发明背景

周围神经损伤是长期丧失劳动力的一个主要起因。较差的神经损伤治 疗伴随着肌肉萎缩，并且当断离的轴突不能与远侧神经重建连续性时可以 导致令人痛苦的神经瘤。虽然神经在损伤后具有再生的潜力，这个能力严 格地取决于再生神经纤维(及其轴突芽)与断离的神经段(以及其中的施 旺细胞基膜)进行适当的接触。未能横穿间隙或损伤部位并进入断离的远 侧神经段的基膜的再生轴突将会溃变，导致神经元死亡、肌肉萎缩和永久 的机能缺失(Fawcett JW等[1990] Annu Rev Neurosci 13：43-60)。

简要地，神经携带神经元的周围突起(或轴突)。神经元胞体位于脊 髓中(运动神经元)、沿着脊柱的神经节中(脊髓感觉神经节)或者遍布 全身器官的神经节中(自主和肠神经节)。神经由轴突、施旺细胞和大量 的结缔组织鞘组成(Dagum AB[1998] J Hand Ther 11：111-117)。外覆层 神经外膜是由缓冲神经束的外部压力并且围绕神经束膜的胶原性结缔组织 构成的。神经束膜环绕每束神经纤维，并且与神经内膜微血管中的内皮细 胞一起，行使血-神经屏障的功能。神经内膜位于神经束膜的内部，并且由 环绕施旺细胞和轴突的胶原性组织组成。神经束组(fascicular group)由两 个或更多个分别被神经束膜和神经外膜环绕的神经束(fascicle)组成。神经 的远侧局部解剖图是稳定的，或者是一组感觉神经束或者是一组运动神经 束。神经元由胞体(细胞体)和轴突组成，轴突可以是数英尺长。

当神经损伤存在轴突破坏、但是神经内膜鞘的连续性完整无损(例如， 挤压伤)的时候，轴突在它们原来的基膜内再生，并且彻底痊愈是可以预 期的。相反，轴突再生在神经横断之后受到严重地影响，而且外科手术恢 复高度地依赖于如上所述的神经元件的重新对接(realignment)(Dagum AB [1998] J Hand Ther 11：111-117)。神经外膜缝合术(神经缝合术)是治 疗神经横断的主要方法。不过，再生程度是高度可变的，并且充其量可以 预期功能的部分恢复(Terzis JK等[1990]The Peripheral Nerve： Structure，function and reconstruction，Hampton Press，Norfolk)。尽管存 在当前显微外科技术的技术现状，但由于神经精细的显微结构和不能实现 的轴突到轴突的精确接合，在神经横断修复之后功能的完全恢复仍然是一 个不能及的理想。

神经切除术为神经移植提供了正当理由，但存在若干实际问题。这些 年来，已经探索了各种神经移植物的备选方案。目前被视为有发展前途的 备选方案是关于同种异体神经移植物的应用。虽然供体移植物可获得性遇 到其它器官替代策略的困难，但神经移植物中细胞元件的存活可能远不是 那么重要。尽管施旺细胞明显有助于再生过程，但神经鞘结构已含有促进 轴突再生的必要脚手架和粘性线索(adhesive cues)，并且在无细胞(例 如冷冻杀死的)神经移植物中已经实现了具有重要意义的再生(Ide C等 [1983]Brain Res 288：61-75；Hall SM[1986]Neuropathol Appl Neurobiol 12：401-414；Gulati AK[1988]J Neurosurg 68：117-123；Nadim W等 [1990]Neuropathol Appl Neurobiol 16：411-421)。杀死定居的抗原递呈细 胞(例如施旺细胞、成纤维细胞、内皮细胞等)可以使移植物的免疫原性 大为降低。利用无细胞神经移植物极大地降低或消除了宿主-移植物免疫排 斥的顾虑(Evans PJ等[1994]Prog Neurobiol 43：187-233；Evans PJ等 [1998]Muscle Nerve 21：1507-1522)。这些特性为冷冻杀死的(无细胞)同 种异体和异种神经移植物的应用提供了可观的前景。另一方面，没有存活 细胞预先排除了看似促进再生过程的神经变性以及随后的重塑(Bedi KS 等[1992]Eur JNeurosci 4：193-200；Danielsen N等[1994]Brain Res 666： 250-254)。

层粘连蛋白是基膜主要的生长促进成分，其是用于轴突成功再生的粘 性刺激物(Wang，GY等[1992]Brain Res 570：116-125)。然而，虽然正常 (未受损伤的)神经具有丰富的层粘连蛋白，正常神经仍然抑制或者抵抗 轴突生长(Langley JN [1904]JPhysiol 31：365-391；Brown MC等[1994] EurJNeurosci 6：420-428)。这意味着层粘连蛋白的生长促进活性在正常神 经环境下被抑制，而且层粘连蛋白活性在神经变性中必须以某种方式被恢 复从而确保再生。

正常周围神经对于轴突生长而言是一种较差的基质(Zuo J.等[1998] J Neurobiol 34：41-54；Bedi KS等[1992]Eur J Neurosci 4：193-200)。试 验结果显示正常神经基膜内的层粘连蛋白不能接近再生的轴突芽(Zuo J. 等[1998]J Neurosci 18：5203-5211；Ferguson TA，和D.Muir [2000]Mol Cell Neurosci 16：157-167；Agius E.等[1998]J Neurosci 18：328-338)。一 旦神经损伤，断离的节段(损伤远侧)经历广泛的变性(degeneration)过 程，引起广泛的重塑(remolding)。在创伤诱导的神经变性中，断离的轴 突死亡，它们的髓鞘碎片和产生的残骸通过吞噬作用清除。尽管存在这种 变性，鞘结构和基膜仍保存下来。施旺细胞增生并为神经作好轴突再生的 准备。这整个的过程，包括重塑方面，通常被称作为神经变性。现在清楚 神经损伤导致远侧神经段的积极改变，并且实验证明变性的神经比正常神 经具有更大的轴突生长促进潜力(Bedi KS等[1992]Eur J Neurosci 4： 193-200；Danielsen NJ等[1994]Brain Res 666：250-254；Agius E等 [1998]J Neurosci 18：328-338)。所以，变性过程似乎参与将正常神经从抑 制状态转化到促进轴突生长的状态的机制(Salonen VJ等[1987]J Neurocytol 16：713-720；Danielsen N等[1995]Brain Res 681：105-108)。

与神经损伤有关的功能丧失因轴突破坏而引起。轴突非常细且脆，因 而最轻微的损伤(包括受压)都可以导致断离反应(轴索切断)。在轴索切 断中，损伤远侧的轴突死亡并且变性。对于神经来说问题最小的损伤是挤 压伤(轴索断伤)，其中发生轴索切断，但是神经鞘的连续性保持完整。 在轴索断伤的情况下，由于基膜保持连续，轴突典型地无需外科手术的干 预就得以再生。为使断离的周围神经成功地再生，自近侧神经残段萌发的 轴突芽首先必须定位之后进入远侧神经段的施旺细胞基膜内。这一决定性 必要条件被认为造成了与挤压伤相比神经横断后相对较差的再生。在神经 横断(神经断伤)中，神经部分或者完全地断离。横断损伤中轴突和神经 鞘都断离，破坏了神经连续性和轴突再生所需的引导机制。重建神经的神 经元件的连续性的外科接合术(神经缝合术)对于轴突再生是必要的。此 外，神经横断和修复后的轴突再生也会因为近侧和远侧元件的未对准而复 杂化。即使是在尖锐器械利落横断的例子中，整个神经结构也会被破坏。 肿胀以及轴浆自切口端的外流导致迅速增生效应，其干扰基膜脚手架的准 确接合和重新对接。尽管通过显微外科技术可以改善神经束的对接，轴突- 轴突的接合仍然是一个理想化的目标。由于轴突的小尺寸以及结缔组织的 相对优势，多数在外科手术接合后从近侧残段萌发的轴突芽最有可能首先 遭遇富含抑制性硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的非许可性基质。这可能解 释了与周围神经横断修复相关联的显著的潜代期和不稳定的再生。证据显 示CSPGs结合层粘连蛋白并抑制其生长促进活性，并且CSPG在损伤后 的变性过程中将被降解。从而，使CSPGs失活的此过程能够解释为何变性 对于神经再生是必要的。最近发现周围神经含有丰富的CSPG，其抑制神 经内膜层粘连蛋白的生长促进活性(Zuo J等[1998a]J Neurobiol 34： 41-54)。抑制神经突的CSPGs在包绕施旺细胞基膜的神经内膜组织中很丰 富，并且在神经损伤后迅速地被上调(Braunewell KH等[1995a]Eur J Neurosci 7：805-814；Braunewell KH等[1995b]Eur J Neurosci 7：792-804)。所以，任何神经微细结构的未对准(在损伤和修复后)都将迫 使再生的轴突芽遇到非许可性组织的干涉，这可能严重地限制了它们进入 远侧神经的基膜。最近的研究支持某些CSPG降解酶是层粘连蛋白的生长 促进特性可在变性的神经内藉以恢复的一种机制的结论(Zuo J等[1998b] J Neurosci 18：5203-5211；Ferguson TA等[2000]Mol Cell Neurosci 16： 157-167)。此外，这个过程可通过在神经损伤部位和神经移植物上施用 CSPG-降解酶而实现以改善再生(Zuo J等[2002]Exp Neurol 176： 221-228；Krekoski CA等[2001]J Neurosci 21：6206-6213)。一种特别有效的 此类CSPG-降解酶是软骨素酶(chondroitinase)ABC，一种降解CSPG 双糖侧链的细菌酶(Zuo J等[1998a]J Neurobiol 34：41-54)。其它包括基 质金属蛋白酶家族的特定成员，MMP-2和MMP-9，它们降解CSPG的核 心蛋白(Ferguson TA等[2000]Mol Cell Neurosci 16：157-167)。

虽然软骨素酶ABC(一种糖胺聚糖裂解酶)降解硫酸软骨素、硫酸皮 肤素和透明质酸盐，其增强神经组织的生长促进特性的能力归功于CSPG 降解(Zuo J等[1998]Exp Neurol 154：654-662；Ferguson TA等[2000] Mol Cell Neurosci 16：157-167)。此外，已经证明软骨素酶ABC治疗不会 破坏神经鞘的组织或者将层粘连蛋白从施旺细胞基膜中转移出来 (Krekoski CA等[2001]J Neurosci 21：6206-6213)。

在神经横断修复模型中，对抑制性CSPG的降解去除了再生轴突芽的 一个主要障碍，并导致其向远侧神经更加茁壮和一致的生长(Krekoski CA 等[2001]J Neurosci 21：6206-6213)。

已经证明变性的神经具有提高的支持轴突生长的能力(Giannini C等 [1990]J Neuro pathol Exp Neurol 49：550-563；Hasan N等[1996]J Anat 189：293-302)。变性的作用很可能归因于神经基膜的改变，因为在从预变 性的神经制备的无细胞移植物中轴突再生也得以改善(Danielsen N等 [1995]Brain Res 681：105-108)。在整个变性过程中，施旺细胞基膜保持结 构完整。

动物模型已经证明从体内预变性的神经制备的移植物在支持神经再生 方面要比新鲜切除的移植物好得多(Danielsen N等[1995]Brain Res 681： 105-108)。不过，建立预变性神经的方法(即，神经损伤后继之以一段体 内存活期以允许组织变性)在人体中是不切实际的。

体内周围神经变性导致几种细胞外基质分子的周转提高，这取决于神 经元、施旺细胞以及侵入的巨嗜细胞对蛋白水解酶的释放和活化。损伤后 基质金属蛋白酶(MMP)活性的调节暗示MMP-2和MMP-9在神经变性和 再生期间参与胞外基质的重塑(La Fleur等[1996]J Exp Med 184： 2311-2326；Kherif等[1998]Neuropathol Appl Neurobiol 24：309-319； Ferguson等[2000]Mol Cell Neurosci 16：157-167)。MMP-9在损伤后立 即在周围神经中表达，并且主要是在损伤部位。MMP-9的表达与血液-神 经屏障的崩溃、粒细胞的积聚和巨嗜细胞的入侵相关(Shubayev等[2000] Brain Res 855：83-89；Siebert等[2001]J Neuropathol Exp Neurol 60： 85-93)。大多数证据表明造血细胞显著地有助于MMP-9活性的升高 (Taskinen等[1997]Acta Neuropathol(Berl)93：252-259)。在另一方面， MMP-2在正常周围神经中由施旺细胞组成型地表达(Yamada等[1995] Acta Neuropathol(Berl)89：199-203)。损伤后数天，MMP-2表达被上调， 并且潜在酶相当程度地转变为其活性形式(Ferguson等[2000]Mol Cell Neurosci 16：157-167)。

体外变性导致神经外植块的神经突促进活性得到实质上的提高。这种 提高通过添加MMP抑制剂被封阻，同时发生的净明胶水解活性的提高也 被封阻(由原位酶谱证明)。在培养的神经外植块中神经突促进活性迅速 上升，并且与MMP-2的上调和活化平行。相反，体内变性的最初效果仅 仅是抑制正常神经原本就很低的神经突促进活性，在此期间MMP-2的体 内表达或活化没有变化。不过，横断神经的神经突促进活性确实在体内随 着时间提高，并且这与突然爆发的MMP-2的表达和活化相对应(Ferguson 和Muir，2000，Mol Cell Neurosci 16：157-167；Shubayev和Myers，2000， Brain Res 855：83-89)。

体外试验显示体内预变性的神经段比正常神经段具有较大的神经突促 进活性(Bedi等[1992]Eur J Neurosci 4：193-200；Agius等[1998] JNeurosci 18：328-338；Ferguson等[2000]Mol Cell Neurosci 16： 157-167)。不过，体内测试预变性的神经移植物的研究产生了与之矛盾的 结果，特别是当利用细胞(活)神经移植物的时候(Gordon等[1979]J Hand Surg [Am]4：42-47；Danielsen等[1994]Brain Res 666：250-254； Hasan等[1996]J Anat 189(Pt2)：293-302)。但是，预变性似乎对增强进 入无细胞移植物的再生特别有利(Ochi等[1994]Exp Neurol 128： 216-225；Danielsen等[1995]Brain Res 681：105-108)。这说明，在变性时， 细胞和分子机制起着增强基膜的生长促进特性的作用，然后其在细胞元件 被杀死后保留了刺激神经再生的能力。体外预变性可以导致无细胞神经移 植物的生长促进能力相当程度地提高，这在本发明的低温培养和移植模型 中很容易地得到了证明。无细胞神经移植与轴突再生开始的实质性延迟相 关联(Danielsen等[1995]Brain Res 681：105-108)。

许多关于神经外植块培养物和神经移植物保存的研究聚焦于神经段的 冷藏。与促进培养中神经移植物的有限变性的努力不同，冷藏法目的是在 最低限度的缺血性条件下保存神经以抑制细胞和蛋白水解活性。Levi等 (Levi A等[1994]Glia 10：121-131)发现冷藏1周后细胞存活力显著下降， 并且在冷藏3周后仅有少量存活的施旺细胞残留在神经外植块中。后来， Lassner等(Lassner等[1995]J Reconstr Microsurg 11：447-453)报道培 养基(DMEM，而非冷藏液)对于维持施旺细胞存活力以及对于冷藏缺血条 件下贮藏的神经移植物的再生潜力具有正面效果。虽然不利于神经移植物 的生长促进潜力的最优化，持续冷藏确实会进一步降低细胞存活力、免疫 原性以及同种异体神经移植物免疫排斥的问题(Evans等[1998]Muscle Nerve 21：1507-1522)。鉴于这个原因，延长的冷藏和冷冻杀死的神经同种 异体移植物比新鲜同种异体移植物导致更好的再生(Evans等[1999] Microsurgery 19：115-127)。

从而，本领域仍然需要可以用于改善传统神经修复结果的低风险辅助 疗法。

发明概述

本发明涉及促进神经组织修复的组合物和方法。在一个优选的实施方 式中，本发明的组合物包含硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)-降解酶。在一个 实施方式中，本发明的组合物包含从由软骨素酶、透明质酸酶、及基质金 属蛋白酶(MMP)、或其组合组成的组中选择的CSPG降解酶。在另一个 实施方式中，本发明的组合物包含从由软骨素酶ABC、软骨素酶A、软骨 素酶C、软骨素酶AC、透明质酸酶、MMP-2、及MMP-9、或其组合组成 的组中选择的CSPG降解酶。

本发明还涉及促进人或动物损伤的神经组织修复的方法。本发明的方 法包括向神经修复、接合、移植物、或者损伤的神经给药一种或多种CSPG- 降解酶。本发明的方法改善再生轴突越过神经-神经或神经-移植物界面的 能力，并增强基膜脚手架内的轴突生长。抑制性CSPG的降解建立了一个 更加许可的神经基质，并且允许轴突芽更好地进入神经的施旺细胞基膜， 从而增加成功伸入损伤的神经组织或植入的神经移植物的轴突的数目。此 外，这也使得轴突芽可以采取正确的路径，从而导致功能恢复进一步的改 善。

本发明还涉及通过用CSP-降解酶处理制备神经移植物的方法。优选 地，神经移植物(同种异体的或者异种的)是新鲜和没有变性的，并且在神 经移植物冷冻之前或之后用CSPG-降解酶处理。如果是在移植物的细胞活 着的时候处理的，则移植物可以就此植入，或者随后被冷冻杀死使之无细 胞化。在一个实施方式中，神经组织在处理后被无细胞化。在一个优选的 实施方式中，神经组织通过冷冻杀死无细胞化。

本发明还涉及培养新鲜(或者为运输而短暂保存)的神经组织用于随 后作为神经移植物植入人或动物体内的方法。优选地，从人或动物供体中 收获新鲜的神经组织，并在允许组织离体发生变性和重塑的生理条件下培 养，通过内源性过程促进施旺细胞在组织内的增生和基膜的活化。在一个 实施方式中，神经组织/移植物在培养后被无细胞化。在一个优选的实施方 式中，神经组织/移植物通过冷冻杀死被无细胞化。

本发明进一步涉及提供用于植入人或动物体内的神经移植物的方法。 优选地，供体移植物的横断面特征与植入部位的神经组织横断面特征相似。

附图的简短说明

图1A-1D显示了软骨素酶处理的无细胞神经移植物的CSPG新表位 (neoepitope)免疫荧光。无细胞(冷冻杀死的)大鼠坐骨神经段整个用软 骨素酶ABC在体外处理16小时。图1A显示了由Ab1918标记的新表位(软 骨素酶-依赖性)，证明用软骨素酶整体处理有效地渗透所有的神经区室并 且降解CSPG侧链。在图1B中，Ab1918免疫标记的强度并不因为用软骨 素酶额外处理图1A中所示神经的切片而增加，说明最初的整体处理是彻 底的。在图1C中，软骨素酶处理的无细胞神经段中施旺细胞基膜的结构 完整性通过层粘连蛋白免疫荧光证实。图1D显示了8天后软骨素酶处理 的无细胞居间神经移植物的体内Ab1918免疫标记。

图2显示了通过由软骨素酶处理的无细胞神经段的低温培养生物试验 反映的抑制性CSPG的失活。无细胞神经段整体用软骨素酶(″Ch′ase″)或 单独用介质处理。进行神经切片，然后再用软骨素酶或仅用介质进行后处 理。将分离的鸡胚DRG神经元在该神经切片上生长24小时，并如材料和 方法中所述记录神经突的长度。通过对每个条件下至少250个神经元的评 定进行测定。结果以平均值(-SEM)表示，并且利用Studentt检验比较整 体施用介质和软骨素酶条件的统计学差异显著性。*P＜0.001。

图3显示了居间无细胞神经移植物的连续性和GAP-43免疫染色评估。 每个神经移植物的连续性通过在纵切面上检测近侧和远侧神经-移植物的 接合来证实。在近侧接合处，GAP-43标记揭示众多的再生轴突进入移植 物的近侧面。GAP-43不标记无细胞移植物中任何其余元件。

图4显示了8天后轴突再生进入无细胞居间神经移植物。这一系列代 表性的切片来自两个动物，其均接受了介质处理和软骨素酶处理的移植物。 从近侧移植物(1.2mm，顶部)开始随后以0.56mm间隔获取的连续切片 用GAP-43免疫标记。在每个接受双侧移植物的动物(n＝9)中，较之于介 质处理的对照，轴突生长更多地进入了用软骨素酶处理的无细胞移植物中。 图像在神经外膜处进行修剪以接近图5中数字图像分析所评定的视野。

图5显示了再生轴突能更多地进入用软骨素酶处理的无细胞神经移植 物中。8-天的居间神经移植物的连续切片(如图4所示)通过数字图像分 析评定GAP-43-标记的轴突分布。数据代表在进入移植物内特定的距离处 (从近侧到远侧)对9个介质处理的和9个软骨素酶处理的移植物评估的 平均值(-SEM)。

图6显示了4天后轴突再生进入无细胞居间神经移植物的开始节段。 对4天无细胞移植物的神经-移植物界面以及紧近侧的区域进行了检测，以 比较进入移植物的0.3mm处的GAP-43-标记的轴突分布。数据代表3个 介质处理的和3个软骨素酶处理的移植物的平均值(-SEM)。

图7显示了移植物内轴突再生和施旺细胞迁移的联系。8天移植物的 连续切片进行GAP-43(轴突)和S-100(施旺细胞)的免疫标记。在软骨素 酶处理的移植物的近侧区域，最常见施旺细胞与再生轴突紧密关联。观察 到偶然的没有与施旺细胞共迁移的轴突簇(箭头)。在移植物较远侧，常见 没有伴随施旺细胞的轴突。在该移植物较远侧的区域几乎没有被S-100强 烈地免疫标记的单个施旺细胞，该区主要含有与冷冻杀死的施旺细胞残骸 相关的微弱的S-100染色。

图8A和8B显示了远侧移植物接合处轴突和施旺细胞的生长。对8 天的软骨素酶处理移植物和远侧神经残段的纵向连续切片进行GAP-43 (轴突)免疫标记，如图8A中所示，以及S-100(施旺细胞)免疫标记，如图 8B中所示。在图8A中，轴突(小箭头)接近、穿过远侧接合处，并在宿 主远侧残段内扩散生长。在图8B中，S-100标记的施旺细胞在宿主远侧残 段中很丰富，但是即便有侵入移植物远侧面的施旺细胞，也是很少的(其主 要含有与冷冻杀死的施旺细胞残骸相关的微弱的S-100免疫染色)。

图9A和9B分别显示了CSPG新表位和层粘连蛋白被染色的人神经。 这些结果说明，虽然人神经的总体结构比大鼠神经更为复杂，支持轴突再 生的基膜大体上相似，并且调控生长的分子成分(CSPG和层粘连蛋白)是丰 富的。图9A还通过新表位标记证明，CSPG侧链在软骨素酶处理的人类 神经段中被有效地降解。

图10显示了利用人类神经段通过低温培养试验反映的抑制性CSPG 的失活。人神经用软骨素酶处理，随之分析神经突促进活性。分离的鸡DRG 神经元在切片上生长24小时并记录神经突长度。结果以平均值(-SEM)表 示。利用Studentt检验比较介质处理和软骨素酶处理条件的统计学差异显 著性(P＜0.001)。

图11显示在一种人到大鼠的异种移植模型中轴突较好地生长进入软 骨素酶处理的无细胞神经移植物中。人神经束(与大鼠坐骨神经的直径相 似)被移植到在大鼠坐骨神经中制备的缺口中。8天居间神经异种移植物 的连续切片通过数字图像分析来评定GAP-43标记的轴突分布图。数据代 表在进入移植物内特定的距离(从近侧到远侧)对2个介质处理的和2个 软骨素酶处理的移植物估定的平均值(-SEM)。

图12A-12D显示了损伤的坐骨神经中通过单次注射软骨素酶ABC发 生的CSPG降解。检测了两种损伤模型，双侧神经横断和修复(图12A、 12B、和12D)以及双侧神经挤压(图12C)。在损伤时右侧坐骨神经用软骨 素酶ABC(2μl 1U)在神经损伤部位远侧2mm处注射。神经横断和修复后 4天，CSPG-新表位免疫染色在接合部位的整个神经内膜和神经鞘中(图 12A)(注意神经外膜的缝合)以及距接合处数mm的整个远侧(图12B)和近 侧(未显示)神经横断面区域中均很强烈。如图12C中所示，在软骨素酶注 射后2天检测的挤压伤神经中得到了相似的结果。由体内注射软骨素酶发 生的CSPG的降解程度通过在组织切片后对软骨素酶第二次处理的神经进 行CSPG-新表位免疫标记来检测，如图12D中所示。在第二次应用后连续 切片中的染色强度并不显著不同(比较图12B和图12D)，说明单次体内注 射软骨素酶有效地降解了周围细胞外基质中的CSPG。

图13A和13B显示了在神经挤压伤后用软骨素酶ABC处理并不改变 轴突再生。成年大鼠接受双侧坐骨神经挤压伤，并且一侧神经用软骨素酶 ABC注射，而对侧神经仅接受介质。损伤后两天取出神经，并用GAP-43 免疫细胞化学标记再生的轴突。两只代表性动物中(均接受介质和软骨素 酶注射)紧邻神经挤压伤处远侧的再生轴突分布图示于图13A。如图13B 所示，评定了远侧神经连续切片中GAP-43-免疫标记的轴突。软骨素酶处 理的(Ch′ase)神经的轴突再生与介质处理的对照神经相比没有显著差别。数 据代表进入远侧神经内每隔0.56mm对6个软骨素酶处理的和6个介质处 理的神经估定的平均值(±SEM)。

图14A和14B显示了在神经横断和神经缝合修复后用软骨素酶ABC 处理显著增强了轴突再生。成年大鼠接受双侧神经横断以及端到端的修复。 一侧神经用软骨素酶ABC注射，而对侧神经仅接受介质。损伤后4天取 出神经，并用GAP-43免疫细胞化学标记再生的轴突。两只代表动物中(均 接受介质和软骨素酶注射)紧邻神经接合处远侧的再生轴突的分布图示于 图14A。如图14B所示，评定了远侧神经连续切片中GAP-43-免疫标记的 轴突。软骨素酶处理的(Ch′ase)神经中轴突再生比介质处理的对照显著增 强。数据代表进入远侧神经内每隔0.56mm对7个软骨素酶处理的和7个 介质处理的神经估定的平均值(±SEM)。

图15A和15B显示了神经外植块培养物的低温培养试验。如图15A 所示，新鲜切除的大鼠坐骨神经外植块在含有0、2或10％胎牛血清的 DMEM/N2中培养1、2、4和7天。如图15B所示，神经外植块在不添加 和添加GM6001(MMP抑制剂)的含有2％血清(培养标准)的DMEM/N2 中培养2天。然后冷冻切片神经，并在含有NGF的DMEM/N2中在组织 切片上种植胚性DRG神经元。24小时后，对DRG神经元进行GAP-43 免疫染色，并通过数字显微照相和图像分析测量神经突生长。对照条件是 正常神经(培养0天)。数据代表在每一条件下评定的大于250个神经元 的神经突长度平均值(±SEM)，其中所述神经元来自2个或更多个独立实验 中测试的至少4个独立神经外植块培养物。

图16显示了神经外植块培养物的酶谱分析。神经外植块在含有2％血 清的DMEM/N2中培养0(对照，C)、1、2、4和7天。然后提取神经并 通过明胶覆盖电泳分析。酶谱揭示了酶原形式和活化形式的明胶酶，其在 着色的凝胶内显示为透明的条带。对照神经主要地含有MMP-2原和痕量 活化的MMP-2。在培养2天或更长时间的神经外植块中，存在着MMP-2 含量的渐进增长以及向活性形式的迅速转化。MMP-9在对照及早期外植块 中可以忽略不计，然而在第4和第7天检测到痕量。分子量指示重组人 MMP-9原(92kD)、活化MMP-9(84kD)、MMP-2原(72kD)和活化MMP-2 (66kD)的位置。

图17A-17F显示了通过原位酶谱对神经段中净明胶水解活性的定位。 对照神经(图17A和图17B)和培养的神经外植块(2天，2％血清)(图17C 和图17D)的组织切片用淬灭的荧光素标记的明胶覆盖，该明胶可以被组 织内的明胶水解活性转化为荧光肽。在正常神经中检测到组成型明胶水解 活性(图17A)，其在更高的放大倍数(图17B)下与施旺细胞相关联。如图 17C和17D所示，在培养的神经中明胶水解活性更加强烈，并且散布在培 养神经的整个神经内膜中。如图17E和17F所示，在GM6001存在的条件 下培养的神经中明胶水解活性显著下降。

图18A-18D显示了培养的神经外植块中MMP-2和MMP-9的免疫表 达。如图18A所示，培养神经(2天，2％血清)的MMP-2免疫标记在施旺 细胞和周围的基膜(插图)内强烈。在图18B中，S-100免疫标记显示了 扩增的施旺细胞群在神经内的重定位。如图18C所示，MMP-9免疫标记 在神经束内事实上是不存在的，除了罕见的细胞分布之外。周围的神经外 膜中的一些细胞被MMP-9免疫标记。在图18D中，OX42标记显示了散 布于整个神经外膜而少见于培养神经的神经束内的巨噬细胞。

图19A-19D显示了培养的神经外植块中的沃勒氏变性。培养2天的神 经段中观察到的变性改变是体内观察到的早期沃勒氏变性的记忆。在图 19A中，神经丝免疫标记显示，与如图19B(图19A和19B插图，纵向切 片)中所示的培养的神经外植块(2天，2％血清)中环状和片段化的轴突不 同，正常神经中形成紧凑且连续的轴突。如图19C所示，层粘连蛋白免疫 标记显示基膜结构完整，并且层粘连蛋白表达在施旺细胞中被上调(插 图)。如图19D所示，轴突变性和由施旺细胞引起的髓鞘质突出在用甲苯胺 蓝着色的半薄切片中尤为明显。如图19D插图中所示，在培养2天的神经 段中未观察到导致进一步髓鞘质变性(崩解和浓缩)和吞噬作用清除的变 性过程。

图20A和20B显示了体外预变性的无细胞神经移植物中的轴突再生。 正常和培养(2天，2％血清)的神经移植物被冷冻杀死，修剪至10mm的长 度，并用作为居间移植物来修复横断的坐骨神经。宿主大鼠接受双侧移植 物，一侧为正常的(未培养的)，而一侧为预变性的(培养的)。8天后 通过评定横切片中的GAP-43-免疫阳性分布图来评估轴突再生。在图20A 中，显示了有代表性的来自两个动物的对照和预变性移植物的切片。切片 显示进入移植物1.5mm处的轴突再生。免疫荧光图像的象素值被反转。 如图20B所示，按测定的进入移植物的距离进行定量分析。数据代表各种 条件下6个神经的平均值(±SEM)。

发明的详细公开

本发明提供了促进神经组织修复的组合物和方法。本发明的组合物和 方法可被用来恢复因疾病、创伤事件或外科手术操作中断的神经的连续性。 本发明的组合物和方法通过增加成功穿入损伤的神经组织或植入的神经移 植物的轴突的数目促进神经组织修复，导致更好的功能恢复。

在一个优选的实施方式中，本发明的组合物包括硫酸软骨素蛋白聚糖 (CSPG)-降解酶。在一个实施方式中，本发明的组合物包括从由软骨素酶、 透明质酸酶、及基质金属蛋白酶(MMP)、或其组合构成的组中选择的 CSPG-降解酶。在另一个实施方式中，本发明的组合物包括从由软骨素酶 ABC、软骨素酶A、软骨素酶C、软骨素酶AC、透明质酸酶、MMP-2、 及MMP-9、或其组合构成的组中选择的CSPG-降解酶。

CSPG-降解酶可以是人类、动物或细菌来源的，天然存在或者重组的。 如本文所用的，术语“CSPG-降解酶”还旨在包括这类酶的生物学活性片 段和变体，例如保留了实质量的CSPG-降解活性的那些片段和变体。本发 明的组合物可以包括适当的药学载体。本发明进一步涉及用一种或多种 CSPG-降解酶处理的神经组织。

除了一种或多种CSPG-降解酶以外，本发明的组合物可以进一步包括 生物或药学活性分子，例如生长因子。这类生长因子包括，但不限于，神 经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-1和2)、表皮生长因子 (EGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养 蛋白-3、-4和-5(NT-3、-4和-5)、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I、II)、 转化生长因子(TGF)、胶质细胞生长因子-2(GGF-2)、血管内皮细胞生长因 子(VEGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、以及淋巴细胞浸润 因子/胆碱能分化因子(LIF/CDF)。这类分子可以自天然来源或通过重组 DNA技术获得。还可以利用保留其生物或药学活性的这类分子的片段或变 体。

本发明还涉及促进人类或动物损伤的神经组织修复的方法。本发明的 方法包括向神经移植物或损伤的神经组织施用一种或多种CSPG-降解酶。 本发明的方法改善再生轴突越过神经-神经或神经-移植物界面的能力，并 使基膜脚手架内部的轴突生长得以增强。抑制性CSPG的降解建立了一个 更加许可的神经基质(nerve substratum)，并且允许轴突芽更好地进入神 经的施旺细胞基膜，从而增加成功地穿入损伤的神经组织或植入的神经移 植物的轴突的数目。

向损伤的神经施用CSPG-降解酶。在一个实施方式中，CSPG-降解 酶被施用于损伤的神经、神经损伤部位或者神经损伤修复部位。在一个优 选的实施方式中，CSPG-降解酶被施用于主要的神经修复部位，包括断离 或修剪的神经的接合(即端到端的神经接合)部位。神经损伤可以是神经 横断(神经断伤)，其中神经部分或者完全地断离，或者是小范围损伤并 通过外科手术切除，而且神经外膜接合术(神经缝合术)是修复此损伤神 经的主要方法。举例来说，本发明的组合物和方法可被用来促进涉及损伤 神经的至少一种神经鞘的连续性中断的神经损伤的修复，所述神经鞘例如 基膜、神经束膜或神经外膜。优选地，外科手术修复旨在重新对接神经元 件。

在一个具体的实施方式中，神经损伤为挤压伤(轴索断伤)或更极端 的损伤，其中发生轴索切断，但是神经鞘的连续性保持完整或者稍微受到 损害。在轴索断伤的情况下，轴突典型地无需外科手术的干预就得以再生。

在某些情况下，神经段是病态的、被无可挽回地损伤或者闭塞的，并 通过外科手术切除。修复可以包括植入移植物或修补物以桥接断口。植入 物可以天然的(例如，神经或血管移植物)、天然衍生物(例如，生物聚 合物管)或合成导管(聚硅氧烷管)。这些物质被连接到切断的神经端。在 一个具体的实施方式中，CSPG-降解酶被施用于连接部位，在任一端或者 两端。举例来说，CSPG-降解酶可以被施用于居间移植物上一处或两处的 宿主-移植物界面。CSPG-降解酶可以在外科手术修复损伤的神经组织或者 将移植物植入受体内之前、期间或之后施用。

向神经移植物施用CSPG-降解酶。在一个实施方式中，CSPG-降解 酶被施用于神经移植物。当CSPG-降解酶被施用于神经移植物时，可以处 理整个移植物。CSPG-降解酶可以施用于整个神经移植物作整体处理。这 种施用为移植前的预处理或者温育，并且可以包括或可以不包括除去所施 用的酶的操作。整体处理可以应用于活(新鲜)的或者先前冷冻的神经移 植物。整体处理不排除在与宿主神经接合的部位额外施用CSPG-降解酶， 而是可以与之联合使用。

根据本发明的方法，CSPG-降解酶可以被施用于神经移植物或损伤的 神经组织，或者两者兼而有之。CSPG-降解酶可以在植入前、期间或之后 施用于神经移植物。CSPG-降解酶可以被施用于移植物的任何部分，例如 待与损伤神经的残段相接的一端或两端。如果CSPG-降解酶被施用于损伤 的神经，该酶可以被施用于能促进损伤的神经修复的损伤神经的任何区域， 例如损伤部位或者邻近损伤的部位。CSPG-降解酶可以被置于将应用于神 经移植物的培养基中。这种培养基可以是不确定成分的培养基、确定成分 培养基、或者补充有例如血清的确定成分培养基。本发明还包括在植入前 贮藏神经移植物的贮液。这种贮液含有如上所述的培养基，和至少一种 CSPG-降解酶。这种贮液可以还包括组织胶粘剂，例如血纤蛋白胶。这种 贮液可以还包括其它生物学活性剂，例如上文所列的生长因子。

如本文所用的，术语“移植物”是指被用来植入人或动物体内的任何 组织。各种类型的移植物都被涵盖在本发明内，例如自体移植物、同基因 移植物、同种异体移植物和异种移植物。移植物的大小(例如，长度和直 径)对本发明不是关键的。举例来说，神经移植物的长度可以从大约1厘 米到大约10厘米，或者超过大约10厘米。神经移植物的直径可以按照需 要与任何损伤的神经或神经的一部分的直径相匹配。神经移植物可以是结 构上完整的神经段，以沿受体神经的长桥接缺口，或者取代远侧端，即用 于端到端移植。作为选择的，神经移植物可以是部分神经段，或者具有奇 怪的形状(例如神经片(nerve flap))，并用来重建具有少许结构破坏但 保持其物理连续性的撕裂神经。

任选地，CSPG-降解酶可以联合组织胶粘剂，例如生物胶而施用于损 伤的神经或者神经移植物。优选地，生物胶是含有血纤蛋白的胶粘剂，例 如血纤蛋白胶、血纤蛋白粘合剂或者血小板凝胶(platelet gel)。生物胶 在外科手术领域是公知的(Suri A等[2002]Neurol.India 50：23-26； Alibai E等[1999]Irn J.Med.Sci.24(3 & 4)：92-97；Sames M等[1997] Physiol.Res.46(4)：303-306；Jackson M等  [1996]Blood Coag. Fibrinolysis 7：737-746；Fasol R等[1994]J Thorac.Cardiovasc.Surg.107： 1432-1439)。如本文所用的，术语“血纤蛋白胶”、“血纤蛋白粘合剂” 和“血纤蛋白组织胶粘剂”可互换使用，是指含有纤维蛋白原和凝血酶的 一组制剂，其在施用部位导致形成血纤蛋白凝块。组织胶粘剂可以与 CSPG-降解酶同时或者顺序地施用。组织胶粘剂可以与CSPG-降解酶存在 于相同的制剂中，或者以单独的制剂施用于损伤的神经和/或神经移植物。 优选地，胶粘剂不含有可以吸引残余的神经结构上的轴突生长的物质例如 层粘连蛋白，或者含有将与所用酶竞争或者抑制酶活的物质或抑制剂。

本发明中所用的CSPG-降解酶可通过各种方法并以多种制剂形式施 用于神经移植物或者损伤的神经组织。如本文所用的，术语“施用”、“给 药”、“接触”和“处理”可互换使用。举例来说，CSPG-降解酶可以局 部施用于于神经移植物或者损伤的神经组织(例如，逐滴地)，或者通过注 射给药。局部施用或通过注射局部给药因控制性更强而是优选的。此外， CSPG-降解酶或者含有这种酶的组合物优选以液体的可流动制剂形式施 用。CSPG-降解酶也可以被吸附到多孔材料上，或者举例来说，配制成软 膏、油膏、凝胶、霜剂或泡沫。

本发明还包括促进损伤的神经组织修复的试剂盒。本发明的试剂盒包 括含有至少一种CSPG-降解酶的第一室，以及含有例如本文所述的那些组 织胶粘剂的第二室。任选地，试剂盒可以包括用于混合CSPG-降解酶和组 织胶粘剂的第三室。试剂盒可以被直接地或者间接地通过神经移植物用来 修复损伤的神经组织。试剂盒可以包括使用本领域已知的各种材料，例如 塑料、玻璃和/或纸制品的包装。

药物组合物。一种或多种CSPG-降解酶可以被掺入到适合向患者，

例如人或动物给药的药物组合物中。这种组合物典型地包括至少一种 CSPG-降解酶和药学上可接受的载体。如本文所用的，术语“药学上可接 受的载体”旨在包括任何及所有的与药物给药相容的溶剂、分散介质、包 衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和药剂 应用于药学活性物质是本领域公知的。辅助活性化合物同样可以被掺入到 组合物中。优选地，药物组合物包括至少一种CSPG-降解酶和组织胶粘剂。 例如血纤蛋白胶。

本发明的药物组合物可以根据制备药学上有用的组合物的已知方法配 制。制剂在本领域熟练技术人员公知并且容易获得的多种资料来源中有描 述。举例来说，Remington′s Pharmaceutical Science(Martin EW[1995] Easton Pennsylavania，Mack Publishing Company，19th ed.)描述了可用于 本发明的制剂。适于肠胃外给药的制剂包括，举例来说，无菌注射水溶液， 它可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使得制剂与目的受体的血液等 渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。 制剂可以在单次剂量或多次剂量容器中给出，举例来说，密封的安瓿、小 药瓶、和由玻璃或塑料制成的一次性注射器，并且可以以在临用前仅需要 无菌液体载体，举例来说，注射用水的冷冻干燥(冻干)状态贮藏。现用 的注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒、药片等制备。应当理解，除 了上文特别提及的成分之外，本发明的制剂可以包括本领域中常规的、顾 及到所讨论制剂的类型的其它药剂。药物组合物可以与给药说明书一起包 括在容器、包装或者给药器(dispenser)中。

CSPG-降解酶可以配制在适合给药方式的载体中，例如盐水或水性缓 冲液。CSPG-降解酶还可以包含在控释制剂中、或者与之联系。这样的材 料包括，但不限于，生物可降解基质和颗粒，例如脂质体、脂球或小泡。 控释制剂可以是生物可降解聚合基质。CSPG-降解酶还可以作为凝胶或薄 膜施用，或者包含在合成的移植物或植入物中。

CSPG-降解酶可以与保护酶免于迅速从体内消除的载体一起配制，例 如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。优选地，载体是生物可降 解和/或生物可吸收的。生物可降解的生物相容性聚合物可被用于该控释制 剂中，例如ethylene vinyl acetate、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯 和聚乳酸。

控释制剂在本质上可以是微粒(例如微米或纳米级)，例如球或胶囊。 微粒可以具有包含一种或多种CSPG-降解酶的核心，其被外层或外壳包 被。外壳可以被包被的CSPG-降解酶降解(以致壳从内部开始降解)。举 例来说，壳可以至少部分地由透明质酸组成，这样当壳内的透明质酸被包 被的CSPG-降解酶降解时(部分或者完全地)，CSPG-降解酶得以释放。 作为选择地，壳可以通过另外一种或者来自外部施用的、或者存在于体内 环境中的降解剂降解(这样壳从外部开始降解)。

美国专利No.5,320,837描述了通过使具有氨基的酶，例如透明质酸酶 或者软骨素酶与马来酸酐和可共聚化的聚烷撑二醇醚的共聚物反应获得的 控释制品。反应产物可溶于水和/或有机溶剂，并且能够通过水解缓慢地释 放酶。

美国专利No.4,933,185描述了用于递送被包被在具有由可特异性地 被酶降解的聚合物，例如离子交联多糖形成的核心和速率控制外壳的微胶 囊中由酶(例如透明质酸酶)组成的生物学活性物质的控释体系。当核心 被降解时，外壳的完整性丧失，导致生物学活性物质突然从胶囊内释放出 来。该′185专利中的控释体系可以被用来递送一种或多种CSPG-降解酶。 举例来说，CSPG-降解酶可以作为生物学活性物质、或者核心降解酶、或 者两者以发挥作用。

控释制剂可以造成CSPG-降解酶一次初始的暴露，并在一个特定的时 间段后，接着造成一次或多次延迟的暴露。作为选择地，控释制剂可以导 致CSPG-降解酶的单次缓释。作为选择地，持续释放制剂可以允许CSPG- 降解酶的持续释放。任选地，CSPG-降解酶的持续释放可以与一次或多次 的脉冲释放相结合。

CSPG-降解酶的载体，例如植入物，可以具有适合特定应用的大小和 形状。因此，载体可以具有期望的体积和期望的形状，依据预期考虑的载 体待投入使用的活体区域来设计。形状的例子包括，但不限于，圆柱形、 半圆柱形或者环形。载体可以是与损伤的神经或神经移植物相接触的垫、 套、板、棍或线。优选地，载体的形状不具有可能激怒或者以其它方式刺 激活体周围组织的边或角。

从载体中释放的CSPG-降解酶的数量以及释放持续时间可以被控制 在适当的范围内。载体可以被固定于或者牢固于移植物或者损伤的神经上 或者邻近移植物或者损伤神经的组织上。载体可以在例如，24小时到3个 月的一段时期内，持续地在神经损伤部位释放CSPG-降解酶。

有赖于所利用的特定载体，CSPG-降解酶可以在载体的制造期间或之 后被包含在载体之内、用载体包被、或者以其它方式与载体连接。举例来 说，CSPG-降解酶可以与商业产品连接。

载体还可以行使递送其它生物学活性剂，例如细胞(如施旺细胞)或 生长因子连同CSPG-降解酶的功能。通过载体递送的细胞可以来源于患 者、或者来自同种或不同种的其它来源。通过载体递送的细胞可以被遗传 修饰以产生生物学活性剂。

在一个实施方式中，载体是外科手术套(surgical cuff)，例如在美国专 利No.4,602,624、美国专利No.5,487,756、以及公开的美国专利申请 No.2002/0071828中描述的那些，其可以紧邻神经移植物或损伤的神经(例 如在损伤部位)而被植入。本发明的套包括一种待施用于神经移植物或者 损伤的神经组织的套管(sleeve)。套管可以是各种形状。举例来说，套管可 以是至少部分或完全地包绕损伤神经和/或神经移植物的管状修补物或包 裹物，并且可以包括任何与利用加套技术直接或间接地通过神经移植物连 接损伤神经的两端以便恢复神经连续性的目的用途相适配的装置。如果套 是管状的，套可以任选地包括带有邻接的第一和第二边缘的纵向狭长切口 以便容易地施用于神经移植物或者损伤的神经。举例来说，纵向狭长切口 的第一和第二邻接边缘能够彼此接触，但该接触是可分开的，从而允许该 狭长切口两邻接边缘的分离并暴露出管状套管的内腔。损伤的神经和/或神 经移植物可以被插入该内腔中，允许纵向狭长切口的邻接边缘回复至彼此 可分离地接触的状态，从而将损伤的神经和/或神经移植物放置在一起并可 暴露于CSPG-降解酶。

任选地，外科手术套可以利用常规的缝合技术或者组织胶粘剂，例如 能够施用于神经系统的生物胶，或者其它手段而固定到神经上。优选地， 生物胶是含有血纤蛋白的胶，例如BIOCOLLE(BIOTRANSFUSION)， CRTS(Lille)，ISSUCOL(IMMUNOAG，Vienna Austria)等等。套可以是刚 性支持物，举例来说，一种自卷曲板。当与相应的组织接触时，自卷曲板 可以自动包绕损伤的神经和/或神经移植物。套可以是渗透性的、非渗透性 的、或者半渗透性的。任选地，套可以包括电刺激神经移植物或损伤神经 的装置和/或记录神经移植物或损伤神经内的神经电活动的装置，例如在美 国专利No.5,487,756中所述的。优选地，CSPG-降解酶自套的内表面，即 朝向神经移植物或损伤神经的表面释放或者以其它方式运作。

外科手术套可以通过递送系统，例如贮藏库或表达系统，例如在公开 的美国专利申请No.2002/0071828中描述的腺病毒构建物，向神经移植物 或损伤神经提供CSPG-降解酶。软骨素裂解酶表达系统是本领域公知的， 其中一些被描述在美国专利No.6,054,569、美国专利No.6,093,563、公开 的美国专利申请No.2001/0034043以及Tralec，A.L.[2000]Appl.Environ. Microbiol.66：29-35之中。

外科手术套可以由许多合成材料组成，例如聚硅氧烷、PAN/PVC、 PVFD、聚四氟乙烯(PTFE)纤维或者丙烯酸共聚物。在本发明的一个具体 实施方式中，优选使用由生物材料组成或与之为基础的套，所述生物材料 例如尤其可以是交联胶原蛋白、骨粉、基于碳水化合物的聚合物、聚乙醇 酸/聚乳酸衍生物、透明质酸酯、或者基于白垩的支持物。优选地，在本发 明的构架内利用胶原蛋白或者聚硅氧烷。它可以是，举例来说，人、牛或 鼠源的胶原蛋白。更优选地，应用由I或III或IV型、较佳地IV/IVox胶 原蛋白双层或聚硅氧烷双层组成的套。作为具体的例子，这里可以提及， 一种由聚硅氧烷组成的SILASTIC套(DOW-CORNING)。此外，套可以 有利地为管状，具有柱形或角形截面。套径可以根据预期的应用由本领域 熟练技术人员予以调整。特别地，为了刺激周围神经的再生，可以使用相 对小的，从0.05到15mm的直径。更优选地，套内直径在0.5和10mm 之间。至于脊髓再生的应用，可以选择具有更大内径的套。特别地，对于 这些应用，所用的套具有可能最高达15到20mm的内直径，这取决于有 关的神经截面。为了桥接在臂丛水平撕脱的神经根，套直径优选地与根的 直径相符。套的长度通常由待弥补的丧失物的大小决定。可以使用长度在 0.5和5cm之间的套。优选地，套的长度保持小于5cm，大于5cm的丧 失物是不太常见的。

CSPG-降解酶可以以各种浓度施用于神经移植物或损伤的神经，但优 选以浓缩的形式施用。理想浓度将随着神经大小和酶而改变。举例来说， 软骨素酶可以在从大约10单位/mL到大约1000单位/mL的浓度范围内施 用。优选地，软骨素酶在从大约100单位/mL到大约500单位/mL的浓度 范围内施用于神经移植物或损伤的神经组织。MMPs可以在从大约0.1 μg/ml到大约100μg/ml的浓度范围内施用。优选地，MMP是在从大约10 μg/ml到大约50μg/ml的浓度范围内施用的。

如上所述，根据本发明的方法，CSPG-降解酶可以联合生物学活性分 子，例如生长因子向神经移植物或损伤的神经组织给药。可以连同CSPG- 降解酶一起给药的其它生物学活性剂包括遗传修饰或非遗传修饰的细胞。 因此，本发明的组合物可以包括这样的细胞。细胞可以是非干细胞(成熟 和/或特化细胞，或者它们的前体或先祖细胞)或者干细胞。因此，给予的 细胞可以弹性地从全能或多能干细胞(例如成人或胚胎干细胞)、前体或 先祖细胞延伸至高度特化或成熟的细胞，例如中枢或周围神经系统的那些 细胞(例如施旺细胞)。

干细胞可以从许多来源获得，举例来说，包括胎儿组织、成年组织、 髓细胞血液(cord cell blood)、外周血、骨髓、和脑。干细胞和非干细胞 (例如，特化或成熟细胞，以及前体或先祖细胞)可以被分化和/或遗传修 饰。通常用来鉴定干细胞和表征分化细胞类型的方法和标志描述在科学文 献中(例如，干细胞：科学进展和未来研究方向(Stem Cells：Scientific Progress and Future Research Directions)，附录E1-E5，国立健康研究院报 告，2001年6月)。据报道含有干细胞的成年组织列表正在增长，并且包括 骨髓、外周血、脑、脊髓、牙髓、血管、骨骼肌、皮肤和消化系统的上皮、 角膜、视网膜、肝脏和胰脏。

根据本发明的方法，可以向神经移植物或损伤的神经组织给药遗传修 饰的宿主，例如重组细胞。宿主可以被遗传修饰以产生一种或多种CSPG- 降解酶。优选地，CSPG-降解酶是由重组细胞分泌的。举例来说，软骨素 裂解酶表达系统是本领域公知的，其中一些被描述在美国专利No.6,054, 569、美国专利No.6,093,563、公开的美国专利申请No.2001/0034043以 及Tralec，A.L. [2000]Appl.Environ.Microbiol.66：29-35之中。任选地， 重组宿主被遗传修饰，以重组产生CSPG-降解酶以及其它生物学活性剂。

编码一种或多种CSPG-降解酶的核酸分子可以被插入到载体中，并用 作为基因治疗载体。基因治疗载体可以通过，举例来说，静脉内注射、局 部给药、或者通过立体定位注射递送给患者。基因治疗载体的药物制品可 以包括处于可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含埋植了或者以 其它方式结合了基因递送介质的缓释载体。此外，这种药物制品可以包括 治疗有效量的重组产生CSPG-降解酶的细胞。

遗传修饰宿主细胞所用的各种方法是本领域公知的，并且被描述在， 举例来说，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，和 Gloves，D.M.(1985)DNA Cloning，Vol.I：A Practical Approach，IRL Press，Oxford中。因此，从来源提取DNA、进行限制性酶消化、DNA片 段电泳、加尾并使质粒和插入的DNA退火、连接DNA、转化细胞例如原 核和真核细胞、制备质粒DNA、电泳蛋白以及分析DNA序列都落在遗传 工程领域人员的技术范围之内。

为降低免疫原性，本发明所用的神经移植物可以通过许多本领域普通 技术人员已知的方法制成无细胞的。举例来说，神经组织可以通过如材料 和方法部分所述的冷冻杀死法，或者通过用去污剂化学提取(Sondell M等 [1998]Brain Res 795：44-54)制成无细胞的。神经移植物可以在施用一种 或多种CSPG-降解酶之前、期间或之后被无细胞化。

体外神经培养。本发明还涉及培养用于植入人或动物体内的神经组 织的方法。本发明的培养方法涉及在体外“预变性”神经组织，这在移植 物植入之后可提高再生轴突越过移植物和宿主神经组织间界面的能力。没 有被理论束缚，本发明的培养方法允许活神经细胞表达CSPG-降解酶并促 进施旺细胞增殖，正如在体内神经变性重塑过程期间天然发生的那样。

体外培养方法包括在允许神经组织体外生长和提高神经组织在随后作 为移植物植入时的神经突促进活性的条件下，培养神经组织。神经突促进 活性的提高可以通过神经组织的体外神经突向外生长试验测定，例如本文 所述的低温培养生物试验。

作为选择地，还可以利用神经组织的体内神经突向外生长试验。分析 神经突向外生长的方法是本领域已知的，并且典型地包括定性或定量地测 定神经突在固相支持物，例如微量培养板或者显微载片上的向外生长程度。 可以利用标准荧光。

本发明的方法可以包括自人或动物分离神经组织，并且在体外短期培 养神经组织，培养时间在从大约24小时到大约96小时的范围内变化。在 体外较长时间的温育可导致生长促进特性的退化和丧失。优选地，神经组 织被培养大约24小时到大约72小时。更优选地，神经组织被培养大约48 小时。

神经组织可以在大约10℃到大约37℃的温度范围内培养。优选地，神 经组织在大约30℃到大约37℃的温度范围内培养。更优选地，神经组织在 大约37℃下培养。

神经组织可以在确定成分培养基或者补充血清的培养基中培养。确定 成分培养基可以是，举例来说，N2培养基或者Dulbecco′s改良的Eagle 培养基(DMEM)。如果利用补充血清的培养基，血清可以是人或动物的， 例如胎牛血清。优选地，神经组织在确定成分培养基中培养。在一个实施 方式中，神经组织是一个在培养后并且在植入宿主前被无细胞化的神经移 植物。在一个优选的实施方式中，神经移植物通过冷冻杀死无细胞化。尽 管实施本发明的培养方法时无需外源酶，但该方法也可以包括使神经组织 同一种或多种CSPG-降解酶接触。

本发明进一步涉及提供用于植入人或动物体内的神经移植物的方法。 优选地，神经移植物的横断面特征与植入部位的宿主神经组织，例如宿主 近侧和远侧神经残段的横断面特征相似。在一个实施方式中，本发明的方 法包括产生潜在宿主(即移植物受体)的神经残段横断面的数字图像数据， 分析图像数据以限定神经元件的坐标位置和它们的直径，以便产生受体模 板，并将受体模板数据与能够被贮藏在存储器中的供体模板数据进行比较。 供体模板数据为来自贮藏的神经移植物“库”的数字图像数据。然后可以 选择与受体神经残段在结构元件上对接程度最高的贮藏神经移植物植入受 体内。相关参数包括一种或多种结构元件的直径、厚度和/或空间排列(即 边界)，其中结构元件包括，但不限于，神经外膜、神经束组、神经束、 髓鞘和轴突。所以，神经移植物和宿主神经之间的对接可以被最大化。优 选地，所选的神经移植物具有相似的神经束组和轴突横断面排列。

美国专利No.5,231,580描述了许多确定神经特征的方法。数字图像数 据的产生可以利用本领域公知的方法和设备实现，例如数码像机。图像数 据的分析和受体模板数据与贮藏的供体模板数据的比较可以，举例来说， 通过能够进行图像扫描、分析和模式识别的运算法则实现。为选择神经移 植物和受体神经之间最接近的匹配，可以建立相似性阈值。

本发明的方法和组合物可以施用于中枢神经系统(CNS)和周围神经系 统(PNS)的神经组织。举例来说，本发明的神经移植物可以作为PNS中的 居间神经移植物，或者脑和脊髓及其任何外延中的桥接物。

本发明的CSPG-降解酶可以从许多来源获得，包括天然产生该酶的生 物，或者通过遗传修饰产生(或过量产生)该酶(产生重组酶)的生物。 举例来说，CSPG-降解酶可以从细菌来源获得，包括那些天然产生该酶， 或者那些被遗传修饰产生(或过量产生)该酶的细菌。CSPG-降解酶也可 以从哺乳动物来源获得，包括天然产生该酶的那些哺乳动物，或者被遗传 修饰产生(或过量产生)该酶的那些哺乳动物。作为选择地，CSPG-降解 酶可以被化学合成。

如本文所用的，术语“近侧”部分旨在指保持与神经元胞体的连续性 的轴突部分，或者包含这些轴突的神经部分。“远侧”部分旨在指自神经 元胞体断离的轴突部分，或者包含这些断离轴突的神经部分。

在周围神经损伤的情况下，其近侧部分是与神经节或脊髓连接的部分。 周围神经的远侧部分旨在指与运动终板(神经肌肉接点)或感觉器官连接 的神经最外周的部分。在脊髓损伤的情况下，近侧部分是与核接触的部分 或者更前端的部分。远侧部分旨在指延伸至末端突触的部分。

如本文所用的术语“治疗”，是指降低或减缓与患者所遭受的特定神 经损伤相关的至少一种不良效应或症状。

如本文所用的，术语“干细胞”是指能够复制或自我更新、并发育成 许多细胞类型的特化细胞的未特化的细胞。干细胞经历分裂产生至少另一 个与起源细胞具有相同能力的干细胞。举例来说，在合适的条件下，造血 干细胞可以产生第二代干细胞和神经元。干细胞包括胚胎干细胞(例如起 源于胚泡内细胞团的那些干细胞)和成年干细胞(可存在于更成熟的动物， 包括人的全身)。如本文所用的，干细胞旨在包括在处于晚于胚胎期的成 熟期(例如，胎儿、婴儿、青少年、少年、成年等)的动物中发现的那些 干细胞。

如本文所用的，术语“先祖细胞”(也称为“前体细胞”)是未特化 的或者具有特化细胞的部分特征的细胞，其能够进行细胞分裂并产生两个 特化细胞。举例来说，髓样先祖/前体细胞能够进行细胞分裂产生两个特化 细胞(嗜中性粒细胞和红细胞)。

如本文所用的，术语“共给药”及其变体是指同时(在一个或多个制 品中)或者连续地施用两种或者多种药剂。

如本文所用的，术语“组合”包括亚组合。举例来说，CSPG-降解酶 软骨素酶ABC、软骨素酶A、软骨素酶C、软骨素酶AC、透明质酸酶、 MMP-2和MMP-9的组合将包括，举例来说，软骨素酶ABC和MMP-2 的亚组合。

如本文所用的，术语“生物学活性”或“生物学活性的”旨在指与特 定药剂、分子、化合物等相关联的活性。举例来说，CSPG-降解酶软骨素 酶的生物学活性是CSPG的降解。优选地，CSPG-降解酶活性包括软骨素 -4-硫酸、软骨素-6-硫酸、或者软骨素-4-硫酸和软骨素-6-硫酸两者的断裂 或裂解。因此，特定CSPG-降解酶的生物学活性片断及变体同样表现出 CSPG-降解酶活性。同样地，生长因子，例如成纤维细胞生长因子-1的生 物学活性片断将表现出正常地与该生长因子相关的生物学活性。

如本文所用的术语“遗传修饰”是指本发明的细胞的基因型通过本领 域已知的导致基因型永久或短暂改变的任何手段(举例来说，包括通过细 胞或病毒颗粒的多核苷酸序列的直接传递、感染性病毒颗粒的传递、以及 通过任何已知可携带多核苷酸的物质进行的传递)有意地引入外源核酸而 发生的稳定或瞬时改变。核酸可以是合成的，或者天然来源的，并且可以 包含基因、部分基因或者其它有用的多核苷酸。术语“遗传修饰”并不旨 在包括天然发生的改变，例如通过天然病毒活动、天然遗传重组等等发生 的改变。

多种载体可被用来进行根据本发明的遗传修饰。载体可以是疫苗、复 制或扩增载体。在本发明这方面的一些实施方式中，多核苷酸可操作地与 能够导致该多核苷酸序列表达的调控元件相连。这样的载体包括，例如， 染色体、附加体和病毒来源的载体，例如，来源于细菌质粒、来自噬菌体、 来自转座子、来自酵母附加体、来自插入元件、来自酵母染色体元件、来 自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病 毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒，以及来源于上述载体来源的组合的载体， 例如那些来源于质粒和噬菌体的遗传元件的载体(例如粘粒和噬菌粒)。

如上所示，被利用来进行遗传修饰的载体还可以包含促使本发明的核 苷酸序列编码的多肽，例如CSPG-降解酶，或其生物学活性片断或变体能 在给定宿主细胞中表达和/或分泌的必要元件。载体可以包含一种或多种选 自启动子、翻译起始信号、翻译终止信号以及适当的转录调控区的元件。 在某些实施方式中，载体可以在宿主细胞中稳定地维持，并且可以任选地， 包含指导翻译的蛋白分泌的信号序列。其它实施方式提供了在转化的宿主 细胞中不稳定的载体。载体可以整合进宿主染色体中，或者是自主复制的 载体。

在一个具体的实施方式中，载体包含可操作地与编码蛋白或肽的核酸 序列连接的启动子，一个或多个复制起点，以及任选地，一个或多个选择 标记(例如，抗生素抗性基因)。用于表达本发明的多肽的非限制性示例 载体包括pBr-型载体、pET-型质粒载体(PROMEGA)、pBAD质粒载体 (INVITROGEN)或下文实施例中所提供的那些。此外，根据本发明的载体 可用于转化宿主细胞，以克隆或表达本发明的核苷酸序列。

可用于控制表达的启动子包括，但不限于，CMV启动子、SV40早期 启动子区(Bernoist和Chambon [1981]Nature 290：304-310)、劳氏肉瘤病 毒3′长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等[1980]Cell 22：787-797)、 疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等[1981]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等[1982] Nature 296：39-42)；原核载体包含启动子例如β-内酰胺酶启动子(VillKamaroff 等[1978]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)、或者tac启动子 (DeBoer等[1983]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；参见Scientific American中的″来自重组细菌的有用蛋白″，1980，242：74-94；植物表达 载体包含胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella等[1983]Nature 303： 209-213)或者花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子(Gardner等[1981]Nucl. Acids Res.9：2871)、以及光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子 (Herrera-Estrella等[1984]Nature 310：115-120)；来自酵母或真菌的启动 子元件例如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(甘油磷酸激酶) 启动子，和/或碱性磷酸酶启动子。

本发明还提供了“同源”或“修饰”核苷酸序列的应用。修饰的核酸 序列应理解为是指根据本领域技术人员公知的技术通过诱变获得的、并且 与正常序列相比表现出改变的任何核苷酸序列。举例来说，在用于多肽表 达的调控和/或启动子序列中导致本发明多肽表达水平改变的突变提供了 一种“修饰核苷酸序列”。同样地，对本发明的多核苷酸的替代、缺失或 添加也提供了“同源”或“修饰”核苷酸序列。在各种实施方式中，“同 源”或“修饰”核酸序列与天然(天然存在的)CSPG-降解酶具有基本上 相同的生物学或血清学活性。“同源”或“修饰”核苷酸序列还可以被理 解为是指本发明的多核苷酸的剪接变体或者编码如下文所限定的“修饰多 肽”的任何核苷酸序列。

用于本发明目的的同源核苷酸序列涵盖与核苷酸序列的碱基具有至少 (或至少大约)20.00％到99.99％(包括在内)的百分比一致性的核苷酸序 列。

上述范围的百分比一致性应当被看作包括了在20.00％和99.99％之间 以0.01％为间隔的任何分数百分比，并为这些百分比提供了书面描述和支 持。这些百分比纯粹是统计学百分比，并且两个核酸序列之间的差别可以 随机地在整个序列长度内分布。

在不同的实施方式中，与本发明中所用的核苷酸序列的碱基表现出百 分比一致性的同源序列可以与编码CSPG-降解酶的多核苷酸序列具有百 分之20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 或99的一致性。

蛋白以及核酸序列的同源性都可以利用本领域已知的任何种类的序列 比较算法和程序进行评估。这样的算法和程序包括，但绝不限于， TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA及CLUSTALW(Pearson和 Lipman[1988]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448；Altschul等 [1990]J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Thompson等[1994]Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680；Higgins等[1996]Methods Enzymol.266： 383-402；Altschul等[1990]J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Altschul等 [1993]Nature Genetics 3：266-272)。

根据本主题发明的方法给予患者的细胞或组织可以来源于人或其它哺 乳动物，举例来说，包括非人灵长类动物、啮齿类动物和猪。来源物种的 具体例子包括，但不限于，人、非人灵长类动物(例如猿、黑猩猩、猩猩、 猴子)；家畜(宠物)例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南垂腹猪、兔子和雪 貂；驯化农场动物例如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；典型 地动物园中可见的野生动物，例如熊、狮子、虎、豹、象、河马、犀牛、 长颈鹿、羚羊、树獭、瞪羚、斑马、角马、草原土拨鼠、考拉熊、袋鼠、 负鼠、浣熊、熊猫、大熊猫、鬣狗、海豹、海狮、海象、鼠海豚、海豚和 鲸。

同样地，可得益于本公开的治疗方法的哺乳动物种类包括，但不限于， 人、非人灵长类动物(例如猿、黑猩猩、猩猩、猴子)；家畜(如宠物) 例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南垂腹猪、兔子和雪貂；驯化农场动物例如 牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；典型地动物园中可见的野生 动物，例如熊、狮子、虎、豹、象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树獭、 瞪羚、斑马、角马、草原土拨鼠、考拉熊、袋鼠、负鼠、浣熊、熊猫、鬣 狗、海豹、海狮、海象、水獭、鼠海豚、海豚和鲸。

本文提及或引用的所有的专利、专利申请、临时专利申请、以及出版 物在此全文并入作为参考，同样并入作为参考的还有同时递交的美国专利 申请No.________，(UF-336XC1)“神经修复的材料和方法”；美国专利申 请No._______，(UF-336XC2)“神经移植的材料和方法”以及美国专利申 请No._______，(UF-336XC3)“神经移植的材料和方法”，包括所有的图、 表、附图、核苷酸序列以及氨基酸序列，只要它们不与本说明书所显示的 明确教导相矛盾即可。

材料和方法

用于神经横断和神经挤压实验的外科手术操作。所有的外科手术操 作是根据实验动物管理及使用委员会(IACUC)批准的方案进行的。年青成 年SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN Indianapolis，IN)用甲苯噻嗪(15 mg/kg，肌肉内注射)继之以氯胺酮-HCl(110mg/kg，腹膜内注射)深度麻 醉。6只动物接受双侧神经挤压损伤。暴露坐骨神经，然后在internal obdurator腱远侧4mm处用DUMONT#5号钳以稳定的压力挤压30秒。 挤压部位用神经外膜缝合标记。在不同的实验组中，8只大鼠利用锯齿剪 接受双侧坐骨神经横断损伤。近侧和远侧残段利用9-0 ETHILON缝线通 过神经外膜神经缝合术包上。然后施用血纤蛋白胶(纤维蛋白原和凝血酶) 以稳固此联合。在两种损伤模型中，右侧坐骨神经用软骨素酶ABC(1U2 μl)(高度纯化，无蛋白水解酶；SIGMA CHEMICAL CO.，St.Louis，MS) 在损伤远侧2-mm处注射。左侧坐骨神经(具有与右侧相同的损伤)单独 用介质(溶于PBS中的0.1％牛血清白蛋白)注射。缝合肌肉切口，并用金属 夹夹紧皮肤。在自麻醉状态恢复以后，动物被返回作标准舍养。外科手术 后两天(对于挤压伤)和四天(对于横断伤)，在麻醉条件下取出神经并 如下文所述固定。8只接受神经横断损伤和修复的动物中有1只因为在恢 复期间一侧神经丧失连续性而被排除。

用软骨素酶处理的无细胞神经移植物的制备。成年(180-200g)雌性 SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN，Indianapolis，IN)被用作为神经供体 和受体宿主。供体大鼠用氟烷麻醉并断颈处死。通过臀肌割裂切口暴露并 分离不带下面筋膜的坐骨神经。切出腓总神经和胫神经岔口处喙形端一段 15-mm的神经段。该节段用冷无菌林格液漂洗，通过将末端钉到薄塑料支 持物上使之稳固，并转移到一个低温小瓶中。将该小瓶在液氮中浸没2分 钟，然后转移到37℃水浴2分钟。重复这个冻/融循环，产生无细胞神经移 植物，随之贮藏在液氮中。在移植前一天，令神经移植物温热至室温，并 于37℃在含有2单位/ml软骨素酶ABC(SIGMA，St.Louis，MO)的100μl 磷酸缓冲盐溶液pH7.4(PBS)中或仅在PBS(介质)中温育16小时。移植 物用林格液漂洗两次，并放置在冰上备用。软骨素酶ABC制品是高度纯 化的，并且制造商声称其基本上没有蛋白水解酶活性。

用于软骨素酶实验的居间神经移植术。12只大鼠接受双侧无细胞神 经移植物，一侧为软骨素酶处理的，而一侧是介质处理的移植物。宿主大 鼠用甲苯噻嗪(15mg/kg，肌肉内注射)和氯胺酮(110mg/kg，腹膜内注射) 深度麻醉。暴露坐骨神经，并由置于神经和下面组织之间的塑料插入物支 撑。于坐骨神经缺口和岔口之间半途的神经区域首先包上血纤蛋白胶。利 用锯齿剪，剪下2.5-mm的宿主神经段，并用新鲜修剪的10-mm无细胞移 植物取代。移植物在每一端各用一根9-0 ETHILON缝线通过神经外膜神 经缝合术与宿主神经残段接合。然后施用血纤蛋白胶以稳定接合，其与最 初的血纤蛋白涂层联合减少了神经元件的外突(神经内膜的迅速增殖) (Menovsky T等[1999]Neurosurgery 44：224-226)。肌肉用4-0缝线，而 皮肤用创伤夹严缝。在自麻醉状态恢复以后，动物被返回作标准舍养。

9只大鼠在移植后8天杀死，4只4天后杀死。动物被深度麻醉并断颈 处死。取出移植物和3mm的近侧和远侧宿主神经，浸在4％多聚甲醛的 0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中于4℃过夜。样品用PBS平衡，并于4℃在30％ 的蔗糖/磷酸缓冲液中浸渍2天。利用解剖显微镜和作为界标的神经外膜缝 线，将每个样品再分为3个节段，代表a)近侧神经-移植物界面，b)主移植 物和c)远侧神经-移植物界面。样品被包埋并冷冻切片。取穿过神经-移植 物界面的纵向切片检测接合的连续性。

主移植物在横切面上按记录的尺度连续切片以通过显微镜检评估轴突 生长程度。再生轴突通过GAP-43免疫荧光(见下文)在0.56mm间距的 移植物切片上标记。利用SPOT数码像机系统(DIAGNOSTIC INSTRUMENTS，INC.，Sterling Heights，MI)和AXIOVERT 10显微镜 (CARL ZEISS，Thornwood，NY)获取表面荧光显微照片。利用 IMAGE-PRO PLUS软件(MEDIA CYBERNETICS，Silver Springs，MD) 评定GAP-43-阳性轴突分布图。

用于预变性实验的神经外植块培养。成年(180-200gm)雌性

SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN，Indianapolis，IN)被用作为神经供 体和移植物受体。这个项目受到实验动物管理及应用委员会的评审和批准。 供体大鼠用异氟烷深度麻醉并断颈处死。通过臀肌割裂切口暴露并分离不 带下面筋膜的坐骨神经。切出腓总神经和胫神经岔口处喙形端一段15-mm 的神经段。该节段用冷无菌林格液漂洗，并通过将末端钉到薄塑料支持物 上使之稳固。神经外植块在含有N2补充物的DULBECCO′S改良的 EAGLES′培养基(DMEM/N2)中或者在补充有2％或10％胎牛血清(FBS) (ATLANTA BIOLOGICALS，Atlanta，GA)的DMEM/N2中培养1、2、4 和7天。正如说明的，一些外植块在存在MMP抑制剂GM6001(50uM) 的条件下培养(Grobelny等[1992]Biochem.，31：7152-7154)。培养的神经 在DMEM中彻底洗涤，然后转移到密封管中。管在液氮中浸没2分钟， 然后在37℃水浴中融化5分钟。重复两次这个冻-融循环，产生冷冻杀死的 (无细胞)神经段。新鲜切除的神经(未培养的对照)利用相同的操作冷 冻杀死。然后这些无细胞神经段a)被包埋以冷冻切片用于低温培养试验或 者b)贮藏在液氮中(长达2周)用于生化分析和作为居间神经移植物。制 备的用于组织学检测的神经外植块用乙醛固定，而省去冷冻杀死操作。

体内神经变性是通过近骨盆处单次横断坐骨神经实现的。近侧残段被 移出并结扎以排除轴突生长。胫肌和皮肤被严缝，并允许横断的神经原位 变性2或7天。

免疫细胞化学。轴突再生通过GAP-43免疫荧光和数字图像分析评 估。封固在载片上的组织切片用PBS洗涤，然后用PBS中的0.5％Triton X-100处理10分钟。切片用封闭缓冲液(PBS中的10％血清+0.1％Triton X-100)处理，然后与一抗(在封闭液中稀释)在4℃过夜温育。结合的抗 体用猪抗-兔免疫球蛋白(DAKO CORPORATION，Carpinteria，CA)或羊 抗-小鼠免疫球蛋白(Sigma)FITC-偶联的二抗于室温暗处标记1小时。抗- 小鼠二抗临用前用大鼠血清预吸附。切片洗涤、用PBS中的4％多聚甲醛 后固定、漂洗、并在荧光封固剂中盖上盖玻片。亲和纯化的兔抗-GAP-43 肽抗体利用已知的方法制备(Ferguson TA等[2000]Mol Cell Neurosci， 16：157-167)并以2μg/ml应用。多克隆抗体1918(CHEMICON INTERNATIONAL，Temecula，CA)(1∶1000)仅仅结合到通过软骨素酶 ABC消化暴露出的、仍然与CSPG核心蛋白连结区相连的不饱和双糖单位 上(Bertolotto A等[1986]J Neurol Sci 73：233-244)。多克隆抗-EHS层粘 连蛋白抗体(Sigma)(1∶1000)被用来标记基膜。多克隆抗-S-100抗血清 (Dako)(1∶500)被用来标记施旺细胞。暗视场图像被反转并优化以便在 PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS INC.，San Jose，CA)中打印。

低温培养生物试验。低温培养是神经突向外生长试验，其中神经元直 接地培养在新鲜/冷冻神经切片上，并如先前所描述的方法(Ferguson TA 等[2000]Mol Cell Neurosci，16：157-167)进行。简要地，软骨素酶和介质 处理的神经段以20μm切片，封固在无菌氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)- 包被的盖玻片上，并于-20℃贮存备用。在指出的时候，切片用软骨素酶 ABC(0.1单位/ml)或者介质(50mM Tris-HCl，(pH8.0)，含50mM NaCl) 在37℃处理2小时。纯化的来自8天鸡胚的背根神经节(DRG)神经元直 接在含有10ng/ml神经生长因子的确定成分的N2培养基(Bottenstein JE 等[1980]Exp Cell Res 125：183-190)中接种在神经切片上。低温培养试验 在温育24小时后通过100％甲醇固定而终止。DRG神经元的神经突生长 通过GAP-43免疫荧光标记评估。表面荧光显微照片的获取按针对组织切 片时所述的方法进行。神经突长度直接利用IMAGE-PRO PLUS软件 (MEDIA CYBERNETICS，Silver Springs，MD)测量。在每个实验的每个条 件下评定至少250个具有大于1个胞体(～15μm)的神经突的神经元。

用于神经预变性实验的凝胶酶谱。将神经段置于冰冷提取缓冲液(50 mM Tris-HCl，pH7.6，含1％Triton X-100，200mM NaCl，和10mM CaCl2)中，并通过探头超声波匀浆(15秒)。样品在4℃振荡30分钟，并离 心收集可溶性成分(12,000g，20分钟)。可溶性成分中的总蛋白含量利用 BRADFORD REAGENT(BIO-RAD LABORATORIES，Hercules，CA)测 定。溶解在提取缓冲液中的牛血清白蛋白被用作为蛋白标准。提取物无需 加热溶解在非还原性Laemmli样品缓冲液中，并在含有1.5mg/ml猪明胶 的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上于4℃电泳。凝胶短暂地在水中漂洗，然后 在2.5％Triton X-100中洗涤3次达45分钟之久。用3次5分钟水洗除去 Triton，酶谱凝胶在温育缓冲液(50mM Tris-HCI，pH8.0，5mM CaCl2， 0.02％叠氮化钠)中显影21小时。固定凝胶并用0.05％考马斯亮蓝着色。具 有明胶水解活性的蛋白带在明胶凝胶的蓝色背景下显示为清澈的裂解区 域。明胶水解条带与潜在和活性形式的重组人MMP-2和MMP-9，以及预 着色的分子量标准(BIO-RAD)进行共迁移比较。获取数字显微照片并利 用IMAGE-PRO PLUS软件进行明胶水解条带的光密度测量。

用于神经预变性实验的原位酶谱。将未固定的正常和培养神经的冷 冻切片(10μm)封固在载玻片上，并用含有20μg/ml分子内淬灭的荧光素 标记的明胶底物(MOLECULAR PROBES INC.，Eugene，OR)(Oh等， 1999)的反应缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.2 mM叠氮化钠，pH7.6)覆盖。在对照条件下，反应缓冲液中包括MMP抑 制剂EDTA(30mM)。在37℃温育24小时后，切片用PBS漂洗，并用磷 酸缓冲液中的4％多聚甲醛固定。切片用水漂洗，并利用Citifluor封固。 组织切片中通过明胶水解活性产生的荧光素明胶肽通过表面荧光显微镜观 察和照相。

用于预变性实验的居间神经移植术。6只大鼠接受双侧无细胞神经移 植物，一侧为正常(未培养的)而一侧为体外预变性的(在2％血清中培 养2天)。宿主大鼠用甲苯噻嗪(15mg/kg，肌肉内注射)和氯胺酮(110 mg/kg，腹膜内注射)深度麻醉。暴露坐骨神经，并由置于神经和下面组织 之间的塑料插入物支撑。在坐骨神经缺口和岔口之间中途的神经区域首先 包上血纤蛋白胶。利用锯齿剪剪下2.5-mm的宿主神经段。融化移植物并 用解剖刀片新鲜修剪至10mm。移植物在每一端各用一根9-0 ETHILON 缝线通过神经外膜神经缝合术与宿主神经残段接合。然后施用血纤蛋白胶 以稳定接合，其与最初施用于宿主神经的血纤蛋白涂层组合减少了神经元 件的外突(神经内膜的迅速增殖)(Menovsky和Bartels，1999， Neurosurgery，44：224-225，pp.225-226讨论)。肌肉用4-0缝线，而皮肤用 创伤夹严缝。在自麻醉状态恢复以后，动物被返回作标准饲养。在移植后 8天宿主大鼠被深度麻醉并断颈处死。取出移植物和3mm的近侧和远侧 宿主神经，浸在4％多聚甲醛、0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中于4℃过夜。 样品用PBS平衡，并于4℃在30％的蔗糖/磷酸缓冲液中浸渍2天。样品 被包埋并按记录的尺度在横切面上冷冻切片。移植物内的再生轴突通过 GAP-43免疫荧光(见下文)标记。获取表面荧光显微照片，并利用 IMAGE-PRO PLUS软件评定GAP-43-阳性轴突分布图。

用于神经预变性实验的免疫荧光标记。固定的组织切片用PBS中的 0.5％Triton X-100处理10分钟。非特异性抗体结合通过用含有0.1％ Triton X-100和10％正常血清的PBS(封闭缓冲液)预处理封闭。一抗 在封闭缓冲液中稀释并在4℃过夜施用。结合的一抗用与荧光素或罗丹明 偶联的猪抗-兔免疫球蛋白(DAKO CORPORATION，Carpinteria，CA)或 羊抗小鼠免疫球蛋白(Sigma)于室温暗处标记1小时。抗小鼠二抗临用前用 大鼠血清预吸附。神经突长度(低温培养)和轴突再生(移植术)通过多 克隆抗-GAP-43 IgG(2μg/ml)(Ferguson和Muir，2000，Mol Cell Neurosci， 16：157-167)(NB300-143；NOVUS BIOLOGICAL，Littleton，CO)免疫标 记评估。其它一抗包括：多克隆抗-MMP-2 IgG(4μg/ml)(MMP2/475； Muir，1995)；多克隆抗-MMP-9 IgG(4ug/ml)(AB19047；CHEMICON， Temecula，CA)；多克隆抗-S-100抗血清(1∶500)(DAKO)；和多克隆OX42 抗血清(1∶500)(SEROTEK，Raleigh，NC)；以及单克隆抗-神经丝IgG(4 ug/ml)(NAP4；Harris等，1993)。在一些情况下，表面荧光显微照片被反 转并增强反差，以便在PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS，San Jose，CA) 中打印。

以下是举例说明实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应当理解 为限制性的。所有的百分比以重量计，而所有的溶剂混合比例除非另外指 出否则按体积计。

实施例1-用软骨素酶处理无细胞神经段对CSPG的降解

这个实验的目的是测定是否软骨素酶处理有效地降解整个完整的无细 胞神经段中的CSPG。大鼠坐骨神经段(长1.5cm)通过重复冻融循环被 无细胞化，然后整体在软骨素酶ABC溶液中浸浴16小时。软骨素酶预处 理的神经中的CSPG降解通过新表位抗体Ab1918免疫标记进行检测。这 个抗体与通过软骨素酶ABC对硫酸软骨素链裂解后在核心蛋白上产生的 表位结合(Bertolotto等[1986]J Neurol Sci，73：233-244)。Ab1918免疫染 色在整个预处理的神经段中均很强烈，如图1A所示。此外，Ab1918免疫 染色的强度并不因为用软骨素酶对这些切片额外地进行后处理而增加，如 图1B所示。Ab1918免疫活性在未暴露于软骨素酶的无细胞神经中不存在 (未显示)。这些发现说明整体软骨素酶处理有效地渗透到所有的神经区 室，并且彻底地降解CSPG侧链。

在正常神经中，CSPG和层粘连蛋白主要地一起分布于神经鞘和基膜 中，包括施旺细胞基膜(Zuo等[1998a]J.Neurobiol.，34：41-54)。它们的 分布在重复冻融之后不变，而且在光学显微镜水平没有整体软骨素酶处理 改变ECM结构的迹象，如图1A和1C所示。软骨素酶处理的无细胞神经 段的完整性是将其随后用作为神经再生移植物的一个重要的考虑因素。因 而，还检测了神经移植后预处理神经段的结构完整性。体内8天后Ab1918 免疫反应性的强度和分布(在未被宿主细胞浸润的移植物区域)不变，说 明最初的施旺细胞基膜结构保持完整，如图1D所示。综上所述，这些结 果证明无细胞神经移植物的整体软骨素酶处理有效地降解CSPG，而不会 危害基膜脚手架或者扰乱其层粘连蛋白内容物的定位。

实施例2-用软骨素酶处理无细胞神经段对抑制性CSPG的失活

软骨素酶处理的无细胞神经中抑制性CSPG的失活通过低温培养生物 试验测定。将鸡胚DRG神经元种植在制备的神经段切片上，并通过评定 神经突生长来评估神经突促进活性。结果示于图2。在仅用介质整体预处 理的无细胞神经切片上，平均神经突长度为49μm。在用软骨素酶整体预 处理的无细胞神经上，神经突生长平均为96μm，与对照相比为95％的增 长。为了测定整体软骨素酶处理是否彻底，在切片后用软骨素酶处理神经 组织(后处理)，并在之上进行低温培养试验。正如所预期的，仅用介质 整体处理的无细胞神经的神经突促进活性通过用软骨素酶后处理显著增加 (86％)。相反，软骨素酶后处理对来自整体软骨素酶处理的神经移植物的 切片仅具有微小的附加效果。

这些结果说明，通过将无细胞神经移植物节段在小量软骨素酶ABC 中浸浴，抑制性CSPG被有效地降解和失活。此外，整体软骨素酶处理有 效地使神经移植物脱抑制，而不破坏基膜脚手架上与层粘连蛋白相关的神 经突促进潜能。后一点被诸如在正常和变性神经的低温培养试验(Ferguson 和Muir，2000，Mol Cell Neurosci，16：157-167)中所观察到的现象——在软 骨素酶处理的无细胞神经移植物切片上发生的神经突生长严格地与施旺细 胞基膜相关联——所加强。

实施例3-神经再生通过软骨素酶对无细胞神经移植物的处理而增强

下列实验通过无细胞同基因神经移植物测验软骨素酶处理改善神经再 生的假说。如实施例2所述，无细胞坐骨神经段整体用介质或软骨素酶ABC 处理。10-mm的居间神经移植物通过用血纤蛋白胶加固的神经外膜神经缝 合术与宿主神经连接。9只宿主大鼠每一只都接受双侧移植物，一侧为介 质处理的而一侧为软骨素酶处理的移植物。再生在8天后开始检测。首先， 在纵向切片上检测近侧和远侧神经-移植物接合，以评估外科手术接合的对 接情况，如图3所示。所有的移植物都具有连续性，因此被包括在随后的 分析中。再生的评定建立在对生长的轴突强烈着色的GAP-43免疫标记的 基础上。冷冻杀死的移植物内轴突和施旺细胞残骸是GAP-43免疫阴性的， 而宿主施旺细胞仅仅十分微弱的着色(强度低于用于数字评定的阈值)。以 规定的空间间隔在移植物内通过评定横切片中的GAP-43免疫阳性分布来 评估轴突生长。在所有的移植物中均观察到些许的轴突向内生长，如图4 所示。不过，进入软骨素酶处理的移植物中的生长显著比进入对照移植物 中的生长更强并且分布更广。定量结果示于图5。

进入软骨素酶处理的移植物中的轴突平均数目(GAP-43免疫阳性分布 图)比进入对照移植物中的平均大3倍多。而进入对照移植物的轴突总是受 限，并且最常见为在中央成簇，进入软骨素酶处理的移植物中的最初轴突 生长分布更广，并且在近侧端尤为丰富。这些发现说明轴突穿入无细胞神 经移植物的成功性通过用软骨素酶预处理移植物而显著提高。不过，在两 种条件下一致观察到在移植物远侧有相似数目的轴突。这表明轴突穿入对 照移植物发生在早期，随后暂时地受限，而轴突在整个8天的时间内持续 穿入软骨素酶处理的移植物。

为了测定是否轴突生长进入无细胞移植物的潜伏期可以通过软骨素酶 处理而缩短，对4天的移植物进行相同的分析，但只检测移植物的最近侧 面以及在横切片上对其进行评定。虽然只检测了3只接受双侧移植物的动 物，结果与8天移植物中观察到的相一致。此外，在移植物最近侧面(离 宿主-移植物界面0.3mm)，穿入软骨素酶处理的移植物中的轴突平均多5 倍，如图6所示。从这些结果可以得出结论——软骨素酶处理缩短潜伏期， 并显著改善进入无细胞神经移植物的轴突再生。

实施例4-在软骨素酶处理的移植物的基膜管内的轴突再生

由于神经再生是否成功取决于轴突在层粘连蛋白丰富的基膜管内的生 长，故测定了轴突生长与基膜的联系是否由于无细胞移植物的软骨素酶处 理而改变。8天移植物的横切片用GAP-43和层粘连蛋白双标记。层粘连 蛋白标记强烈，并且基膜看起来在对照和软骨素酶处理的整个移植物中类 似地保持完整。虽然重复的冻融、酶处理、外科手术操作并且在体内8天， 细胞外基质脚手架看起来仍结构完整。多个GAP-43标记的轴突(或神经突) 明显存在于各基膜内，并且观察到其中绝大部分与管内腔表面紧密相连。 在对照和处理过的移植物中观察到相似并且是少量数目的附着不确定的神 经突。大体上，轴突在基膜内生长的倾向不因为无细胞神经移植物的软骨 素酶处理而改变。

实施例5-轴突生长和施旺细胞迁移进入软骨素酶处理的移植物

8天移植物的连续切片进行S-100和GAP-43免疫标记，以检测施旺 细胞就轴突生长而言的迁移。移植物含有两种不同模式的S-100着色；强 烈着色与活的宿主来源的施旺细胞相关联，而弱着色与冷冻杀死的施旺细 胞残骸相关。除非另行指出，以下描述指的是强烈着色的(活)施旺细胞 的分布。在移植物近侧区，施旺细胞和轴突的分布大体上—致，如图7所 示。发现零星的轴突簇，没有任何明显的施旺细胞关联。在没有生长的轴 突的区域也发现分散的施旺细胞。施旺细胞十分显然进入了8天的移植物。 可是，在移植物的较远侧点，常见没有伴随施旺细胞的轴突，如图7所示。 这在包括远侧接合处的纵向切片中得到证实，如图8所示。S-100标记的 施旺细胞在远侧宿主残段中很丰富，但假如有的话也很少侵入移植物的远 侧面(此处仅含有冷冻杀死的施旺细胞残骸)，如图8B所示。图7、8A 和8B中提供的例子来自于软骨素酶处理的移植物，并在对照移植物中观 察到同样的结果。这些发现提示软骨素酶处理的移植物中轴突生长的促进 作用主要地归功于基膜神经突促进活性的增强。

仅在紧紧围绕近侧和远侧接合处的组织的纵向切片中检测了轴突生长 的路径。一旦进入移植物，轴突被引导向远侧生长，并且移植物内没有偏 离生长或神经瘤形成的迹象。这提示引导机制(或者与远侧残段相关联的 趋化性能)在软骨素酶处理的移植物中没有受到损害。此外，基于轴突达 到移植物远侧区域的几个例子，轴突走出移植物，并继续生长进入宿主神 经残段，如图8A所示。

实施例6-通过软骨素酶处理无细胞入神经段产生的抑制性CSPG的 降解和失活

上文实施例中描述的利用大鼠神经进行的许多实验还利用人神经进行 了重复。除了另外指出，利用人神经的实施例6和7也按照实施例1和2 中描述的用于大鼠神经的操作进行。人腓肠神经和胫神经从腿截肢外科手 术新鲜获得。截肢对于不牵连神经的疾病(例如骨癌)是必要的，而且神经 根据组织学检测判断是正常的。

首先检测人神经，以确定它们的CSPG和层粘连蛋白含量与大鼠神经 中所观察到的是否类似。免疫细胞化学显示支持神经再生的基膜既含有 CSPG又含有层粘连蛋白，两者的共同定位方式和其它物种中的相同。图 9A和9B分别显示了CSPG新表位和层粘连蛋白着色的人神经。此外，利 用低温培养生物试验，发现人神经的生长促进特性通过软骨素酶的处理而 提高。定量结果示于图10。

实施例7-软骨素酶处理的人神经移植物内的轴突再生

在下列实验中，测验了软骨素酶处理在大鼠异种移植模型中可以改善 神经再生通过无细胞人神经移植物的假说。从人神经中取出的亚单位(单 个神经束)整体用介质或软骨素酶ABC处理。10-mm的居间神经移植物 通过用血纤蛋白胶加固的神经外膜神经缝合术与大鼠宿主坐骨神经连接。2 只宿主大鼠每一只均接受双侧移植物，一侧为介质处理的而一侧为软骨素 酶处理的移植物。再生在8天后开始检测。在移植物内以规定的空间间距 评定横切片中的GAP-43免疫阳性分布，以评估轴突生长。

进入软骨素酶处理的移植物中的生长比进入对照移植物中的生长显著 地强，并且分布更广。定量结果示于图11。进入软骨素酶处理的移植物中 的轴突平均数目(GAP-43免疫阳性分布图)比对照移植物中的平均大3倍 多。这些发现说明轴突穿入无细胞人神经移植物的成功性通过用CSPG-降 解酶预处理移植物而显著提高。这个异种移植模型还证明无细胞人神经不 被大鼠宿主排斥(在8天内)，证实了无细胞神经的低免疫原性。

实施例8-软骨素酶注射后神经内CSPG的隆解

动物接受或者双侧神经挤压伤或者双侧神经横断以及直接的缝合修 复。同时，一侧神经注射软骨素酶ABC，而对侧只接受介质。首先检测是 否软骨素酶处理有效地降解了损伤神经中的CSPG。损伤部位和损伤部位 周围的神经组织切片利用CSPG-新表位抗体免疫标记。抗体结合于通过软 骨素酶ABC裂解硫酸软骨素链后在CSPG核心蛋白上产生的新的表位。 在损伤和使用软骨素酶后4天的横断神经中，CSPG-新表位免疫染色在接 合处和周围数mm的远侧神经的整个横切面上是强烈的，如图12A和12B 所示。强烈免疫标记还在进入近侧神经内数mm处观察到。在挤压伤神经 中取得类似结果，如图12C所示。当作为免疫染色方法的一部分，向组织 切片应用第二次软骨素酶处理的时候，接近接合处和注射部位的组织的 CSPG-新表位标记至多在边缘处更强烈，如图12D所示。这些结果表明软 骨素酶ABC体内处理如果不是完全的话，也基本上降解了注射部位，包 括神经损伤和修复部位周围细胞外基质中的CSPG。

实施例9-在神经挤压伤(轴索断伤)后，软骨素酶处理不改变轴突 再生

检测了软骨素酶处理改善轴突再生通过神经挤压伤部位的假说。双侧 轴索断伤通过重度挤压坐骨神经而仍保持神经鞘的连续性来实现。在损伤 的时候，一侧神经用软骨素酶ABC注射，而对侧神经仅接受介质注射。 由于神经挤压后轴突的迅速重新生长，在损伤后2天检测穿过损伤部位的 轴突生长。再生轴突通过GAP-43免疫荧光标记，并通过数字图像分析评 定。正如预期的那样，对照神经中，直接伸向损伤部位远侧的轴突再生是 茁壮的并广泛分布于整个神经横切面上，如图13A所示。同样在软骨素酶 处理的神经中观察到相似的再生反应和生长模式。在两种条件下，免疫标 记非常密集，并且在每个基膜管内都观察到数目众多的神经突。GAP-43 免疫反应性的定量评价表明神经挤压后的轴突再生受软骨素酶施用的影响 不明显(图13B)。同样地，在软骨素酶处理的神经中也没有轴突再生的潜伏 期或速率改变的迹象。

实施例10-神经横断(神经断伤)修复后轴突再生通过软骨素酶处理 而增强

检测了软骨素酶处理改善通过神经接合处的轴突生长的假说。双侧神 经断伤通过剪刀剪断坐骨神经然后通过神经外膜缝合和血纤蛋白胶修复以 实现。一侧神经用软骨素酶ABC注射，而对侧神经仅接受介质注射。由 于神经横断后再生潜伏期的缘故，在损伤后4天检测穿过接合处的轴突生 长。在对照神经中，轴突进入主要地以成片方式发生，并且局限于远侧神 经的离散亚区中；另外只发现很少的轴突散布于整个剩余的神经横切面上， 如图14A所示。向远侧更远处延伸的轴突数目(4天后)迅速下降，并且 在离接合处3mm的范围内趋近于0。相反，侵入软骨素酶处理的神经中 的轴突更加茁壮，并且广泛地遍布于整个神经横切面上。在7/7的动物中， 在软骨素酶处理的神经中进入远侧神经的轴突数目比对照神经中的多。平 均起来，紧邻接合处远侧的轴突的数目在软骨素酶处理的神经中增大两倍， 而且3/7的动物增加多于3.5倍，如图14B所示。软骨素酶处理的神经中 的轴突数目与对照神经中的轴突数目的比例逐渐地从2∶1(刚好越过接合 处)升至4∶1以上(在伸向远侧残段的更远点上)。因此，除了增加侵入远 侧神经的轴突数目，软骨素酶处理还缩短轴突侵入的潜伏期和/或提高远侧 神经段内的生长速率。远侧神经所有部分中的轴突生长很清楚地是严格线 性的，并且与神经的长轴对齐。此外，再生轴突(GAP-43)和基膜(层粘连 蛋白)的双免疫标记显示了轴突在远侧神经的基膜内再生的强烈倾向不因 软骨素酶处理而改变。

这些发现证明挤压伤后轴突再生在软骨素酶处理的神经和对照神经中 相似。相反，通过横断神经接合处的轴突再生被加速，并且向远侧神经段 侵入的轴突在注射软骨素酶的神经中增加了数倍。因此，在神经连续性被 破坏的横断伤中，软骨素酶的施用显著地提高了轴突进入远侧神经段基膜 的能力并明显地促进了再生。

根据本发明，单次注射软骨素酶可以显著改善穿过接合的周围神经界 面的轴突再生。抑制性CSPG的降解可以建立更为许可性的神经基质，并 给予轴突芽更大的自由行动空间以实现其定位并进入远侧神经的施旺细胞 基膜内。在这个过程中轴突面临的困难通过横断损伤后较之于挤压伤后与 再生相关的潜伏期的增加而得以证明。值得注意地，数据提示软骨素酶处 理的一个重要效果是缩短周围神经横断模型的再生潜伏期。此外，已知如 果轴突不能够横穿接合处，则轴突芽就会变性(Fu，S.Y.  和T.Gordon 1997，Mol Neurobiol 14：67-116)。

实施例11-培养的神经段的神经突促进活性

新鲜切割的(有细胞)大鼠坐骨神经段在含有0、2和10％胎牛血清 的培养基中培养不超过7天。对照(未培养的)和培养的神经进行冷冻切 片，并且通过低温培养试验评估其神经突促进活性。结果示于图15A。在 对照神经切片上生长的鸡胚DRG神经元具有的平均神经突长度为118 μm。在培养1-4天的神经外植块切片上的神经突生长明显较好。对于在确 定成分培养基(0％血清)中培养的神经，神经突促进活性在体外第2天达 到最大值，与对照神经相比为43％的增加。在含有2％血清的培养基中培 养1或2天的神经外植块的神经突促进活性增长70％多。在10％血清中培 养的神经外植块在体外第2天也达到类似的最大值。神经外植块的神经突 促进活性在更长的培养期后下降，并且在第7天降至对照条件的水平之下。 这些数据表明，当在体外短期培养的时候，无论向培养基中添加或不添加 血清，神经外植块的神经突促进活性都显著增加。神经外植块被阻止贴壁 于培养容器上，并且没有观察到细胞向外生长。不过，所有条件下的细胞 存活性在独立的实验中都得到证实，在所述实验中在切碎并被压在培养表 面的神经外植块中观察到茁壮的细胞迁移。

实施例12-体外和体内预变性的比较

利用低温培养试验，比较体外预变性的和体内预变性的大鼠坐骨神经 的神经突促进活性。如上文所述(见图15A和15B)，在2％血清中培养2 天的神经外植块上的DRG神经元的神经突生长(体外预变性)比对照神 经(未预变性的)大70％。而且，培养期更长的神经外植块(4和7天) 导致渐少的神经突促进活性。培养7天的神经比对照条件下少37％的活 性。通过比较，在体内预变性的神经的神经突促进活性比在体外预变性的 神经要低得多。在体内预变性2天的神经上的神经突生长为35.8μm，比 对照条件下少72％的活性(126.5μm)(t-test，p＜0.001)。不过，这种抑制随 着时间而逆转，并且体内预变性7天导致神经突生长比对照条件下增加 12％(p＝0.06)。这些数据表明体外预变性提高神经段的神经突促进活性的 程度比体内预变性所实现的程度要大。

实施例13-体外变性是MMP依赖性的

神经段在含2％血清并添加或不添加MMP抑制剂GM6001的培养基 中培养2天。培养神经的神经突促进活性通过低温培养试验评估。结果示 于图15B。与图15A中所显示的相似，生长在培养的神经(2天，2％血清) 上的DRG神经元的平均神经突长度为210μm，比(未培养)对照神经增 加68％。不过，对于在GM6001存在条件下培养的神经，这种增加减至仅 有14％。每种条件下神经段的离散培养(压片制备物)显示了丰富的细胞 向外生长，表明没有细胞存活性的丧失。此外，用GM6001处理分离的施 旺细胞培养物证实这种基于hydromate的二肽毒性非常低。这些结果有力 地暗示了MMP活性在变性过程中提高培养的神经外植块的神经突促进活 性。

实施例14-培养的神经段中的MMP表达：酶谱凝胶分析

MMP-2和MMP-9是主要的能够降解明胶(裂解的胶原蛋白)的胞外 蛋白酶，并且它们的主要底物是基膜的IV型胶原蛋白。在大鼠内，MMP-2 在体内由施旺细胞组成型地表达，并且在神经损伤后上调。另一方面， MMP-9在正常神经中检测不到，并在损伤之后与入侵的粒细胞和巨噬细胞 相联系而存在。在本发明中，对体外神经变性的检测最大限度地排除了由 造血细胞引起的MMP表达作用，从而为确定由定居的神经细胞实现的 MMP表达作用提供了独一无二的机会。培养的神经外植块中的MMP水 平首先通过明胶底物覆盖凝胶电泳(酶谱)检测。明胶酶谱对于检测MMP-2 和MMP-9非常灵敏，并且具有同时揭示潜在和活性两种形式的附加优势。 神经段在2％血清存在的条件下培养1、2、4和7天。提取的神经的有代 表性的酶谱分析示于图16。正常(未培养的对照)神经在Mr＝72kD处显 示出占优势的明胶水解带，其与人重组MMP-2的酶原形式共迁移。观察 到痕量活化的MMP-2(Mr＝66kD)，而MMP-9(Mr＝92和84kD)未检测到。 在培养的神经中，活化的MMP-2迅速增长，并且总MMP-2含量出现实 质增加。MMP-9在培养1或2天的神经中检测不到，而在4和7天的样品 中检测到痕量活化的MMP-9。对于在确定成分培养基中培养的神经外植 块，获得相似的结果，证实血清对神经样品中观察到的明胶水解活性没有 贡献。这些结果表明在体外神经变性中MMP-2迅速活化，并被增量调节。 值得注意的是，明胶酶谱检测MMP-9比检测MMP-2敏感若干倍(Ladwig 等[2002]Wound Repair Regen 10：26-37)，这预示着MMP-9含量在神经 样品中可忽略不计。

实施例15-培养的神经段中的MMP活性：原位酶谱

MMPs的活性通过基因转录、酶原活化以及基质金属蛋白酶的组织抑 制剂的作用进行调节。通过原位酶谱检测了神经段中的净明胶水解活性。 组织切片用淬灭的荧光素-明胶(其可以被组织内的明胶水解活性转化为荧 光肽)覆盖。在正常神经中检测到组成型的明胶水解活性，大多与沿着神 经内膜基膜排列的施旺细胞相关联(如图17A和17B所示)。在培养的神 经中，散布于神经内膜内的明胶水解活性具有普遍的增加，并且施旺细胞 被更强烈地标记，如图17C和17D所示。还检测了在GM6001存在条件 下培养的神经的明胶水解活性。如上所述，GM6001阻断在培养的神经中 观察到的神经突促进活性的增加。GM6001处理的神经外植块中的明胶水 解活性几乎不可检测，如图17E和17F所示。汇总起来这些结果表明明胶 水解活性通过神经外植块培养显著提高，并且GM6001有效地阻断体外变 性期间新生的MMP活性。

实施例16-培养的神经段中的MMP分布：免疫荧光标记

通过免疫荧光显微术检测培养了2天的神经外植块中的MMP-2和 MMP-9分布。培养的神经的MMP-2免疫标记在施旺细胞内和周围基膜内 强烈，如图18A所示。用S-100着色施旺细胞显示最强烈的MMP-2免疫 标记与迁移的施旺细胞有关(图18B；并见下文)。此外，MMP-2免疫表 达与通过原位酶谱获得的明胶水解活性模式非常相似。另一方面，MMP-9 免疫标记除了罕见的细胞分布之外，在神经束内实质上不存在。在周围的 神经外膜中见到些许的细胞MMP-9免疫表达，如图18C所示。OX42标 记被用来鉴定巨噬细胞，其分散在培养神经的整个神经外膜内，并且很少 分布在神经束内，如图18D所示。MMP-9和OX42标记的区室性分布提 示巨噬细胞是主要的MMP-9来源。此外，施旺细胞以及可能地一些神经 束膜成纤维细胞表达MMP-2，并且还在周围的细胞外基质中观察到弥散的 MMP-2免疫反应性。

实施例17-培养的神经段中的细胞分布和轴突再生

神经损伤后，施旺细胞被激活，与其髓鞘解离并广泛地迁移。培养的 神经外植块的S-100免疫标记表明许多施旺细胞丧失了其伸长的形态和与 轴突的紧密结合——典型的损伤反应，如图18B所示。正如所预期的那样， 当与循环系统分离后，神经外植块中的巨噬细胞的数目比在体内神经变性 中观察到的低得多。此外，在神经束内极少发现巨噬细胞，并且几乎所有 OX42标记的细胞都限于神经外膜，如图18D所示。显然在神经切断时存 在于神经外膜区室中的巨噬细胞在培养期间不侵入内部神经区室。从而， 体外神经外植块成为这样的神经变性模型，其中施旺细胞的贡献可以独立 于侵入的巨噬细胞而被评估。

通过神经丝的免疫标记检测了培养的神经外植块中的轴突变性。结果 示于图19A-19D。与正常神经中观察到的连续神经丝染色不—样，如图19A 所示，培养2天的神经段中的神经丝被片断化并且不规则，如图19B所示。 与体内轴突变性相似，培养的神经既含有环状的又含有浓缩的神经丝，表 明细胞骨架的瓦解和轴突的变性。轴突变性在用甲苯胺蓝着色的半薄切片 中尤为明显，它显示了残留髓鞘内的空洞或者密集的小球，如图19D所示。 培养2天的神经中观察到的变性变化是体内看到的初期沃勒氏变性的记忆 (由Stoll和Muller综述，1999，Brain Pathol 9：313-325)。在培养的神经中 也观察到二期沃勒氏变性的主要特征，包括髓鞘形态变化和由施旺细胞引 起的髓鞘质外突以及施旺细胞增生，如图19D所示。不过，导致进一步的 髓鞘质变性(瓦解和浓缩)以及吞噬作用清除的变性过程在2天的神经外植 块培养物中没有发生。虽然存在实质上的变性改变，但基膜脚手架保持结 构完整，并且重塑通过施旺细胞高水平的层粘连蛋白表达得以证实，如图 19C所示。

实施例18-培养的神经作为无细胞居间移植物

本实验通过无细胞神经同种异体移植物测验体外预变性改善神经再生 的假说。宿主大鼠接受双侧无细胞神经移植物，一侧为正常(未变性的) 而一侧为体外预变性的(在2％血清中培养2天)。8天后通过评定横切面 中的GAP-43免疫阳性分布评估轴突再生。轴突生长在所有移植物中均观 察到，并且是集中分布的，表明近侧宿主神经和移植物之间良好的对接和 接合，如图20A和20B所示。在6/6的动物中，穿过近侧神经-移植物接合 处并进入移植物的轴突数目在体外预变性移植物中比在对侧对照移植物中 多。平均起来，体外预变性移植物内的轴突的数值大两倍，如图20B所示。 在两种移植物条件下，轴突生长发生在基膜管内，并且伴随着宿主来源的 施旺细胞。这些发现证明轴突再生进入无细胞神经移植物通过体外预变性 增强。

变性可以提高切除的周围神经和衍生的神经移植物的生长促进特性。 本实验利用神经外植块培养模型研究MMPs在这个变性过程中的作用。同 时，由于体内神经预变性对于制备人同种异体移植物是不可行的，故检测 了体外预变性的神经移植物的属性。本实验的结果支持以下结论：首先， 早期沃勒氏变性发生在周围神经外植块的短期培养中，虽然不存在造血巨 噬细胞。通过体外变性可以显著提高神经段的神经突促进活性，并且比体 内预变性的神经引起更大程度的提高。由体外变性导致的神经突促进活性 的提高归功于施旺细胞增强的MMP-2表达和MMP-2的活化。最后，体 外预变性增强轴突再生进入无细胞居间神经移植物。

这个周围神经体外变性的实验发现MMP-9以痕量存在，并主要地与 少量的局限于神经外膜鞘的细胞群有关。MMP-9免疫标记基本上在培养神 经的神经内膜区室内不存在。相反，MMP-2，特别是其活性形式，在培养 神经的神经内膜内迅速升高。将免疫定位和原位酶谱数据综合起来考虑， 实验数据得出结论，即MMP-2由施旺细胞表达，并且在体外神经变性期 间活性酶被释放到周围的神经内膜中。

与目前的神经外植块观察资料结合，这些实验数据证明MMP-2提供 了如果不是主要的也是充分的用于增强切除的神经(和预变性的神经移植 物)的生长促进特性的变性机制。

根据本发明，利用支持细胞存活和生长的条件培养神经外植块可以允 许细胞介导的变性，并显著增强神经移植物的再生潜力。神经外植块可以 被冷冻杀死并冷冻贮藏，以后用作为居间神经移植物。冷冻杀死的神经移 植物事实上消除了移植物免疫排斥的顾虑。鉴于这个原因，无细胞神经移 植物比有细胞神经移植物在不实施免疫抑制的同种异体移植中具有更好的 临床应用潜力。

应当理解本文所描述的实施例和实施方式仅仅是用于举例说明的目 的，而且根据它们的各种修饰或改变将会是本领域熟练技术人员能够想到 的，因而应当包括在本申请的精神和范围之内。

本发明是在国立健康研究院(National Institutes of Health)资金 No.R01 NS37901资助的研究项目下由政府资助完成的。政府在这个发明中 享有某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2001年8月13日递交的临时专利申请序列号 No.60/311,870的权益，兹将其全文并入作为参考，包括所有的插图、表格 和附图。