热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
阅读：590发布：2021-01-13
专利汇可以提供热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供利用可切割的寡核苷酸来扩增、捕获和/或检测靶核酸的组合物和方法。，下面是热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用专利的具体信息内容。
1.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，和(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；
(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物和包含所述封闭部分的片段；以及
(c)在扩增条件下延伸所述可延伸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中包含封闭部分的片段含有可检测特征。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括检测所述可检测特征。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，其中包含封闭部分的片段含有捕获剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，其中第一寡核苷酸的封闭部分不同于第二寡核苷酸的封闭部分。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，其中每种寡核苷酸的封闭部分独立地选自生物素、亲和素、链霉亲和素和可检测标记。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行和/或同时进行。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸中的一种包含5′区，该5′区含有：
(i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，
(ii)第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，该第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和
(iii)可检测特征。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包含用第二内切核酸酶在切割条件下切割所述功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生包含可检测特征的片段。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种片段。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，还包含检测一种或多种片段的一种或多种可检测特征。
12.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述片段含有捕获剂。
13.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其特征在于其中用第二内切核酸酶切割在与(a)、(b)和(c)相同的反应环境中进行和/或与(a)、(b)和(c)同时进行。
14.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，(iii)可检测特征，和
(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；
(b)在切割条件下使核酸组合物与第一内切核酸酶接触，当存在靶核酸时，第一内切核酸酶切割所述功能性第一内切核酸酶切割位点，从而产生并释放含有可检测特征的切割产物；以及
(c)检测上否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)同时进行。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其特征在于，(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种切割产物含有捕获剂。
20.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，(iii)可检测特征，和
(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，
此二种寡核苷酸之一包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分；
(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物；
(c)在扩增条件下延伸所述可延伸引物，从而将第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下转变成功能性第二内切核酸酶切割位点；
(d)用第二内切核酸酶在切割条件下切割该功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生含有可检测特征的切割产物；以及
(e)检测是否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应环境中进行。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)、(c)和(d)同时进行。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其特征在于，(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述切割产物含有捕获剂。
26.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和正向与反向多核苷酸引物接触，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述寡核苷酸包含第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性的第一内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸包含所述寡核苷酸3′端的封闭部分，
(iv)使所述多核苷酸引物之一与所述寡核苷酸5′的靶核酸杂交；
(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生切割产物；以及
(c)在扩增条件下延伸所述多核苷酸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸阻断多核苷酸引物的延伸直至第一功能性切割位点被第一内切核酸酶切割。
28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)同时进行。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种切割产物含有捕获剂。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，还包括检测一种或多种切割产物的可检测特征。
32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种切割产物含有捕获剂。
33.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和
(iv)可检测特征；
(b)在切割条件下使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有可检测特征的寡核苷酸片段；和
(c)检测有无含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而根据检测有无该可检测特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，包括使(a)中的核酸组合物与两种或多种寡核苷酸接触。
35.如权利要求33或34所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)同时进行。
37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其特征在于，(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种寡核苷酸片段。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种所述寡核苷酸片段的一种或多种可检测特征。
39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述寡核苷酸片段含有捕获剂。
40.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性的内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和
(iv)可检测特征；
(b)在切割条件下使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有可检测特征的寡核苷酸片段；
(c)在延伸条件下使核酸组合物与正向和反向引物多核苷酸接触；和
(d)检测是否存在含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而根据检测有无该可检测特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，包括使(a)中的核酸组合物与两种或多种寡核苷酸接触。
42.如权利要求40或41所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)同时进行。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其特征在于，(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种寡核苷酸片段。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种所述寡核苷酸片段的一种或多种可检测特征。
46.如权利要求40-45中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述寡核苷酸片段含有捕获剂。
47.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和引物多核苷酸接触，其中所述寡核苷酸包含：
(i)与所述靶核酸互补的核苷酸亚序列，和
(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分；和
(b)在扩增条件下延伸所述寡核苷酸，从而产生延伸的寡核苷酸，其中引物多核苷酸与该延伸的寡核苷酸杂交并在扩增条件下延伸，从而产生包含功能性第一内切核酸酶切割位点的双链扩增产物，由此扩增靶核酸或其部分。
48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，还包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生双链切割产物。
49.如权利要求47或48所述的方法，其特征在于，所述双链切割产物含有可检测特征。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，还包括检测所述可检测特征。
51.如权利要求49或50所述的方法，其特征在于，所述双链切割产物含有捕获剂。
52.如权利要求47-51中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
53.如权利要求47-52中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)同时进行。
54.如权利要求47所述的方法，其特征在于，还包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生单链切割产物。
55.如权利要求47或54所述的方法，其特征在于，所述单链切割产物含有可检测特征。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，还包括检测所述可检测特征。
57.如权利要求55或56所述的方法，其特征在于，所述单链切割产物含有捕获剂。
58.一种检测核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和引物多核苷酸接触，其中所述寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，和
(iii)可检测特征；以及
(b)使核酸组合物暴露于扩增条件，其中(i)当存在靶核酸时所述寡核苷酸被延伸，和(ii)所述引物多核苷酸与延伸的寡核苷酸杂交并在扩增条件下延伸，从而产生含有功能性第一内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；
(c)将核酸组合物与切割所述第一内切核酸酶切割位点的第一内切核酸酶接触，从而产生含有该可检测特征的切割产物；以及
(d)检测有无含该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行。
60.如权利要求58或59所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)同时进行。
61.如权利要求58-60中任一项所述的方法，其特征在于，(c)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
63.如权利要求58-62中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述切割产物含有捕获剂。
64.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下，提供寡核苷酸和多核苷酸，或提供包含3′部分的寡核苷酸，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
(iii)所述寡核苷酸的3′部分包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，和
(iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点；
(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物寡核苷酸；
(c)使所述核酸组合物与可延伸引物寡核苷酸接触；
(d)在扩增条件下存在引物核酸时延伸所述可延伸引物寡核苷酸，其中
(i)产生延伸的引物寡核苷酸，和(ii)使所述引物核酸与延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，
从而扩增靶核酸或其部分。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于：
所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，和
在扩增条件下产生包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，还包括(e)用第二内切核酸酶切割所述功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生切割产物。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述切割产物是双链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述切割产物是单链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的一条链)。
69.如权利要求66-68中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述切割产物含有捕获剂。
72.如权利要求64-71中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸和多核苷酸包含相同或不同的封闭部分。
73.如权利要求64-72中任一项所述的方法，其中(a)、(b)、(c)和(d)，或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)在同一反应环境中进行。
74.如权利要求64-73中任一项所述的方法，其中(a)、(b)、(c)和(d)，或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)同时进行。
75.如权利要求64-74中任一项所述的方法，其特征在于，所述包括3′部分的寡核苷酸形成茎环结构。
76.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下，提供寡核苷酸和多核苷酸，或提供包括3′部分的寡核苷酸，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
(iii)所述寡核苷酸的3′部分包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，
(iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和捕获多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点，
(v)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的非功能性部分，和
(vi)所述寡核苷酸包含可检测特征；
(b)在切割条件下提供第一内切核酸酶，其中所述第一内切核酸酶切割该第一内切核酸酶切割位点，从而产生可延伸引物寡核苷酸；
(c)使所述核酸组合物与可延伸引物寡核苷酸接触；
(d)使核酸组合物接触扩增条件和引物核酸，其中：(i)当存在靶核酸时，所述可延伸的引物寡核苷酸被延伸，从而产生延伸的引物寡核苷酸，和(ii)所述引物核酸与该延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而产生包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；
(e)使核酸组合物在切割条件下与第二内切核酸酶接触，其中所述第二内切核酸酶切割包含第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物，从而产生含有该可检测特征的切割产物；和
(f)检测是否存在含该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无含该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)在同一反应环境中进行。
78.如权利要求76或77所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)同时进行。
79.如权利要求76-78中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割产物是双链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。
80.如权利要求76-79中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割产物是单链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的一条链)。
81.如权利要求76-80中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
82.如权利要求76-81中任一项所述的方法，其特征在于，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
83.如权利要求76-82中任一项所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述切割产物含有捕获剂。
84.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸包含：
(i)所述寡核苷酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，
(ii)所述寡核苷酸的3′末端含有封闭部分，和
(iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，
(iv)内部5′区和内部3′区与靶核酸不互补，
(v)内部5′区与内部3′区基本互补并在末端5′区和末端3′区与靶序列杂交时能彼此杂交形成内部茎环结构，
(vi)当末端5′区和末端3′区不与靶序列杂交时，内部5′区与内部3′区不彼此杂交，和
(vii)所述茎环结构包含内切核酸酶切割位点；
(b)使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，若核酸组合物中存在靶核酸则产生茎环结构切割产物；以及
(c)检测有无该切割产物，从而根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。
85.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述切割产物含有可检测特征。
86.如权利要求84或85所述的方法，其特征在于，所述切割产物含有捕获剂。
87.如权利要求84-86中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
88.如权利要求84-87中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)同时进行。
89.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在杂交条件下使核酸组合物与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸接触，其中：
(i)所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各包含5′区、3′区和3′末端的封闭部分，(ii)所述第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区段与靶核酸基本互补并能与其杂交，
(iii)所述第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，(iv)所述第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸杂交时，它们彼此杂交形成茎结构，(v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区不与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区彼此不杂交，和
(vi)所述茎结构包含内切核酸酶切割位点；
(b)使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，若核酸组合物中存在靶核酸则产生茎结构切割产物；以及
(c)检测有无该切割产物，从而根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。
90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述切割产物含有可检测特征。
91.如权利要求89或90所述的方法，其特征在于，所述切割产物含有捕获剂。
92.如权利要求89-91中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
93.如权利要求89-92中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)同时进行。
94.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获剂选自生物素、亲和素和链霉亲和素。
95.如权利要求1-94中任一项所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶是热稳定性内切酶。
96.如权利要求95所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶在扩增条件下其最大活性损失低于约50％。
97.如权利要求1-96中任一项所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶切割位点包含脱碱基位点。
98.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶是AP内切核酸酶。
99.如权利要求1-96中任一项所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶是限制性内切核酸酶。
100.如权利要求99所述的方法，其中，所述限制性内切核酸酶具有双链切割活性。
101.如权利要求99所述的方法，其特征在于，所述限制性内切核酸酶具有单链切割活性(例如切口酶)。
102.如权利要求1-101中任一项所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶切割DNA。
103.如权利要求1-101中任一项所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶不切割RNA。
104.如权利要求1-103中任一项所述的方法，其特征在于，所述内切核酸酶不是RNA酶。
105.如权利要求1-104中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含一个或多个脱碱基位点。
106.如权利要求1-105中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含一个或多个不可切割的碱基。
107.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述一个或多个不可切割碱基位于一个切割位点内，所述限制性内切核酸酶具有双链切割活性，并且所述限制性内切核酸酶仅切割这种切割位点的一条链。
108.如权利要求1-107中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测特征选自：质量、长度、核苷酸序列、光学性质、电学性质、磁学性质、化学性质和通过基质开口的时间或速度。
109.如权利要求1-107中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测特征是质量。
110.如权利要求109所述的方法，其特征在于，所述质量用质谱法检测。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述质谱法选自：基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)、激光解吸质谱(LDMS)、电喷雾(ES)质谱、离子回旋共振(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。
112.如权利要求110所述的方法，其特征在于，所述质谱包括使核酸离子化并挥发。
113.如权利要求1-112中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测特征是可检测标记测得的信号。
114.如权利要求113所述的方法，其特征在于，所述信号选自：荧光、发光、紫外光、红外光、可见波长光、光散射、偏振光、辐射和同位素辐射。
115.如权利要求1-46，64-75和84-114中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭部分是选自以下的3′末端部分：磷酸、氨基、巯基、乙酰基、生物素、胆固醇、四乙二醇(TEG)、生物素-TEG、胆固醇-TEG、一个或多个反向核苷酸、反向脱氧腺苷、地高辛和1，3-丙二醇(C3间隔子)。
116.如权利要求1-46、64-75和84-115中任一项所述的方法，其特征在于，所述茎环结构中的环包含核苷酸。
117.如权利要求1-46、64-75和84-116中任一项所述的方法，其特征在于，所述茎环结构中的环包含非核苷酸接头。
118.如权利要求1-46、64-75和84-117中任一项所述的方法，其特征在于，所述茎环结构中的环是部分单链。
119.如权利要求1-46、64-75和84-118中任一项所述的方法，其特征在于，所述茎环结构中的茎是双链。
120.如权利要求1-46、64-75和84-119中任一项所述的方法，其特征在于，所述茎环结构或茎结构包含一对信号分子的一个或两个成员，其中所述信号分子对成员被内切核酸酶切割位点隔开。
121.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述信号分子对成员是荧光团和淬灭分子。
122.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述信号分子对成员是适合荧光共振能量转移(FRET)的荧光团分子。
123.如权利要求1-13、20-25和64-75中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一内切核酸酶与第二内切核酸酶不相同。
124.如权利要求1-13、20-32和40-83中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增和/或延伸条件包括核酸聚合酶。
125.如权利要求1-13、20-32、40-83和124中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增条件包括具有链置换活性的聚合酶。
126.如权利要求124或125所述的方法，其特征在于，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
127.如权利要求124或125所述的方法，其特征在于，所述核酸聚合酶是RNA聚合酶。
128.如权利要求126所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是跨损伤合成聚合酶。
129.如权利要求128所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶。
130.如权利要求129所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是硫化叶菌DNA聚合酶IV。
131.如权利要求128所述的方法，其特征在于，所述聚合酶能跨越一处或多处DNA模板损伤合成DNA。
132.如权利要求131所述的方法，其特征在于，所述一处或多处损伤是一个或多个脱碱基位点。
133.如权利要求124-132所述的方法，其特征在于，所述聚合酶选自：Taq DNA聚合酶；
TM TM TM TM
Q-Bio Taq DNA聚合酶；SurePrime 聚合酶；Arrow Taq DNA聚合酶；JumpStart Taq ；
o TM TM
9N m DNA聚合酶；Deep VentR (无外切活性)DNA聚合酶；Tth DNA聚合酶；抗体介导的聚合酶；用于热稳定性扩增的聚合酶；天然和/或改良的RNA聚合酶及其功能片段，天然和/或改良的DNA聚合酶及其功能片段等，和它们的组合。
134.一种包含封闭寡核苷酸的物质组合物，所述封闭寡核苷酸包含：
(i)非末端脱碱基位点，
(ii)3′末端的封闭部分，和
(iii)可检测特征。
135.一种包含两种寡核苷酸的物质组合物，其中每种寡核苷酸包含：
(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时，第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性的第一内切核酸酶切割位点，和(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；
136.如权利要求135所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸之一包含5′区，该5’区包含：
(i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，
(ii)第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，在扩增条件下第二内切核酸酶切割位点的该无功能性部分转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和
(iii)可检测特征。
137.一种包含彼此杂交的寡核苷酸和多核苷酸的物质组合物，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列杂交的多核苷酸亚序列，和
(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点。
138.如权利要求137所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
139.一种包含彼此杂交的寡核苷酸和多核苷酸的物质组合物，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点，和
(iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分。
140.如权利要求139所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
141.一种包含寡核苷酸的物质组合物，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述多核苷酸包含3′部分，该3′部分含有一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列杂交的多核苷酸亚序列，从而形成茎环结构，和(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点。
142.如权利要求141所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸包含3′末端的封闭部分。
143.一种包含寡核苷酸的物质组合物，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
(ii)所述多核苷酸包含3′部分，该3′部分含有一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，从而形成茎环结构，(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点，和
(iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分。
144.如权利要求143所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸包含3′末端的封闭部分。
145.一种包含寡核苷酸的物质组合物，其中：
(i)所述寡核苷酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，
(ii)所述寡核苷酸包含3′末端的封闭部分，和
(iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，
(iv)所述内部5′区和内部3′区靶核酸不互补，
(v)内部5′区与内部3′区基本互补，当末端5′区和末端3′区与靶核酸杂交时，内部5′区与内部3′区彼此杂交形成内部茎环结构，
(vi)当末端5′区和末端3′区与靶核酸不杂交时，内部5′区与内部3′区彼此不杂交，和
(vii)所述茎环结构包含内切核酸酶切割位点。
146.一种包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的物质组合物，其中：
(i)所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各含有5′区、3′区和3′末端的封闭部分，(ii)所述第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，
(iii)所述第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，(iv)所述第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区可彼此杂交形成茎结构，
(v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸不杂交时，第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区彼此不杂交，和
(vi)所述茎结构包含内切核酸酶切割位点。
热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
[0002] 本申请要求2009年3月18日提交的美国临时专利申请第61/161,385号的权益，该申请名为USE OF THERMOSTABLE ENDONUCLEASES FOR GENERATING REPORTER
MOLECULES(《热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用》)，发明人为M.A.罗伊和
P.A.厄斯，代理人案卷编号为SEQ-6025-PV。上述专利申请的全部内容通过引用纳入本文，
包括但不限于所有文字、表格和附图。
MOLECULES(《热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用》)，发明人为M.A.罗伊和
P.A.厄斯，代理人案卷编号为SEQ-6025-PV。上述专利申请的全部内容通过引用纳入本文，
包括但不限于所有文字、表格和附图。
技术领域
[0003] 本发明的技术部分涉及扩增和/或检测核酸的组合物与方法。
背景技术
[0004] 核酸扩增已广泛应用于许多实验技术和临床或诊断过程中。由于增加了多重反应和人工或自动化高通量技术和设备，现已能够快速扩增与检测大量的靶核酸序列，例如，基
于微阵列的基因分型或全基因组测序。
于微阵列的基因分型或全基因组测序。
[0005] 热循环或等温过程扩增核酸的方法能快速、特异性扩增靶核酸。称为“非目标扩增产物(amplification artifact)”的不良扩增产物可是由于聚合酶延伸了不恰当退火的核
酸而产生，例如当反应容器内的温度升高而聚合酶活性增强时。对反应技术与条件(例如
热启动PCR技术)的改进已使非目标扩增产物(例如，“引物二聚体”或扩增寡核苷酸的不
正确或非特异性退火)减至最低。热启动扩增技术通常包括分隔或抑制反应组分直至达到
确定的温度，然后使之接触、混合并激活组分，和延伸与特定靶核酸退火的寡核苷酸。
酸而产生，例如当反应容器内的温度升高而聚合酶活性增强时。对反应技术与条件(例如
热启动PCR技术)的改进已使非目标扩增产物(例如，“引物二聚体”或扩增寡核苷酸的不
正确或非特异性退火)减至最低。热启动扩增技术通常包括分隔或抑制反应组分直至达到
确定的温度，然后使之接触、混合并激活组分，和延伸与特定靶核酸退火的寡核苷酸。
[0006] 发明概述
[0007] 在一些实施方式中，提供扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：(i)与
靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所
述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性第一内
切核酸酶切割位点，和(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；(b)用第一内切核酸酶在
切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物和包含所述封闭部分的片
段；以及(c)在扩增条件下延伸所述可延伸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所
述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性第一内
切核酸酶切割位点，和(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；(b)用第一内切核酸酶在
切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物和包含所述封闭部分的片
段；以及(c)在扩增条件下延伸所述可延伸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
[0008] 在一些实施方式中，包含所述封闭部分的片段可含有可检测特征。在某些实施方式中，所述方法可进一步包括检测这种可检测特征。在一些实施方式中，包含所述封闭部分
的片段可含有捕获剂。在一些实施方式中，第一种寡核苷酸的封闭部分可不同于第二种寡
核苷酸的封闭部分。在某些实施方式中，每种寡核苷酸的封闭部分可独立地选自生物素、亲
和素、链霉亲和素和可检测标记。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)和(c)可在同一反应环
境中进行和/或同时进行。
的片段可含有捕获剂。在一些实施方式中，第一种寡核苷酸的封闭部分可不同于第二种寡
核苷酸的封闭部分。在某些实施方式中，每种寡核苷酸的封闭部分可独立地选自生物素、亲
和素、链霉亲和素和可检测标记。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)和(c)可在同一反应环
境中进行和/或同时进行。
[0009] 在某些实施方式中，所述寡核苷酸之一包含5′区，该5′区可包含：(i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，(ii)第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，该第二内切核
酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下可转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和
(iii)可检测特征。在一些实施方式中，用第二内切核酸酶在切割条件下切割所述功能性第
二内切核酸酶切割位点，从而产生包含可检测特征的片段。在某些实施方式中，所述切割能
产生含有可区分的可检测特征的2种或多种片段。在一些实施方式中，所述方法还包括检
测一种或多种所述片段的一种或多种可检测特征。在某些实施方式中，一种或多种所述片
段可含有捕获剂。在一些实施方式中，用第二内切核酸酶切割可在与(a)、(b)和(c)相同
的反应环境中进行和/或与(a)、(b)和(c)同时进行。
酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下可转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和
(iii)可检测特征。在一些实施方式中，用第二内切核酸酶在切割条件下切割所述功能性第
二内切核酸酶切割位点，从而产生包含可检测特征的片段。在某些实施方式中，所述切割能
产生含有可区分的可检测特征的2种或多种片段。在一些实施方式中，所述方法还包括检
测一种或多种所述片段的一种或多种可检测特征。在某些实施方式中，一种或多种所述片
段可含有捕获剂。在一些实施方式中，用第二内切核酸酶切割可在与(a)、(b)和(c)相同
的反应环境中进行和/或与(a)、(b)和(c)同时进行。
[0010] 在某些实施方式中，也提供检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸可包含：(i)与靶核
酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡
核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性第一内切核
酸酶切割位点，(iii)可检测特征，和(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；(b)在切割
条件下使核酸组合物与第一内切核酸酶接触，当存在靶核酸时，第一内切核酸酶切割所述
功能性第一内切核酸酶切割位点，从而产生并释放含有所述可检测特征的切割产物；以及
(c)检测是否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无含有该可检测特征的
切割产物确定有无靶核酸。
酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡
核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性第一内切核
酸酶切割位点，(iii)可检测特征，和(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；(b)在切割
条件下使核酸组合物与第一内切核酸酶接触，当存在靶核酸时，第一内切核酸酶切割所述
功能性第一内切核酸酶切割位点，从而产生并释放含有所述可检测特征的切割产物；以及
(c)检测是否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无含有该可检测特征的
切割产物确定有无靶核酸。
[0011] 在一些实施方式中，步骤(a)和(b)在同一反应环境中进行。在某些实施方式中，步骤(a)和(b)可同时进行。在一些实施方式中，(b)中的切割可产生含有可区分的可检
测特征的2种或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一种或多种所述切割产物的一
种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切割产物可含有捕获剂。
测特征的2种或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一种或多种所述切割产物的一
种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切割产物可含有捕获剂。
[0012] 在某些实施方式中，还提供检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：(i)与靶核酸
互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核
苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶
切割位点，(iii)可检测特征，和(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，此二种寡核苷酸之
一包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分；(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切
割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物；(c)在扩增条件下延伸该可延伸引物，
从而将第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下转变成功能性第二内切核
酸酶切割位点；(d)用第二内切核酸酶在切割条件下切割该功能性第二内切核酸酶切割位
点，从而产生含有该可检测特征的切割产物；以及(e)检测是否存在含有该可检测特征的
切割产物，从而根据检测有无含有该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核
苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶
切割位点，(iii)可检测特征，和(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，此二种寡核苷酸之
一包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分；(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切
割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物；(c)在扩增条件下延伸该可延伸引物，
从而将第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下转变成功能性第二内切核
酸酶切割位点；(d)用第二内切核酸酶在切割条件下切割该功能性第二内切核酸酶切割位
点，从而产生含有该可检测特征的切割产物；以及(e)检测是否存在含有该可检测特征的
切割产物，从而根据检测有无含有该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
[0013] 在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在某些实施方式中，(b)中的切割可产生含有可区分的可检测特征
的2种或多种切割产物。在一些实施方式中，可检测一种或多种所述切割产物的一种或多
种可检测特征。在某些实施方式中，一种或多种所述切割产物可含有捕获剂。
的2种或多种切割产物。在一些实施方式中，可检测一种或多种所述切割产物的一种或多
种可检测特征。在某些实施方式中，一种或多种所述切割产物可含有捕获剂。
[0014] 在某些实施方式中，提供扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和正向与反向多核苷酸引物接触，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述寡核苷酸包含第一内切核
酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶
切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，(iii)所述寡核苷酸包含此种
寡核苷酸3′端的封闭部分，(iv)使所述多核苷酸引物之一与所述寡核苷酸5′的靶核酸
杂交；(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生切割
产物；以及(c)在扩增条件下延伸所述多核苷酸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述寡核苷酸包含第一内切核
酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶
切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，(iii)所述寡核苷酸包含此种
寡核苷酸3′端的封闭部分，(iv)使所述多核苷酸引物之一与所述寡核苷酸5′的靶核酸
杂交；(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生切割
产物；以及(c)在扩增条件下延伸所述多核苷酸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
[0015] 在某些实施方式中，所述寡核苷酸可阻断多核苷酸引物的延伸直至第一功能性切割位点被第一内切核酸酶切断。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)可在同一反
应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在一些实施方式中，一种或多种切割产物可
包含可检测特征。在某些实施方式中，所述方法还包括检测一种或多种切割产物的所述可
检测特征。在一些实施方式中，一种或多种切割产物含有捕获剂。
应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在一些实施方式中，一种或多种切割产物可
包含可检测特征。在某些实施方式中，所述方法还包括检测一种或多种切割产物的所述可
检测特征。在一些实施方式中，一种或多种切割产物含有捕获剂。
[0016] 在一些实施方式中，提供测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：(i)与靶核酸互
补的核苷酸亚序列，(ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸
与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和(iv)可检测特征；(b)在切割条件下使核酸组合
物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有该可检测特
征的寡核苷酸片段；和(c)检测有无含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而根据检测有
无含有该可检测特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、
(c)和(d)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在一些实施方式中，
(b)中的切割可产生含有可区分的可检测特征的2种或多种寡核苷酸片段。在某些实施方
式中，可检测一种或多种所述寡核苷酸片段的一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，
一种或多种所述寡核苷酸片段可含有捕获剂。
补的核苷酸亚序列，(ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸
与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和(iv)可检测特征；(b)在切割条件下使核酸组合
物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有该可检测特
征的寡核苷酸片段；和(c)检测有无含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而根据检测有
无含有该可检测特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、
(c)和(d)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在一些实施方式中，
(b)中的切割可产生含有可区分的可检测特征的2种或多种寡核苷酸片段。在某些实施方
式中，可检测一种或多种所述寡核苷酸片段的一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，
一种或多种所述寡核苷酸片段可含有捕获剂。
[0017] 在一些实施方式中，还提供测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：(i)与靶核酸
互补的核苷酸亚序列，(ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸
与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和(iv)可检测特征；(b)在切割条件下使核酸组合
物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有该可检测特
征的寡核苷酸片段；(c)在延伸条件下使核酸组合物与正向和反向引物多核苷酸接触；和
(d)检测是否存在含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而可根据检测有无含有该可检测
特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。在一些实施方式中，可使所述核酸组合物与2种或
多种寡核苷酸接触。
互补的核苷酸亚序列，(ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸
与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性内切核酸酶切割位点，
(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和(iv)可检测特征；(b)在切割条件下使核酸组合
物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有该可检测特
征的寡核苷酸片段；(c)在延伸条件下使核酸组合物与正向和反向引物多核苷酸接触；和
(d)检测是否存在含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而可根据检测有无含有该可检测
特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。在一些实施方式中，可使所述核酸组合物与2种或
多种寡核苷酸接触。
[0018] 在某些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在一些实施方式中，(b)中的切割可产生含有可区分的可检测特征
的2种或多种寡核苷酸片段。在某些实施方式中，可检测一种或多种所述寡核苷酸片段的
一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述寡核苷酸片段可含有捕获剂。
的2种或多种寡核苷酸片段。在某些实施方式中，可检测一种或多种所述寡核苷酸片段的
一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述寡核苷酸片段可含有捕获剂。
[0019] 在一些实施方式中，提供扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和引物多核苷酸接触，其中所述寡核苷酸
包含：(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，和(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功
能性部分；以及(b)在扩增条件下延伸所述寡核苷酸，从而产生延伸的寡核苷酸，其中引物
多核苷酸与该延伸的寡核苷酸杂交并在扩增条件下延伸，从而产生包含功能性第一内切核
酸酶切割位点的双链扩增产物，由此扩增靶核酸或其部分。在一些实施方式中，所述方法还
可包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生双链
切割产物。
包含：(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，和(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功
能性部分；以及(b)在扩增条件下延伸所述寡核苷酸，从而产生延伸的寡核苷酸，其中引物
多核苷酸与该延伸的寡核苷酸杂交并在扩增条件下延伸，从而产生包含功能性第一内切核
酸酶切割位点的双链扩增产物，由此扩增靶核酸或其部分。在一些实施方式中，所述方法还
可包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生双链
切割产物。
[0020] 在某些实施方式中，所述双链切割产物含有可检测特征。在一些实施方式中，所述方法还包括检测所述可检测特征。在一些实施方式中，所述双链切割产物含有捕获剂。在某
些实施方式中，步骤(a)和(b)可在同一反应环境中进行，在一些实施方式中可同时进行。
些实施方式中，步骤(a)和(b)可在同一反应环境中进行，在一些实施方式中可同时进行。
[0021] 在一些实施方式中，所述方法还可包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生单链切割产物。在一些实施方式中，所述单链切割产物
可含有可检测特征。在某些实施方式中，所述方法还可包括检测所述可检测特征。在一些
实施方式中，所述单链切割产物可含有捕获剂。
可含有可检测特征。在某些实施方式中，所述方法还可包括检测所述可检测特征。在一些
实施方式中，所述单链切割产物可含有捕获剂。
[0022] 在一些实施方式中，提供检测核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和引物多核苷酸接触，其中所述寡核苷酸
包含：(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能
性部分；和(iii)可检测特征；以及(b)使核酸组合物暴露于扩增条件，其中(i)当存在靶
核酸时所述寡核苷酸被延伸，和(ii)所述引物多核苷酸与延伸的寡核苷酸杂交并在扩增
条件下延伸，从而产生含有功能性第一内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；(c)使核酸
组合物与能切割所述功能性第一内切核酸酶切割位点的第一内切核酸酶接触，从而产生含
有该可检测特征的切割产物；以及(d)检测有无含该可检测特征的切割产物，从而根据检
测有无含该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
包含：(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能
性部分；和(iii)可检测特征；以及(b)使核酸组合物暴露于扩增条件，其中(i)当存在靶
核酸时所述寡核苷酸被延伸，和(ii)所述引物多核苷酸与延伸的寡核苷酸杂交并在扩增
条件下延伸，从而产生含有功能性第一内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；(c)使核酸
组合物与能切割所述功能性第一内切核酸酶切割位点的第一内切核酸酶接触，从而产生含
有该可检测特征的切割产物；以及(d)检测有无含该可检测特征的切割产物，从而根据检
测有无含该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
[0023] 在某些实施方式中，步骤(a)、(b)和(c)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。在一些实施方式中，(c)中的切割可产生含有可区分的可检测特征的2种
或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一种或多种所述切割产物的一种或多种可检
测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切割产物可含有捕获剂。
或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一种或多种所述切割产物的一种或多种可检
测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切割产物可含有捕获剂。
[0024] 在某些实施方式中，提供扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下，提供寡核苷酸和多核苷酸，或提供包含3′部分的寡核苷酸，其中：
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述多核苷酸包含一段互补
“互补多核苷酸序列”并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，(iii)所述寡
核苷酸的3′部分包含一段互补“互补多核苷酸序列”并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序
列的多核苷酸亚序列，和(iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能
性第一内切核酸酶切割位点；(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切
割位点，从而产生可延伸的引物寡核苷酸；(c)使核酸组合物与可延伸的引物寡核苷酸接
触；(d)在扩增条件下存在引物核酸时延伸所述可延伸的引物寡核苷酸，其中(i)产生延伸
的引物寡核苷酸，和(ii)使所述引物核酸与该延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而扩增
靶核酸或其部分。
(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述多核苷酸包含一段互补
“互补多核苷酸序列”并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，(iii)所述寡
核苷酸的3′部分包含一段互补“互补多核苷酸序列”并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序
列的多核苷酸亚序列，和(iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能
性第一内切核酸酶切割位点；(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切
割位点，从而产生可延伸的引物寡核苷酸；(c)使核酸组合物与可延伸的引物寡核苷酸接
触；(d)在扩增条件下存在引物核酸时延伸所述可延伸的引物寡核苷酸，其中(i)产生延伸
的引物寡核苷酸，和(ii)使所述引物核酸与该延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而扩增
靶核酸或其部分。
[0025] 在一些实施方式中，所述寡核苷酸可包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，和在扩增条件下可产生包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物。在某些
实施方式中，所述方法还可包括(e)用第二内切核酸酶切割所述功能性第二内切核酸酶切
割位点，从而产生切割产物。在一些实施方式中，所述切割产物是双链切割产物(例如，所
述内切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。在一些实施方式中，所述切割产物是单链切
割产物(例如，所述内切核酸酶切割该双链扩增产物的一条链)。在一些实施方式中，所述
切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一
种或多种所述切割产物的一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切
割产物可含有捕获剂。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸可包含相同或不同的
封闭部分。在某些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可在
同一反应环境中进行。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)或(a)、(b)、(c)、(d)
和(e)可同时进行。在某些实施方式中，所述包含3′部分的寡核苷酸可形成茎环结构。
实施方式中，所述方法还可包括(e)用第二内切核酸酶切割所述功能性第二内切核酸酶切
割位点，从而产生切割产物。在一些实施方式中，所述切割产物是双链切割产物(例如，所
述内切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。在一些实施方式中，所述切割产物是单链切
割产物(例如，所述内切核酸酶切割该双链扩增产物的一条链)。在一些实施方式中，所述
切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一
种或多种所述切割产物的一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切
割产物可含有捕获剂。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸可包含相同或不同的
封闭部分。在某些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可在
同一反应环境中进行。在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)或(a)、(b)、(c)、(d)
和(e)可同时进行。在某些实施方式中，所述包含3′部分的寡核苷酸可形成茎环结构。
[0026] 在一些实施方式中，还提供检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下，提供寡核苷酸和多核苷酸，或提供包括3′部分的寡核苷酸，其中：(i)所述
寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述多核苷酸包含一段互补(“互补多
核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，(iii)所述寡核苷酸
的3′部分包含一段互补(“互补多核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列
的多核苷酸亚序列，(iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一
内切核酸酶切割位点，(v)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，
和(vi)所述寡核苷酸包含可检测特征；(b)在切割条件下提供第一内切核酸酶，所述第一
内切核酸酶切割该第一内切核酸酶切割位点，从而产生可延伸的引物寡核苷酸；(c)使核
酸组合物与该可延伸的引物寡核苷酸接触；(d)使核酸组合物接触扩增条件和引物核酸，
其中：(i)当存在靶核酸时，所述可延伸的引物寡核苷酸被延伸，从而产生延伸的引物寡核
苷酸，和(ii)所述引物核酸与该延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而产生包含功能性第
二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；(e)使核酸组合物与第二内切核酸酶在切割条件
下接触，其中所述第二内切核酸酶切割包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产
物，从而产生含有该可检测特征的切割产物；和(f)检测是否存在含该可检测特征的切割
产物，从而可根据检测有无含该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述多核苷酸包含一段互补(“互补多
核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，(iii)所述寡核苷酸
的3′部分包含一段互补(“互补多核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列
的多核苷酸亚序列，(iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一
内切核酸酶切割位点，(v)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，
和(vi)所述寡核苷酸包含可检测特征；(b)在切割条件下提供第一内切核酸酶，所述第一
内切核酸酶切割该第一内切核酸酶切割位点，从而产生可延伸的引物寡核苷酸；(c)使核
酸组合物与该可延伸的引物寡核苷酸接触；(d)使核酸组合物接触扩增条件和引物核酸，
其中：(i)当存在靶核酸时，所述可延伸的引物寡核苷酸被延伸，从而产生延伸的引物寡核
苷酸，和(ii)所述引物核酸与该延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而产生包含功能性第
二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；(e)使核酸组合物与第二内切核酸酶在切割条件
下接触，其中所述第二内切核酸酶切割包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产
物，从而产生含有该可检测特征的切割产物；和(f)检测是否存在含该可检测特征的切割
产物，从而可根据检测有无含该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
[0027] 在一些实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)在同一反应环境中进行，在某些实施方式中同时进行。在一些实施方式中，所述切割产物是双链切割产物(例如，所述内
切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。在一些实施方式中，所述切割产物是单链切割产物
(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的一条链)。在一些实施方式中，所述切割产生
含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一种或多种
所述切割产物的一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切割产物可
含有捕获剂。
切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。在一些实施方式中，所述切割产物是单链切割产物
(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的一条链)。在一些实施方式中，所述切割产生
含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。在某些实施方式中，可检测一种或多种
所述切割产物的一种或多种可检测特征。在一些实施方式中，一种或多种所述切割产物可
含有捕获剂。
[0028] 在某些实施方式中，扩增和/或延伸条件包括核酸聚合酶。在一些实施方式中，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶，在某些实施方式中，所述核酸聚合酶是RNA聚合酶。在一些实
施方式中，所述聚合酶是跨损伤的合成聚合酶，有时所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶(例
如，硫化叶菌DNA聚合酶IV)。在某些实施方式中，所述聚合酶能跨越一个或多个DNA模板
损伤处合成DNA，有时所述一个或多个损伤包括一个或多个脱碱基位点。
施方式中，所述聚合酶是跨损伤的合成聚合酶，有时所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶(例
如，硫化叶菌DNA聚合酶IV)。在某些实施方式中，所述聚合酶能跨越一个或多个DNA模板
损伤处合成DNA，有时所述一个或多个损伤包括一个或多个脱碱基位点。
[0029] 在一些实施方式中，所述聚合酶选自：Taq DNA聚合酶；Q-BioTM Taq DNA聚合酶；TM TM TM o TM
SurePrime 聚合酶；Arrow Taq DNA聚合酶；JumpStart Taq ；9N m DNA聚合酶；Deep
TM
VentR (无外切活性)DNA聚合酶；Tth DNA聚合酶；抗体介导的聚合酶；用于热稳定性扩增
的聚合酶；天然或修饰的RNA聚合酶及其功能片段，天然或修饰的DNA聚合酶及其功能片
段，等等和它们的组合。
SurePrime 聚合酶；Arrow Taq DNA聚合酶；JumpStart Taq ；9N m DNA聚合酶；Deep
TM
VentR (无外切活性)DNA聚合酶；Tth DNA聚合酶；抗体介导的聚合酶；用于热稳定性扩增
的聚合酶；天然或修饰的RNA聚合酶及其功能片段，天然或修饰的DNA聚合酶及其功能片
段，等等和它们的组合。
[0030] 在一些实施方式中，提供测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：(i)所述寡核苷
酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，(ii)所述寡核苷酸的3′末端含
有封闭部分，和(iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iv)内
部5′区和内部3′区与靶核酸不互补，(v)内部5′区与内部3′区基本互补并在该末端
5′区和该末端3′区与靶核酸杂交时能彼此杂交形成内部茎环结构，(vi)当末端5′区和
末端3′区不与靶核酸杂交时，该内部5′区和内部3′区不彼此杂交，和(vii)所述茎环
结构包含内切核酸酶切割位点；(b)使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接
触，若核酸组合物中存在靶核酸可产生茎环结构切割产物；以及(c)检测有无该切割产物，
从而可根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。在一些实施方式中，所述切割产物含有
可检测特征。在某些实施方式中，所述切割产物含有捕获剂。在一些实施方式中，步骤(a)
和(b)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中同时进行。
酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，(ii)所述寡核苷酸的3′末端含
有封闭部分，和(iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iv)内
部5′区和内部3′区与靶核酸不互补，(v)内部5′区与内部3′区基本互补并在该末端
5′区和该末端3′区与靶核酸杂交时能彼此杂交形成内部茎环结构，(vi)当末端5′区和
末端3′区不与靶核酸杂交时，该内部5′区和内部3′区不彼此杂交，和(vii)所述茎环
结构包含内切核酸酶切割位点；(b)使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接
触，若核酸组合物中存在靶核酸可产生茎环结构切割产物；以及(c)检测有无该切割产物，
从而可根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。在一些实施方式中，所述切割产物含有
可检测特征。在某些实施方式中，所述切割产物含有捕获剂。在一些实施方式中，步骤(a)
和(b)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中同时进行。
[0031] 在某些实施方式中，提供测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下使核酸组合物与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸接触，其中：(i)所述
第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各包含5′区、3′区和3′末端的封闭部分，(ii)所述第一
寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iii)所述第
一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，(iv)所述第一寡核苷酸的
3′区与第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′
区与靶核酸杂交时，它们可彼此杂交形成茎结构，(v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核
苷酸的3′区不与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区彼此不杂
交，和(vi)所述茎结构包含内切核酸酶切割位点；(b)使核酸组合物与能切割所述切割位
点的内切核酸酶接触，若核酸组合物中存在靶核酸可产生茎结构切割产物；以及(c)检测
有无该切割产物，从而根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。在一些实施方式中，所述
切割产物含有可检测特征。在某些实施方式中，所述切割产物含有捕获剂。在一些实施方
式中，步骤(a)和(b)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。
第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各包含5′区、3′区和3′末端的封闭部分，(ii)所述第一
寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iii)所述第
一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，(iv)所述第一寡核苷酸的
3′区与第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′
区与靶核酸杂交时，它们可彼此杂交形成茎结构，(v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核
苷酸的3′区不与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区彼此不杂
交，和(vi)所述茎结构包含内切核酸酶切割位点；(b)使核酸组合物与能切割所述切割位
点的内切核酸酶接触，若核酸组合物中存在靶核酸可产生茎结构切割产物；以及(c)检测
有无该切割产物，从而根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。在一些实施方式中，所述
切割产物含有可检测特征。在某些实施方式中，所述切割产物含有捕获剂。在一些实施方
式中，步骤(a)和(b)可在同一反应环境中进行，在某些实施方式中可同时进行。
[0032] 在一些实施方式中，所述捕获剂可选自生物素、亲和素与链霉亲和素。在某些实施方式中，所述内切核酸酶可以是热稳定性内切酶。在一些实施方式中，所述内切核酸酶在扩
增条件下其最大活性损失低于约50％。在某些实施方式中，所述内切核酸酶切割位点可包
括脱碱基位点。在一些实施方式中，所述内切核酸酶可以是AP内切核酸酶。在某些实施
方式中，所述AP内切核酸酶可选自：Tth内切核酸酶IV和源自海栖热袍菌(Thermotogoa
maritime)、火山热原体(Thermoplasm volacanium)和植物乳杆菌(lactobacillus
plantarum)的AP内切核酸酶。
增条件下其最大活性损失低于约50％。在某些实施方式中，所述内切核酸酶切割位点可包
括脱碱基位点。在一些实施方式中，所述内切核酸酶可以是AP内切核酸酶。在某些实施
方式中，所述AP内切核酸酶可选自：Tth内切核酸酶IV和源自海栖热袍菌(Thermotogoa
maritime)、火山热原体(Thermoplasm volacanium)和植物乳杆菌(lactobacillus
plantarum)的AP内切核酸酶。
[0033] 在某些实施方式中，所述内切核酸酶可以是限制性内切核酸酶。在一些实施方式中，所述限制性内切核酸酶可具有双链切割活性。在某些实施方式中，所述限制性内切核酸
酶可具有单链切割活性(例如切口酶)。在一些实施方式中，所述限制性内切核酸酶可选
自：Acl I、Apa LI、Ape KI、Bam HI、Bam HI-HF、Bcl I、Bgl II、Blp I、Bsa AI、Bsa XI、Bsi HKAI、Bso BI、Bsr FI、Bst BI、Bst EII、Bst NI、Bst UI、Bst Z17I、Bts CI、Cvi QI、Hpa I、Kpn I、Mwo I、Nci I、Pae R7I、Pho I、Ppu MI、Pvu II、Sfi I、Sfo I、Sml I、Tti I、Tsp
509I、Tsp MI、Tsp RI和Zra I。
酶可具有单链切割活性(例如切口酶)。在一些实施方式中，所述限制性内切核酸酶可选
自：Acl I、Apa LI、Ape KI、Bam HI、Bam HI-HF、Bcl I、Bgl II、Blp I、Bsa AI、Bsa XI、Bsi HKAI、Bso BI、Bsr FI、Bst BI、Bst EII、Bst NI、Bst UI、Bst Z17I、Bts CI、Cvi QI、Hpa I、Kpn I、Mwo I、Nci I、Pae R7I、Pho I、Ppu MI、Pvu II、Sfi I、Sfo I、Sml I、Tti I、Tsp
509I、Tsp MI、Tsp RI和Zra I。
[0034] 在某些实施方式中，所述内切核酸酶可切割DNA。在一些实施方式中，所述内切核酸酶不切割RNA。在某些实施方式中，所述内切核酸酶不是RNA酶。在一些实施方式中，所
述寡核苷酸可包含一个或多个脱碱基位点。在某些实施方式中，所述寡核苷酸可包含一个
或多个不可切割的碱基。在一些实施方式中，所述一个或多个不可切割碱基可位于一个切
割位点内，所述限制性内切核酸酶可具有双链切割活性，并且所述限制性内切核酸酶可仅
切割这种切割位点的一条链。
述寡核苷酸可包含一个或多个脱碱基位点。在某些实施方式中，所述寡核苷酸可包含一个
或多个不可切割的碱基。在一些实施方式中，所述一个或多个不可切割碱基可位于一个切
割位点内，所述限制性内切核酸酶可具有双链切割活性，并且所述限制性内切核酸酶可仅
切割这种切割位点的一条链。
[0035] 在某些实施方式中，所述可检测特征可选自：质量(例如，核酸的固有质量，切割产物的固有质量)、长度、核苷酸序列、光学性质、电学性质、磁学性质、化学性质和通过基质材料或其它材料(如纳米孔)开口的时间或速度。在一些实施方式中，所述可检测特征抗原
是质量。在某些实施方式中，所述质量可用质谱法测定。在一些实施方式中，所述质谱法可
选自：基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)、激光解吸质谱(LDMS)、
电喷雾(ES)质谱、离子回旋共振(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。在某些实施方式中，所述
质谱包括使核酸离子化并挥发。
是质量。在某些实施方式中，所述质量可用质谱法测定。在一些实施方式中，所述质谱法可
选自：基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)、激光解吸质谱(LDMS)、
电喷雾(ES)质谱、离子回旋共振(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。在某些实施方式中，所述
质谱包括使核酸离子化并挥发。
[0036] 在一些实施方式中，所述可检测特征可以是可检测标记测得的信号。在某些实施方式中，所述信号可选自：荧光、发光、紫外光、红外光、可见波长光、光散射、偏振光、辐射和同位素辐射。在一些实施方式中，所述扩增条件可包括具有链置换活性的聚合酶。在某些
实施方式中，所述封闭部分可以是选自以下的3′末端部分：磷酸、氨基、巯基、乙酰基、生物素、胆固醇、四乙二醇(TEG)、生物素-TEG、胆固醇-TEG、一个或多个反向核苷酸、反向脱氧胸苷、地高辛和1，3-丙二醇(C3间隔子)。
实施方式中，所述封闭部分可以是选自以下的3′末端部分：磷酸、氨基、巯基、乙酰基、生物素、胆固醇、四乙二醇(TEG)、生物素-TEG、胆固醇-TEG、一个或多个反向核苷酸、反向脱氧胸苷、地高辛和1，3-丙二醇(C3间隔子)。
[0037] 在一些实施方式中，所述茎环结构中的环可包含核苷酸。在某些实施方式中，所述茎环结构中的环可包含非核苷酸接头。在一些实施方式中，所述茎环结构中的茎可以部分
是单链。在某些实施方式中，所述茎环结构中的茎可以是双链。在一些实施方式中，所述茎
环结构或茎结构可包含一对信号分子的一个或两个成员，其中所述信号分子对成员可由内
切核酸酶切割位点隔开。在某些实施方式中，所述信号分子对成员是荧光团和淬灭分子。在
一些实施方式中，所述信号分子对成员是适合荧光共振能量转移(FRET)的荧光团分子。在
某些实施方式中，所述第一内切核酸酶与第二内切核酸酶不相同。
是单链。在某些实施方式中，所述茎环结构中的茎可以是双链。在一些实施方式中，所述茎
环结构或茎结构可包含一对信号分子的一个或两个成员，其中所述信号分子对成员可由内
切核酸酶切割位点隔开。在某些实施方式中，所述信号分子对成员是荧光团和淬灭分子。在
一些实施方式中，所述信号分子对成员是适合荧光共振能量转移(FRET)的荧光团分子。在
某些实施方式中，所述第一内切核酸酶与第二内切核酸酶不相同。
[0038] 在某些实施方式中，提供包含封闭寡核苷酸的物质组合物，所述封闭寡核苷酸包含：(i)非末端脱碱基位点，(ii)3′末端的封闭部分，和(iii)可检测特征。
[0039] 在一些实施方式中，提供包含2种寡核苷酸的物质组合物，每种寡核苷酸包含：(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部
分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时，第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第
一内切核酸酶切割位点，和(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分。在一些实施方式中，所
述寡核苷酸之一包含的5′区包括：(i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，(ii)第二内切核
酸酶切割位点的无功能性部分，在扩增条件下第二内切核酸酶切割位点的该无功能部分转
变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和(iii)可检测特征。
分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时，第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第
一内切核酸酶切割位点，和(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分。在一些实施方式中，所
述寡核苷酸之一包含的5′区包括：(i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，(ii)第二内切核
酸酶切割位点的无功能性部分，在扩增条件下第二内切核酸酶切割位点的该无功能部分转
变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和(iii)可检测特征。
[0040] 在一些实施方式中，提供包含彼此可杂交的寡核苷酸和多核苷酸的物质组合物，其中：(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述多核苷酸包含一段
互补(“互补多核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，和
(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位
点。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
互补(“互补多核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，和
(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位
点。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
[0041] 在某些实施方式中，提供包含彼此可杂交的寡核苷酸和多核苷酸的物质组合物，其中：(i)所述寡核苷酸可包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述多核苷酸包含一
段互补(“互补多核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位
点，和(iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分。在某些实施方式
中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
段互补(“互补多核苷酸序列”)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位
点，和(iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分。在某些实施方式
中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
[0042] 在一些实施方式中，提供包含寡核苷酸的物质组合物，其中：(i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述寡核苷酸包含3′部分，该3′部分含有一段互
补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，从
而形成茎环结构，和(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第
一内切核酸酶切割位点。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封
闭部分。
补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，从
而形成茎环结构，和(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第
一内切核酸酶切割位点。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封
闭部分。
[0043] 在某些实施方式中，提供包含寡核苷酸的物质组合物，其中：(i)所述寡核苷酸可包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，(ii)所述寡核苷酸包含3′部分，该3′部分含有一段
互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，
从而形成茎环结构，(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第
一内切核酸酶切割位点，和(iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性
部分。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，
从而形成茎环结构，(iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第
一内切核酸酶切割位点，和(iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性
部分。在一些实施方式中，所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
[0044] 在一些实施方式中，提供包含寡核苷酸的物质组合物，其中：(i)所述寡核苷酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，(ii)所述寡核苷酸包含3′末端的封
闭部分，和(iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iv)内部5′
区和内部3′区与靶核酸不互补，(v)内部5′区与内部3′区基本互补，当末端5′区和末
端3′区与靶核酸杂交时，内部5′区与内部3′区彼此杂交形成内部茎环结构，(vi)当末
端5′区和末端3′区与靶核酸不杂交时，内部5′区和内部3′区彼此不杂交，和(vii)所
述茎环结构可包含内切核酸酶切割位点。
闭部分，和(iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iv)内部5′
区和内部3′区与靶核酸不互补，(v)内部5′区与内部3′区基本互补，当末端5′区和末
端3′区与靶核酸杂交时，内部5′区与内部3′区彼此杂交形成内部茎环结构，(vi)当末
端5′区和末端3′区与靶核酸不杂交时，内部5′区和内部3′区彼此不杂交，和(vii)所
述茎环结构可包含内切核酸酶切割位点。
[0045] 在某些实施方式中，提供包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的物质组合物，其中：(i)所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各含有5′区、3′区和3′末端的封闭部分，(ii)所
述第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iii)
所述第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，(iv)所述第一寡核
苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸
的3′区与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区可彼此杂交形成
茎结构，(v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸不杂交时，第一寡
核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区彼此不杂交，和(vi)所述茎结构可包含内切核酸
酶切割位点。
述第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，(iii)
所述第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，(iv)所述第一寡核
苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸
的3′区与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区可彼此杂交形成
茎结构，(v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸不杂交时，第一寡
核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区彼此不杂交，和(vi)所述茎结构可包含内切核酸
酶切割位点。
[0047] 附图简要说明
[0048] 附图说明了本发明技术的某些非限制性实施方式。为了说明的清楚和方便，附图不一定按比例，并且在一些情况中，可能夸大或放大显示不同元件以有助于对特定实施方
式的理解。
式的理解。
[0049] 图1是采用3′磷酸封闭、多种脱碱基寡核苷酸组合物(例如“探针寡核苷酸”)联合未修饰的正向和反向寡核苷酸(例如正向和反向“引物”)扩增和检测靶核酸方法的示
意图。此图中未显示反向寡核苷酸。图A说明热循环(例如PCR)反应中常用的变性步骤。
图B说明本文所述含有5′捕获剂的3’封端脱碱基寡核苷酸组合物在退火或杂交条件下与
靶核酸接触并退火。图C说明热稳定性AP内切核酸酶(例如在此具体实施方式中为Tth
内切核酸酶IV)切割被封闭的脱碱基寡核苷酸组合物。图D说明未修饰的正向寡核苷酸与
靶核酸退火。图B、C和D所说明的步骤在适当条件下常同时发生。图E说明热稳定性DNA
聚合酶延伸未修饰的正向寡核苷酸通过靶核酸与脱碱基“探针”寡核苷酸退火的区段，从而
置换或帮助置换被切除的脱碱基寡核苷酸。图E说明完成从正向未修饰寡核苷酸的延伸。
每个分图中给出的是每个步骤的非限制性示范温度范围。
意图。此图中未显示反向寡核苷酸。图A说明热循环(例如PCR)反应中常用的变性步骤。
图B说明本文所述含有5′捕获剂的3’封端脱碱基寡核苷酸组合物在退火或杂交条件下与
靶核酸接触并退火。图C说明热稳定性AP内切核酸酶(例如在此具体实施方式中为Tth
内切核酸酶IV)切割被封闭的脱碱基寡核苷酸组合物。图D说明未修饰的正向寡核苷酸与
靶核酸退火。图B、C和D所说明的步骤在适当条件下常同时发生。图E说明热稳定性DNA
聚合酶延伸未修饰的正向寡核苷酸通过靶核酸与脱碱基“探针”寡核苷酸退火的区段，从而
置换或帮助置换被切除的脱碱基寡核苷酸。图E说明完成从正向未修饰寡核苷酸的延伸。
每个分图中给出的是每个步骤的非限制性示范温度范围。
[0050] 图2是采用一对封闭脱碱基寡核苷酸组合物扩增和/或检测靶核酸方法的示意图。在图2所示实施方式中，5′或上游寡核苷酸在3′端以生物素部分(例如捕获剂)封
闭。在图2中未显示的反向或3′寡核苷酸也用相似或不同的3’封端分子和/或捕获剂
封闭。所示寡核苷酸组合物可选包含可检测特征。图A说明变性步骤。图B说明上游3′
生物素封闭的脱碱基寡核苷酸与靶核酸退火。图C说明热稳定性AP内切核酸酶(例如此
具体实施方式中为Tth内切核酸酶IV)切割封闭的脱碱基寡核苷酸组合物。在图2显示的
实施方式中，已切断寡核苷酸3′部分的Tm远低于该完整寡核苷酸或已切断寡核苷酸5′
部分的Tm，使得在切割和延伸条件下已切断寡核苷酸的3′部分从靶核酸解离。图D说明
聚合酶从已切断寡核苷酸的功能性5′部分延伸。图E说明完成了从已切断寡核苷酸的延
伸。每个分图中给出的是每个步骤的非限制性示范温度范围。
闭。在图2中未显示的反向或3′寡核苷酸也用相似或不同的3’封端分子和/或捕获剂
封闭。所示寡核苷酸组合物可选包含可检测特征。图A说明变性步骤。图B说明上游3′
生物素封闭的脱碱基寡核苷酸与靶核酸退火。图C说明热稳定性AP内切核酸酶(例如此
具体实施方式中为Tth内切核酸酶IV)切割封闭的脱碱基寡核苷酸组合物。在图2显示的
实施方式中，已切断寡核苷酸3′部分的Tm远低于该完整寡核苷酸或已切断寡核苷酸5′
部分的Tm，使得在切割和延伸条件下已切断寡核苷酸的3′部分从靶核酸解离。图D说明
聚合酶从已切断寡核苷酸的功能性5′部分延伸。图E说明完成了从已切断寡核苷酸的延
伸。每个分图中给出的是每个步骤的非限制性示范温度范围。
[0051] 图3说明能形成茎结构的二元寡核苷酸的组合物，可在本文所述延伸或扩增方法中用作杂交探针或封闭的寡核苷酸。图3显示所述寡核苷酸的退火构象中不同区域的非限
制性示范解链温度(Tm)。
制性示范解链温度(Tm)。
[0052] 图4说明含内部茎环结构的寡核苷酸组合物，可在本文所述的延伸或扩增方法中用作杂交探针或封闭的寡核苷酸。图4显示所述寡核苷酸的退火构象中各区域的非限制性
示范解链温度(Tm)。图4所示切割反应可根据所述寡核苷酸组合物中所包含的切割位点，
用限制性内切核酸酶或AP内切核酸酶进行。
示范解链温度(Tm)。图4所示切割反应可根据所述寡核苷酸组合物中所包含的切割位点，
用限制性内切核酸酶或AP内切核酸酶进行。
[0053] 图5-9显示在实施例2所述的扩增反应中，Tth内切核酸酶IV切割脱碱基寡核苷酸组合物的MALDI质谱检测结果。具体实验细节(例如，寡核苷酸的序列、所用聚合酶的类
型、反应条件等)见实施例2中所述。
型、反应条件等)见实施例2中所述。
[0054] 图10是扩增和/或检测靶核酸方法的示意图，采用含有5′捕获剂和/或可检测特征的寡核苷酸组合物和热稳定性限制性内切核酸酶切割底物序列。该方法要求在限制性
内切核酸酶切割位点形成之前至少有两轮延伸。图A说明变性步骤。图B说明5′生物素
化寡核苷酸与靶核酸退火。图C说明寡核苷酸的延伸。图D说明变性步骤，其中新合成的
延伸产物从靶核酸上变性离开。图E说明反向寡核苷酸退火。图F说明第二延伸产物的合
成。第二延伸产物的合成产生所述限制性内切核酸酶切割位点。图G说明该反应所包括的
热稳定性限制性内切核酸酶的切割。图I说明纯化的含有捕获剂的切割片段。每个分图中
给出的是每个步骤的非限制性示范温度范围。
内切核酸酶切割位点形成之前至少有两轮延伸。图A说明变性步骤。图B说明5′生物素
化寡核苷酸与靶核酸退火。图C说明寡核苷酸的延伸。图D说明变性步骤，其中新合成的
延伸产物从靶核酸上变性离开。图E说明反向寡核苷酸退火。图F说明第二延伸产物的合
成。第二延伸产物的合成产生所述限制性内切核酸酶切割位点。图G说明该反应所包括的
热稳定性限制性内切核酸酶的切割。图I说明纯化的含有捕获剂的切割片段。每个分图中
给出的是每个步骤的非限制性示范温度范围。
[0055] 图11显示用热稳定性限制性内切核酸酶Pvu II切割生物素化5′捕获剂/可检测特征阳性反应的MALDI质谱检测结果。图12-15显示用热稳定性限制性内切核酸酶Pvu
II切割生物素化5′捕获剂/可检测特征阴性反应的MALDI质谱检测结果。实施例3中描
述了具体实验细节。
II切割生物素化5′捕获剂/可检测特征阴性反应的MALDI质谱检测结果。实施例3中描
述了具体实验细节。
[0056] 图16说明含有限制性内切核酸酶切割位点的一对3’封端寡核苷酸组合物。图17说明含有5′标记(例如捕获剂或可检测部分)和限制性位点的一对3’封端寡核苷酸组
合物。图18说明含有额外间插序列和两种不同限制性内切核酸酶切割位点的一对3’封端
寡核苷酸组合物。图19说明含有5′标记和两个脱碱基AP内切核酸酶切割位点的一对3’
封端寡核苷酸组合物。图20说明含有额外间插序列和两个脱碱基AP内切核酸酶切割位点
的一对3’封端寡核苷酸组合物。图16-20说明的实施方式可用于扩增和/或检测靶核酸，
实施例4中描述了组合物的其它具体细节。
合物。图18说明含有额外间插序列和两种不同限制性内切核酸酶切割位点的一对3’封端
寡核苷酸组合物。图19说明含有5′标记和两个脱碱基AP内切核酸酶切割位点的一对3’
封端寡核苷酸组合物。图20说明含有额外间插序列和两个脱碱基AP内切核酸酶切割位点
的一对3’封端寡核苷酸组合物。图16-20说明的实施方式可用于扩增和/或检测靶核酸，
实施例4中描述了组合物的其它具体细节。
[0057] 图21示意说明用热稳定性AP内切核酸酶(例如Tth IV内切核酸酶)将被封闭的寡核苷酸组合物解除封闭，从而产生可用于延伸或扩增方法的寡核苷酸。实施例4对图
21有进一步描述。
21有进一步描述。
[0058] 图22和23说明含有可用于扩增和/或检测靶核酸的一个或多个热稳定性限制性内切核酸酶切割位点的3’封端寡核苷酸的双链体组合物。图23还说明含有可选的5′标
记(例如捕获剂和/或可检测部分)的实施方式。图24和25说明含有可用于扩增和/或
检测靶核酸的一个或多个热稳定性AP内切核酸酶切割位点的3’封闭寡核苷酸的双链体组
合物。图25还说明含有可选的5′标记(例如捕获剂和/或可检测部分)的实施方式。图
22-25所示实施方式可用于扩增和/或检测靶核酸，实施例5中描述了组合物的其它具体细
节。
记(例如捕获剂和/或可检测部分)的实施方式。图24和25说明含有可用于扩增和/或
检测靶核酸的一个或多个热稳定性AP内切核酸酶切割位点的3’封闭寡核苷酸的双链体组
合物。图25还说明含有可选的5′标记(例如捕获剂和/或可检测部分)的实施方式。图
22-25所示实施方式可用于扩增和/或检测靶核酸，实施例5中描述了组合物的其它具体细
节。
[0059] 图26示意说明被封闭寡核苷酸组合物的解除封闭，产生可用于延伸或扩增方法的寡核苷酸。实施例5对图26有进一步描述。
[0060] 图27-30A说明含有内切核酸酶切割位点的3’封闭J-钩形寡核苷酸组合物。图27和28，含有的热稳定性限制性内切核酸酶切割位点。图28，还含有5′捕获剂标记。图
29，含有热稳定性AP内切核酸酶切割位点。图30A，含有热稳定性切口内切核酸酶切割位
点。图27-29所示实施方式可用于扩增和/或检测靶核酸，实施例6中描述了组合物的其
它具体细节。
29，含有热稳定性AP内切核酸酶切割位点。图30A，含有热稳定性切口内切核酸酶切割位
点。图27-29所示实施方式可用于扩增和/或检测靶核酸，实施例6中描述了组合物的其
它具体细节。
[0061] 图30B示意说明含有热稳定性切口内切核酸酶切割位点的J-钩形寡核苷酸组合物的解除封闭，产生可用于延伸或扩增方法的寡核苷酸。实施例6对图30B有进一步描述。
[0062] 图31是可用于给J-钩形寡核苷酸组合物提供额外灵活性的内部间隔件(例如内部间隔件18，因特网统一资源定位器(URL)idtdna.com)的化学结构图。图32说明采用含
互补3′末端的3’封闭线性寡核苷酸扩增和捕获和/或检测靶核酸的方法。实施例6中描
述了组合物和方法的其它具体细节。
互补3′末端的3’封闭线性寡核苷酸扩增和捕获和/或检测靶核酸的方法。实施例6中描
述了组合物和方法的其它具体细节。
[0063] 图33说明可用于扩增和检测靶核酸的含“被诱发切口功能”切割位点的3’封闭寡核苷酸组合物。实施例7中对图33有进一步描述。
[0064] 图34A-35C说明含有热稳定性限制性内切核酸酶切割位点的3’封闭引物的MALDI质谱检测结果。在实施例8中给出了具体实验细节。
[0066] 图37说明用MALDI质谱(例如MassARRAY)检测正向和反向引物的示范例。实施例11中描述了具体实验细节。在实施例11所述的一些过程中所用的MassARRAY检测引物
不包括内部杂交探针。图38说明采用硫化叶菌DNA聚合酶IV延伸核酸通过模板脱碱基位
点的方法。该图中还说明Tth内切核酸酶IV切割双链DNA中产生的脱碱基位点，所述双链
DNA由硫化叶菌DNA聚合酶IV跨过脱碱基位点而产生。
不包括内部杂交探针。图38说明采用硫化叶菌DNA聚合酶IV延伸核酸通过模板脱碱基位
点的方法。该图中还说明Tth内切核酸酶IV切割双链DNA中产生的脱碱基位点，所述双链
DNA由硫化叶菌DNA聚合酶IV跨过脱碱基位点而产生。
[0067] 图39-42显示联用硫化叶菌DNA聚合酶IV、Tth内切核酸酶IV与添加的DNA聚合酶的PCR试验，检测产生的切下标记的MALDI质谱结果。实施例11中描述了试验条件。图
39-42所示反应中加入的其它DNA聚合酶有：快速启动(FastStart)DNA聚合酶(图39)；
o TM
Tth DNA聚合酶(图40)；9N m DNA聚合酶(图41)；和深出口(Deep vent)(无外切活性)
DNA聚合酶(图42)。图中，切下的标记注明为“标记”，钝态参比加标(passive reference
spike)标注为“加标”，未切割的正向引物注明为“SRY.Dpo.Tth.f1”。每个图都显示存在切下的标记并表明被Tth内切核酸酶IV所切下。
39-42所示反应中加入的其它DNA聚合酶有：快速启动(FastStart)DNA聚合酶(图39)；
o TM
Tth DNA聚合酶(图40)；9N m DNA聚合酶(图41)；和深出口(Deep vent)(无外切活性)
DNA聚合酶(图42)。图中，切下的标记注明为“标记”，钝态参比加标(passive reference
spike)标注为“加标”，未切割的正向引物注明为“SRY.Dpo.Tth.f1”。每个图都显示存在切下的标记并表明被Tth内切核酸酶IV所切下。
[0068] 图43显示计算出的SRY切割标记对钝态参比加标的比值。显示了改变PCR变性温度对该比值的影响。图44说明荧光检测所用的正向和反向引物的示范性例子。图44显
示该实施方式中所用的引物，在实施例11中有所描述，包含5′荧光团、脱碱基位点和内部
淬灭部分。
示该实施方式中所用的引物，在实施例11中有所描述，包含5′荧光团、脱碱基位点和内部
淬灭部分。
[0069] 图44说明利用5′荧光团、内部脱碱基位点和内部淬灭部分进行荧光试验的示意性设计方案。
[0070] 发明详述
[0071] 扩增和检测稀有或低拷贝数核酸的方法，包括诊断方法如胎儿基因分型，有时会由于产生非目标扩增产物导致的假阳性而被误读。本文所述组合物和方法可用于最大程度
减少或消除非目标扩增产物，并且不需要专门和/或昂贵的试剂而降低大规模核酸扩增和
诊断试难于的相关费用。
减少或消除非目标扩增产物，并且不需要专门和/或昂贵的试剂而降低大规模核酸扩增和
诊断试难于的相关费用。
[0072] 本文提供的组合物和方法可用于代替通常采用的其它核酸扩增的方法和设备，或与之联用。本文所述组合物和方法不难调整为与常用的高通量和自动化生物学工作站一起
应用。
应用。
[0073] 本文提供的组合物和方法可用于扩增、捕获和/或检测靶核酸。本文提供的组合物和方法采用热稳定内切核酸酶和含有所述内切核酸酶切割位点的封闭寡核苷酸，通过内
切核酸酶的切割得以扩增和检测核酸。本文所述组合物和方法不需要分隔反应物或采用聚
合酶抑制剂，或专门的“热启动”程序。本文提供的组合物也可含有捕获剂和可检测特征，
从而可广泛应用于实验室与临床诊断过程。
切核酸酶的切割得以扩增和检测核酸。本文所述组合物和方法不需要分隔反应物或采用聚
合酶抑制剂，或专门的“热启动”程序。本文提供的组合物也可含有捕获剂和可检测特征，
从而可广泛应用于实验室与临床诊断过程。
[0074] 除了不需要分隔或抑制反应组分，或采用其它“热启动”技术外，本文提供的组合物和方法还具有以下代表性优点：(i)单管或封闭管反应(例如所有组分在基本上相似的
条件下工作，无需中断热循环过程以添加追加组分，或无需将一部分或全部反应移至另一
反应容器)，(ii)由于可购买到许多热稳定性内切核酸酶(例如AP内切核酸酶、限制性内
切核酸酶和切口内切核酸酶)因此所述寡核苷酸的设计灵活，(iii)易于调整而广泛采用
各种捕获和/或检测方法(例如可在所述寡核苷酸组合物中掺入各种的捕获剂和可检测特
征)，和(iv)反应设置简易(例如很多情况下的退火、切割和延伸条件基本相似)。
条件下工作，无需中断热循环过程以添加追加组分，或无需将一部分或全部反应移至另一
反应容器)，(ii)由于可购买到许多热稳定性内切核酸酶(例如AP内切核酸酶、限制性内
切核酸酶和切口内切核酸酶)因此所述寡核苷酸的设计灵活，(iii)易于调整而广泛采用
各种捕获和/或检测方法(例如可在所述寡核苷酸组合物中掺入各种的捕获剂和可检测特
征)，和(iv)反应设置简易(例如很多情况下的退火、切割和延伸条件基本相似)。
[0075] 使用本文所述组合物和方法时，可无需分隔反应物或采用聚合酶抑制剂或其它热启动方法。但在一些实施方式中，热启动过程(例如用抗体或化学品灭活DNA聚合酶直至
达到某确定温度)可与本文所述组合物和方法联用以增加反应的特异性。
达到某确定温度)可与本文所述组合物和方法联用以增加反应的特异性。
[0076] 除以上列举的优点外，本文提供的组合物和方法可用于常规筛选能导致“切口”DNA的热稳定性内切核酸酶。限制性内切核酸酶通常在限制性内切核酸酶识别位点处
或附近切割DNA的两条链。切口内切核酸酶通常在切口内切核酸酶识别位点处或附近只切
割一条DNA链。本文描述的组合物和方法采用了不可切割的核苷酸类似物，而能常规筛选
在双链识别位点处仅切割单链DNA的热稳定性限制性内切核酸酶。
或附近切割DNA的两条链。切口内切核酸酶通常在切口内切核酸酶识别位点处或附近只切
割一条DNA链。本文描述的组合物和方法采用了不可切割的核苷酸类似物，而能常规筛选
在双链识别位点处仅切割单链DNA的热稳定性限制性内切核酸酶。
[0077] 样品或靶核酸与核酸组合物
[0078] 核酸组合物可包含任何类型的核酸或不同类型核酸的混合物。核酸组合物可得自样品。样品核酸可衍生自一个或多个样品或来源。如本文所用，“核酸”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。该术语也应理解为包括由核苷酸类似物、单链(有义
或反义)和双链多核苷酸构成的RNA或DNA的等价物、衍生物、变体和类似物。应理解，术
语“核酸”并非仅指或暗示特定长度的多核苷酸链，因此，此定义也包括核苷酸、多核苷酸和寡核苷酸。脱氧核糖核苷酸包含脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。包含样品核酸的来源或样品可包含一种或多种样品核酸。本文所述的多种
样品核酸指至少2种样品核酸，可包括相同或不同的核酸序列。也即，样品核酸可以都是相
同核酸序列的代表，或可以是两种或多种不同核酸序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、1000或更多序列)的代表。
或反义)和双链多核苷酸构成的RNA或DNA的等价物、衍生物、变体和类似物。应理解，术
语“核酸”并非仅指或暗示特定长度的多核苷酸链，因此，此定义也包括核苷酸、多核苷酸和寡核苷酸。脱氧核糖核苷酸包含脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。包含样品核酸的来源或样品可包含一种或多种样品核酸。本文所述的多种
样品核酸指至少2种样品核酸，可包括相同或不同的核酸序列。也即，样品核酸可以都是相
同核酸序列的代表，或可以是两种或多种不同核酸序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、1000或更多序列)的代表。
[0079] 例如，样品可采自生物、矿物或地质地点(例如土壤、岩石、矿藏、角斗场(combat theater))、法医学地点(例如犯罪现场、走私品或疑似走私品)、或古生物学或考古学地点(如化石或骨头)。样品可以是“生物学样品”，该术语是指获自活体来源或先前是活体的来
源，例如动物如人或其它哺乳动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒的任何材料。生物学样品可以是任何形式，包括但不限于：固体材料，如组织、细胞、细胞团、细胞提取物、或活检样品；或者生物液体如尿液、血液、唾液、羊水、感染或炎症区域的渗出液、或含有口腔细胞的漱口水、尿液、脑脊液和滑膜液，以及器官。
源，例如动物如人或其它哺乳动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒的任何材料。生物学样品可以是任何形式，包括但不限于：固体材料，如组织、细胞、细胞团、细胞提取物、或活检样品；或者生物液体如尿液、血液、唾液、羊水、感染或炎症区域的渗出液、或含有口腔细胞的漱口水、尿液、脑脊液和滑膜液，以及器官。
[0080] 生物学样品可以是母体血液，包括母体血浆或血清。在一些情况下，生物学样品是无细胞样品。在其它情况下，生物学样品包括母体血液中的细胞成分或细胞残余物。其它
生物学样品包括羊水、绒毛膜绒毛样品、移植前胚胎的活检材料、母体尿液、母体唾液、膜间液(celocentesis)样品、胎儿有核细胞或胎儿细胞残余物、或女性生殖道清洗样品。在一
些实施方式中，生物学样品可以是血液，有时是血浆。
生物学样品包括羊水、绒毛膜绒毛样品、移植前胚胎的活检材料、母体尿液、母体唾液、膜间液(celocentesis)样品、胎儿有核细胞或胎儿细胞残余物、或女性生殖道清洗样品。在一
些实施方式中，生物学样品可以是血液，有时是血浆。
[0081] 如本文所用，术语“血液”包括全血或血液的任何组分，例如常规定义的血清和血浆。血液血浆指用抗凝剂处理的血液经全血离心所得的组分。血液血清指血液样品凝结后
留下的水性液体部分。通常按照医院或临床诊所普遍遵循的标准方法采集液体或组织样
品。对于血液，通常采集适当量的外周血(例如3-40毫升)并按照标准程序保存，然后在
此类实施方式中作进一步制备。提取模板核酸所用的液体或组织样品可以是无细胞样品。
在一些实施方式中，液体或组织样品可含有细胞成分或细胞残余物。
留下的水性液体部分。通常按照医院或临床诊所普遍遵循的标准方法采集液体或组织样
品。对于血液，通常采集适当量的外周血(例如3-40毫升)并按照标准程序保存，然后在
此类实施方式中作进一步制备。提取模板核酸所用的液体或组织样品可以是无细胞样品。
在一些实施方式中，液体或组织样品可含有细胞成分或细胞残余物。
[0082] 对于本文所述技术的产前应用，液体或组织样品可采自适合测试的怀孕年龄女性或测试可能怀孕的女性。合适怀孕的年龄视所测染色体的异常而不同。在某些实施方式中，
妊娠妇女对象有时处在孕期的第一个三月期，有时处在孕期的第二个三月期或有时处在孕
期的第三个三月期。在某些实施方式中，液体或组织采自怀胎1-4、4-8、8-12、12-16、16-20、
20-24、24-28、28-32、32-36、36-40或40-44周的妊娠女性，有时采自怀胎5-28周之间的妊
娠女性。
妊娠妇女对象有时处在孕期的第一个三月期，有时处在孕期的第二个三月期或有时处在孕
期的第三个三月期。在某些实施方式中，液体或组织采自怀胎1-4、4-8、8-12、12-16、16-20、
20-24、24-28、28-32、32-36、36-40或40-44周的妊娠女性，有时采自怀胎5-28周之间的妊
娠女性。
[0083] 在某些实施方式中，模板核酸可以是胞外核酸。本文所用术语“胞外模板核酸”指分离自基本上没有细胞的来源(例如没有可测细胞；可含有细胞成分或细胞残余物)的
核酸。无细胞来源胞外核酸的例子有血液血浆、血清和尿液。不想受理论的束缚，胞外核
酸可以是细胞凋亡和细胞破裂的产物，这是胞外核酸常具有大范围多系列长度(例如″梯
(ladder)″)的基础。
核酸。无细胞来源胞外核酸的例子有血液血浆、血清和尿液。不想受理论的束缚，胞外核
酸可以是细胞凋亡和细胞破裂的产物，这是胞外核酸常具有大范围多系列长度(例如″梯
(ladder)″)的基础。
[0084] 胞外模板核酸可包括不同种类的核酸。例如，癌症病人的血液血清或血浆可能含癌细胞核酸和非癌细胞核酸。在另一例子中，怀孕妇女的血液血清或血浆可能包含母体核
酸和胎儿核酸。在一些情况中，胎儿核酸有时占全部模板核酸的约5％-40％(例如，约6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35、36、37、38或39％的模板核酸是胎儿核酸)。在一些实施方式中，模板核酸中的主要胎儿核酸长度约为500个碱基对或更短(例如，约80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的胎儿核酸长度约为500个碱基对或更短)。
酸和胎儿核酸。在一些情况中，胎儿核酸有时占全部模板核酸的约5％-40％(例如，约6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35、36、37、38或39％的模板核酸是胎儿核酸)。在一些实施方式中，模板核酸中的主要胎儿核酸长度约为500个碱基对或更短(例如，约80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的胎儿核酸长度约为500个碱基对或更短)。
[0085] 有时要检测低拷贝数或稀有靶核酸。在某些实施方式中，要检测非癌、野生型核酸较大背景中的稀有突变(例如癌突变)，用于检测有无癌症。相似的，要检测母体核酸较大
背景中的胎儿特异性核酸(例如存在于胎儿核酸但不存在于母体核酸中的多态性)，用于
检测有无胎儿紊乱、特征或异常。检测低拷贝数或稀有核酸的方法包括利用能选择性阻断
野生型或背景核酸扩增或检测的寡核苷酸。
背景中的胎儿特异性核酸(例如存在于胎儿核酸但不存在于母体核酸中的多态性)，用于
检测有无胎儿紊乱、特征或异常。检测低拷贝数或稀有核酸的方法包括利用能选择性阻断
野生型或背景核酸扩增或检测的寡核苷酸。
[0086] 有时要测定模板核酸中的胎儿核酸含量(例如浓度)。在某些实施方式中，根据男性胚胎的特异性标记(例如Y-染色体的STR标记(如DYS 19、DYS 385、DYS 392标记)、
RhD阴性女性的RhD标记)，或根据一种或多种胎儿核酸而非母体核酸的特异性标记(例如
母体血浆中的胎儿RNA标记；Lo，2005，Journal of Histochemistry and Cytochemistry
53(3)：293-296)测定胎儿核酸的含量。在某些实施方式中，可定量测定胞外模板核酸中的
胎儿核酸含量，用于鉴定有无染色体异常。
RhD阴性女性的RhD标记)，或根据一种或多种胎儿核酸而非母体核酸的特异性标记(例如
母体血浆中的胎儿RNA标记；Lo，2005，Journal of Histochemistry and Cytochemistry
53(3)：293-296)测定胎儿核酸的含量。在某些实施方式中，可定量测定胞外模板核酸中的
胎儿核酸含量，用于鉴定有无染色体异常。
[0087] 在一些实施方式中，富集或相对富集胞外核酸中的胎儿核酸。在2007年5月30日提交的PCT专利申请PCT/US07/69991、2007年6月15日提交的PCT专利申请
PCT/US2007/071232、2008年8月28日提交的PCT专利公开号WO 2009/032779和WO
2009/032781、2008年3月26日提交的PCT专利公开号WO 2008/118988、以及2005年11
月28日提交的PCT专利申请PCT/EP05/012707中描述了富集样品中特定种类核酸的方法。
在某些实施方式中，选择性除去样品中的(部分除去、基本上除去、几乎完全或完全除去)
母体核酸。在另一些实施方式中，选择性扩增样品中的(部分、基本上、几乎完全或完全扩
增)胎儿核酸。
PCT/US2007/071232、2008年8月28日提交的PCT专利公开号WO 2009/032779和WO
2009/032781、2008年3月26日提交的PCT专利公开号WO 2008/118988、以及2005年11
月28日提交的PCT专利申请PCT/EP05/012707中描述了富集样品中特定种类核酸的方法。
在某些实施方式中，选择性除去样品中的(部分除去、基本上除去、几乎完全或完全除去)
母体核酸。在另一些实施方式中，选择性扩增样品中的(部分、基本上、几乎完全或完全扩
增)胎儿核酸。
[0088] 样品也可以在与另一样品不同的时间点分离得到，其中各样品得自相同或不同来源。样品核酸可得自核酸文库，例如cDNA或RNA文库。样品核酸可以是样品中核酸纯化或
分离和/或核酸分子扩增的产物。本文所述提供用于序列分析过程的样品核酸可包含一个
样品或两个或多个样品(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个样品)的核酸。
分离和/或核酸分子扩增的产物。本文所述提供用于序列分析过程的样品核酸可包含一个
样品或两个或多个样品(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个样品)的核酸。
[0089] 样品核酸可包含适合用于本技术方法的任何类型核酸，例如可与固相核酸(后文有述)杂交的样品核酸，或基本上由其组成。在某些实施方式中，样品核酸可包含DNA(例如
互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)等)、RNA(例如信使RNA(mRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、
核糖体RNA(rRNA)、tRNA等)和/或DNA或RNA类似物(例如含碱基类似物、糖类似物和/
或非天然骨架等)，或基本上由其组成。核酸可以是用于进行本文所述方法的任何形式(例
如线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是或可以来自：质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体、细胞、细胞核或细胞的胞质。在一些实施方式中，样品核酸来自单个染色体(例如核酸样品可获自双倍体生物样品的一个
染色体)。
互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)等)、RNA(例如信使RNA(mRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、
核糖体RNA(rRNA)、tRNA等)和/或DNA或RNA类似物(例如含碱基类似物、糖类似物和/
或非天然骨架等)，或基本上由其组成。核酸可以是用于进行本文所述方法的任何形式(例
如线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是或可以来自：质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体、细胞、细胞核或细胞的胞质。在一些实施方式中，样品核酸来自单个染色体(例如核酸样品可获自双倍体生物样品的一个
染色体)。
[0090] 在某些实施方式中，可无需加工含核酸的样品就提供样品核酸用于进行本文所述的方法。在一些实施方式中，可在加工含核酸的样品后提供样品核酸用于进行本文所述的
方法。例如，可从样品中提取、分离、纯化或扩增样品核酸。本文所用术语“分离”指从其原始环境(例如，天然产生核酸的天然环境或外源表达核酸的宿主细胞)中取得核酸，因此核
酸从其原始环境“通过人手”而改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸含有的非
核酸组分(例如蛋白质、脂质)比来源样品中的组分含量少。包含分离的样品核酸的组合物
可以是基本上分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化的”指提供的样品核酸所含的核酸种
类比衍生该样品核酸的源样品含的更少。包含样品核酸的组合物可以是基本上纯化的(例
如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其它核酸种类)。本文所用术语“扩增”指对样品中的核酸进行处理，经线性或指数扩增，产生核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列或其部分序列相同或基本上相同的扩增核酸。
方法。例如，可从样品中提取、分离、纯化或扩增样品核酸。本文所用术语“分离”指从其原始环境(例如，天然产生核酸的天然环境或外源表达核酸的宿主细胞)中取得核酸，因此核
酸从其原始环境“通过人手”而改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸含有的非
核酸组分(例如蛋白质、脂质)比来源样品中的组分含量少。包含分离的样品核酸的组合物
可以是基本上分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化的”指提供的样品核酸所含的核酸种
类比衍生该样品核酸的源样品含的更少。包含样品核酸的组合物可以是基本上纯化的(例
如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其它核酸种类)。本文所用术语“扩增”指对样品中的核酸进行处理，经线性或指数扩增，产生核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列或其部分序列相同或基本上相同的扩增核酸。
[0091] 在某些实施方式中，在提供样品核酸用于本文所述方法之前，还可通过产生核酸片段的方法处理核酸而加工样品核酸。在一些实施方式中，经片段化或切割的样品核酸可
含有约5-10,000个碱基对、约100-1,000个碱基对、约100-500个碱基对、或约10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的名义平均长度。可用本领域已知的任何合适方法产生这种片段，可由普通技术人员通过选择适当的片
段产生方法控制核酸片段的平均或名义长度。在某些实施方式中，长度较短的样品核酸可
用来分析含有很少序列变异和/或含有较大量已知核苷酸序列信息的序列。在一些实施方
式中，长度较长的样品核酸可用来分析含有较大序列变异和/或含有较少量未知核苷酸序
列信息的序列。
含有约5-10,000个碱基对、约100-1,000个碱基对、约100-500个碱基对、或约10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的名义平均长度。可用本领域已知的任何合适方法产生这种片段，可由普通技术人员通过选择适当的片
段产生方法控制核酸片段的平均或名义长度。在某些实施方式中，长度较短的样品核酸可
用来分析含有很少序列变异和/或含有较大量已知核苷酸序列信息的序列。在一些实施方
式中，长度较长的样品核酸可用来分析含有较大序列变异和/或含有较少量未知核苷酸序
列信息的序列。
[0092] 样品核酸的片段常含有重叠的核苷酸序列，这种重叠序列有利于构建先前未片段化的样品核酸或其部分的核苷酸序列。例如，一个片段可含有亚序列x和y，而另一个片段
可含有亚序列y和z，其中x、y和z是核苷酸序列，其长度可以是5个核苷酸或更长。可利
用重叠序列y来促进构建样品核酸中的x-y-z核苷酸序列。在某些实施方式中，样品核酸可
以是部分片段化的(例如得自未完成的或中止的特异性切割反应)或完全片段化的核酸。
可含有亚序列y和z，其中x、y和z是核苷酸序列，其长度可以是5个核苷酸或更长。可利
用重叠序列y来促进构建样品核酸中的x-y-z核苷酸序列。在某些实施方式中，样品核酸可
以是部分片段化的(例如得自未完成的或中止的特异性切割反应)或完全片段化的核酸。
[0093] 可用普通技术人员已知的各种方法，包括但不限于物理法、化学法和酶法，使样品核酸片段化。美国专利申请公开号20050112590(2005年5月26日公开，题为
“Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and
discovery(用于检测和发现序列变异的基于片段化的方法和系统)”，发明人为Van Den
Boom等)中描述了这些方法的例子。普通技术人员可选择某些方法来产生非特异性切割片
段或特异性切割片段。能产生非特异性切割片段样品核酸的方法的例子包括但不限于：使
样品核酸接触装置(例如使核酸通过注射器针头；采用法式加压器)而使核酸暴露于剪切
力；使样品核酸暴露于辐射(例如γ射线、x射线、紫外辐射；通过辐射强度控制片段的大
小)；在水中煮沸核酸(例如产生约500碱基对的片段)和使核酸暴露于酸性和碱性水解
过程。
“Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and
discovery(用于检测和发现序列变异的基于片段化的方法和系统)”，发明人为Van Den
Boom等)中描述了这些方法的例子。普通技术人员可选择某些方法来产生非特异性切割片
段或特异性切割片段。能产生非特异性切割片段样品核酸的方法的例子包括但不限于：使
样品核酸接触装置(例如使核酸通过注射器针头；采用法式加压器)而使核酸暴露于剪切
力；使样品核酸暴露于辐射(例如γ射线、x射线、紫外辐射；通过辐射强度控制片段的大
小)；在水中煮沸核酸(例如产生约500碱基对的片段)和使核酸暴露于酸性和碱性水解
过程。
[0094] 可使核酸接触一种或多种特异性切割剂，而特异性切割样品核酸。本文所用术语“特异性切割剂”指试剂，有时是能在一个或多个特异性位点处切割核酸的化学物质或酶。
特异性切割剂通常能根据特定位点的特定核苷酸序列进行特异性切割。
特异性切割剂通常能根据特定位点的特定核苷酸序列进行特异性切割。
[0095] 特异性酶切割剂的例子包括但不限于：内切核酸酶(例如，DNA酶(如DNase I、TM
II)；RNA酶(例如RNase E、F、H、P)；Cleavase 酶；Taq DNA聚合酶；大肠杆菌DNA聚合酶
I和真核结构特异性内切核酸酶；小鼠FEN-1内切核酸酶；I、II或III型限制性内切核酸酶
如Acc I、Afl III、Alu I、Alw44I、Apa I、Asn I、Ava I、Ava II、BamH I、Ban II、Bcl I、Bgl I.Bgl II、Bln I、Bsm I、BssH II、BstE II、Cfo I、CIa I、Dde I、Dpn I、Dra I、EcIX I、EcoR I、EcoR I、EcoR II、EcoR V、Hae II、Hae II、Hind II、Hind III、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Ksp I、Mlu I、MIuN I、Msp I、Nci I、Nco I、Nde I、Nde II、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3A I、Sca I、ScrF I、Sfi I、Sma I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Swa I、Taq I、Xba I、Xho I。)；糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II、嘧
啶水合DNA糖基化酶、FaPy-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶错配DNA糖基化酶、次黄嘌呤-DNA糖基
化酶、5-羟甲基尿嘧啶DNA糖基化酶(HmUDG)、5-羟甲基胞嘧啶DNA糖基化酶、或1，N6-亚
乙烯基-腺嘌呤DNA糖基化酶)；外切核酸酶(例如外切核酸酶III)；核酶和DNA酶。样品
核酸可用化学试剂处理、或用经修饰的核苷酸合成，可切割经修饰的核酸。在非限制性例子
中，可采用以下试剂处理样品核酸：(i)烷基化剂如甲基亚硝基脲，它能产生几种烷基化碱
基，包括可被烷基嘌呤DNA糖基化酶识别并切割的N3-甲基腺嘌呤和N3-甲基鸟嘌呤；(ii)
亚硫酸氢钠，它可造成DNA中的胞嘧啶残基脱氨形成可被尿嘧啶N-糖基化酶切割的尿嘧啶
残基；和(iii)能将鸟嘌呤转变成其氧化形式8-羟基鸟嘌呤的化学试剂，8-羟基鸟嘌呤可
被甲酰胺基嘧啶DNA N-糖基化酶切割。化学切割方法的例子包括但不限于：烷基化(例如
硫代磷酸酯修饰核酸的烷基化)；含P3′-N5′-磷酰胺酯核酸的酸不稳定性切割；以及核
酸的四氧化锇与哌啶处理。
II)；RNA酶(例如RNase E、F、H、P)；Cleavase 酶；Taq DNA聚合酶；大肠杆菌DNA聚合酶
I和真核结构特异性内切核酸酶；小鼠FEN-1内切核酸酶；I、II或III型限制性内切核酸酶
如Acc I、Afl III、Alu I、Alw44I、Apa I、Asn I、Ava I、Ava II、BamH I、Ban II、Bcl I、Bgl I.Bgl II、Bln I、Bsm I、BssH II、BstE II、Cfo I、CIa I、Dde I、Dpn I、Dra I、EcIX I、EcoR I、EcoR I、EcoR II、EcoR V、Hae II、Hae II、Hind II、Hind III、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Ksp I、Mlu I、MIuN I、Msp I、Nci I、Nco I、Nde I、Nde II、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3A I、Sca I、ScrF I、Sfi I、Sma I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Swa I、Taq I、Xba I、Xho I。)；糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II、嘧
啶水合DNA糖基化酶、FaPy-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶错配DNA糖基化酶、次黄嘌呤-DNA糖基
化酶、5-羟甲基尿嘧啶DNA糖基化酶(HmUDG)、5-羟甲基胞嘧啶DNA糖基化酶、或1，N6-亚
乙烯基-腺嘌呤DNA糖基化酶)；外切核酸酶(例如外切核酸酶III)；核酶和DNA酶。样品
核酸可用化学试剂处理、或用经修饰的核苷酸合成，可切割经修饰的核酸。在非限制性例子
中，可采用以下试剂处理样品核酸：(i)烷基化剂如甲基亚硝基脲，它能产生几种烷基化碱
基，包括可被烷基嘌呤DNA糖基化酶识别并切割的N3-甲基腺嘌呤和N3-甲基鸟嘌呤；(ii)
亚硫酸氢钠，它可造成DNA中的胞嘧啶残基脱氨形成可被尿嘧啶N-糖基化酶切割的尿嘧啶
残基；和(iii)能将鸟嘌呤转变成其氧化形式8-羟基鸟嘌呤的化学试剂，8-羟基鸟嘌呤可
被甲酰胺基嘧啶DNA N-糖基化酶切割。化学切割方法的例子包括但不限于：烷基化(例如
硫代磷酸酯修饰核酸的烷基化)；含P3′-N5′-磷酰胺酯核酸的酸不稳定性切割；以及核
酸的四氧化锇与哌啶处理。
[0096] 本文所用的术语“互补切割反应”指用不同切割试剂或者通过改变同一切割试剂的切割特异性对同一样品核酸进行切割反应，从而产生同靶核酸或参比核酸或蛋白质的不
同切割模式。在某些实施方式中，可以用一种或多种特异性切割剂(例如1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10或更多种特异性切割剂)在一个或多个反应容器中处理样品核酸(例如用各种特异
性切割剂在分开的容器中处理样品核酸)。
同切割模式。在某些实施方式中，可以用一种或多种特异性切割剂(例如1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10或更多种特异性切割剂)在一个或多个反应容器中处理样品核酸(例如用各种特异
性切割剂在分开的容器中处理样品核酸)。
[0097] 也可加工样品核酸，修饰核酸中的某些核苷酸，然后提供样品核酸用于本文所述方法。可将根据核酸中核苷酸甲基化状态而选择性修饰核酸的方法应用于样品核酸。本文
所用术语“甲基化状态”指多核苷酸序列中的某特定核苷酸是否为甲基化或未甲基化。按
照反映靶核酸分子甲基化模式修饰靶核酸分子的方法是本领域已知的，其例子参见美国专
利第5,786,146号以及美国专利公开号20030180779和20030082600。例如，核酸中的未
甲基化胞嘧啶核苷酸可通过亚硫酸氢盐处理转变成尿嘧啶，这种处理不能修饰甲基化胞嘧
啶。可用于修饰核酸中的核苷酸序列的试剂的非限制性例子包括：甲基甲烷磺酸、乙基甲烷
磺酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)、亚硝酸、二(2-氯乙基)
硫醚、二(2-氯乙基)甲胺、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羟胺、亚硫酸氢钠、肼、甲酸、亚硝酸钠和5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶。此外，高温、紫外辐射、x-射线辐射等条件可诱导核酸
分子的序列变化。
所用术语“甲基化状态”指多核苷酸序列中的某特定核苷酸是否为甲基化或未甲基化。按
照反映靶核酸分子甲基化模式修饰靶核酸分子的方法是本领域已知的，其例子参见美国专
利第5,786,146号以及美国专利公开号20030180779和20030082600。例如，核酸中的未
甲基化胞嘧啶核苷酸可通过亚硫酸氢盐处理转变成尿嘧啶，这种处理不能修饰甲基化胞嘧
啶。可用于修饰核酸中的核苷酸序列的试剂的非限制性例子包括：甲基甲烷磺酸、乙基甲烷
磺酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)、亚硝酸、二(2-氯乙基)
硫醚、二(2-氯乙基)甲胺、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羟胺、亚硫酸氢钠、肼、甲酸、亚硝酸钠和5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶。此外，高温、紫外辐射、x-射线辐射等条件可诱导核酸
分子的序列变化。
[0098] 可以任何形式提供用于进行本文所述序列分析或制备方法的样品核酸，如固体或液体形式。在某些实施方式中，可提供液体形式的样品核酸，可选包含一种或多种其它组
分，包括但不限于普通技术人员选择的一种或多种缓冲剂或盐。术语“样品”、“样品核酸”、“靶标”和“靶核酸”在本文中可互换使用。
分，包括但不限于普通技术人员选择的一种或多种缓冲剂或盐。术语“样品”、“样品核酸”、“靶标”和“靶核酸”在本文中可互换使用。
[0099] 内切核酸酶
[0100] 内切核酸酶是能切割多核苷酸链内磷酸二酯键的酶，与切割多核苷酸链末端磷酸二酯键的外切核酸酶不同。内切核酸酶的非限制性例子有限制性内切核酸酶、脱嘌呤/脱
嘧啶(AP)内切核酸酶和切口内切核酸酶。已鉴定到热稳定性或耐热性内切核酸酶，可从多
种来源商品化购得。热稳定性和耐热内切核酸酶用于本文提供的组合物和方法特别有意
义。热稳定性限制性内切核酸酶、AP内切核酸酶和切口核酸酶可用于延伸和扩增反应，在
扩增条件下使用位点特异性内切核酸酶切割可消除非目标扩增产物而提高反应特异性。在
一些实施方式中，热稳定性内切核酸酶可用来“解封”被封闭的延伸寡核苷酸，使热稳定性
DNA聚合酶得以延伸，在扩增条件下通过消除非目标引导从而产生特异性产物。在一些实
施方式中，热稳定性内切核酸酶可用来消除“引物二聚体”，其中所述寡核苷酸组合物的序
列包含有限制性内切核酸酶切割位点，该位点在形成“引物二聚体”型非目标产物时产生或
再生。在一些实施方式中，在延伸或扩增方案中可包括所述热稳定性内切核酸酶，以释放含
有捕获剂或可检测特征的片段，或区分等位基因变体。例如，可与本文所述组合物和方法联
用热稳定性T7内切核酸酶I来区分等位基因变体，该酶能切割双链DNA区中的未配对核苷
酸。这对于基因分型筛选尤为有用，因为SNP通常是可区分的只相差1个核苷酸的等位基
因变体。采用基于特定基因座SNP序列的寡核苷酸将能设计出用于扩增过程中通过切割错
配寡核苷酸序列以区分等位基因的延伸寡核苷酸，并能检测有无特定等位基因。
嘧啶(AP)内切核酸酶和切口内切核酸酶。已鉴定到热稳定性或耐热性内切核酸酶，可从多
种来源商品化购得。热稳定性和耐热内切核酸酶用于本文提供的组合物和方法特别有意
义。热稳定性限制性内切核酸酶、AP内切核酸酶和切口核酸酶可用于延伸和扩增反应，在
扩增条件下使用位点特异性内切核酸酶切割可消除非目标扩增产物而提高反应特异性。在
一些实施方式中，热稳定性内切核酸酶可用来“解封”被封闭的延伸寡核苷酸，使热稳定性
DNA聚合酶得以延伸，在扩增条件下通过消除非目标引导从而产生特异性产物。在一些实
施方式中，热稳定性内切核酸酶可用来消除“引物二聚体”，其中所述寡核苷酸组合物的序
列包含有限制性内切核酸酶切割位点，该位点在形成“引物二聚体”型非目标产物时产生或
再生。在一些实施方式中，在延伸或扩增方案中可包括所述热稳定性内切核酸酶，以释放含
有捕获剂或可检测特征的片段，或区分等位基因变体。例如，可与本文所述组合物和方法联
用热稳定性T7内切核酸酶I来区分等位基因变体，该酶能切割双链DNA区中的未配对核苷
酸。这对于基因分型筛选尤为有用，因为SNP通常是可区分的只相差1个核苷酸的等位基
因变体。采用基于特定基因座SNP序列的寡核苷酸将能设计出用于扩增过程中通过切割错
配寡核苷酸序列以区分等位基因的延伸寡核苷酸，并能检测有无特定等位基因。
[0101] 本文所用的术语“耐热”或“热耐受性”指能在中等温度(例如，50℃-60℃)下起作用但在包括一步或多步变性步骤(例如90℃-95℃)的非等温扩增条件下将丧失活性的
酶。耐热内切核酸酶指在65℃至70℃以上温度通常经较长时间孵育才失活的酶。本文所
用的术语“热稳定性”指暴露于较高温度(例如超过65℃)或例如在扩增条件下反复暴露
于较高温度之后仍具有酶活性的酶。内切核酸酶的热稳定性可用酶的耐热半衰期表示。术
语“耐热半衰期”指酶在较高温度孵育时恢复至少50％酶活性的时间长度。也即，热稳定性
内切核酸酶有时在扩增条件下其活性损失低于约50％。术语“耐热半衰期”也指酶在扩增
条件下其活性损失超过50％前所经历的循环次数。内切核酸酶的耐热半衰期常随孵育温度
而不同，与在更适度的温度(70℃)下孵育相比，通常温度越高(80℃或90℃)半衰期越短
(例如循环次数更少)。本文描述了热稳定性内切核酸酶的例子，不难筛选多种内切核酸酶
以确定它们是否具有热稳定性(例如可使测试的内切核酸一次或多次短暂暴露于较高温
度，然后评估该内切核酸酶的活性)。
酶。耐热内切核酸酶指在65℃至70℃以上温度通常经较长时间孵育才失活的酶。本文所
用的术语“热稳定性”指暴露于较高温度(例如超过65℃)或例如在扩增条件下反复暴露
于较高温度之后仍具有酶活性的酶。内切核酸酶的热稳定性可用酶的耐热半衰期表示。术
语“耐热半衰期”指酶在较高温度孵育时恢复至少50％酶活性的时间长度。也即，热稳定性
内切核酸酶有时在扩增条件下其活性损失低于约50％。术语“耐热半衰期”也指酶在扩增
条件下其活性损失超过50％前所经历的循环次数。内切核酸酶的耐热半衰期常随孵育温度
而不同，与在更适度的温度(70℃)下孵育相比，通常温度越高(80℃或90℃)半衰期越短
(例如循环次数更少)。本文描述了热稳定性内切核酸酶的例子，不难筛选多种内切核酸酶
以确定它们是否具有热稳定性(例如可使测试的内切核酸一次或多次短暂暴露于较高温
度，然后评估该内切核酸酶的活性)。
[0102] 限制性内切核酸酶(例如限制性酶)通常在特定位点切割双链DNA，该位点通常与特异性或基本特异性识别序列相关。一些限制性酶可切割单链DNA(例如切口内切核酸
酶)。在细菌和古细菌中发现的限制性酶被认为已进化而能提供对抗入侵病毒的防御机制。
在细菌宿主内，该限制性酶在称为限制性的过程中能选择性切割外来DNA；宿主DNA通过修
饰酶(甲基化酶)而甲基化以保护其免受这种限制性酶活性的破坏。本文所用术语“识别
位点”指内切核酸酶所识别并结合的特异性核苷酸序列。本文所用术语“切割位点”指这
种内切核酸酶产生单链或双链的切割位点。在一些实施方式中，识别位点可含有切割位点。
在某些实施方式中，切割位点毗邻或靠近识别位点。下文定义了术语“毗邻”和“靠近”的含义。取决于限制性酶，被识别然后切割的特定DNA序列通常长度4到8个碱基不等，但一些
识别序列较长。限制性酶切割可产生粘性末端(含有5′或3′单链突出)或钝端(无单
链突出)片段。粘性或有突出的末端常称为“粘性末端”，没有单链突出的末端常称为“钝
端”。粘性末端片段含有3’或5’突出端，能“粘”在一起，如果二末端连接即可用于克隆方法或其它分子生物学方法。钝末端片段没有突出端，但其末端仍可用于多种分子生物学方
法，包括DNA聚合酶延伸(例如引导延伸或扩增反应的羟基)。限制性酶根据其作用机制分
为三类，I型、II型和III型。
酶)。在细菌和古细菌中发现的限制性酶被认为已进化而能提供对抗入侵病毒的防御机制。
在细菌宿主内，该限制性酶在称为限制性的过程中能选择性切割外来DNA；宿主DNA通过修
饰酶(甲基化酶)而甲基化以保护其免受这种限制性酶活性的破坏。本文所用术语“识别
位点”指内切核酸酶所识别并结合的特异性核苷酸序列。本文所用术语“切割位点”指这
种内切核酸酶产生单链或双链的切割位点。在一些实施方式中，识别位点可含有切割位点。
在某些实施方式中，切割位点毗邻或靠近识别位点。下文定义了术语“毗邻”和“靠近”的含义。取决于限制性酶，被识别然后切割的特定DNA序列通常长度4到8个碱基不等，但一些
识别序列较长。限制性酶切割可产生粘性末端(含有5′或3′单链突出)或钝端(无单
链突出)片段。粘性或有突出的末端常称为“粘性末端”，没有单链突出的末端常称为“钝
端”。粘性末端片段含有3’或5’突出端，能“粘”在一起，如果二末端连接即可用于克隆方法或其它分子生物学方法。钝末端片段没有突出端，但其末端仍可用于多种分子生物学方
法，包括DNA聚合酶延伸(例如引导延伸或扩增反应的羟基)。限制性酶根据其作用机制分
为三类，I型、II型和III型。
[0103] I型酶是能在远离其识别序列处随机切割DNA的组合了限制和修饰活性的复合体多亚基酶。这些酶最初被认为是稀有的酶，根据测序的基因组分析，现在已知是常见的酶。
I型酶不产生离散的限制性片段或不同的凝胶条带模式。III型酶也是大的限制和修饰活
性组合酶。它们在其识别序列外侧切割并需要在同一DNA分子内有方向相反的两条这种序
列方能实现切割，它们极少产生完全消化的DNA。
I型酶不产生离散的限制性片段或不同的凝胶条带模式。III型酶也是大的限制和修饰活
性组合酶。它们在其识别序列外侧切割并需要在同一DNA分子内有方向相反的两条这种序
列方能实现切割，它们极少产生完全消化的DNA。
[0104] II型酶由于可购得的数量大、识别位点多样、并发现许多II型酶是耐热性或热稳定性酶而最为人们感兴趣。II型酶在靠近其识别序列或识别序列内的确定位置切割DNA。
它们产生离散的限制性片段和不同的凝胶条带模式，它们是用于实验室DNA分析和基因克
隆的唯一一类酶。II型酶不组成相关蛋白的单一家族，而是由许多不同类型不相关蛋白质
组成集合。II型酶的氨基酸序列通常彼此完全不同，事实上它们可能在进化过程中由其它
已知各个蛋白独立地产生而不是从共同祖先分化而来。
它们产生离散的限制性片段和不同的凝胶条带模式，它们是用于实验室DNA分析和基因克
隆的唯一一类酶。II型酶不组成相关蛋白的单一家族，而是由许多不同类型不相关蛋白质
组成集合。II型酶的氨基酸序列通常彼此完全不同，事实上它们可能在进化过程中由其它
已知各个蛋白独立地产生而不是从共同祖先分化而来。
[0105] 最常用的II型酶有，例如HhaI、HindIII和NotI那些在其识别序列内切割DNA的酶。这种酶是市售可得的主要品种。大多数识别对称的DNA序列，因为它们以同二聚体形
式结合DNA，但少数识别不对称DNA序列(例如BbvCI：CCTCAGC)，因为它们以异二聚体形式
结合。一些酶识别连续序列(例如EcoRI：GAATTC)，该识别序列的两个半位点相毗邻，而其
它识别半位点隔开的不连续序列(例如BglI：GCCNNNNNGGC)。此类酶切割在每次切割处的
一侧留下3′羟基而在另一侧留下5′磷酸。它们的活性仅需要镁，而相应的修饰酶仅需要
S-腺苷甲硫氨酸。它们倾向是小分子，亚基含200～350个氨基酸。
式结合DNA，但少数识别不对称DNA序列(例如BbvCI：CCTCAGC)，因为它们以异二聚体形式
结合。一些酶识别连续序列(例如EcoRI：GAATTC)，该识别序列的两个半位点相毗邻，而其
它识别半位点隔开的不连续序列(例如BglI：GCCNNNNNGGC)。此类酶切割在每次切割处的
一侧留下3′羟基而在另一侧留下5′磷酸。它们的活性仅需要镁，而相应的修饰酶仅需要
S-腺苷甲硫氨酸。它们倾向是小分子，亚基含200～350个氨基酸。
[0106] 其次最常用的II型酶，有时称为“IIs型”，是例如FokI和AlwI那些能在其识别序列外一侧切割的酶。这些酶中等大小，长400～650个氨基酸，它们识别连续而不对称的
序列。它们含有两个不同功能域，一个结合DNA，另一个切割DNA。认为它们作为单体结合
DNA，通过毗邻酶分子的切割功能域二聚体化而协同切割DNA。因此，一些类型的IIs酶对含
有多个识别位点的DNA活性高得多。
序列。它们含有两个不同功能域，一个结合DNA，另一个切割DNA。认为它们作为单体结合
DNA，通过毗邻酶分子的切割功能域二聚体化而协同切割DNA。因此，一些类型的IIs酶对含
有多个识别位点的DNA活性高得多。
[0107] 第三种主要的II型酶，更恰当地称为“IV型”酶，是限制和修饰活性的大组合体酶，长850-1250个氨基酸，其两种酶活性位于同一蛋白质链上。这些酶在其识别序列外切
割；识别连续序列的那些酶(例如，AcuI：CTGAAG)只切割一侧；识别不连续序列的那些酶
(例如BcgI：CGANNNNNNTGC)切割两侧释放含有识别序列的小片段。这些酶的氨基酸序列
不同，但它们的组成一致。它们包含与DNA修饰功能域连接的N-末端DNA切割功能域，和
一个或两个DNA序列特异性功能域形成C-末端或呈现为分开的亚基。当这些酶与其底物
结合时，它们楞切换成限制性模式而切割DNA，或切换成修饰性模式而甲基化DNA。
割；识别连续序列的那些酶(例如，AcuI：CTGAAG)只切割一侧；识别不连续序列的那些酶
(例如BcgI：CGANNNNNNTGC)切割两侧释放含有识别序列的小片段。这些酶的氨基酸序列
不同，但它们的组成一致。它们包含与DNA修饰功能域连接的N-末端DNA切割功能域，和
一个或两个DNA序列特异性功能域形成C-末端或呈现为分开的亚基。当这些酶与其底物
结合时，它们楞切换成限制性模式而切割DNA，或切换成修饰性模式而甲基化DNA。
[0108] 有用的耐热和/或热稳定性限制性内切核酸酶的非限制性例子有：Acl I、Apa LI、Ape KI、Bam HI、Bam HI-HF、Bcl I、Bgl II、Blp I、Bsa AI、Bsa XI、Bsi HKAI、Bso BI、Bsr FI、Bst BI、Bst EII、Bst NI、Bst UI、Bst Z17I、Bts CI、Cvi QI、Hpa I、Kpn I、Mwo I、Nci I、Pae R7I、Pho I、Ppu MI、Pvu II、Sfi I、Sfo I、Sml I、Tti I、Tsp 509I、Tsp MI、Tsp RI和Zra I。
[0109] 脱嘌呤/脱嘧啶(AP)内切核酸酶也能在与脱碱基位点通常相关的特定位点处切割DNA。本文所用的术语“脱碱基核酸”或“脱碱基位点”或“脱碱基寡核苷酸”指核酸链中有一个或多个核苷酸(例如，核碱基、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、或胸腺嘧啶)被除去但保留
主链完整的核酸组合物。脱碱基位点在体内通常由DNA碱基切除修复途径(BER)修复，AP
内切核酸酶是BER的一部分。AP内切核酸酶在修复DNA中受损或错配核苷酸时的主要作用
是在DNA糖基化酶去除受损碱基后在磷酸二酯主链中产生的AP位点处产生切口。根据切口
位点分类，有四类AP内切核酸酶。I类和II类AP内切核酸酶在无碱基位点的3′和5′磷
酸基团处切割DNA，留下3′-OH和5′-磷酸末端。III类和IV类AP内切核酸酶也在无碱
基位点的3′和5′磷酸基团处切割DNA，但产生3′-磷酸和5′-OH。适合于本文所述组
合物和实施方式使用的AP内切核酸酶(例如I类和II类AP内切核酸酶)能在延伸和/或
扩增条件下，产生在延伸或扩增反应中用于延伸的3’羟基(如-OH)。热稳定性AP内切核
酸酶的非限制性例子有：Tth内切核酸酶IV和源自海栖热袍菌(Thermotogoa maritime)、
火山热原体(Thermoplasm volacanium)与植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的AP
内切核酸酶。AP内切核酸酶通常只切割双链靶序列的一条链。
主链完整的核酸组合物。脱碱基位点在体内通常由DNA碱基切除修复途径(BER)修复，AP
内切核酸酶是BER的一部分。AP内切核酸酶在修复DNA中受损或错配核苷酸时的主要作用
是在DNA糖基化酶去除受损碱基后在磷酸二酯主链中产生的AP位点处产生切口。根据切口
位点分类，有四类AP内切核酸酶。I类和II类AP内切核酸酶在无碱基位点的3′和5′磷
酸基团处切割DNA，留下3′-OH和5′-磷酸末端。III类和IV类AP内切核酸酶也在无碱
基位点的3′和5′磷酸基团处切割DNA，但产生3′-磷酸和5′-OH。适合于本文所述组
合物和实施方式使用的AP内切核酸酶(例如I类和II类AP内切核酸酶)能在延伸和/或
扩增条件下，产生在延伸或扩增反应中用于延伸的3’羟基(如-OH)。热稳定性AP内切核
酸酶的非限制性例子有：Tth内切核酸酶IV和源自海栖热袍菌(Thermotogoa maritime)、
火山热原体(Thermoplasm volacanium)与植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的AP
内切核酸酶。AP内切核酸酶通常只切割双链靶序列的一条链。
[0110] 除AP内切核酸酶以外，某些序列特异性内切核酸酶只切割双链靶序列的一条链。这些内切核酸酶有时称为切口内切核酸酶。切口内切酶市售可得(NEB公司(New England
BioLabs，因特网URL neb.com))。可用于本文所述组合物和方法的切口酶的非限制性例子
有Nb.BsmI和Nb.BrsDI。有用的热稳定性内切核酸酶的其它非限制性例子有大肠杆菌内切
核酸酶V和T7内切核酸酶I。内切核酸酶V是一种修复酶，能切割含脱氧肌苷DNA(双链上
配对或未配对的，也能以较低程度切割单链)、含脱碱基位点或脲、碱基错配、插入/缺失错
配、发夹或未配对环、含襟翼(flap)和伪Y结构的DNA。T7内切核酸酶I能识别并切割匹
配不理想的DNA、十字型DNA结构、霍利迪结构或连结体、异质双链体DNA，和较慢地识别并
切割缺口双链DNA。切割位点是朝向错配5′处的第一、第二或第三磷酸二酯键。T7内切核
酸酶I也可切割线性单链DNA(特别是折返回自身的单链DNA)、小环(4-15个碱基)错排引
物和超螺旋环状DNA(由于对切割有抗性而切割较慢)。T7内切核酸酶I不切割线性双链
体DNA。
BioLabs，因特网URL neb.com))。可用于本文所述组合物和方法的切口酶的非限制性例子
有Nb.BsmI和Nb.BrsDI。有用的热稳定性内切核酸酶的其它非限制性例子有大肠杆菌内切
核酸酶V和T7内切核酸酶I。内切核酸酶V是一种修复酶，能切割含脱氧肌苷DNA(双链上
配对或未配对的，也能以较低程度切割单链)、含脱碱基位点或脲、碱基错配、插入/缺失错
配、发夹或未配对环、含襟翼(flap)和伪Y结构的DNA。T7内切核酸酶I能识别并切割匹
配不理想的DNA、十字型DNA结构、霍利迪结构或连结体、异质双链体DNA，和较慢地识别并
切割缺口双链DNA。切割位点是朝向错配5′处的第一、第二或第三磷酸二酯键。T7内切核
酸酶I也可切割线性单链DNA(特别是折返回自身的单链DNA)、小环(4-15个碱基)错排引
物和超螺旋环状DNA(由于对切割有抗性而切割较慢)。T7内切核酸酶I不切割线性双链
体DNA。
[0111] 如本文所述，可在靶核酸的一条链中掺入一个或多个抗切割的核苷酸，而导致某些切割双链靶核酸两条链的内切核酸酶只切割靶核酸的一条链。在后面的实施方式中，通
常切割两条链的内切核酸酶将不切割含有这种核苷酸类似物的链，而切割不含有这种核苷
酸类似物的链。不能被切割的核苷酸类似物的非限制性例子包括：肽核酸(PNA)、硫代磷酸
酯和锁定的核酸(例如含桥键连接2′和4′碳修饰的核糖部分)。
常切割两条链的内切核酸酶将不切割含有这种核苷酸类似物的链，而切割不含有这种核苷
酸类似物的链。不能被切割的核苷酸类似物的非限制性例子包括：肽核酸(PNA)、硫代磷酸
酯和锁定的核酸(例如含桥键连接2′和4′碳修饰的核糖部分)。
[0112] 扩增
[0113] 在一些实施方式中，可能需要用多种核酸扩增方法的任何一种扩增靶序列(下文有详细描述)。当靶序列的拷贝数低或靶序列不是宿主序列和只占样品中总核酸的一小部
分(例如在母体核酸背景中的胎儿核酸)时，核酸扩增可能特别有益。在一些实施方式中，
靶序列扩增有助于检测基因量的失衡，例如在涉及非整倍体染色体的遗传疾病中所见。
分(例如在母体核酸背景中的胎儿核酸)时，核酸扩增可能特别有益。在一些实施方式中，
靶序列扩增有助于检测基因量的失衡，例如在涉及非整倍体染色体的遗传疾病中所见。
[0114] 核酸扩增常涉及酶促合成含有与待扩增核苷酸序列相互补序列的核酸扩增子(拷贝)。特定种类的核苷酸序列(例如靶序列)的扩增产物(扩增子)在本文中称为“被
扩增的核酸种类”。因为试验开始时需要的靶序列较少，扩增靶序列和检测合成的扩增子可
提高试验的灵敏度，可改进靶序列的检测。
扩增的核酸种类”。因为试验开始时需要的靶序列较少，扩增靶序列和检测合成的扩增子可
提高试验的灵敏度，可改进靶序列的检测。
[0115] 术语“扩增”、“扩增反应”或“进行扩增”指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外过程。有时，扩增指靶核酸的“指数”递增。然而，本文所用的“进行扩增”也指选择的核酸靶序列数量的线性递增，但不同于一次单一引物的延伸步骤。在一些实施方式中，一次单一寡核苷酸延伸步骤可用于产生双链核酸(例如合成单链寡核苷酸种类中所含的限制性内
切核酸酶切割位点的互补序列，从而产生限制性位点)。
切核酸酶切割位点的互补序列，从而产生限制性位点)。
[0116] 在一些实施方式中，可进行有限的扩增反应，也称为预扩增。预扩增是一种因为进行的循环次数少，例如10轮循环而扩增量有限的方法。预扩增可有一些扩增，但在指数期
之前停止扩增，通常产生约500个拷贝的所需核苷酸序列。采用预扩增还可限制标准PCR
反应中与反应物耗尽有关的不准确性，还能降低因靶核酸的核苷酸序列或丰度引起的扩增
偏向。在一些实施方式中，可进行一次引物延伸作为线性或指数扩增的开场。在一些实施
方式中，可能由于采用了超灵敏检测方法(例如单个核苷酸测序、合成测序等)而不需要扩
增靶核酸。
之前停止扩增，通常产生约500个拷贝的所需核苷酸序列。采用预扩增还可限制标准PCR
反应中与反应物耗尽有关的不准确性，还能降低因靶核酸的核苷酸序列或丰度引起的扩增
偏向。在一些实施方式中，可进行一次引物延伸作为线性或指数扩增的开场。在一些实施
方式中，可能由于采用了超灵敏检测方法(例如单个核苷酸测序、合成测序等)而不需要扩
增靶核酸。
[0117] 当需要扩增时，可采用任何合适的扩增技术。多核苷酸扩增的非限制性例子包括：聚合酶链反应(PCR)；连接扩增(或连接酶链反应(LCR))；基于应用Q-β复制酶或模板依
赖性聚合酶的扩增方法(参见美国专利公开号US20050287592)；解旋酶依赖性等温扩增
(Vincent等，″Helicase-dependent isothermal DNA amplification(解旋酶依赖性等
温DNA扩增)″.EMBO reports 5(8)：795-800(2004))；链置换扩增(SDA)；基于嗜热SDA
核酸序列的扩增(3SR或NASBA)以及转录相关扩增(TAA)。PCR扩增方法的非限制性例子
包括：标准PCR、AFLP-PCR、等位基因特异性PCR、Alu-PCR、不对称PCR、偏向等位基因特异
性(BAS)扩增(其描述见2007年6月14日提交的PCT专利公开号WO 2007/147063A2，该
专利通过引用纳入本文)、菌落PCR、热启动PCR、反向PCR(IPCR)、原位PCR(ISH)、序列间特
异性PCR(ISSR-PCR)、长PCR、多重PCR、嵌套式PCR、定量PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时
PCR、单细胞PCR、固相PCR、通用大小特异性PCR(USS-PCR)，其描述见2008年8月28日提交
的通过引用纳入本文的PCT专利申请号WO 2009/032781，和上述方法的组合等。进行PCR
的试剂和硬件市售可得。
赖性聚合酶的扩增方法(参见美国专利公开号US20050287592)；解旋酶依赖性等温扩增
(Vincent等，″Helicase-dependent isothermal DNA amplification(解旋酶依赖性等
温DNA扩增)″.EMBO reports 5(8)：795-800(2004))；链置换扩增(SDA)；基于嗜热SDA
核酸序列的扩增(3SR或NASBA)以及转录相关扩增(TAA)。PCR扩增方法的非限制性例子
包括：标准PCR、AFLP-PCR、等位基因特异性PCR、Alu-PCR、不对称PCR、偏向等位基因特异
性(BAS)扩增(其描述见2007年6月14日提交的PCT专利公开号WO 2007/147063A2，该
专利通过引用纳入本文)、菌落PCR、热启动PCR、反向PCR(IPCR)、原位PCR(ISH)、序列间特
异性PCR(ISSR-PCR)、长PCR、多重PCR、嵌套式PCR、定量PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时
PCR、单细胞PCR、固相PCR、通用大小特异性PCR(USS-PCR)，其描述见2008年8月28日提交
的通过引用纳入本文的PCT专利申请号WO 2009/032781，和上述方法的组合等。进行PCR
的试剂和硬件市售可得。
[0118] 在一些实施方式中，可用本领域技术人员可获得的或选自以上罗列的任何适当方法(例如连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增和自身维持的序列复制或基于核酸序列的
扩增(NASBA))，来实现靶核酸扩增。也可采用近年开发的分支-DNA技术扩增靶核酸的信
号。关于分支-DNA(bDNA)信号扩增用于直接定量临床样品中核酸序列的综述参见Nolte，
Adv.Clin.Chem.33：201-235，1998。
扩增(NASBA))，来实现靶核酸扩增。也可采用近年开发的分支-DNA技术扩增靶核酸的信
号。关于分支-DNA(bDNA)信号扩增用于直接定量临床样品中核酸序列的综述参见Nolte，
Adv.Clin.Chem.33：201-235，1998。
[0119] 在某些实施方式中，也可采用数字PCR进行扩增(例如Kalinina及其同事(Kalinina等，“Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.(含TaqMan检测的纳升级
PCR)”，Nucleic Acids Research.25；1999-2004，(1997)；Vogelstein和Kinzler(Digital PCR(数字PCR)，Proc Natl Acad Sci U S A.96；9236-41，(1999)；PCT专利公开号
WO05023091A2(全文纳入本文)；美国专利公开号20070202525(全文纳入本文)。数字PCR
利用单分子水平核酸(DNA、cDNA或RNA)扩增的优势，为定量分析低拷贝数核酸提供了高度
灵敏方法。可购得用于数字扩增和核酸分析的系统(例如，Fluidigm 公司)。
PCR)”，Nucleic Acids Research.25；1999-2004，(1997)；Vogelstein和Kinzler(Digital PCR(数字PCR)，Proc Natl Acad Sci U S A.96；9236-41，(1999)；PCT专利公开号
WO05023091A2(全文纳入本文)；美国专利公开号20070202525(全文纳入本文)。数字PCR
利用单分子水平核酸(DNA、cDNA或RNA)扩增的优势，为定量分析低拷贝数核酸提供了高度
灵敏方法。可购得用于数字扩增和核酸分析的系统(例如，Fluidigm 公司)。
[0120] 在一些实施方式中，在利用RNA核酸检测胎儿序列时，可在扩增步骤前合成感兴趣RNA转录物的DNA拷贝(cDNA)。通过逆转录合成此cDNA拷贝，可以单独步骤进行逆转
录，或在均一的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)中进行，RT-PCR是扩增RNA的一种改良的
聚合酶链反应。Romero和Rotbart在Diagnostic Molecular Biology：Principles and
Applications(诊断分子生物学：原理及应用)第401-406页；Persing等编著，麦友基金
会(Mayo Foundation)，明尼苏达州洛切斯特(Rochester，Minn.)，1993；Egger等，J.Clin.Microbiol.33：1442-1447，1995；和美国专利第5,075,212号中描述了适合PCR扩增核糖
核酸的方法。
录，或在均一的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)中进行，RT-PCR是扩增RNA的一种改良的
聚合酶链反应。Romero和Rotbart在Diagnostic Molecular Biology：Principles and
Applications(诊断分子生物学：原理及应用)第401-406页；Persing等编著，麦友基金
会(Mayo Foundation)，明尼苏达州洛切斯特(Rochester，Minn.)，1993；Egger等，J.Clin.Microbiol.33：1442-1447，1995；和美国专利第5,075,212号中描述了适合PCR扩增核糖
核酸的方法。
[0121] 在本文所述方法中也可采用引物延伸反应。例如，通过区分单个核苷酸错配(例如平行进化同源序列间的错配或SNP等位基因)的核酸序列、SNP等位基因，进行引物延伸
反应。术语“平行进化同源序列”指具有共同进化起源但随时间推移可能在感兴趣基因组
中有所重复的序列。平行进化同源序列可能保留了基因结构(例如内含子和外显子的数目
和相对位置和优选转录长度)以及序列。因此，本文所述方法可用于检测SNP-等位基因中
或进化保守区中含一个或多个点突变、插入或缺失而不同的序列错配(两者在下文均称为
“错配位点”或“序列错配”)。
反应。术语“平行进化同源序列”指具有共同进化起源但随时间推移可能在感兴趣基因组
中有所重复的序列。平行进化同源序列可能保留了基因结构(例如内含子和外显子的数目
和相对位置和优选转录长度)以及序列。因此，本文所述方法可用于检测SNP-等位基因中
或进化保守区中含一个或多个点突变、插入或缺失而不同的序列错配(两者在下文均称为
“错配位点”或“序列错配”)。
[0122] 可通过在用于与SNP位点(如错配位点)毗邻区域杂交的引物的延伸引物或寡核苷酸中掺入一个或多个脱氧核苷酸和/或双脱氧核苷酸来检测这种错配。延伸寡核苷酸通
常用聚合酶延伸。在一些实施方式中，将可检测标记或可检测部分(例如生物素或链霉亲
和素)掺入到延伸寡核苷酸中，或加到延伸寡核苷酸中。可用任何已知的适当检测方法(例
如质谱；测序方法)检测延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，只需延伸这种错配位点一个
或两个用特定标记所标记的互补脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，或产生具有特定质量的引物
延伸产物，即可以区分并定量这种错配。
常用聚合酶延伸。在一些实施方式中，将可检测标记或可检测部分(例如生物素或链霉亲
和素)掺入到延伸寡核苷酸中，或加到延伸寡核苷酸中。可用任何已知的适当检测方法(例
如质谱；测序方法)检测延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，只需延伸这种错配位点一个
或两个用特定标记所标记的互补脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，或产生具有特定质量的引物
延伸产物，即可以区分并定量这种错配。
[0123] 对于采用引物延伸方法扩增靶序列的实施方式，寡核苷酸的延伸不限于一轮延伸，因此与上述“一次引物延伸”有所区别。例如，在美国专利第4,656,127；4,851,331；
5,679,524；5,834,189；5,876,934；5,908,755；5,912,118；5,976,802；5,981,186；
6,004,744；6,013,431；6,017,702；6,046,005；6,087,095；6,210,891号和WO 01/20039
中描述了适用于本文所述实施方式的引物延伸或寡核苷酸延伸方法的非限制性例子。
5,679,524；5,834,189；5,876,934；5,908,755；5,912,118；5,976,802；5,981,186；
6,004,744；6,013,431；6,017,702；6,046,005；6,087,095；6,210,891号和WO 01/20039
中描述了适用于本文所述实施方式的引物延伸或寡核苷酸延伸方法的非限制性例子。
[0124] 在此提供了扩增方法的概述。例如，本文所述使寡核苷酸与靶核酸接触，和互补序列彼此退火。寡核苷酸在感兴趣靶序列处或其附近(例如相邻、毗邻等)与核酸退火。将
含有完全酶功能所需的所有组分的反应混合物加入这种寡核苷酸-靶核酸杂交物，在适当
条件下扩增。扩增反应的组分可包括但不限于，例如多种寡核苷酸的组合物(如各种寡核
苷酸、多对寡核苷酸、多组寡核苷酸等)，多核苷酸模板(如含靶序列的核酸)，聚合酶，核苷酸，dNTP，适当的内切核酸酶等。有时，延伸条件是扩增条件的亚组或与其基本相似。
含有完全酶功能所需的所有组分的反应混合物加入这种寡核苷酸-靶核酸杂交物，在适当
条件下扩增。扩增反应的组分可包括但不限于，例如多种寡核苷酸的组合物(如各种寡核
苷酸、多对寡核苷酸、多组寡核苷酸等)，多核苷酸模板(如含靶序列的核酸)，聚合酶，核苷酸，dNTP，适当的内切核酸酶等。有时，延伸条件是扩增条件的亚组或与其基本相似。
[0125] 例如，在一些实施方式中，可采用非天然产生的核苷酸或核苷酸类似物，例如含有可检测部分或特征的类似物(例如荧光或比色标记)。例如，在一些实施方式中，可采用非
天然产生的核苷酸或核苷酸类似物，例如含有可检测部分或特征的类似物(例如荧光或比
色标记)。例如，在一些实施方式中修饰引物寡核苷酸，以有助于“热启动”PCR。公布号US
20070219361A1的美国专利申请第11/583,605号公开了修饰的引物寡核苷酸的例子。核苷
酸也可(例如)按照美国专利6,762,298所述方法修饰。
天然产生的核苷酸或核苷酸类似物，例如含有可检测部分或特征的类似物(例如荧光或比
色标记)。例如，在一些实施方式中修饰引物寡核苷酸，以有助于“热启动”PCR。公布号US
20070219361A1的美国专利申请第11/583,605号公开了修饰的引物寡核苷酸的例子。核苷
酸也可(例如)按照美国专利6,762,298所述方法修饰。
[0126] 普通技术人员可选择聚合酶，包括用于热循环的聚合酶(如Taq DNA聚合酶；TM
Q-Bio Taq DNA聚合酶(重组的缺失5’-3’外切活性的截短形式Taq DNA聚合酶)；
TM
SurePrime 聚合酶(用于“热启动”PCR的经化学修饰的Taq DNA聚合酶，参见如美国专
TM
利5677152和577258)；Arrow Taq DNA聚合酶(高灵敏度和长模板扩增)；JumpStart
TM o TM
Taq (AccuTaq LA DNA聚合酶与针对Taq的抗体的组合)，9N m DNA聚合酶(例如3’-5’
TM
外切核酸酶校正活性降低的工程改造聚合酶)，Deep VentR (无外切活性)DNA聚合酶(例
如3’-5’外切核酸酶校正活性降低的工程改造聚合酶)，Tth DNA聚合酶(例如具有5′至
3′外切核酸酶活性)，抗体介导的聚合酶如美国专利第5,338,671和5,587,287号中所述
的那些酶以及用于热稳定性扩增的聚合酶(例如互联网址URL“gen-probe.com/pdfs/tma_
whiteppr.pdf”中所述用于转录介导扩增(TMA)的RNA聚合酶)。例如，可添加其它酶组分，
如用于转录介导扩增(TMA)反应的逆转录酶。
Q-Bio Taq DNA聚合酶(重组的缺失5’-3’外切活性的截短形式Taq DNA聚合酶)；
TM
SurePrime 聚合酶(用于“热启动”PCR的经化学修饰的Taq DNA聚合酶，参见如美国专
TM
利5677152和577258)；Arrow Taq DNA聚合酶(高灵敏度和长模板扩增)；JumpStart
TM o TM
Taq (AccuTaq LA DNA聚合酶与针对Taq的抗体的组合)，9N m DNA聚合酶(例如3’-5’
TM
外切核酸酶校正活性降低的工程改造聚合酶)，Deep VentR (无外切活性)DNA聚合酶(例
如3’-5’外切核酸酶校正活性降低的工程改造聚合酶)，Tth DNA聚合酶(例如具有5′至
3′外切核酸酶活性)，抗体介导的聚合酶如美国专利第5,338,671和5,587,287号中所述
的那些酶以及用于热稳定性扩增的聚合酶(例如互联网址URL“gen-probe.com/pdfs/tma_
whiteppr.pdf”中所述用于转录介导扩增(TMA)的RNA聚合酶)。例如，可添加其它酶组分，
如用于转录介导扩增(TMA)反应的逆转录酶。
[0127] 当指核苷酸靶序列时，术语“附近”或“毗邻”指引物末端与感兴趣核苷酸之间的距离或区域。本文所用毗邻的范围约为5个核苷酸到约500个核苷酸(例如，离感兴趣核
苷酸约5个核苷酸、离感兴趣的核苷酸约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸)。
苷酸约5个核苷酸、离感兴趣的核苷酸约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500个核苷酸)。
[0128] 在一些实施方式中，各扩增的核酸长度可独立地为约10-1000个碱基对。在某些实施方式中，扩增的核酸长度为约20-250个碱基对，有时长度为约50-150个碱基对，有时
长度约为100个碱基对。因此，在一些实施方式中，每种扩增的核酸产物长度独立地约为
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、
102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、125、130、135、140、145、150、175、200、250、
300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对。
长度约为100个碱基对。因此，在一些实施方式中，每种扩增的核酸产物长度独立地约为
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、
102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、125、130、135、140、145、150、175、200、250、
300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对。
[0129] 扩增产物可包括天然产生的核苷酸、非天然产生的核苷酸、核苷酸类似物等及上述物质的组合。扩增产物常具有与靶序列或其互补体相同或基本相同的核苷酸序列。扩
增产物中“基本相同”的核苷酸序列通常与被扩增的核苷酸序列或其互补序列具有高度序
列相同性(例如，序列相同性约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％)，变异有时是因延伸和/或扩增所用聚合酶失真或扩增所用的引物中含有额外
的核苷酸序列所致。
增产物中“基本相同”的核苷酸序列通常与被扩增的核苷酸序列或其互补序列具有高度序
列相同性(例如，序列相同性约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％)，变异有时是因延伸和/或扩增所用聚合酶失真或扩增所用的引物中含有额外
的核苷酸序列所致。
[0130] PCR条件取决于引物序列、靶核酸的丰度、所需扩增量，因此本领域技术人员可从多种现有的PCR方案中选择(参见例如，美国专利第4,683,195和4,683,202号；PCR
Protocols：A Guide to Methods and Applications(《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990)。PCR通常用热稳定性酶以自动方法进行。在其过程中，反应混合物的温度在变
性期、引物退火期与延伸反应期之间自动循环。适合该目的专用机器可市售购得。适合本
文所述实施方式的PCR方案的非限制性例子为：95℃处理样品5分钟后，95℃ 1分钟、59℃
1分10秒和72℃ 1分30秒重复循环45轮；然后72℃处理样品5分钟。实施例部分描述
了其它PCR方案。通常用市售热循环仪进行多轮循环。在某些实施方式中，也可采用本领
域普通技术人员已知和选择的合适等温扩增方法。
Protocols：A Guide to Methods and Applications(《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990)。PCR通常用热稳定性酶以自动方法进行。在其过程中，反应混合物的温度在变
性期、引物退火期与延伸反应期之间自动循环。适合该目的专用机器可市售购得。适合本
文所述实施方式的PCR方案的非限制性例子为：95℃处理样品5分钟后，95℃ 1分钟、59℃
1分10秒和72℃ 1分30秒重复循环45轮；然后72℃处理样品5分钟。实施例部分描述
了其它PCR方案。通常用市售热循环仪进行多轮循环。在某些实施方式中，也可采用本领
域普通技术人员已知和选择的合适等温扩增方法。
[0131] 在一些实施方式中，可采用多重扩增方法扩增靶序列，从而在一次均匀反应中同时扩增多个扩增子。本文所用的“多重扩增”指一种PCR的变化，其中通过使用一对以上的
引物(例如一组以上的引物)实现在一个反应容器内同时扩增多个靶序列。在一些实施方
式中，多重扩增可用于分析缺失、突变与多态性或定量试验。在某些实施方式中，多重扩增
可用于需要同时分析多个标记的平行进化同源序列失衡的检测、基因分型应用，病原体或
基因修饰的生物体的检测，或微卫星分析。在一些实施方式中，多重扩增可与另一扩增(例
如PCR)方法(例如嵌套式PCR或热启动PCR)联用，以提高扩增特异性和重现性。在一些
实施方式中，多重扩增方法可用来扩增本文所述的Y染色体基因座。
引物(例如一组以上的引物)实现在一个反应容器内同时扩增多个靶序列。在一些实施方
式中，多重扩增可用于分析缺失、突变与多态性或定量试验。在某些实施方式中，多重扩增
可用于需要同时分析多个标记的平行进化同源序列失衡的检测、基因分型应用，病原体或
基因修饰的生物体的检测，或微卫星分析。在一些实施方式中，多重扩增可与另一扩增(例
如PCR)方法(例如嵌套式PCR或热启动PCR)联用，以提高扩增特异性和重现性。在一些
实施方式中，多重扩增方法可用来扩增本文所述的Y染色体基因座。
[0132] 在某些实施方式中，核酸扩增可产生不同或基本相似的核酸序列的额外核酸类型。在本文所述的某些实施方式中，可能含有与靶序列基本互补或基本相同的污染性或额
外的核酸，可用于序列定量分析，只要污染或额外序列的水平保持恒定而能作为水平可基
本重现的可靠标记物。可能影响序列扩增重现性的其它要考虑的因素有：PCR条件(循环
次数、反应体积、引物对之间解链温度的差异等)、样品中靶核酸的浓度(例如母体核酸背
景中的胎儿核酸，宿主背景中的病毒核酸)、感兴趣核苷酸种类(例如平行进化同源序列或
SNP等位基因)所处染色体的数量、所制备样品的质量差异等。本文所用术语“基本上重现
的”或“基本上可重现的”指在基本上相似条件下，在约75％或更长时间，约80％、约85％、约90％、约95％或约99％或更长时间所产生的基本上相同方式的结果(例如核酸的可定量
含量)。
外的核酸，可用于序列定量分析，只要污染或额外序列的水平保持恒定而能作为水平可基
本重现的可靠标记物。可能影响序列扩增重现性的其它要考虑的因素有：PCR条件(循环
次数、反应体积、引物对之间解链温度的差异等)、样品中靶核酸的浓度(例如母体核酸背
景中的胎儿核酸，宿主背景中的病毒核酸)、感兴趣核苷酸种类(例如平行进化同源序列或
SNP等位基因)所处染色体的数量、所制备样品的质量差异等。本文所用术语“基本上重现
的”或“基本上可重现的”指在基本上相似条件下，在约75％或更长时间，约80％、约85％、约90％、约95％或约99％或更长时间所产生的基本上相同方式的结果(例如核酸的可定量
含量)。
[0133] 在一些实施方式中，可在固相支持物上进行扩增。在一些实施方式中，引物可以与固相支持物结合。在某些实施方式中，靶核酸(例如模板核酸或靶序列)可以与固相支持
物结合。与固相支持物结合的核酸(引物或靶核酸)通常称为固相核酸。
物结合。与固相支持物结合的核酸(引物或靶核酸)通常称为固相核酸。
[0134] 在一些实施方式中，将提供的用于扩增的核酸分子装在“微反应器”中。本文所用的术语“微反应器”指分隔空间，其中核酸分子可与固相支持物核酸分子杂交。微反应器的
例子包括但不限于乳液小球(下文有述)和基材中的空穴。在某些实施方式中，基材中的
空穴可以是用于容纳液体的固体材料(例如塑料如聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯)或硅)构成
的基材中的坑、洞或孔(例如微米孔、纳米孔、皮米孔、微米洞或纳米洞。乳液小球被下文详述的不混溶相所分隔。在一些实施方式中，微反应器的容积足够大可容纳一个固相支持物
(例如小珠)，又容积足够小而排斥微反应器中存在两个或多个固相支持物。
例子包括但不限于乳液小球(下文有述)和基材中的空穴。在某些实施方式中，基材中的
空穴可以是用于容纳液体的固体材料(例如塑料如聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯)或硅)构成
的基材中的坑、洞或孔(例如微米孔、纳米孔、皮米孔、微米洞或纳米洞。乳液小球被下文详述的不混溶相所分隔。在一些实施方式中，微反应器的容积足够大可容纳一个固相支持物
(例如小珠)，又容积足够小而排斥微反应器中存在两个或多个固相支持物。
[0135] 本文所用术语“乳液“指两种不混溶和不可混溶物质的混合物，通常其中一种物质(分散相)分散在另一物质(连续相)中。在某些实施方式中，分散相可以是水性溶液(即
含水溶液)。在一些实施方式中，分散相主要由水组成(例如以重量计，水含量超过70％、
超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过97％、超过98％和超过99％)。
分散相的各离散部分，如含水分散相，在此称为“小球”或“微反应器”。在某些实施方式中，小球形状有时可以是球形、基本上球形或半球形。
含水溶液)。在一些实施方式中，分散相主要由水组成(例如以重量计，水含量超过70％、
超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过97％、超过98％和超过99％)。
分散相的各离散部分，如含水分散相，在此称为“小球”或“微反应器”。在某些实施方式中，小球形状有时可以是球形、基本上球形或半球形。
[0136] 本文所用的术语“乳液装置”和“乳液组分”指可用于制备乳液的装置和组分。适合本领域普通技术人员制备乳液所用的乳液装置的非限制性例子包括但不限于：逆流、错流、转鼓和膜装置。在某些实施方式中，乳液组分形成乳液的连续相，包含但不限于与水不混溶
的物质，如含油或基本上由油组成的组分(例如热稳定、生物相容性油如轻质矿物油)。生
物相容性乳液稳定剂可用作乳液组分。乳液稳定剂包括但不限于Atlox 4912、司盘80和其
它生物相容性表面活性剂。
的物质，如含油或基本上由油组成的组分(例如热稳定、生物相容性油如轻质矿物油)。生
物相容性乳液稳定剂可用作乳液组分。乳液稳定剂包括但不限于Atlox 4912、司盘80和其
它生物相容性表面活性剂。
[0137] 在一些实施方式中，分散相中可包含用于生物反应的组分。乳液小球可包含(i)固相支持物单元(例如，一粒珠或一个颗粒)；(ii)样品核酸分子；和(iii)足够量的延伸
试剂以延伸固相核酸并扩增该延伸的固相核酸(如延伸核苷酸、聚合酶、引物)。在一些实
施方式中，如下文实施例部分所述，用于生物反应的组分中可包括内切核酸酶和内切核酸
酶功能必需的组分。乳液中的无活性小球可包含这些组分的亚组(例如固相支持物和延
伸试剂与非样品核酸)，一些小球可以是空的(即一些小球将不包含固相支持物，无样品核
酸，和无延伸试剂)。
试剂以延伸固相核酸并扩增该延伸的固相核酸(如延伸核苷酸、聚合酶、引物)。在一些实
施方式中，如下文实施例部分所述，用于生物反应的组分中可包括内切核酸酶和内切核酸
酶功能必需的组分。乳液中的无活性小球可包含这些组分的亚组(例如固相支持物和延
伸试剂与非样品核酸)，一些小球可以是空的(即一些小球将不包含固相支持物，无样品核
酸，和无延伸试剂)。
[0138] 可采用已知的合适方法制备乳液(例如，Nakano等，“Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion；(采用油包水乳液的单分子PCR)”Journal of Biotechnology102(2003)117-124)。乳化方法包括但不限于：佐剂方法、逆流方法、错流方法、转鼓方法、膜方法等。在某些实施方式中，制备含有固相支持物的含水反应混合物(见下文中“反应混合
物”)然后将其加入生物相容性油中。在某些实施方式中，可将此反应混合物滴加到生物相
容性油(例如轻质矿物油(西格玛公司(Sigma))的旋转混合液中使之乳化。在一些实施
方式中，可将此反应混合放滴加到横流的生物相容性油中。例如，可通过改变流速和各组分
彼此加入的速度调整乳液中含水小球的大小。
物”)然后将其加入生物相容性油中。在某些实施方式中，可将此反应混合物滴加到生物相
容性油(例如轻质矿物油(西格玛公司(Sigma))的旋转混合液中使之乳化。在一些实施
方式中，可将此反应混合放滴加到横流的生物相容性油中。例如，可通过改变流速和各组分
彼此加入的速度调整乳液中含水小球的大小。
[0139] 在某些实施方式中，普通技术人员可根据以下两项竞争因素选择乳液小球的大小：(i)小球够大以包含一个固相支持物分子、一个样品核酸分子、和延伸和扩增所需的足
量延伸试剂；和(ii)小球足够小以便可用常规实验室设备(例如热循环设备、试管、培养
箱等)扩增小球群。在某些实施方式中，乳液中小球的名义平均直径可为约5-500微米、约
10-350微米、约50-250微米、约100-200微米、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500微米。
量延伸试剂；和(ii)小球足够小以便可用常规实验室设备(例如热循环设备、试管、培养
箱等)扩增小球群。在某些实施方式中，乳液中小球的名义平均直径可为约5-500微米、约
10-350微米、约50-250微米、约100-200微米、或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500微米。
[0140] 在某些实施方式中，组内的待扩增核酸长度相同，有时组内的待扩增核酸长度不同。例如，一种待扩增核酸的长度可能比组内其它一种或多种待扩增核酸长约1-100个核
苷酸(例如，长约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、
70、80或90个核苷酸)。
苷酸(例如，长约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、
70、80或90个核苷酸)。
[0141] 在一些实施方式中，可确定组内一种待扩增核酸的含量与该组内另一种待扩增核酸含量的比例(下文为“组内比例”)。在一些实施方式中，组内一种待扩增核酸的含量与该
组内另一种待扩增核酸的含量大约相等(即组内扩增核酸的含量约为1∶1)，这通常发生
在样品中携带各种待扩增核苷酸序列的染色体数或代表该核酸的DNA含量大约相等的情
况下。本文所用的关于待扩增核酸种类的术语“含量”指任何合适的度量，包括但不限于，
拷贝数、重量(例如克)和浓度(例如每单位体积(如毫升)所含克数；摩尔单位)。在一
些实施方式中，胎儿核酸对母体核酸(或相反，母体核酸对胎儿核酸)的比例可与错配序列
比例的测定相结合，用于测定可能与性染色体相关的染色体异常。即样品中在母体核酸背
景中测得的胎儿核酸百分比，或胎儿对母体核酸的比例，可用于检测非整倍体染色体。
组内另一种待扩增核酸的含量大约相等(即组内扩增核酸的含量约为1∶1)，这通常发生
在样品中携带各种待扩增核苷酸序列的染色体数或代表该核酸的DNA含量大约相等的情
况下。本文所用的关于待扩增核酸种类的术语“含量”指任何合适的度量，包括但不限于，
拷贝数、重量(例如克)和浓度(例如每单位体积(如毫升)所含克数；摩尔单位)。在一
些实施方式中，胎儿核酸对母体核酸(或相反，母体核酸对胎儿核酸)的比例可与错配序列
比例的测定相结合，用于测定可能与性染色体相关的染色体异常。即样品中在母体核酸背
景中测得的胎儿核酸百分比，或胎儿对母体核酸的比例，可用于检测非整倍体染色体。
[0142] 在某些实施方式中，组内一种待扩增核酸的含量可能不同于组内另一种待扩增核酸的含量，即使样品中携带各种待扩增核苷酸序列的染色体数量大致相等。在一些实施方
式中，组内待扩增核酸种类的含量可能浮动，最多可达能以约95％(例如，约90、91、92、93、
94、95、96、97、98、99或大于99％)置信度检测染色体异常的阈值水平。在某些实施方式中，组内待扩增核酸种类的含量浮动约50％或更低(例如，不同约45、40、35、30、25、20、15、10、
5、4、3、2或1％，或低于1％)。因此，在某些实施方式中，组内待扩增核酸种类的含量浮动，可以是约1∶1至1∶1.5比例。不想受理论的束缚，某些因素可能导致观察到组内一种
待扩增核酸的含量不同于组内另一种待扩增核酸的含量，即使样品中携带的各种待扩增核
苷酸序列的染色体数量大约相等。这些因素可能包括扩增效率不同和/或实验设计中未顾
及染色体的扩增。
式中，组内待扩增核酸种类的含量可能浮动，最多可达能以约95％(例如，约90、91、92、93、
94、95、96、97、98、99或大于99％)置信度检测染色体异常的阈值水平。在某些实施方式中，组内待扩增核酸种类的含量浮动约50％或更低(例如，不同约45、40、35、30、25、20、15、10、
5、4、3、2或1％，或低于1％)。因此，在某些实施方式中，组内待扩增核酸种类的含量浮动，可以是约1∶1至1∶1.5比例。不想受理论的束缚，某些因素可能导致观察到组内一种
待扩增核酸的含量不同于组内另一种待扩增核酸的含量，即使样品中携带的各种待扩增核
苷酸序列的染色体数量大约相等。这些因素可能包括扩增效率不同和/或实验设计中未顾
及染色体的扩增。
[0143] 在以基本可重现水平扩增各种核酸的条件下，扩增组内各种待扩增的核酸。本文所用的术语“基本可重现水平”指对于每单位模板核酸(例如含有待扩增的特定种类核苷
酸序列的每单位模板核酸)所含的待扩增的特定种类核酸具有一致的扩增水平。在某些实
施方式中，在考虑引起特定种类核酸扩增的模板核酸含量(例如对模板核酸含量标准化)
后，这种基本可重现水平的差异约为1％或更低。在一些实施方式中，在考虑引起特定种类
核酸扩增的模板核酸含量后，这种基本可重现水平的差异为5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、
0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。
酸序列的每单位模板核酸)所含的待扩增的特定种类核酸具有一致的扩增水平。在某些实
施方式中，在考虑引起特定种类核酸扩增的模板核酸含量(例如对模板核酸含量标准化)
后，这种基本可重现水平的差异约为1％或更低。在一些实施方式中，在考虑引起特定种类
核酸扩增的模板核酸含量后，这种基本可重现水平的差异为5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、
0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。
[0144] 在一些实施方式中，可在一个反应容器内实现多组本文所述寡核苷酸组合物的核酸扩增(例如扩增的靶序列)。在一些实施方式中，可在单个反应容器内进行错配序列的扩
增。在某些实施方式中，可通过一对或一组寡核苷酸扩增错配序列(在相同或不同染色体
上的错配序列)。在一些实施方式中，可通过一对或一组寡核苷酸扩增靶序列。在一些实施
方式中，可通过两对或多对寡核苷酸扩增一组靶序列。在一些实施方式中，可采用一对或一
组寡核苷酸扩增靶核酸的亚序列。在一些实施方式中，可采用两对或多对寡核苷酸扩增靶
核酸的亚序列。
增。在某些实施方式中，可通过一对或一组寡核苷酸扩增错配序列(在相同或不同染色体
上的错配序列)。在一些实施方式中，可通过一对或一组寡核苷酸扩增靶序列。在一些实施
方式中，可通过两对或多对寡核苷酸扩增一组靶序列。在一些实施方式中，可采用一对或一
组寡核苷酸扩增靶核酸的亚序列。在一些实施方式中，可采用两对或多对寡核苷酸扩增靶
核酸的亚序列。
[0145] 寡核苷酸
[0146] 本文所述的寡核苷酸可用于靶核酸的扩增、检测、定量和测序。这种寡核苷酸组合物可包含一种或多种寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸可与侧接靶区域的序列或附
近(如毗邻)处互补、并特异性杂交或退火。在一些实施方式中，按组使用本文所述的寡核
苷酸，一组含至少一对寡核苷酸。在一些实施方式中，一组寡核苷酸可包含第三或第四核酸
(例如两对寡核苷酸或多个寡核苷酸嵌套组)。在某些实施方式中，由多对寡核苷酸构成一
组引物(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、
85、90、95或100对)。在一些实施方式中，可采用多组寡核苷酸，每组含一对(或多对)引
物。
近(如毗邻)处互补、并特异性杂交或退火。在一些实施方式中，按组使用本文所述的寡核
苷酸，一组含至少一对寡核苷酸。在一些实施方式中，一组寡核苷酸可包含第三或第四核酸
(例如两对寡核苷酸或多个寡核苷酸嵌套组)。在某些实施方式中，由多对寡核苷酸构成一
组引物(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、
85、90、95或100对)。在一些实施方式中，可采用多组寡核苷酸，每组含一对(或多对)引
物。
[0147] 本文所用的术语“寡核苷酸种类”指其包含的核苷酸序列能与靶核酸在特定感兴趣区域或附近(如毗邻)杂交或退火的核酸。本文所用的术语“PCR寡核苷酸”指(例如)
可用于聚合酶链反应(PCR)扩增靶核苷酸序列的寡核苷酸。在某些实施方式中，用于扩增
编码靶核酸的核苷酸序列的至少一种PCR寡核苷酸可以是序列特异性的寡核苷酸。在一些
实施方式中，可修饰本文所述的寡核苷酸(例如加入通用的引物序列)以提高多重性。
可用于聚合酶链反应(PCR)扩增靶核苷酸序列的寡核苷酸。在某些实施方式中，用于扩增
编码靶核酸的核苷酸序列的至少一种PCR寡核苷酸可以是序列特异性的寡核苷酸。在一些
实施方式中，可修饰本文所述的寡核苷酸(例如加入通用的引物序列)以提高多重性。
[0148] 例如，本文所述的寡核苷酸允许特异性测定靶核酸的核苷酸序列或检测靶核酸序列(例如有无某序列或测定某序列的拷贝数)或其特征。在某些实施方式中，本文所述的
寡核苷酸也可用于检测扩增产物或延伸产物。本文所述的寡核苷酸组合物及使用方法可最
大程度减少或消除人为的假延伸和/或扩增产物(例如“引物二聚体”和PCR热循环过程
中退火和延伸温度转换期导致的非目标产物)，在核酸延伸或扩增的试验中有时可能产生
这种假产物。本文所述的寡核苷酸中包含有用于某些方法(单试管试验、多重试验等)的
热稳定性内切核酸酶的内切核酸酶切割位点，本文还描述了组合杂交、切割和延伸或扩增
的条件，而能鉴定和/或扩增特异性靶核酸。
寡核苷酸也可用于检测扩增产物或延伸产物。本文所述的寡核苷酸组合物及使用方法可最
大程度减少或消除人为的假延伸和/或扩增产物(例如“引物二聚体”和PCR热循环过程
中退火和延伸温度转换期导致的非目标产物)，在核酸延伸或扩增的试验中有时可能产生
这种假产物。本文所述的寡核苷酸中包含有用于某些方法(单试管试验、多重试验等)的
热稳定性内切核酸酶的内切核酸酶切割位点，本文还描述了组合杂交、切割和延伸或扩增
的条件，而能鉴定和/或扩增特异性靶核酸。
[0149] 本文所述的寡核苷酸通常是合成的寡核苷酸，但在以下实施方式中，也可采用结构和/或功能相似的天然产生的核酸序列。本文所述关于核酸的术语“特异”、“特异地”或“特异性”指一个分子与另一分子，例如靶多核苷酸序列的引物的结合或杂交。即，“特异”、“特异地”或“特异性”指两个分子之间的识别、接触和形成稳定的复合物，相比之下这两个分子中任一分子与其它分子的识别、接触或形成复合物显著较差。本文所用的术语“退火”
指两个分子之间形成稳定的复合物。当指引物时，术语“寡核苷酸”、“寡核苷酸组合物”、“引物”、“寡”、或“寡核苷酸”在本文中可互换使用。
指两个分子之间形成稳定的复合物。当指引物时，术语“寡核苷酸”、“寡核苷酸组合物”、“引物”、“寡”、或“寡核苷酸”在本文中可互换使用。
[0150] 可修饰本文所述的寡核苷酸。例如，可修饰这种寡核苷酸减少其长度和/或提高其特异性。在一些实施方式中，可将一种或多种双链体稳定剂(例如小沟结合剂、亚精胺或
吖啶)掺入到寡核苷酸中。在美国专利5,801,155；6,127,121；6,312,894与6,426,408中
进一步描述了小沟结合剂。
吖啶)掺入到寡核苷酸中。在美国专利5,801,155；6,127,121；6,312,894与6,426,408中
进一步描述了小沟结合剂。
[0151] 可采用合适方法设计并合成本文所述的寡核苷酸，它们可以是适合与感兴趣核苷酸序列(例如，核酸在液相或结合于固相支持物)杂交并进行本文所述分析方法的任何长
度。可根据靶核苷酸序列设计本文所述种类的寡核苷酸。
度。可根据靶核苷酸序列设计本文所述种类的寡核苷酸。
[0152] 本文所用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”各指核酸，可以是任何合适的长度。在一些实施方式中，寡核苷酸或多核苷酸可以长约10-100个核苷酸、约10-70个核苷酸、约10-50个核苷酸、约15-30个核苷酸、或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸或多核苷酸长约18-27个核苷酸。寡核苷酸可包含天然产生和/或非天然产生
的核苷酸(例如带标记核苷酸)或其混合物。适用于本文所述方法实施方式的寡核苷酸可
采用已知技术合成并标记。寡核苷酸和多核苷酸(例如引物)可按固相亚磷酰胺三酯法化
学合成，该方法首先由Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letts.22：1859-1862(1981)
中描述，例如按Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984中所述
用自动合成仪化学合成。寡核苷酸的纯化可通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高
效液相色谱(HPLC)实现，例如，如Pearson和Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中所
述。例如，可按互联网址URL glenresearch.com//GlenReports/GR14-13.html合成含脱碱
基AP内切核酸酶切割位点的寡核苷酸。
20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸或多核苷酸长约18-27个核苷酸。寡核苷酸可包含天然产生和/或非天然产生
的核苷酸(例如带标记核苷酸)或其混合物。适用于本文所述方法实施方式的寡核苷酸可
采用已知技术合成并标记。寡核苷酸和多核苷酸(例如引物)可按固相亚磷酰胺三酯法化
学合成，该方法首先由Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letts.22：1859-1862(1981)
中描述，例如按Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984中所述
用自动合成仪化学合成。寡核苷酸的纯化可通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高
效液相色谱(HPLC)实现，例如，如Pearson和Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中所
述。例如，可按互联网址URL glenresearch.com//GlenReports/GR14-13.html合成含脱碱
基AP内切核酸酶切割位点的寡核苷酸。
[0153] 在一些实施方式中，寡核苷酸的核酸序列(天然产生或合成)的全部或一部分可与靶核酸序列基本互补。本文所述的“基本互补”序列指能够彼此杂交的核苷酸序列。可
改变杂交条件的严谨程度而容许存在不同含量的序列错配。包括对应序列、靶序列和捕获
核苷酸序列区域之间55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或者99％或更高的互补。
改变杂交条件的严谨程度而容许存在不同含量的序列错配。包括对应序列、靶序列和捕获
核苷酸序列区域之间55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或者99％或更高的互补。
[0154] 核苷酸组合物所含的与靶核酸序列基本互补的亚序列也与靶核酸序列的互补序列基本上相同。即，引物可与所述核酸的反义链基本相同。本文所述“基本相同”的序列指
核苷酸序列彼此的相同性为55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更
高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或者99％或更高。确定两个核苷酸序列之间是否基本相同的一种试验是测定共享的相同核苷酸序列的百分比。
核苷酸序列彼此的相同性为55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更
高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或者99％或更高。确定两个核苷酸序列之间是否基本相同的一种试验是测定共享的相同核苷酸序列的百分比。
[0155] 寡核苷酸序列的种类和长度可能影响与靶核酸序列的杂交。根据寡核苷酸种类与靶核酸之间的错配程度，可采用低、中、高严谨条件实现寡核苷酸/靶核酸的退火。本文
所用术语“严谨条件”指杂交和洗涤的条件。杂交反应温度条件的优化方法是本领域技术
人员已知的，可参见纽约约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons，N.Y.)出版的Current
Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)中6.3.1-6.3.6部分
(1989年)。该文献中描述的水性和非水性方法均可采用。严谨杂交条件的非限制性例子
是：约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后50℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤
一次或多次。严谨杂交条件的另一个例子是：约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂
交，然后55℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严谨杂交条件的又一个例子是：约
45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后60℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或
多次。常用的严谨杂交条件是：约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后65℃用
0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。更常用的严谨条件是65℃在0.5M磷酸钠、7％SDS
中杂交，然后65℃用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。也可加入某些有机溶剂如甲酰胺
来改变(即降低)严谨杂交温度。有机溶剂如甲酰胺能降低双链多核苷酸的热稳定性，使
得可在较低的温度下进行杂交而仍能保持严谨条件并延长可能不耐热的核酸的使用寿命。
所用术语“严谨条件”指杂交和洗涤的条件。杂交反应温度条件的优化方法是本领域技术
人员已知的，可参见纽约约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons，N.Y.)出版的Current
Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)中6.3.1-6.3.6部分
(1989年)。该文献中描述的水性和非水性方法均可采用。严谨杂交条件的非限制性例子
是：约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后50℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤
一次或多次。严谨杂交条件的另一个例子是：约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂
交，然后55℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严谨杂交条件的又一个例子是：约
45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后60℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或
多次。常用的严谨杂交条件是：约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后65℃用
0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。更常用的严谨条件是65℃在0.5M磷酸钠、7％SDS
中杂交，然后65℃用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。也可加入某些有机溶剂如甲酰胺
来改变(即降低)严谨杂交温度。有机溶剂如甲酰胺能降低双链多核苷酸的热稳定性，使
得可在较低的温度下进行杂交而仍能保持严谨条件并延长可能不耐热的核酸的使用寿命。
[0156] 在采用本文所述的延伸或扩增方法的实施方式中，“严谨条件”也指完整的寡核苷酸能与靶核酸退火，但寡核苷酸的一种或多种切割片段不能与靶核酸退火的条件(如完整
的寡核苷酸在65℃退火而一种或多种片段在50℃退火)。在一些实施方式中，用于本文所
述延伸和/或扩增方法的“严谨条件”为：与杂交条件、切割条件、延伸条件、扩增条件或其组合的亚组基本上相似，或包括其亚组的条件。
的寡核苷酸在65℃退火而一种或多种片段在50℃退火)。在一些实施方式中，用于本文所
述延伸和/或扩增方法的“严谨条件”为：与杂交条件、切割条件、延伸条件、扩增条件或其组合的亚组基本上相似，或包括其亚组的条件。
[0157] 本文所用的短语“杂交”或其语法变体指在低、中、高严谨条件或在核酸合成条件下第一核酸分子与第二核酸分子结合。杂交包括第一核酸分子与第二核酸分子结合的情
况，其中第一与第二核酸分子互补。本文所用的“特异性杂交”指在核酸合成条件下，与不
含互补序列核酸分子的杂交相比，寡核苷酸优先与含有其互补序列的核酸分子杂交。例如，
特异杂交包括寡核苷酸与含有其至少一部分序列互补的靶核酸序列杂交。
况，其中第一与第二核酸分子互补。本文所用的“特异性杂交”指在核酸合成条件下，与不
含互补序列核酸分子的杂交相比，寡核苷酸优先与含有其互补序列的核酸分子杂交。例如，
特异杂交包括寡核苷酸与含有其至少一部分序列互补的靶核酸序列杂交。
[0158] 在一些实施方式中，寡核苷酸可包含与固相核酸寡核苷酸杂交序列互补，或与固相核酸引物杂交序列基本互补的核苷酸亚序列(例如，排列比对时与引物杂交互补序列的
相同性约为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)。寡核苷酸可含有与固相核酸寡核苷酸杂交序列不互补或基本上不互补的核苷酸亚序列(例如
在与固相寡核苷酸杂交序列互补或基本上互补的寡核苷酸中的所述核苷酸亚序列的3’或
5’端)。
相同性约为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)。寡核苷酸可含有与固相核酸寡核苷酸杂交序列不互补或基本上不互补的核苷酸亚序列(例如
在与固相寡核苷酸杂交序列互补或基本上互补的寡核苷酸中的所述核苷酸亚序列的3’或
5’端)。
[0159] 在某些实施方式中，寡核苷酸可含有可检测特征、部分、分子或实体(例如荧光团、放射性同位素、比色剂、颗粒、酶等)。在一些实施方式中，可检测特征可以是捕获剂或封闭剂。在一些实施方式中，各种寡核苷酸可含有封闭部分。在一些实施方式中，第一寡核
苷酸的封闭部分不同于第二寡核苷酸的封闭部分。封闭剂的非限制性例子包括：磷酸基、巯
基、硫代磷酸酯基、氨基修饰剂、生物素、生物素-TEG、胆固醇基-TEG、地高辛NHS酯、巯基修饰剂C3 S-S(二硫键)、反转dT、C3间隔子等。在一些实施方式中，可将一种以上封闭基团
掺入到寡核苷酸中的一个以上内切核酸酶切割位点处或其附近，以使所述寡核苷酸能依次
解除封闭而多轮延伸。
苷酸的封闭部分不同于第二寡核苷酸的封闭部分。封闭剂的非限制性例子包括：磷酸基、巯
基、硫代磷酸酯基、氨基修饰剂、生物素、生物素-TEG、胆固醇基-TEG、地高辛NHS酯、巯基修饰剂C3 S-S(二硫键)、反转dT、C3间隔子等。在一些实施方式中，可将一种以上封闭基团
掺入到寡核苷酸中的一个以上内切核酸酶切割位点处或其附近，以使所述寡核苷酸能依次
解除封闭而多轮延伸。
[0160] 在需要时，可用本领域技术人员已知的任何方法修饰核酸，以包含可检测特征或封闭部分。所述特征可作为合成的一部分而掺入，或在本文所述的任何过程中利用所述寡
核苷酸之前加入。可在液相中或者固相上进行可检测特征的掺入。在一些实施方式中，可利
用这种可检测特征检测靶核酸。在一些实施方式中，可利用这种可检测特征定量分析靶核
酸(例如，测定特定序列或核酸种类的拷贝数)。本领域可适当选择并利用适合检测某系统
中相互作用或者生物学活性的任何可检测特征。可检测特征的例子有：荧光标记如荧光素、
罗丹明其它(例如Anantha等，Biochemistry(1998)37：2709 2714；Qu和Chaires，Methods
Enzymol.(2000)321：353 369)；放射性同位素(例如125I、131I、35S、31P、32P、33P、14C、
3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd 和 127Xe)；光散射标记(例如美国专利第6,214,560号、以及加州杰尼康科学公司(Genicon Sciences
Corporation)的市售产品)；化学发光标记和酶底物(例如二氧杂环丁烷和吖啶酯)；酶或
蛋白质标记(例如绿荧光蛋白(GFP)、或其颜色变体、荧光素酶、过氧化物酶)；其它生色标
记或染料(例如菁)、和其它辅因子或生物分子如地高辛、链霉亲和素、生物素(例如结合对
的成员如生物素和亲和素)、亲和捕获部分、3’封端剂(例如磷酸基、巯基、硫代磷酸酯基、氨基修饰剂、生物素、生物素-TEG、胆固醇基-TEG、地高辛NHS酯、巯基修饰剂C3 S-S(二硫
键)、反转dT，C3间隔子)等。在一些实施方式中，可用亲和捕获部分标记所述寡核苷酸。
可检测特征中还包括用于质量修饰以便用质谱(例如基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)
质谱和电喷雾(ES)质谱)检测的那些标记。
核苷酸之前加入。可在液相中或者固相上进行可检测特征的掺入。在一些实施方式中，可利
用这种可检测特征检测靶核酸。在一些实施方式中，可利用这种可检测特征定量分析靶核
酸(例如，测定特定序列或核酸种类的拷贝数)。本领域可适当选择并利用适合检测某系统
中相互作用或者生物学活性的任何可检测特征。可检测特征的例子有：荧光标记如荧光素、
罗丹明其它(例如Anantha等，Biochemistry(1998)37：2709 2714；Qu和Chaires，Methods
Enzymol.(2000)321：353 369)；放射性同位素(例如125I、131I、35S、31P、32P、33P、14C、
3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd 和 127Xe)；光散射标记(例如美国专利第6,214,560号、以及加州杰尼康科学公司(Genicon Sciences
Corporation)的市售产品)；化学发光标记和酶底物(例如二氧杂环丁烷和吖啶酯)；酶或
蛋白质标记(例如绿荧光蛋白(GFP)、或其颜色变体、荧光素酶、过氧化物酶)；其它生色标
记或染料(例如菁)、和其它辅因子或生物分子如地高辛、链霉亲和素、生物素(例如结合对
的成员如生物素和亲和素)、亲和捕获部分、3’封端剂(例如磷酸基、巯基、硫代磷酸酯基、氨基修饰剂、生物素、生物素-TEG、胆固醇基-TEG、地高辛NHS酯、巯基修饰剂C3 S-S(二硫
键)、反转dT，C3间隔子)等。在一些实施方式中，可用亲和捕获部分标记所述寡核苷酸。
可检测特征中还包括用于质量修饰以便用质谱(例如基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)
质谱和电喷雾(ES)质谱)检测的那些标记。
[0161] 寡核苷酸也指能与靶核酸的亚序列或另外一种寡核苷酸杂交的多核苷酸序列，以促进寡核苷酸、靶核酸或两者、和扩增产物或延伸产物的检测，例如用分子信标检测。本文
所用的术语“分子信标”指可检测的分子，这类分子的可检测特征或性质仅在某些特定条件
下方可检测，从而使其能起到特异性信号和报告信号的作用。可检测特征的非限制性例子
有：光学性质、电学性质、磁力性质、化学性质和通过已知大小开口的时间和速度。
所用的术语“分子信标”指可检测的分子，这类分子的可检测特征或性质仅在某些特定条件
下方可检测，从而使其能起到特异性信号和报告信号的作用。可检测特征的非限制性例子
有：光学性质、电学性质、磁力性质、化学性质和通过已知大小开口的时间和速度。
[0162] 在一些实施方式中，分子信标可以是能形成茎环结构的单链寡核苷酸，其中的环序列与感兴趣的靶核酸序列互补并侧接能形成茎的互补短臂。所述寡核苷酸可在一端用荧
光团标记，在另一端用淬灭分子标记。在茎环构象中，受激发荧光团的能量转移给淬灭分
子，通过与荧光共振能量转移或FRET中所见相似的长范围偶极-偶极耦合，释放热而非光。
当该环序列与特定靶序列杂交时，此分子的两端分开，荧光团受能量激发而发射光，产生可
检测信号。分子信标可提供额外的优点，由于未杂交探针的自身淬灭性质而无需去除过量
探针。在一些实施方式中，设计的分子信标探针可通过调节环-靶杂交和茎形成的相对强
度而能区分或容忍所述环与靶序列之间的错配。本文所用的术语“错配核苷酸”或“错配”
指核苷酸与靶序列在该位置或多个位置不互补。探针可含有至少一个错配，但也可含有2、
3、4、5、6或7个或更多个错配核苷酸。
光团标记，在另一端用淬灭分子标记。在茎环构象中，受激发荧光团的能量转移给淬灭分
子，通过与荧光共振能量转移或FRET中所见相似的长范围偶极-偶极耦合，释放热而非光。
当该环序列与特定靶序列杂交时，此分子的两端分开，荧光团受能量激发而发射光，产生可
检测信号。分子信标可提供额外的优点，由于未杂交探针的自身淬灭性质而无需去除过量
探针。在一些实施方式中，设计的分子信标探针可通过调节环-靶杂交和茎形成的相对强
度而能区分或容忍所述环与靶序列之间的错配。本文所用的术语“错配核苷酸”或“错配”
指核苷酸与靶序列在该位置或多个位置不互补。探针可含有至少一个错配，但也可含有2、
3、4、5、6或7个或更多个错配核苷酸。
[0163] 在一些实施方式中，本文所述种类的寡核苷酸可含有能形成茎环结构的内部亚序列，这种茎环序列与模板DNA的任何序列不互补。此种内部结构的Tm太低而不能形成茎环
结构，除非通过与模板(例如分子信标的反义序列)5’和3’端退火而使两侧并到一起。
结构，除非通过与模板(例如分子信标的反义序列)5’和3’端退火而使两侧并到一起。
[0164] 在某些实施方式中，可将组合物中的寡核苷酸设计成能与特定的靶核酸等位基因特异性杂交。例如，组合物可包含仅相差一个碱基对的两种寡核苷酸(例如，一种寡核苷酸
的某位置为腺嘌呤，另一种的相同位置为胞嘧啶)，从而分别与在相同位置上分别含有胸腺
嘧啶或鸟嘌呤的两个等位基因中的各自碱基特异性杂交。这类寡核苷酸组合物可用于检测
核酸组合物中的特定单个核苷酸多态性变体。在一些实施方式中，所述寡核苷酸中的变体
核苷酸位于各寡核苷酸的中部或中部附近。
的某位置为腺嘌呤，另一种的相同位置为胞嘧啶)，从而分别与在相同位置上分别含有胸腺
嘧啶或鸟嘌呤的两个等位基因中的各自碱基特异性杂交。这类寡核苷酸组合物可用于检测
核酸组合物中的特定单个核苷酸多态性变体。在一些实施方式中，所述寡核苷酸中的变体
核苷酸位于各寡核苷酸的中部或中部附近。
[0165] 检测
[0166] 可用合适的检测方法检测上文制备的多核苷酸序列所产生的、扩增的核酸物质(例如扩增子或扩增产物)、可检测产物(例如延伸产物、切割产物、切割片段)和多态
性的可检测特征(例如质量、信号发射、序列)。检测、定量、测序等方法的非限制性例子
有：质量改变扩增子的质量检测(如基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)质谱和电喷雾
TM
(ES)质谱)、引物延伸方法(如iPLEX ；塞昆纳姆股份有限公司(Sequenom，Inc.))、微
测序方法(如改良的引物延伸方法)、连接酶序列测定方法(如美国专利第5,679,524与
5,952,174号和WO 01/27326)、错配序列测定方法(如美国专利第5,851,770；5,958,692；
6,110,684；6,183,958号)、直接DNA测序、限制性片段长度多态性(RFLP分析)、等位
基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特异性PCR(MSPCR)、焦磷酸测序分析、无环引
物(acycloprime)分析、逆向斑点印迹、GeneChip芯片微阵列、动态等位基因特异性杂交
(DASH)、肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)探针、TaqMan、分子信标(Molecular Beacon)、
嵌入染料、FRET引物、AlphaScreen、SNPstream、遗传位分析(genetic bit analysis，
GBA)、多重迷你测序、SNaPshot、GOOD试验、微阵列迷你测序(Microarray miniseq)、阵列
引物延伸(APEX)、微阵列引物延伸(如微阵列序列测定方法)、标记阵列(Tag array)、
编码微球(Coded microsphere)、模板引导的掺入(TDI)、荧光极化、比色寡核苷酸连接试
验(OLA)、序列编码的OLA、微阵列连接、连接酶链反应、挂锁探针(Padlockprobe)、侵入者
试验(Invader assay)、杂交方法(如采用至少一种探针杂交、采用至少一种荧光标记探
针杂交等)、常规斑点印迹分析、单链构象多态性分析(SSCP，如美国专利第5,891,625与
6,013,499号；Orita等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86：27776-2770(1989))、变性梯度凝
胶电泳(DGGE)、异质双链体分析、错配切割检测以及Sheffield等，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 49：699-706(1991)、White等，Genomics 12：301-306(1992)、Grompe等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 86：5855-5892(1989) 和 Grompe，Nature Genetics 5：111-117(1993) 中
所述的技术、克隆与测序、电泳、采用杂交探针与定量实时聚合酶链反应(QRT-PCR)、数字
PCR、纳米孔测序、芯片及它们的组合。还有，可利用扩增产物与嵌入剂(例如不对称花青染
料，如SYBR Green试剂)的接触并检测嵌入剂的含量(如检测嵌入剂随时间的变化)以
检测其中产生的扩增产物和切割产物。可采用2007年12月4日提交的美国专利申请第
11/950,395号中所述的“封闭试管”方法进行等位基因或平行进化同源序列的检测和定量。
在一些实施方式中，通过质谱、引物延伸、测序(例如任何合适方法，如纳米孔或焦磷酸测
序)、定量PCR(Q-PCR或QRT-PCR)、数字PCR、它们的组合等，确定各种扩增核酸的含量。
性的可检测特征(例如质量、信号发射、序列)。检测、定量、测序等方法的非限制性例子
有：质量改变扩增子的质量检测(如基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)质谱和电喷雾
TM
(ES)质谱)、引物延伸方法(如iPLEX ；塞昆纳姆股份有限公司(Sequenom，Inc.))、微
测序方法(如改良的引物延伸方法)、连接酶序列测定方法(如美国专利第5,679,524与
5,952,174号和WO 01/27326)、错配序列测定方法(如美国专利第5,851,770；5,958,692；
6,110,684；6,183,958号)、直接DNA测序、限制性片段长度多态性(RFLP分析)、等位
基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特异性PCR(MSPCR)、焦磷酸测序分析、无环引
物(acycloprime)分析、逆向斑点印迹、GeneChip芯片微阵列、动态等位基因特异性杂交
(DASH)、肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)探针、TaqMan、分子信标(Molecular Beacon)、
嵌入染料、FRET引物、AlphaScreen、SNPstream、遗传位分析(genetic bit analysis，
GBA)、多重迷你测序、SNaPshot、GOOD试验、微阵列迷你测序(Microarray miniseq)、阵列
引物延伸(APEX)、微阵列引物延伸(如微阵列序列测定方法)、标记阵列(Tag array)、
编码微球(Coded microsphere)、模板引导的掺入(TDI)、荧光极化、比色寡核苷酸连接试
验(OLA)、序列编码的OLA、微阵列连接、连接酶链反应、挂锁探针(Padlockprobe)、侵入者
试验(Invader assay)、杂交方法(如采用至少一种探针杂交、采用至少一种荧光标记探
针杂交等)、常规斑点印迹分析、单链构象多态性分析(SSCP，如美国专利第5,891,625与
6,013,499号；Orita等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86：27776-2770(1989))、变性梯度凝
胶电泳(DGGE)、异质双链体分析、错配切割检测以及Sheffield等，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 49：699-706(1991)、White等，Genomics 12：301-306(1992)、Grompe等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 86：5855-5892(1989) 和 Grompe，Nature Genetics 5：111-117(1993) 中
所述的技术、克隆与测序、电泳、采用杂交探针与定量实时聚合酶链反应(QRT-PCR)、数字
PCR、纳米孔测序、芯片及它们的组合。还有，可利用扩增产物与嵌入剂(例如不对称花青染
料，如SYBR Green试剂)的接触并检测嵌入剂的含量(如检测嵌入剂随时间的变化)以
检测其中产生的扩增产物和切割产物。可采用2007年12月4日提交的美国专利申请第
11/950,395号中所述的“封闭试管”方法进行等位基因或平行进化同源序列的检测和定量。
在一些实施方式中，通过质谱、引物延伸、测序(例如任何合适方法，如纳米孔或焦磷酸测
序)、定量PCR(Q-PCR或QRT-PCR)、数字PCR、它们的组合等，确定各种扩增核酸的含量。
[0167] 除以上罗列的检测方法外，也可采用以下检测方法来检测扩增的核酸种类(如靶序列)。在一些实施方式中，可采用任何合适的核酸测序方法直接测定扩增的核酸序列。可
用于本文所述方法的核酸测序方法的非限制性例子有：焦磷酸测序、基于纳米孔的测序方
法(如合成测序)、连接测序、杂交测序、微测序(基于引物延伸的多态性检测)和常规核苷
酸测序(如采用常规方法的双脱氧测序)。
用于本文所述方法的核酸测序方法的非限制性例子有：焦磷酸测序、基于纳米孔的测序方
法(如合成测序)、连接测序、杂交测序、微测序(基于引物延伸的多态性检测)和常规核苷
酸测序(如采用常规方法的双脱氧测序)。
[0168] 在一些实施方式中，可克隆扩增的序列然后作序列分析。即，用本领域技术人员已知的任何方法将扩增的核酸连接入核酸克隆载体中。在一些实施方式中，可通过在寡核苷
酸亚序列中包含独特的限制性位点进行扩增核酸的克隆，该位点可用来产生片段，所述片
段侧接有可用于克隆入恰当制得载体的限制性位点。在某些实施方式中，可采用钝端克隆
将扩增的核酸克隆入恰当制得的克隆载体中。扩增核酸的克隆可用于感兴趣靶序列的进一
步操作、修饰、保存和分析。在一些实施方式中，可将所述寡核苷酸组合物设计成与SNP位
点重叠以便用等位基因特异性PCR分析。等位基因特异性PCR可用来区分核酸组合物内的
核酸(例如从母体样品中分离的胎儿靶核酸)，因为只有正确杂交的引物方能被扩增。在一
些实施方式中，可通过杂交(例如采用序列特异性探针的液相或固相杂交)进一步分析扩
增的核酸种类。
酸亚序列中包含独特的限制性位点进行扩增核酸的克隆，该位点可用来产生片段，所述片
段侧接有可用于克隆入恰当制得载体的限制性位点。在某些实施方式中，可采用钝端克隆
将扩增的核酸克隆入恰当制得的克隆载体中。扩增核酸的克隆可用于感兴趣靶序列的进一
步操作、修饰、保存和分析。在一些实施方式中，可将所述寡核苷酸组合物设计成与SNP位
点重叠以便用等位基因特异性PCR分析。等位基因特异性PCR可用来区分核酸组合物内的
核酸(例如从母体样品中分离的胎儿靶核酸)，因为只有正确杂交的引物方能被扩增。在一
些实施方式中，可通过杂交(例如采用序列特异性探针的液相或固相杂交)进一步分析扩
增的核酸种类。
[0169] 扩增的核酸(包括逆转录得到的扩增核酸)可以是经修饰的核酸。逆转录的核酸也可以是经修饰的核酸。经修饰的核酸可包含核苷酸类似物，在某些实施方式中，可包含可
检测特征和/或捕获剂(如下文列举的生物分子或结合对的成员)。在一些实施方式中，所
述可检测特征和捕获剂可以是相同部分。在一些实施方式中，可通过检测可检测特征或“信
号产生部分”来检测修饰的核酸。本文所用的术语“信号产生”(部分)指能提供可检测或
可定量效应并能与核酸结合的任何原子或分子。在某些实施方式中，可检测特征可产生独
特的光信号、荧光信号、发光信号、电性质、化学性质、磁学性质等。
检测特征和/或捕获剂(如下文列举的生物分子或结合对的成员)。在一些实施方式中，所
述可检测特征和捕获剂可以是相同部分。在一些实施方式中，可通过检测可检测特征或“信
号产生部分”来检测修饰的核酸。本文所用的术语“信号产生”(部分)指能提供可检测或
可定量效应并能与核酸结合的任何原子或分子。在某些实施方式中，可检测特征可产生独
特的光信号、荧光信号、发光信号、电性质、化学性质、磁学性质等。
[0170] 可检测特征包括但不限于：核苷酸(带标记或不带标记)、复合体(compomer)、糖、肽、蛋白、抗体、化学化合物、导电聚合物、结合分子如生物素、质量标记(mass tag)、比色剂、发光剂、化学发光剂、光散射剂、荧光标记、放射性标记、负荷标记(荷电或磁)、挥发标记和疏水标记、生物分子(如抗体/抗原、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A
或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、
维生素B12/内因子(intrinsic factor)、化学反应基团/互补化学反应基团(如巯基/马
来酰亚胺、巯基/卤化乙酰衍生物、胺/异硫氰酸、胺/琥珀酰亚胺酯和胺/磺酰卤化物)
等结合对的成员)，下文对其中一些有进一步描述。在一些实施方式中，探针或所述寡核苷
酸可含有信号产生部分，该部分能与靶核酸杂交而改变靶核酸通过纳米孔的通道，在通过
纳米孔时从靶核酸上释放产生信号(例如改变通过已知大小的孔的速度或时间信号)。
或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、
维生素B12/内因子(intrinsic factor)、化学反应基团/互补化学反应基团(如巯基/马
来酰亚胺、巯基/卤化乙酰衍生物、胺/异硫氰酸、胺/琥珀酰亚胺酯和胺/磺酰卤化物)
等结合对的成员)，下文对其中一些有进一步描述。在一些实施方式中，探针或所述寡核苷
酸可含有信号产生部分，该部分能与靶核酸杂交而改变靶核酸通过纳米孔的通道，在通过
纳米孔时从靶核酸上释放产生信号(例如改变通过已知大小的孔的速度或时间信号)。
[0171] 可进一步加工扩增过程产生的含扩增子的溶液或延伸过程产生的含延伸产物的溶液。例如，可使溶液接触试剂，除去未掺入扩增子或延伸产物中的游离核苷酸的磷酸部
分。这种试剂的一个例子是磷酸酶(如碱性磷酸酶)。扩增子和延伸产物也可通过与固相
结合，接触能去除末端磷酸的试剂(如接触磷酸酶)，接触能去除末端核苷酸的试剂(如外
切核酸酶)，接触能切割的试剂(如内切核酸酶、核糖核酸酶)等而被洗掉。
分。这种试剂的一个例子是磷酸酶(如碱性磷酸酶)。扩增子和延伸产物也可通过与固相
结合，接触能去除末端磷酸的试剂(如接触磷酸酶)，接触能去除末端核苷酸的试剂(如外
切核酸酶)，接触能切割的试剂(如内切核酸酶、核糖核酸酶)等而被洗掉。
[0172] 本文所用术语“固相支持物”或“固相”指核酸能与之结合的不溶性材料。用于本文所述方法的固相支持物的例子包括但不限于：阵列、珠(如顺磁珠、磁性珠、微米珠、纳米珠)和颗粒(如微米颗粒、纳米颗粒)。可采用名义平均直径为约1纳米-500微米的颗
粒或珠，例如名义平均直径为约10纳米-100微米、约100纳米-100微米；约1-100微米；
约10-50微米；约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、
200、300、400、500、600、700、800或900纳米；或约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500微米的那些颗粒或珠。
粒或珠，例如名义平均直径为约10纳米-100微米、约100纳米-100微米；约1-100微米；
约10-50微米；约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、
200、300、400、500、600、700、800或900纳米；或约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500微米的那些颗粒或珠。
[0173] 固相支持物可包括基本上任何不溶性或固体材料，通常选用不溶于水的固相支持物组合物。例如，固相支持物可包括硅胶、玻璃(如可控孔径玻璃(controlled-pore
glass，CPG))、尼龙、Sephadex Sepharose 纤维素、金属表面(如钢、金、银、铝、硅和
铜)、磁性材料、塑料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF))等，或基
本由其组成。珠或颗粒可以是可溶胀的(例如聚合物珠如王氏树脂)或不可溶胀的(如
CPG)。可市售购得的珠例子包括但不限于：王氏树脂珠、梅氏树脂(Merrifield resin)珠
和Dynabeads 与SoluLink珠。
glass，CPG))、尼龙、Sephadex Sepharose 纤维素、金属表面(如钢、金、银、铝、硅和
铜)、磁性材料、塑料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF))等，或基
本由其组成。珠或颗粒可以是可溶胀的(例如聚合物珠如王氏树脂)或不可溶胀的(如
CPG)。可市售购得的珠例子包括但不限于：王氏树脂珠、梅氏树脂(Merrifield resin)珠
和Dynabeads 与SoluLink珠。
[0174] 可提供位于集合的固相支持物中的固相支持物。集合的固相支持物包含两种或多种不同种类的固相支持物。本文所用的术语“固相支持物种类”指与一种特定的固相核酸或
者不同种类固相核酸的特定组合物相结合的固相支持物。在某些实施方式中，固相支持物
的集合包含2种到10,000种固相支持物、10种到1,000种固相支持物，或者约2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、
500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种独特的固相支持物。位于固相支持物集合中的固相支持物(例如珠粒)可以是均一材料(例
如都是王氏树脂珠)或非均一材料(例如一些为王氏树脂珠，一些为磁珠)。固相支持物集
合中的各种固相支持物有时标记有特异性识别标记。用于特定种类固相支持物的识别标记
有时是核酸(如“固相核酸”)，在某些实施方式中所述核酸具有独特的序列。识别标记可
以是可检测的能与其它种类固相支持物上的识别标记区分的任何分子。
者不同种类固相核酸的特定组合物相结合的固相支持物。在某些实施方式中，固相支持物
的集合包含2种到10,000种固相支持物、10种到1,000种固相支持物，或者约2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、
500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种独特的固相支持物。位于固相支持物集合中的固相支持物(例如珠粒)可以是均一材料(例
如都是王氏树脂珠)或非均一材料(例如一些为王氏树脂珠，一些为磁珠)。固相支持物集
合中的各种固相支持物有时标记有特异性识别标记。用于特定种类固相支持物的识别标记
有时是核酸(如“固相核酸”)，在某些实施方式中所述核酸具有独特的序列。识别标记可
以是可检测的能与其它种类固相支持物上的识别标记区分的任何分子。
[0175] 质谱是检测核酸(如，PCR扩增子、引物延伸产物、从靶核酸切下的检测探针)的一种特别有效的方法。通过比较检测信号的质量与靶核酸的预期质量，可验证靶核酸的存
在。特定靶核酸的相对信号强度，例如质谱上的质量峰可表明靶核酸在其它核酸中的相对
集合，从而能从所得数据直接计算出靶核酸与其它核酸或序列的比例或拷贝数。对采用
TM
Sequenom 标准iPLEX 试验和MassARRAY 技术进行基因分型方法的综述参见Jurinke，
C.，Oeth，P.，van den Boom，D.，MALDI-TOF mass spectrometry：a versatile tool for high-performance DNA analysis(MALDI-TOF质谱：一种万能的高性能DNA分析工具)，
TM
Mol.Biotechnol.26，147-164(2004)；Oeth，P. 等，iPLEX Assay：Increased Plexing
Efficiency and Flexibility for MassARRAY System through single base primer
TM
extension with mass-modified Terminators(iPLEX 试验：通过单碱基引物延伸和质
量修饰终止子提高的质谱分析 体系的多路复用效率和灵活性)，SEQUENOM Application
Note(塞昆纳姆应用备忘)(2005)。对采用可切割检测探针检测和定量靶核酸(如本文所
述寡核苷酸组合物)的综述参见2007年12月4日递交的、通过引用纳入本文的美国专利
申请第11/950,395号，所述探针在扩增过程中被切下用质谱检测。可调整这些方法以便用
本文所述的寡核苷酸组合物和方法检测染色体异常。
在。特定靶核酸的相对信号强度，例如质谱上的质量峰可表明靶核酸在其它核酸中的相对
集合，从而能从所得数据直接计算出靶核酸与其它核酸或序列的比例或拷贝数。对采用
TM
Sequenom 标准iPLEX 试验和MassARRAY 技术进行基因分型方法的综述参见Jurinke，
C.，Oeth，P.，van den Boom，D.，MALDI-TOF mass spectrometry：a versatile tool for high-performance DNA analysis(MALDI-TOF质谱：一种万能的高性能DNA分析工具)，
TM
Mol.Biotechnol.26，147-164(2004)；Oeth，P. 等，iPLEX Assay：Increased Plexing
Efficiency and Flexibility for MassARRAY System through single base primer
TM
extension with mass-modified Terminators(iPLEX 试验：通过单碱基引物延伸和质
量修饰终止子提高的质谱分析 体系的多路复用效率和灵活性)，SEQUENOM Application
Note(塞昆纳姆应用备忘)(2005)。对采用可切割检测探针检测和定量靶核酸(如本文所
述寡核苷酸组合物)的综述参见2007年12月4日递交的、通过引用纳入本文的美国专利
申请第11/950,395号，所述探针在扩增过程中被切下用质谱检测。可调整这些方法以便用
本文所述的寡核苷酸组合物和方法检测染色体异常。
[0176] 在一些实施方式中，可如下检测扩增的核酸种类：(a)使扩增的核酸(如扩增子)接触延伸寡核苷酸组合物(如检测或寡核苷酸检测器或引物)，(b)制备延伸的延伸寡核
苷酸组合物，和(c)通过分析延伸的受检寡核苷酸组合物(如延伸寡核苷酸或检测延伸产
物)，测定一种或多种错配核苷酸的相对含量(如SNP等位基因或平行进化同源物序列之
间存在的SNP)。在某些实施方式中，可用质谱分析一种或多种错配核苷酸。在一些实施方
式中，采用本文所述方法的扩增可产生约1-100组扩增子，约2-80组扩增子，约4-60组扩
增子，约6-40组扩增子，和约8-20组扩增子(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100组扩增子)。
苷酸组合物，和(c)通过分析延伸的受检寡核苷酸组合物(如延伸寡核苷酸或检测延伸产
物)，测定一种或多种错配核苷酸的相对含量(如SNP等位基因或平行进化同源物序列之
间存在的SNP)。在某些实施方式中，可用质谱分析一种或多种错配核苷酸。在一些实施方
式中，采用本文所述方法的扩增可产生约1-100组扩增子，约2-80组扩增子，约4-60组扩
增子，约6-40组扩增子，和约8-20组扩增子(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100组扩增子)。
[0177] 本文提供了采用质谱检测多组扩增子(如多组扩增产物)的实施例。使扩增子在杂交条件下接触(在溶液中或在固相上)一组寡核苷酸(用于扩增的同种寡核苷酸组
合物，或代表寡核酸或靶核酸中亚序列的不同寡核苷酸)，其中：(1)当溶液中存在某扩增
子时，该组内各寡核苷酸包含能在杂交条件下与该扩增子特异性杂交的杂交序列，(2)该组
内各寡核苷酸包含位于所述杂交序列5′的可区分标记，(3)检测一种寡核苷酸的可区分
标记的特征不同于该组内其它寡核苷酸可区分标记的特征；(4)各可区分的标记特异性对
应于特定的扩增子因此特异性对应于特定的靶核酸。使杂交的扩增子和“受检”的寡核苷
酸经受核苷酸合成条件，让受检寡核苷酸延伸一个或多个核苷酸(标记有可检测实体或部
分，或不带标记)，所述一个或多个核苷酸之一可以是终止核苷酸。在一些实施方式中，加
入到所述寡核苷酸中的一个或多个核苷酸可含有捕获剂。在杂交发生于溶液中的实施方式
中，可能需要将寡核酸/扩增子捕获到固相支持物上。可检测部分或实体可以从延伸的受
检寡核苷酸组合物中释放，检测到这种部分可确定感兴趣核苷酸序列的存在、不存在、拷贝
数，或一些实施方式中可提供关于反应状态的信息。在某些实施方式中，所述延伸可进行一
次产生一种延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述延伸可进行多次(例如在扩增条件
下)产生多个拷贝的延伸寡核苷酸。在一些实施方式中，进行多次延伸产生足够数量的拷
贝，以便以95％或更高的置信度(如置信度95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或
更高、99％或更高、或置信度为99.5％或更高)解读代表特定序列拷贝数的信号。在一些实
施方式中，可用检测多组扩增子的方法来检测延伸产物。
合物，或代表寡核酸或靶核酸中亚序列的不同寡核苷酸)，其中：(1)当溶液中存在某扩增
子时，该组内各寡核苷酸包含能在杂交条件下与该扩增子特异性杂交的杂交序列，(2)该组
内各寡核苷酸包含位于所述杂交序列5′的可区分标记，(3)检测一种寡核苷酸的可区分
标记的特征不同于该组内其它寡核苷酸可区分标记的特征；(4)各可区分的标记特异性对
应于特定的扩增子因此特异性对应于特定的靶核酸。使杂交的扩增子和“受检”的寡核苷
酸经受核苷酸合成条件，让受检寡核苷酸延伸一个或多个核苷酸(标记有可检测实体或部
分，或不带标记)，所述一个或多个核苷酸之一可以是终止核苷酸。在一些实施方式中，加
入到所述寡核苷酸中的一个或多个核苷酸可含有捕获剂。在杂交发生于溶液中的实施方式
中，可能需要将寡核酸/扩增子捕获到固相支持物上。可检测部分或实体可以从延伸的受
检寡核苷酸组合物中释放，检测到这种部分可确定感兴趣核苷酸序列的存在、不存在、拷贝
数，或一些实施方式中可提供关于反应状态的信息。在某些实施方式中，所述延伸可进行一
次产生一种延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述延伸可进行多次(例如在扩增条件
下)产生多个拷贝的延伸寡核苷酸。在一些实施方式中，进行多次延伸产生足够数量的拷
贝，以便以95％或更高的置信度(如置信度95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或
更高、99％或更高、或置信度为99.5％或更高)解读代表特定序列拷贝数的信号。在一些实
施方式中，可用检测多组扩增子的方法来检测延伸产物。
[0178] 本文提供的方法能高通量检测多种核酸中的核酸种类(例如上面所述的产生的核苷酸序列种类、扩增的核酸和可检测产物)。多重反应指同时扩增一种以上核酸和/或检
测其是否存在。已知可与质谱联合进行多重反应的通用方法(参见美国专利第6,043,031、
5,547,835号与国际PCT申请WO 97/37041)。与每种靶核酸必须个别进行质谱分析相比，
多重反应提供的优点是能在少至一次质谱中鉴定多种核酸(例如含不同序列差异的一些
核酸)。在一些实施方式中，本文提供的方法能以高通量、高度自动化过程，高速和高准确地分析序列差异。在某些实施方式中，本文的方法可在一次反应中高水平地进行多重反应。
测其是否存在。已知可与质谱联合进行多重反应的通用方法(参见美国专利第6,043,031、
5,547,835号与国际PCT申请WO 97/37041)。与每种靶核酸必须个别进行质谱分析相比，
多重反应提供的优点是能在少至一次质谱中鉴定多种核酸(例如含不同序列差异的一些
核酸)。在一些实施方式中，本文提供的方法能以高通量、高度自动化过程，高速和高准确地分析序列差异。在某些实施方式中，本文的方法可在一次反应中高水平地进行多重反应。
[0179] 微阵列可能适合与本文所述寡核苷酸组合物和方法的实施方式联用。可用微阵列来测定核酸样品中有无多态性变体。微阵列可包含本文所述的任何寡核苷酸组合物，美国
专 利 5,492,806；5,525,464；5,589,330；5,695,940；5,849,483；6,018,041；6,045,996；
6,136,541；6,142,681；6,156,501；6,197,506；6,223,127；6,225,625；6,229,911；
6,239,273；WO 00/52625；WO 01/25485；和WO 01/29259中公开了适合预后应用的寡核苷
酸微阵列的制备和使用方法。这种微阵列通常包含固相支持物，寡核苷酸可通过共价键或
非共价相互作用与该固相支持物相连接。所述寡核苷酸也可直接或通过接头分子与固相支
持物相连接。微阵列可包含与多态性靶核酸位点互补的一种或多种寡核苷酸。微阵列可与
本文所述多重方案联用。
专 利 5,492,806；5,525,464；5,589,330；5,695,940；5,849,483；6,018,041；6,045,996；
6,136,541；6,142,681；6,156,501；6,197,506；6,223,127；6,225,625；6,229,911；
6,239,273；WO 00/52625；WO 01/25485；和WO 01/29259中公开了适合预后应用的寡核苷
酸微阵列的制备和使用方法。这种微阵列通常包含固相支持物，寡核苷酸可通过共价键或
非共价相互作用与该固相支持物相连接。所述寡核苷酸也可直接或通过接头分子与固相支
持物相连接。微阵列可包含与多态性靶核酸位点互补的一种或多种寡核苷酸。微阵列可与
本文所述多重方案联用。
[0180] 在某些实施方式中，进行多重反应的核酸种类数量包括但不限于，约1-500种(例如， 约 1-3、3-5、5-7、7-9、9-11、11-13、13-15、15-17、17-19、19-21、21-23、23-25、25-27、
27-29、29-31、31-33、33-35、35-37、37-39、39-41、41-43、43-45、45-47、47-49、49-51、
51-53、53-55、55-57、57-59、59-61、61-63、63-65、65-67、67-69、69-71、71-73、73-75、
75-77、77-79、79-81、81-83、83-85、85-87、87-89、89-91、91-93、93-95、95-97、97-101、
101-103、103-105、105-107、107-109、109-111、111-113、113-115、115-117、117-119、
121-123、123-125、125-127、127-129、129-131、131-133、133-135、135-137、137-139、
139-141、141-143、143-145、145-147、147-149、149-151、151-153、153-155、155-157、
157-159、159-161、161-163、163-165、165-167、167-169、169-171、171-173、173-175、
175-177、177-179、179-181、181-183、183-185、185-187、187-189、189-191、191-193、
193-195、195-197、197-199、199-201、201-203、203-205、205-207、207-209、209-211、
211-213、213-215、215-217、217-219、219-221、221-223、223-225、225-227、227-229、
229-231、231-233、233-235、235-237、237-239、239-241、241-243、243-245、245-247、
247-249、249-251、251-253、253-255、255-257、257-259、259-261、261-263、263-265、
265-267、267-269、269-271、271-273、273-275、275-277、277-279、279-281、281-283、
283-285、285-287、287-289、289-291、291-293、293-295、295-297、297-299、299-301、
301-303、303-305、305-307、307-309、309-311、311-313、313-315、315-317、317-319、
319-321、321-323、323-325、325-327、327-329、329-331、331-333、333-335、335-337、
337-339、339-341、341-343、343-345、345-347、347-349、349-351、351-353、353-355、
355-357、357-359、359-361、361-363、363-365、365-367、367-369、369-371、371-373、
373-375、375-377、377-379、379-381、381-383、383-385、385-387、387-389、389-391、
391-393、393-395、395-397、397-401、401-403、403-405、405-407、407-409、409-411、
411-413、413-415、415-417、417-419、419-421、421-423、423-425、425-427、427-429、
429-431、431-433、433-435、435-437、437-439、439-441、441-443、443-445、445-447、
447-449、449-451、451-453、453-455、455-457、457-459、459-461、461-463、463-465、
465-467、467-469、469-471、471-473、473-475、475-477、477-479、479-481、481-483、
483-485、485-487、487-489、489-491、491-493、493-495、495-497、497-501种)。
27-29、29-31、31-33、33-35、35-37、37-39、39-41、41-43、43-45、45-47、47-49、49-51、
51-53、53-55、55-57、57-59、59-61、61-63、63-65、65-67、67-69、69-71、71-73、73-75、
75-77、77-79、79-81、81-83、83-85、85-87、87-89、89-91、91-93、93-95、95-97、97-101、
101-103、103-105、105-107、107-109、109-111、111-113、113-115、115-117、117-119、
121-123、123-125、125-127、127-129、129-131、131-133、133-135、135-137、137-139、
139-141、141-143、143-145、145-147、147-149、149-151、151-153、153-155、155-157、
157-159、159-161、161-163、163-165、165-167、167-169、169-171、171-173、173-175、
175-177、177-179、179-181、181-183、183-185、185-187、187-189、189-191、191-193、
193-195、195-197、197-199、199-201、201-203、203-205、205-207、207-209、209-211、
211-213、213-215、215-217、217-219、219-221、221-223、223-225、225-227、227-229、
229-231、231-233、233-235、235-237、237-239、239-241、241-243、243-245、245-247、
247-249、249-251、251-253、253-255、255-257、257-259、259-261、261-263、263-265、
265-267、267-269、269-271、271-273、273-275、275-277、277-279、279-281、281-283、
283-285、285-287、287-289、289-291、291-293、293-295、295-297、297-299、299-301、
301-303、303-305、305-307、307-309、309-311、311-313、313-315、315-317、317-319、
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337-339、339-341、341-343、343-345、345-347、347-349、349-351、351-353、353-355、
355-357、357-359、359-361、361-363、363-365、365-367、367-369、369-371、371-373、
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429-431、431-433、433-435、435-437、437-439、439-441、441-443、443-445、445-447、
447-449、449-451、451-453、453-455、455-457、457-459、459-461、461-463、463-465、
465-467、467-469、469-471、471-473、473-475、475-477、477-479、479-481、481-483、
483-485、485-487、487-489、489-491、491-493、493-495、495-497、497-501种)。
[0181] 设计采用多重试验实现分辨质谱的方法，通常包括引物和寡核苷酸组合物设计方法和反应设计方法。对于多重试验中的引物与寡核苷酸组合物设计，可将寡核苷酸组合物
设计的同样通用指导方针应用于单一反应。设计的本文所述寡核苷酸组合物可最大程度减
少或消除非目标产物，从而避免假引发和形成引物二聚体，唯一的差别是多重反应涉及更
多种类的寡核苷酸。对于质谱应用，某一试验质谱中出现的分析物峰足以与任一试验的产
物相分辨，所述试验为包括暂停峰(pausing peak)和任一其它副产物峰的多重试验。还有，
分析物峰最好落入用户指定的质量窗口中，例如，在5,000-8,500Da范围内。在一些实施方
式中，多重分析可能适合例如染色体异常的质谱检测。在某些实施方式中，多重分析可能适
合本文所述的各种单个核苷酸测序或纳米孔测序方法。商业生产的微反应室或装置或阵列
或芯片可用来促进多重分析，已可市售购得。
设计的同样通用指导方针应用于单一反应。设计的本文所述寡核苷酸组合物可最大程度减
少或消除非目标产物，从而避免假引发和形成引物二聚体，唯一的差别是多重反应涉及更
多种类的寡核苷酸。对于质谱应用，某一试验质谱中出现的分析物峰足以与任一试验的产
物相分辨，所述试验为包括暂停峰(pausing peak)和任一其它副产物峰的多重试验。还有，
分析物峰最好落入用户指定的质量窗口中，例如，在5,000-8,500Da范围内。在一些实施方
式中，多重分析可能适合例如染色体异常的质谱检测。在某些实施方式中，多重分析可能适
合本文所述的各种单个核苷酸测序或纳米孔测序方法。商业生产的微反应室或装置或阵列
或芯片可用来促进多重分析，已可市售购得。
[0182] 可对上述产生的核苷酸序列种类、扩增的核酸种类或可检测产物进行序列分析。本文所用的术语“序列分析”指测定延伸产物或扩增产物的核苷酸序列。可测定延伸产物
或扩增产物的全部序列或部分序列，测定核苷酸序列在本文中称为“读取(read)”。例如，
在一些实施方式中，无需进一步扩增即可直接分析一次“引物延伸”的产物或线性扩增产物
(例如采用单分子测序方法(下文有详述))。在某些实施方式中，可进一步扩增线性扩增
产物然后分析(例如采用连接测序或焦磷酸测序方法(下文有详述))。可对读取进行不同
类型的序列分析。可采用任何合适的测序方法检测并确定上面产生的核苷酸序列种类、扩
增的核酸种类或可检测产物的含量。下文描述了某些测序方法的实施例。
或扩增产物的全部序列或部分序列，测定核苷酸序列在本文中称为“读取(read)”。例如，
在一些实施方式中，无需进一步扩增即可直接分析一次“引物延伸”的产物或线性扩增产物
(例如采用单分子测序方法(下文有详述))。在某些实施方式中，可进一步扩增线性扩增
产物然后分析(例如采用连接测序或焦磷酸测序方法(下文有详述))。可对读取进行不同
类型的序列分析。可采用任何合适的测序方法检测并确定上面产生的核苷酸序列种类、扩
增的核酸种类或可检测产物的含量。下文描述了某些测序方法的实施例。
[0183] 本文所用的术语“序列分析装置”和“序列分析组件”指普通技术人员可应用的检测本文所述方法产生的扩增产物(例如线性和/或指数扩增产物)的核苷酸序列的装置，
和可与此类装置联用的一种或多种组件。测序平台的例子包括但不限于：454平台(罗氏
公司(Roche))，(Margulies，M.等，2005 Nature 437，376-380)、Illumina基因组分析仪
(或Solexa平台)或SOLID系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))或Helicos
True单分子DNA测序技术(Harris TD等，2008 Science，320，106-109)、太平洋生物科学公
司(Pacific Biosciences)的单分子实时(SMRTTM)技术和纳米孔测序(Soni GV和Meller
A.2007 Clin Chem 53：1996-2001)。这类平台能以高度多重平行试验方式对分离自试样的
多种核酸分子进行测序(Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003；1：397-416)。这些
平台中的每个都能测定克隆扩增或未扩增的一分子核酸片段的序列。例如，某些平台包括
(i)利用连接染料修饰的探针测序(包括环形连接和切割)，(ii)焦磷酸测序，和(iii)单
分子测序。由此产生的核苷酸序列种类、扩增的核酸种类和可检测产物可视为“在研核酸”，目的是通过此类测序分析平台分析其核苷酸序列。
和可与此类装置联用的一种或多种组件。测序平台的例子包括但不限于：454平台(罗氏
公司(Roche))，(Margulies，M.等，2005 Nature 437，376-380)、Illumina基因组分析仪
(或Solexa平台)或SOLID系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))或Helicos
True单分子DNA测序技术(Harris TD等，2008 Science，320，106-109)、太平洋生物科学公
司(Pacific Biosciences)的单分子实时(SMRTTM)技术和纳米孔测序(Soni GV和Meller
A.2007 Clin Chem 53：1996-2001)。这类平台能以高度多重平行试验方式对分离自试样的
多种核酸分子进行测序(Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003；1：397-416)。这些
平台中的每个都能测定克隆扩增或未扩增的一分子核酸片段的序列。例如，某些平台包括
(i)利用连接染料修饰的探针测序(包括环形连接和切割)，(ii)焦磷酸测序，和(iii)单
分子测序。由此产生的核苷酸序列种类、扩增的核酸种类和可检测产物可视为“在研核酸”，目的是通过此类测序分析平台分析其核苷酸序列。
[0184] 连接测序是一种依赖于DNA连接酶对碱基对错配灵敏度的核酸测序方法。DNA连接酶将碱基正确配对的DNA末端连接到一起。将DNA连接酶只连接碱基正确配对DNA末端
的能力与荧光标记寡核苷酸或引物的混合库相结合，就能用荧光检测法进行序列测定。可
通过纳入含有可切割连接键的引物获得更长序列的读取，所述可切割连接可在标记识别后
被切断。在接头处切割除去标记并在连接的寡核苷酸末端再产生5’磷酸，以制备进行另
一轮连接的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸组合物可用一种以上的荧光标记
(例如，1种荧光标记，2、3或4种荧光标记)标记。
的能力与荧光标记寡核苷酸或引物的混合库相结合，就能用荧光检测法进行序列测定。可
通过纳入含有可切割连接键的引物获得更长序列的读取，所述可切割连接可在标记识别后
被切断。在接头处切割除去标记并在连接的寡核苷酸末端再产生5’磷酸，以制备进行另
一轮连接的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸组合物可用一种以上的荧光标记
(例如，1种荧光标记，2、3或4种荧光标记)标记。
[0185] 普通技术人员可采用的基于连接测序的系统的实施方式通常包括以下步骤。制备在含靶核酸序列(“模板”)、扩增反应组分(例如在适当情况下包括切割反应组分”、珠和
本文所述寡核苷酸组合物的乳液微反应器中的克隆珠群。扩增后，使模板变性，进行珠的富
集，使含有已延伸模板的珠与不需要的珠(如含有未延伸模板的珠)相分离。对所选珠上
的模板进行3’修饰使之能与玻片共价结合，经修饰的珠可沉积到玻片上。在珠装载过程中
玻片沉积室分成1、4或8个隔离室。对于序列分析，使引物与衔接子序列杂交。一组四色
染料标记探针竞争连接于待测序的寡核苷酸。探针通过询问连接系列中每第4和第5个碱
基实现特异性连接。经5-7轮连接，检测和切割记录每一个第5位的颜色，通过所用文库的
类型确定扩增轮次数。每轮连接后，加入5’方向偏移一个碱基的新的互补引物进行另一系
列的连接。重置所述寡核苷酸和依次重复连接轮次(每轮5-7个连接循环)5次以产生含
单个标签的25-35碱基对序列。用伴侣配对测序法对第二标签重复该过程。此类系统可用
于指数扩增本文所述过程产生的扩增产物，例如，通过连接异源核酸与本文所述方法所产
生的第一扩增产物，并采用与初始所用的产生该第一扩增产物相同或不同的固相支持物进
行乳液扩增。此类系统也可用于通过绕过指数扩增过程在玻片上直接分拣本文所述固相支
持物，来分析本文所述方法直接产生的扩增引物。
本文所述寡核苷酸组合物的乳液微反应器中的克隆珠群。扩增后，使模板变性，进行珠的富
集，使含有已延伸模板的珠与不需要的珠(如含有未延伸模板的珠)相分离。对所选珠上
的模板进行3’修饰使之能与玻片共价结合，经修饰的珠可沉积到玻片上。在珠装载过程中
玻片沉积室分成1、4或8个隔离室。对于序列分析，使引物与衔接子序列杂交。一组四色
染料标记探针竞争连接于待测序的寡核苷酸。探针通过询问连接系列中每第4和第5个碱
基实现特异性连接。经5-7轮连接，检测和切割记录每一个第5位的颜色，通过所用文库的
类型确定扩增轮次数。每轮连接后，加入5’方向偏移一个碱基的新的互补引物进行另一系
列的连接。重置所述寡核苷酸和依次重复连接轮次(每轮5-7个连接循环)5次以产生含
单个标签的25-35碱基对序列。用伴侣配对测序法对第二标签重复该过程。此类系统可用
于指数扩增本文所述过程产生的扩增产物，例如，通过连接异源核酸与本文所述方法所产
生的第一扩增产物，并采用与初始所用的产生该第一扩增产物相同或不同的固相支持物进
行乳液扩增。此类系统也可用于通过绕过指数扩增过程在玻片上直接分拣本文所述固相支
持物，来分析本文所述方法直接产生的扩增引物。
[0186] 焦磷酸测序是基于合成测序的核酸测序方法，其依赖于对核苷酸掺入时释放的焦磷酸检测。通常，合成测序法包括每次加入一个核苷酸来合成与欲知其序列的链互补的
DNA链。可将靶核酸固定于固相支持物，与测序寡核苷酸(例如本文所述的寡核苷酸组合
物)杂交，与DNA聚合酶、合适的内切核酸酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸
酶(apyrase，phosphosulfate)、腺苷5’磷酰硫酸和荧光素一起孵育。依序加入和除去核
苷酸溶液。核苷酸正确掺入后释放出焦磷酸，在腺苷5’磷酰硫酸(phosphsulfate)酯存在
下焦磷酸与ATP硫酸化酶相互作用产生ATP，为荧光素反应提供能量，从而产生允许序列测
定的化学发光信号。产生的光量与加入碱基的数量成正比。由此，可测定待测序寡核苷酸
的下游序列。
DNA链。可将靶核酸固定于固相支持物，与测序寡核苷酸(例如本文所述的寡核苷酸组合
物)杂交，与DNA聚合酶、合适的内切核酸酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸
酶(apyrase，phosphosulfate)、腺苷5’磷酰硫酸和荧光素一起孵育。依序加入和除去核
苷酸溶液。核苷酸正确掺入后释放出焦磷酸，在腺苷5’磷酰硫酸(phosphsulfate)酯存在
下焦磷酸与ATP硫酸化酶相互作用产生ATP，为荧光素反应提供能量，从而产生允许序列测
定的化学发光信号。产生的光量与加入碱基的数量成正比。由此，可测定待测序寡核苷酸
的下游序列。
[0187] 普通技术人员可采用的基于焦磷酸测序的系统的实施方式通常包括以下步骤：使衔接子核酸与在研核酸连接并使在研核酸与珠粒杂交；扩增乳液中的在研核酸的核苷酸
序列；用皮升多孔固相支持物分选珠；用焦磷酸测序方法测定扩增核苷酸的序列(例如，
Nakano等，“Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion(采用油包水乳液的单
分子PCR)”Journal of Biotechnology 102：117-124(2003))。此类系统可用于指数扩增
本文所述方法所产生的扩增产物，例如通过连接异源核酸与本文所述方法产生的第一扩增
产物。
序列；用皮升多孔固相支持物分选珠；用焦磷酸测序方法测定扩增核苷酸的序列(例如，
Nakano等，“Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion(采用油包水乳液的单
分子PCR)”Journal of Biotechnology 102：117-124(2003))。此类系统可用于指数扩增
本文所述方法所产生的扩增产物，例如通过连接异源核酸与本文所述方法产生的第一扩增
产物。
[0188] 某些单分子测序实施方式根据合成测序原理，利用一个荧光共振能量转移对(一对FRET)，作用机制是成功掺入核苷酸可导致发射光子。通常采用强化或高灵敏度冷却电荷
耦联器件与全内反射显微镜(TIRM)联合检测发射的光子。只有当引入反应溶液所含的核
苷酸正确掺入到测序过程中合成产生的生长核酸链中时，才发射光子。在基于单分子测序
的FRET中，能量通过长范围偶极相互作用在两种荧光染料之间转移，染料有时是聚甲炔花
青染料Cy3和Cy5。用特定波长的激发光激发供体，激发态能量非放射性地转移至受体染
料，后者进而被激发。受体染料辐射光子后最终返回基态。在一对FRET中，能量转移所用
的两种染料代表“一对”。Cy3常用作荧光团供体，并常掺入作为第一标记核苷酸。Cy5常用
作受体荧光团，在掺入第一Cy3标记核苷酸后Cy5用于标记后续加入的核苷酸。为成功发
生能量转移，此二荧光团通常相隔在10纳米内。
耦联器件与全内反射显微镜(TIRM)联合检测发射的光子。只有当引入反应溶液所含的核
苷酸正确掺入到测序过程中合成产生的生长核酸链中时，才发射光子。在基于单分子测序
的FRET中，能量通过长范围偶极相互作用在两种荧光染料之间转移，染料有时是聚甲炔花
青染料Cy3和Cy5。用特定波长的激发光激发供体，激发态能量非放射性地转移至受体染
料，后者进而被激发。受体染料辐射光子后最终返回基态。在一对FRET中，能量转移所用
的两种染料代表“一对”。Cy3常用作荧光团供体，并常掺入作为第一标记核苷酸。Cy5常用
作受体荧光团，在掺入第一Cy3标记核苷酸后Cy5用于标记后续加入的核苷酸。为成功发
生能量转移，此二荧光团通常相隔在10纳米内。
[0189] 可用于依据单分子测序的系统的实施方式通常涉及使寡核苷酸与靶核酸序列杂交以产生复合体；使该复合体与固相结合；加入荧光分子标记的核苷酸反复延伸此寡核
苷酸；每次重复后捕获荧光共振能量转移信号的图像(例如美国专利第7,169,314号；
Braslavsky等，PNAS 100(7)：3960-3964(2003))。此类系统可用于本文所述方法产生的扩
增产物(线性或指数扩增产物)的直接测序。在一些实施方式中，使扩增产物与含有固定在
固相支持物(如珠或玻片)上的捕获序列的互补序列的寡核苷酸杂交。此种寡核苷酸-扩
增产物的复合体与固定捕获序列杂交后，将扩增产物固定到固相支持物上，进行一对FRET
为基础的合成测序。这种寡核苷酸通常有荧光(标记)，因此载有固定核酸的玻片表面可产
生初始的参比图像。利用此初始参比图像可确定发生真正核苷酸掺入的位置。在“仅含引
物”参比图像中最初未识别的阵列位置上测得的荧光信号视为非特异性荧光而弃去。寡核
苷酸-扩增产物的复合体被固定后，通常通过以下重复步骤平行地测定结合核酸的序列：
a)在一种荧光标记核苷酸存在下聚合酶延伸，b)用合适的显微镜如TRIM检测荧光，c)除
去荧光核苷酸，和d)返回步骤a)，加入不同的荧光标记核苷酸。
苷酸；每次重复后捕获荧光共振能量转移信号的图像(例如美国专利第7,169,314号；
Braslavsky等，PNAS 100(7)：3960-3964(2003))。此类系统可用于本文所述方法产生的扩
增产物(线性或指数扩增产物)的直接测序。在一些实施方式中，使扩增产物与含有固定在
固相支持物(如珠或玻片)上的捕获序列的互补序列的寡核苷酸杂交。此种寡核苷酸-扩
增产物的复合体与固定捕获序列杂交后，将扩增产物固定到固相支持物上，进行一对FRET
为基础的合成测序。这种寡核苷酸通常有荧光(标记)，因此载有固定核酸的玻片表面可产
生初始的参比图像。利用此初始参比图像可确定发生真正核苷酸掺入的位置。在“仅含引
物”参比图像中最初未识别的阵列位置上测得的荧光信号视为非特异性荧光而弃去。寡核
苷酸-扩增产物的复合体被固定后，通常通过以下重复步骤平行地测定结合核酸的序列：
a)在一种荧光标记核苷酸存在下聚合酶延伸，b)用合适的显微镜如TRIM检测荧光，c)除
去荧光核苷酸，和d)返回步骤a)，加入不同的荧光标记核苷酸。
[0190] 在一些实施方式中，可用固相单个核苷酸测序法和过程进行核苷酸测序。固相单个核苷酸测序方法包括在单个样品核酸分子能与固相支持物上的单个分子杂交的条件下，
使靶核酸接触固相支持物。这种条件可包括在“微反应器”中提供固相支持物分子和单个
靶核酸分子。这种条件还可包括提供使靶核酸分子与固相支持物上的固相核酸杂交的混合
物。2008年1月17日提交的美国临时专利申请第61/021,871号中描述了可用于本文所述
实施方式的单个核苷酸测序方法。
使靶核酸接触固相支持物。这种条件可包括在“微反应器”中提供固相支持物分子和单个
靶核酸分子。这种条件还可包括提供使靶核酸分子与固相支持物上的固相核酸杂交的混合
物。2008年1月17日提交的美国临时专利申请第61/021,871号中描述了可用于本文所述
实施方式的单个核苷酸测序方法。
[0191] 在某些实施方式中，纳米孔测序检测方法包括(a)使待测序靶核酸(“基础核酸”，如连接的探针分子)与序列特异性检测器(例如本文所述的寡核苷酸组合物)在该检测器
能与此基础核酸的基本上互补的亚序列特异性杂交的条件下接触；(b)检测该检测器的信
号，和(c)根据测得的信号确定此基础核酸的序列。在某些实施方式中，当基础核酸通过纳
米孔时检测器与纳米孔结构有扰动，此时与基础核酸杂交的检测器从基础核酸上解离(例
如依序解离)，从而测得从基础(核酸)序列上解离的检测器。在一些实施方式中，从基础
核酸解离的检测器发射可检测信号，而与基础核酸杂交的检测器发射不同的可检测信号或
不发射可检测信号。在某些实施方式中，用对应于特定核苷酸(“核苷酸代表”)的特定核
苷酸序列取代核酸(如连接的探针分子)中的核苷酸，从而产生扩展的核酸(例如美国专
利第6,723,513号)，使检测器与扩展核酸中作为基础核酸的该核苷酸代表杂交。在此类实
施方式中，可以二元或更高等级安排法安置核苷酸代表(例如，Soni和Meller，Clinical
Chemistry 53(11)：1996-2001(2007))。在一些实施方式中，不扩展核酸，不产生扩展的
核酸，而直接用作基础核酸(例如，连接的探针分子用作未扩展的基础核酸)，检测器直接
接触基础核酸。例如，第一检测器与第一亚序列杂交，而第二检测器与第二亚序列杂交，其
中第一检测器与第二检测器各自含有能相互区分的可检测标记，当检测器从基础核酸解离
时，第一检测器与第二检测器发出的信号可彼此区分。在某些实施方式中，检测器包含与基
础核酸杂交的区域(例如两个区域)段，该区域可以长约3-100个核苷酸(例如，长约4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、
90或95个核苷酸)。检测器还可包含不与基础核酸杂交的一个或多个核苷酸区域。在一
些实施方式中，检测器是分子信标。在一些实施方式中，检测器可以是含有本文所述内部茎
环的寡核苷酸组合物，当内部茎环从完整的寡核苷酸组合物中切下时起着可检测特征的作
用。检测器通常含有独立选自本文所述的一个或多个可检测特征。可用能检测各标记所产
生信号的任何常规检测方法(例如，磁性、电学、化学、光学等)检测各可检测特征或标记。
例如，可用CD相机检测与检测器相连的一种或多种可区分量子斑点的信号。
能与此基础核酸的基本上互补的亚序列特异性杂交的条件下接触；(b)检测该检测器的信
号，和(c)根据测得的信号确定此基础核酸的序列。在某些实施方式中，当基础核酸通过纳
米孔时检测器与纳米孔结构有扰动，此时与基础核酸杂交的检测器从基础核酸上解离(例
如依序解离)，从而测得从基础(核酸)序列上解离的检测器。在一些实施方式中，从基础
核酸解离的检测器发射可检测信号，而与基础核酸杂交的检测器发射不同的可检测信号或
不发射可检测信号。在某些实施方式中，用对应于特定核苷酸(“核苷酸代表”)的特定核
苷酸序列取代核酸(如连接的探针分子)中的核苷酸，从而产生扩展的核酸(例如美国专
利第6,723,513号)，使检测器与扩展核酸中作为基础核酸的该核苷酸代表杂交。在此类实
施方式中，可以二元或更高等级安排法安置核苷酸代表(例如，Soni和Meller，Clinical
Chemistry 53(11)：1996-2001(2007))。在一些实施方式中，不扩展核酸，不产生扩展的
核酸，而直接用作基础核酸(例如，连接的探针分子用作未扩展的基础核酸)，检测器直接
接触基础核酸。例如，第一检测器与第一亚序列杂交，而第二检测器与第二亚序列杂交，其
中第一检测器与第二检测器各自含有能相互区分的可检测标记，当检测器从基础核酸解离
时，第一检测器与第二检测器发出的信号可彼此区分。在某些实施方式中，检测器包含与基
础核酸杂交的区域(例如两个区域)段，该区域可以长约3-100个核苷酸(例如，长约4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、
90或95个核苷酸)。检测器还可包含不与基础核酸杂交的一个或多个核苷酸区域。在一
些实施方式中，检测器是分子信标。在一些实施方式中，检测器可以是含有本文所述内部茎
环的寡核苷酸组合物，当内部茎环从完整的寡核苷酸组合物中切下时起着可检测特征的作
用。检测器通常含有独立选自本文所述的一个或多个可检测特征。可用能检测各标记所产
生信号的任何常规检测方法(例如，磁性、电学、化学、光学等)检测各可检测特征或标记。
例如，可用CD相机检测与检测器相连的一种或多种可区分量子斑点的信号。
[0192] 在某些序列分析实施方式中，可利用读取(序列)来构建较大的核苷酸序列，通过鉴定不同读取序列中的重叠序列和利用读取序列中的识别序列可促进这种构建。普通
技术人员知道这类序列的分析方法和从读取序列构建更大序列的软件(例如，Venter等，
Science 291：1304-1351(2001))。在某些序列分析实施方式中，特定的读取序列、部分核苷酸序列的构建和全长核苷酸序列的构建可对样品核酸中的核苷酸序列之间作比较(即内
部比较)或与参比序列比较(即参比比较)。当从多个样品或从含有变异序列的一个样品
来源制备样品核酸的情况下，有时进行内部比较。当已知参比核苷酸的序列和目的是测定
样品核酸中是否含有与参比核苷酸序列基本相似或相同或不同的核苷酸序列时，有时进行
参比比较。采用本文所述序列分析装置和组件可促进序列分析。
技术人员知道这类序列的分析方法和从读取序列构建更大序列的软件(例如，Venter等，
Science 291：1304-1351(2001))。在某些序列分析实施方式中，特定的读取序列、部分核苷酸序列的构建和全长核苷酸序列的构建可对样品核酸中的核苷酸序列之间作比较(即内
部比较)或与参比序列比较(即参比比较)。当从多个样品或从含有变异序列的一个样品
来源制备样品核酸的情况下，有时进行内部比较。当已知参比核苷酸的序列和目的是测定
样品核酸中是否含有与参比核苷酸序列基本相似或相同或不同的核苷酸序列时，有时进行
参比比较。采用本文所述序列分析装置和组件可促进序列分析。
[0193] 也可采用标准电泳技术检测靶核酸序列。虽然有时在检测步骤前要进行扩增步骤，本文所述实施方式中不需要扩增。在本领域中可找到用电泳技术检测和定量靶核酸序
列的方法例子。本文提供了非限制性例子。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上运行样品(例
如，分离自母体血清的混合核酸样品，或扩增的核酸)后，用溴乙啶标记(例如染色)凝胶
(参见Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆实验
手册》)，第3版，2001)。存在大小与标准对照相同的条带表明存在靶核酸序列，然后根据
条带的强度与对照作比较确定其含量，如此检测并定量感兴趣的靶序列。在一些实施方式
中，可利用能区分母体与父体等位基因的限制性酶检测并定量靶核酸种类。在某些实施方
式中，可利用靶核酸(例如特定等位基因)的特异性的寡核苷酸组合物检测感兴趣靶序列
的存在。也可利用所述寡核苷酸，根据该寡核苷酸种类产生的信号强度，与标准对照比较，
表明靶核酸分子的含量。
列的方法例子。本文提供了非限制性例子。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上运行样品(例
如，分离自母体血清的混合核酸样品，或扩增的核酸)后，用溴乙啶标记(例如染色)凝胶
(参见Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆实验
手册》)，第3版，2001)。存在大小与标准对照相同的条带表明存在靶核酸序列，然后根据
条带的强度与对照作比较确定其含量，如此检测并定量感兴趣的靶序列。在一些实施方式
中，可利用能区分母体与父体等位基因的限制性酶检测并定量靶核酸种类。在某些实施方
式中，可利用靶核酸(例如特定等位基因)的特异性的寡核苷酸组合物检测感兴趣靶序列
的存在。也可利用所述寡核苷酸，根据该寡核苷酸种类产生的信号强度，与标准对照比较，
表明靶核酸分子的含量。
[0194] 还可利用序列特异性寡核苷酸的杂交来检测含有其它种类核酸的混合物或混合群体中的特定核酸。在足够严谨的杂交条件下，所述寡核苷酸(例如探针)只特异性杂交
基本上互补的序列。可放松杂交条件的严谨性以容许不同量的序列错配。本领域知道有多
种杂交形式，包括但不限于，溶液相、固相或混合相杂交试验。下列文件提供了不同杂交试
验形式的综述：Singer等，Biotechniques 4：230，1986；Haase等，Methods in Virology，
189-226页，1984；Wilkinson，In situ Hybridization(原位杂交)，Wilkinson编，IRL出
版社、牛津大学出版社，牛津；以及Hames与Higgins编，Nucleic Acid Hybridization：A
Practical Approach(《核酸杂交：实用方法》)，IRL出版社，1987)。
基本上互补的序列。可放松杂交条件的严谨性以容许不同量的序列错配。本领域知道有多
种杂交形式，包括但不限于，溶液相、固相或混合相杂交试验。下列文件提供了不同杂交试
验形式的综述：Singer等，Biotechniques 4：230，1986；Haase等，Methods in Virology，
189-226页，1984；Wilkinson，In situ Hybridization(原位杂交)，Wilkinson编，IRL出
版社、牛津大学出版社，牛津；以及Hames与Higgins编，Nucleic Acid Hybridization：A
Practical Approach(《核酸杂交：实用方法》)，IRL出版社，1987)。
[0195] 可用本领域已知的技术检测杂交复合体。能与靶核酸(例如mRNA或扩增的DNA)特异性杂交的核酸探针(例如，寡核苷酸物质)可用任何适当的方法标记，用标记的探针检
测杂交核酸的存在。采用3H、125I、35S、14C或32P等标记的探针进行放射自显影是一种常
用的检测方法。放射性同位素的选择取决于对所选同位素的合成难易、稳定性和半衰期研
究所导致的偏爱。其它标记包括能与标记有荧光团、化学发光剂和酶的抗配体或抗体结合
的化合物(例如生物素和地高辛)在一些实施方式中，可直接将探针与标记如荧光团、化学
发光剂或酶偶联。标记的选择取决于所需的灵敏度、与探针偶联的难易、稳定性要求和所拥
有的设备。
测杂交核酸的存在。采用3H、125I、35S、14C或32P等标记的探针进行放射自显影是一种常
用的检测方法。放射性同位素的选择取决于对所选同位素的合成难易、稳定性和半衰期研
究所导致的偏爱。其它标记包括能与标记有荧光团、化学发光剂和酶的抗配体或抗体结合
的化合物(例如生物素和地高辛)在一些实施方式中，可直接将探针与标记如荧光团、化学
发光剂或酶偶联。标记的选择取决于所需的灵敏度、与探针偶联的难易、稳定性要求和所拥
有的设备。
[0196] “引物延伸”多态性检测方法本文中也称为“微测序”方法，通常通过使互补寡核苷酸与携带所述多态性位点的核酸杂交进行此方法。在这些方法中，寡核苷酸通常在毗邻
多态性位点处杂交。“微测序”方法所用术语“毗邻”指当延伸寡核苷酸与(靶)核酸杂交
时，延伸寡核苷酸的3’末端有时距离该核酸中的多态性位点5’末端1个核苷酸，通常为
2或3个，有时距离多态性位点5’末端4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。然后，所述延伸寡核苷酸被延伸一个或多个核苷酸，通常延伸1、2或3个核苷酸，加入延伸寡核苷酸的核苷酸
数量和/或种类决定了存在何种多态性变体。例如，美国专利第4,656,127；4,851,331；
5,679,524；5,834,189；5,876,934；5,908,755；5,912,118；5,976,802；5,981,186；
6,004,744；6,013,431；6,017,702；6,046,005；6,087,095；6,210,891号和WO 01/20039
中描述了寡核苷酸的延伸方法。可用任何方法检测延伸产物，例如荧光方法(参见例如
Chen与Kwok，Nucleic Acids Research 25：347-353(1997)和Chen等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94/20：10756-10761(1997))或质谱方法(例如，MALDI-TOF质谱)和本文所述的
其它方法。例如，在美国专利第5,547,835；5,605,798；5,691,141；5,849,542；5,869,242；
5,928,906；6,043,031；6,194,144与6,258,538号中描述了采用质谱法检测延伸寡核苷
酸。
多态性位点处杂交。“微测序”方法所用术语“毗邻”指当延伸寡核苷酸与(靶)核酸杂交
时，延伸寡核苷酸的3’末端有时距离该核酸中的多态性位点5’末端1个核苷酸，通常为
2或3个，有时距离多态性位点5’末端4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。然后，所述延伸寡核苷酸被延伸一个或多个核苷酸，通常延伸1、2或3个核苷酸，加入延伸寡核苷酸的核苷酸
数量和/或种类决定了存在何种多态性变体。例如，美国专利第4,656,127；4,851,331；
5,679,524；5,834,189；5,876,934；5,908,755；5,912,118；5,976,802；5,981,186；
6,004,744；6,013,431；6,017,702；6,046,005；6,087,095；6,210,891号和WO 01/20039
中描述了寡核苷酸的延伸方法。可用任何方法检测延伸产物，例如荧光方法(参见例如
Chen与Kwok，Nucleic Acids Research 25：347-353(1997)和Chen等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94/20：10756-10761(1997))或质谱方法(例如，MALDI-TOF质谱)和本文所述的
其它方法。例如，在美国专利第5,547,835；5,605,798；5,691,141；5,849,542；5,869,242；
5,928,906；6,043,031；6,194,144与6,258,538号中描述了采用质谱法检测延伸寡核苷
酸。
[0197] 微测序检测方法通常包括在延伸步骤前进行扩增过程。此扩增过程通常扩增核酸样品中含多态性位点的区域。可采用上文、下文实施例部分所述方法进行扩增，或例如在聚
合酶链反应(PCR)中采用本文所述的一对寡核苷酸组合物，其中一种寡核苷酸通常与多态
位点的3’区域互补，而另一种通常与多态位点的5’区域互补。例如，美国专利4,683,195；
4,683,202、4,965,188；5,656,493；5,998,143；6,140,054；WO 01/27327；和WO 01/27329中公开的PCR方法采用了一对寡核苷酸。多对PCR寡核苷酸还可用于进行PCR的任何市售
可得的机器，例如购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的任何GeneAmp 系统。
合酶链反应(PCR)中采用本文所述的一对寡核苷酸组合物，其中一种寡核苷酸通常与多态
位点的3’区域互补，而另一种通常与多态位点的5’区域互补。例如，美国专利4,683,195；
4,683,202、4,965,188；5,656,493；5,998,143；6,140,054；WO 01/27327；和WO 01/27329中公开的PCR方法采用了一对寡核苷酸。多对PCR寡核苷酸还可用于进行PCR的任何市售
可得的机器，例如购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的任何GeneAmp 系统。
[0198] 在一些实施方式中，可利用全基因组测序来区分靶核酸(例如RNA转录物或DNA)的等位基因。全基因组测序的例子包括但不限于，上文所述的基于纳米孔的测序方法、合成
测序以及连接测序法。
测序以及连接测序法。
[0200] 如本文所用术语对一个或多个切割产物或切割片段(下文统称为“切割产物”)的“检测”指用适当的方法检测内切核酸酶切割反应的产物。如本文所述，可采用任何适当的
检测装置和方法检测切割产物。在一些实施方式中，检测一种或多种切割片段(例如用质
谱检测两种切割产物；可通过检测可检测标记发射的信号来检测含有可检测标记的一种切
割产物)。
检测装置和方法检测切割产物。在一些实施方式中，检测一种或多种切割片段(例如用质
谱检测两种切割产物；可通过检测可检测标记发射的信号来检测含有可检测标记的一种切
割产物)。
[0201] 本文所用的术语“结果”指有无切割产物所表明的表型。结果的非限制性例子包括有无胎儿、染色体异常、非整倍体染色体(如三体21、三体18、三体13)或疾病状况。结
果也可是有无切割产物。可以任何合适的形式表示有无结果，包括但不限于：与对象或样品
存在的结果相关的比例、比例偏移、频率、分布、概率(例如胜算比、p值)、可能性、百分比、阈上值、或风险因子。在某些实施方式中，可用灵敏度、特异性、标准偏差、变异系数(CV)和/或置信度中的一种或多种或其组合提供结果。
果也可是有无切割产物。可以任何合适的形式表示有无结果，包括但不限于：与对象或样品
存在的结果相关的比例、比例偏移、频率、分布、概率(例如胜算比、p值)、可能性、百分比、阈上值、或风险因子。在某些实施方式中，可用灵敏度、特异性、标准偏差、变异系数(CV)和/或置信度中的一种或多种或其组合提供结果。
[0202] 可确定所有测试样品有无结果，在一些实施方式中，确定样品亚组(例如妊娠妇女个体的样品)有无结果。在某些实施方式中，确定组内约60、65、70、75、76、77、78、79、80、
81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或99％以上所分析样品的结果。一组样品可包括任何合适数量的样品，在一些实施方式中，一组有约10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或
1000个样品，或1000个以上样品。所述组可考虑包括特定时间段和/或特定位置的测试样
品。例如，所述组也可由孕龄和/或种族特征所确定。所述组可包含细分的子样品或复制样
品，可测试全部样品或其中的一些。所述组可包含在两个不同时间采集自同一对象的样品。
在某些实施方式中，确定所分析的给定样品约60％或更多时间(例如，给定样品约65、70、
75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 ％或99％以上的时间)的结果。在某些实施方式中，分析能区分等位基因的更高数量的特征
(例如序列变异)可提高有确定结果(例如在多重分析中区分)的样品百分数。在一些实
施方式中，让对象(例如妊娠女性)提供一种或多种组织或液体样品(例如一种或多种血
液样品)。在某些实施方式中，分离一种组织或液体样品的一种或多种RNA或DNA样品，或
两种或多种重复RNA或DNA样品，用本文所述方法分析。
81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或99％以上所分析样品的结果。一组样品可包括任何合适数量的样品，在一些实施方式中，一组有约10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或
1000个样品，或1000个以上样品。所述组可考虑包括特定时间段和/或特定位置的测试样
品。例如，所述组也可由孕龄和/或种族特征所确定。所述组可包含细分的子样品或复制样
品，可测试全部样品或其中的一些。所述组可包含在两个不同时间采集自同一对象的样品。
在某些实施方式中，确定所分析的给定样品约60％或更多时间(例如，给定样品约65、70、
75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 ％或99％以上的时间)的结果。在某些实施方式中，分析能区分等位基因的更高数量的特征
(例如序列变异)可提高有确定结果(例如在多重分析中区分)的样品百分数。在一些实
施方式中，让对象(例如妊娠女性)提供一种或多种组织或液体样品(例如一种或多种血
液样品)。在某些实施方式中，分离一种组织或液体样品的一种或多种RNA或DNA样品，或
两种或多种重复RNA或DNA样品，用本文所述方法分析。
[0203] 可根据一种或多种计算出的变量，包括但不限于：比例、分布、频率、灵敏度、特异性、标准偏差、变异系数(CV)、阈值、置信度、评分、概率和/或它们的组合，来鉴定有无结果。在一些实施方式中，(i)诊断方法所选各组的数目和/或(ii)诊断方法所选各组的特定种类核苷酸序列部分或完全由这些计算出的一种或多种变量所确定。
[0204] 在某些实施方式中，比例、灵敏度、特异性和/或置信度中的一种或多种表示为百分比。在一些实施方式中，各变量单独的百分比大于约90％(例如约90、91、92、93、94、95、
96、97、98或99％或99％以上(例如，约99.5％或更高，约99.9％或更高、约99.95％或更
高、约99.99％或更高))。在一些实施方式中，变异系数(CV)表示为百分比，有时该百分比
为约10％或更低(例如约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％或低于1％(例如，约0.5％或更低、约0.1％或更低、约0.05％或更低、约0.01％或更低))。在某些实施方式中，概率(例如由
算法确定不是随机产生的特定结果)表示为p值，有时p值为约0.05或更低(例如约0.05、
0.04、0.03、0.02或0.01、或低于0.01(例如约0.001或更低、约0.0001或更低、约0.00001
或更低、约0.000001或更低))。
96、97、98或99％或99％以上(例如，约99.5％或更高，约99.9％或更高、约99.95％或更
高、约99.99％或更高))。在一些实施方式中，变异系数(CV)表示为百分比，有时该百分比
为约10％或更低(例如约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％或低于1％(例如，约0.5％或更低、约0.1％或更低、约0.05％或更低、约0.01％或更低))。在某些实施方式中，概率(例如由
算法确定不是随机产生的特定结果)表示为p值，有时p值为约0.05或更低(例如约0.05、
0.04、0.03、0.02或0.01、或低于0.01(例如约0.001或更低、约0.0001或更低、约0.00001
或更低、约0.000001或更低))。
[0205] 例如，评分或分数可指计算对象/样品中确实有无特定结果的概率。评分值可用来确定例如对应于实际结果的被扩增的可检测核酸产物的变异、差异或比例。例如，从可检
测产物计算得到的正评分可引起结果的鉴定，该结果与单一样品分析尤为相关。
测产物计算得到的正评分可引起结果的鉴定，该结果与单一样品分析尤为相关。
[0206] 在某些实施方式中，模拟数据可能有助于数据处理，例如通过训练某算法或测试某算法。例如，模拟数据可能涉及血清、血浆等中不同浓度胎儿和母体核酸的各种假设样
品。模拟数据可根据真实群体中预期的情况或被歪曲的情况，测试某算法和/或根据一组
模拟数据指定正确的类别。本文中模拟数据也称为“虚拟”数据。样品中的胎儿/母体贡
献可模拟为数字表格或阵列(例如与参比生物分子或扩增的核酸序列切割产物质量信号
相对应的峰列表)、质谱、凝胶条带的模式、标记的强度、或测量质量分布的任何技术提供的数据。在大多数情况下可用计算机程序进行模拟。在使用一组模拟数据时可能的一个步骤
是评估所鉴定结果的置信度，即所选的阳性/阴性样品结果匹配是否良好，以及是否有其
它变异。常用方法是计算概率值(p值)，该值评估随机样品比所选样品具有更好评分的可
能性。由于某些情况中p值计算可能不适用，可评估经验模型，该模型假设至少一个样品匹
配参比样品(有无可分辨的变异)。或者，可采用其它分布如泊松分布描述概率分布。
品。模拟数据可根据真实群体中预期的情况或被歪曲的情况，测试某算法和/或根据一组
模拟数据指定正确的类别。本文中模拟数据也称为“虚拟”数据。样品中的胎儿/母体贡
献可模拟为数字表格或阵列(例如与参比生物分子或扩增的核酸序列切割产物质量信号
相对应的峰列表)、质谱、凝胶条带的模式、标记的强度、或测量质量分布的任何技术提供的数据。在大多数情况下可用计算机程序进行模拟。在使用一组模拟数据时可能的一个步骤
是评估所鉴定结果的置信度，即所选的阳性/阴性样品结果匹配是否良好，以及是否有其
它变异。常用方法是计算概率值(p值)，该值评估随机样品比所选样品具有更好评分的可
能性。由于某些情况中p值计算可能不适用，可评估经验模型，该模型假设至少一个样品匹
配参比样品(有无可分辨的变异)。或者，可采用其它分布如泊松分布描述概率分布。
[0207] 在某些实施方式中，所用算法可对计算的真阳性、真阴性、假阳性和假阴性指定置信值。也可根据某些概率模型指定某结果发生的可能性。
[0208] 通常在硅片处理中产生模拟数据。本文所用术语“在计算机中(in silico)”指用计算机进行研究和实验。计算机中的方法包括但不限于，分子模拟研究、染色体的组型、遗
传计算、生物分子停靠实验和分子结构和/或过程如分子相互作用的虚拟表示。
传计算、生物分子停靠实验和分子结构和/或过程如分子相互作用的虚拟表示。
[0209] 本文所用“数据加工途径”指可用软件实施确定所得数据(即试验最终结果)的生物学意义的过程。例如，数据加工途径可根据采集的数据确定各种核苷酸序列的含量。数
据加工途径也可根据测得的结果控制仪器和/或数据采集途径。数据加工途径和数据采集
途径通常集成在一起并提供反馈以操纵设备的数据获取，从而提供本文所述的试验评判方
法。
据加工途径也可根据测得的结果控制仪器和/或数据采集途径。数据加工途径和数据采集
途径通常集成在一起并提供反馈以操纵设备的数据获取，从而提供本文所述的试验评判方
法。
[0210] 本文所用的软件，指由计算机执行的进行计算机操作的计算机可读程序指令。通常，提供的软件产品含有程序指令，所述指令记录在计算机可读介质上，包括但不限于，磁
性介质包括软盘、硬盘和磁带；和光学介质包括CD-ROM盘、DVD盘、磁光盘，和其它可记录程序指令的此类介质。
性介质包括软盘、硬盘和磁带；和光学介质包括CD-ROM盘、DVD盘、磁光盘，和其它可记录程序指令的此类介质。
[0211] 预测异常或正常的不同方法可产生不同类型结果。对于任何给定的预测，结果可能有四种类型：真阳性、真阴性、假阳性或假阴性。本文所用术语“真阳性”指对象正确诊断为具有某结果。本文所用术语“假阳性”指将对象错误鉴定为具有某结果。本文所用术语
“真阴性”指将对象正确鉴定为不具有某结果。本文所用术语“假阴性”指将对象错误鉴定
为不具有某结果。可根据这些结果发生的比例计算出任何给定方法的两种性能衡量指标：
(i)灵敏度值，正确鉴定为阳性占预计阳性的比例(例如，通过水平比较检测/测定，鉴定结
果正确的核苷酸序列组占所有核苷酸序列组的比例是否正确)，从而反映检测结果的准确
性；和(ii)特异性值，正确鉴定为阴性占预计阴性的比例(通过水平比较检测/测定，鉴定
染色体正常的核苷酸序列组占鉴定的所有核苷酸序列组的比例是否正确)，从而反映检测
结果的准确性。
“真阴性”指将对象正确鉴定为不具有某结果。本文所用术语“假阴性”指将对象错误鉴定
为不具有某结果。可根据这些结果发生的比例计算出任何给定方法的两种性能衡量指标：
(i)灵敏度值，正确鉴定为阳性占预计阳性的比例(例如，通过水平比较检测/测定，鉴定结
果正确的核苷酸序列组占所有核苷酸序列组的比例是否正确)，从而反映检测结果的准确
性；和(ii)特异性值，正确鉴定为阴性占预计阴性的比例(通过水平比较检测/测定，鉴定
染色体正常的核苷酸序列组占鉴定的所有核苷酸序列组的比例是否正确)，从而反映检测
结果的准确性。
[0212] 本文所用的术语“灵敏度”指：真阳性数除以真阳性、假阳性数之和，其中灵敏度(sens)可在0≤sens≤1范围内。理想地，本文方法实施方式的假阴性数等于0或接近
等于0，从而当对象事实上具有至少一种结果时，没有对象被错误地鉴定为不具有至少一种
结果。相反，通常需对预测算法能否正确分类阴性作出评估，这是对灵敏度的补充措施。本
文所用的术语“特异性”指：真阴性数除以真阴性、假阴性数之和，其中特异性(spec)可在
0≤spec≤1范围内。理想地，本文方法实施方式的假阳性数等于0或接近等于0，从而当
对象没有所评估的结果时，没有对象被错误鉴定为具有至少一种结果。因此，有时选择灵敏
度和特异性等于1或100％的方法。
等于0，从而当对象事实上具有至少一种结果时，没有对象被错误地鉴定为不具有至少一种
结果。相反，通常需对预测算法能否正确分类阴性作出评估，这是对灵敏度的补充措施。本
文所用的术语“特异性”指：真阴性数除以真阴性、假阴性数之和，其中特异性(spec)可在
0≤spec≤1范围内。理想地，本文方法实施方式的假阳性数等于0或接近等于0，从而当
对象没有所评估的结果时，没有对象被错误鉴定为具有至少一种结果。因此，有时选择灵敏
度和特异性等于1或100％的方法。
[0213] 可采用一种或多种预测算法确定显著性或给出在不同条件下采集得到的检测数据的意义，可独自或相互依赖地对它们进行权衡。本文所用术语“变量”指某算法中具有一
种值或一组值的因素、数量或函数。例如，设计的变量可以是：一组被扩增的核酸，被扩增核酸组的数目，测得的胎儿基因贡献的百分比，测得的母体基因贡献的百分比，测得的结果类
型，测得的性别相关异常的类型，母体的年龄等。本文所用术语“独立”指不受另一种因素
的影响或不受其控制。本文所用术语“依赖”指受另一种因素的影响或受其控制。例如，由
于相互依赖的某变量有所变化，导致某特定染色体产生该特定染色体的三体异常。
种值或一组值的因素、数量或函数。例如，设计的变量可以是：一组被扩增的核酸，被扩增核酸组的数目，测得的胎儿基因贡献的百分比，测得的母体基因贡献的百分比，测得的结果类
型，测得的性别相关异常的类型，母体的年龄等。本文所用术语“独立”指不受另一种因素
的影响或不受其控制。本文所用术语“依赖”指受另一种因素的影响或受其控制。例如，由
于相互依赖的某变量有所变化，导致某特定染色体产生该特定染色体的三体异常。
[0214] 可采用具有可接受的灵敏度和/或特异性的任何合适类型的方法或预测算法，对本发明技术的数据作显著性分析。例如，可采用Mann-Whitney U检验、二项检验、对数胜算
2
比、X 检验、z-检验、t-检验、ANOVA(方差分析)、回归分析、神经网络、模糊逻辑、隐马尔可夫模型、多重状态模型评估等。可确定对本发明技术的不同独立和/或依赖变量的数据作
出显著性分析的一种或多种方法或预测算法。可确定对本文所述技术的不同独立和/或依
赖变量的数据不能作出显著性分析的一种或多种方法或预测算法。可根据一种或多种预测
算法的结果设计或改变本文所述方法不同变量的参数(例如所分析的组数目，各组内核苷
2
酸的类型)。例如，用X 检验检测数据，可能提示特定年龄范围的母亲与生出具有特定结果
的后代更可能相关，从而对母体年龄的变量作不同的权衡，而非如其它变量那样作相同的
权衡。
2
比、X 检验、z-检验、t-检验、ANOVA(方差分析)、回归分析、神经网络、模糊逻辑、隐马尔可夫模型、多重状态模型评估等。可确定对本发明技术的不同独立和/或依赖变量的数据作
出显著性分析的一种或多种方法或预测算法。可确定对本文所述技术的不同独立和/或依
赖变量的数据不能作出显著性分析的一种或多种方法或预测算法。可根据一种或多种预测
算法的结果设计或改变本文所述方法不同变量的参数(例如所分析的组数目，各组内核苷
2
酸的类型)。例如，用X 检验检测数据，可能提示特定年龄范围的母亲与生出具有特定结果
的后代更可能相关，从而对母体年龄的变量作不同的权衡，而非如其它变量那样作相同的
权衡。
[0215] 在某些实施方式中，可选择多种算法作测试。然后，可以用原始数据训练这些算法。对每个新样品的原始数据，受训算法将会指定该样品的类别(即三体或正常)。基于新
样品的原始数据类别，可根据灵敏度和特异性评估受训算法的性能。最后，可鉴定灵敏度和
/或特异性最高或二者组合的算法。
样品的原始数据类别，可根据灵敏度和特异性评估受训算法的性能。最后，可鉴定灵敏度和
/或特异性最高或二者组合的算法。
[0216] 对于染色体异常如非整倍体而言，预期正常整倍体胎儿的染色体比例约1∶1。在一些实施方式中，一组内二种核苷酸序列种类的比例预计为约1.0∶1.0，表明该组内的二
种核苷酸序列以相同数量存在于对象的不同染色体中。当一组内的二种核苷酸序列以不同
数量存在于对象的染色体上(例如三体21)时，测得的比例低于或高于约1.0∶1.0。当
用胞外核酸作为模板核酸时，由于多种因素的影响，测得的比例常常不是1.0∶1.0(整倍
体)或1.0∶1.5(例如，三体21)。预期测得的比例可能改变，只要这种改变基本上可重现
和可检测。例如，某特定组在整倍体测量中可能提供1.0∶1.2的可重现测定比例(例如
质谱峰的比例)。而该组的非整倍体测量可能是，例如1.0∶1.3。1.3相比1.2的测量是
胎儿核酸相对母体核酸背景的测量，这是由于“纯”胎儿样品例如羊水或胎儿细胞样品所提
供的信号造成母体核酸比例降低之故。
种核苷酸序列以相同数量存在于对象的不同染色体中。当一组内的二种核苷酸序列以不同
数量存在于对象的染色体上(例如三体21)时，测得的比例低于或高于约1.0∶1.0。当
用胞外核酸作为模板核酸时，由于多种因素的影响，测得的比例常常不是1.0∶1.0(整倍
体)或1.0∶1.5(例如，三体21)。预期测得的比例可能改变，只要这种改变基本上可重现
和可检测。例如，某特定组在整倍体测量中可能提供1.0∶1.2的可重现测定比例(例如
质谱峰的比例)。而该组的非整倍体测量可能是，例如1.0∶1.3。1.3相比1.2的测量是
胎儿核酸相对母体核酸背景的测量，这是由于“纯”胎儿样品例如羊水或胎儿细胞样品所提
供的信号造成母体核酸比例降低之故。
[0217] 如上所述，可利用(例如)算法、软件、处理器和/或机器来(i)处理涉及切割产物的检测数据，和/或(ii)鉴定有无某结果。
[0218] 在某些实施方式中，提供了鉴定有无某结果的方法，包括：(a)提供系统，该系统包括不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号检测模块，逻辑处理模块，和数据显示组
织模块；(b)检测表明有无切割产物的信号信息；(c)由逻辑处理模块接收该信号信息；(d)
用逻辑处理模块判定有无某结果；和(e)用数据显示组织模块响应逻辑处理模块的判定，
组织数据显示，表明有无这种结果。
织模块；(b)检测表明有无切割产物的信号信息；(c)由逻辑处理模块接收该信号信息；(d)
用逻辑处理模块判定有无某结果；和(e)用数据显示组织模块响应逻辑处理模块的判定，
组织数据显示，表明有无这种结果。
[0219] 还提供了鉴定有无某结果的方法，包括：提供表明有无切割产物的信号信息；提供系统，该系统包含不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号检测模块、逻辑处理模块
和数据显示组织模块；由逻辑处理模块接收信号信息；用逻辑处理模块判定有无某结果；
以及数据显示组织模块响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有无这种结果。
和数据显示组织模块；由逻辑处理模块接收信号信息；用逻辑处理模块判定有无某结果；
以及数据显示组织模块响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有无这种结果。
[0220] 还提供了鉴定有无某结果的方法，包括：提供系统，该系统包括不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号检测模块、逻辑处理模块和数据显示组织模块；由逻辑处理模
块接收表明有无切割产物的信号信息；用逻辑处理模块判定有无某结果；以及数据显示组
织模块响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有无这种结果。
块接收表明有无切割产物的信号信息；用逻辑处理模块判定有无某结果；以及数据显示组
织模块响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有无这种结果。
[0221] “提供信号信息”指提供信息的任何方式，例如，包括与某位置或远程位点的计算机通信、人数据的登记或传输信号信息的任何其它方法。所述信号信息可在一个位置产生，
并提供给另一位置。
并提供给另一位置。
[0222] “获得”或“接收”信号信息指用计算机通信方式接收本地或远程位点的信号信息、人数据的录入或接收信号信息的任何其它方法接收信息。所述信号信息的产生位置可与其接收位置相同，或可在不同的位置产生并传输到接收位置。
[0223] “表明”或“代表”所述含量，指所述信号信息涉及如切割产物的含量或者有无切割产物，或与其相关。例如，所述信息可以是质谱所得原始数据转化后获得的与有无切割产物相关的计算数据。
[0224] 还提供计算机程序产品，例如，包含在计算机可用介质中的计算机程序产品，所述介质载有计算机可读程序编码，此计算机可读程序编码适合运行以实施鉴定有无某结果的
方法，该方法包括(a)提供系统，该系统包括不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号
检测模块，逻辑处理模块，和数据显示组织模块；(b)检测表明有无切割产物的信号信息；
(c)由逻辑处理模块接收所述信号信息；(d)用逻辑处理模块判定有无某结果；以及数据显
示组织模块响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有无这种结果。
方法，该方法包括(a)提供系统，该系统包括不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号
检测模块，逻辑处理模块，和数据显示组织模块；(b)检测表明有无切割产物的信号信息；
(c)由逻辑处理模块接收所述信号信息；(d)用逻辑处理模块判定有无某结果；以及数据显
示组织模块响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有无这种结果。
[0225] 还提供计算机程序产品，例如，包含在计算机可用介质中的计算机程序产品，所述介质载有计算机可读程序编码，此计算机可读程序编码适合运行以实施鉴定有无某结果的
方法，该方法包括提供系统，该系统包括不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号检测
模块，逻辑处理模块，和数据显示组织模块；接收表明有无切割产物的信号信息；逻辑处理
模块判定有无某结果；数据显示组织模型响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有
无这种结果。
方法，该方法包括提供系统，该系统包括不同的软件模块，其中不同软件模块包括信号检测
模块，逻辑处理模块，和数据显示组织模块；接收表明有无切割产物的信号信息；逻辑处理
模块判定有无某结果；数据显示组织模型响应逻辑处理模块的判定，组织数据显示，表明有
无这种结果。
[0226] 例如，信号信息可以是从切割产物或扩增核酸的质谱获得的质谱数据。由于切割产物可被扩增成核酸而检测到，所述信号信息可以是受检信息，例如从切割产物产生的核
酸经化学计量获得的质谱数据。这种质谱数据可以是原始数据，例如一组数字，或例如质谱
的二维显示。可将此信号信息转换或转化成任何形式的数据，提供给计算机或由计算机系
统接收。例如，这种信号信息也可转换或转化成代表结果的鉴定数据或信息。例如，结果可
以是胎儿等位基因的比例或胎儿细胞中某特定染色体的数目。当此染色体数目高于或低于
整倍体细胞，或者，例如当一个或多个染色体，如染色体21、18或13的数目高于其它染色体
的数目时，即可鉴定为存在某染色体疾病。
酸经化学计量获得的质谱数据。这种质谱数据可以是原始数据，例如一组数字，或例如质谱
的二维显示。可将此信号信息转换或转化成任何形式的数据，提供给计算机或由计算机系
统接收。例如，这种信号信息也可转换或转化成代表结果的鉴定数据或信息。例如，结果可
以是胎儿等位基因的比例或胎儿细胞中某特定染色体的数目。当此染色体数目高于或低于
整倍体细胞，或者，例如当一个或多个染色体，如染色体21、18或13的数目高于其它染色体
的数目时，即可鉴定为存在某染色体疾病。
[0227] 还提供了鉴定有无某结果的机器，该机器包括载有不同软件模块的计算机系统，其中不同软件模块包括信号检测模块、逻辑处理模块和数据显示组织模块，其中软件模块
适合实施鉴定有无某结果的方法，该方法包含(a)检测表明有无切割产物的信号信息；(b)
由逻辑处理模块接收此信号信息；(c)用逻辑处理模块判定有无某结果，其中等位基因比
例不同于正常比例表明有染色体疾病；和(d)数据显示组织模块响应逻辑处理模块的判
定，组织数据显示，表明有无这种结果。这种机器可进一步包括存储表明有无染色体疾病的
信号信息或数据的内存模块。还提供了鉴定有无某结果的方法，所述方法包括用机器来鉴
定有无某结果。
适合实施鉴定有无某结果的方法，该方法包含(a)检测表明有无切割产物的信号信息；(b)
由逻辑处理模块接收此信号信息；(c)用逻辑处理模块判定有无某结果，其中等位基因比
例不同于正常比例表明有染色体疾病；和(d)数据显示组织模块响应逻辑处理模块的判
定，组织数据显示，表明有无这种结果。这种机器可进一步包括存储表明有无染色体疾病的
信号信息或数据的内存模块。还提供了鉴定有无某结果的方法，所述方法包括用机器来鉴
定有无某结果。
[0228] 还提供了鉴定有无某结果的方法，包括：(a)检测信号信息，此信号信息可表明有无切割产物；(b)将所述信号信息转化成鉴定数据，此鉴定数据代表有无这种结果，从而根
据该信号信息鉴定出有无这种结果；和(c)显示鉴定数据。
据该信号信息鉴定出有无这种结果；和(c)显示鉴定数据。
[0229] 还提供鉴定有无某结果的方法，包括：(a)提供表明有无切割产物的信号信息，(b)将该信号信息转化成鉴定数据，该鉴定数据代表有无这种结果，从而根据所述信号信息
鉴定出有无这种结果；和(c)显示鉴定数据。
鉴定出有无这种结果；和(c)显示鉴定数据。
[0230] 还提供鉴定有无某结果的方法，包括：(a)接收表明有无切割产物的信号信息，(b)将该信号信息转化成鉴定数据，该鉴定数据代表有无这种结果，从而根据所述信号信息
鉴定出有无这种结果；和(c)显示鉴定数据。
鉴定出有无这种结果；和(c)显示鉴定数据。
[0231] 对于这些和相似实施方式的目的而言，术语“信号信息”指可由任何电子介质包括例如计算机可读取的代表用本文方法得到的数据的信息。例如，“信号信息”可代表切割产
物或扩增核酸的含量。例如在这些实施例中，可将代表物理物质的信号信息转化成代表其
它物理物质例如染色体疾病或染色体数目的鉴定数据，例如视觉显示。可以任何合适方式
显示鉴定的数据，包括但不限于，以计算机视觉显示方式，将鉴定数据编入计算机可读介质
中，例如转移到另一电子设备(如电子记录)，或通过产生该展示的硬拷贝，例如信息的打
印件或物理记录，这种信息也可展示为听觉信号或任何其它信息通信方式。在一些实施方
式中，所述信号信息可以是用检测切割产物的方法获得的检测数据。
物或扩增核酸的含量。例如在这些实施例中，可将代表物理物质的信号信息转化成代表其
它物理物质例如染色体疾病或染色体数目的鉴定数据，例如视觉显示。可以任何合适方式
显示鉴定的数据，包括但不限于，以计算机视觉显示方式，将鉴定数据编入计算机可读介质
中，例如转移到另一电子设备(如电子记录)，或通过产生该展示的硬拷贝，例如信息的打
印件或物理记录，这种信息也可展示为听觉信号或任何其它信息通信方式。在一些实施方
式中，所述信号信息可以是用检测切割产物的方法获得的检测数据。
[0232] 一旦测得这种信号信息，就可传送至逻辑处理模块。由逻辑处理模块“判定”或“鉴定”有无有某结果。
[0233] 还提供传送遗传信息给对象的方法，包括鉴定有无某结果，其中通过测定对象样品中有无切割产物来确定有无该该结果；并将有无该结果传送给对象。在某些实施方式中，
传送方法包括传送产前遗传信息给妊娠妇女对象，这种结果可以是有无染色体异常或非整
倍体染色体。
传送方法包括传送产前遗传信息给妊娠妇女对象，这种结果可以是有无染色体异常或非整
倍体染色体。
[0234] 本文所用的术语“鉴定有无某结果”或“某结果的风险增高”指用任何方法获得此类信息，包括但不限于从实验室文件获得这种信息。实验室文件可由进行试验确定有无某
结果的实验室产生。所述实验室可以处在与鉴定实验室文件中有无该结果的人所处的相同
位置或不同位置(例如在另一国家)。例如，所述实验室文件可在一个位置产生，然后传送
到另一位置，其中的信息经后一位置传送给对象。在某些实施方式中，所述实验室文件可以
是有形形式或电子形式(例如计算机可读形式)。
结果的实验室产生。所述实验室可以处在与鉴定实验室文件中有无该结果的人所处的相同
位置或不同位置(例如在另一国家)。例如，所述实验室文件可在一个位置产生，然后传送
到另一位置，其中的信息经后一位置传送给对象。在某些实施方式中，所述实验室文件可以
是有形形式或电子形式(例如计算机可读形式)。
[0235] 本文所用的术语“传送有无这种结果给对象”或传送本文所述的任何其它信息，指以合适的介质，包括但不限于语言、文档或文件形式，将所述信息传达给对象、或其家庭成
员、监护人或指派人。
员、监护人或指派人。
[0237] 术语“根据产前遗传信息提供医学处方”指以合适的介质，包括但不限于语言、文档或文件形式，将所述处方传达给对象、或其家庭成员、监护人或指派人。
[0238] 例如，这种医学处方可以是由医学专业人员根据产前遗传信息的审阅所确定的任何方式。例如，所述处方可以指定妊娠妇女对象应作羊膜穿刺。或在另一实施例中，所述医
学处方可以指定对象应作另一种基因检测试验。在另一实施例中，所述医学处方可以是不
必作进一步基因检测的医学劝告。
学处方可以指定对象应作另一种基因检测试验。在另一实施例中，所述医学处方可以是不
必作进一步基因检测的医学劝告。
[0239] 还提供了文件，例如包括怀孕妇女对象的胎儿有无染色体疾病的文件，其中根据对象样品中有无切割产物来确定有无这种结果。
[0240] 还提供了文件，例如包括对象有无某结果的文件，其中根据对象样品中有无切割产物来确定有无这种结果。例如，所述文件可以是但不限于：计算机可读文件、纸质文件或
医学记录文件。
医学记录文件。
[0242] 本文所述的系统可进一步包括计算机系统的通用组件，例如网络服务器、笔记本电脑系统、桌面电脑系统、手持系统、个人数字助理、计算机自助服务终端等。这种计算机系统可包括一种或多种输入方式，例如键盘、触摸屏、鼠标、语音识别或允许用户输入数据到
系统内的其它方式。这种系统也可包括一种或多种输出方式，例如CRT或LCD显示屏，扬声
器、传真机、击打式打印机、喷墨打印机、黑白或彩色激光打印机或其它方式提供视觉、听觉信息或硬拷贝输出信息。
系统内的其它方式。这种系统也可包括一种或多种输出方式，例如CRT或LCD显示屏，扬声
器、传真机、击打式打印机、喷墨打印机、黑白或彩色激光打印机或其它方式提供视觉、听觉信息或硬拷贝输出信息。
[0243] 可将输入和输出方式连接于中央处理单元，该单元可含有执行程序指令的微处理器和存储程序密码与数据的存储器和其它组件。在一些实施方式中，所述方法由位于一处
地理位置的单用户系统实施。在其它实施方式中，所述方法由多用户系统实施。在多用户
实施的情况中，可通过网络方式连接多个中央处理单元。这种网络可以是本地网络，覆盖位
于某建筑物一部分中的一个部门、整个建筑物、跨越多个建筑物、跨区域、跨全国或是全球
网络。所述网络可以是私人网络、由提供商持有并控制，或可借助英特网的服务实施，用户
可接入网页输入或获取信息。
地理位置的单用户系统实施。在其它实施方式中，所述方法由多用户系统实施。在多用户
实施的情况中，可通过网络方式连接多个中央处理单元。这种网络可以是本地网络，覆盖位
于某建筑物一部分中的一个部门、整个建筑物、跨越多个建筑物、跨区域、跨全国或是全球
网络。所述网络可以是私人网络、由提供商持有并控制，或可借助英特网的服务实施，用户
可接入网页输入或获取信息。
[0244] 需要时，可将实施本发明产品和方法相关的各种软件模块适当地安装在计算机系统内，或者可将软件编码存储在计算机可读介质如软盘、磁带或光盘等上。在联机实施中，
可将机构维护的服务器和网站设置成能为远程用户提供软件下载。本文所用的“模块”包
括其语法变体，指可与更大系统一起使用的自成体系的功能单元。例如，软件模块是执行特
定任务程序的一部分。因此，本文提供包括一种或多种本文所述软件模块的机器，所述机器
可以是但不限于：装有存储装置如软盘、磁带、光盘、随机存取存储器和/或硬盘驱动器的
计算机(如服务器)。
可将机构维护的服务器和网站设置成能为远程用户提供软件下载。本文所用的“模块”包
括其语法变体，指可与更大系统一起使用的自成体系的功能单元。例如，软件模块是执行特
定任务程序的一部分。因此，本文提供包括一种或多种本文所述软件模块的机器，所述机器
可以是但不限于：装有存储装置如软盘、磁带、光盘、随机存取存储器和/或硬盘驱动器的
计算机(如服务器)。
[0245] 可采用硬件、软件或其组合实施本发明方法，可在计算机系统或其它处理系统中实施。示范性的计算机系统包括一个或多个处理器。处理器可以与通信总线连接。所述计
算机系统包括主存储器，有时为随机读取存储器(RAM)，也可包括第二存储器。第二存储器
可包括例如硬盘驱动器和/或可移动存储驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、
存储卡等。可移动存储驱动器以熟知方式从可移动存储单元读取和/或向其写入。可移
动存储单元包括但不限于：软盘、磁带、光盘等，例如，它可通过可移动存储驱动器读取和写入。应当理解，所述可移动存储单元包括其中存储有计算机软件和/或数据的计算机可用
存储介质。
算机系统包括主存储器，有时为随机读取存储器(RAM)，也可包括第二存储器。第二存储器
可包括例如硬盘驱动器和/或可移动存储驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、
存储卡等。可移动存储驱动器以熟知方式从可移动存储单元读取和/或向其写入。可移
动存储单元包括但不限于：软盘、磁带、光盘等，例如，它可通过可移动存储驱动器读取和写入。应当理解，所述可移动存储单元包括其中存储有计算机软件和/或数据的计算机可用
存储介质。
[0246] 在替代实施方式中，第二存储器包括其它类似的方式而允许计算机程序或其它指令装载到计算机系统。例如，这些方式包括可移动存储单元和接口设备。其例子包括程序
盒和盒接口(例如在视频游戏设备中见到的那种)、可移动存储芯片(例如EPROM或PROM)
以及关联插座，和允许软件和数据从可移动存储单元转移到计算机系统的其它可移动存储
单元的接口。
盒和盒接口(例如在视频游戏设备中见到的那种)、可移动存储芯片(例如EPROM或PROM)
以及关联插座，和允许软件和数据从可移动存储单元转移到计算机系统的其它可移动存储
单元的接口。
[0247] 这种计算机系统也可包括通信接口。通信接口允许软件和数据在计算机系统和外部设备之间转移。通信接口的例子包括调制解调器、网络接口(例如以太网卡)、通信端口、
PCMCIA槽和卡等。经通信接口转移的软件和数据是信号形式，可以是能被通信接口接收的
电子、电磁、光学、或其它信号。这些信号经通道提供给通信接口。这种通道可携带信号，能利用电线或电缆、光纤、电话线、手机连接、RF连接和其它通信通道实施信号传输。因此，在一个实施例中，可利用通信接口接收需由信号检测模块测定的信号信息。
PCMCIA槽和卡等。经通信接口转移的软件和数据是信号形式，可以是能被通信接口接收的
电子、电磁、光学、或其它信号。这些信号经通道提供给通信接口。这种通道可携带信号，能利用电线或电缆、光纤、电话线、手机连接、RF连接和其它通信通道实施信号传输。因此，在一个实施例中，可利用通信接口接收需由信号检测模块测定的信号信息。
[0248] 在相关方面，可通过多种方式，包括但不限于人工输入设备或直接数据录入装置(DDE)输入所述信号信息。例如，人工设备包括键盘、概念键盘、触敏屏、光笔、鼠标、轨迹球、操纵杆、图形平板、扫描仪、数码相机、视频数字化仪和语音识别设备。例如，DDE可包括条码阅读器，磁条码、智能卡、磁墨字符识别、光学字符识别、光学标记识别和周转文档
(turnaround document)。在一种实施方式中，基因或芯片的输出可作为输入信号。
实施例
(turnaround document)。在一种实施方式中，基因或芯片的输出可作为输入信号。
实施例
[0249] 陈述以下实施例来说明而非限制本发明技术。
[0250] 实施例1：采用含有内切核酸酶切割底物的引物检测核酸的通用方法
[0251] 可采用3’末端封闭的脱碱基寡核苷酸和AP内切核酸酶扩增和/或检测靶核酸序列。也可采用含有其它内切核酸酶切割位点(限制性酶或切口酶)的封闭寡核苷酸扩增和
/或检测靶核酸序列。3’末端封闭可防止寡核苷酸被用于引物延伸或靶扩增。这种脱碱基
位点或限制性内切核酸酶识别位点允许内切核酸酶特异性切所述割寡核苷酸。所述方法
适合于利用热稳定性内切核酸酶，因而允许所述方法与热循环技术(例如PCR、热循环测序
等)联用。
/或检测靶核酸序列。3’末端封闭可防止寡核苷酸被用于引物延伸或靶扩增。这种脱碱基
位点或限制性内切核酸酶识别位点允许内切核酸酶特异性切所述割寡核苷酸。所述方法
适合于利用热稳定性内切核酸酶，因而允许所述方法与热循环技术(例如PCR、热循环测序
等)联用。
[0252] 该通用方法包括：(i)在杂交条件下使寡核苷酸接触核酸组合物，(ii)在切割条件下切割内切核酸酶切割位点，和(iii)在延伸或扩增条件下延伸该功能性切割位点。在
一些实施方式中，在(iii)后包括检测步骤。
一些实施方式中，在(iii)后包括检测步骤。
[0253] 本文所述的寡核苷酸组合物可用于直接检测核酸或用于防止不准确的模板引导导致不需要的非目标产物(例如引物二聚体等)。可将所述寡核苷酸设计成含有与靶核酸
互补的序列或与靶核酸邻近序列互补的序列。所述寡核苷酸包含在引物中心处或靠近中心
处的内切核酸酶切割位点，和3’末端封闭剂。所述寡核苷酸也包含用于检测或鉴定(i)靶
核酸，或(ii)用于完成反应中特定步骤或完成整个反应的一种或多种捕获剂和/或特征。
可将所述寡核苷酸的序列设计成该完整寡核苷酸的退火温度(Tm)接近热稳定性聚合酶和
/或热稳定性内切核酸酶功能最优时的温度，并且切下的寡核苷酸片段的Tm低于该完整寡
核苷酸。以此方式设计的寡核苷酸可容易地用于热循环方法，其中延伸反应用的温度将导
致一些或全部被切割的引物片段从模板解离。可通过正在推进的聚合酶的链置换活性，置
换尚未解离但处在聚合酶从上游寡核苷酸延伸途径中的那些引物。也可将寡核苷酸设计成
内切核酸酶切割位点5’方向的寡核苷酸部分的Tm能允许切割位点上游部分保持退火并起
着聚合酶延伸或扩增的引导位点作用。下文实施例中提供了补充方法的具体细节。
互补的序列或与靶核酸邻近序列互补的序列。所述寡核苷酸包含在引物中心处或靠近中心
处的内切核酸酶切割位点，和3’末端封闭剂。所述寡核苷酸也包含用于检测或鉴定(i)靶
核酸，或(ii)用于完成反应中特定步骤或完成整个反应的一种或多种捕获剂和/或特征。
可将所述寡核苷酸的序列设计成该完整寡核苷酸的退火温度(Tm)接近热稳定性聚合酶和
/或热稳定性内切核酸酶功能最优时的温度，并且切下的寡核苷酸片段的Tm低于该完整寡
核苷酸。以此方式设计的寡核苷酸可容易地用于热循环方法，其中延伸反应用的温度将导
致一些或全部被切割的引物片段从模板解离。可通过正在推进的聚合酶的链置换活性，置
换尚未解离但处在聚合酶从上游寡核苷酸延伸途径中的那些引物。也可将寡核苷酸设计成
内切核酸酶切割位点5’方向的寡核苷酸部分的Tm能允许切割位点上游部分保持退火并起
着聚合酶延伸或扩增的引导位点作用。下文实施例中提供了补充方法的具体细节。
[0254] 为在延伸或扩增反应中可用于解除被封闭寡核苷酸的封闭，应将未封闭的寡核苷酸设计成在其退火温度或该温度以上会发生解除封闭反应。若它们在显著较低温度下解除
封闭，所述聚合酶可能会启动非特异性退火的寡核苷酸扩增。此外，所述内切核酸酶用于解
除寡核苷酸封闭时应保留游离3’羟基，而使聚合酶可延伸该寡核苷酸。对所述寡核苷酸的
3’末端设计要求最低特异性的位点特异性内切核酸酶允许最大的灵活性。
封闭，所述聚合酶可能会启动非特异性退火的寡核苷酸扩增。此外，所述内切核酸酶用于解
除寡核苷酸封闭时应保留游离3’羟基，而使聚合酶可延伸该寡核苷酸。对所述寡核苷酸的
3’末端设计要求最低特异性的位点特异性内切核酸酶允许最大的灵活性。
[0255] 实施例2：用含有内切核酸酶切割底物的封闭引物和热稳定性内切核酸酶扩增靶核酸组合物
[0256] 可采用含有内切核酸酶切割底物(脱碱基位点或限制性内切核酸酶位点)和含有适合用作捕获剂或可检测特征的5’特征的3’封端寡核苷酸，和一种或多种未修饰引物(例
如正向和/或反向引物)执行本方法，或者可采用含有内切核酸酶切割底物(脱碱基位点
或限制性内切核酸酶位点)和适合用作捕获剂或可检测特征的可选5’特征的两种或多种
3’封端寡核苷酸执行所述方法。对于采用含有内切核酸酶切割底物的两种或多种3’封端
寡核苷酸的实施方式，切割位点5’方向寡核苷酸部分的Tm与延伸或扩增条件所用温度应
基本上相似。可将切割位点3’方向的被切割寡核苷酸部分的Tm设计成低于延伸或扩增条
件所用的温度。对于只用一条含内切核酸酶切割位点的3’封端寡核苷酸的实施方式，可将
所述寡核苷酸的序列设计成其两个切割片段的Tm均低于延伸或扩增条件所用的温度。
如正向和/或反向引物)执行本方法，或者可采用含有内切核酸酶切割底物(脱碱基位点
或限制性内切核酸酶位点)和适合用作捕获剂或可检测特征的可选5’特征的两种或多种
3’封端寡核苷酸执行所述方法。对于采用含有内切核酸酶切割底物的两种或多种3’封端
寡核苷酸的实施方式，切割位点5’方向寡核苷酸部分的Tm与延伸或扩增条件所用温度应
基本上相似。可将切割位点3’方向的被切割寡核苷酸部分的Tm设计成低于延伸或扩增条
件所用的温度。对于只用一条含内切核酸酶切割位点的3’封端寡核苷酸的实施方式，可将
所述寡核苷酸的序列设计成其两个切割片段的Tm均低于延伸或扩增条件所用的温度。
[0257] 图1说明的方法实施方式采用含有AP内切核酸酶切割底物和5’捕获剂的3’封端脱碱基寡核苷酸。图2说明的方法实施方式采用至少两种含有AP内切核酸酶切割位点
的3’封端脱碱基寡核苷酸。
的3’封端脱碱基寡核苷酸。
[0258] 图3说明用作杂交探针或作为封闭寡核苷酸用于延伸或扩增方法的双寡核苷酸结构。这种设计可用作内部杂交探针或用作封闭引物试验。这两种寡核苷酸与靶核酸的相
邻区域互补。在正确的Tm(例如本实施例中为60℃)下，它们彼此相邻退火，在杂交的寡核
苷酸之间留有小数量的一些碱基。上游寡核苷酸的3’端与下游寡核苷酸的5’端互补，而
不与模板DNA中的任何序列互补。内切核酸酶将识别并切割此结构，释放生物素化标记和
留下游离3’羟基。在某些实施方式中，所述寡核苷酸也可通过在上游寡核苷酸3’端加入
荧光部分(例如FAM)和在下游寡核苷酸5’端加入淬灭剂而用于荧光试验。
邻区域互补。在正确的Tm(例如本实施例中为60℃)下，它们彼此相邻退火，在杂交的寡核
苷酸之间留有小数量的一些碱基。上游寡核苷酸的3’端与下游寡核苷酸的5’端互补，而
不与模板DNA中的任何序列互补。内切核酸酶将识别并切割此结构，释放生物素化标记和
留下游离3’羟基。在某些实施方式中，所述寡核苷酸也可通过在上游寡核苷酸3’端加入
荧光部分(例如FAM)和在下游寡核苷酸5’端加入淬灭剂而用于荧光试验。
[0259] 图4说明含有内部茎环结构的寡核苷酸，可在延伸或扩增方法中用作杂交探针或封闭的寡核苷酸。这种寡核苷酸可含有与靶核酸相邻区域互补的多个区域。在正确的
Tm(例如本实施例中为60℃)下，这些区域彼此相邻退火，在杂交的寡核苷酸之间留有小数
量的一些碱基。所述寡核苷酸的内部区域形成不与模板DNA中任何序列互补的茎环结构。
这种内部结构的Tm太低不能形成茎环结构，除非与模板(例如逆转的分子信标)的5’和
3’二端退火使两侧并到一起。在一些实施方式中，所述寡核苷酸也可通过在上游寡核苷酸
的3’端或在环结构内部加入荧光部分(例如FAM)和在下游寡核苷酸5’端加入淬灭分子
而用于荧光试验。可将所述内切核酸酶切割位点设计成包括或排除两部分可检测特征(例
如两部分荧光团系统)的方式，而切掉茎环。
Tm(例如本实施例中为60℃)下，这些区域彼此相邻退火，在杂交的寡核苷酸之间留有小数
量的一些碱基。所述寡核苷酸的内部区域形成不与模板DNA中任何序列互补的茎环结构。
这种内部结构的Tm太低不能形成茎环结构，除非与模板(例如逆转的分子信标)的5’和
3’二端退火使两侧并到一起。在一些实施方式中，所述寡核苷酸也可通过在上游寡核苷酸
的3’端或在环结构内部加入荧光部分(例如FAM)和在下游寡核苷酸5’端加入淬灭分子
而用于荧光试验。可将所述内切核酸酶切割位点设计成包括或排除两部分可检测特征(例
如两部分荧光团系统)的方式，而切掉茎环。
[0260] 采用上述相同的策略设计这种双寡核苷酸结构和茎环结构寡核苷酸。利用图2-4所述种类的寡核苷酸的方案与图1说明的实施方式基本上相似。
[0261] 图1说明在采用5’→3’外切核酸酶活性缺失的DNA聚合酶的PCR试验中，利用Tth内切核酸酶IV切割内部杂交探针的方法。在此具体实施方式中，试验采用了未修饰的
正向引物、未修饰的反向引物和含有内部脱碱基位点的生物素化内部杂交探针。封闭该探
针的3’端以防止延伸。退火时，内切核酸酶在脱碱基位点切割。切下的探针片段含有游
离3’羟基但不被聚合酶延伸，因为此片段的Tm低于完整寡核苷酸组合物的退火温度。图
3-7说明采用本文所述延伸和扩增方法从切下的封闭引物延伸寡核苷酸的MALDI质谱检测
结果。
正向引物、未修饰的反向引物和含有内部脱碱基位点的生物素化内部杂交探针。封闭该探
针的3’端以防止延伸。退火时，内切核酸酶在脱碱基位点切割。切下的探针片段含有游
离3’羟基但不被聚合酶延伸，因为此片段的Tm低于完整寡核苷酸组合物的退火温度。图
3-7说明采用本文所述延伸和扩增方法从切下的封闭引物延伸寡核苷酸的MALDI质谱检测
结果。
[0262] 此试验所用的DNA聚合酶不含有TaqMan试验所需的5’→3’外切核酸酶活性。此探针不被DNA聚合酶切割。
[0263] 缺失5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的例子包括Deep VentRTM(无外切活性)DNA聚合酶，Phire热启动DNA聚合酶，Phusion DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的Stoffel
片段。
片段。
[0264] ●Deep VentRTM(无外切活性)DNA聚合酶(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich MA))经遗传工程改造消除了Deep Vent DNA聚合酶相关的3′→5′外切核酸酶
校正活性。Deep VentR DNA聚合酶纯化自携带古细菌GB～D种类的Deep VentR DNA聚合
酶基因的大肠杆菌菌株。
校正活性。Deep VentR DNA聚合酶纯化自携带古细菌GB～D种类的Deep VentR DNA聚合
酶基因的大肠杆菌菌株。
[0265] ●Phire热启动DNA聚合酶(芬酶有限公司(Finnzymes，Inc.)，马萨诸塞州沃本(Woburn MA)是通过融合DNA聚合酶(橙色)与小双链DNA结合蛋白(黄色)而构建。本
发明技术提高了此聚合酶的持续合成能力，改善了其总体性能。它含有3’→5’外切核酸
酶活性但没有5’→3’外切核酸酶活性。
发明技术提高了此聚合酶的持续合成能力，改善了其总体性能。它含有3’→5’外切核酸
酶活性但没有5’→3’外切核酸酶活性。
[0266] ●Phusion DNA聚合酶(芬酶有限公司，马萨诸塞州沃本)是一种融合了新型古细菌样DNA聚合酶与持续合成能力增强功能域的嵌合蛋白。它含有3’→5’外切核酸酶活
性但没有5’→3’外切核酸酶活性。
性但没有5’→3’外切核酸酶活性。
[0267] ●Stoffel片段(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州福斯特市(Foster City CA))是截短版本的Taq DNA聚合酶蛋白，缺失5’→3’外切核酸酶结
构域。
构域。
[0268] 采用以下寡核苷酸序列证明，在扩增反应中可用Tth内切核酸酶IV切割内部杂交探针。所有以下的实施例均采用20μL反应液，这20μL反应液含有：1X Thermopol缓冲液
(20mM Tris～HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4和0.1％Triton X～100)，25μM
ZnCl2，125μM dATP，125μM dCTP，125μM dGTP，125μM dTTP，2.5单位Tth内切核酸酶IV和5ng人基因组DNA。每20μL反应加入1单位DNA聚合酶。
(20mM Tris～HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4和0.1％Triton X～100)，25μM
ZnCl2，125μM dATP，125μM dCTP，125μM dGTP，125μM dTTP，2.5单位Tth内切核酸酶IV和5ng人基因组DNA。每20μL反应加入1单位DNA聚合酶。
[0269] 注明/5BioTEG/的寡核苷酸序列含有通过延伸15个原子的间隔臂与寡核苷酸5’端连接的生物素。注明/dSpacer/或/idSp/的寡核苷酸序列含有1’，2’-双脱氧核糖或
dSpacer。这种1’，2’-双脱氧核糖修饰用于在寡核苷酸内引入稳定的脱碱基位点。此种修
饰处可被Tth内切核酸酶IV切割。它比标准的脱碱基位点更稳定，也可称为脱碱基呋喃。
注明/3Phos/的寡核苷酸序列在3’位置含有磷酸。此实施例中采用3’磷酸(代替3’羟
基)防止DNA聚合酶延伸所述杂交寡核苷酸。也可取代3’末端的其它部分以防止DNA聚合
酶延伸所述寡核苷酸。这些部分包括但不限于：3′氨基修饰剂，3′生物素，3’生物素TEG，
3′胆固醇-TEG，3′地高辛，3′硫醇，3′反转dT或3′C3间隔子。
dSpacer。这种1’，2’-双脱氧核糖修饰用于在寡核苷酸内引入稳定的脱碱基位点。此种修
饰处可被Tth内切核酸酶IV切割。它比标准的脱碱基位点更稳定，也可称为脱碱基呋喃。
注明/3Phos/的寡核苷酸序列在3’位置含有磷酸。此实施例中采用3’磷酸(代替3’羟
基)防止DNA聚合酶延伸所述杂交寡核苷酸。也可取代3’末端的其它部分以防止DNA聚合
酶延伸所述寡核苷酸。这些部分包括但不限于：3′氨基修饰剂，3′生物素，3’生物素TEG，
3′胆固醇-TEG，3′地高辛，3′硫醇，3′反转dT或3′C3间隔子。
[0270] 图5说明采用含有内部杂交探针的寡核苷酸作Tth内切核酸酶试验。用DeepVent(无外切活性)DNA聚合酶和3步热循环方案进行此试验，热循环方案为95℃3分钟，然
后95℃20秒和60℃2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物
素部分的分子来纯化反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该
基因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
后95℃20秒和60℃2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物
素部分的分子来纯化反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该
基因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
[0271] 正向引物：SRY.CTA.Tth.f3 GAATGCGAAACTCAGAGATCA
[0272] 反向引物：SRY.CTA.Tth.r3 CCTGTAATTTCTGTGCCTCCT
[0273] 内部探针：SRY.CTA.Tth.p3
[0274] /5BioTEG/ACTGAAGCC/dSpacer/AAAAATGGCCATTC/3 Phos/
[0275] MALDI分析物：/5BioTEG/ACTGAAGCC
[0276] 此完整探针的质量为7855.3道尔顿，切下的标记或分析物的质量为3277.4道尔顿。
[0277] 图6说明采用含有内部杂交探针的寡核苷酸作Tth内切核酸酶试验。用DeepVent(无外切活性)DNA聚合酶和2步热循环方案进行此试验，热循环方案为：95℃ 3分钟，
然后95℃ 20秒和60℃ 2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生
物素部分的分子来纯化反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该
基因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
然后95℃ 20秒和60℃ 2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生
物素部分的分子来纯化反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该
基因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
[0278] 正向引物：SRY.CTA.Tth.f4 AAATG CTTACTGAAGCCGAAA
[0279] 反向引物：SRY.CTA.Tth.r4 CG GGTATTTCTCTCTGTG CAT
[0280] 内部探针：SRY.CTA.Tth.p4
[0281] /5 BioTEG/CAG GAG GCA/dSpacer/AGAAATTACAGGCC/3 Phos/
[0282] MALDI分析物：/5BioTEG/CAGGAGGCA
[0283] 此完整探针的质量为7945.4道尔顿，切下的标记或分析物的质量为3342.4道尔顿。
[0284] 图7说明采用含有内部杂交探针的寡核苷酸作Tth内切核酸酶试验。用Taq DNA聚合酶的Stoffel片段和3步热循环方案进行此试验，热循环方案为：95℃ 3分钟，然后
95℃ 20秒和60℃ 2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物素
部分的分子来纯化反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该基
因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
95℃ 20秒和60℃ 2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物素
部分的分子来纯化反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该基
因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
[0285] 正向引物：SRY.CTA.Tth.f2 GTCCAG CTGTGCAAGAGAATA
[0286] 反向引物：SRY.CTA.Tth.r2 TACAG CTTTCAGTGCAAAGGA
[0287] 内部探针：SRY.CTA.Tth.p2
[0288] /5BioTEG/CGC TCT CCG/dSpacer/AGAAGCTCT TCCT/3Phos/
[0289] MALDI分析物：/5BioTEG/CGCTCTCCG
[0290] 此完整探针的质量为7452.0道尔顿，切下的标记或分析物的质量为3220.4道尔顿。
[0291] 图8说明采用含有内部杂交探针的寡核苷酸作Tth内切核酸酶试验。用Phusion热启动DNA聚合酶和2步热循环方案进行此试验，热循环方案为：95℃ 3分钟，然后95C 20
秒和60℃ 2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物素部分的
分子来纯化反应物。所述设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该基因
是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
秒和60℃ 2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物素部分的
分子来纯化反应物。所述设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该基因
是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
[0292] 正向引物：SRY.CTA.Tth.f2 GTCCAG CTGTGCAAGAGAATA
[0293] 反向引物：SRY.CTA.Tth.r2 TACAG CTTTCAGTGCAAAGGA
[0294] 内部探针：SRY.CTA.Tth.p2
[0295] /5BioTEG/CGCTCTCCG/dSpacer/AGAAGCTCTTCCT/3Phos/
[0296] MALDI分析物：/5BioTEG/CGCTCTCCG
[0297] 此完整探针的质量为7452.0道尔顿，切下的标记或分析物的质量为3220.4道尔顿。
[0298] 图9说明采用含有内部杂交探针的寡核苷酸作Tth内切核酸酶试验。用Phire DNA聚合酶和2步热循环方案进行此试验，热循环方案为：95℃ 3分钟，然后95℃ 20秒和60℃
2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物素部分的分子来纯化
反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该基因是性别决定区域
Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
2分钟共99轮循环。随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获含5’生物素部分的分子来纯化
反应物。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的寡核苷酸序列，该基因是性别决定区域
Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
[0299] 正向引物：SRY.CTA.Tth.f2 GTCCAG CTGTGCAAGAGAATA
[0300] 反向引物：SRY.CTA.Tth.r2 TACAG CTTTCAGTGCAAAGGA
[0301] 内部探针：SRY.CTA.Tth.p2
[0302] /5BioTEG/CGCTCTCCG/dSpacer/AGAAGCTCTTCCT/3Phos/
[0303] MALDI分析物：/5BioTEG/CGCTCTCCG
[0304] 此完整探针的质量为7452.0道尔顿，切下的标记或分析物的质量为3220.4道尔顿。
[0305] 图1-9是采用由脱碱基位点形成AP内切核酸酶切割位点的寡核苷酸的示范性实施方式。本领域技术人员知道，限制性酶也是内切核酸酶，并且某些限制性酶也是热稳定性
的。因此，上述实施例也可包括用限制性内切核酸酶或切口内切核酸酶切割底物替换脱碱
基AP内切核酸酶底物，和用热稳定性限制性酶或切口酶替换热稳定性AP内切核酸酶的修
饰。
的。因此，上述实施例也可包括用限制性内切核酸酶或切口内切核酸酶切割底物替换脱碱
基AP内切核酸酶底物，和用热稳定性限制性酶或切口酶替换热稳定性AP内切核酸酶的修
饰。
[0306] 实施例3：采用含热稳定限制性内切核酸酶与5’捕获和/或检测特征的寡核苷酸扩增靶核酸组合物；热度对限制性内切核酸酶的影响
[0307] 限制性内切核酸酶在长时间反应中保持活性的能力有所不同。对很多分子生物学应用而言，宜采用可灭活限制性内切核酸酶的方法。例如，如果切下的片段随后在克隆实验
中连接入质粒中，宜灭活限制性酶使其不干扰后续操作(例如切割质粒内或连接片段内可
能存在的限制性序列)。
中连接入质粒中，宜灭活限制性酶使其不干扰后续操作(例如切割质粒内或连接片段内可
能存在的限制性序列)。
[0308] 对大多数分子生物学应用而言，能否灭活限制性酶的酶活性很重要。大多数限制性内切核酸酶能够被“热灭活”已有描述。灭活限制性内切核酸酶的一种常用方法是加热
酶蛋白质使之变性。最优孵育温度37℃的限制性内切核酸酶中大多数可通过65℃孵育20
分钟而灭活。80℃孵育20分钟可灭活很多其它酶。也有些限制性内切核酸酶加热不易灭
活。因此，了解具体限制性内切核酸酶的耐热性或耐热半衰期对于设计寡核苷酸组合物和
热循环方案很重要。
酶蛋白质使之变性。最优孵育温度37℃的限制性内切核酸酶中大多数可通过65℃孵育20
分钟而灭活。80℃孵育20分钟可灭活很多其它酶。也有些限制性内切核酸酶加热不易灭
活。因此，了解具体限制性内切核酸酶的耐热性或耐热半衰期对于设计寡核苷酸组合物和
热循环方案很重要。
[0309] 表1，“限制性内切核酸酶耐热性的示范例子”，提供了65℃孵育20分钟，80℃孵育20分钟可灭活或者加热不可灭活的限制性内切核酸酶的若干例子。对于加热可灭活的酶，
列出了实现灭活所需的时间和温度。此信息系从NEB公司网站(互联网址URL neb.com)
所列数据而编制。实施例9中提供了热稳定限制性内切核酸酶的更详尽列表。
列出了实现灭活所需的时间和温度。此信息系从NEB公司网站(互联网址URL neb.com)
所列数据而编制。实施例9中提供了热稳定限制性内切核酸酶的更详尽列表。
[0310] 表1
[0311]酶 热灭活 灭活温度 灭活时间
BamHI 否 ～～ ～～
BstUI 否 ～～ ～～
EcoRI 能 65℃ 20分钟
EcoRI～HFTM 能 65℃ 20分钟
EcoRV 能 80℃ 20分钟
EcoRV～HF 能 65℃ 20分钟
HaeII 能 80℃ 20分钟
HaeIII 能 80℃ 20分钟
HindIII 能 65℃ 20分钟
PvuII 否 ～～ ～～
PvuII～HFTM 能 80℃ 20分钟
XmaI 能 65℃ 20分钟
BamHI 否 ～～ ～～
BstUI 否 ～～ ～～
EcoRI 能 65℃ 20分钟
EcoRI～HFTM 能 65℃ 20分钟
EcoRV 能 80℃ 20分钟
EcoRV～HF 能 65℃ 20分钟
HaeII 能 80℃ 20分钟
HaeIII 能 80℃ 20分钟
HindIII 能 65℃ 20分钟
PvuII 否 ～～ ～～
PvuII～HFTM 能 80℃ 20分钟
XmaI 能 65℃ 20分钟
[0312] 表1所列不同酶耐受长时间高温的能力有所不同。一旦被克隆后，可在体外进一步工程改造限制性内切核酸酶以特异性改变其性能，如热灭活或耐受性能。
[0313] 一些改良的限制性内切核酸酶保留与其天然酶相同的识别特异性。然而，某些性能也被改变，包括耐热性。为区分例举的这些工程改造酶与NEB公司网站中的酶，将工程改
TM
造的酶列为“高保真(HF)”限制性酶，在表1中用字母HF 表示。例如，天然PvuII酶不能
TM
热灭活，而工程改造的PvuII-HF 酶通过80℃孵育20分钟被容易地灭活。虽然大多数分
子生物学方法通常倾向避免使用耐热酶而偏爱可被热灭活的酶，但在本文所述试验中研究
的是耐热酶。
TM
造的酶列为“高保真(HF)”限制性酶，在表1中用字母HF 表示。例如，天然PvuII酶不能
TM
热灭活，而工程改造的PvuII-HF 酶通过80℃孵育20分钟被容易地灭活。虽然大多数分
子生物学方法通常倾向避免使用耐热酶而偏爱可被热灭活的酶，但在本文所述试验中研究
的是耐热酶。
[0314] 图10说明采用含有5’捕获剂和/或可检测特征和热稳定限制性内切核酸酶切割底物序列的寡核苷酸组合物的方法。该方法采用了正向和反向引物寡核苷酸。所述寡核苷
酸之一含5’生物素。还含有限制性内切核酸酶识别位点，在靶DNA内由正向和反向引物寡
核苷酸限定的区段内没有该位点的序列。在PCR过程中合成第二链时，将复制此寡核苷酸
内的限制性内切核酸酶位点和任何其它序列。此两种寡核苷酸延伸形成双链限制性位点。
限制性内切核酸酶将切割此双链模板释放生物素化标记。未退火的单链引物不被切割。进
行限制性内切核酸酶消化可在PCR过程中在约50℃-75℃温度范围内用酶切割，或在PCR
后在约25℃-37℃温度范围用酶切割。
酸之一含5’生物素。还含有限制性内切核酸酶识别位点，在靶DNA内由正向和反向引物寡
核苷酸限定的区段内没有该位点的序列。在PCR过程中合成第二链时，将复制此寡核苷酸
内的限制性内切核酸酶位点和任何其它序列。此两种寡核苷酸延伸形成双链限制性位点。
限制性内切核酸酶将切割此双链模板释放生物素化标记。未退火的单链引物不被切割。进
行限制性内切核酸酶消化可在PCR过程中在约50℃-75℃温度范围内用酶切割，或在PCR
后在约25℃-37℃温度范围用酶切割。
[0315] 优选切割后留下钝端的限制性内切核酸，因为某些DNA聚合酶在限制性内切核酸酶切割后不大可能修饰钝端，因而不大可能改变分析物的预期质量。可采用留下粘性末端
(3′突出端或5′突出端)的限制性内切核酸酶，但应监测某些DNA聚合酶的3’→5’外切
核酸酶活性可能导致的二级结构修饰如3’“钝化”，或某些DNA聚合酶导致的3’端补平。
(3′突出端或5′突出端)的限制性内切核酸酶，但应监测某些DNA聚合酶的3’→5’外切
核酸酶活性可能导致的二级结构修饰如3’“钝化”，或某些DNA聚合酶导致的3’端补平。
[0316] 除限制性内切核酸酶外，热稳定性“切口酶”可用于释放生物素化标记。切口酶只切割双链DNA两条链中的一条。所述方法也可通过在含上游限制性位点的该寡核苷酸的5’
端加入荧光标记(例如FAM)和在该寡核苷酸3，端加入淬灭剂而用于荧光试验。在一些实
施方式中，可通过标记正向和反向寡核苷酸而倍增荧光信号。
端加入荧光标记(例如FAM)和在该寡核苷酸3，端加入淬灭剂而用于荧光试验。在一些实
施方式中，可通过标记正向和反向寡核苷酸而倍增荧光信号。
[0317] 下文提供可用于本文所述方法的热稳定限制性内切核酸酶的非限制性例子。可获得很多其它限制性内切核酸酶。可体外改变限制性内切核酸酶的其它克隆序列使表达的酶
蛋白具有改变的表型，例如耐热性提高。此外，若干嗜热菌的限制性酶(例如NEB公司的来
自丝状栖热菌(Thermus filiformis)的TfiI基因)已可购买到或将可购买到。以下实施
例所用的DNA聚合酶不含有TaqMan试验所需的5’→3’外切核酸酶活性。所述标记或分
析物不会被这种DNA聚合酶切割。
蛋白具有改变的表型，例如耐热性提高。此外，若干嗜热菌的限制性酶(例如NEB公司的来
自丝状栖热菌(Thermus filiformis)的TfiI基因)已可购买到或将可购买到。以下实施
例所用的DNA聚合酶不含有TaqMan试验所需的5’→3’外切核酸酶活性。所述标记或分
析物不会被这种DNA聚合酶切割。
[0318] 图11-15显示用PvuII限制性内切核酸酶切割5′标记或分析物的特异性。PvuII在识别序列CAGCTG处切割双链DNA。此反应为特异性反应，因为若PCR反应中无PvuII限
制性内切核酸酶或DNA就不产生这种分析物。反应的特异性还表现为37℃孵育前必须经过
热循环方能产生预期的分析物。
制性内切核酸酶或DNA就不产生这种分析物。反应的特异性还表现为37℃孵育前必须经过
热循环方能产生预期的分析物。
[0319] 图11说明用PvuII限制性内切核酸酶切割生物素化5’标记的阳性反应。扩增样品的3步热循环方案是：95℃ 3分钟，然后95℃ 15秒、60℃ 15秒与72℃ 30秒，35轮循
环，然后37℃ 1小时。此实施例中加入所有组分产生阳性反应，表现为存在分析物峰。
环，然后37℃ 1小时。此实施例中加入所有组分产生阳性反应，表现为存在分析物峰。
[0320] 图12说明用PvuII限制性内切核酸酶切割生物素化5’标记的阴性反应(如阴性对照)。扩增样品的3步热循环方案是：95℃ 3分钟，然后95℃ 15秒、60℃ 15秒与72℃
30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。此实施例中，加入除PvuII限制性内切核酸酶与基因
组DNA外的所有组分。注意，缺乏分析物则表明为阴性反应。
30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。此实施例中，加入除PvuII限制性内切核酸酶与基因
组DNA外的所有组分。注意，缺乏分析物则表明为阴性反应。
[0321] 图13说明用PvuII限制性内切核酸酶切割生物素化5’标记的阴性反应(如阴性对照)。扩增样品的3步热循环方案是：95℃ 3分钟，然后95℃ 15秒、60C 15秒与72℃
30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。此实施例中，加入除Pvu II限制性内切核酸酶外的所
有组分。注意，缺乏分析物则表明为阴性反应。
30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。此实施例中，加入除Pvu II限制性内切核酸酶外的所
有组分。注意，缺乏分析物则表明为阴性反应。
[0322] 图14说明用Pvu II限制性内切核酸酶切割生物素化5’标记的阴性反应(如阴性对照)。扩增样品的3步热循环方案是：95℃ 3分钟，然后95℃ 15秒、60℃ 15秒与72℃
30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。此实施例中，加入除基因组DNA外的所有组分。注意，
缺乏分析物，表明为阴性反应。
30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。此实施例中，加入除基因组DNA外的所有组分。注意，
缺乏分析物，表明为阴性反应。
[0323] 图15说明用PvuII限制性内切核酸酶切割生物素化5’标记的阴性反应(如阴性对照)。此实施例中，加入所有PCR组分。反应不经预告热循环，37℃孵育1小时。注意，无
热循环即无分析物则表明为阴性反应。
热循环即无分析物则表明为阴性反应。
[0324] 图11-15所示实验在25μL反应液中进行，此反应液含有下列成分(终浓度)：1XTaq缓冲液(50mM Tris-HCl，5mM(NH4)2SO4，10mM KCl，和4mM MgCl)，100μM dATP，100μM dCTP，100μM dGTP，100μM dTTP，300nM正向引物，300nM反向引物，3nM加标(spike)，2.5单位罗氏热启动DNA聚合酶，5单位PvuII限制性内切核酸酶和5ng人基因组DNA。图11-15
所示实施例中采用了针对智人(Homo sapiens)SRY基因设计的寡核苷酸序列，该基因是性
别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
所示实施例中采用了针对智人(Homo sapiens)SRY基因设计的寡核苷酸序列，该基因是性
别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)。此寡核苷酸的序列如下：
[0325] 正向引物：SRY.f1.Pvu II/5
[0326] BioTEG/AAAAACAGCTG CGATCAGAG GCG CAAGATG
[0327] 反向引物：SRY.r1.f G CTGATCTCTGAGTTTCG CATTCTG
[0328] MALDI分析物： /5BioTEG/AAAAACAG
[0329] 加标：SRY1.Spike1L /5BioTEG/AATCAAAAC
[0330] 此完整探针的质量为9876.7道尔顿，切下的标记或分析物的质量为3005.2道尔顿，加标的质量为3020.3道尔顿。注明/5BioTEG/的寡核苷酸序列含有通过延伸的约15
个原子的间隔臂与寡核苷酸5’端连接的生物素。扩增样品的3步热循环方案是：95℃ 3分
钟，然后95℃ 15秒、60℃ 15秒与72℃ 30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。随后通过用
链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获5’生物素部分来纯化反应物。
个原子的间隔臂与寡核苷酸5’端连接的生物素。扩增样品的3步热循环方案是：95℃ 3分
钟，然后95℃ 15秒、60℃ 15秒与72℃ 30秒，35轮循环，然后37℃ 1小时。随后通过用
链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获5’生物素部分来纯化反应物。
[0331] PCR主混合物中加入内标或加标。此加标的质量比阳性PCR中的分析物或切割产物大15道尔顿。采用内标可使PCR反应中吹打吸移的差异、PCR后操作的损失(例如
用链霉亲和素包裹的顺磁珠纯化和点样到MALDI芯片上)和仪器性能差异标准化。计算
出分析物和相应加标的响应峰面积比例(Bruenner BA，T～T Yip，TW Hutchens.1996.
Quantitative analysis of oligonucleotides by matrix-assisted laser desorption/
ionization of mass spectrometry.(用基质辅助激光解吸/电离质谱定量分析寡核苷酸)
Rapid Communications in Mass Spectrometry.10：1797～1802)。
用链霉亲和素包裹的顺磁珠纯化和点样到MALDI芯片上)和仪器性能差异标准化。计算
出分析物和相应加标的响应峰面积比例(Bruenner BA，T～T Yip，TW Hutchens.1996.
Quantitative analysis of oligonucleotides by matrix-assisted laser desorption/
ionization of mass spectrometry.(用基质辅助激光解吸/电离质谱定量分析寡核苷酸)
Rapid Communications in Mass Spectrometry.10：1797～1802)。
[0332] 实施例4：用于扩增靶核酸组合物的寡核苷酸组合物，包含一对含有一个或多个热稳定性内切核酸酶切割底物和可选的5’捕获和/或检测特征的3’封端寡核苷酸
[0333] 也可将本文所述寡核苷酸组合物设计成含有一个或多个内切核酸酶切割位点的几对寡核苷酸而发挥其作用，所述切割位点可以是相同或不同内切核酸酶的切割位点。在
一些实施方式中，可用不同类型的内切核酸酶(例如限制性内切核酸酶和AP内切核酸酶)
解除正向和反向寡核苷酸的封闭。此种寡核苷酸组合物也可含有3’封端，和可选的5’捕获
剂或可检测部分，如图16-21B所示。在采用限制性内切核酸酶切割位点的实施方式中，所
述限制性内切核酸酶切割位点可与此种寡核苷酸组合物的3’末端重叠，如图16-17所示。
在一些实施方式中，可如图18和20所示包含间插序列以提供额外的间隔供酶结合并且有
助于首次切割后再次切割前的末端稳定性，间插序列可含有内切核酸酶切割位点的部分。
一些实施方式中，可用不同类型的内切核酸酶(例如限制性内切核酸酶和AP内切核酸酶)
解除正向和反向寡核苷酸的封闭。此种寡核苷酸组合物也可含有3’封端，和可选的5’捕获
剂或可检测部分，如图16-21B所示。在采用限制性内切核酸酶切割位点的实施方式中，所
述限制性内切核酸酶切割位点可与此种寡核苷酸组合物的3’末端重叠，如图16-17所示。
在一些实施方式中，可如图18和20所示包含间插序列以提供额外的间隔供酶结合并且有
助于首次切割后再次切割前的末端稳定性，间插序列可含有内切核酸酶切割位点的部分。
[0334] 图16显示含有3’封端和限制性内切核酸酶切割位点的一对封闭寡核苷酸(例如引物二聚体)。图17显示含有5′标记(例如捕获剂或可检测部分)、3’封端和限制性位
点的一对封闭寡核苷酸。图16和17所示实施方式包含的正向和反向寡核苷酸(例如，图
16和17中标记为正向和反向引物)与该正向与反向寡核苷酸的部分或所有反向互补序列
和3’封端串联在一起，形成与引物二聚体相似的结构。用一种限制性内切核酸酶一次切割
即可切割该正向和反向寡核苷酸。
点的一对封闭寡核苷酸。图16和17所示实施方式包含的正向和反向寡核苷酸(例如，图
16和17中标记为正向和反向引物)与该正向与反向寡核苷酸的部分或所有反向互补序列
和3’封端串联在一起，形成与引物二聚体相似的结构。用一种限制性内切核酸酶一次切割
即可切割该正向和反向寡核苷酸。
[0335] 从各寡核苷酸3’端切下序列的Tm低于该完整的寡核苷酸。此寡核苷酸用于后续扩增试验时的温度高于已切割的3’端的退火温度。因此，切下的片段不会干扰扩增反应。
[0336] 图18的示范性实施方式包括含有两个限制性内切核酸酶切割位点的一对3’封端寡核苷酸，每个限制性内切核酸酶切割位点都有部分包含在间插序列中。在图18所示实施
方式中，正向与反向寡核苷酸(例如在图18中标记为正向和反向引物)被识别不同切割序
列的两种限制性内切核酸酶切割。包含在该寡核苷酸组合物中的间插序列补全了各限制性
切割位点的余部。此寡核苷酸组合物可加入间插序列增强首次切割后再次切割前末端的稳
定性。从各寡核苷酸3’端切下序列的Tm低于该完整的寡核苷酸。此寡核苷酸用于后续扩
增试验的温度高于已切割3’端的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
方式中，正向与反向寡核苷酸(例如在图18中标记为正向和反向引物)被识别不同切割序
列的两种限制性内切核酸酶切割。包含在该寡核苷酸组合物中的间插序列补全了各限制性
切割位点的余部。此寡核苷酸组合物可加入间插序列增强首次切割后再次切割前末端的稳
定性。从各寡核苷酸3’端切下序列的Tm低于该完整的寡核苷酸。此寡核苷酸用于后续扩
增试验的温度高于已切割3’端的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
[0337] 图19与20所示实施方式和图17与18所示基本上相似，区别在于形成两个脱碱基AP内切核酸酶切割位点而非限制性内切核酸酶位点。图19与20所示实施方式中，所示
正向与反向寡核苷酸可与该正向与反向寡核苷酸的部分或所有反向互补序列和3’封端串
联在一起，形成与引物二聚体相似的结构。图19与20中的实施方式区别在于图20的寡核
苷酸中加有间插序列。此间插序列的加入基本执行图18中实施方式所述的相同功能。
正向与反向寡核苷酸可与该正向与反向寡核苷酸的部分或所有反向互补序列和3’封端串
联在一起，形成与引物二聚体相似的结构。图19与20中的实施方式区别在于图20的寡核
苷酸中加有间插序列。此间插序列的加入基本执行图18中实施方式所述的相同功能。
[0338] 从各寡核苷酸3’端切下的序列片段的Tm低于完整的寡核苷酸。此寡核苷酸用于后续扩增试验时的温度高于已切割3’端的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
图21示意说明用热稳定性AP内切核酸酶(例如Tth IV内切核酸酶)解除该封闭的寡核
苷酸组合物的封闭，产生可用于延伸或扩增方法的寡核苷酸。图21说明在切割条件下热稳
定性内切核酸酶起作用的非限制性温度范围。
图21示意说明用热稳定性AP内切核酸酶(例如Tth IV内切核酸酶)解除该封闭的寡核
苷酸组合物的封闭，产生可用于延伸或扩增方法的寡核苷酸。图21说明在切割条件下热稳
定性内切核酸酶起作用的非限制性温度范围。
[0339] 在一些实施方式中，可同时(例如在单一试管内，或在单个反应容器内或结合在固相支持物上的多重反应中)使用多对寡核苷酸的组合物，每对含有相同的限制性内切核
酸酶位点。在一些实施方式中，可同时或在多重反应中采用多对寡核苷酸的组合物，每对含
有不同的限制性内切核酸酶位点。
酸酶位点。在一些实施方式中，可同时或在多重反应中采用多对寡核苷酸的组合物，每对含
有不同的限制性内切核酸酶位点。
[0340] 实施例5：用于扩增靶核酸组合物的寡核苷酸组合物，包含两对或多对含有一个或多个热稳定性内切核酸酶切割底物和可选的5’捕获和/或检测特征的3’封端寡核苷酸
[0341] 也可将本文所述寡核苷酸组合物设计成含有一个或多个内切核酸酶切割位点的两对或对多寡核苷酸而发挥作用，其中所述切割位点可以是相同或不同内切核酸酶的切
割位点。这种寡核苷酸组合物也可含有3’封端，和可选的5’捕获剂或可检测部分，如图
22-26B所示。在采用限制性内切核酸酶切割位点的实施方式中，所述限制性内切核酸酶切
割位点可与此种寡核苷酸组合物的5’末端重叠(例如此种寡核苷酸的部分可作为聚合酶
延伸的引物)，如图22、23、26A和26B所示。在一些实施方式中，寡核苷酸的3’端可含有限
制性酶切割位点的一半。在一些实施方式中，如图22-25所示，此种寡核苷酸的3’末端可
包含额外的序列以提供酶结合的额外间隔和/或增加切割位点的热稳定性，该额外序列可
含有内切核酸酶切割位点的部分。在一些实施方式中，可增加约3-20个额外的核苷酸以提
高切割位点的结合效率和/或稳定性。
割位点。这种寡核苷酸组合物也可含有3’封端，和可选的5’捕获剂或可检测部分，如图
22-26B所示。在采用限制性内切核酸酶切割位点的实施方式中，所述限制性内切核酸酶切
割位点可与此种寡核苷酸组合物的5’末端重叠(例如此种寡核苷酸的部分可作为聚合酶
延伸的引物)，如图22、23、26A和26B所示。在一些实施方式中，寡核苷酸的3’端可含有限
制性酶切割位点的一半。在一些实施方式中，如图22-25所示，此种寡核苷酸的3’末端可
包含额外的序列以提供酶结合的额外间隔和/或增加切割位点的热稳定性，该额外序列可
含有内切核酸酶切割位点的部分。在一些实施方式中，可增加约3-20个额外的核苷酸以提
高切割位点的结合效率和/或稳定性。
[0342] 含两对或多对寡核苷酸的组合物也可称为“寡核苷酸双链体”或“引物双链体”。在一些实施方式中，可同时(例如在一个试管内，或在一个反应容器内或结合在固相支持物上的多重反应中)采用多对寡核苷酸双链体，每对双链体含有相同的限制性内切核酸酶位
点。在一些实施方式中，可同时或在多重反应中采用多对寡核苷酸双链体，每对双链体含有
不同的限制性内切核酸酶位点。
点。在一些实施方式中，可同时或在多重反应中采用多对寡核苷酸双链体，每对双链体含有
不同的限制性内切核酸酶位点。
[0343] 图22与23显示含有一个或多个热稳定性限制性内切核酸酶切割位点的3’封端寡核苷酸双链体组合物。图23还显示含有可选的5′标记(例如捕获剂和/或可检测部
分)的实施方式。图24与25显示含有一个或多个热稳定性AP内切核酸酶切割位点的3’
封端寡核苷酸双链体组合物。图25还显示含有可选的5′标记(例如捕获剂和/或可检测
部分)的实施方式。图26示意说明封闭寡核苷酸组合物被解除封闭产生可用于延伸或扩
增方法的寡核苷酸。图26说明的具体非限制性实施例显示用限制性内切核酸酶BstUI切
割，但是该寡核苷酸组合物可设计为含有任何合适的热稳定性内切核酸酶切割位点。
分)的实施方式。图24与25显示含有一个或多个热稳定性AP内切核酸酶切割位点的3’
封端寡核苷酸双链体组合物。图25还显示含有可选的5′标记(例如捕获剂和/或可检测
部分)的实施方式。图26示意说明封闭寡核苷酸组合物被解除封闭产生可用于延伸或扩
增方法的寡核苷酸。图26说明的具体非限制性实施例显示用限制性内切核酸酶BstUI切
割，但是该寡核苷酸组合物可设计为含有任何合适的热稳定性内切核酸酶切割位点。
[0344] 在本实施例所述和图22-26B所示的实施方式中，4种独立的寡核苷酸包含寡核苷酸双链体。在采用限制性内切核酸酶切割位点的实施方式中，正向与反向寡核苷酸(例如
在图22-23中标记为正向与反向引物)的序列各终止于限制性位点的一部分，此限制性位
点的其余部分包含在为了酶结合与切割位点的稳定性而加到3′末端的序列中(例如3-20
个碱基)。所示的正向与反向寡核苷酸各具有相应的反向互补寡核苷酸，这种反向互补物跨
越所述限制性位点并能在限制性内切核酸酶为活性的温度下退火。图24和25中，脱碱基
位点在用于后续延伸或扩增反应的该寡核苷酸部分中末位核苷酸的3’。
在图22-23中标记为正向与反向引物)的序列各终止于限制性位点的一部分，此限制性位
点的其余部分包含在为了酶结合与切割位点的稳定性而加到3′末端的序列中(例如3-20
个碱基)。所示的正向与反向寡核苷酸各具有相应的反向互补寡核苷酸，这种反向互补物跨
越所述限制性位点并能在限制性内切核酸酶为活性的温度下退火。图24和25中，脱碱基
位点在用于后续延伸或扩增反应的该寡核苷酸部分中末位核苷酸的3’。
[0345] 在一些采用限制性内切核酸酶切割位点的实施方式中，正向与反向寡核苷酸可用同一限制性内切核酸酶解除其封闭。在一些实施方式中，正向与反向寡核苷酸可用不同的
限制性内切核酸酶解除其封闭。在一些实施方式中，正向和反向寡核苷酸可以用不同类型
的内切核酸酶类(例如限制性内切核酸酶和AP内切核酸酶)解除其封闭。从各寡核苷酸
3’端切下序列的Tm低于完整的寡核苷酸。这种寡核苷酸用于后续扩增试验时的温度高于
已切割3’端或已切割反向互补物的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
限制性内切核酸酶解除其封闭。在一些实施方式中，正向和反向寡核苷酸可以用不同类型
的内切核酸酶类(例如限制性内切核酸酶和AP内切核酸酶)解除其封闭。从各寡核苷酸
3’端切下序列的Tm低于完整的寡核苷酸。这种寡核苷酸用于后续扩增试验时的温度高于
已切割3’端或已切割反向互补物的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
[0346] 实施例6：用于扩增靶核酸组合物的寡核苷酸组合物，其含有一对3’封端J-钩形寡核苷酸，或一对含互补3’末端、一个或多个热稳定性内切核酸酶切割底物和可选的5’捕
获和/或检测特征的3’封端线性寡核苷酸
获和/或检测特征的3’封端线性寡核苷酸
[0347] 本文所述寡核苷酸组合物可设计成包含多对J-钩形寡核苷酸(图27-30A中所示)，或包含多对含互补3’末端的3’封端线性寡核苷酸(图32中所示)的组合物而发挥
其作用，其中含有一个或多个内切核酸酶切割位点，所述切割位点可以是相同或不同内切
核酸酶的切割位点。所述寡核苷酸组合物也可含有3’封端，和可选的5’捕获剂或可检测
部分，如图27-30A和图33中所示。在J-钩形寡核苷酸组合物实施方式中，可掺入可选的
内部间隔子(图31所示)以提供额外的可挠性使得该寡核苷酸的自身互补部分能退火。
其作用，其中含有一个或多个内切核酸酶切割位点，所述切割位点可以是相同或不同内切
核酸酶的切割位点。所述寡核苷酸组合物也可含有3’封端，和可选的5’捕获剂或可检测
部分，如图27-30A和图33中所示。在J-钩形寡核苷酸组合物实施方式中，可掺入可选的
内部间隔子(图31所示)以提供额外的可挠性使得该寡核苷酸的自身互补部分能退火。
[0348] 与上文实施方式中所述的原理基本相似的设计原理(例如采用一种或多种相似或不同的内切核酸酶位点，采用不同类型的内切核酸酶位点，采用捕获剂和/或可检测部
分，采用封闭3’端，考虑完整和已切割寡核苷酸的Tm，内切核酸酶切割位点与寡核苷酸组
合物的5’或3’部分的重叠，切割位点的定位以使两个可检测部分中各个部分能保留在相
同或不同的切下片段上，等等)也可用于J-钩形和含有互补3’端的线性成对寡核苷酸组
合物的设计。
分，采用封闭3’端，考虑完整和已切割寡核苷酸的Tm，内切核酸酶切割位点与寡核苷酸组
合物的5’或3’部分的重叠，切割位点的定位以使两个可检测部分中各个部分能保留在相
同或不同的切下片段上，等等)也可用于J-钩形和含有互补3’端的线性成对寡核苷酸组
合物的设计。
[0349] 图27与28显示的3’封端J-钩形成对寡核苷酸含有限制性内切核酸酶切割位点和可选的5’捕获剂和/或可检测部分(图28)。在一些实施方式中，所述限制性内切核酸
酶切割位点是热稳定限制性内切核酸酶的切割位点。图29显示含有热稳定性AP内切核酸
酶切割位点的3’封端J-钩形成对寡核苷酸物质。图30显示含有切口内切核酸酶切割位
点的3’封端J-钩形成对寡核苷酸。在一些实施方式中，也可任选地包含5’捕获剂和/或
可检测部分。
酶切割位点是热稳定限制性内切核酸酶的切割位点。图29显示含有热稳定性AP内切核酸
酶切割位点的3’封端J-钩形成对寡核苷酸物质。图30显示含有切口内切核酸酶切割位
点的3’封端J-钩形成对寡核苷酸。在一些实施方式中，也可任选地包含5’捕获剂和/或
可检测部分。
[0350] 在图27-30所示实施方式中，构成含J-钩形成对寡核苷酸组合物的寡核苷酸通过自身互补在其3’末端折返成J-钩形。用内切核酸酶(例如限制性内切核酸酶、热稳定限
制性内切核酸酶、AP内切核酸酶、热稳定AP内切核酸酶等)切割此寡核苷酸(例如限制性
内切核酸酶切割双链，AP内切核酸酶切割单链)，释放封闭，在寡核苷酸此部分留下游离的
3’OH，可用DNA聚合酶延伸。图27-30中的环区可含有单链DNA、一个或多个间隔分子(例
如图31所示的间隔子18)、其组合等，从而具有允许分子内杂交所需的挠性。从各寡核苷
酸3’端切下序列的Tm低于完整的寡核苷酸物质。这种寡核苷酸用于后续扩增试验时，温
度高于已切割3’端或已切割反向互补物的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
制性内切核酸酶、AP内切核酸酶、热稳定AP内切核酸酶等)切割此寡核苷酸(例如限制性
内切核酸酶切割双链，AP内切核酸酶切割单链)，释放封闭，在寡核苷酸此部分留下游离的
3’OH，可用DNA聚合酶延伸。图27-30中的环区可含有单链DNA、一个或多个间隔分子(例
如图31所示的间隔子18)、其组合等，从而具有允许分子内杂交所需的挠性。从各寡核苷
酸3’端切下序列的Tm低于完整的寡核苷酸物质。这种寡核苷酸用于后续扩增试验时，温
度高于已切割3’端或已切割反向互补物的退火温度。因此切下的片段不会干扰扩增反应。
[0351] 在一些实施方式中，可采用热稳定切口内切核酸酶代替限制性内切核酸酶，如图30A所示。切口酶以序列特异性方式只切割双链DNA两条链中的一条。Nb.BamI和Nb.BsrDI
是热稳定切口酶的两个非限制性例子。Nb.BamI与Nb.BsrDI的酶作用最适温度为65℃，因
此允许设计在65℃或更低温度退火的寡核苷酸。Nb.BsmI将序列5’-NGCATTC-3’切断成为
5’-NG-3’和5’-CATTC-3’。因此，该寡核苷酸序列的3’末端为5’-NG-3’(倒数第二位的N为A、C、G或T而3’碱基为G的任一组合)。Nb.BsrDI将序列5’-NNCATTGC-3’切断成为
5’-NNCATTGC-3’和5’-NNCATTGC-3’。因此，该寡核苷酸序列的3’末端为5’-NN-3’(NN
是由A、C、G或T的任一组合组成的任何双核苷酸序列)。图30B显示用切口内切核酸酶除
去封闭。以序列特异性方式切割单链寡核苷酸(例如“切口”)去除封闭留下DNA聚合酶可
延伸的3’羟基。从各寡核苷酸3’端切下序列的Tm低于完整的寡核苷酸。这种寡核苷酸
用于后续扩增试验时，温度高于已切割3’端或已切割反向互补物的退火温度。因此切下的
片段不会干扰扩增反应。在设计寡核苷酸组合物和切口酶联用时，所述寡核苷酸的3’端必
须含有该切口内切核酸酶识别序列的5’部分，如图30A和30B所示。
是热稳定切口酶的两个非限制性例子。Nb.BamI与Nb.BsrDI的酶作用最适温度为65℃，因
此允许设计在65℃或更低温度退火的寡核苷酸。Nb.BsmI将序列5’-NGCATTC-3’切断成为
5’-NG-3’和5’-CATTC-3’。因此，该寡核苷酸序列的3’末端为5’-NG-3’(倒数第二位的N为A、C、G或T而3’碱基为G的任一组合)。Nb.BsrDI将序列5’-NNCATTGC-3’切断成为
5’-NNCATTGC-3’和5’-NNCATTGC-3’。因此，该寡核苷酸序列的3’末端为5’-NN-3’(NN
是由A、C、G或T的任一组合组成的任何双核苷酸序列)。图30B显示用切口内切核酸酶除
去封闭。以序列特异性方式切割单链寡核苷酸(例如“切口”)去除封闭留下DNA聚合酶可
延伸的3’羟基。从各寡核苷酸3’端切下序列的Tm低于完整的寡核苷酸。这种寡核苷酸
用于后续扩增试验时，温度高于已切割3’端或已切割反向互补物的退火温度。因此切下的
片段不会干扰扩增反应。在设计寡核苷酸组合物和切口酶联用时，所述寡核苷酸的3’端必
须含有该切口内切核酸酶识别序列的5’部分，如图30A和30B所示。
[0352] 图32显示采用含有互补3′末端的一对3’封端线性寡核苷酸扩增和捕获和/或检测靶核酸的方法。该方法也可采用以上所述的J-钩形寡核苷酸组合物和适当的内切核
酸酶(参见图27-30)。
酸酶(参见图27-30)。
[0353] 含有互补3’末端的3’封端线性寡核苷酸组合物是含有一组正向与反向寡核苷酸的成对寡核苷酸构成的组合物，在去除3’封闭留下游离3’羟基后，可用DNA聚合酶延伸。
退火时，各对寡核苷酸的互补3’端形成的第一限制性内切核酸酶(例如热稳定限制性或AP
内切核酸酶)的内部识别位点，这在模板DNA中不会发生。若正向和反向寡核苷酸再退火，
所述第一限制性内切核酸酶切割位点将再生，但若正向与反向寡核苷酸与靶核酸退火则不
会再生，因此，延伸或扩增反应中存在第一限制性内切核酸酶可消除非目标产物“引物二聚
体”。所述互补3’端也可包含额外的核苷酸以提高结合效率和热稳定性。
退火时，各对寡核苷酸的互补3’端形成的第一限制性内切核酸酶(例如热稳定限制性或AP
内切核酸酶)的内部识别位点，这在模板DNA中不会发生。若正向和反向寡核苷酸再退火，
所述第一限制性内切核酸酶切割位点将再生，但若正向与反向寡核苷酸与靶核酸退火则不
会再生，因此，延伸或扩增反应中存在第一限制性内切核酸酶可消除非目标产物“引物二聚
体”。所述互补3’端也可包含额外的核苷酸以提高结合效率和热稳定性。
[0354] 使捕获剂和/或可检测部分与位于该组正向寡核苷酸5’端的第二限制性内切核酸酶切割位点连接。以此方式配置时，在产生第二限制性内切核酸酶切割位点前需要至少
两轮延伸或扩增，以便用第二限制性内切核酸酶切割释放捕获剂和/或可检测部分。因此，
在一些实施方式中，本实施例所述组合物也可用于监测反应状态。
两轮延伸或扩增，以便用第二限制性内切核酸酶切割释放捕获剂和/或可检测部分。因此，
在一些实施方式中，本实施例所述组合物也可用于监测反应状态。
[0355] 如图32中所示，在杂交条件下，使成对寡核苷酸组合物与靶核酸和支持所加热稳定酶(例如聚合酶和/或内切核酸酶)功能所必需的组分接触，孵育混合物使内切核酸酶
切割其切割位点，与解除封闭的寡核苷酸退火。所述反应能在延伸条件下推进。所述反应产
生的扩增子包含新产生的第二内切核酸酶切割位点。切割第二内切核酸酶切割位点释放捕
获剂和/或可检测部分。在一些实施方式中，杂交条件、延伸条件和切割条件基本上相似。
切割其切割位点，与解除封闭的寡核苷酸退火。所述反应能在延伸条件下推进。所述反应产
生的扩增子包含新产生的第二内切核酸酶切割位点。切割第二内切核酸酶切割位点释放捕
获剂和/或可检测部分。在一些实施方式中，杂交条件、延伸条件和切割条件基本上相似。
[0356] 为最大程度减少或消除DNA聚合酶补平反应的可能性，优选采用能留下切割钝端或5’突出端的酶，方能利用限制性内切核酸酶的切割位点。本实施例所述的组合物也可通
过在寡核苷酸5’端添加荧光部分(例如FAM)和在同一寡核苷酸的3’端添加淬灭子而用
于荧光试验。在一些实施方式中，通过用相同或不同的荧光分子标记正向和反向寡核苷酸
两者，可倍增荧光或可监测两种不同类型的荧光。
过在寡核苷酸5’端添加荧光部分(例如FAM)和在同一寡核苷酸的3’端添加淬灭子而用
于荧光试验。在一些实施方式中，通过用相同或不同的荧光分子标记正向和反向寡核苷酸
两者，可倍增荧光或可监测两种不同类型的荧光。
[0357] 实施例7：诱发切口活性
[0358] 在一些实施方式中，可用诱发的切口功能解除成对或成组3’封端的J-钩形寡核苷酸组合物的封闭。限制性内切核酸酶是以序列特异性方式切割双链DNA两条链的多聚体
酶。热稳定“切口酶”Nb.BamI和Nb.BsrDI是经工程改造的热稳定内切核酸酶，经过突变改
变抑制了酶亚基之一切割DNA的能力。得到人工产生的热稳定性切口酶。
酶。热稳定“切口酶”Nb.BamI和Nb.BsrDI是经工程改造的热稳定内切核酸酶，经过突变改
变抑制了酶亚基之一切割DNA的能力。得到人工产生的热稳定性切口酶。
[0359] 为消除对人工工程改造切口酶的需求，可制备含不可切割的核苷酸类似物的寡核苷酸组合物，筛选在存在这种组合物时能诱导切开双链DNA(例如切割双链DNA中单条链)
的酶。筛选方法不难实施，可采用常规实验室方案。合成成对的寡核苷酸与互补序列，在
对中的一个成员内掺入一个或多个不可切割的核苷酸类似物。在一些实施方式中，也可将
可检测特征或捕获剂或二者掺入所述筛选寡核苷酸内。在切割或扩增条件下，在限制性内
切核酸酶存在下孵育这种模板，通过捕获携带捕获剂的片段或检测可检测特征监测这种反
应。当在切割位点掺入不可切割核苷酸类似物后，仍存在大小正确的切割片段或测得检测
特征表明这种限制性内切核酸酶能诱导DNA的一条链产生“切口”。
的酶。筛选方法不难实施，可采用常规实验室方案。合成成对的寡核苷酸与互补序列，在
对中的一个成员内掺入一个或多个不可切割的核苷酸类似物。在一些实施方式中，也可将
可检测特征或捕获剂或二者掺入所述筛选寡核苷酸内。在切割或扩增条件下，在限制性内
切核酸酶存在下孵育这种模板，通过捕获携带捕获剂的片段或检测可检测特征监测这种反
应。当在切割位点掺入不可切割核苷酸类似物后，仍存在大小正确的切割片段或测得检测
特征表明这种限制性内切核酸酶能诱导DNA的一条链产生“切口”。
[0360] 鉴定到能诱发双链寡核苷酸模板产生切口的热稳定限制性内切核酸酶，将使本文所述寡核苷酸的设计更为灵活。图33显示含有不可切割核苷酸类似物的这类寡核苷酸组
合物。可将这类寡核苷酸组合物设计成包含图33所示成对双链体(例如实施例5中所述
的每组4个寡核苷酸)的组合物，或设计成包含J-钩形成对寡核苷酸组合物(未显示)。
这类寡核苷酸组合物通过互补区域的退火可形成限制性内切核酸酶位点。将不可切割核苷
酸类似物掺入互补区之一的限制性内切核酸酶序列中。这将导致切割天然核苷酸但不可切
割核苷酸类似物不被切割，产生诱发的序列特异性切口。一个非限制性例子是利用硫代磷
酸酯键，以硫原子取代寡核苷酸磷酸酯骨架内的非桥联氧原子，从而使核苷酸间连接键耐
受核酸酶降解。内部引入硫代磷酸酯键可限制内切核酸酶的攻击。这种诱生切口方法可用
于设计采用热稳定性AP内切核酸酶的任一上述实施例中。
合物。可将这类寡核苷酸组合物设计成包含图33所示成对双链体(例如实施例5中所述
的每组4个寡核苷酸)的组合物，或设计成包含J-钩形成对寡核苷酸组合物(未显示)。
这类寡核苷酸组合物通过互补区域的退火可形成限制性内切核酸酶位点。将不可切割核苷
酸类似物掺入互补区之一的限制性内切核酸酶序列中。这将导致切割天然核苷酸但不可切
割核苷酸类似物不被切割，产生诱发的序列特异性切口。一个非限制性例子是利用硫代磷
酸酯键，以硫原子取代寡核苷酸磷酸酯骨架内的非桥联氧原子，从而使核苷酸间连接键耐
受核酸酶降解。内部引入硫代磷酸酯键可限制内切核酸酶的攻击。这种诱生切口方法可用
于设计采用热稳定性AP内切核酸酶的任一上述实施例中。
[0361] 实施例8：在封端寡核苷酸实验中，采用含BstUI或BsaAI热稳定限制性内切核酸酶的寡核苷酸组合物的实验结果
[0362] 所用的含BstUI切割位点的封端寡核苷酸组合物
[0363] 限制性内切核酸酶BstUI识别CGCG序列，其最适温度为60℃。当BstUI限制性内切核酸酶切割DNA后，在上游片段的3’端留下双核苷酸序列CG。此3’端含有游离3’羟基
随后可通过聚合酶延伸。如本文所述设计了针对智人(Homo sapiens)SRY基因的封闭寡核
苷酸组合物，该基因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)：
随后可通过聚合酶延伸。如本文所述设计了针对智人(Homo sapiens)SRY基因的封闭寡核
苷酸组合物，该基因是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)：
[0364] 1 ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGCGTACTCAACAGCGATGATTACAGTCCAGCT
[0365] 61 GTGCAAGAGAATATTCCCGCTCTCCGGAGAAGCTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGT
[0366] 121 AACTCTAAGTATCAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGTAAAGGCAACGTCCAGGATAGAGTG
[0367] 181 AAGCGACCCATGAACGCATTCATCGTGTGGTCTCGCGATCAGAGGCGCAAGATGGCTCTA
[0368] 241 GAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAGAGATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTGGAAAATG
[0369] 301 CTTACTGAAGCCGAAAAATGGCCATTCTTCCAGGAGGCACAGAAATTACAGGCCATGCAC
[0370] 361 AGAGAGAAATACCCGAATTATAAGTATCGACCTCGTCGGAAGGCGAAGATGCTGCCGAAG
[0371] 421 AATTGCAGTTTGCTTCCCGCAGATCCCGCTTCGGTACTCTGCAGCGAAGTGCAACTGGAC
[0372] 481 AACAGGTTGTACAGGGATGACTGTACGAAAGCCACACACTCAAGAATGGAGCACCAGCTA
[0373] 541 GGCCACTTACCGCCCATCAACGCAGCCAGCTCACCGCAGCAACGGGACCGCTACAGCCAC
[0374] 601 TGGACAAAGCTGTAG
[0375] BstUI切割序列CG/CG在SRY序列中出现一次，其出现在本实施例中用下划线表示。寡核苷酸组合物设计为避免在所得扩增子中出现BstUI的切割位点。SRY序列中的多
个CG用下划线标出，这些是布置引物3’端的潜在位置。Pvu II切割序列CAG/CTG在SRY
序列中有二个，其出现在本实施例中以下划线标出。寡核苷酸组合物设计为避免在所得扩
增子中出现Pvu II切割位点。
个CG用下划线标出，这些是布置引物3’端的潜在位置。Pvu II切割序列CAG/CTG在SRY
序列中有二个，其出现在本实施例中以下划线标出。寡核苷酸组合物设计为避免在所得扩
增子中出现Pvu II切割位点。
[0376] BstUI封闭寡核苷酸序列：
[0377] 正向引物：SRY.BstUI.f1
[0378] /5BioTEG/AAAAACAGCTGGTGAAGCGACCCATGAACGCGTGTGGTCTCGCGATCA/3SpC3/
[0379] 反向引物：SRY.BstUI.r1
[0380] TGATCGCGAGACCACACGCGTTCATGGGTCGCTTCAC/3SpC3/
[0381] 用MALDI检测的切下分析物：
[0382] /5BioTEG/AAAAACAG
[0383] 此完整探针的质量为15,543道尔顿。切下的标记或分析物的质量为3005.2道尔顿。内部加标的质量为3020.3道尔顿。下划线标出与靶序列互补并用作扩增反应延伸寡
核苷酸的序列区域。含正向延伸寡核苷酸序列的寡核苷酸组合物也含有Pvu II 5’标记序
列和反向延伸寡核苷酸的反向互补序列。含有此反向延伸寡核苷酸的寡核苷酸组合物也含
有正向延伸寡核苷酸的反向互补序列。这些寡核苷酸在PCR中杂交可产生BstUI酶的切割
位点。切割后，产生的功能性(例如解除封闭的)寡核苷酸组合物即可参与靶序列的PCR
扩增。有一组寡核苷酸针对BstUI酶所用的封闭寡核苷酸。
核苷酸的序列区域。含正向延伸寡核苷酸序列的寡核苷酸组合物也含有Pvu II 5’标记序
列和反向延伸寡核苷酸的反向互补序列。含有此反向延伸寡核苷酸的寡核苷酸组合物也含
有正向延伸寡核苷酸的反向互补序列。这些寡核苷酸在PCR中杂交可产生BstUI酶的切割
位点。切割后，产生的功能性(例如解除封闭的)寡核苷酸组合物即可参与靶序列的PCR
扩增。有一组寡核苷酸针对BstUI酶所用的封闭寡核苷酸。
[0384] 对照延伸的寡核苷酸序列如下：
[0385] 正向引物：SRY.f1.PvuII
[0386] /5BioTEG/AAAAACAGCTGCGATCAGAGGCGCAAGATG
[0387] 反向引物：SRY.r1.f
[0388] GCTGATCTCTGAGTTTCGCATTCTG
[0389] 用MALDI检测的切下分析物：
[0390] /5BioTEG/AAAAACAG
[0391] 此完整对照探针的质量为9876.7道尔顿。切下的标记或分析物的质量为3005.2道尔顿。含有正向延伸寡核苷酸序列的该寡核苷酸组合物还含有Pvu II 5’标记序列。该
对照反应证实，在针对此封闭寡核苷酸组合物所用热循环方案下PCR和Pvu II切割有效。
对照反应证实，在针对此封闭寡核苷酸组合物所用热循环方案下PCR和Pvu II切割有效。
[0392] 该试验在20μL反应液中扩增，各反应物的终浓度如下：1X缓冲液(50mMTris-HCl，4mM(NH4)2SO4，10mM KCl，4mM MgCl)，125μM dATP，125μM dCTP，125μM dGTP，
125μM dTTP，2单位罗氏热启动DNA聚合酶，300nM正向寡核苷酸，300nM反向寡核苷酸，
20nM加标寡核苷酸，7.5ng人基因组DNA，5单位Pvu II限制性内切核酸酶和4单位BstUI
限制性内切核酸酶。
125μM dTTP，2单位罗氏热启动DNA聚合酶，300nM正向寡核苷酸，300nM反向寡核苷酸，
20nM加标寡核苷酸，7.5ng人基因组DNA，5单位Pvu II限制性内切核酸酶和4单位BstUI
限制性内切核酸酶。
[0393] 在PCR主混合物中加入内标或加标(spike)。加标的质量比分析物大15道尔顿。采用内标可将PCR反应时吹吸造成的差异、PCR后操作如用链霉亲和素包裹的顺磁珠纯化
和点样到MALDI芯片上中的损失，和MALDI仪器性能的差异标准化。计算出分析物与相应
加标的响应峰面积比例(Bruenner等，1996)。内部加标的质量为3020.3道尔顿。
和点样到MALDI芯片上中的损失，和MALDI仪器性能的差异标准化。计算出分析物与相应
加标的响应峰面积比例(Bruenner等，1996)。内部加标的质量为3020.3道尔顿。
[0394] PCR中加入的加标：SRY1.SpikelL
[0395] /5BioTEG/AAAGAAAT
[0396] 注明/5BioTEG/的寡核苷酸序列含有通过延长15个原子的间隔臂与该寡核苷酸5’端连接的生物素。注明/3SpC3/的寡核苷酸序列含有3’C3间隔子。此实施例所用的
3’C3间隔子(而非3’羟基)可防止DNA聚合酶延伸杂交的寡核苷酸。也可取代3’末端的
其它部分以防止DNA聚合酶延伸此寡核苷酸。这些部分可包括但不限于：3′氨基修饰剂，
3′生物素，3’生物素TEG，3′胆固醇-TEG，3′地高辛，3′硫醇，3′反转dT或3′磷酸。
3’C3间隔子(而非3’羟基)可防止DNA聚合酶延伸杂交的寡核苷酸。也可取代3’末端的
其它部分以防止DNA聚合酶延伸此寡核苷酸。这些部分可包括但不限于：3′氨基修饰剂，
3′生物素，3’生物素TEG，3′胆固醇-TEG，3′地高辛，3′硫醇，3′反转dT或3′磷酸。
[0397] BstUI反应的热循环方案是：
[0398] 90℃ 5秒钟
[0399] 60℃ 1小时(BstUI限制性内切核酸酶的最适温度)
[0400] 95℃ 3分钟
[0401] 95℃ 10秒钟，60℃ 10秒钟和72℃ 20秒钟，35轮循环
[0402] 37℃ 1小时(Pvu II限制性内切核酸酶的最适温度)
[0403] 随后用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获5’生物素部分纯化反应物。图34A和34B显示采用本文所述延伸和扩增方法，对从经切割的封闭寡核苷酸组合物延伸的寡核苷酸所
做的MALDI质谱检测结果。图34A显示用封闭寡核苷酸组合物做的对照反应的5’Pvu II
标记图谱。此对照反应证实，在针对该封闭寡核苷酸组合物所用的热循环方案下PCR和Pvu
II切割有效。图34B显示用本文所述BstUI酶的封闭寡核苷酸组合物做的反应的5’Pvu
II标记图谱。存在分析物峰表明所述寡核苷酸组合物的封闭已被加入PCR中的BstUI限制
性内切核酸酶解除。所有分图中的质谱包括在PCR设定时加入的参比加标峰。
做的MALDI质谱检测结果。图34A显示用封闭寡核苷酸组合物做的对照反应的5’Pvu II
标记图谱。此对照反应证实，在针对该封闭寡核苷酸组合物所用的热循环方案下PCR和Pvu
II切割有效。图34B显示用本文所述BstUI酶的封闭寡核苷酸组合物做的反应的5’Pvu
II标记图谱。存在分析物峰表明所述寡核苷酸组合物的封闭已被加入PCR中的BstUI限制
性内切核酸酶解除。所有分图中的质谱包括在PCR设定时加入的参比加标峰。
[0404] 所用的含BstUI切割位点的封闭寡核苷酸组合物
[0405] 限制性内切核酸酶BsaAI识别YACGTR序列，能切割4个序列TACGTA、CACGTA、TACGTG或CACGTG中的任何一个。该酶的最适温度是50℃。当BsaAI限制性内切核酸酶切
割DNA后，上游片段的3’端留下三核苷酸序列TAC或CAC。此3’端含有游离3’羟基，可随
后通过聚合酶延伸。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的封闭引物寡核苷酸，该基因
是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)：
割DNA后，上游片段的3’端留下三核苷酸序列TAC或CAC。此3’端含有游离3’羟基，可随
后通过聚合酶延伸。设计针对智人(Homo sapiens)SRY基因的封闭引物寡核苷酸，该基因
是性别决定区域Y的ADT3分离株(GenBank AM884751.1)：
[0406] 1 ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGCGTACTCAACAGCGATGATTACAGTCCAGCT
[0407] 61 GTGCAAGAGAATATTCCCGCTCTCCGGAGAAGCTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGT
[0408] 121 AACTCTAAGTATCAGTGTGAAACGGGAGAAAACAGTAAAGGCAACGTCCAGGATAGAGTG
[0409] 181 AAGCGACCCATGAACGCATTCATCGTGTGGTCTCGCGATCAGAGGCGCAAGATGGCTCTA
[0410] 241 GAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAGAGATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTGGAAAATG
[0411] 301 CTTACTGAAGCCGAAAAATGGCCATTCTTCCAGGAGGCACAGAAATTACAGGCCATGCAC
[0412] 361 AGAGAGAAATACCCGAATTATAAGTATCGACCTCGTCGGAAGGCGAAGATGCTGCCGAAG
[0413] 421 AATTGCAGTTTGCTTCCCGCAGATCCCGCTTCGGTACTCTGCAGCGAAGTGCAACTGGAC
[0414] 481 AACAGGTTGTACAGGGATGACTGTACGAAAGCCACACACTCAAGAATGGAGCACCAGCTA
[0415] 541 GGCCACTTACCGCCCATCAACGCAGCCAGCTCACCGCAGCAACGGGACCGCTACAGCCAC
[0416] 601 TGGACAAAGCTGTAG
[0417] 所述BsaAI限制性内切核酸酶切割的序列TACGTA、CACGTA、TACGTG或CACGTG在SRY序列中不存在。本实施例中用下划线标出的多个CAC或TAC是布置寡核苷酸序列3’端
的潜在位置。Pvu II限制性内切核酸酶切割的序列CAG/CTG在SRY序列中有二个，在本实
施例中用下划线标出。寡核苷酸组合物设计为避免在所得扩增子中出现Pvu II切割位点。
在两个用BsaAI封闭寡核苷酸序列的独立试验中，针对两个独立扩增子设计了寡核苷酸组
合物。
的潜在位置。Pvu II限制性内切核酸酶切割的序列CAG/CTG在SRY序列中有二个，在本实
施例中用下划线标出。寡核苷酸组合物设计为避免在所得扩增子中出现Pvu II切割位点。
在两个用BsaAI封闭寡核苷酸序列的独立试验中，针对两个独立扩增子设计了寡核苷酸组
合物。
[0418] 第#1组封端寡核苷酸：
[0419] 正向引物：SRY.BsaAI.f1
[0420] /5BioTEG/AAAAACAGCTGGGCCATGCACAGAGAGAAATACGTATCGA
[0421] CCTCGTCGGAAGG/3SpC3/
[0422] 反向引物：SRY.BsaAI.r1
[0423] CCTTCCGACGAGGTCGATACGTATTTCTCTCTGTGCATGGCC/3SpC3/
[0424] 第#2组封闭寡核苷酸组：
[0425] 正向引物：SRY.BsaAI.f2
[0426] /5BioTEG/AAAAACAGCTGAAGCTCTTCCTTCCTTTGCACGTAAAGGCA
[0427] ACGTCCAGGATAG/3SpC3/
[0428] 反向引物：SRY.BsaAI.r2
[0429] CTATCCTGGACGTTGCCTTTACGTGCAAAGGAAGGAAGAGCTT/3SpC3/
[0430] 下划线标出各寡核苷酸组合物中与靶序列互补作为扩增反应延伸寡核苷酸的序列区域。含正向延伸寡核苷酸序列的该寡核苷酸组合物也含Pvu II5’标记序列和反向延
伸寡核苷酸的反向互补序列。含反向延伸寡核苷酸的寡核苷酸组合物也含有正向延伸寡核
苷酸的反向互补序列。这些寡核苷酸组合物在PCR中的杂交产生BsaAI切割位点。切割后
释放的寡核苷酸参与靶序列的PCR扩增。
伸寡核苷酸的反向互补序列。含反向延伸寡核苷酸的寡核苷酸组合物也含有正向延伸寡核
苷酸的反向互补序列。这些寡核苷酸组合物在PCR中的杂交产生BsaAI切割位点。切割后
释放的寡核苷酸参与靶序列的PCR扩增。
[0431] 该试验在20μL反应液中进行，各反应物的终浓度如下：1X缓冲液(50mMTris-HCl，4mM(NH4)2SO4，10mM KCl，4mM MgCl)，125μM dATP，125μM dCTP，125μM dGTP，
125μM dTTP，2单位罗氏FastStart DNA聚合酶，300nM正向寡核苷酸，300nM反向寡核苷
酸，20nM加标寡核苷酸，7.5ng人基因组DNA，5单位Pvu II限制性内切核酸酶和2单位
BsaAI限制性内切核酸酶。
125μM dTTP，2单位罗氏FastStart DNA聚合酶，300nM正向寡核苷酸，300nM反向寡核苷
酸，20nM加标寡核苷酸，7.5ng人基因组DNA，5单位Pvu II限制性内切核酸酶和2单位
BsaAI限制性内切核酸酶。
[0432] PCR主混合物中加入内标或加标。此加标的质量比分析物大15道尔顿。内标可用于使PCR反应物的吹吸造成的的差异、PCR后操作如用链霉亲和素包裹的顺磁珠纯化和点
样到MALDI芯片上时的损失，以及MALDI仪器性能的差异标准化。可计算出分析物与相应
加标的峰面积响应比例(Bruenner等，1996)。此内部加标的质量是3020.3道尔顿。
样到MALDI芯片上时的损失，以及MALDI仪器性能的差异标准化。可计算出分析物与相应
加标的峰面积响应比例(Bruenner等，1996)。此内部加标的质量是3020.3道尔顿。
[0433] 注明/5BioTEG/的寡核苷酸序列含有通过延长的15个原子间隔臂与寡核苷酸5’端连接的生物素。注明/3SpC3/的寡核苷酸序列含有3’C3间隔子。此实施例中所用的
3’C3间隔子(而非3’羟基)可防止DNA聚合酶延伸这种延伸寡核苷酸。也可取代3’末
端的其它部分以能防止DNA聚合酶延伸这种寡核苷酸。这些部分可包括但不限于：3′氨基
修饰剂，3′生物素，3’生物素TEG，3′胆固醇-TEG，3′地高辛，3′硫醇，3′反转dT或3′磷酸。
3’C3间隔子(而非3’羟基)可防止DNA聚合酶延伸这种延伸寡核苷酸。也可取代3’末
端的其它部分以能防止DNA聚合酶延伸这种寡核苷酸。这些部分可包括但不限于：3′氨基
修饰剂，3′生物素，3’生物素TEG，3′胆固醇-TEG，3′地高辛，3′硫醇，3′反转dT或3′磷酸。
[0434] 热循环反应方案如下：
[0435] 90℃ 5秒钟
[0436] 50℃ 1小时(BsaAI限制性内切核酸酶的最适温度)
[0437] 95℃ 3分钟
[0438] 95℃ 10秒钟，60℃ 10秒钟和72℃ 20秒钟，35轮循环
[0439] 37℃ 1小时(Pvu II限制性内切核酸酶的最适温度)
[0440] 随后通过用链霉亲和素包裹的顺磁珠捕获5’生物素部分纯化反应物。图35A-35C显示采用本文所述延伸和扩增方法，对从经切割的封闭寡核苷酸组合物延伸的寡核苷酸所
做的MALDI质谱检测结果。图35A显示用未封闭寡核苷酸组合物做的对照反应的5’Pvu II
标记图谱。此对照反应证实，在针对该封闭寡核苷酸组合物所用的热循环方案下PCR和Pvu
II切割有效。图35B显示用本文所述的第#1组SRY.BsaAI.f1和SRY.BsaAI.r1封闭成对
寡核苷酸组合物所作反应的5’Pvu II标记图谱。存在分析物峰表明该对寡核苷酸组合物
已被PCR反应中加入的BsaAI限制性内切核酸酶解除封闭。图35C显示用本文所述的第#2
组SRY.BsaAI.f2和SRY.BsaAI.r2封闭成对寡核苷酸组合物所作反应的5’Pvu II标记图
谱。存在分析物峰表明该寡核苷酸组合物已被PCR中加入的BsaAI限制性内切核酸酶解除
封闭。所有分图中的质谱包括在PCR设定时加入的参比加标峰。
做的MALDI质谱检测结果。图35A显示用未封闭寡核苷酸组合物做的对照反应的5’Pvu II
标记图谱。此对照反应证实，在针对该封闭寡核苷酸组合物所用的热循环方案下PCR和Pvu
II切割有效。图35B显示用本文所述的第#1组SRY.BsaAI.f1和SRY.BsaAI.r1封闭成对
寡核苷酸组合物所作反应的5’Pvu II标记图谱。存在分析物峰表明该对寡核苷酸组合物
已被PCR反应中加入的BsaAI限制性内切核酸酶解除封闭。图35C显示用本文所述的第#2
组SRY.BsaAI.f2和SRY.BsaAI.r2封闭成对寡核苷酸组合物所作反应的5’Pvu II标记图
谱。存在分析物峰表明该寡核苷酸组合物已被PCR中加入的BsaAI限制性内切核酸酶解除
封闭。所有分图中的质谱包括在PCR设定时加入的参比加标峰。
[0441] 实施例9：不能热激活的限制性内切核酸酶的部分名单
[0442] 下文提供的表列举了热稳定限制性内切核酸酶的非限制性例子(表分成两部分)。所提供的数据在互联网址URL neb.com可得。热稳定性定义为耐热半衰期，如上文所
述，已研究了下文所示的一些这类酶的热稳定性。在设计热循环方案时，耐热半衰期是最大
程度减少限制性内切核酸酶完全灭活的重要考虑因素。一些耐热酶在多次变性循环后可重
折叠而保留其至少50％的活性，从而能进行多轮扩增。其它耐热酶仅经过一轮或几轮扩增
后活性损失超过50％。正对热稳定酶的耐热半衰期作进一步研究。本文所述实施方式适合
采用任何耐热(例如热稳定性)的限制性内切核酸酶，因此不限于下表中所包括的酶。
述，已研究了下文所示的一些这类酶的热稳定性。在设计热循环方案时，耐热半衰期是最大
程度减少限制性内切核酸酶完全灭活的重要考虑因素。一些耐热酶在多次变性循环后可重
折叠而保留其至少50％的活性，从而能进行多轮扩增。其它耐热酶仅经过一轮或几轮扩增
后活性损失超过50％。正对热稳定酶的耐热半衰期作进一步研究。本文所述实施方式适合
采用任何耐热(例如热稳定性)的限制性内切核酸酶，因此不限于下表中所包括的酶。
[0443]
[0444]
[0445] 实施例10：适合用于荧光检测方法的寡核苷酸组合物
[0446] 图36显示使含有热稳定性限制性内切核酸酶的寡核苷酸组合物产生荧光信号至少需要两轮寡核苷酸延伸的方法。此方法的步骤与上文实施例3中就图10所述方法相似，
因此在此不作描述。这两个实施例之间的差异在于用可检测荧光特征替代实施例3图10中
的捕获剂。图36所示实施方式采用信号对荧光试剂(例如发射剂和淬灭剂，或在FRET情
况中为激发剂和发射剂)，然而，技术人员知道，可用适合本文所述组合物的任何可检测特
征或荧光特征代替图36所示的信号对可检测特征。上文已描述了适合与本文所示组合物
和方法一起使用的信号对可检测试剂。
因此在此不作描述。这两个实施例之间的差异在于用可检测荧光特征替代实施例3图10中
的捕获剂。图36所示实施方式采用信号对荧光试剂(例如发射剂和淬灭剂，或在FRET情
况中为激发剂和发射剂)，然而，技术人员知道，可用适合本文所述组合物的任何可检测特
征或荧光特征代替图36所示的信号对可检测特征。上文已描述了适合与本文所示组合物
和方法一起使用的信号对可检测试剂。
[0447] 在图36所示实施方式中，将淬灭剂掺入限制性内切核酸酶切割位点的3’端，这使得经至少两轮寡核苷酸延伸产生限制性内切核酸酶切割位点后能激活此可检测特征。即，
延伸必需使5’标记的正向寡核苷酸产生延伸产物，该产物与反向寡核苷酸退火并延伸，从
而产生双链限制性内切核酸酶的识别位点。在切割条件下被切割释放出该标记，使淬灭剂
与荧光团分离，从而得以检测到该可检测特征。
延伸必需使5’标记的正向寡核苷酸产生延伸产物，该产物与反向寡核苷酸退火并延伸，从
而产生双链限制性内切核酸酶的识别位点。在切割条件下被切割释放出该标记，使淬灭剂
与荧光团分离，从而得以检测到该可检测特征。
[0448] 实施例11：硫化叶菌DNA聚合酶IV和Tth内切核酸酶内部杂交探针试验
[0449] 在某些实施方式中，可在本文所述的试验中加入能跨越各种DNA模板损伤处合成DNA的聚合酶。硫化叶菌DNA聚合酶IV是热稳定Y家族跨损伤DNA聚合酶的非限制性例
子，它能跨越各种DNA模板损伤处而有效合成DNA。
子，它能跨越各种DNA模板损伤处而有效合成DNA。
[0450] 跨损伤处合成的DNA聚合酶
[0451] DNA链有所可含有因各种因素，例如紫外光、辐射、细胞代谢副产物或外源性化学品所导致的“损伤”。这类损害可导致DNA碱基有时被氧化、烷基化、水解(脱酰胺基、脱嘌
呤和脱嘧啶)、错配或其它修饰。这些损伤的非限制性例子包括：脱碱基位点、胸腺嘧啶二
聚体、切口和缺口，脱氨基胞嘧啶、8-氧代-鸟嘌呤和8-氧代-7，8-二氢-2′脱氧腺嘌呤。
呤和脱嘧啶)、错配或其它修饰。这些损伤的非限制性例子包括：脱碱基位点、胸腺嘧啶二
聚体、切口和缺口，脱氨基胞嘧啶、8-氧代-鸟嘌呤和8-氧代-7，8-二氢-2′脱氧腺嘌呤。
[0452] 当高保真DNA聚合酶遭遇DNA链中的某些损伤时，DNA复制中止。高保真DNA聚合酶的非限制性例子包括Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。通常跨损伤Y家族聚合酶如
硫化叶菌DNA聚合酶IV(Dpo4)能绕过使高保真DNA聚合酶停止的DNA损伤。
硫化叶菌DNA聚合酶IV(Dpo4)能绕过使高保真DNA聚合酶停止的DNA损伤。
[0453] 硫化叶菌DNA聚合酶IV是能绕过损伤处的热稳定性Y家族DNA聚合酶，能跨越多2+
种DNA模板损伤处而有效合成DNA。硫化叶菌DNA聚合酶IV的跨损伤合成在反应中存在Mn
时得到加强。该酶在95℃ 6分钟被热灭活。硫化叶菌DNA聚合酶IV的持续合成能力和热
稳定性低于热稳定DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。硫化叶菌DNA聚合酶IV可市售购得(例
如，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich，MA)的NEB公司和马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，
MD)的特莱维进有限公司(Trevigen，Inc.)。
种DNA模板损伤处而有效合成DNA。硫化叶菌DNA聚合酶IV的跨损伤合成在反应中存在Mn
时得到加强。该酶在95℃ 6分钟被热灭活。硫化叶菌DNA聚合酶IV的持续合成能力和热
稳定性低于热稳定DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。硫化叶菌DNA聚合酶IV可市售购得(例
如，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich，MA)的NEB公司和马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，
MD)的特莱维进有限公司(Trevigen，Inc.)。
[0454] Tth内切核酸酶IV
[0455] Tth内切核酸酶IV是得自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的热稳定性脱嘌呤/脱嘧啶(AP)内切核酸酶(马萨诸塞州伊普斯威奇的NEB公司)。该酶能去除受损DNA
的脱碱基位点。内切核酸酶IV对DNA分子中的尿素位点、碱基对错配、折翼和伪Y结构、小
插入/缺失也具有活性。Tth内切核酸酶IV首先在最靠近DNA分子5′端的损伤处切割双
2+ 2+
链DNA的一条DNA链。切割单链DNA的效率显著低于双链DNA。酶活性需要Mg 或Mn 离
子，升高温度时加入25uM ZnCl2可增强其热稳定性。此酶的最适温度范围是65℃-70℃。
的脱碱基位点。内切核酸酶IV对DNA分子中的尿素位点、碱基对错配、折翼和伪Y结构、小
插入/缺失也具有活性。Tth内切核酸酶IV首先在最靠近DNA分子5′端的损伤处切割双
2+ 2+
链DNA的一条DNA链。切割单链DNA的效率显著低于双链DNA。酶活性需要Mg 或Mn 离
子，升高温度时加入25uM ZnCl2可增强其热稳定性。此酶的最适温度范围是65℃-70℃。
[0456] 硫化叶菌DNA聚合酶IV和Tth内切核酸酶内部杂交探针试验
[0457] 在一些实施方式中，硫化叶菌DNA聚合酶IV和Tth内切核酸酶内部杂交探针试验包含修饰的正向引物。在某些实施方式中，5’序列区不作为模板而3’序列区作为模板。在
一些实施方式中，用内部脱碱基残基分隔这两个序列区域(见图37)。在某些实施方式中，
用能检测此种切割标记的分子标记所述寡核苷酸。这样的标记有时包括可在利用链霉亲和
素-生物素或相似纯化方法中被捕获的5’生物素部分。在一些实施方式中，所述反向引物
作为模板不经修饰(见图37)。本实施例所述实施方式没有内部杂交探针。
一些实施方式中，用内部脱碱基残基分隔这两个序列区域(见图37)。在某些实施方式中，
用能检测此种切割标记的分子标记所述寡核苷酸。这样的标记有时包括可在利用链霉亲和
素-生物素或相似纯化方法中被捕获的5’生物素部分。在一些实施方式中，所述反向引物
作为模板不经修饰(见图37)。本实施例所述实施方式没有内部杂交探针。
[0458] 在一些实施方式中，在PCR反应中与变性DNA模板退火时，用DNA聚合酶延伸正向和反向引物。在某些实施方式中(见图38)，采用跨损伤DNA聚合酶(例如硫化叶菌DNA聚
合酶IV(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)
DNA聚合酶IV(Dpo4)(特莱维进有限公司，马里兰州盖瑟斯堡))，或任何能绕过损伤处的
DNA聚合酶，跨越模板的脱碱基位点(或其它损伤位点)掺入碱基，通过正向引物的引入使
反应越过该脱碱基位点(或其它损伤位点)继续聚合。
合酶IV(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)
DNA聚合酶IV(Dpo4)(特莱维进有限公司，马里兰州盖瑟斯堡))，或任何能绕过损伤处的
DNA聚合酶，跨越模板的脱碱基位点(或其它损伤位点)掺入碱基，通过正向引物的引入使
反应越过该脱碱基位点(或其它损伤位点)继续聚合。
[0459] PCR后得到的扩增子含有正向引物序列掺入的脱碱基位点。合成的相对链越过该脱碱基位点和正向引物5’区所引入的非模板序列延伸(见图38)。在一些实施方式中，加
入热稳定性脱碱基切割酶如Tth内切核酸酶IV使特异性标记得以从双链扩增子切下。可用
任何合适方法检测此切下的标记。在某些实施方式中，切下的标记标含有5’生物素部分，
有时可用链霉亲和素珠捕获和纯化。
入热稳定性脱碱基切割酶如Tth内切核酸酶IV使特异性标记得以从双链扩增子切下。可用
任何合适方法检测此切下的标记。在某些实施方式中，切下的标记标含有5’生物素部分，
有时可用链霉亲和素珠捕获和纯化。
[0460] 跨损伤硫化叶菌DNA聚合酶IV可用第二DNA热稳定性聚合酶补充。得到补充的跨损伤硫化叶菌DNA聚合酶IV可通过辅助模板序列的聚合而提高得率。
[0461] 材料和方法
[0462]
[0463] 上表提供了代表性试验中所用的寡核苷酸。设计这类寡核苷酸用以扩增人SRY基因中的序列。包含“/5BioTEG/”的寡核苷酸含有通过延长的15个原子间隔臂与该寡核苷
酸5’端连接的生物素。包含“/idSp/”的寡核苷酸含有内部脱碱基位点，例如1’，2’-双脱氧核糖(dSpacer)部分。包含“/3SpC3/”的寡核苷酸含有与该寡核苷酸3’端连接使该寡
核苷酸不能被DNA聚合酶延伸的3个碳原子间隔。
酸5’端连接的生物素。包含“/idSp/”的寡核苷酸含有内部脱碱基位点，例如1’，2’-双脱氧核糖(dSpacer)部分。包含“/3SpC3/”的寡核苷酸含有与该寡核苷酸3’端连接使该寡
核苷酸不能被DNA聚合酶延伸的3个碳原子间隔。
[0464] 在一些实施方式中，已知钝态参比加标与加入PCR反应中的MALDI标记的浓度相似，但质量不同。此种参比加标不参与PCR反应，但可用作质谱定量分析用的参比品。在某
些实施方式中，通过计算切下的标记与该不易变参比标记的比例，定量分析切下的标记。此
种比例可用作分析PCR中样品的纯化程度、沉积到MALDI芯片基质或MALDI仪器检测效率
的对照。
些实施方式中，通过计算切下的标记与该不易变参比标记的比例，定量分析切下的标记。此
种比例可用作分析PCR中样品的纯化程度、沉积到MALDI芯片基质或MALDI仪器检测效率
的对照。
[0465] 此试验在25μL PCR反应液中进行，各反应物的终浓度如下：20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，4mM MgSO4，0.1％Triton X-100，125uM dATP，125uM dCTP，125uM dGTP，125uM dTTP，0.5nM MnCl2，25uM ZnCl2，150nm正向引物，150mM反向引物，25nm内部参比加标，0.5单位Tth内切核酸酶IV，0.6单位硫化叶菌DNA聚合酶IV和50ng人基因组
DNA。
DNA。
[0466] 样品可作如下热循环：90℃ 5秒钟一轮循环，90℃ 15秒、60℃ 10秒和68℃ 20秒，35轮循环；70℃ 30秒一轮循环。将样品保持在4℃直至其加工用于质谱分析。PCR后，
TM
用链霉亲和素珠(Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1，英杰公司(Invitrogen)，加利福尼
亚州卡尔斯巴德(Carlsbad CA))捕获，纯化得到含生物素的寡核苷酸。
TM
用链霉亲和素珠(Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1，英杰公司(Invitrogen)，加利福尼
亚州卡尔斯巴德(Carlsbad CA))捕获，纯化得到含生物素的寡核苷酸。
[0467] 在一些实施方式中，反应液可含有第二DNA聚合酶(例如Taq FastStart DNA聚合o TM TM
酶(见图39)、Tth DNA聚合酶(见图40)、9N m DNA聚合酶(见图41)、Deep VentR (无
外切活性)DNA聚合酶(见图42))以提高硫化叶菌DNA聚合酶IV在未修饰DNA碱基的聚合
中的持续合成能力。图39-42中，切下的标记注明为“标记”，钝态参比加标注明为“加标”，未切割的正向引物注明为“SRY.Dpo.Tth.f1”。每个都显示存在切下的标记，表明被Tth内
切核酸酶IV切割。以下是所述聚合酶的一些信息。
酶(见图39)、Tth DNA聚合酶(见图40)、9N m DNA聚合酶(见图41)、Deep VentR (无
外切活性)DNA聚合酶(见图42))以提高硫化叶菌DNA聚合酶IV在未修饰DNA碱基的聚合
中的持续合成能力。图39-42中，切下的标记注明为“标记”，钝态参比加标注明为“加标”，未切割的正向引物注明为“SRY.Dpo.Tth.f1”。每个都显示存在切下的标记，表明被Tth内
切核酸酶IV切割。以下是所述聚合酶的一些信息。
[0468] Taq FastStart DNA聚合酶是改良的重组Taq DNA聚合酶。该酶在温度低于75℃时无活性，但95℃2-4分钟的热激活步骤可被激活。每25μL PCR反应液中加入1.0单位
Taq FastStart DNA聚合酶。
Taq FastStart DNA聚合酶。
[0469] 9oNTMm DNA聚合酶(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)是嗜热DNA聚合酶，经过基因工程改造使其3′→5′校对外切核酸酶活性降低。每25μLPCR反应液中加入0.4单位
o TM
9N m DNA聚合酶。
o TM
9N m DNA聚合酶。
[0470] Deep VentRTM(无外切活性)DNA聚合酶(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)经基因工程改造消除了Deep Vent DNA聚合酶相关的3′→5′校对外切核酸酶活性。每25μL
PCR反应液中加入0.4单位Deep Vent(无外切活性)DNA聚合酶。
PCR反应液中加入0.4单位Deep Vent(无外切活性)DNA聚合酶。
[0471] Tth DNA聚合酶(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))是具有5′→3′外切核酸酶活性的热稳定性酶，被推荐用于升高温度下的PCR和逆转录反
应。每25μL PCR反应液中加入1.0单位Tth DNA聚合酶。
应。每25μL PCR反应液中加入1.0单位Tth DNA聚合酶。
[0472] 硫化叶菌DNA聚合酶的热稳定性不如某些其它热稳定DNA聚合酶。硫化叶菌DNA聚合酶在95℃放置6分钟后被热灭活。改变变性时间和温度预期会影响产量。评估了变性
温度对产量的影响，数据见图43。将MALDI标记峰下的面积按内部参比加标峰下的面积标
准化。本实验中，切下的标记产量随退火温度的升高而降低。
温度对产量的影响，数据见图43。将MALDI标记峰下的面积按内部参比加标峰下的面积标
准化。本实验中，切下的标记产量随退火温度的升高而降低。
[0473] 在一些实施方式中，可在一定范围的PCR热循环时间和温度下进行试验，采用不2+ 2+ 2+ 2+
同的酶混合物及浓度，和不同浓度的Mg ，Mn ，Ca 和Zn 。
同的酶混合物及浓度，和不同浓度的Mg ，Mn ，Ca 和Zn 。
[0474] 在一些实施方式中，引入修饰报道剂，包括但不限于联用荧光共振能转移(FRET)或淬灭剂与一种或多种图8所示含脱碱基的引物。引物对通常包括荧光部分和淬灭部
分。例子包括但不限于：FAM和黑洞猝灭剂(BlackHole Quencher)、FAM和爱荷华黑淬灭剂
(Iowa Black Quencher)、FAM和TAMRA、以及FAM和ROX。
分。例子包括但不限于：FAM和黑洞猝灭剂(BlackHole Quencher)、FAM和爱荷华黑淬灭剂
(Iowa Black Quencher)、FAM和TAMRA、以及FAM和ROX。
[0475] 在一些实施方式中，除脱碱基损伤外的其它损伤通过硫化叶菌DNA聚合酶得以延伸并用Tth内切核酸酶IV切割。其它损伤位点的非限制性例子包括：DNA分子内的尿素位
点、大体积碱基、DNA加合物、碱基对错配、折翼和伪Y结构、小插入/缺失。
点、大体积碱基、DNA加合物、碱基对错配、折翼和伪Y结构、小插入/缺失。
[0476] 此种试验不限于使用Tth内切核酸酶IV。可采用任何合适的热稳定性内切核酸酶。可用于试验(例如切割通过引物导入的脱碱基位点)的热稳定性内切核酸酶的非限制
性例子包括：Tma内切核酸酶III(NEB，马萨诸塞州伊普斯威奇)和内切核酸酶III(Nth)。
除内切核酸酶活性外，Tma内切核酸酶III含有N-糖基化酶活性。在某些实施方式中，此
N-糖基化酶活性可在试验中与内切核酸酶活性联合。在一些实施方式中，此种N-糖基化酶
可使损伤的嘧啶碱基释放，因而尿嘧啶处留下脱碱基位点。此种内切核酸酶的活性可切割
产生的脱碱基位点。
性例子包括：Tma内切核酸酶III(NEB，马萨诸塞州伊普斯威奇)和内切核酸酶III(Nth)。
除内切核酸酶活性外，Tma内切核酸酶III含有N-糖基化酶活性。在某些实施方式中，此
N-糖基化酶活性可在试验中与内切核酸酶活性联合。在一些实施方式中，此种N-糖基化酶
可使损伤的嘧啶碱基释放，因而尿嘧啶处留下脱碱基位点。此种内切核酸酶的活性可切割
产生的脱碱基位点。
[0477] 在某些实施方式中，在PCR扩增和利用内切核酸酶活性分别进行的2步试验中，可采用非热稳定性或热稳定性内切核酸酶。起初进行的PCR没有内切核酸酶，而在PCR后加
入内切核酸酶，保持反应在允许内切核酸酶发挥活性的温度下进行。
入内切核酸酶，保持反应在允许内切核酸酶发挥活性的温度下进行。
[0478] 在一些实施方式中，在PCR扩增和利用内切核酸酶活性分别进行的2步试验中，可采用非热稳定性或热稳定性能跨越损伤处的DNA聚合酶。起初进行的PCR采用非跨越损伤
DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。在PCR后加入跨越损伤DNA聚合酶，保持反应在允许跨越损
伤活性的温度下进行。
DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。在PCR后加入跨越损伤DNA聚合酶，保持反应在允许跨越损
伤活性的温度下进行。
[0479] 在某些实施方式中，在PCR扩增和利用内切核酸酶活性分别进行的2步试验中，可采用非热稳定性或热稳定性的跨越损伤DNA聚合酶和内切核酸酶。起初进行的PCR没有内
切核酸酶而用非跨越损伤的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。PCR后加入跨越损伤DNA聚合
酶和内切核酸酶，保持反应在允许跨越损伤活性的温度下进行。
切核酸酶而用非跨越损伤的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。PCR后加入跨越损伤DNA聚合
酶和内切核酸酶，保持反应在允许跨越损伤活性的温度下进行。
[0480] 在上述实施方式中，可采用任何合适的非热稳定性内切核酸酶和非热稳定性跨越损伤DNA聚合酶。非热稳定性内切核酸酶的非限制性例子包括但不限于：大肠杆菌内切核
酸酶IV(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)、大肠杆菌内切核酸酶III(NEB公司，马萨诸塞
州伊普斯威奇)、大肠杆菌内切核酸酶VIII(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)。大肠杆菌
DNA聚合酶V是非热稳定性跨越损伤DNA聚合酶的非限制性例子。
酸酶IV(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)、大肠杆菌内切核酸酶III(NEB公司，马萨诸塞
州伊普斯威奇)、大肠杆菌内切核酸酶VIII(NEB公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)。大肠杆菌
DNA聚合酶V是非热稳定性跨越损伤DNA聚合酶的非限制性例子。
[0481] 实施例12：某些实施方式的举例
[0482] 下文提供某些实施方式的非限制性例子。非顺序性引用某些实施方式。A1.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
[0483] (a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：
[0484] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0485] (ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，和
[0486] (iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；
[0487] (b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物和包含所述封闭部分的片段；以及
[0488] (c)在扩增条件下延伸所述可延伸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
[0489] A2.实施方式A1所述的方法，其中包含所述封闭部分的片段含有可检测特征。
[0490] A3.实施方式A2所述的方法，还包括检测所述可检测特征。
[0491] A4.实施方式A2或A3所述的方法，其中包含所述封闭部分的片段含有捕获剂。
[0492] A5.实施方式A1-A4中任一项所述的方法，其中第一种寡核苷酸的封闭部分不同于第二种寡核苷酸的封闭部分。
[0493] A6.实施方式A1-A5中任一项所述的方法，其中每种寡核苷酸的封闭部分独立地选自生物素、亲和素、链霉亲和素和可检测标记。
[0494] A7.实施方式A1-A6中任一项所述的方法，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行和/或同时进行。
[0495] A8.实施方式A1-A7中任一项所述的方法，其中一种寡核苷酸包含5′区，该5′区包含：
[0496] (i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，
[0497] (ii)第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，该第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下可转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和
[0498] (iii)可检测特征。
[0499] A9.实施方式A8所述的方法，还包含用第二内切核酸酶在切割条件下切割所述功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生包含可检测特征的片段。
[0500] A10.实施方式A9所述的方法，所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种片段。
[0501] A11.实施方式A9或A10所述的方法，还包含检测一种或多种所述片段的一种或多种可检测特征。
[0502] A12.实施方式A9或A10所述的方法，其中所述片段的一种或多种含有捕获剂。
[0503] A13.实施方式A8-A13中任一项所述的方法，其中用第二内切核酸酶切割在与(a)、(b)和(c)相同的反应环境中进行和/或与(a)、(b)和(c)同时进行。
[0504] A50.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：
[0505] (a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：
[0506] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0507] (ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分可形成功能性第一内切核酸酶切割位点，
[0508] (iii)可检测特征，和
[0509] (iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；
[0510] (b)在切割条件下使核酸组合物与第一内切核酸酶接触，当存在靶核酸时，第一内切核酸酶切割所述功能性第一内切核酸酶切割位点，从而产生并释放含有可检测特征的切
割产物；以及
割产物；以及
[0511] (c)检测是否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无含有该可检测特征的切割产物，确定有无靶核酸。
[0512] A51.实施方式A50所述的方法，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
[0513] A52.实施方式A50或A51所述的方法，其中(a)和(b)同时进行。
[0514] A53.实施方式A50-A52中任一项所述的方法，其中(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
[0515] A54.实施方式A53所述的方法，其中检测一种或多种所述切割产物的一种或多种可检测特征。
[0516] A55.实施方式A50-A54中任一项所述的方法，其中一种或多种所述切割产物含捕获剂。
[0517] A60.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：
[0518] (a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：
[0519] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0520] (ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，
[0521] (iii)可检测特征，和
[0522] (iv)所寡核苷酸3′端的封闭部分，
[0523] 此二种寡核苷酸之一包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分；
[0524] (b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物；
[0525] (c)在扩增条件下延伸该可延伸引物，从而将第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下转变成功能性第二内切核酸酶切割位点；
[0526] (d)用第二内切核酸酶在切割条件下切割该功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生含有可检测特征的切割产物；以及
[0527] (e)检测是否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据有无含该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
[0528] A61.实施方式A61所述的方法，其中(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应环境中进行。
[0529] A62.实施方式A60或A61所述的方法，其中(a)、(b)、(c)和(d)同时进行。
[0530] A63.实施方式A60-A62中任一项所述的方法，其中(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
[0531] A64.实施方式A63所述的方法，其中检测一种或多种所述切割产物的一种或多种可检测特征。
[0532] A65.实施方式A60-A64中任一项所述的方法，其中一种或多种所述切割产物含捕获剂。
[0533] B1.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
[0534] (a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和正向与反向多核苷酸引物接触，其中：
[0535] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0536] (ii)所述寡核苷酸包含第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核
酸酶切割位点，
酸酶切割位点，
[0537] (iii)所述寡核苷酸包含所述寡核苷酸3′端的封闭部分，
[0538] (iv)所述多核苷酸引物之一与所述寡核苷酸5′的靶核酸杂交；
[0539] (b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生切割产物；以及
[0540] (c)在扩增条件下延伸所述多核苷酸引物，从而扩增靶核酸或其部分。
[0541] B2.实施方式B1所述的方法，其中所述寡核苷酸阻断多核苷酸引物的延伸至第一功能性切割位点处被第一内切核酸酶切断。
[0542] B3.实施方式B1或B2所述的方法，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行。
[0543] B4.实施方式B 1-B3中任一项所述的方法，其中(a)、(b)和(c)同时进行。
[0544] B5.实施方式B1-B4中任一项所述的方法，其中一种或多种切割产物包含捕获剂。
[0545] B6.实施方式B5所述的方法，还包括检测一种或多种切割产物中的可检测特征。
[0546] B7.实施方式B1-B6中任一项所述的方法，其中一种或多种切割产物含捕获剂。
[0547] B50.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
[0548] (a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：
[0549] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0550] (ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸物质与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性内切核酸酶切割位点，
[0551] (iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和
[0552] (iv)可检测特征；
[0553] (b)在切割条件下使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有该可检测特征的寡核苷酸片段；和
[0554] (c)检测有无含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而根据检测有无含有该可检测特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。
[0555] B51.实施方式B50所述的方法，包含使(a)中所述的核酸组合物与两种或多种寡核苷酸接触。
[0556] B52.实施方式B50或B51所述的方法，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
[0557] B53.实施方式B50-B52中任一项所述的方法，其中(a)和(b)同时进行。
[0558] B54.实施方式B50-B63中任一项所述的方法，其中(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种寡核苷酸片段。
[0559] B55.实施方式B54所述的方法，其中检测一种或多种所述寡核苷酸片段的一种或多种可检测特征。
[0560] B56.实施方式B50-B55中任一项所述的方法，其中一种或多种所述寡核苷酸片段含有捕获剂。
[0561] B60.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
[0562] (a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含：
[0563] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0564] (ii)内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸物质与靶核酸杂交时该内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性内切核酸酶切割位点，
[0565] (iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分，和
[0566] (iv)可检测特征；
[0567] (b)在切割条件下使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，从而当存在靶核酸时，产生含有可检测特征的寡核苷酸片段；
[0568] (c)在延伸条件下使核酸组合物与正向和反向引物多核苷酸接触；和
[0569] (d)检测是否存在含有该可检测特征的寡核苷酸片段，从而根据检测有无该可检测特征的寡核苷酸片段确定有无靶核酸。
[0570] B61.实施方式B60所述的方法，包含使(a)中所述核酸组合物与两种或多种寡核苷酸接触。
[0571] B62.实施方式B60或B61所述的方法，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行。
[0572] B63.实施方式B60-B62中任一项所述的方法，其中(a)、(b)和(c)同时进行。
[0573] B64.实施方式B60-B63中任一项所述的方法，其中(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种寡核苷酸片段。
[0574] B65.实施方式B64所述的方法，其中检测一种或多种所述寡核苷酸片段的一种或多种可检测特征。
[0575] B66.实施方式B60-B65中任一项所述的方法，其中一种或多种所述寡核苷酸片段含有捕获剂。
[0576] C1.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
[0577] (a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和引物多核苷酸接触，其中所述寡核苷酸包含：
[0578] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，和
[0579] (ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分；和
[0580] (b)在扩增条件下延伸所述寡核苷酸，从而产生延伸的寡核苷酸，其中引物多核苷酸与该延伸的寡核苷酸杂交并在扩增条件下延伸，从而产生包含功能性第一内切核酸酶切
割位点的双链扩增产物，由此扩增靶核酸或其部分。
割位点的双链扩增产物，由此扩增靶核酸或其部分。
[0581] C2.实施方式C1所述的方法，还包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生双链切割产物。
[0582] C3.实施方式C1或C2所述的方法，其中所述双链切割产物含有可检测特征。
[0583] C4.实施方式C3所述的方法，还包括检测所述可检测特征。
[0584] C5.实施方式C3或C4所述的方法，其中所述双链切割产物含有捕获剂。
[0585] C6.实施方式C1-C5中任一项所述的方法，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
[0586] C7.实施方式C1-C6中任一项所述的方法，其中(a)和(b)同时进行。
[0587] C8.实施方式C1所述的方法，还包括(c)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生单链切割产物。
[0588] C9.实施方式C1或C8所述的方法，其中所述单链切割产物含有可检测特征。
[0589] C10.实施方式C9所述的方法，还包括检测所述可检测特征。
[0590] C11.实施方式C9或C10所述的方法，其中所述单链切割产物含有捕获剂。
[0591] C12.实施方式C1-C11中任一项所述的方法，其中所述第一内切核酸酶切割位点包含脱碱基位点。
[0592] C13.实施方式C12所述的方法，其中所述扩增条件包含跨损伤合成聚合酶。
[0593] C14.实施方式C13所述的方法，其中所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶。
[0594] C15.实施方式C14所述的方法，其中所述聚合酶是硫化叶菌DNA聚合酶IV。
[0595] C50.一种检测核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
[0596] (a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸和引物多核苷酸接触，其中所述寡核苷酸包含：
[0597] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0598] (ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，和
[0599] (iii)可检测特征；以及
[0600] (b)使核酸组合物暴露于扩增条件，其中(i)当存在靶核酸时，所述寡核苷酸被延伸，和(ii)所述引物多核苷酸与延伸的寡核苷酸杂交并在扩增条件下延伸，从而产生含有
功能性第一内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；
功能性第一内切核酸酶切割位点的双链扩增产物；
[0601] (c)使核酸组合物与切割所述第一内切核酸酶切割位点的第一内切核酸酶接触，从而产生含有该可检测特征的切割产物；以及
[0602] (d)检测有无含该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
[0603] C51.实施方式C50所述的方法，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行。
[0604] C52.实施方式C50或C51所述的方法，其中(a)、(b)和(c)同时进行。
[0605] C53.实施方式C50-C52中任一项所述的方法，其中(c)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
[0606] C54.实施方式C53所述的方法，其中检测一种或多种所述切割产物的一种或多种可检测特征。
[0607] C55.实施方式C50-C54中任一项所述的方法，其中一种或多种所述切割产物含有捕获剂。
[0608] C56.实施方式C50-C55中任一项所述的方法，其中所述第一内切核酸酶切割位点包含脱碱基位点。
[0609] C57.实施方式C56所述的方法，其中所述扩增条件包含跨损伤合成聚合酶。
[0610] C58.实施方式C57所述的方法，其中所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶。
[0611] C59.实施方式C58所述的方法，其中所述聚合酶是硫化叶菌DNA聚合酶IV。
[0612] D1.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：
[0613] (a)在杂交条件下，提供寡核苷酸和多核苷酸，或提供包含3′部分的寡核苷酸，其中：
[0614] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0615] (ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
[0616] (iii)所述寡核苷酸的3′部分包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，和
[0617] (iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点；
[0618] (b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物寡核苷酸；
[0619] (c)使所述核酸组合物与可延伸引物寡核苷酸接触；
[0620] (d)在扩增条件下存在引物核酸时延伸所述可延伸的引物寡核苷酸，其中(i)产生延伸的引物寡核苷酸，和(ii)使所述引物核酸与延伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，
[0621] 从而扩增靶核酸或其部分。
[0622] D2.实施方式D1所述的方法，其中：
[0623] 所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，和
[0624] 在扩增条件下产生含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物。
[0625] D3.实施方式D2所述的方法，还包括(e)用第二内切核酸酶切割所述功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生切割产物。
[0626] D4.实施方式D3所述的方法，其中所述切割产物是双链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。
[0627] D5.实施方式D3所述的方法，其中所述切割产物是单链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割该双链扩增产物的一条链)。
[0628] D6.实施方式D3-D5中任一项所述的方法，其中所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
[0629] D7.实施方式D3-D6中任一项所述的方法，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
[0630] D8.实施方式D3-D7中任一项所述的方法，其中一种或多种所述切割产物中含有捕获剂。
[0631] D9.实施方式D1-D8中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸和多核苷酸包含相同或不同的封闭部分。
[0632] D10.实施方式D1-D9中任一项所述的方法，其中(a)、(b)、(c)和(d)，或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)在同一反应环境中进行。
[0633] D11.实施方式D1-D10中任一项所述的方法，其中(a)、(b)、(c)和(d)，或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)同时进行。
[0634] D12.实施方式D1-D11中任一项所述的方法，其中所述包括3′部分的寡核苷酸形成茎环结构。
[0635] D50.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：
[0636] (a)在杂交条件下，提供寡核苷酸和多核苷酸，或提供包含3′部分的寡核苷酸，其中：
[0637] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0638] (ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
[0639] (iii)所述寡核苷酸的3′部分包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，
[0640] (iv)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点，
[0641] (v)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，和
[0642] (vi)所述寡核苷酸包含可检测特征；
[0643] (b)在切割条件下提供第一内切核酸酶，所述第一内切核酸酶切割该第一内切核酸酶切割位点，从而产生可延伸的引物寡核苷酸；
[0644] (c)使所述核酸组合物与该可延伸的引物寡核苷酸接触；
[0645] (d)将核酸组合物接触扩增条件和引物核酸，其中：(i)当存在靶核酸时，所述可延伸的引物寡核苷酸被延伸，从而产生延伸的引物寡核苷酸，和(ii)所述引物核酸与该延
伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而产生包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增
产物；
伸的引物寡核苷酸杂交并延伸，从而产生包含功能性第二内切核酸酶切割位点的双链扩增
产物；
[0646] (e)使核酸组合物在切割条件下与第二内切核酸酶接触，其中所述第二内切核酸酶切割包含第二内切核酸酶切割位点的双链扩增产物，从而产生含有该可检测特征的切割
产物；和
产物；和
[0647] (f)检测是否存在含该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。
[0648] D51.实施方式D50所述的方法，其中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)在同一反应环境中进行。
[0649] D52.实施方式D50或D51所述的方法，其中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)同时进行。
[0650] D53.实施方式D50-D52中任一项所述的方法，其中所述切割产物是双链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的两条链)。
[0651] D54.实施方式D50-D53中任一项所述的方法，其中所述切割产物是单链切割产物(例如，所述内切核酸酶切割双链扩增产物的一条链)。
[0652] D55.实施方式D50-D54中任一项所述的方法，其中所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。
[0653] D56.实施方式D50-D55中任一项所述的方法，其中检测一种或多种切割产物的一种或多种可检测特征。
[0654] D57.实施方式D50-D56中任一项所述的方法，其中一种或多种所述切割产物含有捕获剂。
[0655] E1.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
[0656] (a)在杂交条件下使核酸组合物与寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸包含：
[0657] (i)所述寡核苷酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，
[0658] (ii)所述寡核苷酸的3′末端含有封闭部分，和
[0659] (iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能杂交，
[0660] (iv)内部5′区和内部3′区不与靶核酸互补，
[0661] (v)内部5′区与内部3′区基本互补并在末端5′区和末端3′区与靶核酸杂交时彼此杂交形成内部茎环结构，
[0662] (vi)当末端5′区和末端3′区与靶序列不杂交时，内部5′区和内部3′区彼此不杂交，和
[0663] (vii)所述茎环结构包含内切核酸酶切割位点；
[0664] (b)使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，若核酸组合物中存在靶核酸则产生茎环结构切割产物；以及
[0665] (c)检测有无该切割产物，从而根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。
[0666] E2.实施方式E1所述的方法，其中所述切割产物含有可检测特征。
[0667] E3.实施方式E1或E2所述的方法，其中所述切割产物含有捕获剂。
[0668] E4.实施方式E1-E3中任一项所述的方法，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
[0669] E5.实施方式E1-E4中任一项所述的方法，其中(a)和(b)同时进行。
[0670] F1.一种测定核酸组合物中是否存在靶核酸的方法，所述方法包括：
[0671] (a)在杂交条件下使核酸组合物与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸接触，其中：
[0672] (i)所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各包含5′区、3′区和3′末端的封闭部分，
[0673] (ii)所述第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，
[0674] (iii)所述第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，
[0675] (iv)所述第一寡核苷酸的3′区与所述第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸杂交时，它们可彼此杂交形成茎结构，
[0676] (v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区不与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区与第二寡核苷酸的5′区彼此不杂交，和 (vi)所述茎结构包含内切核酸
酶切割位点；
酶切割位点；
[0677] (b)使核酸组合物与能切割所述切割位点的内切核酸酶接触，若核酸组合物中存在靶核酸则产生茎结构切割产物；以及
[0678] (c)检测有无该切割产物，从而根据检测有无该切割产物确定有无靶核酸。
[0679] F2.实施方式F1所述的方法，其中所述切割产物含有可检测特征。
[0680] F3.实施方式F1或F2所述的方法，其中所述切割产物含有捕获剂。
[0681] F4.实施方式F1-F3中任一项所述的方法，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。
[0682] F5.实施方式F1-F4中任一项所述的方法，其中(a)和(b)同时进行。
[0683] G1.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中，所述捕获剂选自生物素、亲和素和链霉亲和素。
[0684] G2.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶是热稳定性内切核酸酶。
[0685] G3.实施方式G2所述的方法，其中所述内切核酸酶在扩增条件下活性损失低于其最大活性的约50％。
[0686] G4.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶切割位点包含脱碱基位点。
[0687] G5.实施方式G4所述的方法，其中，所述内切核酸酶是AP内切核酸酶。
[0688] G6.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶是限制性内切核酸酶。
[0689] G7.实施方式G6所述的方法，其中，所述限制性内切核酸酶具有双链切割活性。
[0690] G8.实施方式G6所述的方法，其中，所述限制性内切核酸酶具有单链切割活性(例如切口酶)。
[0691] G9.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶切割DNA。
[0692] G10.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶不切割RNA。
[0693] G11.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶不是RNA酶。
[0694] G12.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含一个或多个脱碱基位点。
[0695] G13.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含一个或多个不可切割碱基。
[0696] G14.实施方式G13所述的方法，其中所述一个或多个不可切割碱基位于一个切割位点内，所述限制性内切核酸酶具有双链切割活性，所述限制性内切核酸酶只切割所述切
割位点的一条链。
割位点的一条链。
[0697] G15.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述可检测特征选自：质量、长度、核苷酸序列、光学性质、电学性质、磁学性质、化学性质和通过基质内开口的时间或速度。
[0698] G16.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述可检测特征是质量。
[0699] G17.实施方式G16所述的方法，其中所述质量用质谱法检测。
[0700] G18.实施方式G17所述的方法，其中所述质谱选自：基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)、激光解吸质谱(LDMS)、电喷雾(ES)质谱、离子回旋共振
(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。
(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。
[0701] G19.实施方式G17所述的方法，其中所述质谱包括使核酸离子化并挥发。
[0702] G20.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述可检测特征是从可检测标记测得的信号。
[0703] G21.实施方式G20所述的方法，其中所述信号选自：荧光、发光、紫外光、红外光、可见波长光、光散射、偏振光、辐射和同位素辐射。
[0704] G20.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述扩增条件包含具有链置换活性的聚合酶。
[0705] G21.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述封闭部分选自以下的3′末端部分：磷酸、氨基、巯基、乙酰基、生物素、胆固醇、四乙二醇(TEG)、生物素-TEG、胆固醇-TEG、一个或多个反向核苷酸、反向脱氧腺苷、地高辛和1，3-丙二醇(C3间隔子)。
[0706] G22.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述茎环结构中的环包含核苷酸。
[0707] G23.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述茎环结构中的环包含非核苷酸接头。
[0708] G24.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述茎环结构中的茎是部分单链。
[0709] G25.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述茎环结构中的茎为双链。
[0710] G26.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述茎环结构或茎结构包含一对信号分子的一个或两个成员，该对信号分子的成员被内切核酸酶切割位点隔开。
[0711] G27.实施方式G26所述的方法，其中所述信号分子对成员是荧光团和淬灭分子。
[0712] G27.实施方式G26所述的方法，其中所述信号分子对成员为适合荧光共振能量转移(FRET)的荧光团分子。
[0713] G28.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述第一内切核酸酶和第二内切核酸酶不相同。
[0714] G29.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述扩增和/或延伸条件包括核酸聚合酶。
[0715] G30.实施方式G29所述的方法，其中所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
[0716] G31.实施方式G29所述的方法，其中所述核酸聚合酶是RNA聚合酶。
[0717] G32.实施方式G29所述的方法，其中所述聚合酶是跨损伤合成聚合酶。
[0718] G33.实施方式G32所述的方法，其中所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶。
[0719] G34.实施方式G32所述的方法，其中所述聚合酶是硫化叶菌DNA聚合酶IV。
[0720] G35.实施方式G32所述的方法，其中所述聚合酶能跨越一处或多处DNA模板损伤合成DNA。
[0721] G36.实施方式G33所述的方法，其中所述一处或多处损伤是一个或多个脱碱基位点。
[0722] G37.实施方式G29所述的方法，其中所述聚合酶选自：Taq DNA聚合酶；Q-BioTMTM TM TM o TM
Taq DNA聚合酶；SurePrime 聚合酶；Arrow Taq DNA聚合酶；JumpStart Taq ；9N m DNA
TM
聚合酶；Deep VentR (无外切活性)DNA聚合酶；Tth DNA聚合酶；抗体介导的聚合酶；用于
热稳定性扩增的聚合酶；天然或改良的RNA聚合酶及其功能片段，天然或改良的DNA聚合酶
及其功能片段，和它们的组合。
Taq DNA聚合酶；SurePrime 聚合酶；Arrow Taq DNA聚合酶；JumpStart Taq ；9N m DNA
TM
聚合酶；Deep VentR (无外切活性)DNA聚合酶；Tth DNA聚合酶；抗体介导的聚合酶；用于
热稳定性扩增的聚合酶；天然或改良的RNA聚合酶及其功能片段，天然或改良的DNA聚合酶
及其功能片段，和它们的组合。
[0723] G38.上述应用实施方式中任一项所述的方法，其中所述第一内切核酸酶切割位点包含脱碱基位点。
[0724] G39.实施方式G38所述的方法，其中所述扩增条件包含跨损伤合成聚合酶。
[0725] G40.实施方式C39所述的方法，其中所述聚合酶是Y家族跨损伤聚合酶。
[0726] G41.实施方式C40所述的方法，其中所述聚合酶是硫化叶菌DNA聚合酶IV。
[0727] H1.一种包含封闭寡核苷酸的物质组合物，所述封闭寡核苷酸包含：
[0728] (i)非末端脱碱基位点，
[0729] (ii)3′末端封闭部分，和
[0730] (iii)可检测特征。
[0731] I1.一种包含两种寡核苷酸的物质组合物，其中每种寡核苷酸包含：
[0732] (i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0733] (ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性的第一内切核酸酶切割位点，和
[0734] (iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；
[0735] I2.实施方式I1所述的组合物，其中所述寡核苷酸之一的5′区包含：
[0736] (i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，
[0737] (ii)第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，在扩增条件下第二内切核酸酶切割位点的该无功能性部分转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和
[0738] (iii)可检测特征。
[0739] J1.一种包含彼此可杂交的寡核苷酸和多核苷酸的物质组合物，其中：
[0740] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0741] (ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，和
[0742] (iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点。
[0743] J2.实施方式J1所述的组合物，其中所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
[0744] K1.一种包含彼此可杂交的寡核苷酸和多核苷酸的物质组合物，其中：
[0745] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0746] (ii)所述多核苷酸包含一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的互补亚序列的多核苷酸亚序列，
[0747] (iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点，和
[0748] (iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分。
[0749] K2.实施方式K1所述的组合物，其中所述寡核苷酸和多核苷酸各包含3′末端的封闭部分。
[0750] L1.一种包含寡核苷酸的物质组合物，其中：
[0751] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0752] (ii)所述多核苷酸包含3′部分，该3′部分含有一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，从而形成茎环结构，和
[0753] (iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点。
[0754] L2.实施方式L1所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含3′末端的封闭部分。
[0755] M1.一种包含寡核苷酸的物质组合物，其中：
[0756] (i)所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的核苷酸亚序列，
[0757] (ii)所述寡核苷酸包含3′部分，该3′部分含有一段互补(″互补多核苷酸序列″)并杂交所述寡核苷酸的5′互补亚序列的多核苷酸亚序列，从而形成茎环结构，
[0758] (iii)所述寡核苷酸的互补亚序列和互补多核苷酸序列包含功能性第一内切核酸酶切割位点，和
[0759] (iv)所述寡核苷酸包含第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分。
[0760] M2.实施方式L1所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含3′末端的封闭部分。
[0761] N1.一种包含寡核苷酸的物质组合物，其中：
[0762] (i)所述寡核苷酸包含末端5′区、内部5′区、内部3′区和末端3′区，
[0763] (ii)所述寡核苷酸包含3′末端的封闭部分，和
[0764] (iii)末端5′区和末端3′区与靶核酸基本互补并能与其杂交，
[0765] (iv)内部5′区和内部3′区与靶核酸不互补，
[0766] (v)内部5′区与内部3′区基本互补，当末端5′区和末端3′区与靶核酸杂交时，内部5′区与内部3′区彼此杂交形成内部茎环结构，
[0767] (vi)当末端5′区和末端3′区与靶核酸不杂交时，内部5′区与内部3′区彼此不杂交，和
[0768] (vii)所述茎环结构包含内切核酸酶切割位点。
[0769] O1.一种包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的物质组合物，其中：
[0770] (i)所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各含有5′区、3′区和3′末端的封闭部分，
[0771] (ii)所述第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与所述靶核酸基本互补并能与其杂交，
[0772] (iii)所述第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区与靶核酸不互补，
[0773] (iv)所述第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区基本互补，当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸杂交时，第一寡核苷酸的3′区和第二寡核
苷酸的5′区可彼此杂交形成茎结构，
苷酸的5′区可彼此杂交形成茎结构，
[0774] (v)当第一寡核苷酸的5′区和第二寡核苷酸的3′区与靶核酸不杂交时，第一寡核苷酸的3′区和第二寡核苷酸的5′区彼此不杂交，和
[0775] (vi)所述茎结构包含内切核酸酶切割位点。
[0776] 本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技
术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
[0777] 可对上述内容进行修改而不背离本发明技术的基本方面。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本发明的技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申
请中具体揭示的实施方式进行修改，但这些修改和改进仍属于本发明技术的范围和思路之
内。
请中具体揭示的实施方式进行修改，但这些修改和改进仍属于本发明技术的范围和思路之
内。
[0778] 本文中适当描述的技术可在本文中尚没有具体揭示的任何元素存在下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包含”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个之一代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，这些
术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，以
及在要求专利权的本技术范围内的各种可行的改变。术语“一个”或“一种”表示一个或一
种或者多个或多种其修饰的要素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文
清楚表示所描述的是一种要素或是多种要素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的
10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用术语“约”表示修饰该列数值中
的每个数值(即，“约1、2和3”是约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括在90
克到110克之间的重量。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和可选的特征具体描述了
本发明的技术，但是本领域技术人员能够想到本文所揭示的内容的修改和变化，应认为这
些修改和变化落在本发明技术的范围内。
术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，以
及在要求专利权的本技术范围内的各种可行的改变。术语“一个”或“一种”表示一个或一
种或者多个或多种其修饰的要素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文
清楚表示所描述的是一种要素或是多种要素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的
10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用术语“约”表示修饰该列数值中
的每个数值(即，“约1、2和3”是约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括在90
克到110克之间的重量。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和可选的特征具体描述了
本发明的技术，但是本领域技术人员能够想到本文所揭示的内容的修改和变化，应认为这
些修改和变化落在本发明技术的范围内。
[0779] 本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技
术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
[0780] 在所附权利要求书中陈述了本技术的一些实施方式。
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