喷司他丁；苯丙氨酸芥；顺氯氨铂；顺氯氨铂-AQ®；泼尼松龙；泼尼松；Prelone®；丙卡巴肼；PROCRIT®；阿地白介素；具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20；巯基嘌呤；雷洛昔芬；Revlimid®；Rheumatrex®；Rituxan®；利妥昔单抗；罗荛愫；罗米司亭；Rubex®；盐酸红比霉素；善宁；善龙；沙格司亭；Solu-Cortef®；甲强龙；索拉非尼；SPRYCELSTI-571；链佐星；SU11248；舒尼替尼；索坦；Tamoxifen Tarceva®；Targretin®；Tasigna®；泰素；泰索帝；Temodar®；替莫唑胺坦罗莫司；替尼泊苷；塞替派；沙利度胺；Thalomid®；TheraCys®；
硫鸟嘌呤；硫鸟嘌呤片剂；Thiophosphoamide；Thioplex®；塞替派；TICE®；拓扑杀；托泊替康；托瑞米芬；Torisel®；托西莫单抗；曲妥珠单抗；Treanda®；维A酸；TrexallTrisenox®；
TSPA；TYKERB®；VCR；VectibixVelban®；万珂；凡毕士；Vesanoid®；ViadurVidaza®；长春碱；硫酸长春碱；Vincasar Pfs®；长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏林司他；Votrient；VP-16；卫萌；希罗达；Zanosar®；泽娃灵™；右雷佐生；诺雷德；唑来膦酸；
Zolinza；或择泰。
Adrucil®；Afinitor®；Agrylin®；Ala-Cort®；阿地白介素；阿仑珠单抗；力比泰；阿利维A酸；Alkaban-AQ®；爱克兰；全反式视黄酸；α干扰素；六甲蜜胺；甲氨蝶呤；氨磷汀；氨鲁米特；阿那格雷；尼鲁米特；阿那曲唑；阿糖胞嘧啶；Ara-C Aranesp®；阿可达；瑞宁得；阿诺新；Arranon®；三氧化二砷；ArzerraATRA；阿伐他汀；阿扎胞苷；卡介苗；BCNU；苯达莫司汀；贝伐珠单抗；贝沙罗汀；BEXXAR®；比卡鲁胺；BiCNU；硫酸博来霉素；博来霉素；硼替佐米；白消安；白舒非；C225；亚叶酸钙；Campath®；Camptosar®；喜树碱-11；卡培他滨；e Carac；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；红卫霉素；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；
噬橙菌因子；克拉屈滨；可的松；更生霉素；CPT-11；环磷酰胺；氨鲁米特；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；Cytosar-U®；环磷酰胺；达卡巴嗪；Dacogen；更生霉素；达促红素α；达沙替尼；道诺霉素；柔红霉素；盐酸柔红霉素；柔红霉素脂质体；DaunoXome®；地卡特隆；地西他滨；泼尼松龙；Deltasone®；地尼白介素；Diftitox；DepoCytDexasone；右丙亚胺；DHAD；
DIC；Diodex；多西他赛；Doxil®；多柔比星；多柔比星脂质体；DroxiaDTIC；DTIC-Dome®；
Duralone®；Efudex®；醋酸亮丙瑞林™；盐酸表柔比星™；Eloxatin；Emcyt®；表柔比星；促红素α；爱必妥；厄洛替尼；欧文氏菌属L-天门冬酰胺酶；雌莫司汀；阿密磷定；凡毕复；依托泊苷；磷酸依托泊苷；Eulexin®；依维莫司；易维特；依西美坦；法乐通；Faslodex®；弗隆；非格司亭；氟尿苷；福达华；氟达拉滨；Fluoroplex®；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶（乳膏剂）；氟甲睾酮；氟他胺；亚叶酸；FUDR®；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥珠单抗奥加米星；健择；格列卫™；Gliadel®糯米纸囊剂；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）；
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（G-MCSF）；Halotestin®；赫赛汀；地塞米松；克瘤灵；六甲蜜胺；HMM；和美新；羟基脲；Hydrocort Acetate®；氢化可的松；氢化可的松磷酸钠；氢化可的松琥珀酸钠；磷酸氢化可的松；羟基脲；替伊莫单抗；替伊莫单抗；依达比星；Idarubicin Ifex®；干扰素-α；干扰素-α-2b（PEG缀合物）；异环磷酰胺；白介素-11（IL-11）；白介素-2（IL-2）；甲磺酸伊马替尼；咪唑羧酰胺；甘乐能；易瑞沙；伊立替康；异维A酸；伊沙匹隆；IxempraKidrolase（t）Lanacort®；拉帕替尼；L-天门冬酰胺酶；LCR；来那度胺；
来曲唑；亚叶酸；留可然；LeukineLiquid Pred®；洛莫司汀；L-PAM；L-沙可来新；醋酸亮丙瑞林；醋酸亮丙瑞林贮库；甲苯肼；Maxidex；氮芥；盐酸氮芥；Medralone®；美卓乐；梅格施；甲地孕酮；乙酸甲地孕酮；美法仑；巯嘌呤；美司钠；MesnexMeticorten®；丝裂霉素；丝裂霉素-C；Mitoxantrone M-Prednisol®；MTC；MTX；氮芥；氮芥；突变霉素；马利兰；
Mylocel；诺维本；奈拉滨；Neosar®；NeulastaNeumega®；优保津；多吉美；Nilandron®；尼洛替尼；尼鲁米特；Nipent®；Nitrogen Mustard Novaldex®；诺肖林；Nplate；奥曲肽；醋酸奥曲肽；奥法木单抗；Oncospar®；安可平；Ontak®；OnxalOrapred®；Orasone®；奥沙利铂；紫杉醇；结合蛋白的紫杉醇；帕米膦酸盐；帕木单抗；Panretin®；伯尔定；帕唑帕尼；
Pediapred®；PEG干扰素；培门冬酶；培非司亭；佩乐能™；PEG-L-天门冬酰胺酶；培美曲塞；
喷司他丁；苯丙氨酸芥；顺氯氨铂；顺氯氨铂-AQ®；泼尼松龙；泼尼松；Prelone®；丙卡巴肼；PROCRIT®；阿地白介素；具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20；巯基嘌呤；雷洛昔芬；Revlimid®；Rheumatrex®；Rituxan®；利妥昔单抗；罗荛愫；罗米司亭；Rubex®；盐酸红比霉素；善宁；善龙；沙格司亭；Solu-Cortef®；甲强龙；索拉非尼；SPRYCELSTI-571；链佐星；SU11248；舒尼替尼；索坦；Tamoxifen Tarceva®；Targretin®；Tasigna®；泰素；泰索帝；Temodar®；替莫唑胺坦罗莫司；替尼泊苷；塞替派；沙利度胺；Thalomid®；TheraCys®；
硫鸟嘌呤；硫鸟嘌呤片剂；Thiophosphoamide；Thioplex®；塞替派；TICE®；拓扑杀；托泊替康；托瑞米芬；Torisel®；托西莫单抗；曲妥珠单抗；Treanda®；维A酸；TrexallTrisenox®；
TSPA；TYKERB®；VCR；VectibixVelban®；万珂；凡毕士；Vesanoid®；ViadurVidaza®；长春碱；硫酸长春碱；Vincasar Pfs®；长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏林司他；Votrient；VP-16；卫萌；希罗达；Zanosar®；泽娃灵™；右雷佐生；诺雷德；唑来膦酸；
Zolinza；或择泰。
[0147] 治疗自身免疫和炎性疾病的组合是一种或多种非甾体类抗炎药，也称为NSAIDS，它包括药物如布洛芬。其它组合是皮质类固醇，包括泼尼松龙；当与本文提供的结合蛋白组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。本文提供的抗体或其抗原结合部分可以与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性例子包括下述：一种或多种细胞因子抑制性抗炎药（CSAID）；针对其它人细胞因子或生长因子（例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF）的抗体或拮抗剂。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子（诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80（B7.1）、CD86（B7.2）、CD90、CTLA）或其配体（包括CD154（gp39或CD40L））的抗体组合。
[0148] 治疗剂的组合可以在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上进行干扰；例子包括：本文公开的结合蛋白和TNF拮抗剂如嵌合的、人源化的或人TNF抗体、阿达木单抗（PCTTM公开号WO 97/29131）、CA2（类克 ）、CDP 571、可溶性的p55或p75 TNF受体或其衍生物TM
（p75TNFR1gG（Enbrel ）或p55TNFR1gG（来那西普））、TNFα转换酶（TACE）抑制剂；或IL-1抑制剂（白介素-1-转换酶抑制剂、IL-1RA等）。其它组合包括本文公开的结合蛋白和白介素11。另一个组合包括自身免疫应答的关键起作用者，其可以与IL-12功能平行地、依赖于IL-12功能或者与IL-12功能协同地起作用；特别有关的是IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体、可溶性的IL-18受体或IL-18结合蛋白。已经证实，IL-12和IL-18具有重叠的、但是不同的功能，并且针对二者的拮抗剂的组合可以是最有效的。另一个组合是本文公开的结合蛋白和非耗尽性的抗-CD4抑制剂。其它组合包括本文公开的结合蛋白和共刺激性的途径CD80（B7.1）或CD86（B7.2）的拮抗剂，包括抗体、可溶性的受体或拮抗配体。
（p75TNFR1gG（Enbrel ）或p55TNFR1gG（来那西普））、TNFα转换酶（TACE）抑制剂；或IL-1抑制剂（白介素-1-转换酶抑制剂、IL-1RA等）。其它组合包括本文公开的结合蛋白和白介素11。另一个组合包括自身免疫应答的关键起作用者，其可以与IL-12功能平行地、依赖于IL-12功能或者与IL-12功能协同地起作用；特别有关的是IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体、可溶性的IL-18受体或IL-18结合蛋白。已经证实，IL-12和IL-18具有重叠的、但是不同的功能，并且针对二者的拮抗剂的组合可以是最有效的。另一个组合是本文公开的结合蛋白和非耗尽性的抗-CD4抑制剂。其它组合包括本文公开的结合蛋白和共刺激性的途径CD80（B7.1）或CD86（B7.2）的拮抗剂，包括抗体、可溶性的受体或拮抗配体。
[0149] 本文提供的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂是例如甲氨蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪、氯喹（chloroquinine）/羟氯喹、青霉胺、金硫代苹果酸盐（肌内和经口）、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇（经口、吸入和局部注射）、β-2肾上腺素能受体激动剂（沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗）、黄嘌呤（茶碱、氨茶碱）、色甘酸盐、奈多罗米、酮替芬、异丙托铵、氧托品、环孢素、FK506、雷帕霉素、吗替麦考酚酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、干扰经由促炎性细胞因子（例如TNFα或IL-1）的信号传递的试剂（例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂）、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶（TACE）抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物（例如，TM可溶性p55或p75 TNF受体或衍生物p75TNFRIgG（Enbrel ）或p55TNFRIgG（来那西普））、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R）、抗炎细胞因子（例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ）、塞来考昔、叶酸、硫酸羟氯喹、罗非昔布、依那西普、英夫利昔单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲泼尼龙、美洛昔康、乙酸甲泼尼龙、金硫丁二钠、阿司匹林、曲安奈德、萘磺酸右丙氧芬/对乙酰氨基酚、叶酸盐、萘丁美酮、双氯芬酸、吡罗昔康、依托度酸、双氯芬酸钠、奥沙普秦、盐酸羟考酮、重酒石酸氢可酮/对乙酰氨基酚、双氯芬酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素人重组体、盐酸曲马多、双水杨酯、舒林酸、氰钴胺/fa/吡多辛、对乙酰氨基酚、阿屈膦酸钠、泼尼松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺（glucosamine sulf）/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟考酮/对乙酰氨基酚、盐酸奥洛他定、米索前列醇、萘普生钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥昔单抗、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗-IL-18、抗-IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特、IC-485、CDC-801或Mesopram。组合包括甲氨蝶呤或来氟米特和环孢菌素。
[0150] 在一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合部分与下述试剂之一组合施用用于治疗类风湿性关节炎：KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂；甲氨蝶呤；泼尼松；塞来考昔；叶酸；硫酸羟氯喹；罗非昔布；依那西普；英夫利昔单抗；来氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲泼尼龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲泼尼龙；金硫丁二钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘磺酸右丙氧芬/对乙酰氨基酚；叶酸盐；萘丁美酮；双氯芬酸；吡罗昔康；依托度酸；双氯芬酸钠；奥沙普秦；盐酸羟考酮；重酒石酸氢可酮/对乙酰氨基酚；双氯芬酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素人重组体；盐酸曲马多；双水杨酯；舒林酸；氰钴胺/fa/吡多辛；对乙酰氨基酚；阿屈膦酸钠；泼尼松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟考酮/对乙酰氨基酚；盐酸奥洛他定；米索前列醇；萘普生钠；奥美拉唑；吗替麦考酚酯；环磷酰胺；利妥昔单抗；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18 BP；IL-12/23；抗-IL 18；抗-IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；或mesopram。
[0151] 本文提供的结合蛋白可以与之组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性例子包括下述：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1βmAb；抗-IL-6 mAb；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其它人细胞因子或生长因子（例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF）的抗体或拮抗剂。本文提供的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子（诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90）或其配体的抗体组合。本文提供的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂是例如甲氨蝶呤、环孢素、FK506、雷帕霉素、吗替麦考酚酯、来氟米特、NSAID，例如，布洛芬、皮质类固醇诸如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、干扰经由促炎性细胞因子（例如TNFα或IL-1）的信号传递的试剂（例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂）、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性的细胞因子受体或其衍生物（例如，可溶性的p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R）或抗炎细胞因子（例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13或TGFβ）或bcl-2抑制剂。
[0152] 其中结合蛋白可以组合用于克罗恩氏病的治疗剂的例子包括下述：TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体、阿达木单抗（PCT公开号WO 97/29131; HUMIRA）、CA2（类克）、CDP 571、TNFR-Ig构建体、（p75TNFRIgG（ENBREL）或p55TNFRIgG（来那西普））抑制剂或PDE4抑制剂。本文提供的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇（例如，布地奈德和地塞米松）组合。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂是例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉秦，或干扰促炎性细胞因子（诸如IL-1）的合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本文提供的抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传递抑制剂（例如，酪氨酸激酶抑制剂或6-巯基嘌呤）一起使用。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分可以与IL-11组合。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分可以与下述试剂组合：美沙拉秦、泼尼松、硫唑嘌呤、巯嘌呤、英夫利昔单抗、甲泼尼龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、甲氨蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/右旋糖-水、重酒石酸氢可酮/对乙酰氨基酚、盐酸四环素、醋酸氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、考来烯胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑仑、盐酸羟考酮/对乙酰氨基酚、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、塞来考昔、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/对乙酰氨基酚、盐酸考来维仑、氰钴胺、叶酸、左氧氟沙星、甲泼尼龙、那他珠单抗或干扰素-γ。
[0153] 本文提供的结合蛋白可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的非限制性例子包括下述：皮质类固醇；泼尼松龙；甲泼尼龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a（Avonex；Biogen）；干扰素-β1b（Betaseron；
Chiron/Berlex）；干扰素α-n3）（Interferon Sciences/Fujimoto）、干扰素-α（Alfa Wassermann/J&J）、干扰素β1A-IF（Serono/Inhale Therapeutics）、聚乙二醇干扰素α2b（Enzon/Schering-Plough）、共聚物1（Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.）；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨（clabribine）；针对其它人细胞因子或生长因子及其受体（例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF）的抗体或拮抗剂。本文提供的结合蛋白可以与针对细胞表面分子（诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90）或其配体的抗体组合。本文提供的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂是例如甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、吗替麦考酚酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇诸如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、干扰经由促炎性细胞因子（例如TNFα或IL-1）的信号传递的试剂（例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂）、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性的细胞因子受体或其衍生物（例如，可溶性的p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R）、抗炎细胞因子（例如，IL-4、IL-10、IL-13或TGFβ）或bcl-2抑制剂。
Chiron/Berlex）；干扰素α-n3）（Interferon Sciences/Fujimoto）、干扰素-α（Alfa Wassermann/J&J）、干扰素β1A-IF（Serono/Inhale Therapeutics）、聚乙二醇干扰素α2b（Enzon/Schering-Plough）、共聚物1（Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.）；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨（clabribine）；针对其它人细胞因子或生长因子及其受体（例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF）的抗体或拮抗剂。本文提供的结合蛋白可以与针对细胞表面分子（诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90）或其配体的抗体组合。本文提供的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂是例如甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、吗替麦考酚酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇诸如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、干扰经由促炎性细胞因子（例如TNFα或IL-1）的信号传递的试剂（例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂）、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性的细胞因子受体或其衍生物（例如，可溶性的p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R）、抗炎细胞因子（例如，IL-4、IL-10、IL-13或TGFβ）或bcl-2抑制剂。
[0154] 其中本文提供的结合蛋白可以组合用于多发性硬化的治疗剂的例子包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；copaxone，皮质类固醇，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的抑制剂，IL-1抑制剂，TNF抑制剂和抗体-CD40配体和CD80。
[0155] 本文提供的结合蛋白可以与之组合用于哮喘的治疗剂的非限制性例子包括下述：沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡松、布地奈德、泼尼松、昔萘酸沙美特罗、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、泼尼松龙磷酸钠、曲安奈德、二丙酸倍氯米松、异丙托溴铵、阿奇霉素、乙酸吡布特罗、泼尼松龙、无水茶碱、甲泼尼龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲泼尼龙、阿莫西林三水合物、氟尼缩松、变态反应注射剂、色甘酸钠、盐酸非索非那定、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸盐、左氧氟沙星、吸入器辅助装置、愈创甘油醚、地塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创甘油醚/d-甲吗喃、对-麻黄碱/cod/chlorphenir、加替沙星、盐酸西替利嗪、糠酸莫米松、昔萘酸沙美特罗、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/氢可酮/chlorphenir、盐酸西替利嗪/伪麻黄碱（pseudoephed）、去氧肾上腺素/cod/异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢丙烯、地塞米松、愈创甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/氢可酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、甲泼尼龙、硫酸奥西那林。
[0156] 本文提供的结合蛋白可以与之组合用于COPD的治疗剂的非限制性例子包括下述：硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替卡松、沙丁胺醇、昔萘酸沙美特罗、丙酸氟替卡松、泼尼松、无水茶碱、甲泼尼龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特罗、曲安奈德、左氧氟沙星、愈创甘油醚、阿奇霉素、二丙酸倍氯米松、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸盐、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯那敏/氢可酮、硫酸奥西那林、甲泼尼龙、糠酸莫米松、对-麻黄碱/cod/chlorphenir、乙酸吡布特罗、对-麻黄碱/氯雷他定、硫酸特布他林、噻托溴铵、（R,R）-福莫特罗、TgAAT、西洛司特、罗氟司特。
[0157] 本文提供的结合蛋白可以与之组合用于银屑病的治疗剂的非限制性例子包括下述：KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂、卡泊三烯、丙酸氯倍他索、曲安奈德、丙酸卤倍他索、他扎罗汀、甲氨蝶呤、醋酸氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸肤轻松、阿维A、焦油（tar）洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米松、酮康唑、普莫卡因/肤轻松、戊酸氢化可的松、氟氢缩松、脲、倍他米松、丙酸氯倍他索/emoll、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化可的松、湿润配方、叶酸、地奈德、吡美莫司、煤焦油、二乙酸二氟拉松、叶酸依那西普、乳酸、甲氧沙林、hc/次五倍子酸铋（bismuth subgal）/znox/resor、乙酸甲泼尼龙、泼尼松、防晒剂、哈西奈德、水杨酸、地蒽酚、新戊酸氯可托龙、煤提取物、煤焦油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、软化剂、醋酸氟轻松/软化剂、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、补骨脂素、水杨酸、肥皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来考昔、英夫利昔单抗、环孢菌素、阿来西普、依法珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB、柳氮磺吡啶。
[0158] 其中本文提供的结合蛋白可以组合用于SLE（狼疮）的治疗剂的例子包括下述：NSAIDS，例如，双氯芬酸、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来考昔、罗非昔布、伐地考昔；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，泼尼松、泼尼松龙、布地奈德、地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤；PDE4或嘌呤合成抑制剂的抑制剂，例如骁悉（Cellcept）。本文提供的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂是例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉秦、依木兰，以及干扰促炎性细胞因子（例如，IL-1）的合成、生产或作用的试剂，例如，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本文提供的结合蛋白还可以与以下试剂一起使用：
T细胞信号传递抑制剂，例如，酪氨酸激酶抑制剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如，CTLA-4-IgG或抗-B7家族抗体、抗-PD-1家族抗体。本文提供的结合蛋白可以与IL-11或抗-细胞因子抗体组合，例如，芳妥珠单抗（fonotolizumab）（抗-IFNg抗体），或抗-受体受体抗体，例如，抗-IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分还可以与下述试剂一起使用：LJP 394（阿贝莫司），耗尽或灭活B细胞的试剂，例如，利妥昔单抗（抗-CD20抗体），lymphostat-B（抗-BlyS抗体），TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，阿达木单抗（PCT公开号WO 97/29131；HUMIRA），CA2（类克），CDP 571，TNFR-Ig构建体（p75TNFRIgG（ENBREL）和p55TNFRIgG（来那西普））和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的过表达会造成狼疮样表型（参见Marquina）。
T细胞信号传递抑制剂，例如，酪氨酸激酶抑制剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如，CTLA-4-IgG或抗-B7家族抗体、抗-PD-1家族抗体。本文提供的结合蛋白可以与IL-11或抗-细胞因子抗体组合，例如，芳妥珠单抗（fonotolizumab）（抗-IFNg抗体），或抗-受体受体抗体，例如，抗-IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分还可以与下述试剂一起使用：LJP 394（阿贝莫司），耗尽或灭活B细胞的试剂，例如，利妥昔单抗（抗-CD20抗体），lymphostat-B（抗-BlyS抗体），TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，阿达木单抗（PCT公开号WO 97/29131；HUMIRA），CA2（类克），CDP 571，TNFR-Ig构建体（p75TNFRIgG（ENBREL）和p55TNFRIgG（来那西普））和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的过表达会造成狼疮样表型（参见Marquina）。
[0159] 本文提供的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本文提供的结合蛋白。“治疗有效量”表示在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据诸如下述因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及结合蛋白在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过抗体或抗原结合部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”表示在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。通常，因为在疾病前或疾病早期时在对象中使用预防剂量，所以预防有效量将小于治疗有效量。
[0160] V. 诊断本文公开内容也提供了诊断应用，包括、但不限于，诊断测定方法、含有一种或多种结合蛋白的诊断试剂盒、和所述方法的改进以及用于自动化和/或半自动化系统中的试剂盒。提供的方法、试剂盒和改进可以用于检测、监测和/或治疗个体中的疾病或障碍。这在下面进一步阐明。
[0161] A. 测定的方法本公开内容也提供了使用如本文中所述的至少一种结合蛋白确定试验样品中分析物或其片段的存在、量或浓度的方法。可以将本领域已知的任何合适的测定用于该方法。实例包括、但不限于免疫测定和/或采用质谱法的方法。
[0162] 本公开内容提供的免疫测定可以包括夹心免疫测定、放射免疫测定（RIA）、酶免疫测定（EIA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、竞争性抑制免疫测定、荧光偏振免疫测定（FPIA）、酶多种免疫测定技术（EMIT）、生物发光共振能量转移（BRET）和均质化学发光测定等。
[0163] 化学发光微粒免疫测定，具体为采用ARCHITECT®自动化分析仪（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）的那种，是免疫测定的一个例子。
[0164] 本公开内容提供了采用质谱法的方法，且包括、但不限于MALDI（基质辅助的激光解吸/电离）或SELDI（表面增强的激光解吸/电离）。
[0165] 使用免疫测定法和质谱法来收集、处理、加工和分析生物试验样品的方法是本领域技术人员众所周知的，并提供用于实践本公开内容（US 2009-0311253 A1）。
[0166] B. 试剂盒也提供了针对试验样品中分析物或其片段的存在、量或浓度来测定试验样品的试剂盒。所述试剂盒包含至少一种用于测定试验样品的分析物或其片段的组分、以及关于测定试验样品的分析物或其片段的说明书。所述至少一种测定试验样品的分析物或其片段的组分可以包括含有如本文所公开的结合蛋白和/或抗分析物结合蛋白（或其片段、变体、或变体的片段）的组合物，其任选固定化在固相上。
[0167] 任选地，所述试剂盒可以包含校准物或对照，其可以包含分离的或纯化的分析物。所述试剂盒可以包含至少一种用于通过免疫测定法和/或质谱法测定试验样品的分析物的组分。使用任何本领域已知的可检测标记物，可以任选地标记试剂盒组分，包括分析物、结合蛋白和/或抗-分析物结合蛋白或其片段。用于实践本公开内容的材料和方法是本领域技术人员已知的（US 2009-0311253 A1）。
[0168] C. 试剂盒和方法的改进可以改进试剂盒（或其组分）以及通过测定（诸如本文中所述的免疫测定）确定试验样品中分析物的存在、量或浓度的方法，以用于多种自动化的和半自动化的系统（包括其中固相包含微粒的那些）中，如例如在美国专利号5,089,424和5,006,309中所述、以及例如由Abbott Laboratories（Abbott Park, IL）作为ARCHITECT®商业销售的。
[0169] 可从Abbott Laboratories获得的其它平台包括、但不限于AxSYM®、IMx®（参见，例如，美国专利号5,294,404）、PRISM®、EIA（珠）、和QuantumII，以及其它平台。另外，可以以其它形式采用所述测定、试剂盒和试剂盒组分，例如，在电化学或其它手提式或床旁（point of care）测定系统上。本公开内容例如可用于商业Abbott Point of Care（i-STAT®, Abbott Laboratories）电化学免疫测定系统，该系统实施夹心免疫测定。在例如下述文献中描述了在一次性使用的试验装置中的免疫传感器及其制备和操作方法：美国专利号5,063,081、7,419,821和7,682,833；和美国公开号20040018577、20060160164和US 20090311253。
[0170] 本领域技术人员将容易明白，本文描述的方法的其它合适修改和改进是显而易见的，且可以使用合适的等同方案做出，而不背离本文公开的实施方案的范围。现在已经详细描述了某些实施方案，通过参考下述实施例将更清楚地理解所述实施方案，所述实施例仅为了例证目的而包括，且无意成为限制性的。实施例
[0171] 实施例1：双重可变结构域（DVD）结合蛋白的制备和表征通过合成编码DVD结合蛋白可变重链序列和DVD结合蛋白可变轻链序列的多核苷酸片段，并根据本领域已知的方法将所述片段克隆进pHybC-D2载体中，制备使用具有已知氨基酸序列的亲本抗体的四链双重可变结构域（DVD）结合蛋白。将DVD结合蛋白构建体克隆进
293细胞中并表达，并根据本领域已知的方法进行纯化。下面提供了DVD结合蛋白的DVD VH和VL链。
293细胞中并表达，并根据本领域已知的方法进行纯化。下面提供了DVD结合蛋白的DVD VH和VL链。
[0172] 在表2中提供了在DVD的构建中使用的接头。
[0173] 实施例1.1：针对相同靶蛋白的不重叠表位的DVD结合蛋白。
[0174] 实施例1.2：针对在相同细胞上表达的2种不同受体的DVD结合蛋白。
[0175] 表5含有293细胞中的亲本抗体和DVD-Ig蛋白的收率数据，表示为毫克/升。
[0176] 所有DVD-Ig蛋白在293细胞中较好地表达。在蛋白A柱上可以容易地纯化DVD-Ig蛋白。在大多数情况下，从293细胞的上清液可以容易地得到>5 mg/L的纯化的DVD-Ig蛋白。
[0177] 实施例2：用于确定亲本抗体和DVD-Ig蛋白的功能活性的测定实施例2.1：使用BIACORE技术的亲和力确定
。
。
[0178] BIACORE方法：BIACORE测定（Biacore, Inc, Piscataway, NJ）用结合速率和解离速率常数的动力学测量来确定抗体或DVD-Ig蛋白的亲和力。通过基于表面等离子体共振的测量，用Biacore®1000或3000仪器（Biacore®AB, Uppsala, 瑞典），使用流动HBS-EP（10 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA和0.005%表面活性剂P20），在25℃，测定抗体或DVD-Ig蛋白与靶抗原（例如，纯化的重组靶抗原）的结合。所有化学试剂都得自Biacore®AB（Uppsala, 瑞典）或否则来自如文中所述的不同来源。例如，使用标准胺偶联试剂盒，根据制造商的说明书和在25µg/ml的规程，将在10 mM醋酸钠（pH 4.5）中稀释的大约5000 RU的山羊抗-小鼠IgG（Fcγ）片段特异性多克隆抗体（Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL）直接固定化在CM5研究级生物传感器芯片上。用乙醇胺封闭在生物传感器表面上的未反应的部分。在流动池2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。在流动池1和
3中的不含山羊抗-小鼠IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，使来源于1:1 Langmuir结合模型的速率方程式同时拟合至所有8次注射的结合阶段和解离阶段（使用总体拟合分析）。将纯化的抗体或DVD-Ig蛋白在HEPES-缓冲盐水中稀释，用于捕获在山羊抗-小鼠IgG特异性的反应表面上。将要作为配体捕获的抗体或DVD-Ig蛋白（25µg/ml）以5µl/分钟的流速注射在反应基质上。在25µl /-1 -1 -1
分钟的连续流速下确定结合速率常数kon（M s ）和解离速率常数koff（s ）。通过在10 -
200 nM范围内的不同抗原浓度进行动力学结合测量，衍生出速率常数。然后通过下式从动力学速率常数计算抗体或DVD-Ig蛋白和靶抗原之间的反应的平衡解离常数（M）：KD = koff/kon。将结合记录为时间的函数，且计算动力学速率常数。
在表7中，“NT”指示未试验的DVD-Ig蛋白。通过Biacore技术表征的所有DVD-Ig蛋白的结合能力得到维持，并与亲本抗体的结合能力可比较。所有可变结构域以与亲本抗体类似的亲和力结合。
3中的不含山羊抗-小鼠IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，使来源于1:1 Langmuir结合模型的速率方程式同时拟合至所有8次注射的结合阶段和解离阶段（使用总体拟合分析）。将纯化的抗体或DVD-Ig蛋白在HEPES-缓冲盐水中稀释，用于捕获在山羊抗-小鼠IgG特异性的反应表面上。将要作为配体捕获的抗体或DVD-Ig蛋白（25µg/ml）以5µl/分钟的流速注射在反应基质上。在25µl /-1 -1 -1
分钟的连续流速下确定结合速率常数kon（M s ）和解离速率常数koff（s ）。通过在10 -
200 nM范围内的不同抗原浓度进行动力学结合测量，衍生出速率常数。然后通过下式从动力学速率常数计算抗体或DVD-Ig蛋白和靶抗原之间的反应的平衡解离常数（M）：KD = koff/kon。将结合记录为时间的函数，且计算动力学速率常数。
在表7中，“NT”指示未试验的DVD-Ig蛋白。通过Biacore技术表征的所有DVD-Ig蛋白的结合能力得到维持，并与亲本抗体的结合能力可比较。所有可变结构域以与亲本抗体类似的亲和力结合。
[0179] 实施例2.2：通过流式细胞计量术测定的单克隆抗体与人肿瘤细胞系表面的结合从组织培养瓶收获过表达目标细胞表面抗原的稳定细胞系或人肿瘤细胞系，并再悬浮于含有5％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中（PBS/FBS）。染色前，将人肿瘤细胞与在5
PBS/FCS中的5µg/ml的（100µL）人IgG一起在冰上温育。将1-5 x10 个细胞与在PBS/FBS中的抗体或DVD-Ig（2 μg/mL）一起在冰上温育30-60分钟。将细胞洗涤两次，并添加100µl的F(ab’)2山羊抗人IgG, Fcγ-藻红蛋白（在PBS中的1:200稀释物）（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, 目录号109-116-170）。在冰上温育30分钟后，将细胞洗涤两次，并再悬浮于PBS/FBS中。使用Becton Dickinson FACSCalibur（Becton Dickinson, San Jose, CA）测量荧光。
PBS/FCS中的5µg/ml的（100µL）人IgG一起在冰上温育。将1-5 x10 个细胞与在PBS/FBS中的抗体或DVD-Ig（2 μg/mL）一起在冰上温育30-60分钟。将细胞洗涤两次，并添加100µl的F(ab’)2山羊抗人IgG, Fcγ-藻红蛋白（在PBS中的1:200稀释物）（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, 目录号109-116-170）。在冰上温育30分钟后，将细胞洗涤两次，并再悬浮于PBS/FBS中。使用Becton Dickinson FACSCalibur（Becton Dickinson, San Jose, CA）测量荧光。
[0180] 表8显示了DVD-Ig蛋白的FACS数据。几何平均值为n个荧光信号的乘积（a1 x a2 x a3....an）的n次方根。对于对数变换的数据，使用几何平均值来标准化数据分布的加权。下表含有亲本抗体和DVD-Ig蛋白的FACS几何平均值。
[0181] 所有DVD-Ig蛋白表现出与它们的细胞表面靶标的结合。DVD-Ig蛋白的N-端结构域与亲本抗体一样好地或者比亲本抗体更好地结合它们的在细胞表面上的靶标。通过调整接头长度，可以恢复或改善结合。
[0182] 实施例2.3：用于确定亲本抗体和DVD-Ig蛋白的功能活性的细胞增殖测定细胞增殖测定将细胞从液氮保存状态融化，并繁殖和培养直到它们达到合适的生存力，并在预期的倍增时间（通常2周）拆分。将细胞维持在如表9所述的含有10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中。在抗体添加之前24小时，在组织培养物处理过的测定平板中，以表9中描述的细胞密度（1536个细胞/孔）将细胞接种在含有2%FBS的筛选培养基中。将细胞通过离心在测定平板中平衡，并在处理之前放在连接至给药模块的培养箱中在37℃保持24小时。在给药过程中，用指定浓度（在下面和在表10和11中）的抗体处理细胞。对于阶段3b，从20nM的开始浓度，在8-点剂量响应曲线中收集单一试剂数据。收集共计6个副本用于筛选（跨
2个测定平板）。将经处理的测定平板与抗体一起温育96小时。96小时以后，使用ATPLite（Perkin Elmer）使平板显影用于端点分析。在Envision平板读数器（Perkin Elmer）上使用超灵敏的发光读出平板。通过自动化的过程收集所有数据点；进行质量控制；并使用TM
Chalice Analyzer 软件（Zalicus Inc.）进行分析。如果它们通过了下述质量控制标准，则接受测定平板：相对萤光素酶值在整个实验中是一致的，Z-因子评分大于0.6，未处理的/媒介物对照在平板上具有一致表现。
2个测定平板）。将经处理的测定平板与抗体一起温育96小时。96小时以后，使用ATPLite（Perkin Elmer）使平板显影用于端点分析。在Envision平板读数器（Perkin Elmer）上使用超灵敏的发光读出平板。通过自动化的过程收集所有数据点；进行质量控制；并使用TM
Chalice Analyzer 软件（Zalicus Inc.）进行分析。如果它们通过了下述质量控制标准，则接受测定平板：相对萤光素酶值在整个实验中是一致的，Z-因子评分大于0.6，未处理的/媒介物对照在平板上具有一致表现。
[0183] 将所有细胞系维持在10%FBS中。在加入抗体之前24小时，将细胞放在含有2%FBS的筛选培养基中。
[0184] 抗体制备以500x浓度提供抗体。以1:500的它们的最高期望筛选浓度，将抗体加入384-孔聚丙烯“母平板”中。将抗体在柠檬酸盐缓冲液（10mM柠檬酸, 10mM磷酸二氢钠, pH 6.0）中
1:2系列稀释。在给药的时间之前，将母平板在4℃储存。给药后，将母平板“压印”在“子平板”（LDV COC听觉级塑料）中用于听觉分配。在使用之前允许所有平板平衡至室温。
1:2系列稀释。在给药的时间之前，将母平板在4℃储存。给药后，将母平板“压印”在“子平板”（LDV COC听觉级塑料）中用于听觉分配。在使用之前允许所有平板平衡至室温。
[0185] 实施例2.4：用于确定亲本抗体和DVD-Ig蛋白的功能活性的分析方法抑制百分比
将重复数据用平均值归并，并将抑制百分比确定为细胞生存力的量度。0%的抑制水平代表处理对细胞生长没有抑制。100%的抑制代表在处理窗中细胞数目没有倍增。细胞生长抑制性处理和细胞毒性处理可以产生100%的抑制百分比。如下计算抑制百分比：I=1-T/U，其中T是经过处理，且U是未处理。
将重复数据用平均值归并，并将抑制百分比确定为细胞生存力的量度。0%的抑制水平代表处理对细胞生长没有抑制。100%的抑制代表在处理窗中细胞数目没有倍增。细胞生长抑制性处理和细胞毒性处理可以产生100%的抑制百分比。如下计算抑制百分比：I=1-T/U，其中T是经过处理，且U是未处理。
[0186] 协同作用评分分析使用用于表征协同相互作用强度的标量量度（被称作协同作用评分）来测量超过Loewe加和性的组合效应（Zalicus）。如下计算协同作用评分：
。
。
[0187] 相对于所有媒介物处理的对照孔的中位值，计算矩阵中的每个组分试剂和组合点的相对抑制。该协同作用评分方程式将矩阵中的每个点处的实验观察到的活性体积积分，超过使用Loewe加和性模型从组分试剂活性在数字上衍生出的模型表面。使用协同作用评分方程式（上面）中的额外项将用于各种试剂的不同稀释因子标准化，并允许在整个试验中对比协同作用评分。
[0188] 使用Zalicus cHTS平台，可以组合地筛选2种试剂以捕获宽范围的浓度和比率。可以将组合效应归因于效价迁移或作为增强以达到最大效应。使用更亮的/更暖的颜色矩阵，展示更高的活性水平。使用关于任意组合中的2种单一试剂组分收集的数据，可以建立所述组合的各种组分之间的空相互作用的组合剂量模型（形状模型）。从实验衍生的数据（数据表面）减去该空相互作用矩阵以鉴别超过在组分之间不存在相互作用时可以预见到的值的活性值。将该多余矩阵体积积分以产生协同作用评分（上面）。
[0189] 自交分析为了客观地建立组合筛选分析的命中标准，为跨细胞系组的所有组合收集自交组合作为平均值以经验地确定累加的非协同应答。产生统计上替代这些基线加和性值的效应水平的那些药物组合被认为是协同的。其中加和性体积大于平均自交+3个标准差（3σ）的组合可以被视作候选配伍。该策略是以细胞系为中心的，从而聚焦于每个细胞系中的自交行为而不是细胞系组活性的总体评论。
[0190] 观察到的总抑制活性以及检测的组合效应的数目随细胞系变化。具有大于3σ的协同作用评分的组合在约99%置信度是“个别地显著的”，从而呈现标准误差。在表12和13中显示了每个细胞系的自交协同作用评分。在表12和13中突出显示了具有超过每个细胞系的阈值的协同作用评分的那些组合。
[0191] 通过细胞增殖表征的许多DVD-Ig蛋白在A549、BT-549、BxPC-3、FaDu、HCC1395和MDA-MB-453细胞系中表现出对细胞增殖的协同效应。还在额外细胞系中测量了细胞增殖。
[0192] 通过细胞增殖表征的许多DVD-Ig蛋白在MDA-MB-468、NCI-H1650、NCI-H1975、NCI-H441、NCI-H460和NCI-SNU-5细胞系中表现出对细胞增殖的协同效应。还在额外细胞系中测量了细胞增殖。
[0193] 因为针对在低浓度发生的组合效应将协同作用评分加权，由不充分剂量取样引起的差单一试剂曲线拟合可以促进自交评分中的人工增加。此外，其它次优因素（诸如实验噪音、陡峭剂量转变或长细胞系倍增时间）会促进“部分地发展的”表型效应，这可能非故意地影响自交协同作用评分。通过在协同相互作用的2个不同量度之间执行统计自交分析，可以将归因于一个量度或其它量度的统计偏倚标准化。没有通过与它们各自的自交矩阵的自交分析的那些组合的手工对比可以证实可用于揭示在细胞系组之间微弱的但是一致的组合效应。
[0194] 实施例3：抗体和DVD-Ig蛋白的表征例如，使用如实施例2所述的细胞因子生物测定，确定纯化的DVD-Ig蛋白的抑制功能活性的能力。使用如实施例2所述的表面等离子体共振（Biacore®）测量，确定DVD-Ig蛋白与重组人抗原的结合亲和力。对来自生物测定的IC50值以及抗体和DVD-Ig蛋白的亲和力进行排序。选择完全维持亲本mAb的活性的DVD-Ig蛋白作为用于将来开发的候选物。对前2-3种最有利的DVD-Ig蛋白进一步表征。
[0195] 实施例3.1：人源化抗体或DVD-Ig蛋白的药代动力学分析在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中执行药代动力学研究。给雄性和雌性大鼠和食蟹猴静脉内地或皮下地施用4mg/kg mAb或DVD-Ig蛋白的单剂量给药，且使用抗原捕获ELISA分析样品，并且通过无房室分析来确定药代动力学参数。简而言之，将ELISA平板用山羊抗-生物素抗体（5 mg/ml，4℃，过夜）包被，用Superblock（Pierce）封闭，且在室温与在
10%Superblock TTBS中的50 ng/ml的生物素化的人抗原一起温育2小时。连续稀释血清样品（0.5%血清，10%Superblock，在TTBS中），且于室温在板上温育30分钟。使用HRP-标记的山羊抗人抗体执行检测，且使用4参数逻辑拟合借助标准曲线来确定浓度。使用WinNonlin软件（Pharsight Corporation, Mountain View, CA）通过无房室模型确定药代动力学参数的值。选择具有良好药代动力学概况的人源化mAb（T1/2为8-13天或更好，具有低清除率和优良的生物利用度50-100%）。
10%Superblock TTBS中的50 ng/ml的生物素化的人抗原一起温育2小时。连续稀释血清样品（0.5%血清，10%Superblock，在TTBS中），且于室温在板上温育30分钟。使用HRP-标记的山羊抗人抗体执行检测，且使用4参数逻辑拟合借助标准曲线来确定浓度。使用WinNonlin软件（Pharsight Corporation, Mountain View, CA）通过无房室模型确定药代动力学参数的值。选择具有良好药代动力学概况的人源化mAb（T1/2为8-13天或更好，具有低清除率和优良的生物利用度50-100%）。
[0196] 实施例3.2：人源化单克隆抗体和DVD-Ig蛋白的物理化学和体外稳定性分析尺寸排阻色谱法用水将抗体或DVD-Ig蛋白稀释到2.5 mg/mL，且使用TSK凝胶G3000 SWXL柱（Tosoh Bioscience, 目录号k5539-05k）在Shimadzu HPLC系统上分析20 mL。用211 mM硫酸钠、
92 mM磷酸钠（pH 7.0），以0.3 mL/分钟的流速从柱洗脱样品。HPLC系统操作条件如下：
流动相： 211 mM Na2SO4, 92 mM Na2HPO4*7H2O, pH 7.0梯度： 等度
流速： 0.3 mL/分钟
检测器波长： 280 nm
自动采样器冷却器温度： 4℃
柱加热器温度： 环境温度
运行时间： 50分钟。
92 mM磷酸钠（pH 7.0），以0.3 mL/分钟的流速从柱洗脱样品。HPLC系统操作条件如下：
流动相： 211 mM Na2SO4, 92 mM Na2HPO4*7H2O, pH 7.0梯度： 等度
流速： 0.3 mL/分钟
检测器波长： 280 nm
自动采样器冷却器温度： 4℃
柱加热器温度： 环境温度
运行时间： 50分钟。
[0197] 表13含有通过上述方案确定的亲本抗体和DVD-Ig蛋白的纯度数据，表示为单体百分比（预期分子量的未聚集蛋白）。
[0198] DVD-Ig蛋白表现出优良的SEC分布，大部分DVD-Ig蛋白表现出>90%单体。该DVD-Ig蛋白概况类似于关于亲本抗体所观察到的概况。
[0199] SDS-PAGE通过在还原和非还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分析抗体和DVD-Ig蛋白。将阿达木单抗批次AFP04C用作对照。对于还原条件，将样品与含有100 mM DTT的2X tris甘氨酸SDS-PAGE样品缓冲液（Invitrogen, 目录号LC2676, 批号1323208）1:1混合，并于60℃加热30分钟。对于非还原条件，将样品与样品缓冲液1:1混合，并于100℃加热5分钟。将还原的样品（10 mg/泳道）加样到12%预制tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen, 目录号EC6005box, 批号6111021）上，且将非还原样品（10 mg/泳道）加样到8%-16%预制tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen, 目录号EC6045box, 批号6111021）上。SeeBlue Plus 2（Invitrogen, 目录号LC5925, 批号1351542）用作分子量标记。凝胶在XCell SureLock mini cell凝胶盒（gel box）（Invitrogen, 目录号EI0001）中运行，且通过首先应用75的电压以将样品堆积在凝胶中，随后应用125的恒定电压直至染料前沿到达凝胶的底部来分离蛋白。使用的运行缓冲液为1X tris甘氨酸SDS缓冲液，其从10X tris甘氨酸SDS缓冲液（ABC, MPS-79-080106））制备。凝胶用胶态蓝染色剂（Invitrogen目录号46-7015, 46-7016）染色过夜，且用Milli-Q水脱色，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪（型号1680，S/N DASX003641）扫描染色的凝胶。
[0200] 沉降速度分析将抗体或DVD-Ig蛋白加样到3个标准二区碳环氧类树脂中心杯（two-sector carbon epon centerpieces）的每一个的样品室中。这些中心杯具有1.2 cm光程长度，且由蓝宝石窗口制造。使用PBS作为参考缓冲液，且各室含有140µL。使用4孔（AN-60Ti）转子在Beckman ProteomeLab XL-I分析型超速离心机（serial # PL106C01）中同时检查所有样品。
[0201] 将运行条件编程，且使用ProteomeLab（v5.6）进行离心机控制。分析前允许样品和转子热平衡一小时（20.0±0.1℃）。在3000 rpm实施正确的细胞加样的确认，并对各室记录单个扫描。沉降速度条件如下：样品室体积：420 mL
参考室体积：420 mL
温度：20℃
转子速度：35,000 rpm
时间：8:00小时
UV波长：280 nm
径向阶大小（Radial Step Size）：0.003 cm
数据收集：每阶一个数据点，无信号平均
扫描总数：100。
参考室体积：420 mL
温度：20℃
转子速度：35,000 rpm
时间：8:00小时
UV波长：280 nm
径向阶大小（Radial Step Size）：0.003 cm
数据收集：每阶一个数据点，无信号平均
扫描总数：100。
[0202] 完整抗体的LC-MS分子量测量通过LC-MS分析完整抗体和DVD-Ig蛋白的分子量。用水将每个抗体或DVD-Ig蛋
白稀释到约1 mg/mL。使用具有蛋白microtrap（Michrom Bioresources, Inc, 目录号
004/25109/03）的1100 HPLC（Agilent）系统脱盐，并将5 mg样品导入API Qstar pulsar i质谱仪（Applied Biosystems）。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A（在HPLC水中的
0.08%FA，0.02%TFA）和流动相B（在乙腈中的0.08%FA和0.02%TFA）在50 mL/分钟流速下运行梯度。在4.5千伏喷射电压以2000至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
白稀释到约1 mg/mL。使用具有蛋白microtrap（Michrom Bioresources, Inc, 目录号
004/25109/03）的1100 HPLC（Agilent）系统脱盐，并将5 mg样品导入API Qstar pulsar i质谱仪（Applied Biosystems）。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A（在HPLC水中的
0.08%FA，0.02%TFA）和流动相B（在乙腈中的0.08%FA和0.02%TFA）在50 mL/分钟流速下运行梯度。在4.5千伏喷射电压以2000至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
[0203] 抗体和DVD-Ig蛋白轻链和重链的LC-MS分子量测量通过LC-MS分析抗体和DVD-Ig蛋白轻链（LC）、重链（HC）和去糖基化HC的分子量测量。
用水将抗体和DVD-Ig蛋白稀释到1 mg/mL，并用终浓度10 mM的DTT在37℃将样品还原为LC和HC进行30分钟。为了将抗体和DVD-Ig蛋白去糖基化，将100 mg抗体或DVD-Ig蛋白与2 mL PNGase F、5 mL 10%N-辛基葡萄糖苷一起以总体积100 mL在37℃温育过夜。去糖基化后，用终浓度10 mM的DTT将样品在37℃还原30分钟。使用具有C4柱（Vydac，目录号
214TP5115，S/N 060206537204069）的Agilent 1100 HPLC系统脱盐，并将样品（5 mg）导入API Qstar pulsar i质谱仪（Applied Biosystems）。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A（在HPLC水中的0.08%FA、0.02%TFA）和流动相B（在乙腈中的0.08%FA和0.02%TFA）在50 mL/分钟流速下运行梯度。在4.5千伏喷射电压以800至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
用水将抗体和DVD-Ig蛋白稀释到1 mg/mL，并用终浓度10 mM的DTT在37℃将样品还原为LC和HC进行30分钟。为了将抗体和DVD-Ig蛋白去糖基化，将100 mg抗体或DVD-Ig蛋白与2 mL PNGase F、5 mL 10%N-辛基葡萄糖苷一起以总体积100 mL在37℃温育过夜。去糖基化后，用终浓度10 mM的DTT将样品在37℃还原30分钟。使用具有C4柱（Vydac，目录号
214TP5115，S/N 060206537204069）的Agilent 1100 HPLC系统脱盐，并将样品（5 mg）导入API Qstar pulsar i质谱仪（Applied Biosystems）。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A（在HPLC水中的0.08%FA、0.02%TFA）和流动相B（在乙腈中的0.08%FA和0.02%TFA）在50 mL/分钟流速下运行梯度。在4.5千伏喷射电压以800至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
[0204] 肽作图用75 mM碳酸氢铵中的6 M盐酸胍的终浓度在室温将抗体或DVD-Ig蛋白变性15分钟。
变性的样品用10 mM DTT的终浓度于37℃还原60分钟，随后用50 mM碘乙酸（IAA）在黑暗中于37℃烷化30分钟。烷化后，将样品于4℃针对4升10 mM碳酸氢铵透析过夜。将透析的样品用10 mM碳酸氢铵，pH 7.8稀释到1 mg/mL，且100 mg抗体或DVD-Ig蛋白用胰蛋白酶（Promega, 目录号V5111）或Lys-C（Roche, 目录号11 047 825 001）以1:20（w/w）胰蛋白酶/Lys-C: 抗体或DVD-Ig蛋白比率于37℃消化4小时。用1 mL的1 N HCl猝灭消化。对于利用质谱仪检测的肽作图，利用Agilent 1100 HPLC系统在C18柱（Vydac, 目录号218TP51, S/N NE9606 10.3.5）上通过反相高效液相色谱法（RPHPLC）分离40 mL消化物。利用使用流动相A（在HPLC等级水中的0.02%TFA和0.08%FA）和流动相B（在乙腈中的0.02%TFA和0.08%FA）的梯度在50 mL/分钟的流速运行肽分离。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。
变性的样品用10 mM DTT的终浓度于37℃还原60分钟，随后用50 mM碘乙酸（IAA）在黑暗中于37℃烷化30分钟。烷化后，将样品于4℃针对4升10 mM碳酸氢铵透析过夜。将透析的样品用10 mM碳酸氢铵，pH 7.8稀释到1 mg/mL，且100 mg抗体或DVD-Ig蛋白用胰蛋白酶（Promega, 目录号V5111）或Lys-C（Roche, 目录号11 047 825 001）以1:20（w/w）胰蛋白酶/Lys-C: 抗体或DVD-Ig蛋白比率于37℃消化4小时。用1 mL的1 N HCl猝灭消化。对于利用质谱仪检测的肽作图，利用Agilent 1100 HPLC系统在C18柱（Vydac, 目录号218TP51, S/N NE9606 10.3.5）上通过反相高效液相色谱法（RPHPLC）分离40 mL消化物。利用使用流动相A（在HPLC等级水中的0.02%TFA和0.08%FA）和流动相B（在乙腈中的0.02%TFA和0.08%FA）的梯度在50 mL/分钟的流速运行肽分离。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。
[0205] 二硫键作图为了使抗体或DVD-Ig蛋白变性，将100 mL抗体或DVD-Ig蛋白与300 mL溶于100 mM
碳酸氢铵中的8 M盐酸胍混合。检查pH以确保它在7和8之间，且在6 M盐酸胍的终浓度于室温使样品变性15分钟。用Milli-Q水将一部分变性的样品（100 mL）稀释到600 mL，以给出1 M的最终盐酸胍浓度。将样品（220 mg）用胰蛋白酶（Promega, cat # V5111, 批号22265901）或Lys-C（Roche, 目录号11047825001, 批号12808000）以1:50胰蛋白酶或
1:50 Lys-C: 抗体或DVD-Ig蛋白（w/w）比率（4.4 mg酶:220 mg样品）于37℃消化约16小时。将另外5 mg胰蛋白酶或Lys-C添加到样品，且允许消化于37℃进行另外2小时。通过向每个样品添加1 mL TFA终止消化。使用在Agilent HPLC系统上的C18柱（Vydac, 目录号218TP51 S/N NE020630-4-1A）通过RPHPLC分离消化的样品。在50 mL/分钟的流速利用与用于肽作图的相同的梯度运行分离，其中使用流动相A（在HPLC等级水中的0.02%TFA和0.08%FA）和流动相B（在乙腈中的0.02%TFA和0.08%FA）。HPLC操作条件与对于肽作图使用的那些相同。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。通过匹配肽的观察到的MWs与通过二硫键连接的胰蛋白酶消化的肽或Lys-C肽的预测MWs来指派二硫键。
碳酸氢铵中的8 M盐酸胍混合。检查pH以确保它在7和8之间，且在6 M盐酸胍的终浓度于室温使样品变性15分钟。用Milli-Q水将一部分变性的样品（100 mL）稀释到600 mL，以给出1 M的最终盐酸胍浓度。将样品（220 mg）用胰蛋白酶（Promega, cat # V5111, 批号22265901）或Lys-C（Roche, 目录号11047825001, 批号12808000）以1:50胰蛋白酶或
1:50 Lys-C: 抗体或DVD-Ig蛋白（w/w）比率（4.4 mg酶:220 mg样品）于37℃消化约16小时。将另外5 mg胰蛋白酶或Lys-C添加到样品，且允许消化于37℃进行另外2小时。通过向每个样品添加1 mL TFA终止消化。使用在Agilent HPLC系统上的C18柱（Vydac, 目录号218TP51 S/N NE020630-4-1A）通过RPHPLC分离消化的样品。在50 mL/分钟的流速利用与用于肽作图的相同的梯度运行分离，其中使用流动相A（在HPLC等级水中的0.02%TFA和0.08%FA）和流动相B（在乙腈中的0.02%TFA和0.08%FA）。HPLC操作条件与对于肽作图使用的那些相同。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。通过匹配肽的观察到的MWs与通过二硫键连接的胰蛋白酶消化的肽或Lys-C肽的预测MWs来指派二硫键。
[0206] 游离巯基确定用于定量抗体或DVD-Ig蛋白中的游离半胱氨酸的方法是基于Ellman氏试剂，
5,5¢-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）与巯基（SH）的反应，该反应产生特有的生色产物5-硫代-(2-硝基苯甲酸)（TNB）。该反应以下式阐明：
。
5,5¢-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）与巯基（SH）的反应，该反应产生特有的生色产物5-硫代-(2-硝基苯甲酸)（TNB）。该反应以下式阐明：
。
[0207] 使用Cary 50分光光度计在412 nm测量TNB-的吸光度。使用2巯基乙醇（b-ME）稀释物作为游离SH标准绘制吸光度曲线，且通过样品在412 nm的吸光度确定蛋白中的游离巯基浓度。
[0208] 通过用HPLC等级水将14.2 M b-ME连续稀释到终浓度0.142 mM而制备b-ME标准原液。然后制备各浓度的一式三份的标准品。使用amicon ultra 10,000 MWCO离心滤器（Millipore, 目录号UFC801096, 批号L3KN5251）将抗体或DVD-Ig蛋白浓缩到10 mg/mL，且将缓冲液改为用于阿达木单抗的配制缓冲液（5.57 mM磷酸二氢钠，8.69 mM磷酸氢二钠，106.69 mM NaCl，1.07 mM柠檬酸钠，6.45 mM柠檬酸，66.68 mM甘露糖醇，pH 5.2，0.1%（w/v）Tween）。将样品于室温在摇床上混合20分钟。然后将180 mL的100 mM Tris缓冲液，pH 8.1添加到各样品和标准品，随后添加300 mL在10 mM磷酸缓冲液，pH 8.1中的2 mM DTNB。彻底混合后，在Cary 50分光光度计上测量样品和标准品于412 nm的吸收。通过绘制游离SH量和b-ME标准品的OD412 nm获得标准曲线。减去空白值后，基于该曲线计算样品的游离SH含量。
[0209] 弱阳离子交换色谱法用10 mM磷酸钠，pH 6.0将抗体或DVD-Ig蛋白稀释到1 mg/mL。使用具有WCX-10
ProPac分析型柱（Dionex，目录号054993，S/N 02722）的Shimadzu HPLC系统分析电荷异质性。在80%流动相A（10 mM磷酸钠，pH 6.0）和20%流动相B（10 mM磷酸钠，500 mM NaCl，pH 6.0）中将样品加样在柱上，并以1.0 mL/分钟的流速洗脱。
ProPac分析型柱（Dionex，目录号054993，S/N 02722）的Shimadzu HPLC系统分析电荷异质性。在80%流动相A（10 mM磷酸钠，pH 6.0）和20%流动相B（10 mM磷酸钠，500 mM NaCl，pH 6.0）中将样品加样在柱上，并以1.0 mL/分钟的流速洗脱。
[0210] 寡糖概况分析用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记试剂衍生化抗体或DVD-Ig蛋白经PNGase F处理后释放的寡糖。通过正相高效液相色谱法（NPHPLC）分离荧光标记的寡糖，并基于与已知标准品的保留时间对比对寡糖的不同形式进行表征。
[0211] 首先用PNGaseF消化抗体或DVD-Ig蛋白，以从重链Fc部分切割N-连接的寡糖。将抗体或DVD-Ig蛋白（200 mg）与2 mL PNGase F和3 mL 10%N-辛基葡糖苷一起置于500 mL Eppendorf管中。加入磷酸缓冲盐水，以使终体积达到60 mL。将样品在设定为700 RPM的Eppendorf恒温混合器（thermomixer）中于37℃温育过夜。阿达木单抗批次AFP04C也以PNGase F消化作为对照。
[0212] PNGase F处理后，将样品在设定为750 RPM的Eppendorf恒温混合器中于95℃温育5分钟，以沉淀出蛋白，然后将样品置于在10,000 RPM的Eppendorf离心机中2分钟以离心沉淀的蛋白。将含有寡糖的上清液转移到500 mL Eppendorf管中并在speed-vac中于65℃干燥。
[0213] 使用从Prozyme（目录号GKK-404, 批号132026）采购的2AB标记试剂盒将寡糖用2AB标记。根据制造商说明书制备标记试剂。将乙酸（150 mL，试剂盒中提供）添加到DMSO小瓶（试剂盒中提供），并通过上下吸打溶液几次而混合。将乙酸/DMSO混合物（100 mL）转移到2-AB染料小瓶中（恰在使用前），并混合直至染料完全溶解。然后将染料溶液添加到还原剂小瓶（试剂盒中提供）中，并充分混合（标记试剂）。将标记试剂（5 mL）添加到各个干燥的寡糖样品小瓶，并充分混合。将反应小瓶置于设定为65℃和700-800 RPM的Eppendorf恒温混合器中反应2小时。
[0214] 标记反应后，使用来自Prozyme（目录号GKI-4726）的GlycoClean S药液筒去除过量的荧光染料。添加样品前，用1 mL milli-Q水洗涤药液筒，随后为1 mL 30%乙酸溶液的5 ishes。恰在添加样品前，将1 mL的乙腈（Burdick and Jackson，目录号AH015-4）添加到药液筒。
[0215] 所有乙腈通过药液筒后，将样品点样在新鲜洗涤的盘中央，并允许其吸附到盘上10分钟。用1 mL乙腈洗涤盘，随后为1 mL的96%乙腈的5 ishes。将药液筒置于1.5 mL Eppendorf管之上，并用3 ishes（每ish 400 mL）milli Q水洗脱2-AB标记的寡糖。
[0216] 使用与Shimadzu HPLC系统连接的Glycosep N HPLC（目录号GKI-4728）柱分离寡糖。Shimadzu HPLC系统由系统控制器、脱气装置、二元泵、带有样品冷却器的自动进样器、以及荧光探测器组成。
[0217] 在高温的稳定性使用Amicon超速离心滤器的抗体或DVD-Ig蛋白缓冲液是5.57 mM磷酸二氢钠、8.69 mM磷酸氢二钠、106.69 mM NaCl、1.07 mM柠檬酸钠、6.45 mM柠檬酸、66.68 mM甘露糖醇、
0.1%（w/v）Tween，pH 5.2；或10 mM组氨酸、10 mM甲硫氨酸、4%甘露糖醇，pH 5.9。用合适的缓冲液将抗体或DVD-Ig蛋白终浓度调整为2 mg/mL。然后将抗体或DVD-Ig蛋白溶液过滤灭菌，并在无菌条件下制备0.25 mL等分试样。将等分试样在-80℃、5℃、25℃、或40℃放置1、2或3周。温育时间段结束时，通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE分析样品。
0.1%（w/v）Tween，pH 5.2；或10 mM组氨酸、10 mM甲硫氨酸、4%甘露糖醇，pH 5.9。用合适的缓冲液将抗体或DVD-Ig蛋白终浓度调整为2 mg/mL。然后将抗体或DVD-Ig蛋白溶液过滤灭菌，并在无菌条件下制备0.25 mL等分试样。将等分试样在-80℃、5℃、25℃、或40℃放置1、2或3周。温育时间段结束时，通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE分析样品。
[0218] 在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析稳定性样品。使用的规程与本文所述相同。用胶态蓝染色剂（Invitrogen目录号46-7015, 46-7016）将凝胶染色过夜，并用Milli-Q水脱色，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪（型号1680, S/N DASX003641）将染色的凝胶扫描。为了获得更高灵敏度，使用银染色试剂盒（Owl Scientific）将相同凝胶银染色，且使用制造商提供的推荐规程。
[0219] 通过引用并入在整个本申请中可能引用的所有引用的参考文献（包括文献参考、专利、专利申请和网站）的内容特此明确地通过引用整体并入用于任意目的，其中引用的参考文献也如此。除非另有说明，否则本公开内容将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
[0220] 本公开内容也通过引用以它们的整体并入分子生物学和药物递送领域中众所周知的技术。这些技术包括、但不限于在以下出版物中描述的技术：。
[0221] 等同方案可以将本公开内容以其它具体形式具体化，而不背离其精神或基本特征。因此，前述实施方案应当在所有方面视作示例性的，而不是本公开内容的限制。因此，本公开内容的范围由所附权利要求而不是由前述说明书指出，且因此意图在本文中包括在权利要求的等同方案的含义和范围内的所有改变。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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| 电离辐射探测器 | 2020-05-11 | 817 |
| 电离辐射防护剂 | 2020-05-11 | 617 |
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| 防电离辐射墙板及屏蔽室 | 2020-05-13 | 90 |
| 抗电离辐射的光纤放大器 | 2020-05-15 | 69 |
| 电离辐射图像数据校正 | 2020-05-13 | 871 |
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| 电离辐射探测器 | 2020-05-11 | 586 |
| 测量电离辐射的检测器 | 2020-05-12 | 433 |
| 电离辐射检测仪 | 2020-05-13 | 427 |
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