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微流体装置

阅读：284发布：2020-05-11

专利汇可以提供微流体装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种微流体装置，其包括：至少一个样品入口，其用来接纳生物流体样品中的生物细胞；至少一个鞘流入口，其用于接纳鞘流体；至少一个曲线形通道，其被构造成在基本上外流中提供生物流体样品和在基本上分离的内流中提供鞘流体；多个细胞捕集区，其在曲线形通道的周界处，每个捕集区被构造成允许从外流接纳具有目标大小范围的单细胞。，下面是微流体装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微流体装置，包括：
至少一个样品入口，所述至少一个样品入口用于接纳生物流体样品中的生物细胞；
至少一个鞘流入口，所述至少一个鞘流入口用于接纳鞘流体；
至少一个曲线形通道，所述至少一个曲线形通道被构造成基本上在稳定的外层流中提供生物流体样品和基本上在稳定的内层分离流中提供鞘流体；
位于所述曲线形通道的周界处的多个细胞捕集区，每个捕集区被构造成允许接纳来自所述外层流的具有目标大小范围的单细胞。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括：喷射器，所述喷射器被构造成在喷射模式期间从每个捕集区喷射具有目标大小范围的每个单细胞。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述细胞捕集区包括靠近外流的第一端口和远离所述外层流的第二端口，所述第一端口被构造成允许接纳具有目标大小范围的单细胞。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述第二端口被构造成在捕集模式期间相对于所述外层流提供较低压力。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述较低压力是环境大气压力。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的装置，其特征在于，所述第二端口还被构造成在所述喷射模式期间提供高压。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述高压由流体流提供。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的装置，其特征在于，所述第二端口选自堰、缩窄通道、光学切换闸板和介电切换闸板。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述堰具有小于5μm的最窄尺寸。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述堰具有1至3μm的最窄尺寸。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的装置，其特征在于，所述第一端口的宽度为10μm至30μm、15μm至25μm、16至21μm或17至20μm。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的装置，其特征在于，所述至少一个样品入口被构造成控制所述生物流体样品的体积和/或流量。
13.根据权利要求12所述的装置，另外其中，所述至少一个鞘入口被构造成控制所述鞘流体的体积和/或流量。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述鞘流体的黏度为所述生物流体样品的黏度的2至10倍之间、2至4倍之间或者大约3倍。
15.根据权利要求14所述的装置，其中，所述黏度、相应的体积和/或流量被配置成实现
15-25μm的外层流的宽度。
16.根据权利要求2至15中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置被构造成在所述捕集模式与所述喷射模式之间冲洗所述通道。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置由结合到玻璃载片上的PDMS或硬塑料模制而成。
18.根据权利要求2至17中任一项所述的装置，其特征在于，还包括：光检测器，所述光检测器被构造成确定每个捕集区中细胞的存在和/或每个捕集区的细胞的类型或身份。
19.根据权利要求18所述的装置，其特征在于，所述光学检测器适合于选择靶向细胞类型。
20.根据权利要求19所述的装置，其特征在于，所述靶向细胞类型是循环肿瘤细胞和/或目标大小范围是10μm至30μm。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的装置，其特征在于，所述光学检测器被构造成明场或荧光成像。
22.根据权利要求2至21中任一项所述的装置，其特征在于，还包括：再循环端口，其被构造成使所述流体样品再循环通过所述通道。
23.根据权利要求2至22中任一项所述的装置，其特征在于，还包括：出口，所述出口被构造成向预定位置提供每个喷射的单细胞。
24.一种流体递送系统，包括：
入口，所述入口被构造成接纳生物流体；
根据权利要求1至23中任一项所述的微流体装置，其中所述微流体装置的至少一个样品入口联接到所述系统的所述生物流体样品入口，并且所述微流体装置的所述至少一个鞘流入口联接到所述系统的所述鞘流体入口，
诊断或分析模块，所述诊断或分析模块被构造成处理来自所述微流体装置的输出口的具有目标大小范围的每个喷射的单细胞，以进行诊断或分析；以及
控制器，所述控制器被构造成在所述捕集模式期间向至少一个入口发送控制信号直至所有捕集区满了，并且在喷射模式期间向喷射器发送控制信号，以从每个捕集区依序喷射具有目标大小范围的细胞。
25.根据权利要求24所述的系统，其特征在于，其还包括输出阵列，所述输出阵列被构造成能相对于所述微流体装置的输出口而平移，其中将来自所述输出口的具有目标大小范围的每个喷射的单细胞提供到所述阵列内的分离位置。
26.根据权利要求25所述的系统，其特征在于诊断或分析模块，所述诊断或分析模块被构造成从所述输出阵列提取具有目标大小范围的每个喷射的单细胞，以进行单细胞分析。

说明书全文

微流体装置

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微流体装置。

背景技术

[0002] 每个单独的细胞是独特的并且可能在大小、状态、蛋白质表达方面不同并且也可以表现出不同的基因组谱，即使在相同组织内。这些相异性是重要的，特别是在理解在群体平均测量中经常被掩盖的罕见病/细胞事件的情况下。例如，检测血液循环中的循环肿瘤细胞(CTC)是癌症预后的可能非侵入式方法。除了与肿瘤负荷有关的枚举之外，CTC表征预期引导患者个性化护理的治疗选择。单细胞分析可以提供帮助识别这些变化的关键信息。通过移液和处理细胞进行提取的常规方法是繁琐的并且易于出错的，特别是当靶向(目标)细胞的数量和/或纯度较低时。自动化荧光细胞分选仪需要数百万的细胞并且引入了严重的细胞损失，这使得它们不适合于这类应用。

[0003] 由于满足细胞异质性的可能益处，单细胞分析不断发展。当对细胞群体进行分析时，存在于少量细胞中的重要变化可能被掩盖。因此，各个细胞的回收和表征是肿瘤学和再生医学的许多当前研究中的重要部分。由于医学实践趋向于个性化和靶向治疗，了解细胞群体的多样性和基因组成将有助于医师更好地做出临床判定。如果能识别与疾病相关联的关键突变，这也将加速药物设计和筛选过程。以高处理量的方式来精确地选择、操纵和处理单细胞的能力适用于获得足够的样品大小来理解细胞异质性。

[0004] 单细胞分选和制备的常规试验台方法包括连续稀释和在显微镜下细胞的手动移液。为了实现单细胞解析度，使用连续稀释导致较大误差，这些误差是随机的并且难以发现。细胞的手动移液是相当低处理量的技术并且操作是繁琐的，意味着其将不适合于处理数百细胞，为了产生充分的数据点以表征细胞亚群体多样性图案需要数百细胞。涉及微量移液管选择和使用微型操纵器或激光器俘获解剖的当前半自动分离方法也是低处理量的过程，使用者必须引导到单独的相关细胞以执行分离过程。

[0005] 荧光启动的细胞分选仪(FACS)能通过光学询问实现单细胞分离。然而，这些系统需要相当大量的起始材料并且由于较大细胞损失而不太适合于罕见细胞事件。FACS系统也是相当昂贵的工具并且通常在若干使用者之间共用，从而具有样品之间污染的风险，这种污染可能会导致随后基因组分析中的假阳性结果。这限制了FACS对于罕见样本的可用性。

[0006] 提出了其它形式的细胞分选仪，最显著地使用微系统。由于低样品输入要求，这些类型的系统是有利的并且允许相当合理的处理量。这些装置也较为廉价并且允许单次使用以防止交叉污染。在连续流动中使用磁性分离的装置表现为特别高效，具有高达5000倍的富集性以区分不同的细胞亚群体。这些系统的主要局限性在于它们并不允许回收单细胞，这限制了某些下游分析诸如下一代测序(NGS)，下一代测序是大规模探测基因变异的适用工具。被认为对于细胞温和的其它分选技术包括通过确定侧向移位或者通过将层流特征修改为微流而分离。然而，样品经过微通道的速度太快而不能在不使用复杂设备的情况下对荧光强度做出精确测量，这也使得回收单细胞较难。

[0007] 对于在单细胞水平实现分选/回收的系统，其包括用于单细胞沉积的基板的微图案化，使用微流体的物理捕集，细胞的喷墨印刷和在其主动探测区域操纵细胞的介电泳(DEP)力。例如，难以将微图案化用于具体细胞回收来执行DNA提取以用于分子分析，而不影响相邻的粘附细胞。使用介电泳(DEP)力和细胞的喷墨印刷的系统的复杂的控制是显著较高的额外成本。例如，使用被动物理捕集的FluidigmTM单细胞样品制备系统的主要局限性在于需要高于1.1％频率的靶向细胞，因为在系统内仅存在96个孔。如果所需细胞的频率低于1.1％，那么将存在靶向细胞全都不从该试验中提取出来的较大概率。即使如此，在该系统内的大部分样品浪费，因为大部分并非靶向细胞，除非输入相对较纯。因此，需要一种系统，其能快速地回收系统，但是其也具有充分的灵活性以便允许细胞归档(archival)或者允许在各个下游应用中使用所述细胞。

发明内容

[0008] 一般而言，本发明提出了一种微流体装置，其从高流量通道俘获各个细胞，并且单独地喷射它们用于单细胞分析。这可以允许高速处理和/或光学/荧光询问。再循环可以使细胞回收最高，这可以专门靶向罕见细胞事件和低细胞输入样品，其中样品数量是限制因素。该装置可以提供综合的样品制备工具，这些工具能递送大量单细胞并且通过免疫细胞化学提供基本细胞属性，诸如形态学信息和蛋白质表达水平。

[0009] 在本发明的第一方面，公开了微流体装置，其包括：

[0010] 至少一个样品入口，其用来接纳生物流体样品中的生物细胞；

[0011] 至少一个鞘流入口，其用于接纳鞘流体；

[0012] 至少一个曲线形通道，其被构造成基本上在外流中提供生物流体样品和基本上在分离的内流中提供鞘流体；以及

[0013] 位于曲线形通道的周界处的多个细胞捕集区，每个捕集区被构造成允许从外流接纳具有目标大小范围的单细胞。

[0014] 在周界处的多个细胞捕集区被构造成与外流接触。

[0015] 该装置还可包括喷射器，喷射器被构造成在喷射模式期间从每个捕集区喷射具有目标大小范围的每个单细胞。

[0016] 细胞捕集区可以包括靠近外流的第一端口和远离外流的第二端口，第一端口被构造成接纳具有目标大小范围的单细胞。第二端口可被构造成在捕集模式期间相对于外流提供较低压力。举例而言，较低压力是周围大气压力。

[0017] 第二端口还被构造成在喷射模式期间提供高压。举例而言，高压由鞘流体流来提供。

[0018] 第二端口可选自堰、缩窄通道、光学切换闸板和介电切换闸板。例如，当第二端口是堰时，堰具有小于5μm的最窄尺寸，诸如从1μm至3μm的最窄尺寸。

[0019] 第一端口的宽度为10μm至30μm、15μm至25μm、16至21μm或17至20μm。

[0020] 该装置还可以包括光学系统。例如，光学系统可以适合于选择靶细胞类型，可选地，其中光学系统被构造成用于明场或荧光成像。靶向细胞类型可以是循环肿瘤细胞。

[0021] 至少一个样品入口可以被构造成控制生物流体样品的体积和流量和/或至少一个鞘入口被构造成控制鞘流体的体积和流量。例如，生物流体样品和鞘流体的相应体积和流量被构造成实现15-25μm的外流宽度。

[0022] 在捕集模式与喷射模式之间可以冲洗通道。

[0023] 该装置由结合到玻璃载片上的PDMS或硬塑料模制而成。

[0024] 光检测器还可包括光学检测器，光学检测器被构造成确定每个捕集区中细胞的存在和/或每个捕集区内的细胞的类型或身份。

[0025] 该装置还可包括再循环端口，再循环端口被构造成使流体样品再循环通过通道。

[0026] 该装置还可包括出口，出口被构造成向预定位置提供每个喷射的单个靶向细胞。

[0027] 在本发明的第二方面，流体递送系统包括：

[0028] 入口，其被构造成接纳生物流体；

[0029] 根据权利要求23所述的微流体装置，其中，微流体装置的至少一个样品联接到系统的生物流体样品入口，并且微流体装置的至少一个鞘流入口联接到该系统的鞘流体入口，

[0030] 诊断或分析模块，其被构造成处理来自微流体装置的输出口的、具有目标大小范围的每个喷射的单细胞，用于诊断或分析；以及

[0031] 控制器，其被构造成在捕集模式期间向至少一个入口发送控制信号，直到所有捕集区都满了，并且在喷射模式期间向喷射器发送控制信号，以从每个捕集区依序喷射具有目标大小范围的细胞。

[0032] 流体递送系统还可包括输出阵列，输出阵列被构造成能相对于微流体装置的输出口而平移，其中来自输出口的、具有目标大小范围的每个喷射的单细胞被提供到阵列内的分离位置。

[0033] 诊断或分析模块可以被构造成从输出阵列提取具有目标大小范围的每个喷射的单细胞，以进行单细胞分析。附图说明

[0034] 现将借助于以下附图在下文中更详细地描述本发明。

[0035] 图1A是用于细胞分离和回收的系统架构的示意图。

[0036] 图1B是描绘了装置的引出通道的视图的图像，其中彩色染料用来区分生物样品流体流与鞘流体流。

[0037] 图2(A)是微流体装置的计算机辅助设计(CAD)布局，(B)是细胞俘获区域的示意图，示出了流动流和细胞腔室的位置；以及(C)是在细胞靠近细胞腔室时作用于细胞上的力的示意图。

[0038] 图3(A)是使用结合到玻璃载片上的PDMS制造的原型装置的图像，并且(B)是使用彩色染料视觉化的操作中的装置的图像。

[0039] 图4(A)(i)和(ii)是细胞流线的图像，并且(B)是在流量比与细胞流线的宽度之间关系的曲线图。

[0040] 图5(A)是用于细胞分离和回收的机构的示意图，(B)是使用光学显微镜拍摄的细胞腔室内的细胞分离的图像；以及，(C)是经由光学成像的细胞回收和验证的图像。

[0041] 图6是使用光学显微镜拍摄的所有10个腔室内的细胞俘获的效率的图像。

[0042] 图7是示出用于细胞分离和回收的替代机构的示意图。

[0043] 图8是使用光学显微镜拍摄的在细胞腔室内的细胞分离的图像。

具体实施方式

[0044] 在图1中示出了用于分选和分离单细胞的系统。微流体装置(100)能用于低细胞输入和细胞到基板(106)上受控制的分配，这可选地是自动载物台(110)和光学设置(120)，自动载物台(110)允许细胞回收的精确定位，光学设置(120)用于成像和反馈(例如，包括摄像机(121)和物镜(122))。该装置还可以包括计算机接口(130)、样品输入(101)、鞘流输入(102)、样品再循环端口(105)和放置于x-y载物台(111)上的样品回收托盘(107)。

[0045] 系统能分选并且向回收基板提供大约数千细胞的单细胞，这些单细胞然后可以立即用于随后的下游分析。回收基板是可更换的平台，其能保持不同类型的介质，诸如典型地用于细胞成像的常用玻璃载片或者用于PCR和细胞培养中的孔板(不同大小)。例如，如果使用者对于通过免疫化学或荧光原位杂交来识别其输入样品池内的细胞的亚群体感兴趣，在细胞回收期间，细胞可以固定到涂布了多聚赖氨酸的载片上，并且随后利用相关抗体培育以进行相关研究。可以根据要对细胞进行的操作(例如，细胞将要经受的分析类型)来选择合适基板。在该系统上的成像设置也能提供荧光扫描以区分存在的不同细胞亚型。而且，由于每个细胞的定位是系统预先确定的，若需要，基板可以容易地归档用于在未来进行分析。

[0046] 显著受益于单细胞样品制备系统的可能下游应用是下一代测序(NGS)。NGS是生长的和重要的应用，其在生物医疗科学中引起典范转移，对于基因变化的理解具有深远影响，并且改进了临床评价。通过选择合适回收基板，诸如96/384孔PCR板，这可以直接与现有平台兼容以执行细胞溶解和随后的测序库制备。受益于这种样品制备系统的预期下游应用的可能性是无限的，并且其将通过提供更高处理量而提高当前检测方法的生产率。

[0047] 在图2A和图2B中描绘了微流体装置100的设计。这种装置可以包含单细胞分离部分(210)、再循环端口(220)、回收端口或出口(230)、细胞流入口(240)和鞘流入口(250)。单细胞分离部分(210)包括流体动力聚集区域261和一系列细胞保持腔室或细胞捕集区260，它们绕流体动力聚集区域261间隔开。该装置还包括细胞喷射控制部分270。

[0048] 这种装置可以经由软光刻技术、热压纹方法或注塑成型利用PDMS模制成。

[0049] 在所描绘的系统中，如图2A和图2B所示，流体动力聚集区域(261)是环形的，在180°曲线弧上延伸。有10个保持腔室(260)绕外边缘定位。应意识到，细胞保持腔室的数量可以大于或小于10，例如可以存在2至200个细胞保持腔室(例如，4至100个细胞保持腔室，诸如5至50个细胞保持腔室)。细胞保持腔室(260)具有第一端口(267)和第二远侧端口(264)，第一端口(267)通向流体动力聚集区域(261)。

[0050] 应意识到关于通道的间距或曲率并无限制或具体设计考虑。

[0051] 为了实现细胞的最小损失和高速分离，输入细胞(262)通过鞘流而聚集到通道壁的侧部上(图2B)，并且随着其通过而被推入到第一端口267内。对细胞的离心力与微小负压差(图2C)的组合效果有利于其进入到细胞保持腔室内。可以通过使细胞保持腔室经由细胞喷射端口(263)从第二端口(264)向大气通风来获得细胞保持腔室中的负压，同时施加正压来驱动大量流体通过半圆形弯部。在所描绘的实施例中，由高度为2μm(例如1.8至2.2μm)的堰结构(264)来阻碍细胞到达细胞喷射端口(263)。替代地，细胞保持腔室中的堰可以由光学切换闸板或者介电切换闸板替换。一旦占据了细胞腔室，进一步细胞进入的阻力变得较高，并且接下来进来的细胞可能翻滚到下一邻近(impending)的细胞保持腔室。利用这种方案，所描绘的装置能一次保持多达10个细胞并且这可以由成像系统验证。这在图5B的图像中示出，其中，每个腔室可以看到由单细胞占据。

[0052] 该装置可以被设计成俘获CTC，但是可以同样被设计成分离任何细胞类型，可选地不包括红血细胞和血小板。例如，堰(264)和腔室(260)的尺寸取决于靶向细胞大小。例如大约15μm直径的CTC而言，腔室(260)应在16-21μm宽(例如，17-20μm)之间，并且堰间隙应为0.5μm至大约5μm(例如，1μm至3μm，诸如1.5μm至2.5μm，例如2μm)。

[0053] 为了确保细胞被细胞保持腔室俘获，鞘流(265)和细胞流(266)的流量被优化，以使得细胞流动流必须具有与被靶向的细胞尺寸相似的宽度。这允许细胞流动流中的细胞尽可能接近腔室。例如，当选定细胞具有15μm的大小时，细胞流的靶向宽度在15-25μm的范围。可选地，具有更高黏度的鞘流可以用来使浪费体积最小(例如，用作鞘流的液体黏度可以在用作细胞流载剂的液体黏度的2至10倍之间，诸如2至4倍，诸如3倍)。任何合适的注射泵可以用于细胞流和鞘流线，并且该系统可以由计算机运行控制软件来控制。

[0054] 上面使用的条件基本上确保了两种流并不由于每种流的层流特征而混合。在单独各流之间的扩散也最小化，因为通道长度相对较短。图1B描绘了引出通道(160,170)的90°弯部，但是这类似于在通道的周壁中的腔室与外部流之间存在的弯曲(弯部)。图1B示出了这些流并不混合，但是一个流动(外部流，140)由其它流(内部流；150)压抵于周壁上。

[0055] 虽然大多数细胞将保持在生物样品流体流或外部流(140)中，可能存在某些例外。这些例外是较大的细胞，其质量中心超过了生物样品流体流动的聚集流尺寸，并且将停止遵循鞘流或内部流(150)的流线。

[0056] 鞘流液体可以包括任何合适细胞兼容的缓冲剂。例如，鞘流液体可以包含不同浓度的、与水/磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合的甘油。其它合适鞘流可以包括与水/PBS混合的不同浓度的聚乙二醇或右旋糖酐。将意识到鞘流可以包含与水/PBS混合的、不同浓度的甘油、聚乙二醇与右旋糖酐中任一个的组合。

[0057] 例如，在捕集阶段，流量可以在100–400μL/分钟之间，其中鞘流与细胞流的流体黏度比为大约3:1。细胞与鞘流量(以毫升/s为单位)的体积比可以为大约1:1至大约1:5，并且样品浓度可以大于或等于每毫升100个细胞(例如，从每毫升大约1000个细胞到每毫升大约2000000个细胞，例如，从每毫升大约2000个细胞至每毫升大约1000000细胞)。使用这些参数，预期填充所有细胞保持腔室将花费从大约瞬时填充到30分钟(例如，0.01秒至10分钟，诸如0.1秒至120秒)。应认识到填充所有腔室的时间将根据流体样品中的细胞浓度不同。

[0058] 在CTC方面，估计在预富集血液样品中的这些细胞的浓度通常为在十亿血细胞中大约1个细胞。然而，对于富集样品，CTC的浓度可以为在1000-10000个血细胞中大约1个细胞。

[0059] 一旦细胞流和鞘流经过了流体动力聚集区域和细胞保持腔室，将这些流引导至再循环端口。可选地，再循环端口分叉，以允许在鞘流与细胞流之间更好分离，特别是当鞘流具有比细胞流更高黏度时。

[0060] 在所有腔室装满之后，可以冲洗流体动力聚集区域(例如，具有任何合适的细胞缓冲剂或无核酸酶的水)。

[0061] 然后，开始喷射阶段。通过向相应的细胞腔室施加正压力(在图2A中的细胞喷射控制)，将每个细胞单独地释放到回收基板上。回收基板可以是任何合适基板，例如可移动的回收托盘或96/384孔PCR板。施加到细胞上的正压力可以呈通过细胞喷射端口(例如，通过从任何合适的注射器泵施加压力)进入细胞保持腔室的合适液体的形式(例如，任何合适细胞缓冲剂或无核酸酶的水)，从而向半圆形弯部内喷射细胞并且将细胞引导至回收端口。在捕集阶段，闭合回收端口230。通过校准该装置来控制回收端口的选择，以使得当通过喷射端口施加喷射流体持续正确的时间段并且以正确压力(例如，在1-5磅/平方英寸(Psi)的压力范围在3秒施加1μL)施加时，选择回收端口。可选地，在细胞从其各个细胞保持腔室中释放之前，可以利用任何合适液体来冲洗流体动力聚集区域(即，半圆形弯部)。

[0062] 应意识到使用者可选择单独地或以任何其它可能组合地分配每个细胞，直到并且包括捕集到细胞保持腔室中的所有细胞。还应认识到细胞的喷射可以根据操作者的需要而不同并且可以针对每次喷射运行来变化。这种灵活的分配系统允许在多个研究中执行滴定实验。

[0063] 装置的另一重要特征是能再循环在第一次(或随后的)通过时未能进入细胞腔室的样品(损失样品)。由于该系统针对于其中所希望的细胞样品量有限或稀有的应用，确保最大程度上回收输入细胞材料是至关重要的。这通过从再循环端口(220)往回向细胞流入口(240)内引导聚集细胞流来实现，在此，细胞将具有被接纳进入细胞保持腔室内的另一次机会。重复细胞分离循环，直到耗尽了细胞样品输入。例如，可以通过设置该装置在5分钟的时段并未俘获到细胞时自动停止再循环该样品而以该装置的自动形式来确定再循环样品耗尽。

[0064] 如果光学器件用来检查是否填充了所有腔室(在分配之前)，那么这些光学器件也可以用来选择相关细胞。例如，光学系统可以使用明场或荧光成像。这允许操作者摆脱噪音或非计划的细胞。例如，在描绘的装置中，在填充了所有十个腔室之后，如果腔室5是具有相关细胞(靶向细胞)的唯一腔室，那么这个细胞可以分配到板/载片上，而其它九个细胞能同时分配到废料装置。这个废料装置可以是再循环端口或单独废料端口。这种样品可以易于进给到任何单细胞分析平台。这排除了移动载片/板到细胞拾取工位以从单细胞的大量平行板选择细胞的需要。

[0065] 所描绘的系统可以用作较大测序实验室或者其中执行频繁的免疫细胞化学、荧光原位杂交(FISH)和其它分子方法的中心病理实验室中样品制备的辅助装置。该系统也可以用于细胞/分子生物学实验室，向它们提供关于单细胞的完整分析，其集成成像能力能处理细胞多样性。所描绘的系统已经用来证明利用微流体设计来进行细胞分离和回收的构思，如下文所描述的那样。

[0066] 这种系统是致力于循环肿瘤细胞(CTC)分离和检测的当前研究中的重大进步，其进一步桥接了在研究机构与临床环境之间的间隙。所描绘的系统能制备样品用于下游分析，其能允许更敏感的措施来检测当前由于大量白血细胞存在而掩盖的突变和变化。例如，使用常规PCR和Sanger测序的突变分析的黄金标准具有1％的检测极限，其通常不能利用具有低CTC计数的样品来实现。所描绘的系统能确保在执行下游分析之前存在充分的样品纯度。

[0067] 实验部分

[0068] 装置的制造

[0069] 采用经由软光刻使用PDMS制造的装置来追求构思实验的证明(例如，参看在Qin,D.、Xia,Y.&Whitesides,G.M.Soft lithography for micro-and nanoscale patterning(微纳米和纳米图案化的软光刻技术).Nature protocols(自然实验手册)5,491-502(2010)和在Whitesides、G.M.、Ostuni,E.、Takayama,S.、Jiang,X.&Ingber、D.E.Soft lithography in biology and biochemistry Annual review of biomedical engineering(生物学和生物化学生物医学工程年度总结软光刻技术)3,335-373(2001)中所描述的方法，这些文献通过参考以引用的方式并入到本文中)。

[0070] 构思证明

[0071] 图3A示出了用来表征单细胞俘获和回收构思的功效的原型装置，其使用15μm聚苯乙烯珠粒作为理想测试样品。该装置与大部分现有倒置或直立显微镜兼容，因此使任何额外成本最低，并且允许分离过程实时可视。然而，集成的显微镜可集成到该装置内。如所描绘的那样，该装置使用注射器泵来连接和测试，连接管如图3B所示布置。

[0072] 当用于优化流体动力聚集细胞流时，这个系统得到高分离速率，并且也展示了将损失的细胞再循环回到系统的可能性，以使得能提高总细胞回收率。这种系统也通过向所希望的细胞腔室施加正压力而允许积极回收单珠粒，并且通过光学成像获得这种取回的视觉验证。

[0073] 优化的鞘流

[0074] 在图3A和图3B内的装置的流动控制是重要的，因为这直接影响珠粒进入到细胞腔室内的分离效率。优化流动的标准在于细胞流动流必须具有与细胞尺寸类似宽度。在此情况下，靶向宽度在15-25μm的范围以匹配用作“细胞”的珠粒大小。这能允许细胞流动流中的“细胞”尽可能接近腔室。而且，为了最小化废料体积，选择更高黏度的鞘流，从而在样品处理步骤期间改变流体动力传播。这允许容易的维护，产生最少废料，和易于选择泵，因为最终流线比不会过于发散。

[0075] 在当前示例中，使用NI Labview(National Instruments,USA(美国国家仪器))接口来控制两个注射泵，两个注射泵进给细胞流线和鞘流线。软件提供每个流线的流率(流量)的主动调节，而无需每次手动改变泵上的参数。其也帮助同步泵的开始以最小化系统的瞬时响应。这个软件当前控制2个注射泵。这些注射泵可以被用于压力控制的电磁阀替换。可以使用这种软件来实施总共多达24个阀/注射泵。

[0076] 研究在100-500μL/分钟之间的流量，其中鞘流与细胞流的流体黏度比为大约3:1。在很多测试之后选择这个流体黏度比。使用去离子(DI)水来模拟细胞流，而鞘流使用黏度显著更高的食品彩色染料。利用DI水稀释彩色染料直到其黏度大于单单DI水的大约三倍。
使用流变仪来测量黏度。

[0077] 图4A示出了在100μL/分钟并且使用1:1(图4A(i))或1:5(图4A(ii))细胞流(410)与鞘流(420)的流量比执行的典型表征实验。如在图4A中可以看出，简单地改变流量允许将聚集的细胞流宽度控制在所希望的尺寸内。

[0078] 从图4B，观察到高于400μL/分钟的流量，鞘流通常在通道的流动中为主导，从而导致不均匀脉动的细胞流动流。因此，系统的最大处理限度指定为400μL/分钟。鉴于此，对于1000-2000μL的典型输入样品，第一次通过的处理时间在5分钟至10分钟的范围，假定1:1的细胞流与鞘流的流量比。在试验这种样品的过程中，产生1-2mL的鞘流废料，与在细胞流和鞘流中使用相同黏度的情况下的10至20mL相比。

[0079] 分离效率和样品回收

[0080] 使用15μm聚苯乙烯珠粒来模仿细胞，研究以各个入口流率引入到系统内的粒子浓缩效果。这允许测定不同初始条件的样品所需的处理时间并且判断在加载到装置上之前是否需要预先制备样品(稀释或样品浓缩)。最佳输入浓度范围将允许在可容许的时间间隔内单细胞定期通过。相反，如果浓度太高，这可能导致输入细胞的较大损失，因为当占据了所有细胞腔室时在细胞流动能停止之前，存在较短的延迟时间。然而，低浓度将导致在完全填充腔室之前较长等待时间，并且这将延长处理时间。

[0081] 图5A示出了用于细胞分离和回收的机构。在每个细胞腔室(520)中的堰结构(510)允许细胞保持在凹进腔室中，直到其准备被取回。这由弯部(530)周围的负压和离心力的组合效果实现。由于腔室定位于主流旁边，分离的细胞将会受到主要通道中的流动的不利影响。这允许在取回捕集的细胞之前冲洗主要通道。释放机构是直观的，向堰台阶的相对端施加正压力(540)。图7示出了替代布置，其中在图5A中的堰结构(510)由在细胞保持腔室中的缩窄通道(570)替换。在描绘的示例中，缩窄通道和堰结构提供2μm的间隙，但可以使用本文公开的任何大小。

[0082] 在当前描绘的装置中，使用细胞流与鞘流的流量1:5的流动条件用于从100至400μL/分钟的变化的总流量。注意占据所有10个细胞腔室所花费的时间并且在五次独立的运行上平均化。填充腔室越快，系统的处理量就越大。图5B示出了在典型测试试验中腔室中成功的珠粒分离。在当前示例中，输入珠粒浓度从每毫升去离子水2000个珠粒变化到每毫升2000万个珠粒。图6总结了所研究的不同的操作条件。在每毫升20万个珠粒和更多的情况下，珠粒分离在所有不同的测试流量几乎都是瞬时的。在每毫升2000个珠粒的较低浓度下，当流量设置为100μL/分钟时，填充所有10个细胞捕集区所需的时间为53秒。增加样品流量将俘获时间缩短为13秒。即，将流量改变为400μL/分钟导致填充细胞捕集区所花费的时间
75％的改进。因此，该系统被良好地定位成处置浓度为每毫升20万个细胞和更高的输入样品并且对于较低浓度样品，能调整系统以更高的流量运行，以使处理量最大。

[0083] 图5C示出了在装置(560)的回收出口处成功地回收珠粒(550)。为了允许自细胞腔室的喷射过程可视化，使用较大直径的活检穿孔器(5mm)来形成在回收流体端口处的收集孔。通过手动移液而移除所喷射的珠粒并且然后启动下一珠粒腔室来移走并回收下一珠粒。这样做，直到所有珠粒被依序回收。在100个不同的试验中，系统成功地单独地移除并且回收所有100个珠粒。

[0084] 如在此试验部分中所提到的那样，使用聚苯乙烯珠粒来模仿细胞。图5A至图5C示出了在规定的条件下的机构、珠粒的分离和回收。图8示出了使用根据本发明的装置成功地分离单个MCF-7癌细胞。使用与关于图5所描述的那些条件相同的条件。如从图8可以看出，通过启动半圆形蛇形弯曲部中的每个细胞保持器的喷射控件，单细胞俘获的效率为100％。

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