专利汇可以提供基因修饰的组织工程血管专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及的基因修饰的组织工程血管的特征是:采用如下的方法制备:(1)血管 支架 材料获取;(2)血管表面修饰:在血管腔表面修饰由可 生物 降解 的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和A20基因质粒组成的表面修饰混合物;(3)平滑肌细胞种植;(4)内皮细胞种植。所述组织工程血管具有良好 力 学性能及抗血栓形成、抗血管 再狭窄 等性能,用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。,下面是基因修饰的组织工程血管专利的具体信息内容。
1、一种基因修饰的组织工程血管,其特征是:采用如下的方法制备:
(1)、血管支架材料获取:由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分, 保留血管的天然网状结构制成,或直接采用人工合成材料制成;
(2)、血管表面修饰:在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子 释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯、粘附短肽 Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白和A20基因质粒组成的表面 修饰混合物;其配比关系按重量百分比为:其配比关系为可生物降解的控制 生长因子释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯70-90%, 粘附短肽Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp为0.3-1%,生长因子蛋白为 0.003-0.008%,A20基因质粒为0.001-0.003%,其余为去离子水,充分混合 成水溶液,灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔 内,经紫外光反应将其交联在血管腔表面,真空干燥备用,其中生长因子蛋 白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子,A20基因质粒为 pEGFPA20-N1;
(3)、平滑肌细胞种植:完成血管腔表面修饰后,再在血管中膜接种平 滑肌细胞;
(4)、内皮细胞种植:平滑肌细胞长好后,在血管腔表面再种植A20基因 修饰的血管内皮细胞。
2、一种基因修饰的组织工程血管,其特征是:采用如下的方法制备:
(1)、血管支架材料获取:由异种或同种血管去除抗原性和细胞成分, 保留血管的天然网状结构制成,或直接采用人工合成材料制成;
(2)、血管表面修饰:在血管腔表面修饰由可生物降解的控制生长因子 释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯、粘附短肽 Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白和A20基因质粒组成的表面 修饰混合物;其配比关系按重量百分比为:其配比关系为可生物降解的控制 生长因子释放的抗凝血高分子材料N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯70-90%, 粘附短肽Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp为0.3-1%,生长因子蛋白为 0.003-0.008%,A20基因质粒为0.001-0.003%,其余为去离子水,充分混合 成水溶液,灌注到处理好的异种或同种血管腔或人工合成材料制成的血管腔 内,经紫外光反应将其交联在血管腔表面,真空干燥备用,其中生长因子蛋 白为内皮生长因子或内皮生长因子加少量的转化生长因子,A20基因质粒为 pEGFPA20-N1;
(3)、平滑肌细胞种植:完成血管腔表面修饰后,再在血管中膜接种平滑 肌细胞。
3、根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管,其特征是: 在其制备方法的步骤(1)中所述的人工合成材料采用不可降解材料或降解材料, 其中不可降解材料选自聚甲基丙烯酸甲酯和聚四氟乙烯,降解材料选自聚乙 二醇酸、聚丙醇酸及上述材料的共聚物;在步骤(2)中的可生物降解的控制生 长因子等释放的抗凝血高分子材料为N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯;粘 附短肽为Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp、生长因子蛋白为内皮生长因子或 内皮生长因子加少量的转化生长因子。
4、根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管,其特征是: 其特征是:其制备方法步骤(1)中血管支架材料的获取采用以下方式:
无菌条件下取新鲜猪血管或异体血管,去除其上所附软组织,无菌PBS 冲洗血管,去除血栓凝块,无菌包装放入-80℃保存,复温于37℃用0.1mol/L PMSF溶液处理1--3小时,抗生素低渗及高渗缓冲液分别处理3--5小时,每1 小时换液一次;无菌蒸馏水浸洗干净,在保持37℃、5%CO2用0.03--0.05%胰 蛋白酶处理16--24小时,每8小时换液一次,无菌蒸馏水浸洗干净;用 0.005%---0.01%RNA酶消化1--3小时,无菌蒸馏水浸洗干净,0.006%---0.01% DNA酶消化1--3小时,无菌蒸馏水浸洗干净,0.005%---0.01%脂质酶消化2--4 小时,无菌抗生素蒸馏水浸洗干净,15--20Gy γ射线辐射处理10--15分钟消 毒并清除剩余血管基质胶原蛋白、弹性蛋白的抗原性,最后获得生物衍生血 管支架。
5、根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管,其特征是:其 制备方法步骤(2)中可生物降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料制 备是将光交联壳聚糖进行磺化和硫酸酯化得到的N—磺酸—光交联—壳聚糖 硫酸酯,具体方法为:
①、6-0-磺化光交联壳聚糖的合成:将纯化的光交联壳聚糖溶解在2%甲 酸溶液中,然后在室温下逐滴加入适量的1mol/L的CuSO4.5H2O溶液,搅 拌15--20小时后,过滤后依次用水、丙酮和乙醚洗涤,将所得产物完全分散 在干燥的DMF溶液中,然后将溶解在DMF中的SO3.Pyridine溶液按1∶4 的比例在低温下滴加到溶液中,其中1∶4指壳聚糖分子重复单元与 SO3.Pyridine之间的摩尔比,搅拌1--3小时后,在氮气保护和50℃下加热搅 拌15--20小时,将冷却后的溶液用NaHCO3调到pH值为8.2,加入适量的水 透析3--5天,将所得溶液用色谱的方法除掉铜离子后,冷冻干燥得到产品, 这步的产率为80%;
②、将上一步得到的6-o-磺酸光交联壳聚糖溶解在一定量的水中,然 后加入适量的Na2CO3和SO3.NMe3复合物,用氮气保护,在70℃下搅拌 15--20小时,等反应完成后,在去离子水中透析25--35小时,在稀NaoH溶 液中透析4--6小时,最后在去离子水中透析3--5天,冷冻干燥得最终产品, 15--20Gy Y射线辐射处理15--20分钟消毒备用。
6、根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管,其特征是:其 制备方法步骤(2)中A20基因质粒pEGFPA20-N1的制备如下:
用肿瘤坏死因子TNF刺激培养的内皮细胞3--5小时,刺激A20基因表达, 抽提细胞中RNA,设计引物上游:5’-AGTTGTCCCATTCGTCATTCC-3’,下 游:5’-TTTGAGCAATATGCGGAAAGC-3’,用RT-PCR方法克隆A20基因 cDNA,从上海生工处购买带A末端DNA克隆载体pUCm-T Vector,将A20 基因cDNA与pUCm-T Vector进行连接,运用x-gal染色,蓝白斑筛选出成功 连接的菌落,扩增后抽提质粒DNA,用EcoR I和BamH I进行酶切,得到大 量包含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因cDNA片段,从基因有限公司 购买绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1,包括4.7kb,此载体包括多个酶 切位点可以插入外源片段,其中本实验主要应用载体多克隆位点中的631处 的EcoR I位点和661bp处的BamH I位点,用EcoR I和BamH I双酶切线性 化pEGFP-N1载体,再用连接酶将含EcoR I和BamH I酶切位点的A20基因 cDNA片段克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1,筛选出阳性菌落, 扩增抽提得到包含A20基因的真核表达载体pEGFPA20-N1。
7、根据权利要求1或2所述的基因修饰的组织工程血管,其特征是:其 制备方法步骤(3)中平滑肌细胞种植方式如下:
在自行构建血管培养系统中,原代培养的平滑肌细胞扩增传代后取3-6 代,加转化生长因子,以浓度3×106cell/ml注射到血管腔,保持管腔内一直有 一定压力进行培养,或者平滑肌细胞种植方法是用同样数量细胞采用间隔相 同的点微注射到血管中膜,在血管细胞化生物反应器中进行培养。
8、根据权利要求1所述的基因修饰的组织工程血管,其特征是:其制备 方法步骤(4)中内皮细胞种植方法如下:
转基因内皮细胞扩增传代后取3-6代,以浓度3×106cell/ml注射到血管 腔,粘附90--120min后,在2--4天的内皮细胞种植培养过程中,腔内流速逐渐 增高从0.033到0.1ml/s,在血管壁相应的剪切应力约为1×10-2N/m2到4× 10-2N/m2之间,构建基因修饰的组织工程血管。
本发明涉及一种构建基因修饰的组织工程血管。
技术背景
目前各种血管移植物,以人体自身血管为佳。但人体自身非必需血管的 长度和直径极为有限,有些患者有全身血管病变甚至无合适的自体血管移植 物。对于大血管,虽然PTFE(聚四氟乙烯)等人工血管可在一定程度上满足 临床需要,但不能降解,一直作为异物存在人体内,且抑制血管细胞的再生 功能。PTFE等人工血管的抗凝血机理是让血液在人工血管内壁形成一层血栓 膜,因此这种人工血管的内径通常不能小于6mm,否则会引起血管阻塞,直径 小于6mm的小血管病变,仍无满意的人工血管替代物。目前临床血管移植物 仍尽量取用自身动、静脉。虽然自体动脉移植物有着无可比拟的优良效果, 自体静脉移植物仍然是冠状动脉搭桥术选用最多的血管移植物,但是由于来 源少,其顺应性不匹配及移植前后各种因素对内皮细胞损伤,大多数搭桥血 管发生内膜增生,最终导致血管狭窄闭塞,静脉桥的远期通畅率低,又是困扰 心脏外科医生的一个难题。
另外人工血管用于急性血管损伤治疗或用于一些不能提供合适种子细胞 的病人,构建的人工血管不能用自体细胞种植需要耐受同种移植。冠脉搭桥 需要小直径血管,但直径小于6mm的人工血管移植6个月后血栓率高达40%, 仍无满意的人工血管替代物。用人工材料构建小直径血管不易成型,同时很难 做到顺应性相匹配。因而如何改善移植血管的力学特性及生物相容性,防止 血管闭塞,是构建小直径血管面临的主要问题。
组织工程血管研究的关键问题是种子细胞和支架材料。种子细胞包括成 体血管细胞和干细胞等。在支架材料方面,血管组织工程最终研制的产品是 具有三维形状和空间结构的血管,因此在培育细胞时,必须提供具有特定三维 结构的立体血管支架材料,使接种细胞能定位、贴附、局域化生长增殖,同时 材料可使细胞在支架空间分布排列有序,分化具有特定功能并合成适当的细 胞外基质,细胞与细胞外基质形成的组织或器官与三维支架形状一致,组织工 程血管移植体内时支架材料还兼有力学支持功能,抗血流压力等。目前组织工 程血管使用的支架材料包括天然材料和人工合成材料,人工合成材料主要有 两种,一种为不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等,另一种为 可降解材料如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等及上述材料的共聚物。由于这类物质 具有低毒、无免疫反应、安全性较好且有很好的生物相容性的特性得到广泛 应用。人工材料尽管有许多优点,但也存在一些问题,人工合成材料的生物 相容性、生物活性、生物降解性及与宿主血管力学匹配等方面还存在一些缺 点,且在孔隙率及孔径大小等方面的仿生制作还有一定难度,同时某些人工 材料(如聚乳酸等)大量使用时在体内降解过程中产生的酸性物质堆积,不利 于细胞的附着、分裂、增殖;同时亲水性差,细胞吸附力较弱,机械强度不 足。另外作为合成类高分子材料缺乏细胞识别信号,其昂贵的价格也限制了其 广泛应用。因此,支架材料已成为妨碍组织工程血管研究进程的主要问题。
因血管替代治疗,并不能改变机体的内部致病环境,Ratliff等观察了115 例用作冠状动脉搭桥的大隐静脉,发现移植物动脉粥样硬化(GAS)病变者占 99%。说明尽管进行了替代治疗,但由于移植过程中的损伤及机体的内部致病 环境仍然存在,极有可能再度导致移植血管发生再狭窄,从而导致移植失败。 尽管目前有构建小直径血管的报道,但都局限在血管表面进行修饰加强细胞 种植,对血管移植后发生的内膜增生血管再狭窄闭塞尚没有好的办法解决。
A20基因属于锌指蛋白家族,在抗炎症方面有相关报道,但目前国内外 未见任何将A20基因应用于血管组织工程研究报道。
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