聚阳离子包合物，其制备方法及用途
阅读：1025发布：2020-09-14
专利汇可以提供聚阳离子包合物，其制备方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种聚甲基 丙烯酸 二异丙 氨 基乙酯修饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩 水 甘油酯修饰金刚烷两嵌段主客体聚阳离子包合物，及其合成方法，及由上述聚阳离子包合物制备的具有双重酸敏感性的阳离子胶束和制备方法。根据本发明的阳离子胶束具有双重酸敏感性，胶束的亲水外层可在pH为7.4的中性生理条件下结合质子显正电性，胶束的疏水内层可在pH低于6.3的弱酸性环境中结合质子解离。阳离子胶束的平均 流体 力 学 粒径优选为20-200纳米。本发明还涉及将该双重酸敏感性的阳离子胶束用于核酸药物输送的应用，主要用于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。，下面是聚阳离子包合物，其制备方法及用途专利的具体信息内容。
1.一种聚阳离子包合物，其为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷，所述聚阳离子包合物由式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷经主客体络合作用而成，
其中，R1～R7中的任意2～5个为 其余为氢，m为1-100的整数；n
为1-100的整数；a为0-10的整数，
优选地，其中，所述n为5-30的整数；m为1-20的整数；a为0-4的整数。
2.一种用于制备根据权利要求1所述的聚阳离子包合物的中间体，其为式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精，
其中，R1～R7中的任意2～5个为 其余为氢，m为1-100的整数。
3.一种制备根据权利要求1所述的聚阳离子包合物的方法，该方法包括混合式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷以发生络合作用的步骤，
4.一种制备根据权利要求2所述的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤a：β-环糊精引发剂的合成
将β-环糊精与溴代烷基酰溴试剂经酯化反应得到β-环糊精引发剂；
其中，R8～R14中的任意2～5个为 其余为氢；
其中，优选地，2-溴异丁基酰溴与β-环糊精的摩尔比为2:1至5:1；
步骤b：聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的合成
将步骤a中得到的β-环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体混合，在原子转移自由基聚合催化剂配体及催化剂存在下发生聚合得到聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精，其中，R8～R14中为 的基团经上述反应成为
基团，其余的R8～R14为氢，
其中，优选地，β-环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体的摩尔比为1:30至1:200。
5.一种阳离子胶束，所述阳离子胶束包括根据权利要求1所述的聚阳离子包合物，其中，所述阳离子胶束包括胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化亲水外层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层，
优选地，所述阳离子胶束具有双重酸敏感性，胶束的亲水外层可在pH为7.4的中性生理条件下结合质子显正电性，胶束的疏水内层可在pH低于6.3的弱酸性环境中结合质子解离，
优选地，所述阳离子胶束的平均流体力学粒径为20-200纳米，更优选为20-60纳米；
优选地，所述阳离子胶束具有在pH＝4.5-6.0和6.0-9.0两个区间的酸敏感性。
6.一种制备权利要求6所述的阳离子胶束的方法，其特征是：将权利要求1所述的聚阳离子包合物溶解于1-5倍体积酸性缓冲溶液中，将该溶液在超声下滴入10-50体积碱性缓冲液中，经超滤法或透析法纯化后得到阳离子胶束，其中，酸性缓冲液的pH值为
1.0-5.0，碱性缓冲液的pH值为8.0-12.0。
7.一种负载有核酸的阳离子胶束复合物，其包括：根据权利要求6所述的阳离子胶束；
和负载在所述阳离子胶束上的核酸，
优选地，所述核酸选自小干扰核糖核酸(siRNA)和短肝素核糖核酸(shRNA)；
优选地，所负载的核酸药物的重量占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20％。
8.一种制备负载有核酸的阳离子胶束复合物的方法，其包括将阳离子胶束与核酸混合的步骤，
优选地，所述核酸选自小干扰核糖核酸(siRNA)和短肝素核糖核酸(shRNA)；
优选地，所负载的核酸药物的重量占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20％。
9.根据权利要求1所述的聚阳离子包合物在制备用于核酸递送的药物中的用途，优选地，所述核酸选自小干扰核糖核酸(siRNA)和短肝素核糖核酸(shRNA)；
优选地，所述药物用于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。
10.本发明的另一方面是提供一种根据本发明的聚阳离子包合物作为药物载体的用途，
优选地，所述药物载体用在核酸递送中，
优选地，所述核酸为小干扰核糖核酸(siRNA)或短肝素核糖核酸(shRNA)。
聚阳离子包合物，其制备方法及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种聚阳离子包合物，具体涉及一种聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷两嵌段主客体聚阳离子包合物，及其合成方法，及由上述聚阳离子包合物制备的具有双重酸敏感性的阳离子胶束和制备方法。本发明还涉及将该双重酸敏感性的阳离子胶束用于核酸药物输送的应用，主要用于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤(癌症)具有治愈率低、复发率和死亡率双高的特征，已成为威胁人类健康的重大疾病之一。近年来，以癌症分子生物学为基础的核糖核苷酸(RNA)干扰疗法为癌症治疗注入了新的活力。RNA干扰(RNAi)疗法可在分子水平抑制与癌症耐药或转移相关的基因表达，从而逆转癌症耐药或抑制癌症转移。但是，目前，RNAi疗法的主要问题在于，如何将siRNA有效地传递进入靶细胞。目前主要应用的病毒载体能够使携带的siRNA高效的转染进入细胞，但是缺点在于，会对宿主细胞产生免疫反应，甚至产生潜在的致癌性。而应用纳米技术的非病毒载体可提高药物稳定性，增加药物对生物膜的黏附性，提高药物靶向输送能力，控制药物的释放并改变药物途径，已在治疗转移和耐药性癌症方面受到了广泛关注并取得了显著成效，但是其问题在于其转染效率远远低于病毒载体。例如中国专利CN102030898A公开了一种ABC型两亲性可生物降解聚酯三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物可在水中自组装形成球形纳米粒，用于疏水药物和脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸等核酸药物的共输送。中国专利CN1281355A公开了一种基于基因递送的生物可降解性混合聚合胶束，其载体可控制包载基因纳米颗粒的大小和电荷密度，提高了基因递送效率。然而，上述载体缺少对细胞内外不同酸性环境的选择性，当用于核酸药物输送时，难以满足细胞外稳定存在、细胞内快速解 离并释放被包载核酸药物的要求，其应用范围和使用效果都受到了严重限制。因此，当前仍需要不断寻找新的可将基因传递进入细胞的特异性的纳米载体。
发明内容
[0003] 基于以上背景，本发明的一个方面是提供了一种聚阳离子包合物，其为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷，所述聚阳离子包合物由式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷经主客体络合作用而成，
[0004]
[0005] 其中，R1～R7中的任意2～5个为 其余为氢，n为1-100的整数，优选5-30的整数；m为1-100的整数，优选1-20的整数；a为0-10的整数，优选0-4的整数。
[0006] 所述聚阳离子包合物的具体结构尚不完全明确，但是据推断，其可以具有大致如图6所示的由式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷经络合作用形成的如A-B所示的结构。
[0007] 本发明的另一方面涉及制备上述聚阳离子包合物的一种中间体，其为式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精，
[0008]
[0009] 其中，R1～R7中的任意2～5个为 其余为氢，m为1-100的整数，优选1-20的整数。
[0010] 本发明的式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精可以通过对β-环糊精进行修饰得到。
[0011] 本发明的又一方面涉及制备上述聚阳离子包合物的另一种中间体，其为式B所示的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷，
[0012]
[0013] 其中，n为1-100的整数，优选5-30的整数；a为0-10的整数，优选0-4的整数。
[0014] 本发明式B所示的所述胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷可以通过对金刚烷甲醇进行修饰得到。
[0015] 本发明的另一方面是提供一种制备上述聚阳离子包合物的方法，该方法包括混合式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷以发生络合作用的步骤。更具体而言，所述方法可以如下进行：将胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷溶于去离子水中，再加到聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的盐酸溶液中发生络合作用得到目标产物。所述方法还可以进一步包括分离纯化根据本发明的聚阳离子包合物的步骤。所述分离纯化可以采用，例如，超滤、透析等方法进行，但不限于此。例如，可以用去离子水透析24小时后冷冻干燥得到根据本发明的聚阳离子包合物。
[0016] 本发明的另一方面是提供一种制备式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的方法，所述方法包括如下步骤：
[0017] (1)将β-环糊精进行修饰得到适合进行活性聚合的β-环糊精引发剂；
[0018] (2)将上述β-环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体进行活性聚合得到聚甲基二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精。
[0019] 在上述制备式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精的方法中，所述活性聚合的方法没有特殊限制，只要能够得到本发明的目标产物即可，例如，其可以为活性自由基聚合，例如原子转移自由基聚合。
[0020] 在一个优选实施方式中，采用原子转移自由基聚合来合成式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精，具体步骤如下：
[0021] 步骤a：β-环糊精引发剂的合成
[0022]
[0023] 将β-环糊精与溴代烷基酰溴试剂经酯化反应得到β-环糊精引发剂；
[0024] 其中，R8～R14中的任意2～5个为 其余为氢；
[0025] 所述反应可以在有机溶剂和有机碱存在下进行，所述有机溶剂可以为N,N-二甲基乙酰胺，所述有机碱可以为三乙胺。优选地，所述反应步骤为：将β-环糊精溶于N,N-二甲基乙酰胺中以使终浓度为5-20w/v，向溶液中加入无水三乙胺，称取2-溴异丁基酰溴并将其溶于无水二氯甲烷，冰浴下将2-溴异丁基酰溴滴加到β-环糊精溶液中，滴加结束后反应24小时，用乙醚沉淀反应产物并用丙酮冲洗后旋蒸，得到溴封端的β-环糊精引发剂。
[0026] 在上述反应中，三乙胺与β-环糊精的摩尔比＝1:1至5:1，优选2:1。2-溴异丁基酰溴与β-环糊精的摩尔比＝2:1至5:1，优选4:1。
[0027] 步骤b：聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的合成
[0028]
[0029] 将步骤a中得到的β-环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体混合，在原子转移自由基聚合催化剂配体及催化剂存在下发生聚合得到聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精，其中，R8～R14中为 的基团经上述反应成为基团，其余的R8～R14仍为氢。
[0030] 在上述反应中，所述溶剂、原子转移自由基聚合催化剂和催化剂配体可以为本领域中常用的溶剂、催化剂和催化剂配体；其中，β-环糊精引发剂与 甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体的比例为1:30至1:200；且优选地，所述溶剂为体积比＝10:1至1:10的N,N-二甲基乙酰胺-异丙醇混合溶剂；所述催化剂配体为五甲基二乙烯三胺，其用量为β-环糊精大分子引发剂的4倍摩尔比；所述催化剂为溴化亚铜，其用量与催化剂配体等摩尔比；所需反应温度为30-90℃之间的任意温度，优选40-60℃。反应时间为1-24小时。
[0031] 本发明的另一方面是提供一种阳离子胶束，所述阳离子胶束包括根据本发明的聚阳离子包合物，其优选由根据本发明的聚阳离子包合物形成，其中，所述阳离子胶束包括胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化亲水外层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层。
[0032] 所述阳离子胶束具有双重酸敏感性，其亲水外层可在pH为7.4的中性生理条件下结合质子显正电性，胶束的疏水内层可在pH低于6.3的弱酸性环境中结合质子解离。所述阳离子胶束的平均流体力学粒径优选为20-200纳米。
[0033] 本发明的另一方面是提供一种所述阳离子胶束的制备方法，其特征是：将根据本发明的聚阳离子包合物溶解于1-5倍体积酸性缓冲溶液中，将该溶液在超声下滴入10-50体积碱性缓冲液中，经超滤法或透析法纯化后得到所述阳离子胶束溶液，其中，酸性缓冲液的pH值为1.0-5.0，碱性缓冲液的pH值为8.0-12.0。
[0034] 本发明由聚阳离子包合物通过溶液自组装方法制备的阳离子胶束具有核壳结构，包括胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化亲水外层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内层，阳离子胶束的平均流体力学粒径优选为20-200纳米，更优选为20-60纳米。
[0035] 所述阳离子胶束的疏水核层和水化外层具有不同功能，使相应的阳离子胶束具备多功能性。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯经乙二胺或其寡聚物胺基化后带有一级胺和二级胺，该嵌段具有强质子缓冲能力，在中性生理条件下带正电性，可通过静电作用吸附负电性核酸药物。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯嵌段具有酸敏感性(pKa 6.3)，在中性生理条件下具有疏水性，构成阳离子胶束的疏水内核。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯内核在细胞弱酸性环境中解离，快速释放被包载药物。所述阳离子胶束具有在pH＝4.5-6.0和6.0-9.0两个区间的酸敏感性。
[0036] 本发明的又一方面是提供一种负载有核酸的阳离子胶束复合物，其包括：根据本发明的阳离子胶束；和负载在上述阳离子胶束上的核酸药物。
[0037] 在根据本发明的负载有核酸的阳离子胶束复合物中，所负载的核酸的重量优选占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20％。
[0038] 在根据本发明的负载有核酸的阳离子胶束复合物中，所述核酸选自小干扰核糖核酸(siRNA)和短肝素核糖核酸(shRNA)。
[0039] 根据本发明的负载有核酸的阳离子胶束复合物具有双重酸敏感性。
[0040] 本发明的再一方面是提供一种制备负载有核酸的阳离子胶束复合物的方法，其包括将阳离子胶束与核酸混合的步骤。
[0041] 在上述制备负载有核酸的阳离子胶束复合物的方法中，优选将阳离子胶束与核酸以重量比为1-30的比例混合。混合后可以静置一段时间，例如可以在常温下静置大约30分钟，但是不限于此。由此得到负载有核酸药物的具有双重酸敏感性的多层阳离子胶束复合物；其中，所负载的核酸药物的重量优选占所述阳离子胶束复合物重量的1.0-20％。
[0042] 本发明的另一方面是提供一种根据本发明的聚阳离子包合物作为药物载体的用途。优选地，所述药物载体用在核酸递送中。
[0043] 本发明的另一方面是提供一种根据本发明的聚阳离子包合物在制备用于递送核酸的药物中的用途。所述药物可以用于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。
[0044] 所述核酸为小干扰核糖核酸(siRNA)或短肝素核糖核酸(shRNA)。
[0045] 在申请文件中，除非另有说明，所有数值范围包括在其中包含的所有数值以及上下限，并且包括在该数值范围中的所有子范围。例如0-10的整数包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及由这些数值组成的所有子范围。其他数值范围以此类推。
附图说明
附图说明
[0046] 图1为本发明的实施例6中合成的甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的核磁共振氢谱，其中，A为乙二胺胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷， B为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精，以及C为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷包合物聚阳离子。
[0047] 图2为本发明的实施例6中合成的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的酸碱滴定曲线。A为去离子水(H2O)，B为乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷，C为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精，以及D为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物。
[0048] 图3A为本发明所制备的各物质的流体力学直径，且图3B为本发明所制备的各物质的表面电位；其中，a为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的阳离子胶束，b为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-二乙基三胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的阳离子胶束，c为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-三乙烯四胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的阳离子胶束，及d为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-四乙烯五胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的阳离子胶束。
[0049] 图4为本发明的实施例6合成的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的阳离子胶束在不同的聚阳离子与pDNA-GFP的质量比下对核酸结合能力评价的凝胶电泳照片。
[0051] 图6为本发明所述的A-B型聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的结构示意图。
具体实施方式
[0052] 通过以下具体实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例的限定。
[0053] 在本发明中，核磁共振谱图是由Varian-MERCURY Plus-400型核磁共振氢谱仪测量得到的。pH值由Sartorius PB-10型pH计测定，二次去离子水由Advantage A10型纯水仪制备。阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位由MALVERN NANO SIZER型粒径仪测定。凝胶电泳采用上海万达科技器材有限公司的DY-501凝胶电泳仪完成，凝胶照片由BIO RAD Chemi DOCTM MP Imaging System型凝胶成像仪拍摄。
[0054] 本发明的实施例中所用的2-溴异丁基酰溴、氯化亚铜、溴化亚铜、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯和五甲基二乙烯三胺购自西格玛奥德里奇(中国)公司。甲基丙烯酸缩水甘油酯购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。
[0055] siRNA和pDNA序列由上海吉玛生物制药技术公司合成。A549肺癌细胞购自美国ATCC细胞库，细胞培养用DMEM培养基和胎牛血清均购自Gibco公司。
[0056] 在本申请中，如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。
[0057] 实施例1：β-环糊精引发剂的合成
[0058] 称取β-环糊精4.5mmol，在搅拌下溶于30ml的无水N,N-二甲基乙酰胺中，并加入三乙胺22.5mmol。称取2-溴异丁基酰溴22.3mmol溶于10ml无水N,N-二甲基乙酰胺。将2-溴异丁基酰溴溶液缓慢滴加到β-环糊精溶液中，冰浴下搅拌后缓慢升至室温，继续搅拌反应过夜。待反应结束用乙醚沉淀，用丙酮，得4取代β-环糊精引发剂1
3.3g(产率42.4％)。H NMR(CDCl3)：δ＝1.88(24H，-OCO-C(CH3)2Br)，3.00-6.00(66H，-OH和-CH-β-CD)。
3.3g(产率42.4％)。H NMR(CDCl3)：δ＝1.88(24H，-OCO-C(CH3)2Br)，3.00-6.00(66H，-OH和-CH-β-CD)。
[0059] 实施例2：金刚烷引发剂的合成
[0060] 称取金刚烷甲醇3.0g(18.0mmol)溶于50ml二氯甲烷中，再向溶液中加入三乙胺3ml(21.6mmol)。量取2-溴异丁基酰溴2.7ml(21.8mmol)溶于二氯甲烷，冰浴下将其滴加到金刚烷甲醇溶液中。滴加结束后，继续搅拌过 夜，将溶液旋蒸浓缩后，用硅胶色谱柱对产
1
品进行纯化，得到金刚烷引发剂4.6g(产率：81％)。H NMR(CDCl3)：δ＝2.00(3H，CH)，
1.95(6H，CH2)，1.69(6H，-C(CH3)2Br)，1.58(6H，CH2)。
1
品进行纯化，得到金刚烷引发剂4.6g(产率：81％)。H NMR(CDCl3)：δ＝2.00(3H，CH)，
1.95(6H，CH2)，1.69(6H，-C(CH3)2Br)，1.58(6H，CH2)。
[0061] 实施例3：聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的合成
[0062] 取实施例1中合成的β-环糊精引发剂0.3g溶于1.5ml N,N-二甲基乙酰胺中搅拌至溶解，加入1ml甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPMA)和催化剂配体五甲基二乙烯三胺(PMDETA)132μl，在无氧条件下加催化剂溴化亚铜90mg，40℃搅拌反应24小时，过氧化铝1
柱，得到聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精1.14g(产率：83％)。H NMR(DMF)：
δ ＝ 1.88-2.25(44H，-OCO-C(CH3)2-CH2-CCH3Br)，2.74(8H，CH)，3.08(8H，CH2)，3.99(8H，CH2)，3.00-6.00(66H，-OH和-CH-β-CD)。其核磁数据如图1中的B中所示。
柱，得到聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精1.14g(产率：83％)。H NMR(DMF)：
δ ＝ 1.88-2.25(44H，-OCO-C(CH3)2-CH2-CCH3Br)，2.74(8H，CH)，3.08(8H，CH2)，3.99(8H，CH2)，3.00-6.00(66H，-OH和-CH-β-CD)。其核磁数据如图1中的B中所示。
[0063] 实施例4：聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷的合成
[0064] 取实施例2中合成的金刚烷引发剂133mg溶于3ml N,N-二甲基乙酰胺-异丙醇(9:1)的溶液中搅拌至溶解，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GC)3ml，五甲基二乙烯三胺88μl。加入催化剂溴化亚铜60mg，40℃反应15小时，过氧化铝柱，冻干后得聚甲基丙烯酸
1
二异丙氨基乙酯修饰金刚烷810mg(产率：79％)。H NMR(CDCl3)：δ＝4.29；3.78(30H，CH2)，3.22(15H，CH)，2.83；2.62(30H，CH2)，1.07(45H，CH3)。
1
二异丙氨基乙酯修饰金刚烷810mg(产率：79％)。H NMR(CDCl3)：δ＝4.29；3.78(30H，CH2)，3.22(15H，CH)，2.83；2.62(30H，CH2)，1.07(45H，CH3)。
[0065] 实施例5：乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷的合成
[0066] 取实施例4中合成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷(AD-PGC15)100mg溶于2ml N,N-二甲基乙酰胺中。取乙二胺(DEA)1ml溶于2ml N,N-二甲基乙酰胺中。将2ml聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷溶液滴加到乙二胺溶液中。40℃搅拌反应12小时，冷冻干燥得乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷130mg(产率：95％)。其核磁数
1
据如图1中的A中所示。 H NMR(CDCl3)：δ＝1.47-2.12(28H，-OCO-C(CH3)2-CH2-CCH3Br和-CH-AD)，3.27；3.42(2H，CH2)，3.58(4H，CH2)，4.16；4.41(2H，CH2)。
1
据如图1中的A中所示。 H NMR(CDCl3)：δ＝1.47-2.12(28H，-OCO-C(CH3)2-CH2-CCH3Br和-CH-AD)，3.27；3.42(2H，CH2)，3.58(4H，CH2)，4.16；4.41(2H，CH2)。
[0067] 实施例6：聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的合成
[0068] 称取实施例5中合成的乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷330mg(0.1mmol)，溶于5ml去离子水中，涡旋下缓慢滴加到3ml的实施例3中合成的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精200mg(0.05mmol)的1M HCl溶液中，超滤管离心浓缩后冷冻干燥，得到目标产物260mg(产率：72％)。其核磁数据如图1中的C中所示。
[0069] 实施例7：双重酸敏感聚阳离子胶束的制备
[0070] 称取实施例6中合成的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物0.50g(0.1mmol)，溶于5ml体积的1M盐酸溶液中，将该溶液在超声下滴入50ml的0.5M氢氧化钠溶液中，超滤法纯化后定容，得到所述聚阳离子胶束溶液。
[0071] 实施例8：阳离子胶束用于核酸药物输送
[0072] 取实施例7中制备的阳离子胶束水溶液与pDNA-GFP以重量比分别为2.0:1，4.0:1，8:1和16:1的不同比例混合，常温静置30分钟得到包载有质粒DNA的胶束复合物。
A549肺癌细胞铺24孔板，4-5万/孔，孵育24h后使用，每孔为0.5ml DMEM完全培养基。每孔分别加入相同浓度的胶束复合物。细胞转染60h后倒置荧光显微镜检测转染效果。
A549肺癌细胞铺24孔板，4-5万/孔，孵育24h后使用，每孔为0.5ml DMEM完全培养基。每孔分别加入相同浓度的胶束复合物。细胞转染60h后倒置荧光显微镜检测转染效果。
[0073] 实验实施例1：A-B聚阳离子包合物的酸碱滴定试验
[0074] 采用Sartorius PB-10型pH计测定本发明实施例6中合成的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物的酸碱滴定曲线。其结果如图2所示。根据图2可以看出，实施例6中的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子包合物具有在4.5-6.0和6.0-9.0两个pH范围内的质子缓冲能力，证明该聚阳离子具备双重酸敏感性，可以满足载体用于核酸药物输送时细胞外稳定存在、细胞内快速解离并释放被包载核酸药物的要求。
[0075] 实验实施例2：A-B双重酸敏感聚阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位的测定[0076] 按照制造商的手册采用MALVERN NANO SIZER型粒径仪测定了A-B双重酸敏感聚阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位。其结果如图3所示。 根据图3可以看出，本发明制备的双重酸敏感聚阳离子胶束的流体力学粒径和表面电位满足用于核酸药物输送，向靶细胞大量输送药物的要求。
[0077] 实验实施例3：A-B聚阳离子包合物的对核酸结合的凝胶电泳试验
[0078] 采用表达绿色荧光蛋白的质粒脱氧核糖核酸(pDNA-GFP)，以不同的聚阳离子与pDNA-GFP的质量比(分别为4:1、3.5:1、3.0:1、2.5:1、2.0:1、1.0:1和0.5:1)以上海万达科技器材有限公司的DY-501凝胶电泳仪作凝胶电泳试验，并以BIO RAD Chemi DOCTM MP Imaging System型凝胶成像仪获取凝胶照片。其结果如图4所示。根据图4可以看出，本发明所制备的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-乙二胺化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷聚阳离子胶束可在与pDNA质量比＝1.0时完全压缩pRNA，证明其具有良好的核酸结合能力。
[0079] 实验实施例4：包载pDNA-GFP的阳离子胶束转染A549肺癌细胞的表达
[0080] 采用实施例8中包载pDNA-GFP的阳离子胶束转染A549肺癌细胞，然后采用荧光显微镜(OLYMPUS1X81型倒置荧光显微镜)检测绿色荧光蛋白表达情况。其中，阳离子胶束与质粒DNA质量比为8.0，pDNA浓度200ng/孔，转染时间60h。其结果如图5所示。根据图5可以看出，所包载的pDNA-GFP得到了良好的表达，即，采用本发明的载体取得了良好的转染效率。
[0081] 根据以上的实施例和实验实施例的结果可以看出，本发明的A-B聚阳离子包合物及其形成的阳离子胶束具备双重酸敏感性，可以有效地用于输送核酸药物，可以满足载体用于核酸药物输送时细胞外稳定存在、细胞内快速解离并释放被包载核酸药物的要求，而且，其转染效率较通用的Lipofectamin-2000阳离子脂质体转染试剂大大提高，是一种新的相对稳定、特异、安全的基因载体系统，能够有效地用于以RNAi技术治疗癌症的广泛用途中。
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