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微流体过滤装置

阅读：139发布：2020-10-28

专利汇可以提供微流体过滤装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种用于捕获可能是例如红细胞的物体的微流体装置。该装置可包括至少一个过滤器，该过滤器包括过滤器结构，所述过滤器结构包括多个通孔，所述通孔以重复排列的方式，排布在所述过滤器结构的第一侧到所述过滤器结构的第二侧之间，使得每个通孔在水平间距和垂直间距上与其他通孔相隔离，每个通孔在过滤器结构的第一侧上具有第一开口，在过滤器结构的第二侧上具有第二开口，在第一开口和第二开口之间具有穿过所述过滤器结构的通道。过滤器结构可以具有1μm至20μm的厚度，并且基板包括支撑过滤器结构的至少一部分的多个叶片，过滤器结构相对于多个叶片设置，使得过滤器结构的第二侧与多个叶片相邻。，下面是微流体过滤装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种装置，包括：至少一个过滤器，所述过滤器包括过滤器结构，所述过滤器结构包括多个通孔，所述通孔以重复排列的方式，排布在所述过滤器结构的第一侧到所述过滤器结构的第二侧之间，使得每个通孔在水平间距和垂直间距上与其他通孔相隔离，每个所述通孔在所述过滤器结构的第一侧上具有第一开口，在所述过滤器结构的第二侧上具有第二开口，在第一开口和第二开口之间具有穿过所述过滤器结构的通道，所述通道包括一个或多个侧壁，所述侧壁在所述第一开口和第二开口之间延伸，所述第一开口和所述第二开口的尺寸适于捕获通孔中的物体，其中，沿着过滤器结构的z轴测量，所述过滤器结构的厚度大于或等于1μm且小于或者等于20μm。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置包括一个微流体芯片，所述微流体芯片包括多个过滤器。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述多个过滤器以网格状图案布置。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基板包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)及聚碳酸酯(PC)中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过滤器结构包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)及聚碳酸酯(PC)中的一种或多种。
6.根据权利要求1或4所述的装置，其特征在于，所述过滤器结构包括氮氧化硅。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一开口的尺寸不同于所述第二开口的尺寸。
8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔的通道包括在所述第一开口与所述第二开口之间延伸的一个或多个侧壁。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述一个或多个侧壁包括至少一个锥形侧壁。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述至少一个锥形侧壁相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线成一角度逐渐变细。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述至少一个锥形侧壁具有两个或更多个区域，所述两个或更多个区域中的每一个相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。
12.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述至少一个锥形侧壁包括三个区域，所述三个区域中的每一个相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。
13.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述一个或多个侧壁处是弯曲的。
14.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一开口和第二开口分别具有介于约4μm-10μm之间的第一尺寸和介于约4μm-10μm之间的第二尺寸。
15.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔的尺寸被设计成捕获并保留所述通孔中的单个红细胞。
16.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔的尺寸被设计成允许成熟的盘形红细胞穿过所述通孔并在所述通孔中捕获单个胎儿有核红细胞。
17.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔为矩形。
18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述通孔的所述第一开口有一个或多个具有倒棱或倒圆的拐角。
19.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述通孔的所述第二开口有一个或多个具有倒棱或倒圆的拐角。
20.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔为椭圆形。
21.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔为圆形。
22.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第二开口的横截面具有至少一个尺寸，所述尺寸小于所述第一开口的横截面的尺寸。
23.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一开口和第二开口分别具有介于约4μm-10μm之间的第一尺寸和介于约4μm-10μm之间的第二尺寸。
24.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述通孔具有大致圆形的开口，所述开口的直径在约4μm和约10μm之间。
25.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述水平间距约为20μm，所述垂直间距约为10μm。
26.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多个叶片是六边形的。
27.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多个叶片是矩形的。
28.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多个叶片是方形的。
29.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述叶片的厚度约为0.1毫米。
30.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过滤器结构形成在所述基底上。
31.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过滤器结构的厚度在约1μm至约20μm的范围内。
32.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过滤器的材料配置成承受大于或等于3psi的压力，所述压力是由流体在所述过滤器结构上方和/或通过所述过滤器结构流动而产生。
33.一种装置，包括：
至少一个过滤器，所述过滤器包括捕获装置，所述捕获装置用于捕获存在于以重复图案排列的多个通孔中的细胞大小的物体；
和捕获支撑装置，其中，所述至少一个过滤器配置为承受大于或等于3psi的压力，所述压力是由流体流过所述至少一个过滤器和/或通过所述至少一个过滤器而产生的。
34.如权利要求33所述的装置，其特征在于，所述捕获装置包括一个过滤器结构，所述过滤器结构包括多个通孔，所述通孔以重复排列的方式，排布在所述过滤器结构的第一侧到所述过滤器结构的第二侧之间，使得每个通孔在水平间距和垂直间距上与其他通孔相隔离，每个通孔在过滤器结构的第一侧上具有第一开口，在过滤器结构的第二侧上具有第二开口，在第一开口和第二开口之间具有穿过所述过滤器结构的通道，所述通道包括一个或多个侧壁，所述侧壁在所述第一开口和第二开口之间延伸，所述第一开口和所述第二开口的尺寸适于捕获通孔中的物体；
其中，所述捕获支撑装置包括基板，所述基板包括支撑过滤器结构的至少一部分的多个叶片，所述过滤器结构相对于多个叶片设置，使得过滤器结构的第二侧与多个叶片相邻。
35.根据权利要求34所述的装置，其特征在于，所述一个或多个侧壁包括至少一个锥形侧壁。
36.根据权利要求35所述的装置，其特征在于，所述至少一个锥形侧壁相对于所述滤膜的第一侧和第二侧的垂直线成一角度逐渐变细。
37.根据权利要求35所述的装置，其特征在于，所述至少一个锥形侧壁具有两个或更多个区域，所述两个或更多个区域中的每一个相对于所述过滤器的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。
38.根据权利要求35所述的装置，其特征在于，所述至少一个锥形侧壁包括三个区域，所述三个区域中的每一个相对于所述滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。
39.根据权利要求34所述的装置，其特征在于，所述一个或多个侧壁是弯曲的。
40.根据权利要求34所述的装置，其特征在于，所述通孔的尺寸被设计成捕获并保留所述通孔中的单个红细胞。
41.根据权利要求34所述的装置，其特征在于，所述通孔的尺寸被设计成允许成熟的盘形红细胞穿过所述通孔并在所述通孔中捕获单个胎儿有核红细胞。

说明书全文

微流体过滤装置

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本发明要求2016年9月13日提交的美国临时申请No.62/394,112的权益，该临时申请通过引用整体并入本发明。

技术领域

[0003] 本发明公开的实施方案涉及使用微流体芯片中的微流体流体动力学捕集器和过滤器结构来隔离、分析、操纵和提取感兴趣的物体(例如细胞或微珠)的方法和装置。

背景技术

[0004] 从含有感兴趣的细胞和非感兴趣的细胞的细胞样品中分离感兴趣的细胞提出了各种挑战。例如，从母体血液中分离循环胎儿细胞(CFC)，其含有对于非侵入性产前诊断不感兴趣的其他母体和胎儿细胞，由于母体血液中胎儿红细胞的稀少性而提出了挑战。从血液中分离罕见的循环肿瘤细胞(CTC)进行液体活检存在同样的问题。在这些情况下，已经尝试了各种方法来提取和分析感兴趣的细胞用于下游遗传分析和诊断测定，但是提取的成功和纯度非常差。另外，这种检测和提取系统的吞吐量仍然很低，这是非侵入性测试领域的另一个挑战。例如，一些分离目的细胞的方法利用在载玻片或平板上铺板或铺展的细胞样品，用于分析，分离和提取细胞用于进一步分析。然而，所采用的扩散方法存在挑战，因为细胞经常在多于一层中聚集在一起并且彼此重叠，使得很难识别每个细胞的边界以确定细胞是否是感兴趣的细胞。从载玻片或平板的顶部和底部成像细胞也是不可行的，因此限制了分析的质量可以在细胞上进行。此外，成像细胞计数方法目前依赖于高分辨率成像，以便分析在载玻片或平板上展开的所有材料，而不仅仅是感兴趣的细胞。但是，高分辨率成像是存储器密集型的并且在缓慢的劳动密集型过程中使用昂贵的设备，并且还无法以有效且高度准确的方式精确地识别感兴趣的单个细胞。

发明内容

[0005] 本发明的一些实施例提供多层微流体装置，所述多层微流体装置被配置成使用基于形态学的分离来捕获和分离感兴趣的细胞。在一些方面，所述多层微流体装置可包括第一层，所述第一层包括微流体过滤器结构，例如微流体过滤材料或微流体过滤膜，所述第一层设置在包括支撑结构(例如基板)的第二层上。例如，过滤膜可以作为薄膜沉积在基底上，或者过滤膜可以旋涂到基底上。微流体芯片可包括一个或多个多层微流体装置。尽管上述实施例是双层微流体装置，但是其他实施例也是可能的。例如，本发明描述的多层微流体装置可包括微流体过滤器结构，所述微流体过滤器结构包括1,2,3或更多层。又如，本发明所述的多层微流体装置可包括具有一个或多个层的支撑结构。

[0006] 本发明发明实施例提供了至少一个微流体过滤器结构，所述微流体过滤器结构被配置为从包含感兴趣的细胞的样品中分离感兴趣的细胞，同时将细胞定位在过滤器结构的不同的精确限定的位置，该位置在空间上与其他位置分离，精确定义了过滤器结构的位置。本发明实施例的微流体装置包括过滤器结构，例如微流体过滤材料或微流体过滤膜，当被染色的样品流过或穿过所述微流体装置时，所述微流体装置会自动创建目标单层细胞。在一些方面，所述过滤器结构包括过滤膜，所述过滤膜包括多个通孔，所述多个通孔的形状和尺寸特别适于捕获感兴趣的细胞，同时允许不感兴趣的细胞穿过过滤膜中的通孔，从而保持不被捕获。通孔具体地以预定且重复的网格状图案布置。

[0007] 本发明所述的通孔包括在过滤膜的第一侧上的第一开口，在相对过滤膜的第二侧上的第二开口，以及在第一和第二开口之间穿过过滤膜的通道。通道可包括过滤膜内部的一个或多个侧壁。本发明所述的通孔允许物体通过过滤膜移动。例如，通孔可以允许最初存在于过滤膜一侧的物体通过过滤膜移动到过滤膜的相对侧上的区域。在一些情况下，通孔不允许目标物体穿过膜，并将目标物体保留在膜的一侧。以这种方式保留的物体可以在滤膜的一侧产生单层目标物体。

[0008] 本发明描述的过滤膜中形成的通孔的开口的形状可以变化。如下面将详细描述的，过滤膜的第一侧上的通孔的开口可以具有圆形形状，其他形状也是可能的。例如，在一些实施方式中，过滤膜包括具有通常为矩形形状的开口的通孔。如下面将详细描述的，具有矩形形状的开口可以有利地促进样品流过过滤膜并捕获过滤膜中的目标物体。另外，本发明所述的通孔的开口还可包括倒角或圆角，其有利地促进包含感兴趣的细胞的样品通过通孔的平稳流动。在一个非限制性示例中，过滤膜的第一侧中的通孔的开口具有带有四个角或边缘的大致矩形形状，并且一个或多个角被倒角或倒圆。在过滤膜的第二相对侧中的通孔的开口也可以具有大致矩形的形状，并且可以包括或不包括倒角或圆角。

[0009] 本发明实施例所述的过滤膜可包括具有通道或侧壁的通孔，所述通道或侧壁通常垂直于过滤膜的第一侧和第二侧。在本发明所述的过滤膜的其他实施方案中，通孔具有锥形侧壁，所述锥形侧壁以一定角度在过滤膜的第一侧和第二侧之间延伸穿过过滤器结构的内部。作为一个非限制性的描述，所述通孔包括侧壁，该侧壁相对于滤膜的第一侧和第二侧的垂直线成一定角度逐渐变细。此外，本发明所述的过滤膜可以由至少在光的可见光谱中具有机械和化学稳定性，化学和电子惰性，亲水和透明的材料构成或形成。在一些方面，支撑基板还可包括由基板材料形成或形成在基板材料中的支撑叶片。支撑叶片可以配置成为邻近支撑基板设置的过滤膜提供结构完整性，并且可以限定过滤膜中的一个过滤区域的形状和尺寸。在一些实施方案中，所述过滤膜的一部分悬挂在支撑基板上但不与支撑基板直接接触，支撑叶片可以为悬浮在支撑基板上的过滤膜部分提供结构完整性。在一些实施方案中，本发明所述的支撑结构中的叶片还可以限定细胞成像过程的视野(“FOV”)，其中叶片限定的视野的形状和大小通常匹配一个过滤膜中过滤区域的形状和大小。

[0010] 本发明的一个方面在于提供一种装置，所述装置包括至少一个过滤器，所述过滤器包括过滤器结构，所述过滤器结构包括多个通孔，所述通孔以重复排列的方式，排布在所述过滤器结构的第一侧到所述过滤器结构的第二侧之间，使得每个通孔在水平距离和垂直距离上与其他通孔相隔离，每个通孔在过滤器结构的第一侧上具有第一开口，在过滤器结构的第二侧上具有第二开口，在第一开口和第二开口之间具有穿过所述过滤器结构的通道，所述通道包括一个或多个侧壁，所述侧壁在所述第一开口和第二开口之间延伸，所述第一开口和所述第二开口的尺寸适于捕获通孔中的物体，其中，沿着过滤器结构的z轴测量，所述过滤器结构的厚度大于或等于1μm且小于或者等于20μm；所述装置还包括一个基板，所述基板具有支撑过滤器结构的至少一部分的多个叶片，所述过滤器结构相对于多个叶片设置，使得过滤器结构的第二侧与多个叶片相邻。

[0011] 另一方面，个别实施方式可以包括以下特征中的一个或多个。例如，所述装置可包括具有多个过滤器的微流体芯片。多个过滤器可以布置成网格状图案。所述基板的材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚碳酸酯(PC)中的一种或多种。在一些实施例中，所述过滤器结构可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)，玻璃，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚碳酸酯(PC)中的一种或多种。在一些实施例中，所述过滤器结构包含氮氧化硅。在一些实施例中，所述第一开口尺寸的大小不同于第二开口的大小。在一些实施方式中，通孔的通道包括在第一开口至第二开口之间延伸的一个或多个侧壁。一些实施方案中，所述一个或多个侧壁包括至少一个锥形侧壁。所述至少一个锥形侧壁相对于过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线成一角度逐渐变细。在一些实施方式中，所述至少一个锥形侧壁具有两个或更多个区域，所述两个或更多个区域中的每一个相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。在一些实施方式中，所述至少一个锥形侧壁包括三个区域，所述三个区域中的每一个相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。在一些实施方案中，一个或一个以上侧壁是弯曲的。在一些实施方案中，第一开口和第二开口分别具有介于约4μm与约10μm之间的第一尺寸和介于约4μm与约10μm之间的第二尺寸。在一些实施方案中，通孔的尺寸被设计成捕获并保留通孔中的单个红细胞。在一些实施方式中，通孔的尺寸被设计成允许成熟的盘形红细胞穿过通孔并在通孔中捕获单个胎儿有核红细胞。在一些实施方案中，通孔为矩形。在一些实现中，通孔的第一开口具有一个或多个倒角或倒圆。在一些实施方案中，通孔的第二开口具有一个或多个倒角或倒圆。在一些实施方式中，通孔是椭圆形的。在一些实施方式中，通孔是圆形的。在一些实施方式中，第二开口的横截面具有至少一个尺寸，该尺寸小于第一开口的横截面的一个尺寸。在一些实施方案中，第一开口和第二开口分别具有介于约4μm与约10μm之间的第一尺寸和介于约4μm与约10μm之间的第二尺寸。在一些实施方式中，通孔通常具有圆形开口的直径在约4μm和约10μm之间。在一些实施方案中，水平间距约为20μm且垂直间距约为10μm。在一些实施方式中，多个叶片是六边形的。在一些实施方式中，多个叶片是矩形的。在一些实施方式中，多个叶片是方形的。在一些实施方案中，叶片的厚度约为0.1毫米。在一些实施方案中，过滤器结构形成于衬底上。在一些实施方案中，过滤器结构的厚度在约1μm至约20μm的范围内。在一些实施方案中，通孔的尺寸被设计成捕获并保留通孔中的单个红细胞。在一些实施方式中，通孔的尺寸被设计成允许成熟的盘形红细胞穿过通孔并在通孔中捕获单个胎儿有核红细胞。在一些实施方案中，过滤材料经配置以承受大于或等于3psi的压力，所述压力由流体在过滤器结构上方和/或通过过器结构流动而产生。

[0012] 本发明其他方面提供了一种装置，所述装置包括至少一个过滤器，所述装置用于捕获以重复图案布置的多个通孔的每一个中的细胞大小的物体，以及用于支撑捕获装置的装置，其中至少一个过滤器被配置成承受大于或等于3psi的压力，这是由流体流过和/或通过至少一个过滤器引起的。这样的设备可以包括一个或多个其他特征或方面。例如，用于捕获的装置可以包括过滤器结构，该过滤器结构具有从过滤器结构的第一侧到过滤器结构的第二侧的多个通孔，并且以重复模式布置，使得每个通孔与另一个通孔分离。通孔具有水平间距和垂直间距，每个通孔在过滤器结构的第一侧上具有第一开口，在过滤器结构的第二侧上具有第二开口，以及通过所述过滤器结构第一开口和第二开口之间的通道。所述通孔的通道包括在第一开口至第二开口之间延伸的一个或多个侧壁，第一开口和第二开口的尺寸适于捕获通孔中的物体，并且支撑装置包括具有多个叶片的基板，所述多个叶片支撑所述过滤器结构的至少一部分，所述过滤器结构相对于所述多个叶片设置这使得过滤器结构的第二侧与多个叶片相邻。在一些实施方案中，所述一个或多个侧壁包括至少一个锥形侧壁。在一些实施方式中，所述至少一个锥形侧壁相对于过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线成一角度逐渐变细。在一些实施方式中，所述至少一个锥形侧壁具有两个或更多个区域，所述两个或更多个区域中的每一个相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。在一些实施方式中，所述至少一个锥形侧壁包括三个区域，所述三个区域中的每一个相对于所述过滤膜的第一侧和第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。在一些实施方案中，一个或多个侧壁是弯曲的。在一些实施方案中，通孔的尺寸被设计成捕获并保留通孔中的单个红细胞。在一些实施方式中，通孔的尺寸被设计成允许成熟的盘形红细胞穿过通孔并在通孔中捕获单个胎儿有核红细胞。附图说明

[0013] 在下文中将结合附图来描述所公开的技术特征，提供附图是为了说明而不是限制所公开的技术特征，其中相同的标号表示相同的元件

[0014] 图1A为根据本发明一实施例的用于捕获和定位感兴趣的细胞的微流体装置的第一侧的透视图。

[0015] 图1B为图1A所示的微流体装置的第二相对侧的透视图。

[0016] 图1C为根据本发明另一实施例的用于捕获和定位感兴趣的细胞的微流体装置的第一侧的透视图。

[0017] 图2为根据本发明另一实施例的用于捕获和定位感兴趣的细胞的微流体装置的一实施方案。

[0018] 图3A，3B和3C为本发明的用于捕获和定位感兴趣的细胞的微流体装置的各种实施方案。

[0019] 图4为根据本发明一实施例的具有矩形通孔的过滤膜的一部分。

[0020] 图5A是本发明的具有椭圆形通孔的过滤膜的一部分的图像。

[0021] 图5B，5C，5D和5E是图5A中所示的过滤膜的单个通孔的特写图像。

[0022] 图6A，6B，6C，6D和6E是图5A中所示的过滤膜的单个通孔的截面侧视图。

[0023] 图7A，7B和7C示出了本发明的用于捕获和定位感兴趣的细胞的微流体装置的各种实施方案。

[0024] 图8A是本发明的具有圆形通孔的过滤膜的一部分的图像。

[0025] 图8B和8C是图8A中所示的过滤膜的单个通孔的特写图像。

[0026] 图9A是本发明的具有圆形通孔的另一滤膜的一部分的图像。

[0027] 图9B和9C是图9A中所示的过滤膜的单个通孔的特写图像。

[0028] 图10A和10B为本发明的用于捕获和定位目标微珠的微流体装置的实施例。

[0029] 图11A和11B为根据本发明另一实施例的用于捕获和定位目标微珠的微流体装置。

[0030] 图12是说明使用本发明一实施例的微流体装置捕获、分离、分析和收获感兴趣的细胞的方法的示例性流程图。

[0031] 图13为本发明的用于捕获和成像感兴趣细胞的微流体芯片的实施方案的示例性图像。

[0032] 图14A和14B为本发明的用于捕获和成像感兴趣的细胞的微流体芯片的实施方案的示例性图像。

[0033] 图15A至16B为本发明的用于制造用于捕获和成像感兴趣的细胞的微流体芯片的示例性过程的处理步骤。

具体实施方式

[0034] 本发明公开的方法和装置的实施方案可使用基于形态学的分离获得感兴趣的细胞。本发明公开的方法和装置有利地使用集成在微流体装置中的过滤装置，例如微流体芯片。尽管这里描述的过滤装置可以是“过滤器”，“晶格”，“过滤器平台”，“过滤器网格”，“过滤器结构”，“过滤材料”，“过滤膜”或其他结构。可以从样品中过滤感兴趣的物体，在整个本发明中，过滤器装置将被称为“过滤膜”。在一个非限制性实例中，过滤膜将感兴趣的细胞与不感兴趣的其他物体(例如不感兴趣的细胞)的样品分离。分离感兴趣的细胞可以包括捕获过滤膜中的细胞，同时将细胞定位在过滤膜的不同的精确限定的位置上，该位置在空间上与过滤膜的其他不同的精确限定的位置分开。除感兴趣的细胞外，样品可含有非细胞物质和/或不感兴趣的细胞。本实施例所述的过滤膜捕获一些大部分或全部感兴趣的细胞，使得感兴趣的细胞可以从含有许多细胞的样品中分离，其中至少一些细胞可以是不感兴趣的细胞。在一些实施方案中，过滤膜还可以用于成像装置和细胞计数过程，以检测已经在过滤膜中捕获的细胞的精确位置，评估捕获的细胞的特征以确定它们是否是感兴趣的细胞，并且捕获或者采集已经确定对下游分析感兴趣的细胞，例如遗传和/或诊断分析。

[0035] 所述的过滤膜可包括多个通孔，其特定形状和尺寸适于捕获感兴趣的细胞，同时允许不感兴趣的细胞通过过滤膜中的通孔，从而保持未被捕获。本发明所述的过滤膜还可以捕获非细胞的目标物体。例如，过滤膜可以捕获样品中感兴趣的微珠，包括感兴趣的微珠和不感兴趣的微珠。应当理解，本发明所述的过滤膜不限于捕获细胞和微珠，然而，使得过滤膜可以捕获包含在具有物理特征(例如，形态，大小等)的感兴趣对象的样品中的其他类型的物体)与不感兴趣的物体的物理特性不同。

[0036] 虽然捕获一些细胞同时允许其他细胞通过过滤膜的过滤膜的特征可称为孔、井、凹陷、过滤孔、通孔、流体动力学陷阱或其他术语，但这些捕获特征将被引用在整个本发明中作为“通孔”。例如，本发明公开的方法和装置可用于胎儿细胞分选和从母体血液样品中分离，用于非侵入性产前诊断。在一个方面，本发明公开的方法和装置分离和分析此类细胞用于下游遗传分析和诊断测定。

[0037] 在一个非限制性实例中，过滤膜是基于形态学的选择过滤器，其基于两个标准分离感兴趣的细胞(例如胎儿有核红细胞(“fnRBC”))：形态学和特定于感兴趣的细胞的生物标志物。本实施例所述的过滤膜可以从含有成熟(非有核)母体红细胞和胎儿有核红细胞的母体血液样品中分离或过滤胎儿有核红细胞。在母体血液中循环的胎儿有核红细胞非常罕见，估计少于1000万分之1。成熟的人类红细胞是椭圆形双凹面圆盘并且通常缺乏细胞核。相反，胎儿有核红细胞比成熟的母体红细胞稍大，并且通常是球形的而不是圆盘形的。本实施例所述的基于形态学的选择过滤器包括具有特定形状，大小和排列的通孔，使得样品中的大部分或全部成熟红细胞穿过过滤器中的通孔，而一些，大多数或所有胎儿有核红细胞被保留或“捕获”在通孔中。然而，由于红细胞形态的变化，一些母体红细胞也可以被捕获在过滤器中的通孔中，即使它们不是感兴趣的细胞。

[0038] 在一个实施方式中，根据本发明的过滤膜包括第一侧，第二相对侧，以及从第一侧到第二侧穿过过滤膜的多个通孔。通孔在过滤膜中以精确限定的网格状图案布置。每个通孔包括在过滤膜的第一侧中的第一开口，在过滤膜的第二侧中的第二开口，以及穿过过滤膜的从第一开口延伸到第二开口的通道，使得最初存在的物体在过滤膜的第一侧附近可以通过通道移位到过滤膜的相对的第二侧附近的区域。在该实施方式中，每个通孔的第一开口和第二开口通常为圆形，直径约为7微米。在该非限制性示例中，过滤膜中的每个通孔具有特殊的形状(例如，具有圆形形状的第一开口)和尺寸(例如，7微米直径)以捕获感兴趣的细胞(例如，在单个通孔中的来自癌性肿瘤的圆形细胞(通常具有10微米直径)，同时允许不感兴趣的细胞(例如，不是来自癌性肿瘤且具有通常直径的细胞)小于7微米)通过第一开口并从通孔的第二开口出来，从而在过滤膜中保持不被捕获。在一些方面，每个感兴趣的细胞(例如，具有大致圆形形态和7微米直径的每个肿瘤细胞)被捕获在滤膜的一个单个通孔中，使得每个捕获的肿瘤细胞在滤膜的第一侧上聚集形成感兴趣的单层细胞。

[0039] 在一些实施例中，过滤器由任何合适的材料制成，该材料为预期的细胞捕获应用提供最佳的透明度特性和最佳强度和物理性质。例如，在一些实施例中，过滤膜包括对可见光谱中的光透明的一种或多种材料(例如，约400纳米至约700纳米的波长)。在一些实施例中，过滤器材料对超出可见光谱的光是透明的，包括但不限于具有近红外(NIR)和近紫外(NUV)光谱中的波长的光。包括透明材料或材料的过滤膜的一个非限制性优点是在过滤膜中捕获的细胞可以从多个方向光学成像。例如，在一个实施方案中，多层微流体装置包括过滤器结构，例如本发明所述的过滤膜，其设置在支撑基板的顶部，邻近或悬挂在支撑基板上。对光透明的过滤膜的实施方案允许微流体装置从两个方向中的任一个成像：(1)从微流体装置的“顶部”(例如，从最接近滤膜的装置的侧面)；或者(2)从微流体装置的“底部”(例如，从最靠近支撑基板的装置侧)。在一些实施方案中，透明材料的使用进一步有助于从微流体装置的顶部和/或从微流体装置的底部对捕获的细胞进行成像。相比之下，传统的微流体装置包括过滤器结构，该过滤器结构仅能够使用明场照明从具有落射荧光的一个方向(例如，仅从装置的顶部)成像。

[0040] 本实施例所述的微流体装置可有利地包括由一种或多种材料形成的过滤膜，所述材料在流体样品流过微流体装置时承受施加在过滤膜上的压力。另外，过滤膜可包括选择具有特定机械性能的一种或多种材料，以承受显微操纵器从过滤膜收集、移除和/或拔除感兴趣的细胞或不感兴趣的细胞所施加的压力，而不会撕裂、破裂、或降解滤膜。在一些方面，单个流体样品可以通过相同的过滤膜重复运行，或者单个流体样品的不同部分可以顺序地通过相同的过滤膜运行，而不会撕裂、破坏或降解过滤膜。这允许在每次运行之后，在子集运行之后或在所有运行完成之后从过滤膜收获感兴趣的细胞，但是在所有情况下，相同的过滤膜有利地用于所有运行而不更换过滤膜或提供具有多个过滤膜以处理单个样品的系统。

[0041] 在一些实施方案中，过滤膜包括在光源照射下不发荧光和/或抑制背景荧光的一种或多种材料。在一些实施方案中，在过滤膜中捕获和分离细胞之后和/或期间，可以用核染色剂，生物标记物和/或荧光染料标记或染色细胞。这种荧光分子或染料在被具有特别相应的光波长的光源照射或激发时可产生相应的光特征或光谱。因此，使用特定荧光分子或染料可以产生存在于捕获细胞上或捕获细胞内的特定核酸，抗体或基于抗体的片段探针的指示物，其可以使用显微镜或其他成像平台成像。抑制或消除滤膜本身的背景荧光的一个非限制性优点是总背景荧光保持较低，以避免在成像过程(例如成像细胞计数)期间干扰捕获细胞的基于荧光或光的指示剂的成像。

[0042] 在下面详细描述的另一个方面，本实施例的微流体装置包括过滤器，所述过滤器代表的一个捕获平台具有特定布置的，预定的和重复的网格状通孔图案。在捕获平台(例如微流体装置)包括多个过滤膜的情况下，可以精确地确定捕获平台中的每个过滤膜的位置。另外，在一些方面，可以非常精确地确定每个过滤膜中每个通孔的精确位置，直至纳米范围。

[0043] 另外，本实施例所述的过滤膜可以提高捕获和定位细胞的速度，以便被捕获的细胞可被分析和收集。例如，可以基于关于过滤膜中细胞的位置或位置的信息(例如，过滤膜上的精确x，y坐标)来识别和/或定位捕获的细胞。因此，可以将捕获的感兴趣的细胞验证为感兴趣的细胞(例如，胎儿有核红细胞或胎儿滋养层)，并且用于捕获和定位本发明所述细胞的过滤膜可以提高感兴趣的细胞从过滤膜中移除或者捕获的速度以用于下游测试。

[0044] 在一个非限制性优选实施例中，所述公开的方法和装置包括但不限于当染色样品流过微流体滤膜时自动产生单层细胞的能力。本实施例所述的微流体装置可以配置成通过防止样品中的一个感兴趣的细胞坐在或躺在另一个感兴趣的细胞上而产生单层细胞，这可能由于成像过程而导致成像和分辨率并发症。需要区分两个紧密间隔的细胞。本实施例所述的微流体过滤膜的包括具有通孔的材料层，所述通孔从材料的一侧完全穿过材料层到达材料的另一侧，使得样品中的物体流过过滤膜可以通过材料层移位。在一些情况下，过滤膜包括具有通孔的单层材料，并且在其他情况下，过滤膜包括多个层，其中每个通孔完全穿过多个层中的每个层。过滤膜中的每个通孔在空间上与其他通孔分离，并配置成仅捕获单个感兴趣的物体，例如感兴趣的单个细胞。因此，捕获细胞的每个通孔包含单个分离的细胞，其特征(例如大小、形态、生物标记)可以容易地区分，因为细胞在空间上与在滤膜中捕获的其他细胞分离，并且被保持在一个独特的，精确定义的位置上进行进一步分析。另外，本实施例所述的方法和装置可以有利地使单个微流体滤膜上的感兴趣的细胞的密度最大化。

[0045] 在一些实施方案中，过滤膜(或其上引入样品的过滤膜的表面)包括与疏水相反的亲水性材料。亲水性质可有利地允许流体样品平稳地流过通孔。相反，疏水性材料可能导致流体样品中的细胞在样品被引入过滤膜时聚集在一起，从而需要更大的压力来使细胞通过通孔。反过来，取决于过滤器的机械性能，通过过滤膜推动细胞(例如不感兴趣的细胞)所需的额外力可能导致过滤膜撕裂，膨胀，翘曲或弯曲，从而抑制微流体装置捕获感兴趣细胞的能力。

[0046] 在一些实施例中，具有矩形开口的通孔可具有一个或多个圆角或倒角。倒角可有利地去除通过通孔的流体流中的盲点，所述盲点通常在具有尖锐角边缘和/或拐角的开口的情况下存在。这些尖锐的角形拐角可能导致角落内或周围的流体和/或细胞积聚。具有圆角或倒角的通孔的一个非限制性优点是通孔可以配置成允许包含细胞，微珠或其他物体的流体样品平滑地流过过滤膜。

[0047] 在一些实施例中，通孔可包括在过滤膜的第一侧和第二侧之间延伸的侧壁(其包括一层或多于一层)，从而允许物体移位通过过滤膜。例如，侧壁可以相对于过滤膜的第一和/或第二侧的垂直线成一定角度逐渐变细。锥形侧壁可以构造成使得过滤膜的第一侧上的通孔的第一开口的尺寸不同于过滤膜的第二侧上的第二开口的尺寸。在一个示例中，过滤膜的第一侧上的通孔的圆形第一开口的直径可以大于过滤膜的第二侧上的通孔的圆形第二开口的直径。如本发明所述的具有锥形侧壁的通孔的实施例有利地改善了滤膜中感兴趣的细胞的捕获。例如，具有锥形侧壁的通孔的过滤膜的实施方案可以捕获流过过滤膜的样品中的更多感兴趣的细胞，并且在一些情况下可以更安全地保留捕获的感兴趣的细胞(例如，同时通过过滤器的另外的流体样品)。

[0048] 在一些实施例中，侧壁可以相对于过滤膜的第一和/或第二侧的垂直线以可变角度逐渐变细。例如，锥形侧壁可以具有一个或多个区域，其中每个区域可以相对于过滤膜的第一和/或第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。在一个示例中，锥形侧壁可以具有两个区域，其中第一区域相对于过滤膜的第一侧的垂直线以第一角度逐渐变细，而第二区域相对于大致垂直的线以第二角度逐渐变细。到滤膜的第二侧。在一些实施例中，在锥形侧壁上可以存在1、2、3、4或更多个区域，每个区域相对于过滤膜的第一和/或第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。在一些实施方案中，一个或多个区域通常可以与过滤膜的第一和/或第二侧的垂直线平行。锥形侧壁的角度和通孔的目标尺寸可以是独立可变的，并且可以选择以实现期望的效果。例如，具有锥形侧壁的圆形通孔的目标尺寸可以是通孔的最小直径。在另一示例中，矩形通孔的目标尺寸可以是在x方向或y方向上测量的通孔的最小尺寸。可以选择目标尺寸以增强特定通孔的流体动力捕获能力，同时可以选择锥形侧壁的角度以进一步帮助捕获，保持和保留感兴趣的物体(例如，细胞，珠子等)在适当的位置。

[0049] 在一个非限制性实施方案中，通孔的成角度侧壁的特性提供双重功能：一个是物理流体动力学捕获器，防止捕获的细胞或珠子进一步横向或定向运动，另一个是过滤或隔离膜。如果通孔不包括锥形侧壁，则通孔可以仅用于防止某些细胞流过过滤膜，但是不会用作目标尺寸的细胞或珠子的流体动力捕获器或捕获网格，因此将它们保持并固定在通孔内或部分地固定在通孔内。在圆形通孔的一个非限制性实例中，膜的厚度和通孔侧壁的角度决定了滤膜的捕获和固定特性，以及通孔底部的最小直径，确定其过滤或隔离属性。通过独立地选择锥形侧壁的角度和通孔的最小尺寸(沿x轴和y轴测量)，可以在非圆形通孔中实现类似的效果。

[0050] 本发明公开的方法和装置还可以允许：1)在一个集成平台上进行细胞过滤，染色，富集(如果需要)，从而尽量减少手工劳动及其干预；2)使用自动化简化细胞样品的处理。

[0051] 本发明公开的方法和装置可以是在举例说明中描述的，无创产前检查(NIPT)及胎儿有核红细胞与母体红细胞的分离的非限制性应用。然而，本领域技术人员可以理解，所述方法和装置的原理和概念广泛适用于从样品中捕获和研究感兴趣的物体，例如细胞，珠子，微珠和其他经过过滤的有或者未经过荧光染色的颗粒。因此，本发明实施例所述的方法和系统可以用于许多应用中，包括但不限于无创产前检查。例如，本发明公开的方法和装置可以被配置用于分离微珠，用于肿瘤学的肿瘤细胞，或任何其他病理状况，其中一种细胞可以基于大小，形态，核染色和/或生物标志物与另一种细胞进行区分。

[0052] 定义

[0053] 除非另外定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本发明提及的所有专利，申请，公开申请和其他出版物均通过引用整体并入。如果本发明中提出的定义与通过引用并入本发明的专利，申请，公开申请和其他出版物中所述的定义相抵触或不一致，则本发明中阐述的定义优先于引用的定义，即通过引用并入本发明。

[0054] 这里所用的，除非另有说明，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数形式。例如，“一个”滤膜包括一个或多个滤膜。

[0055] 这里所用的，术语“微流体装置”或“微流体芯片”通常是指在一些实施方案中，在微观尺度上可以通过其输送材料，特别是流体传播材料(例如液体)的装置，并且在一些实施方案中在纳米尺度上。因此，本发明描述的微流体芯片可包括微米级特征，纳米级特征及其组合。在这种装置上递送的样品可以是单独的流体或具有悬浮组分的流体，例如细胞和颗粒。

[0056] 一个示例性的微流体芯片可包括结构或功能特征属于毫米级或更小尺寸，其能够以约5mL/min或更低的流速操纵流体。示例性的微流体芯片可以是沿微流体芯片的x轴和y轴测量的5毫米×5毫米的尺寸。在另一个非限制性实例中，所述的微流体芯片的尺寸可以是沿微流体芯片的x轴和y轴测量的8毫米×8毫米。其他尺寸也是可能的。在一个示例中，微流体芯片包括以网格状图案布置的多个过滤器。多个过滤器可以以n×m网格状图案排列，其中“n”和“m”可以是任何整数，并且不需要相同。例如，微流体芯片可包括以5×5网格状图案布置的多个过滤器。在另一个非限制性示例中，多个过滤器可以以4×4网格状图案布置。本实施例所述的过滤器可以是沿着过滤器的x轴和y轴测量的大约0.9毫米乘0.9毫米。在另一个非限制性示例中，这里描述的过滤器可以是沿着过滤器的x轴和y轴测量的大约1.2毫米乘1.2毫米。在另一个非限制性示例中，本发明所述的过滤器可以是沿着过滤器的x轴和y轴测量的大约1.2毫米乘5.1毫米。其他尺寸也是可能的。在具有不对称尺寸的实施例中，过滤器可以布置成4×1网格状图案。在不遵循特定科学理论的情况下，微流体芯片上的过滤器的尺寸和布局可以设计成减少气泡形成并管理液体通过过滤器的微流体流动，因为微流体芯片的成像可能被气泡破坏或降解。流体流过过滤器并通过过滤器产生。在另一个实例中，微流体芯片包括由包括叶片的基板支撑的单个过滤膜，其中叶片限定过滤膜的区域。在一些情况下，微流体芯片包括额外的特征，例如但不限于通道，流体贮存器，反应室，混合室，分离区域和支撑结构。在一些示例中，通道包括至少一个横截面尺寸，该横截面尺寸在约0.1μm至约10毫米的范围内。

[0057] 微流体芯片可以单独存在或者可以是微流体系统的一部分，例如但不限于，微流体系统可以包括：泵和阀，用于将流体(例如，样品，试剂，缓冲液等)引入系统和/或通过系统；检测设备或系统；数据存储系统；用于控制装置内的流体输送和/或方向的控制系统，在适用的情况下使用传感器监测和控制装置中的流体所经受的环境条件，例如温度，压力，电流等。这种系统中的阀门和流动可以是压力或真空驱动。

[0058] 微流体芯片可由任何合适的材料制成，例如PDMS(聚二甲基硅氧烷)、玻璃、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PC(聚碳酸酯)等，或其组合。集成在芯片中的过滤器可以由类似材料或不同材料制成。在示例性实施方式中，本发明描述的过滤器由氮氧化硅制成，例如但不限于SiON或SiO2。

[0059] 这里所用的，术语“过滤器”和“过滤膜”是指将感兴趣的物体与不感兴趣的其他物体分开的材料。在本发明所述的实施例中，过滤膜通过将感兴趣的物体保持在过滤膜中的通孔中来分离感兴趣的物体，而不感兴趣的物体穿过过滤膜中的流体动力学捕集器的通孔。感兴趣的物体可以是但不限于细胞，珠子或微珠。本发明所述的过滤膜的实施方案可包括单层材料，或包括多层，例如两层，三层或更多层。

[0060] 这里所用的，术语“通孔”是指延伸穿过结构的开口或凹槽，例如过滤膜。在一个示例中，该结构包括第一侧和第二侧，并且通孔包括在第一侧和第二侧之间完全延伸穿过该结构的侧壁。通孔允许物体通过结构移位。例如，通孔可以允许最初存在于结构的一侧上的物体通过结构移位到结构的相对侧上的区域。在某些情况下，通孔不允许物体穿过结构，并将物体保持在结构的一侧。不通过通孔移位并保留在通孔中的物体可以部分地或完全地定位在通孔内。这里描述的通孔可以具体地成形和定尺寸为将感兴趣的物体与不感兴趣的其他物体分开。通孔也可以称为孔，流体动力学陷阱，井，过滤孔或表示通过过滤膜的通道的其他术语，然而，在整个本发明中，这些特征将被称为“通孔”。在本发明所述的实施例中，通孔有助于物体与不感兴趣的物体分离和保持。通孔可以设计成具有与感兴趣物体的形状和尺寸相对应的特定尺寸。以这种方式，可以在通孔中捕获感兴趣的对象的单个实例(例如，单个单元)，同时允许不感兴趣的对象完全穿过通孔或者禁止进入(或保留在其中)通孔。如上所述，感兴趣的物体可以是但不限于细胞，珠子或微珠。通孔可以设计成任何形状或尺寸，例如它们可以具有大致圆形，矩形，椭圆形或其他横截面形状。每个通孔的形状和尺寸可以基于由过滤膜捕获的感兴趣对象来确定。

[0061] 应当理解，本发明涉及的几个方面和实施例包括“由......组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。

[0062] 在以下描述中，给出了具体细节以提供对示例的深入理解。然而，本领域普通技术人员应当理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践这些示例。例如，电气组件/设备可以以框图示出，以免不必要的细节模糊示例。在其他情况下，可以详细示出这些组件，其他结构和技术以进一步解释这些示例。

[0063] 其他方面，目前公开的优势、特征将在以下结合附图的描述中变得显而易见。

[0064] 带滤膜的集成微流控芯片

[0065] 本发明描述了用于非侵入性分离细胞(例如但不限于胎儿有核红细胞)的集成微流体芯片。集成微流体芯片可包括单个过滤器或多个过滤器。在包括单个过滤器的微流体芯片的实施方案中，过滤器可包括由基底支撑的片材或过滤材料层(“过滤膜”)。本发明所述的过滤膜可包括单个片材或材料层，或可包括多个片材或材料层。在包括多个过滤器的微流体芯片的实施例中，多个过滤器可以布置成网格状结构。本发明描述的微流体芯片的一些实施方案还可包括结合部分或亲和分子。例如，在设计用于捕获胎儿有核红细胞的系统中，该系统可包括特异性结合细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原的结合部分或亲和分子，用于胎儿细胞的阳性选择或不需要的细胞的阴性选择。

[0066] 在一些实施方案中，集成微流体芯片可包括至少一个透明且在显微镜下可视化的过滤膜。过滤器包括多个通孔，所述通孔以重复的网格图案布置，并且被配置成捕获、保持并精确定位感性趣的细胞，清晰分辨在过滤膜上的位置(每个位置对应于单个通孔)。在一些实施例中，通孔具体地布置成规则且重复的网格图案，其中每个通孔可基于滤膜上的唯一的预定X，Y坐标精确定位。在一些实施方案中，每个滤膜可包括数千个通孔(例如，8,000或更多)，因此能够捕获和成像数千个细胞。

[0067] 图1A和1B分别示出了根据一个实施例的示例性微流体芯片100的第一侧视图和第二侧视图。在该非限制性示例中，微流体芯片100是双层结构，包括支撑层和过滤层。在这种情况下，支撑层包括基板110，并且过滤层包括过滤膜120。基板110包括第一侧112和相对的第二侧114。如下面将详细描述的，基板110还包括在第一侧112和第二侧114之间延伸的叶片130。在所示的示例中，过滤膜120设置在基板110的侧面112的顶部并由基板110的侧面112支撑，并且特别地，通过位于侧面112上的叶片130的部分。在图1B中，例如，通过过滤膜
120可看到支撑过滤膜120的叶片130。叶片130限定过滤膜120的六边形过滤区域125。具有不同形状的区域125是可能的(例如，图1C)。在其他实施例中(图1B中未示出)，微流体芯片包括多个六边形过滤膜120，每个过滤膜120设置在基板110的一个六边形区域125上或内。

[0068] 基板110可以由任何合适的材料形成，并且具有任何合适的尺寸以支撑过滤膜120。在一些情况下，衬底110是硅晶片。硅晶片可以是市售的常规尺寸的晶片，其被加工以获得衬底110的所需尺寸。例如，标准硅晶片可以减薄到具有大约400微米的厚度。可以基于微流体芯片所针对的特定应用的需要来选择支撑材料110的厚度。

[0069] 过滤膜120可以通过任何合适的方式形成。在一个非限制性方面，通过在基板110上沉积非常薄的一层或多层材料来形成过滤膜120。例如，可以通过等离子增强化学气相沉积(PECVD)或其他薄膜沉积技术将滤膜120作为薄膜沉积到基板110上。

[0070] 过滤膜120可以形成为具有用于微流体芯片100的特定应用的任何合适的厚度。在一些情况下，过滤膜120设置在基板110的顶部或底部表面上，邻近或悬挂在其上，并且沿着过滤器的z轴测量的厚度大于或等于5微米。例如，过滤膜120可具有约20微米的厚度。在其他实例中，沿滤膜的z轴测量，过滤膜120具有约1微米、约2微米、约3微米、约4微米或约5微米的厚度。然而，如下面将详细描述的，非常薄的过滤膜，例如本发明所述的过滤膜，其厚度仍然相对较强，并且有利地足够刚性以承受与流过过滤膜的样品流体相关的压力。这些特性可能尤其有利于在将多个样品应用于单个过滤膜的应用中，或者必须以相对高的压力将样品施加到过滤膜上以确保有效且准确地在过滤膜上捕获感兴趣的细胞的应用中。

[0071] 过滤膜120可以由与基板110类似的材料或不同的材料制成。在示例性实施方式中，本发明描述的过滤膜包括氮氧化硅，例如但不限于SiON或SiO2。然而，任何材料可能是合适的，其为所需的细胞捕获应用提供所寻求的透明度和所要求的强度和物理性质。例如，在一些实施例中，过滤器材料120对可见光谱中的光是透明的(例如，波长约为400纳米至约700纳米)。在一些实施例中，过滤器材料120对超出可见光谱的光是透明的，包括但不限于具有近红外(NIR)和近紫外(NUV)光谱中的波长的光。包括透明材料的过滤膜的一个非限制性优点是在过滤膜中捕获的细胞可以从基底110的任一侧成像，例如从基底110的第一侧
112或第二侧114成像。

[0072] 在一些实施例中，过滤膜120包括在光源照射下不发荧光和/或抑制背景荧光的一种或多种材料。在一些实施方案中，在过滤膜中捕获和分离细胞之前，期间或之后，可以用核染色剂，生物标记物和/或荧光染料标记或染色细胞。这种荧光分子或染料在被具有特别相应的光波长的光源照射或激发时可产生相应的光特征或光谱。因此，使用特定荧光分子或染料可以产生存在于捕获细胞上或捕获细胞内的特定核酸，抗体或基于抗体的片段探针的指示物，其可以使用显微镜或其他成像平台成像。抑制或消除过滤膜120自身的背景荧光的一个非限制性优点是总背景荧光保持低，以避免在成像过程(例如成像细胞计数)期间干扰捕获细胞的基于荧光或光的指示剂的成像。

[0073] 在一些实施例中，过滤膜120由选择为机械和化学稳定以及化学和电惰性的材料形成。过滤膜120包括机械强度或刚度，以在细胞样品流过并流过微流体芯片时承受来自流体流动的压力。优选地，本发明所述的过滤膜120具有足够的结构完整性和刚性，以限制或避免在流体或重力流的压力下弯曲，下垂或破裂。例如，可以选择过滤材料，其承受大于或等于3psi的压力，这是由于流过和/或通过过滤膜的流体而产生的。

[0074] 另外，过滤膜120可由具有特定机械性质的材料形成，以承受微操纵器的插入，同时从过滤膜收集；移除和/或拔除感兴趣的细胞或不感兴趣的细胞。例如，显微操纵器可以包括微型针，该微型针被配置为采集在过滤膜的每个通孔中捕获的脆弱细胞。在每个通孔中插入和移除针可以在给定通孔的侧壁上施加向外的力，因此可以选择过滤膜以承受该力，使得过滤膜不会破裂也不会使通孔变形。

[0075] 另外，具有所需孔和构造的过滤膜对于某些应用可以是不透明或半透明的，例如由诸如硅的材料制成。本发明所述的过滤膜可以通过特定的化学或电化学过程产生或形成所需的厚度，范围从几微米到几十微米或可能几百微米，然后是分离剥离技术，然后通过特定的粘合技术阳极粘合或附着。可以是具有多种材料的基板，或者是具有不同形状和/或尺寸的硅，有机聚合物，玻璃或塑料的材料层。

[0076] 结果是，所述的过滤膜可以多次使用以捕获样品中的感兴趣细胞或同一样品的多个部分，代表了对现有过滤装置的显著改进。例如，可以将样品的第一部分施加到过滤膜120，捕获样品的第一部分中的第一感兴趣细胞子集。随后，可以将样品的第二部分施加到相同的过滤膜120，在滤膜120的通孔中捕获感兴趣的细胞的第二子集，所述通孔未被物体占据(无论是感兴趣的细胞还是其他不感兴趣对象)。可以重复该过程，直到整个样品已经施加到相同的过滤膜120上，或者直到确定在过滤膜120中捕获了足够数量的感兴趣的细胞。过滤膜120的成像，过滤膜中物体的操纵或其他过程可以以规则的间隔或在将下一个样品部分施加到过滤膜之前进行。在一些情况下，在该捕获过程结束时，微流体芯片100将在单个过滤膜120中具有非常高密度的感兴趣细胞，其中每个感兴趣的细胞在不同的单个通孔中被隔离，精确地定义过滤膜120的x，y位置。在一个实例中，通过过滤膜120将单层感兴趣的细胞保持在基底110的侧面112上的适当位置，并提供独特的平台，从该平台分析，识别和提取来自微流体芯片100的感兴趣的细胞。可以看到，例如，根据本实施例描述的，在过滤膜上保持的感兴趣细胞的实物图，如图14A和14B中所示，并在下面详细描述。

[0077] 在一些实施例中，过滤膜120由具有亲水性质的材料形成，与疏水性质相反。过滤膜120的亲水性使得流体样品能够平稳地流过通孔。在一些实施方案中，处理过滤膜120的第一侧上的表面以获得亲水特性。在其他实施方式中，过滤膜120由具有所需亲水特性的一种或多种材料形成。优选地，过滤膜的亲水性质可以防止细胞在流过过滤膜120时聚集在一起，从而减少将样品(和不感兴趣的细胞)在过滤膜120的通孔中推动的压力或力。在捕获过程期间施加在过滤膜120上的压力或力的减少代表了对现有过滤器系统的显着改进，因为本发明所述的过滤膜120的实施例不太可能刺穿，弯曲，弯曲，膨胀或在一个或多个捕获过程中降解，导致单个过滤膜120的寿命更长，并且使用单个过滤膜120可以实现多个捕获过程的功能。

[0078] 在一些实施例中，示例性微流体芯片100的基板110通常采用固体或半固体基板，其可以是平面结构，即基本上平坦或具有至少一个平坦表面。合适的基底可以由多种材料中的任何一种或材料的组合制成。通常，平面基板使用微加工领域中常见的固体基板制造，例如基于二氧化硅的基板，例如玻璃，石英，硅或多晶硅，以及其他已知的基板，即砷化镓，以确保优异的可制造性。并反复增强目标尺寸。在这些基板的情况下，常用的微加工技术，例如光刻技术，湿化学蚀刻，微机械加工，即钻孔，铣削和等离子体蚀刻等，可以容易地应用于微流体芯片和基板的制造中。或者，聚合物基底材料可用于制造本发明的装置，包括例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯等。在这种聚合物材料的情况下，可以使用注塑或压花方法来形成基材。在这种情况下，可以使用任何上述材料和方法制造原始模具。组装的微流体芯片可以用等离子体处理以改变所需的后组装的表面润湿能力，或者优选首先进行处理然后组装。

[0079] 基板110可以形成或制造为包括多个支撑叶片130。例如，常见的微粉化技术和/或注塑或压花方法可以应用于基板110的制造中以包括叶片130。在一些实施例(未示出)中，各个过滤膜120保持或设置在由叶片130限定的六边形区域内。在图1A和1B所示的实施例中，在第一侧112和第二侧114之间的基板110中形成的叶片130限定单个过滤膜120的六边形过滤区域125。例如，如图1A和1B所示，叶片130形成蜂窝状单元140的图案。设置在基板110的侧面112上的过滤膜120覆盖每个蜂窝单元140。每个蜂窝单元140(在图1A中的基板
110的侧面114上可见并且通过图1B中的过滤膜120可见)限定了过滤膜120的六边形过滤区域125。然而，由叶片130形成的单元图案不限于图1A中所示的蜂窝图案。例如，叶片130可以形成正方形单元(参见图3A)，矩形单元(未示出)或另一形状的单元的图案。

[0080] 在一些实施例中，叶片130的尺寸和制造尺寸设计成为过滤膜120提供支撑。例如，叶片130可以以允许过滤膜120由于流体流动而承受一定量的压力的方式支撑过滤膜120。在基板110中不存在叶片130的情况下，由于将相同量的流体施加到过滤膜的较大的无支撑表面区域，过滤膜120可能下垂，弯曲或破裂。在一些方面，叶片130有利地为过滤膜120提供比由基板110的侧面112,114提供的进一步支撑和结构完整性，使得每个过滤膜120的中间不会由于来自流体的压力流过和/或通过过滤膜120而下垂、弯曲或破裂。此外，形成蜂窝单元140的叶片130可以有利地限定视场(FOV)，用于在成像细胞计数过程或其他分析期间对每个六边形过滤区域125进行成像，如下面附图12所述。然而，如下面将附图10A，10B，11A和
11B更详细地描述的，本发明描述的微流体芯片的一些实施例包括不具有叶片或其他支撑结构的基板。

[0081] 图1C示出了根据本发明的用于捕获和定位感兴趣细胞的微流体装置的另一实施例的第一侧的透视图。图1C的微流体芯片可以与微流体芯片100基本相似。然而，支撑过滤膜的叶片限定了过滤膜的矩形过滤区域(例如，阴影过滤区域)。该示例性微流体芯片中的过滤器区域以5×5网格状图案布置，如下面将根据附图3，图4，图13和图14进行更详细地描述。

[0082] 图2示出了根据一个实施方案的示例性微流体芯片200。在该非限制性示例中，微流体芯片200可以与具有支撑层和过滤层的微流体芯片100基本类似。在这种情况下，支撑层包括基板210，并且过滤层包括过滤膜220。基板210包括框架形外部部分215和包括叶片230的内部部分216。过滤膜220定位在内部部分216中并且接触叶片230。在该非限制性示例中，过滤膜是透明的，使得叶片230通过过滤膜220可见。叶片230形成蜂窝状细胞的图案(类似于图1A的微流体芯片100中所示的蜂窝状细胞)。其他配置也是可能的。在图2所示的示例中，叶片具有约0.1毫米的厚度。

[0083] 叶片230限定过滤膜220的六边形过滤区域225。然而，应该理解，微流体芯片200可以设计成具有任何合适形状的过滤区域225(例如，六边形、正方形、矩形或任何其他形状)。优选地，可以选择过滤区域225的数量，尺寸和形状的特征，以基于微流体芯片200的预期应用最大化对特定感兴趣细胞的捕获。

[0084] 过滤膜220包括以规则重复图案布置的多个通孔。每个通孔的尺寸，形状和相对间距可以基于过滤膜被设计用于捕获和保留对感兴趣细胞的特异性地选择，使得感兴趣的单个细胞被捕获并保留在每个通孔中。通孔可以具有通常为矩形形状，通常为圆形形状或任何其他合适形状的开口。在图2所示的非限制性示例中，通孔具有大致圆形的开口，直径约为10微米。

[0085] 所述的过滤膜的一个非限制性优点是当样品流过过滤膜时自动产生单层细胞的能力，这在载玻片上使用样品电镀是不可能的。由于过滤膜中通孔的特殊设计尺寸，形状和材料特性，过滤膜可以配置成防止样品中的一个感兴趣的细胞模糊，重叠或位于另一个潜在的顶部感兴趣的细胞。结果，利用本发明描述的微流体芯片的实施例的成像系统不需要花费成像资源(例如高分辨率成像资源)来确定特定细胞边界所在的位置，以追踪细胞轮廓以将两个紧密间隔的细胞彼此区分开，或者确定物体实际上是否是两个或更多个聚集在一起的细胞-在实际研究感兴趣的细胞之前常规细胞培养中通常需要的活性并确认其为感兴趣的细胞。

[0086] 在图2所示的非限制性示例中，基板210包括沿着微流体芯片的x轴和y轴测量的约8毫米×约8毫米的外部部分215，并且具有沿微流体芯片的z轴测量约0.3毫米的厚度。其他尺寸也是可能的。在该示例中，内部部分216沿微流体芯片的x轴和y轴测量约为5毫米×5毫米。在该示例中，过滤膜220定位在基板210上并与基板210接触。沿微流体芯片的z轴测量过滤膜220约5μm。具有不同厚度的过滤膜也适用于微流体芯片200。

[0087] 在一些情况下，由叶片230限定的六边形过滤区域225可以被称为过滤膜220的“活动区域”。直接设置在叶片230上方并与叶片230接触的过滤膜220的区域不被认为是过滤膜220的“活动区域”，因为这些区域中的通孔的第二开口可能被叶片230阻挡，例如流过这些通孔的流体会降解或完全阻塞。在图2所示的非限制性实施例中，六边形过滤区域225沿着微流体芯片200的x轴测量约为0.9毫米长，由具有约0.1毫米厚度的叶片230分开。一个六边形过滤区域225的总面积约为0.7毫米。因此，每个过滤器区域225可以表示约0.7毫米的有效区域。基板210的内部部分216可以限定6排过滤区域225，标记为图2中的第1行至第6行。
在第3行和第5行中有大约五个过滤区域225。另外，例如，行2中存在的过滤器区域225的总面积相当于五个过滤器区域225。

[0088] 实施例1-具有带有矩形通孔的过滤膜的微流体芯片

[0089] 图3A示出了根据一个实施方案的示例性微流体芯片300A。在该非限制性示例中，微流体芯片300A包括基板310和滤膜320。基板310包括框架形外部部分315和包括叶片330的内部部分316。基板310包括沿着微流体芯片300A的x轴和y轴测量的约8毫米×约8毫米的外部部分315。沿着z-测量的基板310具有约0.4毫米的厚度。微流体芯片300A的轴。其他厚度也是可能的。在该示例中，内部部分316沿着微流体芯片300A的x轴和y轴测量约为5毫米×约5毫米。

[0090] 过滤膜320定位在内部部分316中并且接触叶片330。叶片330形成立方体形状的细胞的图案。其他配置也是可能的。在图3A所示的示例中，叶片具有沿微流体芯片300A的x轴和y轴测量的约0.124毫米的厚度。

[0091] 叶片330限定了过滤膜320的方形过滤区域311。在该示例性实施方式中，微流体芯片的叶片330限定了以5×5网格布置的25个过滤区域311。叶片330可以在过滤膜320中限定少于25个过滤区域，例如9个过滤区域(如9个过滤区域以3×3网格排列)或16个过滤区域(如同16个过滤区域以4×4网格排列)。一些示例包括超过25个过滤器区域，例如64或100个过滤器区域。其他配置也是可能的。过滤膜320的每个过滤区域311限定沿着微流体芯片300A的x轴和y轴测量的约0.9毫米×约0.9毫米的活性区域。

[0092] 如在25个过滤区域之一的过滤区域311A的特写视图中所示，过滤膜320包括以规则的重复图案布置的矩形通孔，例如通孔305。然而，应当理解，本发明所述的任何过滤膜，不仅是图3A中所示的过滤膜，也可以包括在微流体芯片300A中，这取决于在特定应用中寻求捕获，成像和分析的细胞。过滤膜320中的矩形通孔约5μm高(沿微流体芯片300A的y轴测量)约10μm长(沿微流体芯片300A的x轴测量)。如下面详细描述的，也可以是具有其他尺寸的通孔。该实施例中的矩形通孔具有圆角或倒角。例如，矩形通孔305包括圆角，每个圆角具有1μm的半径。

[0093] 在一些示例中，过滤膜320的每个通孔305在空间上与其他通孔分开或偏移约20μm的水平间距(沿微流体芯片的x轴测量)并且垂直间距约为10μm(在微流体芯片的y轴上测量)。可以有利地选择偏移尺寸以最大化过滤膜320中的通孔的数量而不牺牲过滤膜320的结构完整性，从而最大化可以在过滤膜320中捕获的细胞的数量。在一些实施例中，通孔尺寸保持在间距尺寸的50％。如上所述，这些通孔尺寸和间隔是示例性的，并且基于在微流体芯片300A中待分离的感兴趣的物体(例如细胞或微珠)的具体尺寸和形状，其他构造也是可以的。微流体芯片300A中的每个通孔305的尺寸，形状和相对间隔可以基于滤膜320被设计为捕获的感兴趣对象(例如细胞)来具体选择，使得单个感兴趣的对象是在每个通孔305中捕获。

[0094] 在一个示例中，矩形通孔305的尺寸可以被设计成基于红细胞的在一般的盘形红细胞中捕获通孔中的单个红细胞。在另一个示例中，矩形通孔305的尺寸可以被设定为允许成熟的盘形红细胞(例如母体红细胞)穿过通孔305，同时利用胎儿有核红细胞的球形形状和较大尺寸将单个胎儿有核红细胞捕获并保持在单个通孔305中。因此，基于感兴趣的细胞的形状和大小，每个通孔的特征和尺寸可以被特殊设定。此外，可以选择单个过滤膜上的通孔密度，以及通孔相对于彼此的相对位置或排列，以优化在过滤膜中保留或“捕获”的感兴趣细胞的数量。优选地，可以旋转，翻转或移动本发明所述的过滤膜中的通孔的方向，以使暴露于细胞样品中通孔的数量最大化，从而最大化过滤膜捕获感兴趣细胞的数量。

[0095] 在其他实施例中，通孔305可以具有通常为圆形的开口(例如，如下面附图7至9C更详细地描述的)。圆形通孔可以被特别设计和配置成基于所寻找的细胞，微珠或其他物体的已知特征(例如但不限于尺寸和形态)捕获任何期望的细胞，微珠或其他物体。通过改变通孔的形状和尺寸，可以设计和制造多个过滤膜，用于隔离特别寻求的细胞或物体。在一个非限制性实例中，过滤膜设计成包括圆形孔，其形状和尺寸适于捕获特异性鉴定的目标细菌细胞。在一个非限制性示例中，圆形通孔具有约10μm的直径。其他尺寸也是可以的。例如，通孔305可具有约5μm的直径或约7μm的直径。例如，通孔305可具有约6.5μm的直径。在各种实施例中，通孔305可以是圆形的并且可以具有在约4μm至约10μm范围内的直径。

[0096] 图4示出了另一种示例性滤膜，其具有规则的重复矩形通孔图案。具体地，图4示出了具有多个通孔405的过滤膜420的一部分的近视图。根据本发明描述的实施方案的微流体芯片可包括多个过滤膜420或单个过滤膜420(如上附图3A所述)。在图4所示的实施例中，过滤膜420包括矩形通孔405，其大约4μm高(沿着微流体芯片的y轴测量)8μm长(沿着x轴测量微流体芯片)。其他尺寸也是可以的。

[0097] 过滤膜420的每个通孔405与其他通孔偏移约16μm的水平间距(沿过滤膜420的x轴测量)和约8μm的垂直间距(沿过滤膜420的y轴测量)。可以选择偏移尺寸以最大化过滤膜420中的通孔的数量，而不牺牲过滤膜420的结构完整性，从而最大化在过滤膜420中可以捕获的细胞的数量。

[0098] 上述通孔尺寸和间隔是示例性的，并且基于过滤膜420要捕获的感兴趣的物体(例如细胞或微珠)的具体尺寸和形状，其他构造也是可以的。例如，过滤膜420可包括约5μm高(沿微流体芯片的y轴测量)约10μm长的通孔(沿微流体芯片的x轴测量)。通孔可以彼此偏移大约20μm的水平间距(沿着过滤膜420的x轴测量)和大约10μm的垂直间距(沿着过滤膜420的y轴测量)。

[0099] 在该实施例中，矩形通孔405优选地包括圆角或倒角。包括圆角的矩形通孔增强了流过过滤膜420的流体。不受任何特定理论的束缚，可以认为，圆角或倒角角去除了通过通孔405的流体流中的死点，如果通孔的角包括尖锐的角边缘，则通常会发生死点。这些尖锐的角落拐角可能导致角落内或周围的流体和/或细胞积聚。以这种方式，本发明所述的通孔的实施例可有利地允许流体顺畅地流过过滤器。

[0100] 图3B示出了根据一个实施方案的另一示例性微流体芯片300B。图3B中所示的微流体芯片300B具有矩形通孔，其横截面形状类似于图3A中描绘的微流体芯片300A中包括的通孔。微流体芯片300B中的通孔沿着大约0.008毫米长度测量。微流体芯片的y轴沿着微流体芯片的x轴测量约为0.004毫米长。微流体芯片300B沿微流体芯片的x轴和y轴测量约为8毫米×约8毫米，并且具有约5.1毫米×约5.1毫米的有效面积。多个过滤器以4×4网格状图案排列。沿微流体芯片的x轴和y轴测量的每个过滤器约为1.2毫米×约1.2毫米。过滤器由沿着微流体芯片300B的x轴测量的约0.1毫米宽的叶片分开。其他配置也是可能的。

[0101] 图3C示出了根据一个实施方案的另一示例性微流体芯片。图3C中的微流体芯片300C具有矩形通孔，其横截面形状类似于微流体芯片300A和300B中包括的通孔。微流体芯片300C沿微流控芯片300C的x轴和y轴测量约为8毫米×约8毫米。包括在微流体芯片300C中的过滤器制造成具有与微流体芯片300A和300B中的过滤器不同的尺寸。微流体芯片300C中的多个过滤器以4×1网格状图案布置，并且沿微流体芯片的x轴测量约1.2毫米，沿微流体芯片的y轴测量约5.1毫米。其他配置也是可能的。

[0102] 图13示出了用于捕获具有矩形形状的通孔中的感兴趣细胞的微流体芯片的一个过滤膜的示例图像。图13描绘了过滤膜，其可以基本上类似于微流体芯片300A的过滤器之一。图13是由显微镜平台拍摄的过滤器的实际图像，其中样品中的感兴趣的细胞或样品的部分被捕获并保留在过滤器上精确限定且可识别的通孔中。

[0103] 实施例2-具有椭圆形通孔的过滤膜的微流体芯片

[0104] 图5A是根据本发明的具有规则的重复通孔图案505的过滤膜520的一部分的图像。图5B，5C，5D和5E是图5A的过滤膜520的单个通孔505A的特写图像。包含过滤膜520或多个过滤膜520的微流体芯片可基本上类似于本发明所述的微流体芯片。例如，虽然图5A中未示出，因为仅过滤膜520的一部分已被成像，但是过滤膜520可包括约5毫米×约5毫米的有效区域。另外，过滤膜520的实施例可由具有本发明所述尺寸的基板支撑，例如具有约8毫米×约8毫米的框架形外部部分的基板。

[0105] 具有大致椭圆形开口的多个通孔505以规则的重复图案布置在过滤膜520中。通孔505被配置成捕获并同时将感兴趣的物体(例如感兴趣的细胞)定位在过滤膜520的精确定义、清晰可辫位置上(每个位置对应于单个通孔505)。在该非限制性示例中，过滤膜520被设计和制造为包括通孔505，所述通孔505通常约5μm高(沿过滤膜520的y轴测量)约10μm长(沿x测量)。然而，如下面将详细描述的，单个通孔(例如图5B至图5E中所示的通孔505A)的实际尺寸可以从该目标5μm略微变化10μm的尺寸。期望的尺寸(例如在y方向上为5μm，或在x方向上为10μm)可以被称为通孔的“目标尺寸”，表示成品通孔的最小可允许尺寸。因此，通孔505的实际制造尺寸可以不小于5μm×10μm的目标尺寸。否则，通孔505可能无意捕获流体样本中不是感兴趣对象(例如，成熟的母体红细胞可以被捕获在已经完成尺寸小于约5μm×约10μm的通孔505中，即使这样的RBC不是感兴趣的细胞)。

[0106] 穿过过滤膜520内部延伸的通孔505的侧壁优选地为斜角或锥形，如图6A所示。图6A描绘了过滤膜520中的通孔505A的横截面视图。图6A是示意图，并未按比例绘制。通孔
505A包括在过滤膜520的第一侧512和第二侧514之间延伸的侧壁540a和540b，从而允许物体移位通过过滤膜520。如图6A所示，侧壁540a相对于线555a以角度545a逐渐变细，线555a垂直于过滤膜520的第二侧514。侧壁540也相对于过滤膜520的第二侧514的垂直线555b以角度545b逐渐变细。在该非限制性示例中，侧壁540a，540b分别相对于线555a，555b以约12°的角度逐渐变细。锥形侧壁540a和540b可以配置成使得位于过滤膜520的第一侧512上的通孔505A的第一开口550大于位于过滤膜520的第二侧514上的通孔505A的第二开口560。具有锥形侧壁(例如锥形侧壁540a和540b)的通孔可以捕获流过过滤膜520的样品中的更多感兴趣的细胞，并且在一些情况下可以更安全地保留捕获的感兴趣的细胞(同时额外的流体样品通过过滤器)。不受任何特定理论的束缚，可以理解具有较大尺寸的第一开口(例如第一开口550)允许感兴趣的细胞更自由且一致地进入通孔505A，而第二开口(例如第二开口
560)具有更小的尺寸以抑制感兴趣的细胞完全穿过第二开口560并从滤膜520的第二侧514流出，从而有助于改善通孔505A中细胞的捕获。

[0107] 在一个非限制性实施方案中，通孔成角度的侧壁的特征具有双重功能：一个是物理流体动力学捕获器，防止捕获的细胞或珠子进一步横向或定向运动，另一个是过滤或隔离膜。如果通孔不包括锥形侧壁，则通孔可以仅用于防止某些细胞流过过滤膜，但是不会用作目标尺寸的细胞或珠子的流体动力捕获器或捕获网格，因此将它们保持并固定在通孔内或部分地固定在通孔内。在圆形通孔的一个非限制性实例中，膜的厚度和通孔侧壁的角度决定了滤膜的捕获和固定特性，以及通孔底部的最小直径，确定其过滤或隔离属性。通过独立地选择锥形侧壁的角度和通孔的最小尺寸(沿x轴和y轴测量)，可以在非圆形通孔中实现类似的效果。

[0108] 在一些实施例中，角度545a和545b基本相等，而在其他实施例中，由于设计规格或制造差异，侧壁540a和540b可以以不同的角度逐渐变细。在一些实施例中，角度545a和545b可以在大约0度和大约20度之间。在图6A所示的非限制性实施例中，例如，角度545a和545b约为12度。在另一个实施例中，角度545a和545b可以在大约5度和大约10度之间。可以根据特定应用和要在过滤膜中捕获的感兴趣细胞来选择角度545a和545b。然而，角度545a和545b以及锥形侧壁540a和540b不会导致第一开口550和第二开口560的尺寸小于目标尺寸。

[0109] 根据本说明书描述的锥形侧壁的其他变型，现在将根据附图6B，6C和6D进行描述。在一些实施例中，穿过过滤膜520内部延伸的通孔505的侧壁可以成斜角或锥形，其具有一个或多个角度，该角度可以相对于第一和/或第二侧面512的垂直线而变化。过滤膜520如图
514所示，如图6B至6D所示。图6B至6D描绘了过滤膜520中的通孔505B至505D的各种实施例的横截面视图。图6B至6D是可以类似于图6A的通孔505A的示意图，并且未按比例绘制。然而，图6A至6D示出了具有两个或更多个区域的通孔505A至505D(例如，图6B示出了两个区域
541a，541b和542a，542b以及图6C和6D示出了三个区域541a，541b；542a，542b；543a，543b)，其中每个区域可以相对于过滤膜520的第一侧512和/或第二侧514的垂直线(例如，555a，
555b，556a和/或556b)以不同的角度(例如，545a，545b；546a，546b；和547a，547b)逐渐变细。在一些实施例中，沿锥形侧壁540a和540b可以有1、2、3、4或更多个区域，每个区域相对于过滤器的第一侧和/或第二侧的垂直线以不同的角度逐渐变细。

[0110] 图6E示出了包括侧壁540a和540b的通孔505E的实施例，侧壁540a和540b以曲率半径弯曲。图6E是可以类似于图6A的通孔505A的示意图，并且未按比例绘制。在一些实施例中，曲率半径沿着滤膜520的第一表面512和第二表面514之间的侧壁540a和540b可以是恒定的。在其他实施例中，曲率半径可以沿着侧壁540a和540b变化。例如，图6A至6E的各种实施例可以组合，使得侧壁540a和540b具有多个区域，其中每个区域可以在某个半径处弯曲(每个半径可以不同或相同)和/或在相对于滤膜的第一侧和/或第二侧的垂直线的各种角度。

[0111] 现在转到图5B，5C，5D和5E，提供了图5A的过滤膜520的通孔505A的特写图像。具有锥形侧壁540a，540b的通孔505A代表图5A的过滤膜520中的通孔505.图5B和5D是从过滤膜520的第一侧512取得的通孔505A的第一开口550的图像。图5C和5E也是从过滤膜520的第一侧512获得的图像，但是旨在示出位于过滤膜520的第二侧514上的第二开口560的实际尺寸。

[0112] 如上所述，通孔505A具有在过滤膜520的y方向上测量的5μm的目标高度尺寸(换句话说，过滤膜520被设计为包括具有第一开口550和第二开口560的通孔505。在y方向上高度不小于5μm)。然而，如图5B中提供的图像所示，在y方向上测量的通孔505的第一侧512上的开口550的实际高度沿着x轴和每个的y方向高度变化。三次测量的结果大于5μm的目标尺寸。例如，开口550在y方向上的测量高度在沿x轴的三个不同点处为7.578μm，7.511μm和7.745μm。另外，如图5C中提供的图像所示，在y方向上测量的第二侧514上的开口560的实际高度也沿x轴变化，并且在三次测量中的每一处的y方向高度是大于5μm的目标尺寸。例如，开口560在y方向上的测量高度在沿x轴的三个不同点处为6.343μm，6.143μm和6.376μm。此外，由于通孔505A的第一侧512上的开口550的平均高度大于通孔505A的第二侧514上的开口560的高度的平均值，因此从图5B和图5C中所示的测量中可以明显看出上面参照图6A描述的505A包含锥形侧壁。

[0113] 如图5D中提供的开口550的图像所示，通孔505A的第一侧512上的x方向上的第一开口550的实际长度约为13.12μm。如图5E的图像所示，通孔505A的第二侧514上的开口560的实际长度约为11.65μm。因此，在x方向上测量的开口550和560的长度都大于10μm的目标长度尺寸。另外，由于通孔505A的第一侧512上的开口550的长度大于通孔505A的第二侧514上的开口560的长度，因此从图5D和5E所示的测量中可以明显看出上面参照图6A描述的505A包含锥形侧壁。

[0114] 实施例3-具有圆形通孔的过滤膜的微流体芯片

[0115] 图7A示出了根据一个实施方案的示例性微流体芯片700A。在该非限制性示例中，微流体芯片700A包括基板710和过滤膜720。基板710包括外部部分715和内部部分716，内部部分716基本上类似于参照图3A描述的外部部分315和内部部分316.具体地，基板710包括框架形外部部分715和内部部分716包括叶片730。然而，如下面将详细描述的，微流体芯片700A中的过滤膜720包括通孔705，其不同于微流体芯片300A中的过滤膜320中的通孔305。

[0116] 本实施例中的框架形外部部分715包括沿着内部部分716的垂直边缘765的位置标识符“01”到“10”，以及沿着内部部分716的水平边缘770的位置标识符“A”到“J”。位置标识符可以是标识每个过滤器区域711相对于其他过滤器区域711的位置的标签。通过沿垂直边缘765和水平边缘770参考标识符，可以识别过滤膜720中的每个过滤区域711的精确位置。这样的信息可以被优先使用在以下参考图12详细描述的一个过程中，当在滤膜720中捕获的物体被成像并分析以确定它们是否是感兴趣的物体时，和当从滤膜上收获确认的目标物时。

[0117] 在该实施例中，参考相对于基板710的表面上的一个或多个标记775的特定x和y坐标，已知每个通孔705的精确位置。该实施例中的标记775位于基板710的四个角附近的外部部分715中。其他地方也是可能的。过滤膜720中的每个通孔705的已知的，精确限定的x，y位置允许在成像和分析过程的多个不同步骤期间识别，定位和重新定位在过滤膜720上每个通孔705。下面附图12描述。例如，可以在初始分析步骤期间初始记录其中捕获物体的通孔705A的精确x，y位置。该初始分析步骤可以包括获取每个过滤器区域725的低分辨率图像以确定哪些通孔705具有捕获的物体。然后，该通孔705A的精确x，y位置可以在稍后的步骤中使用，例如，当成像平台仅获取已被识别为可能包含感兴趣对象的通孔705的高分辨率图像时。在通孔705A中捕获的物体已经被确认为感兴趣的物体之后，该通孔705A的精确的x，y位置可以再次用于将收割平台(例如针)引导到确切的位置。通孔705用于从通孔705A移除确认的感兴趣对象。

[0118] 应当理解，图7A中的微流体芯片700A的位置标识符和标记可以应用于本发明所述的所有微流体芯片。另外，识别，标记和定位特定过滤区域725和特定通孔705的其他机构也是可能的，并且不限于上述位置标识符765,770和标记775。

[0119] 微流体芯片700A还包括过滤膜720，过滤膜720定位在基板710的内部部分716上并接触叶片730。在该非限制性实施例中，叶片730形成立方体形状的单元的图案。其他配置是可能的(例如但不限于上面附图1A描述的蜂窝状单元140)。叶片730限定过滤膜720的方形过滤区域711。在该示例性实施方式中，基板710的叶片730限定了以5×5网格布置的25个过滤区域711。微流体芯片700A的叶片730可以限定更少或更多的过滤区域，这取决于微流体芯片700A的特定应用。过滤膜720的每个过滤区域711限定了有效区域，该有效区域基本上类似于由附图3A描述的过滤区域311限定的有效区域。在该非限制性方面，每个过滤区域711约为0.9毫米。沿微流体芯片700A的x轴和y轴测量约0.9毫米，过滤膜720的总有效区域约为20.25毫米。其他配置也是可能的。

[0120] 如在25个过滤区域之一的过滤区域71A的近视图中所示，过滤膜720包括以规则的重复图案布置的圆形通孔，例如通孔705A。然而，应当理解，本发明所述的任何过滤膜，不仅是图7A中所示的过滤膜，可以包括在微流体芯片700A中，这取决于在特定应用中寻求捕获，成像和分析的细胞。过滤膜720中的圆形通孔的直径通常为5μm。具有其他尺寸的通孔是可能的，例如直径约7μm或直径约10μm。在一个实施例中，过滤膜720包括直径约6.5μm的通孔。

[0121] 过滤膜720的每个通孔705在空间上与其他通孔分开或偏移约10μm的中心间距。例如，每组三个通孔705形成等边三角形，其具有约10μm长度的三个边连接每个通孔705的中心。该等边三角形的边的长度可以称为通孔705的“间距”。每个通孔705也可以与相同行中的相邻通孔705分开或“偏移”大约10μm的偏移距离785。可以有利地选择通孔705的间距和偏移，以最大化过滤膜720中的通孔的数量，而不牺牲过滤膜720的结构完整性，从而最大化可以在过滤膜720中捕获的细胞的数量。如上所述，上述通孔尺寸，偏移间隔和间距是示例性的，并且基于在微流体芯片700A中待分离的感兴趣对象(例如细胞或微珠)的特定尺寸和形状，其他配置是可能的。在一个示例中，通孔相对于彼此间隔开，间距和偏移距离大致是通孔的目标尺寸的两倍，其中圆形通孔的目标尺寸是通孔的最小直径。因此，直径等于约7μm的圆形通孔可以以约14μm的间距和14μm的偏移距离分开，而直径等于约10μm的圆形通孔可以以约为20μm的间距分开。偏移距离为20μm。其他配置也是可能的。

[0122] 微流体芯片700A中的每个通孔705的尺寸，形状和相对间隔可以基于滤膜720被设计为根据捕获的感兴趣对象(例如细胞)来具体选择，使得单个感兴趣的对象是在每个通孔705中捕获。在根据另一实施例的一个示例性过滤器700A中，包括圆形通孔的过滤膜720可以被特别设计和配置成基于所追求的细胞，微珠或其他物体形态的已知特征(例如但不限于尺寸)捕获任何期望的细胞、微珠或其他物体。通过改变通孔的形状和尺寸，可以设计和制造多个过滤器，用于隔离特别寻找的细胞或物体。在一个非限制性实例中，包括在集成微流体芯片中的过滤膜720被设计为包括具有圆形开口的通孔，所述圆形开口的形状和尺寸适于捕获特定识别的感兴趣细菌细胞。因此，可以基于细胞或感兴趣对象的形状和大小来具体选择每个通孔的特征和尺寸。此外，可以选择单个过滤膜上的通孔密度，以及通孔相对于彼此的相对位置或排列，以优化在过滤膜中保留或“捕获”的感兴趣细胞的数量。

[0123] 图8A是根据本发明的具有规则的重复图案的通孔805的过滤膜820的一部分的图像。图8B和8C是图8A的过滤膜820的单个通孔805A的特写图像。包含过滤膜820或多个过滤膜820的微流体芯片可基本上类似于本发明所述的微流体芯片。例如，虽然图8A中未示出因为仅过滤膜820的一部分已被成像，但是过滤膜820可包括沿x轴和y轴测量的约5毫米×约5毫米的有效区域。另外，过滤膜820的实施例可由具有本发明所述尺寸的基板支撑，例如具有约8毫米×约8毫米的框架形外部部分的基板。

[0124] 具有大致圆形开口的多个通孔805以规则的重复图案布置在过滤膜820中。通孔805被配置成捕获并同时将感兴趣的物体(例如感兴趣的细胞)定位在过滤膜820上的精确限定的，清晰可辨的位置(每个位置对应于单个通孔805)。在该非限制性示例中，过滤膜820被设计和制造为包括通孔805，通孔805的直径通常约为7μm。然而，如下面将详细描述的，单个通孔(例如图8B和8C中所示的通孔805A)的实际尺寸可以从该目标7μm尺寸略微变化。所需尺寸(例如直径为7μm)也可称为通孔的“目标尺寸”，表示成品通孔的最小可允许尺寸。因此，通孔805的实际制造尺寸可以不小于7μm的目标直径。否则，通孔805可能无意地捕获不是感兴趣对象的流体样本中的对象(例如，在直径小于约7μm的完成尺寸的通孔805中捕获的对象，即使这样的对象不是出于兴趣)。另外，延伸通过过滤膜820内部的通孔805的侧壁有利地以与上面参照图6A描述的方式基本类似的方式成斜角或锥形。

[0125] 现在转向图8B和8C，提供了图8A的过滤膜820的通孔805A的特写图像。具有锥形侧壁的通孔805A代表图8A的过滤膜820中的通孔805。图8B是从过滤膜820的第一侧812截取的通孔805A的第一开口850(例如，类似于参照图6描述的开口550的第一开口)的图像(例如，侧面基本相似)附图6A)描述的过滤膜520的第一侧512。图8C也是从过滤膜820的第一侧812截取的图像，但旨在示出位于过滤膜820的第二侧814上的第二开口860的实际尺寸。

[0126] 如上所述，通孔805A具有7μm直径的目标尺寸(换句话说，过滤膜820设计成包括具有第一开口的通孔805和直径不小于7μm的第二开口)。然而，如图8B中提供的图像所示，第一侧812上的通孔805的第一开口850的实际直径大于7μm的目标尺寸。例如，第一开口550的测量直径为9.067μm。另外，如图8C中提供的图像所示，第二侧814上的第二开口860的实际直径大于7μm的目标尺寸。例如，第二开口560的测量直径为8.268μm。进一步地，由于过滤膜820的第一侧812上的通孔805A的第一开口850的直径大于过滤膜820的第二侧814上的通孔
805A的第二开口860的直径，从图8B和8C所示的测量中可以明显看出上面参照图6A的描述包含锥形侧壁805A。

[0127] 图9A是根据本发明的具有通孔905的规则重复图案的过滤膜920的一部分的图像。图9B和9C是图9A的过滤膜920的单个通孔905A的特写图像。上面附图8A至8C描述的特征可以应用于过滤膜920，除了通孔905具有与过滤膜820的通孔805不同的尺寸。例如，过滤膜
920基本上类似于参照图8A至图8C描述的过滤膜820，然而，通孔905的目标尺寸直径为10μm(而不是直径7μm)。在一个非限制性方面，过滤膜920包含在微流体芯片中，所述微流体芯片设计用于捕获直径通常大于10μm的感兴趣细胞，并且不捕获其他物体(例如，不感兴趣的细胞)通常，其直径小于10μm(例如，直径约9μm)。诸如具有通常直径为7μm的圆形通孔705的过滤膜720的过滤膜将不太适合于该示例性实施方式，因为这样的过滤膜将同时捕获感兴趣的细胞(通常直径大于10μm)和不感兴趣的细胞(通常直径约9μm)。

[0128] 转到图9B和9C，提供了图9A的过滤膜920的通孔905A的特写图像。具有锥形侧壁的通孔905A代表图9A的过滤膜920中的通孔905。图9B是从过滤膜920的第一侧912截取的通孔905A的第一开口950(例如，类似于附图6A描述的开口550的第一开口)的图像(例如，基本上是侧面)类似于参照图6A描述的过滤膜520的第一侧512。图9C也是从过滤膜920的第一侧
912截取的图像，但旨在示出位于过滤膜820的第二侧914上的第二开口960的实际尺寸。

[0129] 如上所述，通孔905A具有直径为10μm的目标高度尺寸。然而，如图9B中提供的图像所示，第一侧912上的通孔905的第一开口950的实际直径大于10μm的目标尺寸。例如，第一开口950的测量直径为12.24μm。另外，如图9C中提供的图像所示，第二侧914上的第二开口960的实际直径大于10μm的目标尺寸。例如，第二开口的测量直径为11.06μm。此外，由于过滤膜920的第一侧912上的通孔905A的第一开口950的直径大于过滤膜920的第二侧914上的通孔905A的第二开口960的直径，因此从图9B和9C中所示的测量值中明显看出上面参照图
6A描述包含锥形侧壁905A。

[0130] 图7B示出了根据一个实施例的另一示例性微流体芯片700B。图7B中所示的微流体芯片700B具有圆形通孔，其横截面形状类似于图7A中所示的微流体芯片700A中包括的通孔。微流体芯片700B中的通孔的直径约为6.5μm，并且沿着微流体芯片700B的x轴测量间隔约0.013毫米。微流体芯片700B沿微流体芯片的x轴和y轴测量约为8毫米×约8毫米，并且具有约5.1毫米×约5.1毫米的有效面积。多个过滤器以4×4网格状图案排列。沿微流体芯片的x轴和y轴测量的每个过滤器约为1.2毫米×约1.2毫米。过滤器由沿着微流体芯片测量的约0.1毫米宽的叶片分开。其他配置也是可能的。

[0131] 图7C示出了根据一个实施方案的另一示例性微流体芯片。图7C中的微流体芯片700C具有圆形通孔，其横截面形状类似于微流体芯片700A和700B中的通孔。沿着微流体芯片700C的x轴和y轴测量的微流体芯片700C约为8毫米×约8毫米。包括在微流体芯片700C中的过滤器制造成具有与微流体芯片700A和700B中的过滤器不同的尺寸。微流体芯片700C中的多个过滤器以4×1网格状图案布置，并且沿着微流体芯片的x轴测量约1.2毫米，沿微流体芯片的y轴测量约5.1毫米。其他配置也是可能的。

[0132] 实施例4-具有用于捕获微珠的过滤膜的微流体芯片

[0133] 图10A示出了根据一个实施方案的配置成捕获和分离微珠的示例性微流体芯片1000。图10B是微流体芯片1000的一部分的近视图。在该非限制性示例中，微流体芯片1000包括基板1010和滤膜1020。基板1010包括框形外部部分1015和矩形内部部分1016。其他配置也是可能的。在该示例中，外部部分1015沿着微流体芯片1000的x轴和y轴测量约为2毫米×约2毫米。基板1010具有沿微流体芯片1000的z轴测量的约5μm的厚度。其他厚度也是可能的。在该非限制性示例中，过滤膜1020设置在内部部分1016上或内部。沿着微流体芯片1000的x轴和y轴测量的过滤膜1020约为0.48毫米×约0.65毫米。因此，该示例中的过滤膜1020限定了约0.312毫米的有效区域。在该示例中，微流体芯片1000的有效区域相对较小，使得基板1010不包括叶片或设置在过滤膜1020的第二侧下方并与其接触的任何其他支撑结构，以为过滤膜1020提供额外的支撑。

[0134] 图10B示出了过滤膜1020的一部分1011的近视图。过滤膜1020包括以规则的重复图案布置的圆形通孔，例如通孔1005。然而，应当理解，本发明所述的任何过滤膜，不仅是图10A和10B中所示的过滤膜，可以包括在微流体芯片1000中，这取决于在特定应用中寻求捕获、成像和分析的物体。在图10所示的实施方案中，过滤膜1020中的圆形通孔的直径通常为
5μm，目标尺寸变化公差约为5％。具有其他尺寸的通孔是可能的，如下面详细描述的。

[0135] 过滤膜1020的每个通孔1005在空间上与其他通孔分开约10μm的中心间距。例如，每组三个通孔1005形成等边三角形，其具有连接每个通孔1005的中心的约10μm长度的三个边。该等边三角形的边的长度可以称为通孔1005的“间距”。每个通孔1005还可以与相同行中的相邻通孔1005分开或“偏移”沿着滤膜1020的x轴测量的约10μm的偏移距离1085。间距和偏移距离可以优选地以最大化过滤膜1020中的通孔的数量而不牺牲过滤膜1020的结构完整性，从而可以最大化过滤膜1020中捕获的感兴趣的物体(例如微珠)的数量。在图10所示的实施例中，过滤膜1020包括3,366个圆形通孔，类似于通孔1005。如上所述，这些通孔尺寸和间隔是示例性的，并且基于在微流体芯片1000中待分离的感兴趣的物体(例如微珠)的具体尺寸和形状，其他配置是可能的。

[0136] 微流体芯片1000中的每个通孔1005的尺寸，形状和相对间隔可以基于被设计为捕获的感兴趣对象(例如微珠)的过滤膜1020来具体选择。在其他实施例中，通孔1005可以具有通常为圆形的开口。在一个实施例中，包括圆形通孔的过滤器1020可以被特别设计和配置成捕获样品中已知特征(例如但不限于尺寸和形态)的微珠。通过改变通孔的形状和尺寸，可以设计和制造多个过滤器，用于隔离具有特定特征的微珠。因此，可以基于微珠感兴趣的形状和尺寸来具体选择每个通孔的特性和尺寸。此外，可以选择单个滤膜上的通孔密度，以及通孔相对于彼此的相对位置或布置，以优化在滤膜中保留或“捕获”的感兴趣的微珠的数量。

[0137] 图11A和11B示出了根据另一个实施方案的示例性微流体芯片1100，其配置成捕获和分离微珠。微流体芯片1100包括基板1110，基板1110基本上类似于参照图10描述的基板1010，具有外部部分1115和具有类似特征的内部部分1116。然而，在该非限制性实施方案中，微流体芯片1100包括过滤膜1120，过滤膜1120具有多个圆形通孔1105，目标尺寸约为7μm。该实施方式中的通孔1105布置成具有约12μm的间距1180。通孔1105还与相同行中的相邻通孔1105分开沿着微流体芯片1100的x轴测量的10μm的偏移距离1185。基于该尺寸和通孔间隔，过滤膜1120包括2,461个通孔。另外，目标尺寸变化的容差约为5％。

[0138] 使用具有滤膜的微流体芯片的示例方法

[0139] 图12是示出根据本发明公开的实施例的实现微流体芯片的示例性过程1200的流程图。过程1200示出了至少一种使用根据本发明公开内容公开的微流体芯片从样品获得感兴趣细胞(例如胎儿有核红细胞)的方法。如图12中所示，方法1200可以包括一个或多个功能，操作或动作，如一个或多个操作1210-1270所示。

[0140] 值得注意的是，所述示例可以被描述为一个过程，所述过程可以被描绘为流程图，流程图，有限状态图，结构图或框图。尽管流程图可以将操作描述为顺序过程，但是许多操作可以并行或同时执行，并且可以重复该过程。另外，可以重新安排操作的顺序当进程在其操作完成时终止。过程可以对应于方法，功能，过程，子程序，辅程序等。当进程对应于软件功能时，其终止对应于函数返回到调用函数或主函数。

[0141] 为了说明的目的，以下描述提供了用于分离，鉴定和收获用于非侵入性产前诊断的胎儿有核红细胞的方法。尽管本发明公开的示例性实施方案可以描述从母体血液样品中分离胎儿有核红细胞用于非侵入性产前诊断，但是本领域技术人员将理解，本发明描述的方法和装置的原理和概念可应用于无创产前DNA检测之外。例如，本发明公开的方法和装置可以被配置用于分离微珠，用于肿瘤学的肿瘤细胞，或任何其他病理状况，其中一种细胞可以基于大小，形态，核染色或生物标志物鉴定和另一种细胞区分。

[0142] 本发明公开的方法和装置的实施方案可以使用基于形态学的分离结合基于亲和力和/或基于生物标记的检测和鉴定来获得感兴趣的细胞。通过根据本发明描述的实施方案在集成微流体芯片上组合这些过程，方法1210解决了与从细胞样品中分离感兴趣的特定细胞相关的长期挑战。与流式细胞术中使用的荧光激活细胞分选(“FACS”)不同，参考方法1200公开的实施方案是基于可视化的方法，其类似于在显微镜平台上进行的成像细胞计数，但有利地解决了与先前成像细胞计数相关的缺点-基于系统和方法。方法1200可以是部分或全部自动化的，这为本发明中描述的实施例增加了另外的益处。

[0143] 细胞计数，包括流式细胞术和成像细胞计数，是对细胞特征的测量和/或鉴定。细胞计数方法被配置为测量许多参数中的任何一个，包括例如细胞大小，细胞计数，细胞形状和结构，细胞周期阶段，DNA含量，以及细胞表面上或细胞内特定蛋白质的存在或不存在。有许多应用可以使用不同的细胞计数方法。例如，细胞计数可用于表征和计数血液样品中的血细胞，细胞生物学研究和医学诊断以表征病理性疾病(例如，癌症和AIDS)中的细胞。成像细胞计数法是一种通过使用光学显微镜对大量细胞进行静态成像来操作的细胞计数法。在分析之前，可以通过用核染色剂，生物标记物和/或荧光染料标记细胞来染色细胞以增强对比度或检测特定分子。

[0144] 本发明公开的微流体芯片的实施方案的一个非限制性优点是它可以用于成像细胞计数，以有利地开发特定感兴趣区域中的所有捕获细胞的表示(例如，获得图像或拍照)。在一个图像中。在一个非限制性方面，特定感兴趣区域是微流体芯片的单个滤膜的多个区域中的一个区域。在另一个非限制性方面，特定感兴趣区域是布置在包括一个单个滤膜的微流体芯片中的一个过滤膜。在另一个实例中，感兴趣的特定区域是布置在微流体芯片中的多个过滤膜的一个过滤膜。由于过滤膜中通孔的精确定义和重复的网格图案，每个捕获的和流体动力学保留的细胞的精确位置可以使用其在过滤膜中的相应通孔的独特位置来识别。在一个实施方案中，以这种方式捕获和同时定位感兴趣的细胞允许分析感兴趣的细胞以验证捕获的细胞实际上是感兴趣的细胞。例如，在用核染色，特定生物标记物和/或荧光染料染色和/或标记细胞样品的情况下，用于识别细胞的用户定义特征，可以容易地识别具有这些特征的捕获细胞，并且它们的位置可以容易返回以用于随后的更详细的捕获细胞分析或用于操纵或提取捕获的细胞。在另一个实施方案中，以这种方式捕获和同时定位感兴趣的细胞允许感兴趣的细胞经历细胞裂解和DNA提取的步骤，用于下游遗传分析。例如，可以评估捕获的，分离的和分选的感兴趣的细胞的核酸分子的核苷酸序列或基因的表达。

[0145] 优选地，本发明实施例的过滤器可将捕获的感兴趣的细胞与不感兴趣的捕获细胞区分开，这是基于第二标准：对感兴趣的细胞特异的生物标志物(在该非限制性实例中，胎儿有核红细胞)。例如，在样品通过过滤器之前或之后并且在过滤膜中捕获细胞，可以用核染色，特定生物标记物和/或荧光染料对细胞进行染色和/或标记，用于选择捕获的细胞的子集的阳性或阴性(例如，捕获的胎儿有核红细胞的阳性选择和非胎儿有核红细胞的捕获细胞的阴性选择)。

[0146] 如本发明所用，“显微镜平台”是指配置成执行细胞成像的系统和/或设备。在一个方面，显微镜平台包括荧光显微镜。显微镜平台可包括配置有可调节或多倍放大物镜(例如，10x，40x，60x等)的成像装置，以及配置成基于通过成像装置镜头接收的光获得图像的图像传感器。在一些实施方案中，成像装置包括视场(“FOV”)，其被配置成匹配微流体芯片的过滤膜的至少一个区域的尺寸和形状，如由支撑基板的叶片所限定的滤膜。在一些实施例中，显微镜平台可以被配置为沿着包括多个过滤区域的微流体过滤膜扫描并获得每个过滤区域的至少一个图像，其中每个过滤区域的尺寸对应于成像装置的场视图。

[0147] 方法1200可以在操作1210“提供样本”开始。“操作1210之后可以进行操作1220，”将样品应用于集成在微流体芯片上的过滤膜。“操作1220之后可以是操作1230，”标记样品中的细胞。“操作1230之后可以是操作1240，”分离样品中感兴趣的细胞。在一些情况下，操作1220和操作1240同时执行。操作1240之后可以是操作1250，“在过滤膜中捕获的成像细胞。操作1250之后可以是可选操作1260，“移除不感兴趣的单元”。该方法接下来转到操作1270，“收集确认的感兴趣的细胞”。

[0148] 在操作1210，”提供样品“，可以提供包含感兴趣的细胞的样品。例如，含有一个或多个胎儿有核细胞(例如红细胞)的母体样品可以使用从人类怀孕母亲获得的抽血样本。孕妇样本可在孕早期(妊娠前三个月)，妊娠中期(妊娠期约4-6个月)或妊娠晚期(妊娠期约7-9个月)获得。在一些实施方案中，从怀孕的人类母亲获得血液样品，即使在妊娠终止后。通常，获得的样品是血液样品。

[0149] 在操作1220，“将样品应用于集成在微流体芯片上的过滤膜”，可以使用具有适合于选择胎儿有核血细胞的本发明所述的过滤膜的微流体芯片的实施方案。在一些实施方案中，在该非限制性实施例中使用的微流体芯片和过滤膜基本上类似于图1A至11B中描绘的微流体芯片。因此，在一些实施方案中，当成熟红细胞通过具有允许成熟红细胞通过但不是胎儿有核红细胞的大小和/或形状的过滤孔时，可以捕获胎儿有核红细胞。

[0150] 在一些实施方案中，过滤膜可以涂覆有选择性结合胎儿有核细胞的结合部分或亲和分子，例如胎儿有核红细胞。例如，可以使用特异性结合胎儿有核红细胞的抗体来包被滤膜，从而保留胎儿有核红细胞，同时成熟红细胞通过滤膜。

[0151] 在一些实施方案中，在操作1220施加到滤膜的样品可以被不感兴趣的细胞(例如，有核母体红细胞)占主导地位(>50％)。在某些情况下，应用于滤膜的样品的有核胎儿细胞，有核胎儿细胞至少占样本中全部细胞的2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，本发明公开的微流体芯片的实施方案的使用已经除去至少来自样品的50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的所有不需要的分析物(例如，母体细胞，例如血小板和白细胞，成熟的RBC)。

[0152] 在操作1230，“标记样品中的细胞”细胞可以在染色过程中用染料直接或间接标记。可以使用荧光显微术中使用的任何荧光染料。例如，有核胎儿红细胞可以用指示细胞某些特征的染料直接或间接标记。在一些实施例中，操作1230的标记过程可以在操作1220之前，期间或之后执行。在一些实施方案中，可以使用染色DNA的染料，例如吖啶橙(AO)，溴化乙锭，苏木精，尼罗蓝，Hoechst，番红花素或DAPI。在一些实施方案中，可以使用细胞类型特异性染料，例如，特异性标记胎儿细胞或非胎儿细胞的染料。细胞类型特异性染料可用于直接或间接标记细胞，例如，通过细胞类型特异性抗体。所涉及的标记策略可以顺序进行或同时进行。

[0153] 可以使用多种荧光分子或染料中的任何一种来标记本发明提供的方法中的细胞，包括但不限于Alexa Fluor 350，AMCA，Alexa Fluor 488，异硫氰酸荧光素(FITC)，GFP，RFP，YFP，BFP。，CFSE，CFDA-SE，DyLight 288，光谱绿，Alexa Fluor 532，罗丹明，罗丹明6G，Alexa Fluor 546，Cy3染料，四甲基罗丹明(TRITC)，光谱橙，Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 568，丽丝胺罗丹明B染料，Alexa Fluor 594，Texas Red染料，SpectrumRed，Alexa Fluor 647，Cy5染料，Alexa Fluor 660，Cy5.5染料，Alexa Fluor 680，藻红蛋白(PE)，碘化丙啶(PI)，多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)，PE-Alexa Fluor 700，PE-Cy5(TRI-COLOR)，PE-Alexa Fluor 750，PE-Cy7，APC，APC-Cy7，Draq-5，太平洋橙，胺水，太平洋蓝，Alexa Fluor 405，Alexa Fluor 430，Alexa Fluor 500，Alexa Fluor 514，Alexa Fluor-555，Alexa fluor-568，Alexa Fluor-610，Alexa Fluor-633，DyLight 405，DyLight 488，DyLight
549，DyLight 594，DyLight 633，DyLight 649，DyLigh t 680，DyLight 750或DyLight
800。这种荧光分子或染料在被具有特别相应的光波长的光源照射或激发时可产生相应的光特征或光谱。因此，使用特定荧光分子或染料可产生存在于胎儿细胞上或胎儿细胞内的特定核酸，抗体或基于抗体的片段探针的指示物。

[0154] 在一些实施方案中，胎儿生物标志物可用于在图1200的操作1230处标记一个或多个胎儿细胞。例如，这可以通过基于在胎儿发育期间差异表达的基因(例如，DYS1，DYZ，CD-71，MMP14)的相对表达来区分胎儿和母体细胞来进行。在本发明的一个实施方案中，检测一种或多种基因的转录物或蛋白质表达，包括MMP14，CD71，GPA，HLA-G，EGFR，CD36，CD34，HbF，HAE9，FB3-2，H3-3，促红细胞生成素受体，HBE，AFP，APOC3，SERPINC1，AMBP，CPB2，ITIH1，APOH，HPX，β-hCG，AHSG，APOB，J42-4-d，2,3-生物磷酸甘油酸酯(BPG)，碳酸酐酶(CA)，或胸苷激酶(TK)用于富集，纯化，计数，鉴定，检测或区分胎儿细胞。表达可包括从这些基因或蛋白质表达的转录物。在本发明的一个实施方案中，表达一种或多种基因，包括MMP14，CD71，GPA，HLA-G，EGFR，CD36，CD34，HbF，HAE9，FB3-2，H3-3，促红细胞生成素受体，HBE，AFP。AHSG，J42-4-d，BPG，CA或TK用于鉴定，纯化，富集或计数胎儿有核细胞，例如胎儿有核红细胞。

[0155] 在本发明的另一个实施方案中，称为滋养细胞的胎儿细胞是使用本发明所述的过滤器分离的感兴趣的细胞。可以标记对滋养细胞特异的生物标志物并用于区分胎儿滋养层细胞(在过滤器中捕获并且是感兴趣的对象)来自母体细胞(其也在过滤器中捕获但不是感兴趣的对象)。可用于标记，鉴定，检测或区分胎儿滋养层细胞的生物标志物包括(但不限于)细胞角蛋白5,6,7,8,10,13,14,18,19；CD147，CD47，CD105，CD141，CD9，HAI-1，CD133，HLA-G，人胎盘催乳素，PAI-1和IL-35。其他生物标志物不是胎儿滋养层细胞特异性但可用于标记，鉴定，检测或区分感兴趣的母体细胞中感兴趣的胎儿细胞，包括(但不限于)CD68，CD105，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，NDOG，GB25，β-hCG和3b-羟基-5-烯类固醇脱氢酶。上述生物标记物列表提供了用于标记，鉴定，检测或区分胎儿细胞与母体细胞的合适生物标记物的实例，并且不旨在限制本发明所述的方法和装置，其可以捕获和鉴定任何过滤的感兴趣的细胞。无论感兴趣的细胞是否具有用于区分过滤器中捕获的感兴趣的细胞与在过滤器中捕获但不是感兴趣的细胞的另一个物体的生物标记物。

[0156] 在操作1240，“分离样品中感兴趣的细胞”，可以使用本发明附图1A至11B描述的微流体芯片和滤膜的实施方案分离感兴趣的细胞，例如胎儿细胞。分离感兴趣的细胞可包括将感兴趣的单个细胞定位在滤膜中的不同的，精确限定的位置，例如单个通孔。如上所述，当胎儿有核红细胞保留在过滤器的单个通孔中时，每个胎儿有核红细胞可以与样品中的其他细胞(其他胎儿有核红细胞，非有核胎儿细胞，母体细胞等)分离。而其他不感兴趣的细胞(例如成熟的母体红细胞)穿过过滤膜的通孔并且不保留在过滤膜中。因此，分离操作1240可以与操作1220同时执行。

[0157] 在操作1250，“在过滤膜中捕获成像细胞”在操作1220和/或操作1240处在过滤器中捕获的细胞被成像用于下游的进一步分析和基因测试。在一些实施例中，在操作1250处的成像还包括使用具有视场(FOV)的显微镜平台对过滤膜的多个过滤区域的每个过滤区域进行成像，所述视场与由单个过滤区域的尺寸相匹配。微流体芯片中的基板，如附图1A至3和7所述。在一些实施例中，视场由过滤区域和过滤膜限定，其中如附图10A至11B所述省略叶片。

[0158] 在一些实施方案中，细胞样品用荧光团标记或染色，所述荧光团是在光激发下可以重新发光的荧光化学化合物。细胞样品可以用多种荧光团标记或染色，每种荧光团设计成在光激发时发出特定颜色的光。显微镜平台的实施例包括光源，其配置成用特定波长的光照射过滤器中的荧光染色细胞，所述特定波长的光被荧光团吸收，使得它们发射更长波长的光(即，与吸收的颜色不同的光)。可以基于用于荧光染色细胞样品的核染色和/或生物标记鉴定来选择特定波长。在一些实施方案中，显微镜平台还包括检测器或传感器，其配置成检测用于标记荧光染色细胞的荧光团的光谱发射特征。单个荧光团(颜色)的分布可以通过显微镜平台成像。可以使用几个单色图像来开发几种荧光团的多色图像。在一个实施方案中，显微镜平台配置成具有多个照射源或改变捕获细胞的照射以引起多种不同染料的荧光。

[0159] 例如，图14A和14B示出了根据本发明的用于捕获通孔中的感兴趣细胞的微流体芯片的一个过滤膜的图像。这些图示出了在方法1200的一个实施期间拍摄的图像，该方法用于使用过滤膜检测和识别来自母体血液样品的胎儿有核红细胞。图14A和14B描绘了过滤膜，其可以基本上类似于本发明中附图1A至图11B描述的微流体芯片的过滤膜之一。图14A和14B是由显微镜平台拍摄的过滤膜的实际图像，其中样品中的感兴趣细胞或样品的部分被捕获并保留在过滤器上精确限定且可识别的通孔中。图14A显示了明场中未染色的细胞。图14B显示了根据本发明公开内容标记或染色的感兴趣细胞。

[0160] 在操作1270，“收获确认的感兴趣细胞”，从过滤膜上除去感兴趣的细胞用于遗传和/或诊断分析。例如，在操作1270，接下来收获在操作1250处被识别为感兴趣的细胞的细胞。在一些实施例中，微操纵器可用于在操作1270期间从通孔收获和/或采集感兴趣的细胞。例如，显微操纵器可以包括针，该针被配置为采集在过滤膜的每个通孔中捕获的细胞。针尖和运动可以设计成不刺穿滤膜。在每个通孔中插入和移除针可以在给定通孔的侧壁上施加向外的力，因此可以选择过滤膜的材料，尺寸和通孔密度以承受该力，使得过滤器膜不破裂或通孔不变形。在一些情况下，过滤膜的这些有利的机械性质允许使用者重复使用相同的过滤膜来处理单个样品，例如，通过在操作1250之后并且在收获之前将样品的另外部分施加到过滤膜上。在操作1270捕获感兴趣的细胞。

[0161] 在一些实施方案中，可以在操作1240中分离不感兴趣的细胞。在确认捕获的细胞是不感兴趣的细胞的情况下，可任选地执行操作1260以从其相应的通孔中破坏，片段化和/或移除捕获的细胞，从而允许捕获现在清除的感兴趣的细胞。先前由不感兴趣的细胞占据的通孔。在一个非限制性实施例中，在操作1260期间移除不感兴趣的单元之后，可以重复操作1210-1250。以这种方式重复方法1200或方法1200中的某些操作可以导致微流体芯片具有在微流体芯片的过滤膜中捕获的大量感兴趣的细胞。因此，通过在操作1260的每次迭代中去除不感兴趣的细胞之后，在相同的微流体芯片上重复方法1200或方法1200的某些操作，可以获得具有最大感兴趣细胞密度的微流体芯片。在一些方面，在操作1270中收获确认的感兴趣细胞仅在大量通孔已捕获确认的感兴趣细胞后进行。因此，微流体芯片内的每个通孔的独特，精确限定的位置使得能够提取和/或操纵感兴趣的捕获细胞以及不感兴趣的细胞。

[0162] 用具有通孔的过滤膜制造微流体芯片的示例方法

[0163] 图15A至15E示出了制造如本发明所述的微流体芯片的示例性制造工艺的示意性说明的示例性横截面视图。

[0164] 虽然各个过滤区域和通孔的形状和尺寸可以与图15A至15E中所示的非限制性实例不同，但是制造本发明所述的微流体芯片的实施方案的方法涉及类似的特征。因此，下面附图15A至15E所示的微流体芯片描述制造具有过滤区域和通孔的微流体芯片的方法，但是应该理解，可以进行相同或基本相似的过程来开发微流体芯片具有不同形状和不同尺寸的过滤区域和通孔，例如，如上参照图1A至图11B所述的那些。另外，图15A至15E中所示的步骤优选地以所示顺序执行；然而，如本领域技术人员将理解的，它们也可以以其他顺序执行，并且可以进行各种替换。在下面的讨论中，将进一步详细讨论一些可能的替换和替代。此外，虽然在以下描述中省略，但是可以周期性地并且根据需要执行适当的清洁步骤以准备用于后续处理步骤的给定层和/或基于先前处理的步骤清洁层。

[0165] 如本发明所用，术语“晶片”将用于描述不完整的微流体芯片，术语“微流体芯片”将用于描述完成的集成微流体芯片。例如，图15A至15E各自示出了制造集成微流体芯片的阶段的一个实施例，其中晶片1500指的是该过程中的每个阶段。例如，图1A示出了使用本发明所述的方法制造的完成的微流体芯片100的一个实施方案，其中图15A至15E中的每一个代表制造过程的至少一个阶段，其以图1A的微流体芯片100结束。

[0166] 该过程开始于提供衬底1502的地方，如图15A所示。基板1502可以由任何合适的材料形成，并且具有任何合适的尺寸以支撑在该过程中稍后形成的过滤膜。在一些情况下，衬底1502是硅晶片。硅晶片可以是市售的常规尺寸的晶片，其被加工以获得衬底1502的所需尺寸。例如，衬底1502可以减薄到具有大约400微米的厚度。可以基于微流体芯片所针对的特定应用的需要来选择基板1502的厚度。在一些实施例中，基板1502可以是固体或半固体基板，其可以是平面结构，即基本上平坦的或具有至少一个基本平坦的表面。在一些实施例中，基板1502可以是双面抛光的硅晶片，其具有抛光到清洁和平坦表面的两个表面以进行处理。平面基板可以使用微加工领域中常见的固体基板制造，例如，基于二氧化硅的基板，例如玻璃，石英，硅或多晶硅，以及其他已知的基板，例如砷化镓。在这些基板的情况下，常用的微加工技术，例如光刻技术，湿化学蚀刻，微机械加工(钻孔，铣削等)，可以容易地应用于微流体芯片和基板的制造中。或者，聚合物基底材料可用于制造本发明的装置，包括例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚氨酯，聚氯乙烯(PVC)，聚苯乙烯，聚砜，聚碳酸酯等。在这种聚合物材料的情况下，可以使用注塑或压花方法来形成基材。在这种情况下，可以使用任何上述材料和方法制造原始模具。组装的微流体芯片可以用等离子体处理以改变所需的后组装的表面润湿能力，或者优选首先进行处理然后组装。

[0167] 该过程继续形成背面蚀刻停止层1503和前侧蚀刻停止层1504。可以通过将各个层沉积到基板1502上来执行背面蚀刻停止层1503和前侧蚀刻停止层1504的形成。背面蚀刻停止层1503和前侧蚀刻停止层1504可以由具有所追求的特性的任何合适的材料形成。用于背面蚀刻停止层1503的示例性材料可包括热氧化物或表现出类似特性的其他材料。在一些实施例中，背面蚀刻停止层1503可具有约3000埃至6000埃的厚度。其他配置也是可能的。用于前侧蚀刻停止层1504的示例性材料可以包括非晶硅(a-Si)或表现出类似特性的其他材料。在一些实施例中，前侧蚀刻停止层1504可具有约1微米的厚度。其他配置也是可能的。可以使用诸如物理气相沉积(PVD，例如，溅射)，等离子体增强化学气相沉积(PECVD)，热化学气相沉积(热CVD)，电子束沉积技术或所选材料旋涂薄层技术在基板1502上来执行背面和前侧蚀刻停止层材料的沉积。在一些实施例中，背面蚀刻停止层1503和前侧蚀刻停止层1504可以是单个蚀刻停止层。

[0168] 该过程继续形成介电掩模材料层1505。可以通过将层沉积到前侧蚀刻停止层1504上来执行介电掩模材料层1505的形成。介电掩模材料层1505可以代表过滤膜材料。介电掩模材料层1505可以由具有所追求的特性的任何合适的材料形成。用于介电掩模材料层1505的示例性材料可包括氧氮化硅或具有类似特性的其他材料。例如，可以选择材料以具有中性应力性质，视觉透明，低固有荧光，电惰性和抗蚀刻性。在一些实施例中，介电掩模材料层1505可具有约5微米的厚度。其他配置也是可能的。可以使用诸如物理气相沉积(PVD，例如，溅射)，等离子体增强化学气相沉积(PECVD)，热化学气相沉积(热CVD)，电子束的沉积技术来执行介电掩模材料层1505的沉积，蒸发，或将所选材料的薄层旋涂到前侧蚀刻停止层
1504上。

[0169] 继续该过程，其中基于硬掩模层1506和光致抗蚀剂掩模层1507在滤膜中限定通孔。在一些实施例中，单独的光致抗蚀剂层足以作为图案化层，因此不需要包括硬掩模层1506。这可以基于光致抗蚀剂和/或硬掩模层相对于待蚀刻层的蚀刻性能(例如，其上沉积图案化层的层)。例如，在介电掩模材料层1505的蚀刻性能大于光致抗蚀剂掩模层1507的情况下，可能需要比硬掩模层1506更好的蚀刻性能。

[0170] 因此，在一个示例中，该过程继续形成硬掩模层1506。可以通过将层沉积到介电掩模材料层1505上来执行硬掩模层1506的形成。硬掩模层1506可由具有所追求的特性的任何合适材料形成，例如，金属，有机或无机材料。用于硬掩模层1506的示例性材料可包括a-Si或表现出类似特性的其他材料。在一些实施例中，硬掩模层1506可具有约1微米的厚度。其他配置也是可能的。可以使用诸如物理气相沉积(PVD，例如，溅射)，等离子体增强化学气相沉积(PECVD)，热化学气相沉积(热CVD)，电子束的沉积技术来执行硬掩模层1506材料的沉积，蒸发，或将所选材料的薄层旋涂到介电掩模材料层1505上。

[0171] 继续该过程，其中在光致抗蚀剂层1507中限定通孔，该光致抗蚀剂层1507包括对应于期望的通孔尺寸，布局和布置的图案。可以使用常规光刻技术(例如但不限于硬掩模，光致抗蚀剂，曝光，显影和其他合适的技术)将光致抗蚀剂层1507沉积到硬掩模层1506上并图案化。在使用光致抗蚀剂1507和/或硬掩模层1506在介电掩模材料层1505中限定通孔图案的一个示例实施例中，通过物理气相沉积，离子体增强化学气相沉积，热化学气相沉积或旋涂将光致抗蚀剂层1507沉积到硬掩模层上1506。

[0172] 光致抗蚀剂1507和硬掩模层1506被配置为允许暴露要被去除的介电材料层1505的区域，从而留下介电材料层1505的材料限定过滤膜的通孔。然后将晶片1500暴露于光，这引起化学变化，使得通过显影步骤去除光致抗蚀剂层1506和硬掩模层1507的暴露区域。通过将显影溶液施加到微流体芯片的表面来执行显影步骤，该溶液被配置成去除光致抗蚀剂层1507和硬掩模层1506的暴露区域，如图15B所示。

[0173] 该过程继续到图15B，其中使用常规光刻技术(例如但不限于硬掩模，光致抗蚀剂，曝光，显影和其他合适的技术)将光刻胶层1507图案化到前侧蚀刻停止层1504上。例如，在一个实施例中，可以使用深反应离子蚀刻(DRIE)将光致抗蚀剂层1507图案化到硬掩模层1506上。然后，可以使用光致抗蚀剂层1507和硬掩模层1506的组合经由深反应离子蚀刻将通孔图案图案化到介电材料层1505上。前侧蚀刻停止层1504可以被配置为使用光学端点技术来停止深反应离子蚀刻处理。在一些实施例中，可以在蚀刻硬掩模层1506之后去除剩余的光致抗蚀剂层1507，然后单独使用硬掩模层1506作为图案化材料以使用深反应离子蚀刻图案化介电材料层1505。一旦蚀刻介电材料层1505，就使用常规处理技术去除光致抗蚀剂层1507。

[0174] 如图15C所示，该过程继续处理衬底1502的背面。图15C示出了相对于图15A和15B中的晶片1500的图示翻转180度的晶片1500的部分横截面侧视图。在一些实施例中，可以对衬底1502的背面执行适当的清洁步骤，以准备后侧表面以用于后续处理步骤。一旦晶片1500被翻转，背面蚀刻停止层1503和前侧蚀刻停止层1504与随后要施加的图案和沉积层对准。

[0175] 该过程继续，基于硬掩模层1510和沉积在衬底1502的背面上的光致抗蚀剂掩模层1511在衬底中限定支撑结构和叶片的过程。在一些实施例中，单独的光致抗蚀剂层足以作为图案化层，因此不需要包括硬掩模层1506。这可以基于相对于待蚀刻的衬底的光致抗蚀剂和/或硬掩模层的硅通孔(TSV)蚀刻特性和选择性。例如，在衬底1502的蚀刻性能大于光致抗蚀剂层1511的情况下，可能需要硬掩模层1510。

[0176] 因此，在一个示例中，该过程继续，其中在衬底1502的背面上形成硬掩模层1510。可以以与沉积硬掩模层1506类似的方式执行硬掩模层1510的形成。硬掩模层1510可以由与硬掩模层1506类似或相同的材料形成。用于硬掩模层1510的示例性材料可包括非晶硅或具有类似特性的其他材料。在一些实施例中，硬掩模层1510可具有约1微米的厚度。其他配置也是可能的。

[0177] 继续该过程，其中支撑结构和叶片限定在光致抗蚀剂层1511中。可以使用常规光刻技术(例如但不限于硬掩模，光致抗蚀剂，曝光，显影和其他合适的技术)将光致抗蚀剂层1511沉积到硬掩模层1510上并图案化。可以通过物理气相沉积，等离子体增强化学气象沉积，热化学气相沉积或旋涂将光致抗蚀剂层1511沉积到硬掩模层1510上。

[0178] 与上述类似，光致抗蚀剂1511和硬掩模层1510被配置为允许基板1502的旨在被去除的区域的曝光，从而使基板1502的材料限定微流体芯片的支撑结构和叶片。然后将晶片1500暴露于光，这引起化学变化，使得通过显影步骤去除光致抗蚀剂层1511和硬掩模层
1510的暴露区域。通过将显影溶液施加到微流体芯片的表面来执行显影步骤，该溶液被配置为去除光致抗蚀剂层1511和硬掩模层1510的暴露区域，如图15C所示。

[0179] 该过程继续到图15D，其中使用常规光刻技术在光刻胶层1511中将支撑结构和叶片图案化到前侧蚀刻停止层1504上。图15D示出了不使用硬掩模层1510并且仅使用光致抗蚀剂层1511将支撑结构和叶片图案化到衬底1502中的实施例。例如，在一个实施例中，支撑结构和叶片可以图案化到衬底1502中。可以在背面蚀刻停止层1503(未示出)处停止通过硅通孔进行深反应离子蚀刻工艺。然后，使用相同或随后的蚀刻工艺(例如，通过硅通孔进行深反应离子蚀刻)，可以在前侧蚀刻停止层1504处蚀刻并停止背面蚀刻停止层1503，从而将支撑结构和叶片图案化到前侧蚀刻停止层1504上。

[0180] 该过程继续如图15E所示，其中通过常规处理技术去除光致抗蚀剂层1511(和硬掩模层1510，如果存在的话)。在一些实施例中，可以对衬底1502的背面和正面进行适当的清洁步骤，以准备晶片1500以进行进一步处理。在一些实施例中，使用湿法蚀刻技术(未示出)蚀刻硬掩模层1506(如果存在的话)。在一些实施例中，使用湿法蚀刻技术(未示出)蚀刻前侧蚀刻停止层1504。在硬掩模层1506和前侧蚀刻停止层1504是相同材料(例如，非晶硅)的实施例中，湿蚀刻技术可以使用氢氧化钾(KOH)溶液。

[0181] 一旦清洁和处理晶片1500，就可以将晶片1500切割成如本发明所述的单独的微流体芯片。例如，图16A和16B示出了切割线。图16A示出了晶片1500的俯视图，晶片1500包括沿着切割线1610切割的两个微流体芯片。图16B示出了晶片1500的横截面视图，晶片1500包括沿着切割线1610切割的两个微流体芯片。在一些实施例中，硬掩模层1506可以在切割道中暴露，同时经由光致抗蚀剂层1507图案化硬掩模层1506，其可以在蚀刻硬掩模层1507的同时去除残留在切割道中的硬掩模层1506。在另一个实施例中，过滤器膜(例如，介电掩模材料层1505)可以在切割通道中暴露，同时图案化通孔，这可以去除留在切割线中的介电掩模材料层1505材料。在另一个实施例中，切割通道可以在基板侧图案化期间(例如，图15D)暴露，其还将在背面蚀刻期间将切割通道图案化穿过基板1502。该实施例可以不需要切割步骤。

[0182] 在另一实施例中，切割步骤可以通过隐形切割技术来执行，其可以在晶片1500的前侧或后侧上进行。该实施例可以消除在晶片1500上分配用于切割线的额外空间的需要。隐形切割的一些非限制性优点是该技术是无振动的，没有冲击，并且没有基板材料损失。此外，内外干燥和清洁过程减少了过滤膜损坏，通孔污染，堵塞或需要进行后切割清洁的可能性。

[0183] 在另一实施例中，光致抗蚀剂层1506沉积在介电掩模材料层1505上，介电掩模材料层1505也沉积在单个蚀刻停止层上(例如，前侧蚀刻停止层1504和背面蚀刻停止层1503组合成单个层)。这些层都沉积在基板1502上。在该实施例中，衬底1502的背面可以在第一处理步骤中通过硅通孔图案化和蚀刻。然后可以使用光致抗蚀剂层1506将衬底1502的前侧图案化并蚀刻穿过介电掩模材料层1505和蚀刻停止层，而不使用硬掩模层。在该实施例中，可以基于蚀刻特性和特性来选择蚀刻停止和掩模材料。还可以基于机械应力特性来选择材料，以保持过滤膜的结构完整性(例如，不开裂或弯曲)。还可以选择材料以使滤膜的翘曲最小化到传统光刻技术可接受的水平。

[0184] 所属领域的技术人员将进一步了解，结合本发明中所揭示的实施方案而描述的各种说明性逻辑块，模块，电路和过程步骤可实施为电子硬件，计算机软件或两者的组合。为了清楚地说明硬件和软件的这种可互换性，上面已经在功能方面对各种说明性的组件，块，模块，电路和步骤进行了总体描述。将此功能性实施为硬件还是软件取决于特定应用和强加于整个系统的设计约束。技术人员可以针对每个特定应用以不同方式实现所描述的功能，但是这种实现决策不应被解释为导致脱离本实施例的范围。本领域普通技术人员将理解，一部分或一部分可包括小于或等于整体的东西。例如，像素集合的一部分可以指代那些像素的子集合。

[0185] 结合本发明中所揭示的实施方案而描述的方法或过程的步骤可直接体现于硬件中，由处理器执行的软件模块中或两者的组合中。软件模块可以驻留在RAM存储器，闪存，ROM存储器，EPROM存储器，EEPROM存储器，寄存器，硬盘，可移动磁盘，CD-ROM或本领域中已知的任何其他形式的非暂时性存储介质中。示例性计算机可读存储介质耦合到处理器，使得处理器可以从计算机可读存储介质读取信息并将信息写入计算机可读存储介质。在替代方案中，存储介质可以是处理器的组成部分。处理器和存储介质可以驻留在专用集成电路中。专用集成电路可以驻留在用户终端，相机或其他设备中。在替代方案中，处理器和存储介质可以作为分立组件驻留在用户终端，相机或其他设备中。

[0186] 本文中的标题仅供参考，并有助于定位各个部分。这些标题不旨在限制关于其描述的概念的范围。这些概念可以在整个说明书中具有适用性。

[0187] 提供先前对所揭示实施方案的描述是为了使所属领域的技术人员能够制作或使用本发明中所描述的实施例。对于本领域技术人员来说，对这些实现的各种修改是显而易见的，并且在不脱离实施例的精神或范围的情况下，这里定义的一般原理可以应用于其他实现。因此，所公开的实施例不旨在限于本发明所示的实施方式，而是与符合本发明公开的原理和新颖特征的最宽范围相一致。

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微流体装置	2020-05-11	284
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