相关专利申请

本申请是2000年11月1日提交的美国专利申请序列号09/704,036的部分继 续申请，该专利申请要求1999年11月2日提交的临时专利申请序列号60/163,126 和2000年5月10日提交的序列号60/203,349的权利，前面各申请的内容和讲授 纳入本文供参考。

                            序列列表

与本发明有关的含21种序列的序列列表以计算机可读的ASCII文档形式纳入 本文供参考并附加两张(2)根据37CFR 1.821(c)的原始光盘、其根据37CFR 1.821(e) 的相同拷贝以及一张(1)其根据37CFR 1.52(e)的相同拷贝。

发明的背景

人血浆中高半胱氨酸的高水平与冠心病、中风、动脉硬化和其它疾病的风险增 加相关。结果需要筛选此氨基酸量提高的一般群体。为使大规模测试高半胱氨酸 可行，需要开发新和花费更少的测定。

常规测量血浆高半胱氨酸是通过高压液相层析(HPLC)和气相层析/质谱 (GC/MS)，花费超过100美金每测定，使这些物理分离方法对于广泛群体研究花 费太高。例如，可制备尿或血液样品用于氨基酸层析，通过HPLC分离和检测来测 量L-高半胱氨酸。Fiskerstrand等.(Clin.Chem.，39：263-271(1993))描述了测 定L-高半胱氨酸的方法，用荧光标记血清硫醇，接着通过HPLC分离和检测来自多 种其它含硫化合物的高半胱氨酸衍生物。然而，这种方法通常费时、昂贵且不易 为许多实验室所采用。

也开发了间接免疫测定高半胱氨酸，然而这些抗体方法仍相对昂贵，约24美 金每测试。一种特定间接免疫测定使高半胱氨酸酶促转变成腺苷高半胱氨酸且腺 苷高半胱氨酸的量通过竞争性ELISA(酶联免疫测定)确定，使用抗腺苷高半胱氨 酸抗体(例如参见美国专利5,827,645，其内容纳入本文供参考)。

已开发间接酶测定用于定量L-高半胱氨酸。例如，酶S-腺苷-高半胱氨酸水解 酶和腺苷加入测试样品。反应混合物中所得腺苷浓度或浓度变化用作样品中高半 胱氨酸起始浓度的指示。

也报导了直接酶测定用于测量高半胱氨酸。通常，这些操作使高半胱氨酸不可 逆地转变成其它可定量的化合物。例如，酶高半胱氨酸脱水酶用于从高半胱氨酸 中去除巯基。然后测量取出的巯基部分的浓度。此时和其它，酶用于高半胱氨酸 测定的主要缺点是所用酶与其它含硫的高半胱氨酸相关氨基酸和化合物反应，导 致背景高且不一致以及血浆的高半胱氨酸测量不精确。

已报导酶促(或酶)循环测定用于很少量的分析物。在酶促循环测定中，使用 两种或多种酶活性，重复利用底物且不可逆地转变测量的化合物。催化使用“化 合物”以控制转变成测定中定量化合物的速度。结果，感兴趣的分析物保持稳态 浓度，浓度足够低以产生准一级(pseudo-first order)反应速度。因此分析物 稳态浓度与总体测定的速度线性相关。通过测量反应速度可容易地确定分析物的 量。酶促循环测定有时称为“扩增”测定，因为方法通常使分析物的测量敏感性 增加100到1000倍。测量中的扩增是不减少化合物的稳态浓度的直接结果。没未 报导酶促循环测定用于测量高半胱氨酸。

本发明提供花费较少的酶促循环测定用于高半胱氨酸和/或胱硫醚，提供的样 品通量高于目前采用的诊断测定。此外，发明提供重组生产酶的方法和载体以及 评估样品中高半胱氨酸和胱硫醚的量的测试试剂盒，酶可用于生产测定试剂。

                            发明的概述

本发明提供酶促循环测定用于评估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。测定 利用高半胱氨酸和L-丝氨酸反应通过酶胱硫醚β-合酶(CBS)或其衍生物形成胱 硫醚，通过胱硫醚β-裂合酶(CBL)使胱硫醚酶促转变成高半胱氨酸、丙酮酸和 氨。测定提供高半胱氨酸和/或胱硫醚的稳态浓度，稳态浓度与与总体反应速度线 性相关。样品中确定的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量以形成的丙酮酸和/或氨的量 或从反应混合物中取出的丝氨酸的量为基础。用本发明测定的能测试溶液可包括 血液、血清、血浆、尿和其它生物样品的实验室样品。此外，可测试任何其它液 体样品。

在一个实施方案中，本发明提供评估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量的方 法，包括步骤：

(a)含高半胱氨酸和/或胱硫醚溶液接触(进行二硫化物还原步骤前和/或后) CBS或其衍生物、L-丝氨酸和CBL或其衍生物以形成反应混合物，接触时间足以催 化高半胱氨酸循环转变成胱硫醚且胱硫醚再转变成高半胱氨酸并产生丙酮酸和 氨；

(b)确定反应混合物中存在的丙酮酸和/或氨的量；

(c)在形成的丙酮酸和/或氨量的基础上评估溶液中存在的高半胱氨酸和/或 胱硫醚的量。

更特别的是，方法通过加入便宜的氨基酸L-丝氨酸提供高半胱氨酸量的评估。 反应混合物中存在的丙酮酸量可以一些方法测量。在本发明的一个特定实施方案 中，乳酸脱氢酶(LDH)或其衍生物和NADH(还原的烟酰胺辅因子)或其衍生物存 在于反应混合物中。NADH存在时，LDH使丙酮酸转变成乳酸，NADH氧化成NAD+(氧 化的烟酰胺辅因子)。

NADH氧化成NAD+可通过本领域一些已知的方法测量，包括在340nm监控反应 混合物。也可通过氧化染料以产生可观察的颜色变化来监控NAD+的产生。优选用 于本发明的染料包括但不限于5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四 唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或任何这些染料的衍生物。溶液中存在的 高半胱氨酸和/或胱硫醚的量以观察到的颜色强度与标准曲线相比为基础，标准曲 线构建用于已知浓度分析物的样品。

在另外的实施方案中，丙酮酸氧化酶和辣有过氧化物酶在过氧化氢和色原存在 时用于检测样品中存在的丙酮酸量。N-乙基-N-2-羟基3-磺丙基)-m-甲苯胺钠 (TOOS)和其它N-乙基-N-(2-羟基3-磺丙基)-苯胺衍生物是此比色反应的优选色 原。如上所述，样品中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量以观察到的颜色强度与标 准曲线相比为基础，标准曲线构建用于已知浓度分析物的样品。

溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量也可在反应混合物中存在的氨量基础 上测量。确定溶液中氨浓度的方法有很多。在本发明的一个特定实施方案中，测 量氨量使用普遍可用的标准氨传感器。

在另一个实施方案中，本发明涉及评估样品中高半胱氨酸和/或胱硫醚量的方 法，包括步骤：溶液接触还原剂，接触时间足以还原大体上所有的高半胱氨酸且 使溶液中存在的其它二硫化物还原成高半胱氨酸。还原剂处理也可用于释放高半 胱氨酸，高半胱氨酸经二硫键附于溶液中存在的蛋白质和/或其它分子。还原后， 溶液然后接触CBS或其衍生物、L-丝氨酸和CBL或其衍生物，接触时间足以催化 高半胱氨酸循环转变成胱硫醚且胱硫醚转变成高半胱氨酸并产生丙酮酸和氨。为 评估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量，反应混合物中存在的丙酮酸和/或 氨量可如上确定。用于本发明的优选还原剂包括氢硼化盐和硫醇还原剂。适用于 本实施方案的典型硫醇还原剂包括二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)、β- 巯基乙醇(βME)、tris-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)或硫代乙酸或它们的衍生物 等。

在另外一个评估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量的实施方案中，溶液 可用胱硫醚γ-裂合酶(CGL)或其衍生物预处理足够的时间以通过胱硫醚转变成 α酮戊二酸从反应混合物中去除任何胱硫醚。胱硫醚去除后，胱硫醚γ-裂合酶从 反应混合物中去除或破坏。在一个典型的实施方案中，破坏胱硫醚γ-裂合酶通过 加热溶液足够的时间以大体上去除其酶活性。胱硫醚γ-裂合酶也可在不溶底物或 表面上固定，例如容易去除微粒或珠。

在本发明另一个实施方案中，提供评估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚 量的方法，包括使溶液与L-丝氨酸和CBS或其衍生物及CBL或其衍生物反应，CBL 固定在固体表面上。固体表面可以是例如纸、滤纸、尼龙、玻璃、陶瓷、硅石、 氧化铝、硅藻土、纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯 乙烯和它们的衍生物。固体表面可以是测试容器的侧面和底部或可以是加入测试 容器的物质。在较佳实施方案中，固体表面包括加入测试容器的珠。

用于本发明的CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、胱硫醚γ-裂合酶或其衍生 物可作为粗提物从细胞获得。在本发明的一个实施方案中，胱硫醚β-合酶(CBS) 或其衍生物、胱硫醚β-裂合酶(CBL)和/或胱硫醚γ-裂合酶(CGL)纯化自人、 酵母或细菌细胞。在本发明的一个特别较佳实施方案中，编码酶的基因被分离或 合成且在宿主细胞中表达为重组蛋白。特别优选的是编码亲和标记的DNA序列加 入基因构建物以协助纯化和/或检测重组产生的酶。重组方法也可用于提供融合蛋 白，在单个蛋白质中包括CBS和CBL的酶活性。也可包含亲和标记作为部分融合 蛋白构建物以协助纯化融合蛋白。

本发明也提供评估样品中高半胱氨酸量的方法，此测定形式与高半胱氨酸/转 录因子复合体的量相关，复合体结合共有多核苷酸结合序列。在特定实施方案中， 方法包括使样品接触还原剂一段足够时间以从任何相关蛋白质中释放高半胱氨 酸；在有助于复合体形成的条件下还原高半胱氨酸接触高半胱氨酸代谢物结合转 录因子，样品与共有多核苷酸序列混合，序列由高半胱氨酸/转录因子复合体特异 识别；从结合共有多核苷酸序列的高半胱氨酸/转录因子复合体的量评估样品中存 在的高半胱氨酸量。可应用于方法的还原剂包括二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖 醇(DTT)、β-巯基乙醇、tris-(羧乙基)磷化氢(TCEP)或硫代乙酸或各自的任何盐 等。高半胱氨酸代谢物结合/转录因子包括识别共有多核苷酸序列的大肠杆菌 MetR，例如SEQ ID NO：11所述多核苷酸序列(Marconi等.，Biochem.Biophys.Res. Commun.，175：1057-1063(1991))或其衍生物。

本发明的另一个实施方案提供的测试试剂盒包括保持待评估溶液的容器以及 提供有助于高酶活性条件所需的任何缓冲液、辅助物质和溶剂，评估溶液中高半 胱氨酸和/或胱硫醚、L-丝氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物的量。测试试 剂盒可进一步包括乳酸脱氢酶或其衍生物和NADH或其衍生物。当氧化可包括时， NADH可在340nm直接测量或用能提供颜色改变的染料。高半胱氨酸和/或胱硫醚的 量与吸光度测量随着时间的变化相关。

在一个较佳实施方案中，提供的酶固定于固体支持物。固体支持物可包括保持 测试样品的容器表面或可以是珠或其它加入容器的物品。在本发明的另一个实施 方案中，可提供胱硫醚γ-裂合酶作为部分试剂盒以在酶促循环测定前从测试溶液 中去除任何胱硫醚。在加入高半胱氨酸酶促循环的剩余成分前，大体上所有的胱 硫醚γ-裂合酶或其衍生物活性必须从反应混合物中去除或破坏。

发现发明的优选测定可在相对短的时间段和用相对少量的酶完成，使测定有显 著的商业优势。例如，优选测定涉及反应混合物的产生，混合物包括含高半胱氨 酸的样品、丝氨酸、CBS、CBL、乳酸脱氢酶、NADH和还原剂如DTE、DTT，混合物 中CBS/CBL比例从约1∶1到25∶1，更优选从约1∶10，最优选从约2∶1到5∶1。有 利的是，已发现还原剂可与检测系统(即乳酸脱氢酶和NADH)一起存在而没有不 利影响测定。因此，进行发明的测定可没有单独的还原步骤，从而减少总测定次 数。因而，当许多样品通过在容器(如分光光度样品池)中连续产生反应混合物 测定时，混合物由样品、丝氨酸、CBS、CBL、乳酸脱氢酶、NADH和还原剂组成， 评估产生反应混合物中存在的丙酮酸量是通过监控NAD+随着时间的产生，各自反 应-产生步骤间的时间间隔可以短至10-50秒，特定样品的总反应时间至约20分 钟。特定样品的总反应时间更优选至约15分钟，更加优选至约13分钟。较慢仪 器的每小时总样品数可以是约15-30个，但对于更快仪器高达200-400个。在此 优选测定中，制备的第一种反应混合物包括样品、丝氨酸、乳酸脱氢酶、NADH和 还原剂，适当温育一段时间以释放样品中以结合、氧化和/或游离状态存在的大部 分(优选所有)高半胱氨酸(总高半胱氨酸)。因此，加入CBS和CBL以完成反应 混合物并起始高半胱氨酸和/或胱硫醚的酶促循环。

在另一个较佳实施方案中，胱硫醚可用于产生酶测定的校准物(因为酶促循环 测定使高半胱氨酸和胱硫醚互变)。换句话说，多种已知水平的胱硫醚可用于测定 系统以“校准”或“标准化”测定和/或可定量样品结果的仪器。在此实施方案中， 已知浓度的胱硫醚加入生物样品，然后进行用于一个其它实施方案的测定。结果 用于确定校准线，由于两条线间的高度相关性，校准线然后用于确立高半胱氨酸 线。另外，已知水平的胱硫醚可用作质量控制测量，以确保测定正常地工作。在 此质量控制实施方案中，这些“已知”水平的胱硫醚作为未知样品被测定，结果 与它们已知(预期)值比较以确保测定系统正常地发挥功能。

优选测定是用分离(纯化)CBL和CBS酶完成的，这些酶与选自SEQ ID Nos.19 和20的酶有至少约80％(优选至少约90％)的序列同一性。如本文所用，“序列同 一性”如本领域已知，指两种或多种蛋白质或多肽序列或两种或多种多核苷酸序 列间的关系，即参考序列和与参考序列比较的特定序列。确定序列同一性通过在 最佳排列序列以产生最高程度序列相似性后比较特定序列和参考序列，序列相似 性由这些序列串间的配对确定。这样排列时，序列同一性在位置-位置基础上确定， 例如如果核苷酸或氨基酸残基在特定位置相同，序列在此位置“相同”。然后这种 位置同一性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基总数以给出％序列同一性。序列 同一性可通过已知方法计算，包括但不限于《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.N.，主编.，Oxford University Press，New York(1988)，《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.，主编.，Academic Press，New York(1993)；《计 算机分析序列数据》(Computer Analysis of Sequence Data)，第1部 分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，主编.，Humana Press，New Jersey(1994)；《分 子生物学的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinge， G.，Academic Press，New York(1987)；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Griboskov，M.和Devereux，J.，主编.，M.Stockton Press New York(1991)；Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)， 所讲授的纳入本文供参考。设计确定序列同一性的优选方法以给出测试序列间的 最大配对。确定序列同一性的方法编纂入可公开获得的计算机程序，程序确定特 定序列间的序列同一性。这种程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.， 等.，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul，S.F.等.，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)。BLASTX程序可公开 获得自NCBI和其它来源(BLAST手册，Altschul，S.等.，NCVINLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S.F.等.，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，所讲授的纳入 本文供参考)。这些程序用默认间隔重量最佳排列序列以便产生特定和参考序列间 最高水平的序列同一性。例如，多核苷酸的核苷酸序列与参考核苷酸序列有至少 95％的“序列同一性”，则特定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除非特定 多核苷酸序列可包括多达5个点突变每100个参考核苷酸序列的核苷酸。换句话 说，核苷酸序列相对参考核苷酸序列有至少95％同一性的多核苷酸中，参考序列中 多达5％的核苷酸可缺失或由另外核苷酸取代，或者参考序列中多达5％总核苷酸的 一些核苷酸可插入参考序列。这些参考序列的突变可在参考核苷酸序列的5’或3’ 末端位置或末端位置间任何地方发生，单独散布在参考序列的核苷酸中或在参考 序列的一个或多个毗连基团中。类似地，具有特定氨基酸序列的多肽与参考氨基 酸序列有至少例如95％的“序列同一性”，则多肽的特定氨基酸序列与参考序列相 同，除非特定多肽序列可包括多达5个氨基酸改变每100个参考氨基酸序列的氨 基酸。换句话说，为获得与参考氨基酸序列有至少95％序列同一性的特定多肽序列， 参考序列中多达5％的氨基酸残基可缺失或由另外氨基酸取代，或者参考序列中多 达5％总氨基酸残基数的一些氨基酸可插入参考序列。这些参考序列的改变可在参 考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置间任何地方发生，单独散布 在参考序列的残基中或在参考序列的一个或多个毗连基团中。优选的是，不相同 的残基位置由保守性氨基酸取代区别。然而，在确定序列同一性时，保守性取代 不包括作为配对。

用于本发明的试剂包括CBS、CBL、L-丝氨酸、LDH、NADH、DTE、βME、DTT、 TCEP、硫代乙酸和CGL。用于本发明的CBS酶浓度范围从约0.1到约100KU/l。 CBS浓度更优选从约0.5到约75KU/l，更加优选从约1到约50KU/l。CBS浓度 最优选从约1到约30KU/l。用于本发明的CBL酶浓度范围从约0.01到约100KU/l。 CBS浓度更优选从约0.05到约50KU/l，更加优选从约0.1到约30KU/l。CBS浓 度最优选从约0.1到约15KU/l。L-丝氨酸可以约1μM到约50mM的终浓度存在。 L-丝氨酸更优选以约10μM到约40mM的终浓度加入，更加优选约100μM到约20mM 的终浓度。加入的L-丝氨酸终浓度最优选从约0.2mM到约10mM。当用于任何实施 方案时，LDH以约30到约5000U/L的终浓度存在于反应混合物中。反应混合物中 存在的LDH终浓度更优选从约30到约3000U/L，更加优选从约50到约2500U/L。 反应混合物中存在的LDH终浓度最优选从约100到约2000U/L。另外，当NADH用 于任何实施方案时，反应混合物中存在的NADH量可在约0.1mM到约2mM间变化。 反应混合物中存在的NADH终浓度更优选从约0.1mM到约1.5mM，更加优选约0.1 到约1mM间。反应混合物中存在的NADH终浓度最优选从约0.2到约0.8mM。当DTE 用于本发明时，它的终浓度范围可从约0.01mM到约100mM。DTE浓度范围更优选 从约0.01mM到约50mM，更加优选从约0.1mM到约25mM。DTE终浓度范围最优选从 约0.1mM到约10mM。类似地，当DTT用于本发明时，它的终浓度范围可从约0.01mM 到约100mM。DTT浓度范围更优选从约0.01mM到约50mM，更加优选从约0.1mM到 约25mM。DTT终浓度范围最优选从约0.1mM到约10mM。最后，当CGL用于本发明 时，它的终浓度范围可从约0.1KU/l到约100KU/l。CGL范围更优选从约0.5KU/l 到约75KU/l，更加优选从约1KU/l到约50KU/l。CGL终浓度范围最优选从约1 KU/l到约30KU/l。

在一些较佳实施方案中，试剂1的缓冲液是pH8.4的250mM TRIS。然而，当 TRIS用作缓冲液时，pH范围可从7.0-9.0。pH范围更优选从7.5-8.5，更加优选 从8.1-8.5。使用浓度增加的TRIS通过协助维持更恒定的pH来改进测定一致性， 因为它是更浓缩的缓冲液。另外，CBS和CBL在此优选pH范围中显然更具活性， 尤其从约pH8.1-8.5。

本发明也提供用混浊样品同样工作很好的测定。通过加入脂肪酶和α-环糊精 到R1来减少浊度问题。这些有助于降低浊度，这是通过甘油三酸酯被脂肪酶水解 成甘油和游离脂肪酸以及通过α-环糊精与游离脂肪酸形成复合体。加入这两种成 分有助于在加入试剂3前澄清反应混合物。用EDTA取代脂肪酶和α-环糊精提供 另一种精确分析混浊样品的方法。

本发明的另一个变化是测试不同体积的试剂的效果。这些变化对测定的精确性 没有显著作用。

本发明也测试不同去污剂和其浓度的效果。例如，Genapol X-80可以约 0.05-0.5％的浓度存在于试剂1。浓度更优选在0.1-0.5％间，更加优选在0.2-0.4％ 间。测试其中3个浓度(0.1％、0.3％和0.5％)，0.3％的浓度提供最精确的结果。 Brij-35也在试剂1中变化浓度。Brij-35可用于本发明，在R1中的浓度约 0.01-0.5％。此浓度范围更优选从约0.015到约0.1％，更加优选从约0.020到约 0.030％。测试的浓度(0.025％、0.05％、0.1％和0.5％)中，用0.025％浓度获得最 精确的一致的结果。

本发明也测试用Tris(2-羧乙基磷化氢)盐酸盐(TCEP)取代还原剂DTE，TCEP 在纯化水中稳定一段延长的时间。这种取代使试剂空白反应从约12-15mA/分钟减 少到约4-5mA/分钟，使此测定的精确度更高。当TCEP用于本发明时，它的浓度 范围可从约6-53mM。此浓度范围更优选从约10-45mM，更加优选从约20-30mM。在 此专利申请测试的浓度中，26.44mM提供最精确的测定结果。

含试剂3的混合物组成也变化。例如，Tris缓冲液被磷酸缓冲液取代且甘油 加入缓冲液。磷酸盐在约50mM到约500mM范围的浓度，pH7.6有效。甘油浓度范围 从约0.5％到15.0％(v/v)。磷酸盐和甘油用于提供酶更长的半衰期，这用TRIS缓 冲液是不可能的。

本发明的一个优点是它可使用任何一些仪器。例如，该测定适合在2种不同仪 器Hitachi 911和Beckman CX5上测试。注意到用任一种机器获得精确和一致的 结果。另外，测定可仅用2种试剂进行，通过在仪器要求基础上将R1和R2成分 以正确比例混合。

最后，本发明适用于单校准点。重要的是，来自单校准点的结果和多点校准曲 线一样精确。

                           附图的概述

图1描述了吸光度相对时间图，用丙酮酸水溶液(5-100μM)获得，证明丙酮 酸的定量。试剂成分描述于表1且仪器设置描述于表2。

图2描述了吸光度值相对已知量丙酮酸(0-100μM)作图的标准曲线。测定时 间是5分钟；

图3描述了吸光度相对时间图，用胱硫醚水溶液(0-100μM)获得。测量胱硫 醚是通过CBL将胱硫醚酶促转变成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。

图4描述了胱硫醚测定标准曲线，用胱硫醚水溶液(0-100μM)获得。反应时 间是5或20分钟；

图5描述了吸光度相对时间图，证明CBS/CBL/丙酮酸氧化酶/过氧化物酶循环 和信号系统。胱硫醚溶解于水以制备1和100μM间的浓度标准；

图6描述了吸光度相对时间图，证明CBS/CBL/丙酮酸氧化酶/过氧化物酶循环 和信号系统。高半胱氨酸溶解于水以制备0和100μM间的浓度标准；

图7描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)获得的典型校准曲线，使用 CBS/CBL/PO/HRP循环和检测系统；

图8描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)获得的典型吸光度相对时间图， 使用没有二硫苏糖醇的CBS/CBL/LDH系统；

图9描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)获得的典型吸光度相对时间图， 使用有二硫苏糖醇的CBS/CBL/LDH系统；

图10描述了有或没有二硫苏糖醇时高半胱氨酸浓度(0-100μM)相对吸光度 的校准图。反应时间是5分钟；

图11描述了用CBS/CBL/LDH酶循环系统获得的定量结果间的相互关系，系统 用DTT作为还原剂测量人血浆样品中的高半胱氨酸，与Abbott IMx高半胱氨酸方 法所得定量结果相比较；

图12描述的相关图阐明本发明测定(y)相对商业购买IMx测定(x)间的相 互关系，如实施例7所述；

图13描述的相关图阐明本发明测定(y)相对常规HPLC测定(x)间的相互关 系，如实施例7所述；

图14描述的相关图阐明IMx测定(x)和HPLC测定(y)间的相互关系，如实 施例7所述；

图15描述了吸光度相对时间的图，用于实施例9所述无DTT的丙酮酸测定。

图16描述了吸光度相对时间的图，用于实施例9所述含DTT的丙酮酸测定。

                         特定实施方案的描述

本发明提供均相酶循环测定用于评估样品中的高半胱氨酸量。酶循环维持高半 胱氨酸的稳态水平且进一步增加测试高半胱氨的敏感性。此外，本发明提供基因 和表达载体以重组产生用于本发明的酶。也提供测试试剂盒用于评估溶液中高半 胱氨酸和/或胱硫醚的量。

高半胱氨酸在细胞中作为中间氨基酸存在，在甲硫氨酸代谢成半胱氨酸时产 生。一般，体内产生的高半胱氨酸通过两条途径之一被迅速代谢：(1)与丝氨酸 缩合以形成胱硫醚或(2)转变成甲硫氨酸，正常情况下其在体内的浓度(以及它 的氧化形式高半胱氨酸)低。健康成人的平均血浆高半胱氨酸水平男性约为12μM， 范围从约8.6到约17.1μM，女性为10μM，范围从约3.9到16.8μM(Vester 等.，Eru.J.Clin.Chem.Biochem.，29：549-554(1991)；Jacobsen等.， Clin.Chem.，40：873-881(1994))。

近来，已确定生物样品中高半胱氨酸水平的量在一些情况中具有临床重要性。 血液中高半胱氨酸量增加与动脉硬化症的发展相关(Clarke等.，New Eng.J.Med.，324：1149-1151(1991))。同样，现在认为中等高半胱氨酸血症 (homocysteinemia)是心血管病的危险因子。正常成人中发现的正常高半胱氨酸 范围的精确性很重要，因为已确定的心脏病危险显著增加，仅超过正常浓度30％ 会使相关危险因子增加3.4倍(Stampfer等.，JAMA 268：877-881(1992))。

如本文所用，术语“评估”包括定量和定性确定测试溶液中存在的高半胱氨酸 和/或胱硫醚的量。如本文所用，“溶液”或“测试溶液”指临床或生物液体样品 或组织提取物，可包括例如血液、血液衍生物如血浆、或尿等。

酶CBS存在时，含高半胱氨酸的样品与L-丝氨酸反应以形成胱硫醚。胱硫醚 然后可用第2种酶CBL转变成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。同时用这些合成代谢和 分解代谢酶操作的结果是“无效循环”，其中(1)胱硫醚和高半胱氨酸连续互变， (2)丝氨酸被降解以及(3)产生丙酮酸和氨。

与高半胱氨酸相比，使用相对高浓度的丝氨酸提供有助于总反应速度的条件， 总反应速度遵循准一级动力学，直接取决于反应中高半胱氨酸和胱硫醚的量。如 果胱硫醚浓度与高半胱氨酸浓度相比低许多，总反应速度会随着高半胱氨酸量而 线性变化。通过测量丝氨酸减少或者丙酮酸或氨的增加，未知溶液或样品中高半 胱氨酸的量可通过与对照反应进行相同酶反应比较来确定，对照反应包括已知浓 度的高半胱氨酸。本发明的酶促循环方法提供扩增过程，产生的最终产物量远大 于测试溶液即血液中可能的高半胱氨酸量。因此，确定反应产生的丙酮酸或氨量 的测定不必须很敏感且可通过技术人员已知的现有方法测量。

丙酮酸通常通过酶转变成乳酸来测量，用乳酸脱氢酶或其衍生物。此酶促转变 反应需要辅因子NADH(还原的烟酰胺辅因子)或其衍生物，NADH转变为NAD+(氧 化的烟酰胺辅因子)。通过测量340nm的吸光度可监控反应。如本文所用，关于辅 因子的术语“衍生物”指盐、溶剂化物和其它化学修饰形式，这些形式保持整体 辅因子活性，但在水溶液中稳定性扩展。衍生物可包括但不限于NADH的乙酰衍生 物，包括3-吡啶醛-NADH、3-乙酰吡啶-NADH、3-硫代烟酰胺-NADH等(参见例如 美国专利5,801,006)。

其它确定NADH或其衍生物氧化的简便测定包括例如荧光测量，如Passoneau 等.，《酶促分析，实践指南》(Enzymatic Analysis，A Practical Guide)，219-222 页(1993)所述(纳入本文供参考)。在另一个实施方案中，NADH或其衍生物在乳酸 脱氢酶存在时与丙酮酸反应以形成NAD+，氧化时NAD+进一步与能产生颜色变化的 染料反应，优选在可见范围。染料的颜色变化可用于确定NADH氧化成NAD+的总量， 与酶促循环反应形成的丙酮酸量相符合。可用于本发明的染料例子包括但不限于 5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、 甲基紫精或各自的衍生物。

丙酮酸也可在用丙酮酸氧化酶或其衍生物的反应中测量，存在过氧化物酶即辣 奶过氧化物酶等。例如通过氧化缩合水溶性氢供体确定转变成过氧化氢的丙酮酸 量，此供体提供有色化合物用于光度测定过氧化物浓度。特别优选的氢供体提供 稳定的颜色反应产物，包括N-烷基-N-磺丙基苯胺衍生物的水溶性衍生物，即N- 乙基-N-(2-羟基3-磺丙基)-m-甲苯胺(TOOS)的钠盐(Tamaoku等.，Chem.Pharm. Bull.30：2492-2497(1982))。H2O2的量也可电势测量。这包括安培计和电位计 测量。测定高半胱氨酸和/或胱硫醚的量由过氧化物量的相关性确定，过氧化物通 过丙酮酸氧化酶在规定时间段从丙酮酸转化产生。

氨也可用不同方法测量，包括使用氨传感器(Willems等.，Clih.Chem.34：2372 (1988)。氨也可用已知比色技术检测。例如，样品中产生的氨能反应形成有色产 物，形成可分光光度检测的产物。纳入本文供参考的《酶促分析方法》(Methods of Enzymatic Analysis)(Bergmeyer)1：1049-1056(1970)所述方法取决于次氯酸盐 存在时氨与苯酚在碱性条件反应形成有色染料靛酚。硝普钠可用作催化剂。也可 使用修改的方法，例如使用多种衍生物。有色最终产物形成的量与氨浓度成正比， 因而与高半胱氨酸成正比。其它方法可包括例如微扩散分析(Seligson等.， J.Lab.Clin.Med.，.49：962-974(1957)、阴离子交换技术(Forman，Clin.Chem. 10：497-508(1964)和多种酶方法(参见例如Mondzac等.，J.Lab.Clin.Med.，. 66：526-531(1979))。

评估高半胱氨酸和/或胱硫醚量的酶促循环方法减少其它先前测定法中的困 难，其中背景化合物和背景反应产生“噪音”。在本发明测定中，可加入大量廉价 氨基酸如L-丝氨酸以使L-丝氨酸全转变成丙酮酸和氨。在较佳实施方案中，可使 用250μM或更高的丝氨酸浓度，随后转变成丙酮酸和氨。血浆通常含约100μM 丝氨酸。此内源丝氨酸的量对于本测定不重要，因为该测定测量转变的速度受高 半胱氨酸量的限制而不是丝氨酸量的限制。不预期约0.1mM到10mM的L-丝氨酸浓 度影响所示测定的敏感性或精确性。

此外，本发明酶促循环方法提供的L-丝氨酸转化的速度取决于准一级反应中 的高半胱氨酸浓度。正常血液丙酮酸水平通常在约0.4和2.5mg/100ml间 (Lehniger，AL.《生化原理》(Principles of Biochemistry).1982.Worthington Publishers，Inc.707页，纳入本文供参考)，与约45-284μM相符合。此丙酮酸浓 度可提供较小背景测量，但本测定测量随着时间的变化并能方便调节用于溶液中 起始水平的丙酮酸。另外，丙酮酸可在乳酸脱氢酶或其它酶温育前去除。更重要 的是，半胱氨酸和其它携带硫的化合物如血液不显著有助于酶促循环反应，因此 被认为是系统中不重要的嘈音。

在本发明的另一个实施方案中，可处理样品以去除胱硫醚提高高半胱氨酸测量 的精确性。作为一个特定例子，处理包括胱硫醚γ-裂合酶接触溶液使胱硫醚转变 成α-酮戊二酸(不参与上述酶促循环的化合物)。进行酶促循环测定以评估高半 胱氨酸量前，胱硫醚γ-裂合酶必须从样品中去除或破坏，即通过热等。

发明的此特定实施方案也可用于评估胱硫醚的量，通过在进行酶促循环测定前 比较胱硫醚γ-裂合酶处理和未处理样品中丙酮酸和/或氨的产生速度的差异。因 此，本发明可用于确定未知样品中胱硫醚的量，即使样品包含高半胱氨酸。

在一些生物样品如血液中，高半胱氨酸通常经二硫键结合蛋白质、硫醇和其它 细胞成分。一般，处理样品可用还原剂如硼氢化钠或硼氢化钾；硫醇如二硫赤藓 糖醇、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、巯基乙酸或谷胱甘肽；或者磷化氢或三烷基磷 化氢如三丁基磷化氢和tris(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)等，以释放结合和二硫键连接 的高半胱氨酸。先前测定法需要抗体用于检测步骤，必须改变反应混合物的氧化 还原条件(大部分抗体用二硫键结合)。然而，本方法中不需要洗涤或改变氧化还 原条件，因为所用CBS和CBL在还原条件下具有活性。因此，本发明测定所需步 骤少于许多现有技术的免疫测定。

在一个典型实施方案中，样品包括血液、血液部分、血清、血浆或尿，用还原 剂处理且直接测定高半胱氨酸。也优选在测定前加热样品，用于加速释放高半胱 氨酸并使降解酶和其它可干扰测定的因子失活。用于高半胱氨酸测定的血液样品 的一般处理对于其它方法领域的技术人员已知，其它方法如HPLC测试。

CBS和CBL是自然界中常见的酶。人和酵母使用CBS合成甲硫氨酸；CBS的人 cDNA可取代啤酒酵母中的CBS基因(Kruger等.，Hum.Molec.Genet.，4：1155-1161 (1995))。CBL在许多细菌中发现，包括大肠杆菌(Laber等.，FEBS Lett.，379：94-96 (1996)。CBS和CBL基因的完整DNA序列在这些生物体和其它种类中已知，为给熟 练的分子生物学家提供了易克隆或合成这些基因或其衍生物的来源。

如本文所用，关于酶的“衍生物”指通过氨基酸加入、缺失、取代和/或修饰 产生的突变体；通过重组和/或DNA改组产生的突变体；盐、溶剂化物和酶的其它 化学修饰形式，修饰形式保持分离的天然酶的酶活性。通过DNA改组产生用于本 发明的衍生酶的方法描述于美国专利5,605,793(纳入本文供参考)。即使没有克 隆，两种酶从一些不同生物体中纯化。参见例如Ono等.，Yeast.，10：333- 339(1994)；Dwivedi等.，Biochemistry 21：3064-3069(1982)，纳入本文供参考。 在本发明的一个较佳实施方案中，提供遗传修饰的生物体以产生CBS或其衍生物 和产生CBL或其衍生物，它们可用于酶促循环测定以提供成本降低的试剂且纯化 酶更容易。

类似地，关于核苷酸序列的术语“衍生物”指通过核苷酸加入、缺失、取代和 /或修饰和/或组合化学产生的变体和突变体；通过重组和/或DNA改组产生的突变 体；盐、溶剂化物和序列的其它化学修饰形式，修饰形式保持所需序列的活性如 MetR的结合特性。当使用修饰的衍生序列时，序列优选与原始序列有至少约60％ 的序列同一性。此同一性更优选为至少约70％，更加优选为至少约85％。这些序列 最优选与原始序列有至少约95％的序列同一性。

CBS基因和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的完整基因组已被测序。 同样，CBL基因和大肠杆菌的剩余基因也已知。因此，使用分子生物领域的普通技 术，编码CBS和CBL的基因可在两种生物体中克隆和表达。已知纯化两种酶的发 表方法，使用标准蛋白质纯化方法。然而各酶可构建作为融合蛋白，包括例如协 助活性酶溶解和/或重折叠的另一种蛋白质部分或可加入协助纯化的氨基酸序列。 加入用于纯化的氨基酸序列例子包括亲和标记如聚-His，或可加入谷胱甘肽-S-转 移酶(GST)以在单个亲和柱上更迅速纯化蛋白质。尽管酶不需要纯化均匀用于本 发明的诊断测试，蛋白酶和其它使丝氨酸转变成丙酮酸的活性可通过纯化降低到 不重要水平。

此外，酶浓度一般在反应期间和长期保存时产生稳定性较高的酶活性。CBS和 CBL来自除了酿酒酵母和大肠杆菌外的生物体，特别是嗜热生物，预期是具更高稳 定性的酶来源。也可选择与高半胱氨酸亲和性较高的分离酶。另外，酵母CBS和 细菌CBL的蛋白质工程可产生商业性质改进的酶，包括较高亲和性、较快反应速 度、较易纯化和保存时较长的半衰期。

类似地，胱硫醚γ-裂合酶(CGL)在许多种类中详细描述(参见例如Yamagata 等.，J.Bacteriol.，175：4800-4808(1993)，纳入本文供参考)。操作编码CGL的 基因可通过标准重组方法进一步遗传修饰并插入宿主细胞以开发较高水平的生产 菌株。

重组表达CBS、CBL和CGL基因是典型的。这些方法可提供大量纯化酶且基因 可被修饰，例如加入特定肽序列(亲和标记)以表达能用于亲和纯化的酶。通过 在重组酶表达中使用亲和标记，可大大简化这些酶的纯化和固定，降低成本。亲 和标记在本领域已知，包括但不限于如聚-组氨酸、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、 p-标记、“标志”、c-myc序列等。标记广泛用于亲和纯化重组表达的蛋白质，许多 可商业购买。

在一个较佳实施方案中，CBS和CBL固定于固体表面，以维持酶活性和保持高 半胱氨酸不直接与蛋白质相互作用的方式。通过高密度固定酶，不同蛋白质间的 扩散距离相对溶液中的酶减少。结果，测定的总反应速度大大增加，因为一种酶 的产物与另一种酶反应且反之亦然。加速反应速度是由于中间物浓度的局部提高， 固定使中间物与下一个酶更接近。增加高半胱氨酸测定速度可以是诊断产品市场 性的重要因素，因为CBS和CBL的Km在毫摩尔范围中，但高半胱氨酸的血液浓度 约为10μM。已知扩散-限制反应需要高浓度的酶以提供快速的反应速度。在循环 测定中固定酶克服这两种酶对它们各自底物低亲和性可能产生的困难。

在另一个较佳实施方案中，CBS和CBL固定作为融合蛋白。两种不同蛋白质彼 此的距离和方向可在融合基因表达载体的构建中控制。通过使两种活性适当位于 融合蛋白中，高半胱氨酸和胱硫醚互变能在蛋白质内很迅速发生，因为扩散距离 可在两个活性中心间最小化。因此，高半胱氨酸在整体酶促循环反应中表现像辅 因子，从L-丝氨酸产生丙酮酸和氨。

本发明的酶促循环测定可以一些测定模式提供。最简单的测定模式提供的试剂 溶液包括L-丝氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、最优化酶反应所需的多种 缓冲液和辅助物质。在本发明的一个特别较佳实施方案中，CBS或其衍生物、CBL 或其衍生物固定于固体表面。

酶固定于固体表面同时保持大体上所有酶活性在本领域熟知。用于固定的一些 方法包括共价结合、物理吸收、截留和电化学沉积。作为一个例子，戊二醛用于 固定肌酸酐脱氨酶和谷氨酸氧化酶到丙胺衍生控制的孔玻璃珠(Rui等.，Ann.NY Acad.Sci.，672：264-271(1992))。其它例子包括但不限于用碳二亚胺使酶共价附 于琥珀酸衍生玻璃珠(Rui等.，同上)、用异或同-双功能交联试剂(如SPDP、N- 琥珀酰亚胺基3-(2-二硫代吡啶)丙酸盐；SMPT、琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α -(2-二硫代吡啶)-甲苯；DSP、二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸盐) (succinimidylpropionate)；DTSSP、3，3’-二硫双(磺基-琥珀酰亚胺基丙酸盐)； DSS、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯等)使酶通过例如氨或巯基共价附于衍生固体表面 (Wilson等.，Biosens.Bioe lectro.，11：805-810(1996))。

如本文所用，“固体表面”可包括多孔或非多孔水不溶性物质，能具有任何形 状如条、杆状颗粒，包括珠等。合适材料在本领域熟知且可包括例如纸、滤纸、 尼龙、玻璃、陶瓷、硅石、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、 聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和它们各自的衍生物。固体表面可以是测试容器的 侧面和底部或可以是加入测试容器的物质。在一个较佳实施方案中，固体表面包 括加入测试容器的珠。

酵母和细菌都具有将L-丝氨酸转变成丙酮酸的酶，活性有时称为丝氨酸脱氨 酶或丝氨酸脱水酶。很好确立的突变方法可用于大幅降低或除去这些活性，活性 可显著地产生高半胱氨酸测定中的背景。尤其是可遗传操作酿酒酵母以去除丝氨 酸脱氨酶活性，此活性对于(1)异亮氨酸合成和(2)以丝氨酸作为碳或氮源生 长是必需的，使用称为“基因破坏”的简单方法。通过缺失酵母chal基因去除主 要的丝氨酸脱氨酶活性，从而去除循环测定的一个潜在背景问题。此外，chal缺 失可用于选择CBS-CBL融合蛋白并用于遗传改造这些融合蛋白。chal缺失菌株不 能以丝氨酸作为唯一碳或氮源生长。CBS-CBL融合基因能互补缺失，只要有高半胱 氨酸作为“辅因子”，因为循环系统产生的最终结果与丝氨酸脱氨酶相同。因此， chal缺失可用于选择和维持改进的CBS-CBL融合，特别是如果融合基因群被突变 并置于单拷贝载体或酵母染色体上。在丝氨酸培养基上生长较快或高半胱氨酸需 求减少的细胞可包含的突变编码较快速酶或对高半胱氨酸和胱硫醚亲和性较高的 蛋白质。

本发明也提供另外方法评估样品中高半胱氨酸的量，使用代谢物结合转录因 子。当代谢物结合转录因子结合它们各自的代谢物时，因子复合体结合特异受体 多核苷酸序列。可监控转录因子复合体结合其受体共有序列并与样品中存在的代 谢物量相关。

本领域已知的一些转录因子与小分子或代谢物相联时，结合特异DNA结合位 置。例如，大肠杆菌有操纵子调节元件，转录因子MetR调节响应于结合高半胱氨 酸的Met操纵子(Cai等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，163：79-83(1989))。 MetR或其衍生物调节基因如MetE(不依赖cobolamin的甲硫氨酸合酶)、MetH(依 赖cobolamin的甲硫氨酸合酶)和GlyA(丝氨酸氢化酶)。MetR和其衍生物优选 在高半胱氨酸存在时结合其共有DNA序列且缺乏高半胱氨酸时不存在于细胞胞质 中。高半胱氨酸存在时结合MetR可用于评估怀疑含高半胱氨酸的样品中高半胱氨 酸的量。

在发明的一个特定实施方案中，测定包括多核苷酸序列编码固定于固体支持物 的MetR受体多核苷酸的共有序列，固定的方式能接近共有受体序列以结合MetR。

核苷酸可以是例如：

GTTAATGTTGAACAAATCTCATGTTGCGTG(SEQ ID NO：11)

处理样品如血浆、血液或尿以在样品混合试剂溶液前释放任何结合蛋白质的高 半胱氨酸，溶液包括缓冲剂中的MetR，存在固定共有受体序列时，在有助于形成 复合体的条件下。温育阶段后，洗涤固体支持物以去除未结合试剂且评估保持结 合固体支持物的MetR量。确定保持结合固体表面的MetR量通常可以是ELISA、表 面胞质基因组共振即BIACORE或简单的标准蛋白质测定，此量与样品中存在的高 半胱氨酸量相关。

处理样品以释放高半胱氨酸可用还原剂完成。上述一些试剂在本领域熟知。通 常样品混合含足够量还原剂的缓冲溶液以从样品中存在的任何相关蛋白质中释放 大体上所有高半胱氨酸。普遍使用的还原剂包括但不限于硼氢化钠和硼氢化钾、 β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、巯基乙酸或谷胱甘肽；或者膦或三烷 基膦，如三丁基膦和tris(2-羧乙基)膦(TCEP)等。

也可修饰MetR蛋白质以掺合可检测标记，如生色团、荧光团等，以改进测定 的速度和敏感性。加入可检测标记能减少进行测定所需时间段，这是通过去除一 些样品处理步骤，例如另外的洗涤步骤。掺合的荧光团发出波长被寡核苷酸吸收 到共有结合序列的光，能测量荧光能量转移以定量蛋白与共有序列的结合。可用 于测量荧光转移的方法包括例如荧光共振能量转移(FRET)或邻近闪烁测定。通 过在结合结构域中加入另外可检测标记对MetR结合共有序列另外修饰也可改进测 定的特异性。

此外，确定肽序列(亲和标记)可加入MetR蛋白质以协助纯化和检测。亲和 标记在本领域已知且包括但不限于例如聚-组氨酸、strep-标记、“标志”、c-myc 序列等。标记广泛用于亲和纯化重组表达的蛋白质，许多可商业购买。另外，改 进重组表达MetR的结合亲和性的突变改变可用于提供其它的测定试剂。

在本发明的一个单独实施方案中，样品中高半胱氨酸的量可通过样品中高半胱 氨酸的酶利用来确定。细胞代谢中高半胱氨酸转化通常从高半胱氨酸的巯基残基 中释放质子。释放此质子用于测量高半胱氨酸对大肠杆菌cobolamin依赖的甲硫 氨酸合酶的结合亲和性(Jerret等.，Biochemistry，36：15739-15748(1997))。蛋 白质如甲硫氨酸合酶催化的酶反应一般需要辅因子或另外的底物已完成反应。如 果这些辅因子和底物不存在，高半胱氨酸仍结合酶。在本方法中，测量释放的质 子去除酶反应释放的质子，推动反应趋向消耗样品中存在的高半胱氨酸。测量与 释放质子相关的pH变化确定样品中高半胱氨酸的量。例如在一个较佳实施方案中， 不依赖cobolamin的甲硫氨酸合酶可用于测定。

为方便起见，本发明所用试剂可在用于测定方法的测试试剂盒中提供。典型试 剂盒包括容纳测试溶液的小型组合容器、L-丝氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍 生物、最佳反应条件所需的辅助缓冲液和物质。重要的是，多种防腐剂和/或稳定 剂也能包括在任何/所有试剂盒试剂和/或酶中以延长半衰期以及样品测定的“联 机”寿命。试剂盒可进一步包括还原剂或CGL以在循环测定前预处理样品。此外， 试剂盒可包括乳酸脱氢酶、NADH和氧化时能观察到颜色改变的染料。

在合适情况下，试剂盒中一种或多种试剂可在溶液中提供(有或没有防腐剂和 /或稳定剂)或作为干粉，通常冻干，包括赋形剂、防腐剂和/或稳定剂，溶解时 可提供具合适浓度的试剂溶液以根据本发明进行测定。为提高发明的多功能性， 试剂可在相同或不同容器中以小型组合提供，从而提供显著最优化方法和测定的 试剂比例。试剂可各自在不同容器中或多种试剂能在一个或多个容器中结合，这 取决于试剂的稳定性。为方便起见，本发明测定方法所用试剂可以预定量提供。 测试试剂盒也能包含书面说明，指导如何使用试剂和/或如何进行特定测定，例如 以包装插入物形式。

提供以下例子用于阐述，而不用于限制。

                               实施例1

               大肠杆菌胱硫醚β-裂合酶基因的克隆和表达

在此例子中，使用标准PCR过程克隆大肠杆菌CBL基因。分离基因插入具亲和 标记序列(6HIS)的表达载体中，表达蛋白用亲和柱纯化。宿主细胞中大量CBL 酶活性用表达载体构建物转化，从细胞裂解物中纯化。

大肠杆菌胱硫醚β-裂合酶(CBL，EC 4.4.1.8)基因的克隆

标准PCR过程使用扩展高保真PCR系统(Roche Biochemicals)，用于扩增大 肠杆菌CBL基因，用ONE SHOT TOP10感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)作为基 因组DNA来源。用于CBL克隆的PCR引物序列如下：(CBL N-末端引物：5’- CGACGGATCCGATGGCGGACAAAAAGCTTG-3’；SEQ ID NO：1)和(CBL C-末端引物：5’- CGCAGCAGCTGTTATACAATTCGCGCAAA-3’；SEQ ID NO：2)。PCR扩增的CBL基因产物然 后通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用BamHI和PvuII限制性内切酶消化，再次通过琼 脂糖凝胶电泳纯化。然后纯化的大肠杆菌CBL基因连接入凝胶纯化、BamHI/PvuII 消化的pRSETB蛋白质表达载体(Invitrogen)。所得构建物提供T7转录启动子控 制下的CBL基因，与氨基末端6个组氨酸(6HIS)残基前导序列(后称为6HISCBL) 框内克隆，可方便表达、亲和纯化和免疫染色分析来自大肠杆菌细胞的重组 6HISCBL蛋白。列出大肠杆菌胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因的DNA序列(SEQ ID NO：21)。也列出克隆的大肠杆菌胱硫醚β-裂合酶(CBL)蛋白质序列(SEQ ID NO：19)，它具有氨基-(NH3)-末端6个组氨酸(6HIS)亲和标记，由CBL基因克隆 入pRSETB细菌表达质粒产生。

胱硫醚β-裂合酶蛋白表达和纯化

pRSETB(6HISCBL)质粒构建物转化入BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌株 (Invitrogen)，在LB/琼脂平板上涂布，平板含(100μg/ml氨苄青霉素、35μg/ml 氯霉素)，然后37℃培养过夜。然后转移单细菌菌落并在含100ml LB生长培养基 的烧瓶中生长过夜，培养基含氨苄青霉素和氯霉素。然后100ml过夜培养物加入 多个含1L新鲜LB生长培养基的烧瓶，培养基含氨苄青霉素，使培养物生长直到 A600为0.6(约2.5小时)。为诱导CBL蛋白表达(由T7启动子驱动)，异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)然后加入生长培养基至0.1到1mM终浓度。CBL酶辅因 子吡哆醛5’-磷酸(PLP)也在诱导中加入生长培养基至100μM终浓度。监控细胞 生长和6HISCBL蛋白表达5小时后，大肠杆菌细胞通过离心收集、重悬浮、在无 EDTA的完整蛋白酶抑制剂(Roche Biochemicals)存在时加入BUGBUSTER蛋白质 提取试剂(Novagen Inc.)来裂解，如厂商规程所述。然后细胞裂解物用DNase I 处理，通过离心澄清并上样到亲和柱，柱含聚-His蛋白质纯化树脂(Roche Biochemicals)。然后柱用10床体积的平衡缓冲液(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl) 洗涤，接着用5床体积的洗脱缓冲液1(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、10mM咪唑； EB1)、5床体积的洗脱缓冲液2(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、50mM咪唑；EB2) 和5床体积的洗脱缓冲液3(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、500mM咪唑；EB3)洗 脱。然后纯化过程各步骤中所取样品通过变性蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并 用考马斯亮蓝染色或用缀合小鼠免疫球蛋白的单克隆抗聚组氨酸过氧化物酶进行 蛋白质印迹分析检测，如厂商所述(Sigma)。

发现纯化6HISCBL蛋白主要在洗脱缓冲液2和3(EB2和EB3)中洗脱。含CBL 的洗脱物然后用离心过滤室(Amicon)浓缩且在4℃对贮存缓冲液(50mM TrisHCl，pH8、100mM NaCl、5mM PLP)透析过夜，等分并在-80℃冷冻保存。然 后纯化均一的CBL酶浓度在280nm消光系数和43，312 Da亚基重量的基础上计算 (Clausen等.Biochem.36：12633-42(1997))。纯化6HISCBL的典型产量在20-30mg 6HISCBL每克大肠杆菌细胞团范围中。

CBL活性测定

从pRSETB(6HISCBL)质粒构建物表达的亲和纯化重组6HisCBL蛋白的CBL活 性如前所述进行(Clausen等.Biochem.36：12633-42(1997)，纳入本文供参考)。 简单地，测定混合物在1mL的终反应体积中含100mM Tris/HCl(pH8.5)、5mM L- 胱硫醚、1mM 5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DNTB；Ellman试剂)和6HisCBL酶。 反应后记录412nm吸光度随着时间的增加。相同酶反应也在具已知底物浓度的样 品上进行以产生标准曲线。完整细胞裂解物中检测到的大体上所有CBL活性被恢 复并发现存在于重组6HisCBL酶的实验纯化样品中，酶产生自pRSETB(6HisCBL) 质粒构建物。

                            实施例2

          酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因在酵母中的克隆和表达

在此例子中，PCR方法用于从酵母中克隆CBS基因。含CBS基因的PCR片段插 入有和没有亲和标记的表达载体，标记加入有助于表达基因产物的纯化。

酿酒酵母的实验室菌株(5153-11-1(his3 met2))用作CBS基因来源。细胞在 YEPD上32℃生长，离心，用水洗涤并转移到200μl酵母质粒缓冲液(100mM NaCl、 10mM Tris(pH8)、1mM EDTA、0.2％SDS)中。细胞悬浮液与等体积的0.45mm玻 璃珠混合并以高速涡旋3×30秒。液体通过移液管除去且在microfuge中离心2分 钟以去除细胞碎片。上清用PCI(酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿提取。加入氯化 钠(5M)(约20μl)，DNA用等体积异丙醇沉淀。

此基因组酵母DNA通过PCR用引物CI-001(CGGGGATCCTGATGCATGCAT GATAAGGA；SEQ ID NO：3)和CI-012(CGGCATTACCGTTTCACTAATTTATTG； SEQ ID NO：4)扩增，引物是发表的酵母CBS结构基因侧翼核苷酸序列。引物CI-001 (SEQ ID NO：3)包含在CBS基因的非翻译3’侧上发现的BamHI位点。为将BamHI 序列加入PCR片段的5’侧，基因进一步通过PCR用CI-001(SEQ ID NO：3)和 CI-002(GTTGGATCCGGCATTA CCGTTTCAC；SEQ ID NO：5)扩增。所得PCR 产物是约1937个碱基对的DNA序列，包括1512个编码CBS蛋白的碱基对。在 编码序列侧翼的另外DNA包括酵母CBS基因的天然启动子和转录终止序列。

一个强启动子插入CBS基因上游以促进蛋白质高水平表达。酵母TPI1启动子 在标准PCR反应中从相同基因组酵母DNA克隆，使用引物CI-009 (GGTGGATCCATCAATAGATACGTA CGTCCT；SEQ ID NO：6)和CI-010 (TTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG；SEQ ID NO：7)。为使CBS编码区附于 TPI1启动子，使用衔接引物：CI-011(AACACATACATAAACTAAAAATGAC TAAATCTGAGCAGCAA；SEQ ID NO：8)，它包含TPI1启动子的20个碱基和CBS 基因的前21个碱基。上面获得的CBS序列通过PCR用引物CI-001(SEQ ID NO：3) 和CI-011(SEQ IDNO：8)扩增。所得PCR产物与来自上面的TPI1启动子产物混 合，混合物通过PCR用引物CI-001(SEQ ID NO：3)和CI-009(SEQ ID NO：6) 扩增以产生命名为“TPICBS”的融合基因，基因包括TPI1启动子、CBS编码序 列和CBS转录终止子。

CBS和TPICBS PCR产物各自在编码区的5’和3’侧包括BamHI位点。这些PCR 产物用PCR WIZARD PREP(Promega)根据厂商建议纯化，用BamHI切割。所 得BamHI核苷酸片段在1％琼脂糖TBE凝胶上跑并用NA45纸(S&S)纯化。酵 母、大肠杆菌穿梭载体C1-1在四环素抗性基因中具有独特BamHI位点，用于表 达CBS基因。C1-1载体用BamHI切割并根据厂商说明(Roche Biochemicals)用 虾碱性磷酸酶处理。CBS和TPICBS BamHI片段连接入线性化C1-1载体。连接反 应转化到TOP10细胞(Invitrogen)中，细胞在LB氨苄青霉素板上平板培养。抗 氨苄青霉素的转化子转移到LB amp和LB tet平板以确定四环素敏感克隆。从LB amp平板选择一些tet-敏感菌落，在LB amp平板上生长过夜，通过质粒DNA的碱 裂解法进一步加工。DNA用BamHI切割并在1％琼脂糖胶上分离以确定哪个质粒 含CBS或TPICBS插入物。

携带插入物的C1-1质粒转化到酵母菌株INVSc-1中，它是可从Invitrogen公司 购买的二倍体菌株。INVSc-1在LEU2基因的2个拷贝中都有突变且需要来自C1-1 质粒的LEU2基因以在无亮氨酸的培养基上选择性生长。INVSc-1用C1-1相关质 粒转化，根据厂商说明使用Invitrogen的酵母转化试剂盒。此试剂盒包括用消解酶 产生细胞的原生质球，接着钙处理用于DNA转化。转化子在合成培养基上平板培 养，培养基含1M山梨糖醇、酵母氮基础组分和酵母补充物，除了亮氨酸。32℃ 培养3天后，转化子在覆盖琼脂中可见。

聚-组氨酸附于胱硫醚β-合酶用于酵母表达

编码6个组氨酸的DNA序列在CBS和TPICBS载体构建物中加入CBS编码区 的3’末端。通过用引物CI-017(ATGATGATGATGATGATGACCTGCT AAGTAGCT CAGTAA；SEQ ID NO：9)扩增来自上面的CBS PCR片段，聚组氨酸的编码序列 加入原始CBS克隆。所得PCR产物包括天然CBS启动子区、CBS编码区以及进 一步的甘氨酸和6个组氨酸残基编码序列。加入甘氨酸残基以增加翻译后聚-his 肽的空间灵活性。聚-his CBS PCR产物从原始CBS DNA胶纯化，其后用引物CI- 002(SEQ ID NO：5)和CI-017(SEQ ID NO：9)连续2次PCR扩增以实际上去除 原始CBS DNA。

类似地，来自上面的TPICBS PCR产物用引物CI-009(SEQ ID NO：6)和CI- 017(SEQ ID NO：9)扩增。PCR产物是凝胶纯化，并用CI-009(SEQ ID NO：6) 和CI-017(SEQ ID NO：9)重扩增2次以大幅减少输入TPICBS DNA序列。

CBS基因也通过PCR用引物CI-001(SEQ ID NO：3)和CI-018 (CATCATCATCATCATCATTAAATAAGAACCCACGCT；SEQ ID NO：10)扩增以 产生具TAA终止密码子的聚-组氨酸序列，接着是转录终止序列。此约190bp的短 PCR产物(“终止子”)也是凝胶纯化并通过PCR用相同引物克隆。聚-his CBS和 “终止子”片断结合在一个PCR反应中，使用引物CI-001(SEQ ID NO：3)和CI-002 (SEQ ID NO：5)。所得扩增产生名为“CBSH”的核酸分子，包括天然CBS启动 子、完整CBS编码区、一个另外的甘氨酸残基、具终止密码子的6个组氨酰残基 以及CBS转录终止子。

同样，聚-his TPICBS和终止子片断结合在一个PCR反应中，使用引物CI-001 (SEQ ID NO：3)和CI-009(SEQ ID NO：6)。所得名为“TPICBSH”的核酸产物 与CBSH序列相同，除了TPI1启动子取代天然CBS启动子。CBSH和TPICBSH (各包含聚-组氨酸亲和标记序列)用BamHI切割并连接入C1-1，如以上适合于 CBS和TPICBS序列。连接混合物转化入INVSc-1。Tet-敏感菌落通过限制性酶分 析检测适当的克隆基因插入C1-1中。

                                实施例3

          酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

在此例子中，标准PCR和分子生物学技术用于克隆酿酒酵母(INVSc1)胱硫 醚β-合酶(CBS)基因作为具氨基-末端谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。 加入此谷胱甘肽-S-转移酶区域可从大肠杆菌培养基中单步亲和纯化CBS蛋白， 也能协助活性形式酶的溶解和/或促进适当重折叠。

克隆

酿酒酵母的实验室菌株(INVSc1)(Invitrogen)用作CBS基因来源。INVSc1 酵母单菌落在100μl去离子水中煮沸5分钟，在等体积0.45mm玻璃珠存在时迅 速涡旋2分钟。1微升此细胞裂解物然后用作酵母CBS基因的PCR扩增的DNA来源， 使用引物CI-024(GCGGGTCGACTATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCC；SEQ ID NO：12)和CI-025(GCGTGCGGCCGCGTTATGCTAAGTAGCTCAG；SEQ ID NO：13)，引物包含发表CBS基因的侧翼序列和克隆到pGEX-6P-2(Amersham Pharmacia)表达载体的限制性位点。所得PCR产物(约1548bp)然后通过琼脂糖 凝胶分离和纯化，DNA提取用商业试剂盒(Roche)。纯化PCR产物所含CBS基因侧 翼有SalI(5’末端)和NotI(3’末端)限制性酶位点，然后被消化(通过SalI和 NotI)、凝胶纯化、连接入pGEX-6P-2表达载体(Amersham Pharmacia)。限制性 酶图谱用于确认PCR扩增的DNA作为酵母CBS基因的同一性。描述了克隆酿酒酵 母胱硫醚β-合酶(CBS)基因的DNA序列(SEQ ID NO：14)。也描述了克隆酿酒酵 母CBS的蛋白质序列(SEQ IDNO：20)，此序列由于克隆到细菌表达载体pGEX-6P-2 的结果附着具有氨基-(NH3)-GST融合蛋白。

表达和纯化

含克隆酵母CBS基因的pGEX6P-2表达载体(如上所述)转化到TOP10大肠杆 菌细胞(Invitrogen)中。挑出单菌落且细胞培养物在含100μg/ml氨苄青霉素的 LB培养基中30EC生长直到600nm吸光度达到约0.5 OD。为诱导GST-CBS融合 蛋白表达(由tac启动子驱动)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入生长培 养基至0.1mM终浓度。CBS酶辅因子吡哆醛5’-磷酸也在诱导中加入生长培养基至 100μM终浓度。然后诱导细胞在30℃生长另外21小时，接着离心收集。

然后如厂商(Amersham Pharmacia)规程所述，用谷胱甘肽琼脂糖4B亲和树 脂亲和纯化GST-CBS蛋白。简单地，细胞悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)并在冰上由 超声波破坏。然后TritonX-100加至0.1％的终浓度(v/v)，超声处理物在室温摇 30-45分钟。细胞裂解物然后通过离心清除不溶碎片，用DNase I处理，上样到谷 胱甘肽琼脂糖4B亲和树脂柱。非特异结合的蛋白质用10柱体积PBS洗去，然后 所需GST-CBS蛋白从亲和树脂洗脱，洗脱是通过加入5柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris，pH8、1.4mMβ-巯基乙醇(BME)、100mM NaCl、0.1％(v/v)TritonX-100、 50mM还原型谷胱甘肽)。纯化GST-CBS融合蛋白然后通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠，聚丙烯酰胺凝胶电泳)确认。然后洗脱的GST-CBS透析到贮 存缓冲液(50mM TrisHCl，pH8、100mM NaCl、5μM PLP)，等分并在-80℃冷冻 保存。然后纯化GST-CBS的浓度用MICRO BCA蛋白测定试剂盒(Pierce Chemical) 确定。纯化GST-CBS的典型产量在5-10mg GST-CBS每克大肠杆菌团范围中。

CBS活性测定

纯化酵母GST-CBS融合蛋白的CBS活性如Kashiwamata和Greenberg (Biomchem.Biophy.Acta 212：488-500(1970))所述进行。此测定以CBS从丝氨 酸和高半胱氨酸合成胱硫醚的能力为基础。然后分光光度确定CBS形成的胱硫醚 量，通过检测455nm的茚三酮反应色原并与标准曲线比较，标准曲线用已知胱硫 醚浓度的样品产生。CBS活性也通过下文所述酶测定或技术人员熟知的其它测定来 确定。

                              实施例4

                       ADH2CYS4融合构建物的构建

酵母胱硫醚β-合酶在酵母中的表达和纯化

在此例子中，强启动子ADH2插入CYS4基因上游且构建与酵母CBS基因的融合 以促进较高蛋白质表达。ADH2启动子由Adrlp调节，当酵母细胞在含葡萄糖的培 养基中生长时被抑制，当细胞在非发酵性碳源中生长时去抑制。如果超量产生蛋 白质对细胞致死，这可调节表达。

ADH2CYS4基因的构建

酵母基因组DNA用引物CI-029(CTATATCGTAATAATGACTAAATCTGAGCAG CAAGCCG ATTCA；SEQ ID NO：15)和CI-017(ATGATGATGATGATGATGAC CTCGTAAGTAGCTCAGTAA；SEQ ID NO：9)扩增以产生所有没有终止密码子和 转录终止子的CYS4基因。除了CYS4基因的前10个密码子，CI-029(SEQ ID NO：15) 引物包含克隆ADH2启动子区域的至少13个碱基。引物CI-017(SEQ IDNO：9)具有 CYS4基因最后6个密码子的序列，终止密码子加甘氨酰残基和6个组氨酰残基除外。 所得PCR产物包括CYS4编码区以及的甘氨酸和6个组氨酸残基的进一步编码序列。 加入甘氨酸以增加翻译后聚-his肽的空间灵活性。“终止子”片段通过扩增相同基因 组DNA产生，使用引物CI-018(CATCATCATCATCATCATAAAT 000 AAGAACCCACGCT；SEQ ID NO：10)和CI-040(AGGGCTCGAGGATCC CGGGGGTGCTATTATGAATGCACGG；SEQ ID NO：16)以产生具TAA终止密码子 的聚-组氨酸序列，接着是转录终止子。CI-029/CI-017 PCR反应产生约1530bp的片 段而CI-018/CI-040反应产生约331bp的片段。通过混合它们的PCR产物并用引物 CI-029/CI-040扩增连接这两个片段。所得产物命名为CYS4H且长度约1861bp。

为连接ADH2启动子到CYS4H基因片段，首先用引物CI-027 (CGGGGATCCGACGTTTTGCCCGCAGGCGGGAAACC，SEQ ID NO：17)和引物 CI-028(AGATTTAGTCATTATTACGATATAGTTAATAGTTGATAG；SEQ ID NO：18) 从相同酵母基因组DNA产生PCR产物，用于产生ADH2启动子序列。引物CI-028 (SEQ ID NO：18)包含CYS4基因编码区的前12个核苷酸。因此，在引物CI-028 (SEQ ID NO：18)和CI-029(SEQ ID NO：15)间有25个各自产物中互补DNA的 核苷酸。ADH2 PCR产物与CYS4H片段混合并用引物CI-027(SEQ ID NO：17) 和CI-040(SEQ ID NO：16)扩增，用于产生约2201bp的产物片段命名为 ADH2CYS4H。这些PCR产物各自通过限制性内切酶分析确认。

ADH2CYS4H产物克隆到YEp24，这是用BamHI切割DNA和用T4 DNA连接 酶连接。连接产物转化入大肠杆菌(TOP10；Invitrogen)细胞并在LB-琼脂加氨 苄青霉素板上平板培养。质粒根据厂商建议用质粒制备试剂盒(Roche)从推定重 组子中制备，通过限制性内切酶分析。发现具有正确插入的克隆质粒转化入酿酒 酵母(BJ5460)且在补充2％葡萄糖的无尿嘧啶合成完全培养基(SC-ura)上平板 培养。2天后推定重组子在相同类型平板上重划线培养以分离菌落。通过在SC-ura 加2％乙醇和1％蛋白胨中生长诱导细胞，通常补充0.1％葡萄糖以使细胞能在24小 时内生长。生长过夜后，细胞通过离心收集且细胞沉淀保存于-70℃直到裂解。通 过细胞沉淀重悬浮于0.05体积的裂解缓冲液原始体积来裂解细胞。玻璃珠然后加 入缓冲液的弯液面。

全部悬浮液涡旋1分钟，各4次。涡旋之间，细胞在冰上冷却1分钟。裂解物 转移到新管并以10,000xg离心10分钟。登清的裂解物在His-树脂柱(Roche) 上分层，根据厂商建议纯化蛋白质。部分纯化的蛋白质在3次洗脱中回收。

                              实施例5

                 高半胱氨酶测定模式的非循环部分的例子

在此例子中，证明丙酮酸和胱硫醚测定的非循环部分。

丙酮酸测定：

丙酮酸：本发明提供高半胱氨酸测量，其基础是用酶CBS和CBL使高半胱氨酸 循环产生丙酮酸和氨。预测丙酮酸和氨产生的速度与样品中原始高半胱氨酸浓度 成正比。用适当酶测量此速度提供均一高半胱氨酸方法的可能。

在发明的一方面，开发了丙酮酸定量的高度敏感方法。在此方法中，丙酮酸氧 化酶使丙酮酸转变成乙酰磷酸、二氧化碳和过氧化物。过氧化物酶随后使过氧化 物、TOOS和4-氨基安替比林转变成显示最大吸收接近550nm的色原。此色原的摩 尔吸收率很高，约36L mol-1cm-1。

使用表1所示试剂和表2所列Cobas FARA(Roche，Basel，Switzerland)仪器 参数，丙酮酸易通过早期-读数空白和终点反应在约5-10分钟内以μM范围测量。 含水校准物的吸光度相对时间图示于图1。实际校准曲线示于图2。     表1.丙酮酸方法：试剂成分     化学制剂     浓度     试剂1     HEPES，半钠盐     21.5mM     HEPES，酸     28.6mM     EDTA(4Na)     5.0mM     MgSO4.7H2O     49.8mM     K2HPO4，二元     7.5mM     TOOS     1.4mM     TTHA     0.8mM     TPP     0.2mM     4-氨基安替比林     1.0mM     BSA     1.9g/L     亚铁氰化钾     0.07mM     辣根过氧化物酶     3.0KU/L     丙酮酸氧化酶     3.0KU/L     PH＝7.0     表2.丙酮酸方法：Cobas FARA参数     参数     设置     综合     测量模式     ABS     反应模式     P-A     校准模式     SLOPE AVG     试剂空白     REAG/DIL     波长     550nm     温度     37℃     分析     样品体积     40μL     稀释体积     10μL     稀释名称     H2O     试剂体积     250μL     温育时间     60秒     起始试剂体积     无     稀释名称     H2O     稀释体积     无     温育时间     无     起始试剂2体积     无     稀释名称     H2O     稀释体积     无     温度延迟     无     吸光度读数     第一次     0.5秒     数量     14     间隔     30秒     计算     步骤数     1     计算步骤A     动态     首先     1     最后     14     校准     stds数     1     STD1     50μM     重复     2

胱硫醚测定：

通过CBL加入上述丙酮酸试剂来测量胱硫醚。CBL使胱硫醚转变成高半胱氨酸、 丙酮酸和氨。丙酮酸然后如上所述测量。用于测量胱硫醚的试剂组成示于表3。测 量可用任何合适仪器进行。在本例子中，使用Cobas FARA(Roche，Basel， Switzerland)。典型的反应参数示于表4。图3描述了吸光度相对时间图，用胱硫 醚水溶液获得。反应在少于10分钟内到达终点。     表3.胱硫醚方法：试剂成分     化学制剂     浓度     试剂1     HEPES，半钠盐     20.3mM     HEPES，酸     27.0mM     EDTA(4Na)     4.7mM     MgSO4.7H2O     47.1mM     K2HPO4，二元     7.1mM     TOOS     1.3mM     TTHA     0.8mM     TPP     0.2mM     4-氨基安替比林     0.9mM     BSA     1.8g/L     亚铁氰化钾     0.07mM     辣根过氧化物酶     2.8KU/L     丙酮酸氧化酶     2.8KU/L     CBL     1.9g/L     PH＝7.0     表4.胱硫醚方法：Cobas FARA参数     参数     设置     综合     测量模式     ABS     反应模式     P-A     校准模式     LIN INTER     试剂空白     REAG/DIL     波长     550nm     温度     37℃     分析     样品体积     30μL     稀释体积     10μL     稀释名称     H2O     试剂体积     260μL     温育时间     60秒     起始试剂体积     无     稀释名称     H2O     稀释体积     无     温育时间     无     起始试剂2体积     无     稀释名称     H2O     稀释体积     无     温度延迟     无     吸光度读数     第一次     0.5秒     数量     21     间隔     60秒     计算     步骤数     1     计算步骤A     终点     首先     1     最后     10     校准     stds数     1     STD1     50μM     重复     2

图4描述了用胱硫醚的水溶液获得的标准曲线。这些曲线至少在0-100μM的 胱硫醚浓度范围是线性的。形成的发色团稳定约15-20分钟。然而，如果测定的 样品的所含胱硫醚浓度高10-20倍，发色团明显有些不稳定。

在一些实验中，丝氨酸包括在反应混合物中。250μM水平的丝氨酸没有表现 出显著效果。；较高水平的丝氨酸也为本测定耐受。丝氨酸的非干扰性是一个重要 的观察，因为高半胱氨酸测定需要丝氨酸存在。

                           实施例6

                     高半胱氨酸的酶循环测定

在此例子中，提供确定高半胱氨酸浓度的酶循环系统，使用丙酮酸氧化酶/过 氧化物酶信号系统或乳酸脱氢酶信号系统。

循环的证明：CBS/CBL/PO/HRP酶循环系统

证明了循环系统，其中反应用高半胱氨酸或胱硫醚起始。这些实验中所用的试 剂成分示于表5。样品与试剂1混合后，单独加入CBS和丝氨酸，试剂1含所有其 它成分。相关Cobas FARA参数示于表6。胱硫醚或高半胱氨酸溶于水以制备适当 浓度的标准。时间相对吸光度图示于图5和6。在3到6分钟迟滞时间后，图为线 性。典型的高半胱氨酸校准曲线(图7)尽管不完全线性，可用于在合适样品中定 量高半胱氨酸浓度。使用合适曲线-配合技术。     表5.CBS/CBL循环，PO/HPR方法     试剂成分     化学制剂         浓度     试剂1     HEPES，半钠盐   20.3mM     HEPES，酸       27.0mM     EDTA(4Na)       4.7mM     MgSO4.7H2O     47.1mM     K2HPO4，二元  7.1mM     TOOS            1.3mM     TTHA            0.8mM     TPP             0.2mM     4-氨基安替比林  0.9mM     BSA             1.8g/L     亚铁氰化钾      0.07mM     辣根过氧化物酶  3.0KU/L     丙酮酸氧化酶    3.0KU/L     CBL     PH＝7.0     试剂SR1     丝氨酸    3.1mM     试剂SR2     CBS       1.23g/L     表6.CBS/CBL/PO/HPR循环系统：Cobas FARA参数     参数     设置     综合     测量模式     ABS     反应模式     P-I-SR1-I-SR2-A     校准模式     LIN INTER     试剂空白     REAG/DIL     波长     550nm     温度     37℃     分析     样品体积     30μL     稀释体积     10μL     稀释名称     H2O     试剂体积     260μL     温育时间     60秒     起始试剂体积     30μL(丝氨酸)     稀释名称     H2O     稀释体积     5μL     温育时间     10秒     起始试剂2体积     30μL(CBS)     稀释名称     H2O     稀释体积     5μL     温度延迟     Na     吸光度读数     第一次     0.5秒     数量     14     间隔     30秒     计算     步骤数     1     计算步骤A     终点或动态     首先     1     最后     14     校准     stds数     1     STD1     50μM     重复     2

二硫键还原：

高半胱氨酸很少以还原、非二硫键状态存在于人血浆中。大部分高半胱氨酸经 二硫键偶联到蛋白质或小分子。需要这些化合物的二硫化物还原以释放高半胱氨 酸用于通过任何确定总高半胱氨酸的方法测量。此例子证明使用还原剂与用乳酸 脱氢酶和NADH的系统相容。可能的候选还原剂包括DTE、DTT、n-乙酰半胱氨酸、 硫基乙酸、TCEP等。为在本发明方法中使用这些化合物，需要精确调节还原剂浓 度和仪器参数。一些还原剂的早期指示会阻碍丙酮酸氧化酶或辣根过氧化物酶作 用，导致研究下述另外的丙酮酸检测系统。

循环的证明：CBS/CBL/LDH系统：

丙酮酸在酶乳酸脱氢酶存在时与NADH反应以产生乳酸和NAD。定量丙酮酸可 通过测量在340nm的吸光度减少。NADH的摩尔吸收率比过氧化物酶产生的色原小 约6倍。然而，这不影响本发明的系统，因为CBL/CBS高半胱氨酸循环能产生相 对大量的丙酮酸。

用于产生图8、9、10&11所示数据的试剂系统包括HEPES缓冲液(pH7.2)中 的丝氨酸、CBL和乳酸脱氢酶，作为第一种试剂。然后顺次加入TRIS缓冲液(pH8.5) 中的NADH和CBS。然而，所有成分可不同组合以形成2或3种试剂高半胱氨酸测 量系统。试剂浓度示于表7且Cobas FARA参数示于表8。调节NADH浓度以提供足 够线性，同时血浆样品在340nm吸收。

    表7.CBS/CBL/LDH循环系统：试剂成分     化学制剂     浓度     试剂1     HEPES，半钠盐     39.4mM     HEPES，酸     12.6mM     丝氨酸     0.72mM     乳酸脱氢酶     33,000U/L     CBL     6.05ug/L     PH＝7.2     试剂SR1     NADH     4.16mM     TRIS     50mM     PH＝8.5     试剂SR2     CBS     996mg/L     TRIS     50mM     氯化钠     100mM     吡哆醛磷酸     5uM     样品稀释     DTT     13mM     HEPES，半钠盐     56.7mM     HEPES，酸     18.1mM     PH＝7.2

    表8.CBS/CBL/LDH循环系统：Cobas FARA参数     参数     设置     综合     测量模式     ABS     反应模式     P-T-I-SR1-I-SR2-A     校准模式     LIN INTER     试剂空白     REAG/DIL     波长     340nm     温度     37℃     分析     样品体积     30μL     稀释体积     10μL     稀释名称     H2O(或还原剂)     试剂体积     250μL     温育时间     60秒     起始试剂体积     15μL(NADH)     稀释名称     H2O     稀释体积     5μL     温育时间     10秒     起始试剂2体积     30μL(CBS)     稀释名称     H2O     稀释体积     10μL     温度延迟     NA     吸光度读数     第一次     5秒     数量     16     间隔     30秒     计算     步骤数     1     计算步骤A     终点或动态     首先     6     最后     20     校准     stds数     1     STD1     25或50μM     重复     2

分析水溶液：

系统对于检测水溶液中高半胱氨酸表现较好。典型的吸收相对时间图示于图8 和9。这些图是线性，明显的延滞期少或没有。NADH消失速度相对高。此外，高 半胱氨酸浓度相对吸光度的校准图在0-100μM样品浓度范围为线性(图10)。因 此，校准仅需要一个校准物如25μM以及试剂空白。

高半胱氨酸溶液在不同浓度制备以证明方法在2-20μM高半胱氨酸浓度范围 的表现。DTT存在和缺乏时的结果示于表9。如上所述，DTT用于减少样品(如血 清、血浆等)中的二硫键。DTT不显著干扰乳酸脱氢酶催化反应。     表9.线性的证明：CBS/CBL/LDH循环系统               反应时间＝3分钟 高半胱氨酸浓度(μM)     观察值(μM)     (-)DTT     (+)DTT     2     2     1.2     5     5.2     4.3     8     8.2     7.4     10     10.4     9.9     12.5     12.7     12.5     16.7     16.8     16.3     20     20.5     20

分析以人血浆为基础的对照产物：

本文证明了CBS/CBL/LDH循环系统的精确性能，使用Bio-Rad Co.生产的以人 血浆为基础的高半脱氨酸对照产物。使用不同浓度DTT，改变温育时间以获得最佳 高半胱氨酸回收。用1.6-3.2mM浓度DTT温育5-15分钟时间产生的高半胱氨酸 测量很好的在多种其它方法特定的范围内。

人血浆样品：

高半胱氨酸循环测定证明用DTT作为还原剂的人血浆样品性能良好。结果与独 立实验室用Abbott IMx高半胱氨酸方法获得的结果很一致(图11)。此实验所用 Cobas FARA参数示于表10且试剂成分示于表7。在此测定中，使用含水高半胱氨 酸校准物(25μM)。以水为基础样品的吸光度相对时间图在DTT缺乏时为线性且 在DTT存在时接近线性。然而，用血浆样品获得的图不同，即前3分钟后不是线 性。在表7和表10概括的条件下，循环似乎随着时间逐步减慢。然而，图11所 示相关性研究证明测试人血清样品时，本方法(概括于表7和表10)与IMx所得 的结果相对紧密一致。

表10.CBS/CBL/LDH循环系统：用于人血浆相关性研究的Cobas FARA参数 参数     设置 综合 测量模式     ABS 反应模式     P-T-I-SR1-I-SR2-A 校准模式     LIN INTER 试剂空白     REAG/DIL 波长     340nm 温度     37℃ 分析 样品体积     30μL 稀释体积     10μL 稀释名称     H2O(或还原剂) 温度延迟     900秒 试剂体积     250μL 温育时间     60秒 起始试剂体积     15μL(NADH) 稀释名称     H2O 稀释体积     5μL 温育时间     10秒 起始试剂2体积     30μL(CBS) 稀释名称     H2O 稀释体积     10μL 温度延迟     NA 吸光度读数 第一次     5秒 数量     24 间隔     30秒 计算 步骤数     1 计算步骤A     终点或动态 首先     1 最后     6 校准 stds数     1 STD1     25或50μM 重复     2

在一个较佳实施方案中，速度在反应起始后前3分钟测量。系统的另外最优化 包括盐和去污剂浓度变化，可能使含水和血浆样品性能更一致。当成分结合到2 或3种试剂混合物中时，测定同样精确。

                           实施例7

                       高半胱氨酸测定的比较

在此例子中，测试了根据发明的一个较佳实施方案并与两个现有测定比较，即 常规HPLC技术和商业购买的IMx测定。

发明的测定用表11所示3种试剂完成。第一种试剂R1开始以粉末形式且重建 到1.5g粉末每100mL水的水平。总测定试剂盒也包括人血浆基质中以不同水平猛 增的校准物以及加工人血浆基质中组成的2个对照样品，校准物含L-胱硫醚。     表11.CBS/CBL/LDH循环系统：试剂成分     化学制剂     浓度     试剂1     HEPES，半钠盐     43.3mM     HEPES，酸     12.7mM     丝氨酸     1.295mM     乳酸脱氢酶     ＞800U/L     NADH     1.06mM     Triton X-100     0.05％v/v     叠氮化钠     7.7mM     PH＝8.0     试剂SR1     DTE     6.75mM     柠檬酸     20mM     PH＝2.0     试剂SR2     CBS     18.7KU/L     CBL     8.9KU/L     山梨糖醇     1.65M     氯化钠     100mM     吡哆醛磷酸     5uM     叠氮化钠     7.7mM     TRIS/HCl     50mM     PH＝8.0                表12.CBS/CBL/LDH循环系统：Cobas MIRA参数     参数     设置     参数     设置     综合     测量模式     吸收     转化因子     1.00     反应模式     R-S-SR1-SR2     抵消     0.00     校准模式     Lin Regre     试剂空白     Reag/Dil     测试范围低     开     清除器     无     高     开     波长     340nm     正常范围低     无     小数位置     2     高     无     单位     umol/L     步骤数     1     分析     稀释后因子     无     计算步骤A     动态     浓度因子     无     读数  首先     18     最后     32     样品循环     1     反应限制     无     体积     30.0uL     稀释名称     H2O     校准     体积     25.0uL     校准间隔     各运行     试剂循环     1     空白     体积     90uL     试剂范围低     无     高     无     起始R1循环     2     空白范围低     无     体积     25uL     高     无     稀释名称     H2O     体积     25uL     标准位置     1     1     3.5umol/L     起始R2循环     17     2     7.0umol/L     体积     35uL     3     17umol/L     稀释名称     H2O     4     27umol/L     体积     15uL     5     47umol/L     6     无     计算     7     无     样品限制     无     重复     单次     反应方向     减少     偏差     检验     关闭     抗原过多     无     校正标准     无     对照     CS1位置     无     CS2位置     无     CS3位置     无

进行此测定时，使用商业购买的Cobas MIRA仪器。Cobas MIRA软件能进行50 个可程序化、25秒的循环。尤其是仪器根据表12的参数编程。在循环1中，30μ L样品加入样品池，接着加入25μL冲洗水和90μL液体试剂R1。在循环2开始 时，加入25μL试剂SR1与另外的25μL冲洗水。随后，混合物可温育15个循 环(6.25分钟)以使还原剂释放任何结合的高半胱氨酸并破坏任何内源存在的丙 酮酸。此时，加入35μL CBS/CBL酶试剂与另外的15μL冲洗水。循环18和32 间随着时间测量的340nm吸光度减小，作为样品中高半胱氨酸的测量。样品加入 和最终吸光度读数间的总测定时间是32个循环或13分钟20秒。由于多个样品平 行运行，另外的样品结果通过MIRA以约每30-90秒1次的速度产生，这取决于运 行长度和所用仪器校准物的数量。使用类似编程参数，此测定可适合甚至更快的 仪器(如RocheINTEGRA，Hitachi，ACE等)，能产生甚至更高的通量速度。

总共24个样品用发明测定和比较的已知测定来测试。下表13列出使用这三种 方法得到的高半胱氨酸浓度。图12-14是描述表13结果的各相关图。如可见到的， 发明方法与IMx和HPLC紧密相关，通常与IMx更一致。然而，本方法花费低许多， 运行较快，可用一般商业购买的化学分析器进行。

如表14所示，发明表现出非常好的运行间精确性。通常高半胱氨酸浓度约为 7-20μmol/L时，发现运行内浓度变化CV小于4％。                    表13.高半胱氨酸测定的比较     高半胱氨酸浓度[μM]     样品#     HPLC     发明     IMx     1     9.5     11.5     11.7     2     14.3     13.1     12.1     3     8.8     7.8     7.5     4     10.6     10.1     9.4     5     10.5     10.1     9.9     6     8.6     9.2     7.2     7     7.6     5.8     6.2     8     5.2     3.5     3.1     9     9.6     9.3     9.7     10     7.7     8.7     7.5     11     11.2     11.1     9.4     12     10.5     8.3     8.1     13     11.9     8.4     8.3     14     10.8     9.2     8.9     15     14.1     12.3     12.5     16     24.3     16.3     17.9     17     20.9     17.7     17.8     18     24.2     22.7     22.1     19     33.6     26.4     26.4     20     21.0     20.7     18.9     21     22.7     19.6     18.1     22     20.5     17.3     16.6     23     25.6     23.3     22.0     24     20.5     17.0     15.8     平均     15.2     13.3     12.8     截距[HPLC]     1.4     0.9     斜率[HPLC]     1.2     1.2     R[HPLC]     0.957     0.974     截距[IMx]     -0.3     0.5     斜率[IMx]     0.8     1.0     r[IMx]     0.976     0.990                      表14.运行间精确性     高半胱氨酸浓度(μmol/L)     样品     运行1     运行2     平均     ％CV     1     16.35     16.46     16.41     0.47     2     12.13     12.58     12.36     2.58     3     19.45     21.6     20.53     7.41     4     16.29     16.79     16.54     2.14     5     11.13     10.01     10.57     7.49     6     7.33     7.56     7.45     2.18     7     6.31     7.24     6.78     9.71     8     7.13     5.54     6.34     17.75     9     14.87     14.5     14.69     1.78     10     13.81     13.41     13.61     2.08     11     26.86     28.66     27.76     4.58     12     12.45     13.05     12.75     3.33     13     10.15     10.74     10.45     3.99     14     9.6     10.39     10.00     5.59     15     12.53     13.67     13.10     6.15     16     14.60     15.20     14.90     2.85     17     25.03     25.65     25.34     1.73     18     20.77     20.03     20.40     2.56     19     31.83     32.10     31.97     0.60     20     36.86     36.43     36.65     0.83     21     11.65     11.48     11.57     1.04     22     40.22     38.25     39.24     3.55     23     31.68     32.62     32.15     2.07     24     7.68     6.38     7.03     13.08                         平均CV(％)＝4.22

                           实施例8

                        试剂浓度变化的效果

在此例子中，实施例7中所述的发明优选测定用改变一些试剂成分进行，即 LDH、NADH和丝氨酸。这是为了确定这些试剂成分的最佳量。测定如上所述进行， 各成分浓度有变化。表15列出这些测试的结果。                          表15.试剂成分浓度变化的效果  [LDH](U/L) 终反应混合物     斜率 (mA/分钟/uM)     截距   mA/分钟     空白   mA/分钟 对照样品的目标高   半胱氨酸范围：     25-35μM     114.5     1.21     -0.14     -10.2     25.8     229.3     1.14     0.12     -11.2     28.1     458.7     1.17     0.14     -11.3     26.6     917.5     0.88     1.89     -11.3     27.2     [NADH](mM)     0.130     0.77     4.23     -10.7     32.9     0.259     1.12     0.05     -11     25.2     0.389     1.09     0.45     -10.7     26.8     0.519     1.13     0.49     -11.1     26.0     [丝氨酸](mM)     0.125     0.64     2.23     -6.7     30.9     0.25     0.92     1.26     -9.0     28.1     0.5     1.13     0.63     -10.8     27.1     1     1.16     0.15     -13.6     28.3     2     1.23     0.33     -15.4     28.2

表15所示结果能选择最终试剂成分水平，提供具最小空白速度的适当敏感性， 同时也尝试将试剂成本减少到最低程度。

                             实施例9

                     R1制剂变化对循环测定的效果

此例子确定pH变化的效果，改变pH是通过将缓冲液变为pH8.4的250mM TRIS 并加入脂肪酶和α-环糊精到试剂1。进行这些制剂变化后，然后测试该测定的性 能。表16详细描述了用于这些实验的试剂成分。

 表16.CBS/CBL/LDH循环系统：试剂成分     化学制剂     浓度     试剂1     TRIS     250mM     α-环糊精     0.1％     脂肪酶     ≥200kU/L     丝氨酸     1.295mM     乳酸脱氢酶     ＞800U/L     NADH     1.06mM     Triton X-100     0.05％v/v     叠氮化钠     7.7mM     PH＝8.2     试剂SR1     TCEP     26.3mM     试剂SR2     CBS     28.5KU/L     CBL     9.4KU/L     甘油     10％     山梨糖醇     1％     吡哆醛磷酸     5μM     叠氮化钠     7.7mM     磷酸钾     100mM     PH＝7.6

通过将试剂1的缓冲液变为pH8.4的250mM TRIS，改进测定一致性。这是因 为CBS和CBL在pH8.4明显更活酰且循环速度增加到3倍。

加入脂肪酶和α-环糊精以对付有时在临床实验室遇到的混浊(脂血症)样品 相关问题。当样品取自的病人在取血样前不久进食过或病人患的某些疾病过程正 在进行中，可能产生这种样品。混浊可干扰此测试结果，通过在340nm产生高吸 光度从而仪器不能准确测量NADH转变成NAD所产生的吸光度小变化。混浊也可强 烈地干扰此测试结果，通过测量NADH到NAD转化中随着时间的改变。例如，如果 混浊量减少，340nm的吸光度也降低，因为光散射小。此效果加大丙酮酸降低引起 的吸光度减小，所得高半胱氨酸确定可能显著太高。脂肪酶和α-环糊精加入R1 降低样品的混浊，大概通过脂肪酶水解甘油三酸酯为甘油和游离脂肪酸以及游离 脂肪酸与α-环糊精形成复合体。因此，混浊反应混合物在加入SR2(R3)时清除， 加入SR2(R3)用于精确测量丙酮酸产生速度。许多混浊反应混合物的340nm吸光度 迅速减小且几分钟内水平消失。高半胱氨酸结果精确。然而，一些混浊样品在加 入SR2(R3)前没有完全清除，因而一些样品的结果有点不精确。尽管如此，使用脂 肪酶和α-环糊精似乎是混浊样品获得准确结果的一种很有希望的方法。

除了试剂构成的变化，体积也变化以评估它们对测定性能的效果。这些变化反 映在表17中，它显示Cobas MIRA的典型循环参数。这些变化后，对86个人样品 进行相关性研究，结果示于表18。              表17.CBS/CBL/LDH循环系统：Cobas MIRA参数     参数     设置     参数     设置     综合     测量模式     吸收     转化因子     1.00     反应模式     R-S-SR1-SR2     抵消     0.00     校准模式     线性回归     试剂空白     Reag/Sol     测试范围低     开     清除器     无     高     开     波长     340nm     正常范围低     无     小数位置     2     高     无     单位     μmol/L     步骤数     1     分析     稀释后因子     无     计算步骤A     动态     浓度因子     无     读数  首先     20     最后     31     样品循环     1     反应限制     无     体积     20.0μL     稀释名称     H2O     校准     体积     45.0μL     校准间隔     各运行     试剂循环     1     空白     体积     90μL     试剂范围低     无     高     无     起始R1循环     2     空白范围低     无     体积     21μL     高     无     稀释名称     H2O     体积     26μL     标准位置     1     1     0.0μmol/L     起始R2循环     17     2     8.5μmol/L     体积     13μL     3     17.2μmol/L     稀释名称     H2O     4     25.2μmol/L     体积     10μL     5     43.0μumol/L     6     无     计算     7     无     样品限制     无     重复     两次     反应方向     减少     偏差     检验     关闭     抗原过多     无     校准标准     无     对照     CS1位置     无     CS2位置     无     CS3位置     无

         表18.表16和17所列改进的相关性数据     样品     IMx(μmol/L)     Catch(μmol/L)     2-01     2-02     2-03     2-04     2-05     2-06     2-07     2-09     2-11     2-13     2-15     2-16     2-17     2-18     2-19     2-21     2-22     2-23     2-24     2-26     2-27     11.0     17.7     18.6     22.1     12.2     15.2     17.6     51.8     29.1     19.6     25.0     22.9     21.9     25.0     22.2     23.6     13.0     23.1     17.0     15.9     8.8     12.0     17.3     18.4     21.2     13.8     14.9     20.4     49.9     28.2     19.2     24.7     23.7     21.3     23.80     22.10     20.80     13.60     21.80     17.60     14.80     9.30     2-28     2-29     2-30     2-31     2-32     2-33     2-34     2-35     9.1     5.2     8.2     4.7     6.6     7.8     7.0     6.9     9.40     5.40     8.10     5.40     6.80     8.10     7.0     7.3     2-36     4-01     4-02     4-03     4-04     4-05     4-06     4-07     4-08     4-09     4-10     4-11     4-12     4-13     4-14     4-15     4-16     4-17     4-18     4-19     4-21     4-22     4-23     4-24     4.8     7.2     7.3     6.2     9.5     6.2     8.2     6.8     8.1     6.5     7.5     8.1     6.1     6.19     5.31     7.17     5.05     5.93     8.57     4.87     19.37     8.61     11.02     12.75     5.7     7.3     9.1     5.8     9.5     7.4     8.0     6.7     7.4     7.9     8.5     8.6     5.7     6.20     5.90     6.80     7.00     7.80     8.10     5.70     19.50     9.30     12.50     13.30     4-25     4-26     4-27     4-29     4-30     4-31     4-32     12.28     14.63     9.33     18.39     14.13     8.63     9.95     12.00     14.30     11.30     19.60     14.20     8.60     9.80     4-33     4-34     4-35     4-36     4-37     4-38     4-39     4-40     4-41     4-43     4-46     4-47     4-50     E1     E2     E3     E6     E8     E9     E11     E13     E14     E15     E16     E20     8.08     12.34     12.16     15.75     14.37     14.72     10.26     12.26     24.62     27.25     21.26     22.08     15.14     4.74     8.24     5.10     13.79     8.79     10.57     7.10     7.65     12.19     6.47     5.28     7.93     10.20     12.00     13.10     16.30     14.30     15.20     11.20     14.00     25.00     29.50     19.60     23.30     15.50      4.90     8.00     5.30     14.50     10.00     11.50     7.40     7.30     12.30     6.14     4.70     7.80     平均     12.6     12.9     斜率     0.957     截距     0.8135     R     0.9927

如此比较表所示，与商业购买的IMx测定相比，用变化制剂的该测定结果很精 确。

                             实施例10

                   使用其它去污剂和它们的浓度变化

在此例子中，不同去污剂与EDTA组合使用作为R1成分。已知EDTA稳定脂质 颗粒。此外，当样品混浊时目标是获得精确结果。尤其是研究去污剂Brij-35和 Genapol X-80。发现EDTA在2.5mM浓度特别有效，在分析脂血症的样品时有助于 使混浊变化引起的吸光度非特异减小到最低程度。去污剂浓度也如表19和20所 示变化。试剂R1的一种优选组成示于表21。Brij-35以0.025％v/v水平存在且 EDTA以2.5mM存在。脂肪酶和α-环糊精不存在，因为EDTA存在时获得混浊样品 精确性似乎不需要它们。Brij-35(0.025％)也加入SR2(R3)，取代Triton X-100。 这可能是一种有前途的取代，因为一些国家认为Triton X-100对环境有害。表22 显示用优选试剂成分进行的相关性研究的结果。

               表19.改变的Genapol X-80浓度  样品  低  中等  高  D910  D912  D913  D915  PBI 27  PBI 28  PBI 29  PBI 10  MAS 1  MAS 2  MAS 3  D913X2  平均   IMx(μmol/L)     7.00     12.50     25.00     14.30     9.40     5.00     21.20     7.40     6.80     7.10     8.90     5.90     14.50     23.10     2.50     11.37  R1中Genapol X-80浓度变化的结果(μmol/L)      0.1 ％     6.31     11.96     23.08     14.38     9.41     5.58     23.85     7.69     7.33     7.83     9.61     4.63     14.46     22.60     2.45     11.41     0.3  ％     6.19     11.48     22.96     14.50     10.60     6.47     21.93     7.70     7.19     7.50     9.07     4.45     15.33     23.07     2.46     11.39      0.5  ％     5.64     10.37     22.86     14.11     9.50     4.53     20.92     6.82     5.96     6.85     7.67     4.15     14.47     23.65     2.17     10.64

                 表20.R1中改变的Brij-35浓度   样品      1      2      3      2     18     21     32  IMx(μmol/L)     5.88     14.57     23.52     6.49     10.15     4.62     8.90  Catch结果(μmol/L)作为R1中Brij-35浓度的函数     0.025％     5.03     15.46     24.66     6.80     10.72     4.86     8.17     0.05％     5.35     16.20     24.89     7.04     11.29     5.84     8.38     0.1％     5.26     15.92     23.67     8.44     9.95     5.73     8.67     0.5％     5.09     15.60     24.02     10.74     10.42     4.96     8.43   平均     10.59     10.81     11.28     11.09     11.32     表21.CBS/CBL/LDH循环系统：试剂成分     化学制剂     浓度     试剂1     TRIS     250mM     EDTA     2.5mM     丝氨酸     1.295mM     乳酸脱氢酶     ＞800U/L     NADH     1.06mM     Brij-35     0.025％w/v     叠氮化钠     7.7mM     PH＝8.2     试剂SR1     TCEP     26.3mM     试剂SR2     CBS     28.5KU/L     CBL     9.4KU/L     甘油     10％     山梨糖醇     1％     吡哆醛磷酸     5μM     叠氮化钠     7.7mM     磷酸钾     100mM     PH＝7.6

             表22.最佳改进的相关性数据     样品     IMx(μmol/L)     Catch(μmol/L)     1     2     3     701     702     703     704     705     706     707     708     709     710     711     712     713     715     716     717     718     719     720     721     722     723     724     725     726     727     728     729     730     731     732     733     734     735     平均     斜率     截距     R     5.90     14.57     23.52     17.95     11.51     11.81     10.13     22.37     16.97     7.76     9.35     7.33     7.24     8.50     19.93     6.82     6.91     7.35     9.44     14.16     5.73     6.32     11.30     16.23     11.77     8.39     10.17     6.69     8.01     10.45     11.73     14.39     8.61     7.56     7.35     6.54     8.39     10.79     5.15     15.36     23.52     17.03     11.55     12.97     10.64     21.87     16.79     7.76     9.90     6.60     6.90     8.54     19.00     6.04     6.93     7.05     9.26     15.61     5.25     6.00     12.75     17.55     12.11     9.72     11.48     6.14     7.50     10.64     11.27     14.87     8.76     7.67     7.56     8.34     7.91     10.92     1.0035     0.0195     0.9873

当Brij-35和EDTA取代Triton X-100和脂肪酶加α-环糊精时，清除一些混 浊反应混合物。然而，也许没有同样使用脂肪酶和α-环糊精的情况多。重要的是， 340nm的吸光度用零变化速度迅速稳定。然后加入SR2(R3)时，准确测量丙酮酸产 生的速度，甚至在样品看上去像牛奶的情况中获得精确结果。当加入R1和SR2(R3) 间的时间缩短2-4分钟时也如此，这对于将本发明的高半胱氨酸测定应用于其它 自动仪器是必需的。

                             实施例11

                将还原剂变为TCEP和改变TCEP浓度的结果

对于此例子，还原剂DTE用tris-(2-羧乙基磷化氢)盐酸盐(TCEP)取代。TCEP 的优点是在纯化水中稳定时间延长。TCEP取代DTE使试剂空白反应从约12到15 mA/分钟减小到约4到5mA/分钟。较低试剂空白能使高半胱氨酸测定更精确。为 发现此高半胱氨酸测定的最佳TCEP浓度，测试了浓度范围。这些实验的结果示 于表23。

                                    表23.R1中改变的TCEP浓度

                                    高半胱氨酸结果(μmol/L)   IMx     Catch测定   SR1   制剂   MAS 1   MAS 2   MAS 3   PBI 20   PBI 22   PBI 36   PBI 39   Doreen 709   平均         5.88     14.57     23.52     7.2     7.8     5.1     4.6     7.33     9.50     A     6.37     16.49     23.19     5.81     7.61     4.16     3.11     6.68     9.17     B     6.18     15.67     21.98     6.24     7.66     4.61     4.25     6.64     9.15     C     5.48     15.95     23.33     7.81     8.28     4.71     4.38     6.71     9.58     D     5.51     16.03     25.11     8.00     8.69     5.05     4.47     7.28     10.02     E     4.42     15.80     24.02     6.95     8.44     5.18     3.68     6.23     9.34     F     4.17     14.77     23.09     8.33     8.23     4.71     4.09     6.43     9.22

TCEP浓度：A＝6.3mM；B＝13.85mM；C＝26.44mM；D＝32.74mM；E＝39.03mM； F＝52.88mM

                             实施例12

            确定将R3缓冲液变为磷酸盐并加入甘油到缓冲液的效果

为获得稳定性更长和与测定相容性的酶混合物，酶制剂变为半衰期显著长于前 面制剂的混合物。重要的变化包括用磷酸盐取代Tris缓冲液并加入甘油到缓冲液。 使用浓度范围从50mM到500mM的pH7.6磷酸钾和浓度范围从0.5％到15.0％(v/v) 的甘油。这些变化使半衰期在4℃从几周显著增加到超过1年。在优选形式中，磷 酸钾范围可从约50mM到250mM。磷酸钾范围可更优选从约75mM到150mM。此实验 中特别有效的磷酸钾浓度是100mM。甘油范围可从约1-15％。此范围更优选从约 5-13％。此实验中特别有效的甘油范围是10％。

                                实施例13

                         使用不同仪器获得的结果

为确定所有测定变化产生的总体改进，通过特异于仪器的书面操作对一些仪器 进行精确评估。表24列出Roche Hitachi 911根据本发明所用参数和设置且表25 列出用Beckman CX-5时的相同参数和设置。下表显示这些精确测试的结果。这些 结果显著优于测定早期制剂所得结果。在Hitachi 911(表26)和Beckman CX-5 (表27)仪器中，所示各样品运行20X并确定运行内精确度。低达5.92μmol/L 的样品C.V.百分比为3.31％且范围在23.01μmol/L到25.4μmol/L的样品为1.9％ 到2.03％。7.3％和2.6％间的总精确度(表28)用高半胱氨酸值为4.6μmol/L和 27.0μmol/L的样品在Cobas MIRA Plus上获得。各样品重复2次运行，2X每天， 总共20天。

    表24.Roche Hitachi 911的Catch高半胱氨酸方法参数     测试     THCY     测定编码     速度-A，15     波长(第二/主要)     376/340     测定点     35-49-0-0     血清     S.Vol.(正常)     28     S.Vol.(减少)     20     S.Vol.(增加)     30     尿     S.Vol.(正常)     10     S.Vol.(减少)     10     S.Vol.(增加)     10     ABS.限制     0-0-减少     前区限制     0-0-降低     试剂     T1     200μL-0-0-00322-0     T2     25μL-0-0-00322-0     T3     0-0-0-00322-0     校准类型     线性-2-2-0     自动暂停时间     空白     0     跨度     0     2点     0     全部     0     自动变化     分配器(lot)     取消     瓶     取消

    经键盘选择测试：     进入     SD限制     100     重复限制     1000     敏感性限制     0     S1 ABS限制     (-32000)(32000)     补偿限制     空白     参数页2     测试     THCY-00322     测试名称     THCY单位：μmol/L     数据模式     成并排行(on board)     报告名称     高半胱氨酸     对照间隔     0     仪器因子(Y＝a×+b)     A     1     B     0     预期值     用户定义     技术限制     血清     0-10000     尿     (-99999)(999999)     标准     Conc.-Pos.-样品-Pre.-Dil.-Calib.     1     0.0-18-28-0-0-501     2     25.2-26-28-0-0-026     3     0     4     0     5     0     6     0

对于此实验，通过R1与去离子水以9到8.1的比例混合制备T1。试剂T2和T4 分别与试剂SR1和SR2相符合。

   表25.Beckman CX-5的Catch高半胱氨酸方法参数     化学名称：     高半胱氨酸     测试名称     HOMO     校准因子：     0     反应类型：     速度1     数学模型：     线性     计算时间限制：     24小时     反应方向：     减少     校准器数     2     单位：     μmol/L     小数精确     X.XX     主要波长：     340nm     第二波长：     380nm     样品体积     25μL     主要注射试剂：     A     179μL     B     22μL     第二注射试剂     C     14μL     加入时间：     592秒     校准器     #1     0.00     #2     24.8     多点跨度     1-2：     -0.001     试剂空白     起始读数：     100秒     终止读数：     200秒     ABS下限：     -1.5     ABS上限：     1.5     适用范围     下限：     0.00     上限：     99999.00     底物消耗     起始速度：     -99.999     δABS     1.5 对于此例子，通过R1与去离子水以9到8.1的比例混合制备A。试剂B和C分别 与MIRA试剂SR1和SR2相符合。

             表26.Hitachi 911的运行内精确度     运行内   低   平均数＝8.3μmol/L     标准偏差     0.224     ％C.V.     2.17   中等   平均数＝11.9μmol/L     标准偏差     0.324     ％C.V.     2.71   高   平均数＝25.4μmol/L     标准偏差     0.516     ％C.V.     2.03

              表27.Beckman CX-5的的运行内精确度     运行内   低   平均数＝5.92μmol/L 标准偏差     0.196 ％C.V.     3.31   中等   平均数＝11.12μmol/L 标准偏差     0.195 ％C.V.     1.70    高   平均数＝23.01μmol/L 标准偏差     0.437 ％C.V.     1.90

                       表28.Roche MIRA-Plus的总精确度     运行内    运行间    天数间     总计 低 平均数＝4.6μmol/L 标准偏差     0.31     0.14     0.04     0.34 ％C.V.     6.6     3.1     0.8     7.3 中等 平均数＝11.6μmol/L 标准偏差     0.40     0.08     0.23     0.47 ％C.V.     3.5     0.7     2.0     4.0 高 平均数＝27.0μmol/L 标准偏差     0.44     0.39     0.39     0.71 ％C.V.     1.6     1.5     1.4     2.6

                             实施例14

                      测定对2-试剂系统的适应性

本发明也适用于仅使用2种试剂的系统。这使发明适应范围更广的仪器，包括 仅能使用2种试剂的仪器。表29显示2-试剂系统的试剂成分且表30显示测定如 何在化学分析仪上进行的MIRA-Plus参数。表31显示用3-试剂系统相对2-试剂 系统所获得的比较数据。

    表29.CBS/CBL/LDH循环系统：2-试剂的试剂成分     化学     浓度     试剂1     TRIS     250mM     EDTA     2.5mM     丝氨酸     1.295mM     乳酸脱氢酶     ＞800U/L     NADH     1.06mM     Brij-35     0.025％v/v     叠氮化钠     7.7mM     TCEP     4.05mM     PH＝8.2     试剂SR1     CBS     28.5 KU/L     CBL     9.4 KU/L     甘油     10％     山梨糖醇     1％     吡哆醛磷酸     5μM     叠氮化钠     7.7mM     磷酸钾     100mM     PH＝7.6

    表30.2-试剂的CBS/CBL/LDH循环系统：Cobas MIRA参数 参数 设置 参数 设置 综合 测量模式 吸收 转化因子 1.00 反应模式 R-S-SR1-SR2 抵消 0.00 校准模式 线性回归 试剂空白 Reag/Sol 测试范围低 开 清除器 无 高 开 波长 340nm 正常范围低 无 小数位置 2 高 无 单位 μmol/L 步骤数 1 分析 稀释后因子 无 计算步骤A 动态 浓度因子 无 读数首先 19 最后 30 样品循环 1 反应限制 无 体积 20.0μL 稀释名称 H2O 计算校准 体积 45.0μL 校准间隔 各运行 试剂循环 1 空白Sol-Pos 1 体积 137μL 试剂范围低 无 高 无 起始R1循环 16 空白范围低 无 体积 13μL 高 无 稀释名称 H2O 体积 10μL 标准位置 1 1 0.0μmol/L 计算 2 8.5μmol/L 样品限制 无 3 17.2μmol/L 反应方向 减少 4 25.2μmol/L 检验 关闭 5 43.0μumol/L 抗原过多 无 6 无 7 无 重复 两次 偏差 Std修正 无 对照 CS1位置 无 CS2位置 无 CS3位置 无

          表31.2-试剂系统相对3-试剂系统的比较 样品 IMx(μmol/L) Catch Inc.Hcy测定(μmol/L)  2-试剂系统  3-试剂系统  MAS 1  5.88  5.55  5.17  MAS 2  14.57  16.14  15.70  MAS 3  23.52  23.99  23.47  P 10  8.90  9.32  9.65  P 11  7.60  7.45  7.27  P 33  7.80  8.11  8.29  P 34  5.93  5.21  5.69  754+848  16.00  15.68  6.15  平均  11.28  11.43  11.42

                               实施例15

                       本发明对使用单点校准的适应性

本发明的高半胱氨酸测定也适用于单校准点，零校准器作为空白。下表32显示在 Mira仪器上进行单点校准的参数。下面的数据(表33)显示在斜率平均模式中使 用单点校准产生的结果与使用多点校准曲线大体上相同。

表32.CBS/CBL/LDH循环系统：单点校准的Cobas MIRA参数 参数 设置 参数 设置 综合 测量模式 吸收 转化因子 1.00 反应模式 R-S-SR1 抵消 0.00 校准模式 线性回归 试剂空白 Reag/Sol 测试范围低 开 清除器 无 高 开 波长 340nm 正常范围低 无 小数位置 2 高 无 单位 μmol/L 步骤数 1 分析 稀释后因子 无 计算步骤A 动态 浓度因子 无 读数首先 19 最后 30 样品循环 1 反应限制 无 体积 20.0μL 稀释名称 H2O 计算 体积 45.0μL 计算间隔 各运行 试剂循环 1 空白Sol-Pos 1 体积 137μL 试剂范围低 无 高 无 起始R1循环 16 空白范围低 无 体积 13μL 高 无 稀释名称 H2O 体积 10μL 标准位置 4 1 25.2μmol/L 计算 2 无 样品限制 无 3 无 反应方向 减少 重复 两次 检验 关闭 偏差 抗原过多 无 校正标准 无 对照 CS1位置 无 CS2位置 无 CS3位置 无

表33.单点相对多点校准 样品 IMx(μmol/L) Catch Inc.Hcy测定(μmol/L) 单点校准 多点校准  MAS 1  5.88  5.03  5.17  MAS 2  14.57  15.18  15.70  MAS 3  23.52  22.97  23.47  PBI 10  8.90  8.82  9.65  PBI 11  7.60  8.26  7.27  PBI 33  7.80  8.05  8.29  PBI 34  5.93  5.80  5.69  754+848  16.00  15.17  6.15  平均  11.28  11.16  11.42

                             实施例16

                 WO 00/28071所述高半胱氧酸测定的研究

PCT出版物WO 00/28071详细描述了两种高半胱氨酸测定。在“第一个实施方 案”中，测定是没有还原步骤进行的。为将此方法转变成用于人血浆高半胱氨酸 测量，必须结合单独的脱机(off-line)或均匀还原步骤。出版物WO 00/28071 描述了一个单独的脱机还原步骤，也许是因为使用丙酮酸氧化酶循环系统。此步 骤需要分析还原样品前的20分钟温育，这大幅增加总测定时间和劳动成本。此外， 如果样品要在临床实验室中分析超过一个分析物，主要血清或血浆样品必须分成 两等分，一个用于高半胱氨酸测试，一个用于任何其它有序实验室测试。相反， 由于使用LDH循环系统(实施例7)，本发明能还原高半胱氨酸。

在实施例16(表34)中，显示DTT确实干扰WO 00/28071的“第二个实施方 案”所述丙酮酸氧化酶检测系统。特别，使用“第二个实施方案”所述试剂和DTT 组合物，有和没有DTT的测定用Cobas FARA仪器相对已知丙酮酸标准(12.5、25 和50μmol/L)进行。在DTT测试情况中，40μL的各标准混合30μL DTT溶液， 接着温育100秒。然后，加入90μL丙酮酸氧化酶试剂并温育30秒。然后在30、 60、90、120、150、180和220秒取吸光度读数。在“无DTT”测试中，进行相同 过程，除了没有DTT加入。表34列出用210秒读数的此实验结果。图15和16进 一步阐述此测试结果。

表34.DTT对PO/HRP丙酮酸检测系统的效果 没有DTT 有DTT 空白 0.0021 -0.0021 因子 2212 -11765 50μmol/L标准 51.5 35.3 25μmol/L标准 24.1 0.0 12.5μmol/L标准 9.7 -21.2 在30秒的δ变化(50μmol标准) 0.0643 -0.0062 在90秒的δ变化(50μmol标准) 0.0890 -0.0103 在120秒的δ变化(50μmol标准) 0.0903 -0.0113 在210秒的δ变化(50μmol标准) 0.0906 -0.0113

这些数据清楚证明，WO 00/28071的“第二个实施方案”所述单独还原步骤的 必要性。还原剂的存在干扰用于测定丙酮酸的丙酮酸氧化酶检测系统。因此，这 里所列数据确定费时的单独脱机还原步骤在“第二个实施方案”中必需。此外， WO 00/28071所述脱机还原步骤相对本发明可能显著提高测定复杂性和成本。

尽管上述发明通过说明和例子详细描述以使理解透彻，显然可在所附权利要求 范围内进行一些变化和修改。因此，发明范围不应参照上面描述确定，而应参照 所附权利要求以及它们的等价物的全部范围确定。

本专利申请引用的所有出版物和专利文件全部纳入供参考，在相同程度上用于 所有目的，似乎各单独出版物或专利文件被单独地表示。

                                     序列表

<110>G.川崎(KAWASAKI，GLENN)

     H.K.韦伯(WEBB，HEATHER K.)

     J.欧文斯(OVENS，JEFFREY)

     R.里德克(LIEDTKE，RAYMOND)

     D.弗里斯特(FOREST，DOREEN)

     M.莱加兹(LEGAZ，MARK)

     G.罗森(LAWSON，SOBOMABO)

<120>用于高半胱氨酸和胱硫醚的酶促循环测定

<130>30865

<150>60/163,126

<151>1999-11-02

<150>09/704,036

<151>2000-11-01

<150>60/203,349

<151>2000-05-10

<160>21

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>1

cgacggatcc gatggcggac aaaaagcttg                                                       30

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>2

cgcagcagct gttatacaat tcgcgcaaa                                            29

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>3

cggggatcct gatgcatgca tgataagga                                            29

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>4

cggcattacc gtttcactaa tttattg                                              27

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>5

gttggatccg gcattaccgt ttcac                                            25

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>6

ggtggatcca tcaatagata cgtacgtcct                                       30

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>7

ttttagttta tgtatgtgtt ttttg                                        25

<210>8

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>8

aacacataca taaactaaaa atgactaaat ctgagcagca a                          41

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>9

atgatgatga tgatgatgac ctgctaagta gctcagtaa                             39

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>    

<221>misc feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>10

catcatcatc atcatcatta aataagaacc cacgct                                36

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>共有MetR受体序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：共有MetR受体序列

<400>11

gttaatgttg aacaaatctc atgttgcgtg                                       30

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>12

gcgggtcgac tatgactaaa tctgagcagc aagcc                                 35

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>13

gcgtgcggcc gcgttatgct aagtagctca g                                     31

<210>14

<211>1524

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>14

atgactaaat ctgagcagca agccgattca agacataacg ttatcgactt agttggtaac 60

accccattga tcgcactgaa aaaattgcct aaggctttgg gtatcaaacc acaaatttat 120

gctaagctgg aactatacaa tccaggtggt tccatcaaag acagaattgc caagtctatg 180

gtggaagaag ctgaagcttc cggtagaatt catccttcca gatctactct gatcgaacct 240

acttctggta acaccggtat cggtctagct ttaatcggcg ccatcaaagg ttacagaact 300

atcatcacct tgccggaaaa aatgtctaac gagaaagttt ctgtcctaaa ggctctgggt 360

gctgaaatca tcagaactcc aactgctgct gcctgggatt ctccagaatc acatattggt 420

gttgctaaga agttggaaaa agagattcct ggtgctgtta tacttgacca atataacaat 480

atgatgaacc cagaagctca ttactttggt actggtcgcg aaatccaaag acagctagaa 540

gacttgaatt tatttgataa tctacgcgct gttgttgctg gtgctggtac tggtgggact 600

attagcggta tttccaagta cttgaaagaa cagaatgata agatccaaat cgttggtgct 660

gagggattcg gttcaatttt agcccaacct gaaaacttga ataagactga tatcactgac 720

tacaaagttg agggtattgg ttatgatttt gttcctcagg ttttggacag aaaattaatt 780

gatgtttggt ataagacaga cgacaagcct tctttcaaat acgccagaca attgatttct 840

aacgaaggtg tcttggtggg tggttcttcc ggttctacct tcactgcggt tgtgaaatac 900

tgtgaagacc accctgaact gactgaagat gatgtcattg ttgccatatt cccagattcc 960

atcaggtcgt acctaaccaa attcgtcgat gacgaatggt tgaaaaagaa caatttgtgg 1020

gatgatgacg tgttggcccg ttttgactct tcaaagctgg aggcttcgac gacaaaatac 1080

gctgatgtgt ttggtaacgc tactgtaaag gatcttcact tgaaaccggt tgtttccgtt 1140

aaggaaaccg ctaaggtcac tgatgttatc aagatattaa aagacaatgg ctttgaccaa 1200

ttgcctgtgt tgactgaaga cggcaagttg tctggtttag ttactctctc tgagcttcta 1260

agaaaactat caatcaataa ttcaaacaac gacaacacta taaagggtaa atacttggac 1320

ttcaagaaat taaacaattt caatgatgtt tcctcttaca acgaaaataa atccggtaag 1380

aagaagttta ttaaattcga tgaaaactca aagctatctg acttgaatcg tttctttgaa 1440

aaaaactcat ctgccgttat cactgatggc ttgaaaccaa tccatatcgt tactaagatg 1500

gatttactga gctacttagc ataa                             1524

<210>15

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>15

ataatgacta aatctgagca gcaagccgat tca                                   43

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>16

agggctcgag gatcccgggg gtgctattat gaatgcacgg                            40

<210>17

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>17

cggggatccg acgttttgcc cgcaggcggg aaacc                                 35

<210>18

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<220>

<221>misc feature

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>18

agatttagtc attattacga tatagttaat agttgatag                             39

<210>19

<211>428

<212>PRT

<213>大肠杆菌Escherichia coli)

<400>19

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr

1         5          10          15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp

       20          25          30

Pro Met Ala Asp Lys Lys Leu Asp Thr Gln Leu Val Asn Ala Gly Arg

    35           40          45

Ser Lys Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Val Asn Ser Val Ile Gln Arg Ala

  50          55           60

Ser Ser Leu Val Phe Asp Ser Val Glu Ala Lys Lys His Ala Thr Arg

65           70          75            80

Asn Arg Ala Asn Gly Glu Leu Phe Tyr Gly Arg Arg Gly Thr Leu Thr

        85           90            95

His Phe Ser Leu Gln Gln Ala Met Cys Glu Leu Glu Gly Gly Ala Gly

       100          105          110

Cys Val Leu Phe Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Ala Asn Ser Ile Leu

    115          120          125

Ala Phe Ile Glu Gln Gly Asp His Val Leu Met Thr Asn Thr Ala Tyr

  130           135          140

Glu Pro Ser Gln Asp Phe Cys Ser Lys Ile Leu Ser Lys Leu Gly Val

145          150         155             160

Thr Thr Ser Trp Phe Asp Pro Leu Ile Gly Ala Asp Ile Val Lys His

         165          170            175

Leu Gln Pro Asn Thr Lys Ile Val Phe Leu Glu Ser Pro Gly Ser Ile

      180           185           190

Thr Met Glu Val His Asp Val Pro Ala Ile Val Ala Ala Val Arg Ser

    195           200             205

Val Val Pro Asp Ala Ile Ile Met Ile Asp Asn Thr Trp Ala Ala Gly

 210            215           220

Val Leu Phe Lys Ala Leu Asp Phe Gly Ile Asp Val Ser Ile Gln Ala

225          230          235           240

Ala Thr Lys Tyr Leu Val Gly His Ser Asp Ala Met Ile Gly Thr Ala

         245          250            255

Val Cys Asn Ala Arg Cys Trp Glu Gln Leu Arg Glu Asn Ala Tyr Leu

      260           265         270

Met Gly Gln Met Val Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ile Thr Ser Arg Gly

    275          280          285

Leu Arg Thr Leu Gly Val Arg Leu Arg Gln His His Glu Ser Ser Leu

 290           295          300

Lys Val Ala Glu Trp Leu Ala Glu His Pro Gln Val Ala Arg Val Asn

305          310          315           320

His Pro Ala Leu Pro Gly Ser Lys Gly His Glu Phe Trp Lys Arg Asp

          325          330           335

Phe Thr Gly Ser Ser Gly Leu Phe Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Leu

      340            345         350

Asn Asn Glu Glu Leu Ala Asn Tyr Leu Asp Asn Phe Ser Leu Phe Ser

    355          360          365

Met Ala Tyr Ser Trp Gly Gly Tyr Glu Ser Leu Ile Leu Ala Asn Gln

  370           375          380

Pro Glu His Ile Ala Ala Ile Arg Pro Gln Gly Glu Ile Asp Phe Ser

385          390            395           400

Gly Thr Leu Ile Arg Leu His Ile Gly Leu Glu Asp Val Asp Asp Leu

         405          410            415

Ile Ala Asp Leu Asp Ala Gly Phe Ala Arg Ile Val

        420         425

<210>20

<211>1252

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>20

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1         5            10           15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

      20          25            30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

    35           40          45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

 50           55           60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65          70            75            80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

         85          90          95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

      100           105           110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

    115          120          125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

 130          135           140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145          150           155          160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

         165          170          175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

      180           185           190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

    195           200           205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

  210           215          220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Met Thr

225          230          235            240

Lys Ser Glu Gln Gln Ala Asp Ser Arg His Asn Val Ile Asp Leu Val

         245          250           255

Gly Asn Thr Pro Leu Ile Ala Leu Lys Lys Leu Pro Lys Ala Leu Gly

      260            265          270

Ile Lys Pro Gln Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Tyr Asn Pro Gly Gly

     275            280         285

Ser Ile Lys Asp Arg Ile Ala Lys Ser Met Val Glu Glu Ala Glu Ala

    290         295            300

Ser Gly Arg Ile His Pro Ser Arg Ser Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser

305           310           315          320

Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Lys Gly Tyr

        325            330           335

Arg Thr Ile Ile Thr Leu Pro Glu Lys Met Ser Asn Glu Lys Val Ser

      340             345          350

Val Leu Lys Ala Leu Gly Ala Glu Ile Ile Arg Thr Pro Thr Ala Ala

    355          360          365

Ala Trp Asp Ser Pro Glu Ser His Ile Gly Val Ala Lys Lys Leu Glu

  370           375          380

Lys Glu Ile Pro Gly Ala Val Ile Leu Asp Gln Tyr Asn Asn Met Met

385           390           395          400

Asn Pro Glu Ala His Tyr Phe Gly Thr Gly Arg Glu Ile Gln Arg Gln

        405           410           415

Leu Glu Asp Leu Asn Leu Phe Asp Asn Leu Arg Ala Val Val Ala Gly

      420           425         430

Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ser Lys Tyr Leu Lys Glu

    435           440           445

Gln Asn Asp Lys Ile Gln Ile Val Gly Ala Asp Pro Phe Gly Ser Ile

  450         455             460

Leu Ala Gln Pro Glu Asn Leu Asn Lys Thr Asp Ile Thr Asp Tyr Lys

465          470         475            480

Val Glu Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Val Pro Gln Val Leu Asp Arg Lys

         485            490         495

Leu Ile Asp Val Trp Tyr Lys Thr Asp Asp Lys Pro Ser Phe Lys Tyr

        500          505          510

Ala Arg Gln Leu Ile Ser Asn Glu Gly Val Leu Val Gly Gly Ser Ser

    515           520           525

Gly Ser Ala Phe Thr Ala Val Val Lys Tyr Cys Glu Asp His Pro Glu

  530           535          540

Leu Thr Glu Asp Asp Val Ile Val Ala Ile Phe Pro Asp Ser Ile Arg

545          550          555            560

Ser Tyr Leu Thr Lys Phe Val Asp Asp Glu Trp Leu Lys Lys Asn Asn

         565          570          575

Leu Trp Asp Asp Asp Val Leu Ala Arg Phe Asp Ser Ser Lys Leu Glu

      580          585          590

Ala Ser Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Val Phe Gly Asn Ala Thr Val Lys

    595            600          605

Asp Leu His Leu Lys Pro Val Val Ser Val Lys Glu Thr Ala Lys Val

  610          615           620

Thr Asp Val Ile Lys Ile Leu Lys Asp Asn Gly Phe Asp Gln Leu Pro

625           630           635         640

Val Leu Thr Glu Asp Gly Lys Leu Ser Gly Leu Val Thr Leu Ser Glu

        645           650           655

Leu Leu Arg Lys Leu Ser Ile Asn Asn Ser Asn Asn Asp Asn Thr Ile

      660          665           670

Lys Gly Lys Tyr Leu Asp Phe Lys Lys Leu Asn Asn Phe Asn Asp Val

    675          680          685

Ser Ser Tyr Asn Glu Asn Lys Ser Gly Lys Lys Lys Phe Ile Lys Phe

  690           695          700

Asp Glu Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asn Arg Phe Phe Glu Lys Asn

705         710          715          720

Ser Ser Ala Val Ile Thr Asp Gly Leu Lys Pro Ile His Ile Val Thr

          725          730           735

Lys Met Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Ala Met Thr Lys Ser Glu Gln Gln

      740          745           750

Ala Asp Ser Arg His Asn Val Ile Asp Leu Val Gly Asn Thr Pro Leu

    755           760           765

Ile Ala Leu Lys Lys Leu Pro Lys Ala Leu Gly Ile Lys Pro Gln Ile

   770          775           780

Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Tyr Asn Pro Gly Gly Ser Ile Lys Asp Arg

785          790          795           800

Ile Ala Lys Ser Met Val Glu Glu Ala Glu Ala Ser Gly Arg Ile His

          805           810          815

Pro Ser Arg Ser Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile

        820          825            830

Gly Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Lys Gly Tyr Arg Thr Ile Ile Thr

    835            840           845

Leu Pro Glu Lys Met Ser Asn Glu Lys Val Ser Val Leu Lys Ala Leu

  850           855         860

Gly Ala Glu Ile Ile Arg Thr Pro Thr Ala Ala Ala Trp Asp Ser Pro

865           870            875              880

Glu Ser His Ile Gly Val Ala Lys Lys Leu Glu Lys Glu Ile Pro Gly

         885            890               895

Ala Val Ile Leu Asp Gln Tyr Asn Asn Met Met Asn Pro Glu Ala His

       900           905         910

Tyr Phe Gly Thr Gly Arg Glu Ile Gln Arg Gln Leu Glu Asp Leu Asn

     915          920           925

Leu Phe Asp Asn Leu Arg Ala Val Val Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly

  930          935          940

Thr Ile Ser Gly Ile Ser Lys Tyr Leu Lys Glu Gln Asn Asp Lys Ile

945           950            955          960

Gln Ile Val Gly Ala Asp Pro Phe Gly Ser Ile Leu Ala Gln Pro Glu

         965            970          975

Asn Leu Asn Lys Thr Asp Ile Thr Asp Tyr Lys Val Glu Gly Ile Gly

      980           985           990

Tyr Asp Phe Val Pro Gln Val Leu Asp Arg Lys Leu Ile Asp Val Trp

     995          1000          1005

Tyr Lys Thr Asp Asp Lys Pro Ser Phe Lys Tyr Ala Arg Gln Leu

   1010         1015          1020

Ile Ser Asn Glu Gly Val Leu Val Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala

  1025        1030           1035

Phe Thr Ala Val Val Lys Tyr Cys Glu Asp His Pro Glu Leu Thr

  1040        1045           1050

Glu Asp Asp Val Ile Val Ala Ile Phe Pro Asp Ser Ile Arg Ser

  1055        1060           1065

Tyr Leu Thr Lys Phe Val Asp Asp Glu Trp Leu Lys Lys Asn Asn

  1070        1075           1080

Leu Trp Asp Asp Asp Val Leu Ala Arg Phe Asp Ser Ser Lys Leu

   1085         1090         1095

Glu Ala Ser Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Val Phe Gly Asn Ala Thr

   1100         1105         1110

Val Lys Asp Leu His Leu Lys Pro Val Val Ser Val Lys Glu Thr

   1115         1120         1125

Ala Lys Val Thr Asp Val Ile Lys Ile Leu Lys Asp Asn Gly Phe

   1130         1135         1140

Asp Gln Leu Pro Val Leu Thr Glu Asp Gly Lys Leu Ser Gly Leu

   1145        1150           1155

Val Thr Leu Ser Glu Leu Leu Arg Lys Leu Ser Ile Asn Asn Ser

   1160        1165           1170

Asn Asn Asp Asn Thr Ile Lys Gly Lys Tyr Leu Asp Phe Lys Lys

   1175         1180          1185

Leu Asn Asn Phe Asn Asp Val Ser Ser Tyr Asn Glu Asn Lys Ser

   1190        1195           1200

Gly Lys Lys Lys Phe Ile Lys Phe Asp Glu Asn Ser Lys Leu Ser

  1205         1210           1215

Asp Leu Asn Arg Phe Phe Glu Lys Asn Ser Ser Ala Val Ile Thr

   1220        1225           1230

Asp Gly Leu Lys Pro Ile His Ile Val Thr Lys Met Asp Leu Leu

   1235        1240           1245

Ser Tyr Leu Ala

   1250

<210>21

<211>1188

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>21

atggcggaca aaaagcttga tactcaactg gtgaatgcag gacgcagcaa aaaatacact  60

ctcggcgcgg taaatagcgt gattcagcgc gcttcttcgc tggtctttga cagtgtagaa 120

gccaaaaaac acgcgacacg taatcgcgcc aatggagagt tgttctatgg acggcgcgga 180

acgttaaccc atttctcctt acaacaagcg atgtgtgaac tggaaggtgg cgcaggctgc 240

gtgctatttc cctgcggggc ggcagcggtt gctaattcca ttcttgcttt tatcgaacag 300

ggcgatcatg tgttgatgac caacaccgcc tatgaaccga gtcaggattt ctgtagcaaa 360

atcctcagca aactgggcgt aacgacatca tggtttgatc cgctgattgg tgccgatatc 420

gttaagcatc tgcagccaaa cactaaaatc gtgtttctgg aatcgccagg ctccatcacc 480

atggaagtcc acgacgttcc ggcgattgtt gccgccgtac gcagtgtggt gccggatgcc 540

atcattatga tcgacaacac ctgggcagcc ggtgtgctgt ttaaggcgct ggattttggc 600

atcgatgttt ctattcaagc cgccaccaaa tatctggttg ggcattcaga tgcgatgatt 660

ggcactgccg tgtgcaatgc ccgttgctgg gagcagctac gggaaaatgc ctatctgatg 720

ggccagatgg tcgatgccga taccgcctat ataaccagcc gtggcctgcg cacattaggt 780

gtgcgtttgc gtcaacatca tgaaagcagt ctgaaagtgg ctgaatggct ggcagaacat 840

ccgcaagttg cgcgagttaa ccaccctgct ctgcctggca gtaaaggtca cgaattctgg 900

aaacgagact ttacaggcag cagcgggcta ttttcctttg tgcttaagaa aaaactcaat 960

aatgaagagc tggcgaacta tctggataac ttcagtttat tcagcatggc ctactcgtgg 1020

ggcgggtatg aatcgttgat cctggcaaat caaccagaac atatcgccgc cattcgccca 1080

caaggcgaga tcgattttag cgggaccttg attcgcctgc atattggtct ggaagatgtc 1140

gacgatctga ttgccgatct ggacgccggt tttgcgcgaa ttgtataa         1188