技术领域
[0001] 本
发明属于食品
质量监测领域，具体涉及一种微生物型时间-温度指示卡及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 保质期问题是
食品安全中的一个重要方面，我国的
食品标签制度以时间为
基础。对于低温食品来说，由于冷链运输过程中，存在实际温度可能偏离预定温度的现象，因此会影响食品的质量和安全，再加上其他因素的干扰，很难推测出食品的
货架期。而仅通过生产厂家在
食品包装上标注的生产日期和保质期来简单判断食品质量是否合格，存在一定的
缺陷。为了监测这一现象的发生，时间-温度指示卡应运而生。
[0003] 时间-温度指示卡(Time-temperature Indicator，TTI)是一种结构简单、成本低、食品质量不会污染产品的非
电子式标签，通过它可以反映出产品出厂后所经历的时间和温度历程，从而能方便观测到不同于公开货架期的产品质量状况。时间-温度指示卡是根据时间、温度的变化使指示剂发生物理或化学反应，从而使指示剂发生机械形变或
颜色变化的原理研制的，具有一定的时间、温度的累积记忆效应，其反应的特点是不可逆。TTI根据工作原理不同，可分为机械型、化学型、扩散型、酶型、微生物型、聚合型和电子型等。
[0004] 食品的腐败变质主要是由于微生物的繁殖造成的，微生物型时间-温度指示卡中微生物作为反应体系的一部分，反映了菌的生长和代谢，能够直接反应微生物造成的食品腐败。在实际冷链过程中，冷链温度可能存在
波动，
现有技术中还没有一种微生物型时间-温度指示卡能够监测冷链过程中(变温条件下)食品的质量变化情况。
发明内容
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出一种微生物型时间-温度指示卡及其制备方法和应用。具体技术方案如下：
[0006] 一种微生物型时间-温度指示卡，包括反应体系
混合液、
滤纸、
真空包装袋和颜色参照比色卡；
[0007] 所述反应体系混合液包括非致病菌菌液、pH指示剂和培养基；
[0008] 所述非致病菌菌液为
植物乳杆菌菌液，其浓度为7.5×107-1.69×108CFU/ml；
[0009] 所述pH指示剂为溴甲酚紫指示剂；
[0010] 所述培养基为MRS肉汤培养基。
[0011] 所述溴甲酚紫指示剂为质量浓度0.2％的溴甲酚紫
乙醇溶液。
[0012] 所述MRS肉汤培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L，
牛肉粉8.0g/L，
酵母粉4.0g/L，
葡萄糖20.0g/L，
碳酸氢二
钾2.0g/L，
柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，
硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
[0013] 所述反应体系混合液中非致病菌菌液、pH指示剂和培养基的体积比为2:1:4。
[0014] 所述非致病菌菌液为植物乳杆菌菌液，其浓度为1.2×108CFU/ml。
[0015] 所述真空包装袋为透明真空包装袋。
[0016] 所述微生物型时间-温度指示卡的制备方法，包括如下步骤：
[0017] (1)将滤纸放入食品真空包装袋中，并灭菌；
[0018] (2)植物乳杆菌菌液、溴甲酚紫指示剂和MRS肉汤培养基按照体积比2:1:4混合均匀，制得反应体系混合液；
[0019] (3)在超净台内，用移液器将反应体系混合液灌入真空包装袋中，使混合液均匀分布在滤纸上，然后
真空包装机密封；
[0020] (4)将颜色参照比色卡置于真空包装袋上，最后将两者压制塑封。
[0021] 所述微生物型时间-温度指示卡在监测恒温或变温条件下冷鲜食品质量中的应用。
[0022] 所述食品为冷鲜鸡胸肉。
[0023] 所述指示卡颜色变为黄绿色表示产品超过了可食用的标准。
[0024] 本发明的有益效果为：本发明的微生物型时间-温度指示卡制作方法简单，体积小巧，成本低，指示准确且重复性好，指示颜色(紫色-黄绿色)易于观察；该指示卡颜色变化时间与冷鲜肉在低温的恒温贮藏和变温贮藏条件下肉质腐败变质时间较为一致，将指示卡粘贴到冷鲜肉产品的包装上，与冷鲜肉产品一同经历时间-温度的变化，能较准确地指示冷鲜肉产品的质量变化。
附图说明
[0025] 图1是本发明微生物型时间-温度指示卡的外观示意图；
[0026] 图2是本发明微生物型时间-温度指示卡的结构示意图；
[0027] 其中，1-不干胶底层，2-滤纸反应区域，3-颜色参照比色卡，4-真空包装袋。
[0028] 图3是本发明微生物型时间-温度指示卡在恒温贮藏条件下，色差值的变化趋势图。
[0029] 图4是本发明微生物型时间-温度指示卡在变温贮藏条件下，色差值的变化趋势图。
[0030] 图5是本发明微生物型时间-温度指示卡计算活化能的拟合曲线图。
[0031] 图6是冷鲜鸡胸肉在恒温贮藏条件下，菌落总数的变化过程。
[0032] 图7是冷鲜鸡胸肉在变温贮藏条件下，菌落总数的变化过程。
[0033] 图8是冷鲜鸡胸肉计算活化能的拟合曲线图。
[0034] 图9是本发明微生物型时间-温度指示卡重复性实验色差值变化趋势。
具体实施方式
[0035] 以下
实施例便于更好地理解本发明，但不限于此。以下实验方法如无特殊说明均为常规方法，实验
试剂均可通过商业途径获得。
[0036] 实施例1
[0037] 微生物型时间-温度指示卡的制备，包括如下步骤：
[0038] (1)将滤纸剪成直径为4cm的圆形，放入6cm×8cm食品真空包装袋中，并置于高压灭菌锅内121℃灭菌15min。
[0039] (2)活化植物乳杆菌：将植物乳杆菌冻干粉活化三代，取第三代菌液(活菌数为2.50×109CFU/ml)为
种子液，配置菌液浓度为3％的植物乳杆菌菌液(活菌数为7.5×
107CFU/ml)。
[0040] 配置溴甲酚紫酸
碱指示剂，显色范围为5.2(黄色)-6.8(紫色)：用分析天平称取0.2g溴甲酚紫于烧杯中，溶于100ml体积浓度为20％的乙醇溶液中，混匀，静置，用
封口膜密封待用。
[0041] 配制MRS肉汤培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，碳酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，
硫酸镁0.2g/L，硫酸锰
0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
[0042] (3)在超净台内，往装有20mlMRS肉汤培养基的100ml锥形瓶中加入的5ml所述溴甲酚紫指示剂和10ml所述的植物乳杆菌菌液，混匀后用移液器将200μl混合液均匀灌入真空包装袋中，使混合液均匀的分布在指示卡的滤纸上，然后用真空包装机密封。
[0043] (4)将颜色参照比色卡置于真空包装袋上，最后将两者压制塑封，即制得微生物型时间-温度指示卡。
[0044] 实施例2
[0045] 步骤(2)中种子液中活菌数为5.30×109CFU/ml，配置菌液浓度为3％的植物乳杆菌菌液(活菌数为1.69×108CFU/ml)，其他步骤同实施例1，制备微生物型时间-温度指示卡。
[0046] 实施例3
[0047] 步骤(2)中种子液中活菌数为4.0×109CFU/ml，配置菌液浓度为3％的植物乳杆菌菌液(活菌数为1.2×108CFU/ml)，其他步骤同实施例1，制备微生物型时间-温度指示卡。
[0048] 实施例1-3制备的微生物型时间-温度指示卡的外观示意图如1，指示卡中间反应区域由滤纸和反应体系混合液构成，指示颜色的变化，外围是颜色参照比色卡。一旦反应区域的颜色变为黄绿色，即表示产品已经超过可食用的标准。
[0049] 图2表示指示卡的结构示意图。指示卡的表层是透明的塑料
薄膜，可以观察反应区域颜色变化。底层是不干胶层，借助不干胶的粘性，可以将指示卡粘贴在
食品包装上。反应区域是由
吸附反应体系混合液的滤纸构成，将其放置在底层之上。颜色参照比色卡是放置在真空包装袋上。最终将各部分整合，压制塑封成指示卡。指示卡的大小尺寸可以根据实际包装需要进行调节。
[0050] 实施例4
[0051] 以TP2变温模型条件(4℃24h，25℃4h，4℃24h，25℃4h，4℃24h，4℃24h)模拟实际冷链中可能存在的温度波动情况。恒温条件为4℃、10℃和30℃。
[0052] 将按实施例1制备的微生物型时间-温度指示卡放置于恒温和变温条件下，每隔一段时间，用色差仪测定指示卡的色差ΔE，每个指示卡平行测定三次，并用相机在相同
位置和光线条件下对指示卡的颜色进行记录。得到恒温条件下，色差值的变化趋势图如图3，在恒温条件下，色差值随着时间的推移逐渐降低，而贮藏温度越高，色差值变化速度越快；变温条件下，色差值的变化趋势图如图4，在变温过程中，随时间的变化，色差值逐渐降低，温度越高，色差值的变化速度越快。
[0053] 微生物型时间-温度指示卡的原理是利用微生物的代谢反应，贮藏温度越高，越接近最适生长温度，微生物的代谢越快，产酸越快，颜色变化就越快。在恒温贮藏条件下，指示卡变化到相同的颜色时，贮藏温度越高，所需要的时间越短，4℃恒温条件下指示卡96h变为黄绿色；10℃恒温条件下指示卡48h变为黄绿色；30℃恒温条件下指示卡6h变为黄绿色。在变温模式下，指示卡56h变为黄绿色，56h至128h之间色差值趋于稳定，颜色也不再改变。
[0054] 同样，将冷鲜鸡胸肉也放置于相同的恒温(4℃、10℃和30℃)或变温条件(4℃24h，25℃4h，4℃24h，25℃4h，4℃24h，4℃24h)下，通过变温条件，模拟实际冷链运输过程中可能存在的温度过程。每隔一段时间，记录冷鲜鸡胸肉的菌落总数。菌落总数采用平板菌落计数法计数。
[0055] 以指示卡的色差值或冷鲜鸡胸肉的菌落总数分别作为响应值，拟合得到反应速率k，以lnk对1/T作图，两者若存在线性关系，则说明不同温度条件下的反应速率k符合Arrhenius公式，可以利用Arrhenius计算得出指示卡的活化能Ea和指前因子。微生物反应中温度对反应速率的影响遵循Arrhenius公式：
[0056]
[0057] 式中：
[0058] k-反应速率常数；
[0059] k0-指前因子，对
指定反应是一个常数；
[0060] R-摩尔气体常数，在法定计量单位中R＝8.314J/(mol·K)；
[0062] Ea-活化能。
[0063] 图5是微生物型时间-温度指示卡计算活化能的拟合曲线图。以色差值为响应值，2
得到不同温度条件下的反应速率，由lnk值与1/T，做关系曲线。拟合直线的相关系数R 为
0.9863，说明两者的相关性显著。由Arrhenius公式可计算出指示卡活化能Ea＝74.59kJ/mol，指前因子k06＝1.51×1013h-1。
[0064] 图8是冷鲜鸡胸肉计算活化能的拟合曲线图。在不同温度条件下，以菌落总数为响应值，由lnk值与1/T，做关系曲线。可以看出，随温度的升高，反应速率越快，菌落总数与时间存在一定的线性关系。拟合直线的相关系数R2为0.98414，说明两者的相关性显著。由Arrhenius公式可计算出冷鲜鸡胸肉活化能Ea＝60.10kJ/mol，指前因子k06＝5.46×109h-1。
[0065] GB16869-2005《鲜、冻禽产品》微生物卫生标准规定：鲜禽产品一级新鲜度的菌落总数≦1×106CFU/g。图6是冷鲜鸡胸肉在恒温贮藏条件下，菌落总数的变化过程。在不同温度恒温贮藏条件下，冷鲜鸡胸肉菌落总数的变化，从图中可以看出，随着时间的延长，菌落总数逐步升高。贮藏温度越高，菌落总数增长速率越快。在4℃贮藏条件下，冷鲜鸡胸肉菌落总数在80h左右达到1×106CFU/g，而10℃和30℃条件下的菌落总数分别在50h左右和10h左右达到1×106CFU/g。
[0066] 图7是冷鲜鸡胸肉在变温贮藏条件下，菌落总数的变化过程。在变温贮藏条件下，冷鲜鸡胸肉菌落总数的变化，从图中可以看出，随着时间的延长，菌落总数逐步升高。贮藏温度为25℃时，菌落总数的增长速度明显高于4℃的增长速度。在TP2变温模型条件下，冷鲜鸡胸肉菌落总数在60h左右达到1×106CFU/g。
[0067] 指示卡的活化能与冷鲜鸡胸肉的活化能之差小于25kJ/mol，且微生物型时间-温度指示卡颜色变化时间与冷鲜肉在低温的恒温贮藏和变温贮藏条件下肉腐败变质时间(菌落总数变化过程)较为一致。在4℃恒温条件下，指示卡指示时间和冷鲜鸡胸肉腐败时间误差为6.67％；在上述变温条件下，与冷鲜鸡胸肉腐败时间的误差为6.67％。
[0068] 图9表示在4℃条件下，TTI6指示卡重复实验三次的色差ΔE的变化情况。从图中可以看出，同一指示卡的变化趋势一致，随着放置时间的延长ΔE逐渐降低。微生物型时间-温度指示卡重复性实验，指示卡由紫色变为土黄色，不同批次TTI6指示卡的颜色变化一致，在肉眼可见范围内，没有明显差异。说明微生物型时间-温度指示卡应用具有良好的重现性。
