抗体多肽及其用途
阅读：500发布：2021-02-24
专利汇可以提供抗体多肽及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了对前列腺特异性 抗原 (PSA)具有结合特异性的 抗体 多肽，其中所述抗体多肽包含(a)包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的 氨 基酸序列的重链可变区和/或(b)包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区，且其中所述重链可变区和轻链可变区包含来自一种或多种人抗体的 框架 氨基酸序列。本发明还提供了所述抗体多肽在诊断和 治疗 前列腺癌 中的用途。，下面是抗体多肽及其用途专利的具体信息内容。
1.一种对前列腺特异性抗原(PSA)具有结合特异性的抗体多肽，其中所述抗体多肽包含
(a)包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和/或
(b)包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区，且其中所述重链可变区和轻链可变区包含来自一种或多种人抗体的框架氨基酸序列。
2.根据权利要求1的抗体多肽，其中所述抗体多肽表现出与鼠5A10抗体相比增强的肿瘤摄取。
3.根据权利要求1或2的抗体多肽，所述抗体多肽包含完整抗体或由完整抗体组成。
4.根据权利要求1-3中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含抗原结合片段或由抗原结合片段组成，所述抗原结合片段选自Fv片段(例如单链Fv和二硫键键合的Fv)、Fab-样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单个VH可变结构域或VL可变结构域)。
5.根据权利要求4的抗体多肽，其中所述抗原结合片段是scFv。
6.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，其中所述框架包含来自人免疫球蛋白
VH4基因家族的序列。
7.根据权利要求6的抗体多肽，其中所述框架序列来自VH4-28种系基因。
8.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，其中所述重链可变区和/或所述轻链可变区的框架序列是非天然存在的。
9.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成。
10.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求9或10的抗体多肽，所述抗体多肽包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
12.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽还包含重链恒定区或其部分。
13.根据权利要求12的抗体多肽，其中所述重链恒定区属于选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的免疫球蛋白亚型。
14.根据权利要求12的抗体多肽，其中所述重链恒定区属于免疫球蛋白亚型IgG1。
15.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含重链恒定区或其部分，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。
16.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽还包含轻链恒定区或其部分。
17.根据权利要求16的抗体多肽，其中所述轻链恒定区属于κ或λ轻链。
18.根据权利要求17的抗体多肽，其中所述轻链恒定区属于κ轻链。
19.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含轻链恒定区或其部分，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。
20.根据权利要求18或19的抗体多肽，所述抗体多肽包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。
21.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。
22.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。
23.根据权利要求21或22的抗体多肽，所述抗体多肽包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成，所述轻链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。
24.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，其中所述抗体多肽与治疗性部分直接地或间接地连接。
25.根据权利要求24的抗体多肽，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分，所述细胞毒性部分包含一种或多种放射性同位素或者由一种或多种放射性同位素组成。
26.根据权利要求25的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素是或各自独立地选自：β-发射体、auger-发射体、转换电子-发射体、α-发射体、和低光子能量-发射体。
27.根据权利要求26的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素各自独立地具有在药剂附近创建高剂量吸收的局部吸收能量的发射样式。
28.根据权利要求26或27的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素各自独立地选自：长程β-发射体，诸如90Y、32P、186Re/188Re；166Ho、76As/77As、153Sm；中程β-发射体，诸如
131I、177Lu、67Cu、161Tb；低能量β-发射体，诸如45Ca、35S或14C；转换或auger-发射体，诸如51Cr、67Ga、99Tcm、111In、123I、125I、201Tl、135La；和α-发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac和221At。
29.根据权利要求28的抗体多肽，其中所述放射性同位素是111In。
30.根据权利要求24的抗体多肽，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分，所述细胞毒性部分包含一种或多种细胞毒性药物或者由一种或多种细胞毒性药物组成。
31.根据权利要求30的抗体多肽，其中所述一种或多种治疗性部分各自独立地选自：细胞抑制性药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜内酯及其代谢物；毒素(诸如皂草素或卡奇霉素)；化学治疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗前列腺癌的任何其它细胞毒性药物。
32.根据权利要求24的抗体多肽，其中所述治疗性部分包含一种或多种适合于在活化疗法中使用的部分或者由一种或多种适合于在活化疗法中使用的部分组成，所述活化疗法诸如光子活化疗法、中子活化疗法、中子诱导的Auger电子疗法、同步加速器照射疗法、或低能量X-射线光子活化疗法。
33.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，其中所述抗体多肽还包含可检测部分。
34.根据权利要求33的抗体多肽，其中所述可检测部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
35.根据权利要求34的抗体多肽，其中所述放射性同位素选自99mTc、111In、67Ga、68Ga、
72As、89Zr、123I和201T1。
36.根据权利要求34的抗体多肽，其中所述放射性同位素是89Zr。
37.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，其中所述抗体多肽包含一对可检测的和细胞毒性的放射性核素，诸如86Y/90Y或124I/211At。
38.根据权利要求37的抗体多肽，其中所述放射性同位素能够作为可检测部分及还作为细胞毒性部分以多模态方式同时起作用。
39.根据权利要求33的抗体多肽，其中所述可检测部分包含顺磁同位素或由顺磁同位素组成。
40.根据权利要求34的抗体多肽，其中所述顺磁同位素选自：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和
56Fe。
41.根据权利要求33-40中的任一项的抗体多肽，其中所述可检测部分是通过成像技术诸如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像可检测的。
42.根据权利要求24-41中的任一项的抗体多肽，其中所述治疗性部分和/或可检测部分经由连接部分与所述抗体多肽间接地连接。
43.根据权利要求34的抗体多肽，其中所述连接部分是螯合剂。
44.根据权利要求34的抗体多肽，其中所述螯合剂选自：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，
4，7，10，四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酰基苄基)-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1，4，8，11-四氮杂环十二烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)的衍生物。
45.根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽，其中所述抗体多肽还包含用于增加所述药剂的体内半衰期的部分。
46.根据权利要求45的抗体多肽，其中所述用于增加体内半衰期的部分选自：聚乙二醇(PEG)、人血清清蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。
47.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码根据前述权利要求中的任一项的抗体多肽或其组分多肽链。
48.根据权利要求47的核酸分子，其中所述分子是cDNA分子。
49.根据权利要求47或48的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO：14和/或SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
50.根据权利要求49的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO：16和/或SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
51.一种载体，所述载体包含根据权利要求47-50中的任一项的核酸分子。
52.根据权利要求51的载体，其中所述载体是表达载体。
53.一种重组宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求47-50中的任一项的核酸分子或者根据权利要求51或52的载体。
54.根据权利要求53的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
55.根据权利要求53的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
56.根据权利要求55的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
57.一种用于生产根据权利要求1-46中的任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许表达编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养如权利要求53-56中的任一项限定的宿主细胞。
58.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
59.根据权利要求58的药物组合物，所述药物组合物适合用于胃肠外施用。
60.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求58或59的药物组合物。
61.根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽用于用在药物中。
62.根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽，所述抗体多肽用于用在前列腺癌的治疗和/或诊断中。
63.根据权利要求62的抗体多肽，其中所述要治疗的前列腺癌是非局限性(即弥散性)前列腺癌。
64.根据权利要求63的抗体多肽，其中所述要治疗的前列腺癌是转移性前列腺癌，任选微转移性前列腺癌。
65.根据权利要求64的抗体多肽，其中所述要治疗的转移性前列腺癌是淋巴系统的转移灶；骨(包括脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)的转移灶；在骨盆、直肠、膀胱、尿道内的转移灶。
66.根据权利要求62-65中的任一项的抗体多肽，其中所述患者具有前列腺癌，并且在诊断前列腺癌时和/或在治疗时小于70、65、60、55、50、45、40岁或更小。
67.根据权利要求62-66中的任一项的抗体多肽，其中所述患者的特征在于，家庭成员诸如父亲或兄弟在先前已经诊断出前列腺癌。
68.根据权利要求62-67中的任一项的抗体多肽，其中所述要治疗的前列腺癌是去势抗性的前列腺癌(CRPC)。
69.根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽在药物制备中的用途，所述药物用于治疗和/或诊断前列腺癌。
70.一种用于治疗患者中的前列腺癌的方法，所述方法包括下述步骤：施用治疗有效量的根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽。
71.一种用于治疗或诊断患者中的癌症的方法，所述方法包括下述步骤：施用诊断有效量的根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述要治疗的前列腺癌是非局限性(即弥散性)前列腺癌。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述要治疗的前列腺癌是转移性前列腺癌，任选微转移性前列腺癌。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述要治疗的转移性前列腺癌是淋巴系统的转移灶；骨(包括脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)的转移灶；在骨盆、直肠、膀胱、尿道内的转移灶。
75.根据权利要求70-74中的任一项所述的方法，其中所述患者具有前列腺癌，并且在诊断前列腺癌时和/或在治疗时小于70、65、60、55、50、45、40岁或更小。
76.根据权利要求70-75中的任一项所述的方法，其中所述患者的特征在于，家庭成员诸如父亲或兄弟在先前已经诊断出前列腺癌。
77.根据权利要求70-76中的任一项所述的方法，其中所述要治疗的前列腺癌是去势抗性的前列腺癌(CRPC)。
78.根据权利要求70-77中的任一项所述的方法，其中在施用所述抗体多肽后对所述患者实施放射引导手术以便除去前列腺癌细胞。
79.一种用于检测受试者血液中的前列腺肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括：
(a)提供来自要测试的受试者的血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化存在于所述血液样品中的细胞；
(c)使根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽与存在于所述血液样品中的细胞接
触；
(d)确定所述抗体多肽是否结合游离PSA，
其中所述抗体多肽与游离PSA的结合指示前列腺肿瘤细胞在受试者血液中的存在。
80.一种用于检测受试者组织中的前列腺肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括：
(a)提供来自要测试的受试者的组织样品；
(b)任选地，提取和/或纯化存在于所述组织样品中的细胞；
(c)使根据权利要求1-46中的任一项的抗体多肽与存在于所述组织样品中的细胞接
触；
(d)确定所述抗体多肽是否结合游离PSA，
其中所述抗体多肽与游离PSA的结合指示前列腺肿瘤细胞在受试者组织中的存在。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述组织样品是组织学样品。
82.根据权利要求79-81中的任一项所述的方法，其中通过ELISA实施步骤(d)。
83.根据权利要求79-82中的任一项所述的方法，所述方法还包括定量所述样品中的前列腺肿瘤细胞。
84.根据权利要求79-83中的任一项所述的方法，所述方法用于诊断受试者中的前列腺癌。
85.基本上如本文中参考说明书描述的抗体多肽。
86.基本上如本文中参考说明书定义的分离的核酸分子。
87.基本上如本文中参考说明书定义的载体。
88.基本上如本文中参考说明书定义的宿主细胞。
89.基本上如本文中参考说明书定义的生产抗体多肽的方法。
90.基本上如本文中参考说明书描述的药物组合物。
91.基本上如本文中参考说明书描述的用于用在前列腺癌的治疗和/或诊断中的抗体
多肽。
92.基本上如本文中参考说明书描述的用于治疗和/或诊断患者中的前列腺癌的方法。
93.基本上如本文中参考说明书描述的用于检测受试者中的前列腺肿瘤细胞的体外方法。
抗体多肽及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 目前，前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。前列腺是男性中的一种核桃大小的腺，其生成作为精液中的组分的流体。前列腺具有被组织外层包围的两个或更多个叶或部分。前列腺位于直肠前面并且刚好在膀胱下方，并且围绕尿道。
[0003] 前列腺癌的发生在欧洲西北部和美国是最高的。肿瘤的生长通常是长时间段期间发生的过程。前列腺癌通常是癌症的轻度形式。实际上，大多数诊断出前列腺癌的男性存活并恢复，仅少数男性遇到前列腺癌的更有侵袭性的形式，其在早期阶段中转移。前列腺癌的此种侵袭性形式仅当它在早期阶段、在癌症已经扩散至囊外组织以前得到诊断时才可以是能治愈的。
[0004] 现今，通常通过测量患者血液中的前列腺特异性抗原(PSA)的浓度实施前列腺癌的诊断和监测。如果PSA的浓度在不同时间点实施的几次连续测量中明显较高，则评估是存在前列腺癌的可能性。在此时间点，可以实施活组织检查以确认前列腺癌。
[0005] PSA(也被称作激肽释放酶III)是一种由237个氨基酸的单链构成的蛋白质，其在前列腺的分泌细胞中生成。可以在整个前列腺腺体中发现这些分泌细胞。PSA是就前列腺癌而言完善建立并且彻底研究的标志物。通过与健康细胞比较，PSA的生成在恶性细胞中更低并且在增生细胞中更高。相当矛盾的是，实际上，PSA的浓度在患有前列腺癌的男性的血液中较高。但是，一种解释可以是恶性细胞具有恶化的细胞结构，并且因此对PSA更能透过。
[0006] 适合作为前列腺癌疗法的靶标的另一种重要的丝氨酸蛋白酶是人腺激肽释放酶2(hK2)。编码hK2的基因与编码PSA的基因一起位于染色体19上。就像PSA一样，hK2主要在前列腺组织中表达。在前列腺中，PSA以无活性的原形式存在，并且通过hK2的肽酶作用而活化。就hK2而言的免疫组织化学研究已经表明，hK2相对于分化水平表达。这意味着，hK2在低分化的组织(诸如经受前列腺癌的组织)中以较高的产率表达，而在高分化的组织(诸如经受良性前列腺增生(BPH)的组织，所述良性前列腺增生是另一种常见的前列腺问题)中以较低的产率表达。
[0007] 现今的前列腺癌疗法是外科手术(例如根治性前列腺切除术)、放射疗法(包括氯化镭-223施用、近距离放射疗法和外线束放射疗法)、高强度聚焦超声(HIFU)、化学疗法、口服化学治疗药物、冷冻手术(冷冻肿瘤)、激素疗法(诸如抗雄激素疗法)、去势或前述项的组合。
[0008] 但是，这些疗法(外科手术和外部放射疗法)中的大多数仅(或主要)可用于治疗原发性肿瘤和大转移灶。化学疗法用于癌症的弥散性，但是对于这些患者中的大多数，它是姑息效果和/或延长的存活。因此，其它或互补的治疗方式是必需的，以实现弥散性恶性疾病的相当大的改善，特别是在微转移灶的情况下。
[0009] 使用靶向性分子(诸如抗体及其片段)疗法(诸如免疫疗法或放射免疫疗法)可以给出治疗弥散性疾病的可能性。
[0010] 因而，需要用于治疗和诊断前列腺癌的新的治疗剂和方法。
发明内容
[0012] 本发明的第一个方面提供了对前列腺特异性抗原(PSA)具有结合特异性的抗体多肽，其中所述抗体多肽包含：
[0013] (a)包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区[0014] CDRH1：TTGMGVS SEQ ID NO：1
[0015] CDRH2：HIYWDDDKRYSTSLK SEQ ID NO：2
[0016] CDRH3：KGYYGYFDY SEQ ID NO：3
[0017] 和/或
[0018] (b)包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区[0019] CDRL1：RASQNVNTDVA SEQ ID NO：4
[0020] CDRL2：STSYLQS SEQ ID NO：5
[0021] CDRL3：QQYSNYPLT SEQ ID NO：6
[0023] 以上6种氨基酸序列代表本发明的抗体多肽的互补决定区(CDR)，如根据Kabat等人，(1991)Sequences of Immunological Interest，第5版，NIH，Bethesda，MD(其公开内容通过引用并入本文)定义的。
[0024] 通过“抗体多肽”，我们包括基本上完整的抗体分子、单链抗体、双抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体、及其抗原结合片段和衍生物。
[0025] 本文中使用的术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码的氨基酸和它们的相应的“D”形式(与天然的“L”形式相比)的立体异构体、ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α，α-双取代的氨基酸、N-烃基氨基酸，等等)和化学上衍生的氨基酸(见下文)。
[0026] 当明确列举氨基酸诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，该术语表示L-丙氨酸和D-丙氨酸，除非另外明确地阐明。其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适组分，只要期望的功能特性被所述多肽保留。对于显示的肽，每种编码的氨基酸残基在适当的情况下用单字母名称表示，所述单字母名称对应于常规氨基酸的俗名。
[0027] 在一个实施方案中，如本文中定义的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
[0028] 本发明的抗体多肽表现出对PSA(且优选人PSA的成熟活性形式)的特异性。
[0029] 人PSA的氨基酸序列显示在下面
[0030] APLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
[0031] [SEQ ID NO：7]
[0032] (其中成熟的活性PSA蛋白的序列加下划线，也参见UniProtKB登记号P07288)。
[0033] 在精浆中发现的大部分PSA是无活性的，并且与蛋白C抑制剂(PCI)形成复合物。也可能的是，PSA与其它胞外蛋白酶抑制剂形成复合物。体外研究表明，PSA可以结合α2-抗纤维蛋白溶酶(α2-AP)、ACT、AMG、抗-凝血酶III(ATIII)、C1-灭活剂和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)。
[0034] 在一个实施方案中，与PSA的复合异形体相比，所述抗体多肽对PSA的游离(即非复合)异形体具有特异性。对PSA的游离异形体具有特异性的结合部分可以对在PSA的游离异形体上暴露、但是在PSA的复合异形体上未暴露的表位具有结合特异性，并且这可以是直链或构象(也就是说，非直链)表位。例如，所述抗体多肽可以对在游离PSA中暴露并且在复合异形体(诸如在PSA与PCI形成复合物时存在于精液中的形式)中未暴露的表位具有特异性，所述表位包含作为PSA的催化裂隙的一部分的一个或多个氨基酸残基。
[0035] 通过“特异性”，我们意指所述抗体多肽能够在体内(即在PSA存在于人体内的生理学条件下)结合PSA。优选地，所述抗体多肽在体内不结合任何其它蛋白质。
[0036] 通过本领域众所周知的方法，诸如ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀、蛋白质印迹和使用表达PSA的转染细胞的流式细胞计量术，可以确定这样的结合特异性。有利地，所述抗体多肽能够选择性地结合PSA，即它比对另一种蛋白质(具体地，其它激肽释放酶，诸如前列腺特异性抗原或PSA)强烈至少10倍地结合PSA。
[0038] 具体地，与衍生其CDR序列的亲本鼠5A10抗体(m5A10)相比，本发明的人源化抗体表现出增强的向肿瘤中的摄取(参见实施例6)。
[0039] 通过“增强的向肿瘤中的摄取”，我们意指本发明的抗体多肽(5A10抗体的人源化形式)当被施用给前列腺肿瘤患者时可以提供比具有更低标准器官毒性的亲本鼠5A10抗体更高的肿瘤吸收剂量。
[0040] 意外地更好的肿瘤积累会提供本发明的抗体的较好治疗特性。它又允许使用较高的放射剂量(吸收剂量)，从而在不增加对健康组织和器官的副作用或“附带损伤”的情况下导致在前列腺癌的治疗中的较大效力。
[0041] 人源化(又称作重塑或CDR嫁接)是一种用于降低来自异种来源(通常来自啮齿类动物诸如小鼠)的单克隆抗体的免疫原性并且用于改善其对人免疫系统的激活的技术(参
见Almagro&Fransson，2008，Frontiers in Bioscience 13：1619-1633的综述；其公开内容通过引用并入本文)。在临床试验中有几种人源化的单克隆抗体，并且已经对几种给予要作为药物使用的批准。虽然使用分子生物学技术生成经工程改造的单克隆抗体的机理是相对直截了当的，但是将啮齿动物互补决定区(CDR)简单嫁接进人框架中不总是重构初始单克隆抗体的结合亲和力和特异性。为了将抗体人源化，人源化抗体的设计在再现初始分子的功能中是一个至关重要的步骤。
见Almagro&Fransson，2008，Frontiers in Bioscience 13：1619-1633的综述；其公开内容通过引用并入本文)。在临床试验中有几种人源化的单克隆抗体，并且已经对几种给予要作为药物使用的批准。虽然使用分子生物学技术生成经工程改造的单克隆抗体的机理是相对直截了当的，但是将啮齿动物互补决定区(CDR)简单嫁接进人框架中不总是重构初始单克隆抗体的结合亲和力和特异性。为了将抗体人源化，人源化抗体的设计在再现初始分子的功能中是一个至关重要的步骤。
[0042] 人源化抗体的设计包括几个关键的选择，包括要使用的CDR和要使用的人框架的程度。但是，为了保留亲本抗体的特异性，也可能至关重要的是将来自啮齿动物mAb的一个或多个残基替代进人框架区中(所谓的回复突变)。鉴定必需的回复突变的位置需要详细的序列/结构分析。最近，已经使用噬菌体文库来改变在选定位置处的氨基酸。类似地，已经使用许多方案来选择要在其中嫁接啮齿动物CDR的最合适的人框架。早期实验使用充分表征的人单克隆抗体的有限子集(经常在结构可用的情况下)，不管与啮齿动物单克隆抗体的序列同一性(所谓的固定框架方案)。一些小组使用与啮齿动物可变区具有高氨基酸序列同一性的可变区(同源性匹配或最佳拟合)；其它小组使用共有或种系序列，而又一些小组选择来自几种不同人单克隆抗体的每种轻或重链可变区内的框架序列的片段。还有用在人单克隆抗体中发现的最常见的残基替换表面啮齿动物残基的开发的人源化方法(“表面重修”或“镶面”)和使用CDR程度的不同定义的那些方法。
[0043] 但是，尽管有抗体人源化的广泛研究，一些啮齿动物单克隆抗体已经被证明难以人源化。
[0044] 本发明的抗体多肽的开发要求不仅在框架区中、而且还在一些CDR中的回复突变(参见下面实施例2)。因而，上文在SEQ ID NO：1-6中表示的6种CDR序列源自鼠抗-PSA抗体
5A10，但是与亲本鼠抗体相比含有CDRH2(SEQ ID NO：2)和CDRL1(SEQ ID NO：4)中的突变。
做出CDR中的这些突变以便对5A10的人源化形式赋予最佳的特异性和稳定性。
5A10，但是与亲本鼠抗体相比含有CDRH2(SEQ ID NO：2)和CDRL1(SEQ ID NO：4)中的突变。
做出CDR中的这些突变以便对5A10的人源化形式赋予最佳的特异性和稳定性。
[0045] 在一个实施方案中，本发明的抗体多肽以大于0.1x 10-9M的KD结合PSA。
[0046] 用于测量相互作用(诸如抗体和配体之间的相互作用)的总亲和力(KD)和结合速率(ka)和解离速率(kd)的方法是本领域众所周知的。在下面实施例3中描述了示例性的体外方法。也预见到使用基于流式细胞计量术的方法(Sklar等人，2002，Annu Rev Biophys Biomol Struct，31：97-119；其公开内容通过引用并入本文)。
[0047] 有利地，本发明的抗体多肽具有低于1.0x10-10M的对PSA的亲和力(KD)，例如低于9.0x10-11M、8.0x10-11M、7.0x10-11M、6.0x10-11M、5.0x10-11M、4.0x10-11M、3.0x10-11M、2.0x10-11M或低于1.0x10-11M的KD。
[0048] 本领域技术人员将理解，本发明的抗体多肽可以构成抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体、及其抗原结合片段和衍生物。
[0049] 在一个实施方案中，所述抗体多肽包含完整(即完全)抗体或由完整(即完全)抗体组成，诸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM分子。
[0050] 有利地，所述抗体多肽包含完整IgG分子、或其抗原结合片段或衍生物，或者由完整IgG分子、或其抗原结合片段或衍生物组成。
[0051] 所述IgG分子可以属于任何已知亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0052] 通过抗体的“抗原结合片段和衍生物”，我们包括Fv片段(例如单链Fv和二硫键键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单个VH可变结构域或VL可变结构域)。
[0053] 例如，所述抗体多肽可以包含scFv或Fab片段或由scFv或Fab片段组成。
[0054] 本发明的抗体多肽的另一个表征特征是来自一种或多种人抗体的框架氨基酸序列在重链和轻链可变区中的存在。
[0055] 通过“框架序列”，我们包括重链和轻链可变结构域的除了CDR以外的区域。通常，每个可变结构域会包含4个框架区，称作FR1至FR4，CDR序列位于所述框架区内：
[0056] FR1----CDR1----FR2----CDR2----FR3----CDR3----FR4
[0057] 应当理解，框架区的氨基酸序列可以是全人的，或者可以含有一个或多个回复突变(即，存在于人框架中的氨基酸序列可以用在衍生出CDR的亲本啮齿动物可变结构域内的相应位置处发现的氨基酸置换)。因此，本发明的抗体多肽的重链和/或轻链可变结构域的FR1、FR2、FR3和/或FR4的序列可以是非天然存在的。
[0058] 在一个实施方案中，抗体多肽的框架序列与来自一种或多种人抗体的框架区具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。因而，所述抗体多肽可以包含与人抗体的FR1区具有至少70％序列同一性的重链FR1区。但是，应当理解，所述抗体多肽的重链和轻链可以与不同人抗体的框架区具有序列同一性。
[0059] 可以确定同一性百分比，例如，通过在Expasy设施站点(http：//www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)的LALIGN程序(Huang和Miller，
Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357)，使用全局比对选项、评分矩阵BLOSUM62、开放缺口罚分-14、延伸缺口罚分-4作为参数。可替换地，使用合适的计算机程序，例如威斯康辛大学遗传计算组(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序，可以确定两个多肽之间的序列同一性百分比，并且应当理解，就已经最佳对比其序列的多肽而言计算同一性百分比。
Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357)，使用全局比对选项、评分矩阵BLOSUM62、开放缺口罚分-14、延伸缺口罚分-4作为参数。可替换地，使用合适的计算机程序，例如威斯康辛大学遗传计算组(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序，可以确定两个多肽之间的序列同一性百分比，并且应当理解，就已经最佳对比其序列的多肽而言计算同一性百分比。
[0060] 可替换地，可以使用Clustal W程序(如描述于Thompson等人，1994，Nucl.AcidRes.22：4673-4680，其通过引用并入本文)实施比对。使用的参数可以如下：
[0061] -快速成对比对参数：K-元组(字)大小；1，窗口大小；5，缺口罚分；3，顶部对角线数目；5.评分罚分：x百分比。
[0062] -多重比对参数：缺口开放罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。
[0063] -评分矩阵：BLOSUM。
[0064] 可替换地，可以使用BESTFIT程序来确定局部序列比对。
[0065] 在一个实施方案中，本发明的抗体多肽的重可变结构域的框架序列由人免疫球蛋白VH4基因家族编码。
[0066] 例如，框架序列可以至少部分地由VH4-28种系基因编码(例如FR1、FR2和FR3可以由VH4-28编码，并且FR4可以由JH1编码)。
[0067] 因而，在一个实施方案中，所述抗体多肽可以包含重链可变区或者由重链可变区组成，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成(其中CDR序列标有下划线为粗体)：
[0068]
[0069] 在一个实施方案中，本发明的抗体多肽的轻可变结构域的框架序列由人免疫球蛋白κV4基因家族编码。
[0070] 例如，所述框架序列可以至少部分地由IgkV4-B3种系基因编码(例如FR1、FR2和FR3可以由IgkV4-B3编码，并且FR4可以由JK2编码)。
[0071] 因而，在一个实施方案中，所述抗体多肽可以包含轻链可变区或者由轻链可变区组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成(其中CDR序列标有下划线为粗体)：
[0072]
[0073] 通过“至少部分地”，我们包括，所述框架序列包含由参照基因编码的至少10个连续氨基酸，例如至少20个连续氨基酸。我们还包括，一个或多个(但不是所有的)FR区由参照基因编码(例如，FR1和FR2可以由参照基因编码，但FR3不然)。
[0074] 在一个优选的实施方案中，所述抗体多肽包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
[0075] 任选地，本发明的抗体多肽进一步包含重链恒定区或其部分。
[0076] 在一个实施方案中，所述抗体多肽包含IgG重链的CH1、CH2和/或CH3区域(诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链)。因而，所述抗体多肽可以包含来自IgG1重链的恒定区的部分或全部。例如，所述抗体多肽可以是包含CH1和CL恒定区的Fab片段。
[0077] 在一个实施方案中，所述抗体多肽可以包含抗体Fc区。技术人员会明白，Fc部分可以来自IgG抗体，或者来自不同类的抗体(诸如IgM、IgA、IgD或IgE)。在一个实施方案中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
[0078] Fc区可以是天然存在的(例如内源地生成的抗体的一部分)，或者可以是人工的(例如包含相对于天然存在的Fc区的一个或多个点突变和/或对CH2结构域内的碳水化合物部分的修饰)。具有改善其结合FcR的能力的点突变的Fc区可以是有利的，例如通过改变血清半衰期或者通过调节(即增强或降低)对参与ADCC和CDC的Fcγ受体(FcγR)的结合。
[0079] 有利地，所述抗体多肽可以包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，或其部分：
[0080] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0081] [SEQ ID NO：10]
[0082] 任选地，本发明的抗体多肽进一步包含轻链恒定区或其部分。
[0083] 在一个实施方案中，所述抗体多肽包含IgG轻链(诸如κ或λ轻链)的CL区。
[0084] 例如，所述抗体多肽可以包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其部分：
[0085] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0086] [SEQ ID NO：11]
[0087] 有利地，所述抗体多肽包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。
[0088] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体多肽包含：
[0089] (a)重链，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成(其中可变区为粗体，并且CDR序列标有下划线)：
[0090]
[0091]
[0092] 和/或
[0093] (b)轻链，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成(其中可变区为粗体，并且CDR序列标有下划线)
[0094]
[0095] 例如，所述抗体多肽可以包含两个SEQ ID NO：12的重链和两个SEQ ID NO：13的轻链或者由两个SEQ ID NO：12的重链和两个SEQ ID NO：13的轻链组成，所述两个SEQ ID NO：12的重链和两个SEQ ID NO：13的轻链通过二硫桥连接在一起以形成典型的IgG抗体结构。
[0096] 本发明的抗体多肽可以包含已经修饰或衍生化的一个或多个氨基酸或者由已经修饰或衍生化的一个或多个氨基酸组成。
[0097] 通过与官能性侧基的反应可以实现一个或多个氨基酸的化学衍生物。这样的衍生化分子包括，例如，其中游离的氨基基团已经被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、羧基苯甲酰氧基(carboxybenzoxy)基团、叔丁基氧基羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的那些分子。可以衍生化游离的羧基基团以形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯和酰肼。可以衍生化游离的羟基基团以形成O-酰基或O-烷基衍生物。还包括含有20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽作为化学衍生物。例如：可以用4-羟脯氨酸替代脯氨酸；可以用5-羟赖氨酸替代赖氨酸；可以用3-甲基组氨酸替代组氨酸；可以用高丝氨酸替代丝氨酸，并且用鸟氨酸替代赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要必要的活性得到维持。其它包括的修饰是酰胺化、氨基端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)和类似的末端修饰。
[0098] 本领域技术人员会进一步明白，肽拟似物化合物也可以是有用的。术语‘肽拟似物’表示模拟作为治疗剂的特定肽的构象和期望特征的化合物。
[0099] 例如，所述多肽不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)键连接的分子，而且包括其中将肽键反转的分子。使用本领域已知的方法，例如诸如记载于Meziere等人(1997)J.Immunol.159，3230-3237(其通过引用并入本文)的那些方法，可以生成这样的反-倒位肽拟似物。此方案涉及生成含有牵涉主链、而非侧链取向的变化的假肽。反-倒位肽(其含有NH-CO键而非CO-NH肽键)对蛋白酶解具有多得多的抗性。可替换地，所述多肽可以是肽拟似物化合物，其中在常规酰胺键处通过-y(CH2NH)-键连接一个或多个氨基酸残基。
[0100] 在另一个替代方案中，可以总体上分配肽键，前提条件是，使用保留氨基酸残基的碳原子之间的间隔的合适接头部分；可以有利的是，接头部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。
[0102] 还已经使用多种未编码的或经修饰的氨基酸诸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸来修饰哺乳动物肽。另外，通过共价修饰诸如环化或者通过掺入内酰胺或其它类型的桥，可以稳定化假设的生物活性构象，例如参见Veber等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：2636和Thursell等人，1983，Biochem.Biophys.Res.Comm.111：166，它们通过引用并入本文。
[0103] 本领域技术人员将理解，可以用功能性部分增强本发明的抗体多肽以促进其预期的用途，例如作为体内成像剂或治疗剂。
[0104] 因而，在一个实施方案中，所述抗体多肽与治疗性部分直接地或间接地连接。
[0105] 可以使用任何合适的治疗性部分。合适的治疗性部分是能够降低或抑制前列腺癌细胞的生长、或者特别是杀死前列腺癌细胞的部分。例如，治疗剂可以是细胞毒性部分。细胞毒性部分可以包含一种或多种放射性同位素或由一种或多种放射性同位素组成。例如，一种或多种放射性同位素可以各自独立地选自：β-发射体、Auger-发射体、转换电子-发射体、α-发射体、和低光子能量-发射体。可以期望，一种或多种放射性同位素各自独立地具有在药剂附近创建高吸收剂量的局部吸收能量的发射样式。示例性的放射性同位素可以包括：长程β-发射体，诸如90Y、32P、186Re/188Re；166Ho、76As/77As、89Sr、153Sm；中程β-发射体，诸如131I、177Lu、67Cu、161Tb、105Rh；低能量β-发射体，诸如45Ca或35S；转换或Auger-发射体，诸如
51Cr、67Ga、99Tcm、111In、114mIn、123I、125I、201Tl；和α-发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac、225Ac、
212Pb、255Fm、223Ra、149Tb和221At。其它放射性核素是可用的，并且可能用于治疗中。
51Cr、67Ga、99Tcm、111In、114mIn、123I、125I、201Tl；和α-发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac、225Ac、
212Pb、255Fm、223Ra、149Tb和221At。其它放射性核素是可用的，并且可能用于治疗中。
[0106] 在另一个实施方案中，可以期望治疗性部分或细胞毒性部分不是如在WO 2006/087374 A1中、特别是在其第11页第7-15行作为“示踪剂”公开的部分。
[0107] 在一个优选的实施方案中，所述抗体多肽与放射性同位素177Lu连接(或以其它方177
式用放射性同位素 Lu标记)。
式用放射性同位素 Lu标记)。
[0108] 可替换地，所述治疗性部分可以包含一种或多种治疗性(诸如细胞毒性)药物或者由一种或多种治疗性(诸如细胞毒性)药物组成，所述治疗性(诸如细胞毒性)药物是例如细胞生长抑制性药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜内酯及其代谢物；毒素(诸如皂草素或卡奇霉素)；化学治疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗前列腺癌的任何其它治疗剂或细胞毒性药物。
[0109] 示例性的治疗剂/细胞毒性药物可以例如包括：
[0110] ●细胞抑制剂，特别是具有剂量限制副作用的那些细胞抑制剂，包括但不限于环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、洛莫司汀、紫杉烷、磷酸雌莫司汀和其它氮芥、抗生素(包括多柔比星、卡奇霉素和埃斯波霉素)、长春花生物碱、楝碱、含铂化合物、内皮他丁、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、酶、取代的脲、甲基-肼衍生物、柔红霉素、两亲的胺，
[0111] ●抗雄激素类诸如氟他胺和比卡鲁胺及其代谢物；
[0112] ●可的松及其衍生物；
[0113] ●膦酸盐诸如二膦酸盐和双膦酸盐；
[0114] ●睾酮-5-α-还原酶抑制剂；
[0115] ●硼附加物；
[0116] ●细胞因子；
[0117] ●毒胡萝卜内酯和它的代谢物；
[0118] ●可用于治疗前列腺癌的其它药剂。
[0119] 可替换地，所述细胞毒性部分可以包含一个或多个部分或者由一个或多个部分组成，所述部分适合用在活化疗法诸如光子活化疗法、中子活化疗法、中子诱导的Auger电子疗法、同步加速器照射疗法、或低能量X-射线光子活化疗法中。
[0120] 例如，用本发明的抗体多肽，将存在使用同步加速器放射(或低能量X-射线)以推进放射疗法的潜力，所述放射疗法主要聚焦于所谓的光子活化放射疗法(PAT)，其中通过与预施用的高Z肿瘤靶向剂的相互作用在癌症组织中增强来自外部X-射线照射的局部能量沉积。
[0121] PAT治疗方式利用来自同步加速器来源的单色X-射线，诸如由格勒诺布尔(Grenoble)的欧洲同步加速器放射设备(European同步加速器Radiation Facility，ESRF)的ID17生物医学束线提供，并且如预期在未来在其它设施诸如新的瑞典同步加速器设备
(Swedish同步加速器facility)Max-IV可用。
(Swedish同步加速器facility)Max-IV可用。
[0122] 作为另一种潜在治疗方式，关于“诱导的Auger电子肿瘤疗法”的研究是在隆德(Lund)的即将到来的欧洲散裂源(European Spallation Source，ESS)，和有希望地医学实验站。已经长期使用反应器产生的热和半热中子进行硼中子俘获疗法(Boron-Neutron-
Capture-Therapy)BNCT，既用于临床前实验又用于用给出高局部吸收能量(吸收剂量)的诱导的α-颗粒和反冲核(7Li)治疗脑肿瘤。一个类似的方案是使用中子和用具有高中子横截面的稳定核标记的合适肿瘤靶向性分子。抗体或肽可以例如用稳定的钆(157Gd)标记，并且作为中子的靶分子作用，所述中子被Gd-核俘获，所谓的钆中子俘获疗法(GdNCT)。通过
Monte Carlo技术，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布，因为它源自γ-光子、中子、核反冲、以及特征性x-射线、来自钆或其它潜在元素的内部转换和Auger-电子。
Capture-Therapy)BNCT，既用于临床前实验又用于用给出高局部吸收能量(吸收剂量)的诱导的α-颗粒和反冲核(7Li)治疗脑肿瘤。一个类似的方案是使用中子和用具有高中子横截面的稳定核标记的合适肿瘤靶向性分子。抗体或肽可以例如用稳定的钆(157Gd)标记，并且作为中子的靶分子作用，所述中子被Gd-核俘获，所谓的钆中子俘获疗法(GdNCT)。通过
Monte Carlo技术，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布，因为它源自γ-光子、中子、核反冲、以及特征性x-射线、来自钆或其它潜在元素的内部转换和Auger-电子。
[0123] 如以上所讨论的，所述治疗性部分(诸如放射性同位素、细胞毒性部分等)可以与结合部分(诸如抗体或其片段)直接地或间接地连接。合适的接头是本领域已知的，并且包括例如辅基，非酚接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯的衍生物；十二硼酸盐)，大环类和无环螯合剂的螯合部分，诸如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)的衍生物，去铁胺(DFO)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物，S-2-(4-异硫氰酰基苄基)-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)的衍生物，和1，4，8，11-四氮杂环十二烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)的衍生物，3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]-十五-1(15)，11，13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰酰基-苄基)-3，6，9-三乙酸(PCTA)的衍生物，5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷-4，7，10-三(乙酸)(DO3A)的衍生物，和其它螯合部分。这样的接头的使用在下述情况下可以是特别适当的：其中所述药剂包含经由接头与作为治疗性部分的放射性同位素连接的作为结合部分的抗体或其片段，或者由经由接头与作为治疗性部分的放射性同位素连接的作为结合部分的抗体或其片段组成。
[0124] 一种优选的接头是DTPA，例如如在177Lu-DTPA-[本发明的抗体多肽]中使用的。
[0125] 另一种优选的接头是去铁胺DFO，例如如在89Zr-DFO-[本发明的抗体多肽]中使用的，优选地用于诊断用途。
[0126] 任选地，本发明的抗体多肽可以(或不可以)进一步包含可检测部分。例如，可检测部分可以包含放射性同位素或由放射性同位素组成，诸如选自下组的放射性同位素：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。任选地，所述药剂可以包含一对可检测的和细胞毒性的放射性核素，诸如86Y/90Y或124I/211At。可替换地，所述药剂可以包含能够以多模态方式作为可检测部分及也作为细胞毒性部分同时起作用以提供所谓的“多模态治疗诊断”的放射性同位素。因而，可以将结合部分与纳米颗粒偶联，所述纳米颗粒具有多重成像(例如，SPECT、PET、MRI、光学或超声)的能力以及使用细胞毒性药物(诸如放射性核素或化疗剂)的治疗能力。在本发明的情况下还包括通过使用高频交替磁场的过热治疗和伴随的超声成像的可能性。
[0127] 可替换地，所述可检测部分可以包含顺磁同位素或由顺磁同位素组成，诸如顺磁同位素选自157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
[0128] 在抗体多肽包含可检测部分的情况下，那么可检测部分可以通过成像技术诸如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像检测到。
[0129] 使用本领域众所周知的方法，可以将治疗性和可检测部分与抗体多肽缀合或以其它方式结合(例如，现有的免疫缀合物疗法、吉妥珠单抗奥加米星[商业名称： ]包含与细胞毒素卡奇霉素连接的单克隆抗体)。
[0130] 在另一个实施方案中，以包含抗体多肽分子群体的制剂的形式使用本发明的抗体多肽治疗前列腺癌。在一个选项中，所述群体中的所有(或基本上所有，诸如按重量计大于90％、95％、99％、99.9％或更多)抗体多肽分子包含相同治疗性部分。在另一个选项中，所述群体包含具有不同治疗性部分的其它药剂的混合物。此选项会给出增强使用各种药剂
(诸如化学治疗剂、激素治疗剂或其它疗法组合)的靶向放射性核素疗法的效果的可能性，其中靶向剂不仅将治疗活性的放射性核素递送至肿瘤相关抗原，而且通过调节(例如触发或阻断)细胞内信号传递级联同时放射性敏化靶向的肿瘤细胞。此选项也可用于用细胞毒性剂的混合物治疗前列腺癌，例如使用α-发射体和不同射程的β-发射体的混合物，或具有不同射程、LET(线性能量转移)和RBE(相对生物学活性)的放射性核素的混合物，用于组合治疗大肿瘤、微转移灶和单个肿瘤细胞。在一个实施方案中，可以使用长程发射体治疗大肿瘤，并且可以使用短程发射体治疗较小肿瘤，诸如微转移灶，和单个肿瘤细胞。
(诸如化学治疗剂、激素治疗剂或其它疗法组合)的靶向放射性核素疗法的效果的可能性，其中靶向剂不仅将治疗活性的放射性核素递送至肿瘤相关抗原，而且通过调节(例如触发或阻断)细胞内信号传递级联同时放射性敏化靶向的肿瘤细胞。此选项也可用于用细胞毒性剂的混合物治疗前列腺癌，例如使用α-发射体和不同射程的β-发射体的混合物，或具有不同射程、LET(线性能量转移)和RBE(相对生物学活性)的放射性核素的混合物，用于组合治疗大肿瘤、微转移灶和单个肿瘤细胞。在一个实施方案中，可以使用长程发射体治疗大肿瘤，并且可以使用短程发射体治疗较小肿瘤，诸如微转移灶，和单个肿瘤细胞。
[0131] 任选地，本发明的抗体多肽可以(不可以)进一步包含用于增加药剂的体内半衰期的部分。用于增加药剂的体内半衰期的示例性部分可以包括聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。可以特别预见到PEG。
[0132] 应当理解，可以将本发明的多肽低压冻干以贮存，并且在使用前在合适的载体中重构，例如通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却、或者通过使用从超临界二氧化碳中的颗粒形成(沉淀)。可以采用任何合适的冷冻干燥方法(例如冷冻干燥、喷雾干燥、滤饼干燥)和/或重构技术。本领域技术人员将理解，冷冻干燥和重构可以导致不同程度的活性丧失，并且可能不得不向上调节使用水平以补偿。优选地，低压冻干的(冷冻干燥的)多肽在再水合时丧失不超过约1％的它的活性(在冷冻干燥前)，或者在再水合时丧失不超过约5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过约50％的它的活性(在冷冻干燥前)。
[0133] 用于生成本发明的多肽的方法是本领域众所周知的。
[0134] 方便地，所述多肽是或包含重组多肽。用于生产这样的重组多肽的合适方法是本领域众所周知的，诸如在原核或真核宿主细胞中表达(例如，参见Sambrook&Russell，2000，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor，New York，在该文件中的有关公开内容特此通过引用并入)。
[0135] 使用商购可得的体外翻译系统，诸如兔网织红细胞裂解物或麦胚裂解物(可得自Promega)，也可以生产本发明的抗体多肽。优选地，所述翻译系统是兔网织红细胞裂解物。
方便地，可以将翻译系统偶联至转录系统，诸如TNT转录-翻译系统(Promega)。此系统具有在与翻译相同的反应中从编码DNA多核苷酸生产合适的mRNA转录物的优点。
方便地，可以将翻译系统偶联至转录系统，诸如TNT转录-翻译系统(Promega)。此系统具有在与翻译相同的反应中从编码DNA多核苷酸生产合适的mRNA转录物的优点。
[0136] 本领域技术人员将理解，可替换地可以人工合成本发明的多肽，例如使用众所周知的液相或固相合成技术(诸如t-Boc或Fmoc固相肽合成)。
[0137] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的抗体多肽或其组分多肽链。通过“核酸分子”，我们包括DNA(例如基因组DNA或互补DNA)和mRNA分子，其可以是单链的或双链的。
[0138] 在一个实施方案中，所述核酸分子是cDNA分子。
[0139] 本领域技术人员将理解，可以将核酸分子进行密码子优化以在特定宿主细胞中表达抗体多肽，例如用于在人细胞中表达(例如，参见Angov，2011，Biotechnol.J.6(6)：650-659)。
[0140] 在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含
[0141] (a)SEQ ID NO：14的核苷酸序列
[0142] CAGGTCACACTGAAGGAATCTGGGCCTGCTTTGGTGAAGCCCACTCAGACTCTGACACTCACATGCACCTTCTCCGGGTTTAGCCTGTCAACCACCGGTATGGGCGTGAGTTGGATTCGCCAACCACCGGGTAAAGCGCTTGAGTGGCTTGCACACATCTATTGGGACGATGACAAGCGGTACAGTACTAGCCTGAAAACGAGACTGACCATAAGCGAGGACTCATCCAAGAATCAGGTGGTACTGACGATGACCAACATGGATCCCGTTGATACCGCCACATACTACTGTGCCAGGAAAGGCTACTATGGCTATTTCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTCACTGTGTCCTCT
[0143] [SEQ ID NO：14]
[0144] 和/或
[0145] (b)SEQ ID NO：15的核苷酸序列
[0146] GACATCCAGATGACCCAATCTCCCTCTAGCTTGTCCGCTAGTGTCGGTGATAGGGTGACAGTGACATGCAGAGCTAGCCAGAATGTCAACACAGACGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAAAGCCCTCATCTTCTCCACGTCATATCTGCAAAGCGGAGTACCTTCCCGGTTTAGTGGGTCTGGGTCAGGCACTGACTTCACCCTGACCATATCCAGCCTTCAACCGGAAGATTTCGCGACCTACTACTGTCAGCAGTACAGCAACTATCCTCTGACTTTTGGACAGGGCACTAAGGTGGAGATTAAGCGT
[0147] [SEQ ID NO：15]
[0148] 因而，本发明的核酸分子可以包含
[0149] (a)SEQ ID NO：16的核苷酸序列
[0150] CAGGTCACACTGAAGGAATCTGGGCCTGCTTTGGTGAAGCCCACTCAGACTCTGACACTCACATGCACCTTCTCCGGGTTTAGCCTGTCAACCACCGGTATGGGCGTGAGTTGGATTCGCCAACCACCGGGTAAAGCGCTTGAGTGGCTTGCACACATCTATTGGGACGATGACAAGCGGTACAGTACTAGCCTGAAAACGAGACTGACCATAAGCGAGGACTCATCCAAGAATCAGGTGGTACTGACGATGACCAACATGGATCCCGTTGATACCGCCACATACTACTGTGCCAGGAAAGGCTACTATGGCTATTTCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTCACTGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
[0151] [SEQ ID NO：16]
[0152] 和/或
[0153] (b)SEQ ID NO：17的核苷酸序列
[0154] GACATCCAGATGACCCAATCTCCCTCTAGCTTGTCCGCTAGTGTCGGTGATAGGGTGACAGTGACATGCAGAGCTAGCCAGAATGTCAACACAGACGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAAAGCCCTCATCTTCTCCACGTCATATCTGCAAAGCGGAGTACCTTCCCGGTTTAGTGGGTCTGGGTCAGGCACTGACTTCACCCTGACCATATCCAGCCTTCAACCGGAAGATTTCGCGACCTACTACTGTCAGCAGTACAGCAACTATCCTCTGACTTTTGGACAGGGCACTAAGGTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
[0155] [SEQ ID NO：17]
[0156] 在本发明范围内也包括以下内容：
[0157] (a)本发明的第三个方面提供了载体(诸如表达载体)，其包含根据本发明的第二个方面的核酸分子；
[0158] (b)本发明的第四个方面提供了宿主细胞(诸如哺乳动物细胞，例如人细胞)，其包含根据本发明的第二个方面的核酸分子或根据本发明的第三个方面的载体；和
[0159] (c)本发明的第五个方面提供了制备根据本发明的第一个方面的抗体多肽的方法，所述方法包括在表达所述多肽的条件下培养根据本发明的第四个方面的宿主细胞的群体，并且从其分离所述多肽。
[0160] 本发明的第六个方面提供了一种药物组合物，其包含药学有效量的本发明的第一个方面的抗体多肽和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
[0161] 在所述药物组合物中还可以包含另外的化合物，包括螯合剂诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。
[0162] 可以以本领域已知的方式制备药物组合物，其是足够贮存稳定的，并且适合用于施用给人类和动物。例如，可以将药物组合物低压冻干，例如，通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却，或者通过使用从超临界颗粒形成的颗粒形成。
[0163] 通过“药学上可接受的”，我们意指不降低本发明的药剂的激肽释放酶蛋白质结合活性的有效性的无毒材料。这样的药学上可接受的缓冲剂、载体或赋形剂是本领域众所周知的(参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R Gennaro，编，Mack Publishing Company(1990)和Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe，编，Pharmaceutical Press(2000)，其公开内容通过引用并入本文)。
[0164] 术语“缓冲剂”意图指以稳定化pH为目的的含有酸-碱混合物的水性溶液。缓冲剂的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲基胂酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
[0166] 术语“佐剂”意图指加入制剂中以增加本发明的药剂的生物学效应的任何化合物。佐剂可以是下列一种或多种：具有不同阴离子的锌、铜或银盐，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、和不同酰基组成的乙酸盐。佐剂也可以是阳离子聚合物，诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰化的透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物诸如聚(乙烯基咪唑)、和阳离子多肽(诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸)、和含有这些氨基酸的肽。
[0167] 赋形剂可以是下列一种或多种：碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质。碳水化合物的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和环糊精，其加入所述组合物，例如用于促进冷冻干燥。聚合物的例子是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、鹿角菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同程度水解的聚乙酸乙烯酯、和聚乙烯吡咯烷酮(都具有不同分子量)，其加入所述组合物，例如用于粘度控制、用于实现生物粘着、或者用于保护脂质免于化学降解和蛋白水解性降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(都具有不同的酰基链长度和饱和度)、蛋卵磷脂，大豆卵磷脂、氢化的蛋和大豆卵磷脂，它们为了与聚合物的那些原因相似的原因而加入组合物中。矿物质的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其加入组合物以获得益处，诸如液体积累的减少或有利的色素特性。
[0168] 可以将本发明的抗体多肽配制成本领域中已知的任何类型的药物组合物以适合于其递送。
[0169] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以呈脂质体形式，其中除了其它药学上可接受的载体外，将所述抗体多肽与两亲性药剂诸如脂质组合，所述脂质以聚集形式如胶束、不溶性单层和液晶存在。适用于脂质体制剂的脂质包括、但不限于，甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质也包括在极性首基中通过聚(乙二醇)修饰的上述脂质以延长血流循环时间。这样的脂质体制剂的制备可以参见例如US 4,235,871，其公开内容通过引用并入本文。
[0170] 本发明的药物组合物也可以呈可生物降解的微球的形式。脂肪族聚酯诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(羟乙酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)和聚酸酐已经在微球的生产中广泛用作可生物降解的聚合物。这样的微球的制备可以参见US 5,851,451和in EP 0 213 303，其公开内容通过引用并入本文。
[0171] 在另一个实施方案中，以聚合物凝胶形式提供本发明的药物组合物，其中使用聚合物诸如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、鹿角菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同程度水解的聚乙酸乙烯酯、和聚乙烯吡咯烷酮来增稠含有所述药剂的溶液。所述聚合物也可以包含明胶或胶原。
[0172] 可替换地，可以将抗体多肽简单地溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲剂中。
[0173] 应当理解，本发明的药物组合物可以包括离子和限定的pH以增强活性抗体多肽的作用。另外，可以对所述组合物进行常规制药操作诸如灭菌和/或可以含有常规佐剂诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等。
[0174] 通过本领域技术人员已知的任何合适的途径，可以施用根据本发明的药物组合物。因而，可能的施用途径包括胃肠外(静脉内、皮下和肌肉内)、局部、眼、鼻、肺、含服、口服、胃肠外和直肠。从植入物施用也是可能的。因为施用的药剂的潜在高细胞毒性，输注可以是期望的途径。
[0175] 在一个实施方案中，胃肠外地，例如，静脉内地、脑室内地、关节内地、动脉内地、腹膜内地、鞘内地、心室内地、胸骨内地、颅内地、肌肉内地或皮下地，施用所述药物组合物，或者可以通过输注技术施用它们。以无菌水溶液的形式方便地使用它们，所述无菌水溶液可以含有其它物质，例如足以使溶液与血液等张的盐或葡萄糖。如果必要的话，应当适当地缓冲水溶液(例如至3-9的pH)。通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术，容易地实现合适的胃肠外制剂在无菌条件下的制备。
[0176] 适合用于胃肠外施用的制剂包括：水性的和非水性的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与目标受体的血液等张的溶质；和水性的和非水性的无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多次剂量容器(例如密封的安瓿和管形瓶)中，并且可以在冷冻干燥(低压冻干)条件下贮存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体(例如注射用水)。可以从前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备即时注射溶液和混悬液。
[0177] 因而，本发明的药物组合物特别适合于胃肠外(例如静脉内)施用或者局部施用至患者中的肿瘤(例如肿瘤内地或肿瘤周地)。
[0178] 将所述药物组合物以药学有效剂量(即治疗性放射性核素的治疗上有效的吸收剂量)施用给患者。
[0179] 在本发明的抗体多肽的治疗用途的背景下，本文中使用的“药学有效量”或“有效量”或“治疗上有效的”表示对于给定的病症和施用方案提供治疗效果的量。这是活性物质的预先确定的量，其经计算以与需要的添加剂和稀释剂(即载体或施用媒介物)结合产生期望的治疗效果。此外，它意图指足以减少和/或防止宿主的活性、功能和应答的临床显著缺乏的量。可替换地，治疗有效量足以造成宿主中临床上显著的病症的改善。如本领域技术人员领会的，化合物的量可以随其比活性而变化。合适的剂量量可以含有预先确定的量的活性组合物，其经计算以与需要的稀释剂结合产生期望的治疗效果。在用于制备本发明的组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。基于患者特征，诸如年龄、重量、性别、病症、并发症、其它疾病等，治疗有效量可以由普通技术医学工作人员确定，如本领域众所周知的(见下文实施例6)。可以如下实施药学有效剂量的施用：以单个剂量单位或者几个更小剂量单位的形式单次施用，以及以特定间隔多次施用细分剂量。可替换地，可以在延长的时段里作为连续输注提供剂量。
[0180] 在本发明的抗体多肽的诊断用途的背景下，本文中使用的“药学有效量”或“有效量”或“诊断上有效的”表示为体内成像目的提供可检测信号的量。
[0181] 根据使用的化合物的效力/毒性，可以以各种浓度配制本发明的抗体多肽。所述制剂可以包含0.1μM和1mM之间、1μM和500μM之间、500μM和1mM之间、300μM和700μM之间、1μM和100μM之间、100μM和200μM之间、200μM和300μM之间、300μM和400μM之间、400μM和500μM之间和约500μM的浓度的多肽。
[0182] 通常，人患者中的抗体多肽(具有或没有治疗性部分)的治疗剂量会在每次施用100μg至700mg的范围内(基于70kg的体重)。例如，最大治疗剂量可以在每次施用0.1-10mg/kg的范围内，例如0.1和5mg/kg之间或1-5mg/kg之间或0.1和2mg/kg之间。应当理解，可以以不同间隔施用这样的剂量，如由肿瘤科医生/医师确定的；例如，可以每天、每周两次、每周、每两周或每月施用剂量。
[0183] 本领域技术人员将理解，可以如下施用本发明的药物组合物：单独地或与用于治疗前列腺癌的其它治疗剂组合地，或者在用用于治疗前列腺癌的其它治疗形式诸如其它治疗性抗体、外科手术(例如，根治性前列腺切除术)、放射性核素疗法、近距离放射疗法、外线束放射疗法、高强度聚焦超声(HIFU)、化学疗法、口服化疗药物、冷冻外科手术(冷冻肿瘤)、激素疗法(诸如抗雄激素疗法)、去势或前述的组合治疗患者之前、之后或同时。
[0185] 本发明的第八个方面提供了根据本发明的第一个方面的抗体多肽，其用于用在药物中。
[0186] 本发明的第九个方面提供了根据本发明的第一个方面的抗体多肽，其用于用在前列腺癌的治疗和/或诊断中。
[0187] 本发明的第十个方面提供了治疗受试者中的前列腺癌的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的第一个方面的抗体多肽。
[0188] 通过“治疗/处理”，我们包括患者的治疗性和预防性处理。术语“预防性的”用于涵盖如本文中所述的药剂或其制剂的应用，其防止或降低前列腺癌的可能性，或者防止或降低患者或受试者中的局限性前列腺癌的扩散、播散或转移。术语“预防性的”还涵盖如本文中所述的药剂或其制剂的应用，以防止先前已经治疗前列腺癌的患者中的前列腺癌复发。
[0189] 本发明的第十一个方面提供了诊断受试者中的前列腺癌的方法，所述方法包括给所述受试者施用诊断有效量的根据本发明的第一个方面的抗体多肽。
[0190] 通过“诊断”，我们包括在体内(即在患者身体内)或离体(即在从患者的身体取出的组织或细胞样品内)的前列腺癌细胞的检测。
[0191] 要治疗或诊断的前列腺癌可以局限于前列腺，或者可以是非局限性的(也就是说弥散性的)前列腺癌。根据TNM系统(从肿瘤/结节/转移灶缩写)，例如可以将局限于前列腺的前列腺癌分类为临床T1或T2癌症，而例如可以将非局限性/弥散性前列腺癌分类为临床T3或T4癌症。
[0192] 要治疗或诊断的前列腺癌可以是转移性前列腺癌。转移表示癌症从其初始位置扩散到身体中的其它部位。例如，要治疗或诊断的转移性前列腺癌可以是存在于淋巴系统中、骨(包括脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)中的转移灶；在骨盆、直肠、膀胱、或尿道内的转移灶。也可以用本发明治疗在其它不太常见的位置处存在的转移灶。所述转移灶可以是微转移灶。微转移灶是转移灶的一种形式，其中新形成的肿瘤通常因为太小而不能检出，或者难以检出。例如，本发明给技术人员提供了治疗单个癌细胞或细胞簇的手段，即使这样的细胞或簇的存在不可能诊断，但是例如作为隐性弥散性疾病存在。
[0194] 因而，在一个实施方案中，本发明提供了用于预防或治疗原发性前列腺肿瘤的转移的抗体多肽和方法。
[0195] 前列腺癌趋向于在超过年龄50岁的男性中、更通常在超过60、65或70岁的男性中发生，并且尽管它是男性中的最普遍的癌症类型之一，但是许多人从未具有症状，没有经历治疗，并且最终死于其它原因。这是因为前列腺癌在大多数情况下是缓慢生长的、无症状的，并且由于具有该病症的男性是年长的，他们经常死于与前列腺癌无关的原因，诸如心脏/循环系统疾病、肺炎、其它无关联的癌症、或老龄。约三分之二的前列腺癌病例是缓慢生长的，另外三分之一是更具侵袭性的并且快速发展。
[0196] 因此，用于治疗和诊断前列腺癌的有效方法的开发对于管理更具侵袭性且快速发展的癌症形式(特别是在较年轻的患者中)是特别重要的。因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗或诊断患者中的前列腺癌，所述患者在诊断前列腺癌时和/或在治疗时小于90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40岁或更小。
[0197] 与没有家族史的男性相比，具有一名患有前列腺癌的一级亲属(父亲或兄弟)的男性被认为具有两倍的发生前列腺癌的风险，并且具有两名受影响的一级亲属的男性被认为具有大5倍的风险。因而，本发明可以涉及治疗或诊断患者中的前列腺癌，所述患者的特征在于，1名、2名或更多的家庭成员、特别是一级家庭成员(诸如父亲或兄弟)先前已经诊断出前列腺癌。
[0198] 本发明还涉及治疗或诊断患者中的前列腺癌，其中要治疗的前列腺癌具有去势抗性前列腺癌(CRPC)。CRPC可以特征在于，通常在1至3年后变成激素治疗难治的，并且尽管有激素疗法仍恢复生长。
[0199] 在本发明的医学用途和方法中，通常将所述抗体多肽注射或输注进患者的身体中。在体内，所述抗体多肽然后结合至生成靶抗原PSA的组织；主要是前列腺癌细胞及其转移灶。在结合后，所述抗体多肽可以直接施加治疗效果(例如经由ADCC、CDC或者通过携带放射性同位素或其它细胞毒性部分而诱导细胞死亡)。可替换地，结合的抗体多肽可以充当诊断(成像)工具，其可以引导疗法的选择或者辅助癌细胞的外科手术除去。
[0200] 本领域技术人员将理解，可以将本发明的抗体多肽与其它治疗剂和/或诊断剂/处理(诸如外部放射疗法、外科手术、细胞抑制剂和雄激素处理)组合使用。
[0201] 前述描述聚焦于适用于前列腺癌的治疗和诊断方法的本发明的实施方案。但是，应当理解，本发明不限于这样的应用，而是可以用于手术后检查、和在放射、细胞抑制剂和雄激素治疗期间或之后的检查。
[0202] 在另一个实施方案中，可以在外科手术期间和/或之前使用放射引导外科手术(RGS)或图像引导外科手术(IGS)鉴定经示踪剂标记的本发明的抗体多肽。因而，可以在外科手术期间和/或之前施用包含如上文讨论的可检测部分的抗体多肽。在该实施方案中，可以首先输注抗体多肽。此后，可以在外科手术期间或之前使用RGS/IGS来用对可检测部分敏感的检测仪鉴定产生PSA的组织。例如，所述可检测部分可以是放射发射部分或磁敏感性可检测部分；例如，它可以是Cerenkov放射和/或轫致放射(Bremsstrahlung)的发射体；它可以是荧光标记物和/或磁性或可磁化标记物。因而，根据本发明的RGS/IGS可以例如是基于以下的方法：光学、Cerenkov、轫致放射、或β放射的检测；放射性核素标记物的检测，和/或可以涉及磁力测定。RGS作为外科手术技术是本领域技术人员众所周知的，所述外科手术技术使外科医生能够鉴定被可检测部分“标记”的组织。
[0204] 因此，在另一个方面，本发明还提供了用于用在药物中的抗体多肽，所述药物在外科手术(诸如放射引导的或图像引导的外科手术)之前或期间施用给前列腺癌患者。
[0205] 本发明的又一个方面提供了用于检测受试者的血液中的前列腺肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括：
[0206] (a)提供来自要测试的受试者的血液样品；
[0207] (b)任选地，提取和/或纯化存在于所述血液样品中的细胞；
[0208] (c)使根据本发明的第一个方面的抗体多肽与存在于所述血液样品中的细胞接触；
[0209] (d)确定(直接地或间接地)所述抗体多肽是否结合游离的(即未复合的)PSA，
[0210] 其中所述抗体多肽与游离PSA的结合指示前列腺肿瘤细胞在受试者血液中的存在。
[0211] 因而，所述方法包括实施测定法以确定所述血液样品是否含有游离PSA；游离PSA的存在指示前列腺肿瘤细胞在受试者血液中的存在。
[0212] 本领域技术人员会明白，有多种实施这样的测定法的方式。例如，免疫测定法可以是同质的，或更优选地是异质的。也可以以竞争形式或更优选地非竞争形式实施测定法。
[0213] 在异质的非竞争性测定法的情况下，一个示例性的方案可以是：
[0214] (a)提供来自要测试的受试者的血液样品；
[0215] (b)任选地，提取和/或纯化存在于所述血液样品中的细胞；
[0216] (c)使固相固定化的根据本发明的第一个方面的抗体多肽与存在于血液样品中的细胞接触；
[0217] (d)洗涤以除去可溶性组分(未结合至固体表面)；
[0218] (e)添加示踪剂，即用报告分子/颗粒标记的另一种抗-PSA特异性抗体；
[0219] (f)洗涤以除去未结合的示踪剂抗体；和
[0220] (g)检测来自示踪剂抗体的信号。
[0221] 在步骤b和c、或c和d之间，通常应当存在温育时段以允许细胞生成可溶性PSA，然后使它被检出。
[0222] 本发明的又一个方面提供了用于检测受试者的组织中的前列腺肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括：
[0223] (a)提供来自要测试的受试者的组织样品(诸如组织学样品)；
[0224] (b)任选地，提取和/或纯化存在于所述组织样品中的细胞；
[0225] (c)使根据本发明的第一个方面的抗体多肽与存在于所述组织样品中的细胞接触；
[0226] (d)确定(直接地或间接地)所述抗体多肽是否结合游离的(即未复合的)PSA，
[0227] 其中所述抗体多肽与游离PSA的结合指示前列腺肿瘤细胞在受试者组织中的存在。
[0228] 在上述体外方法的一个实施方案中，通过ELISA实施步骤(d)。但是，可以使用适合用于体外检测抗体-抗原相互作用的任何测定法。
[0229] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括定量所述样品中的前列腺肿瘤细胞。
[0230] 在上述体外方法的另一个实施方案中，所述方法用于诊断受试者中的前列腺癌。
[0231] 在权利要求书和/或说明书中，术语“一个”或”一种”当与术语“包含”结合使用时可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或一个/种以上”的含义一致。
[0232] 当结合上述描述和附图考虑时，会更好地领会并理解本发明的这些和其它实施方案。但是，应当理解，上述描述尽管指示本发明的多个实施方案及其众多具体细节，但是作为示例而非限制给出。在本发明的范围内在不偏离其精神的前提下可以做出许多置换、修改、添加和/或重排，并且本发明包括所有这样的置换、修改、添加和/或重排。
[0233] 以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
[0234] 图1：直到111In-DTPA-h5A10注射后7天扫描的LNCaP异种移植物的代表性SPECT/CT图像。
[0235] 图2：直到111In-DTPA-m5A10注射后7天扫描的LNCaP异种移植物的代表性SPECT/CT图像。
[0236] 图3：在LNCaP异种移植物小鼠中m5A10和h5A10的肿瘤与对侧比率的分析。
[0237] 图4：在LNCaP异种移植物小鼠中m5A10和h5A10的肝与肿瘤比率的分析。
[0238] 图5：在LNCaP异种移植物小鼠中111In-DTPA-m5A10和111In-DTPA-h5A10的生物分布分析。
[0239] 包括以下实施例以证实本发明的特定实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下实施例中公开的技术代表由发明人发现在本发明的实施中较好地起作用的技术，并且因而可以被认为构成用于其实施的具体模式。但是，本领域技术人员考虑到本公开内容以后应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。实施例
[0240] 实施例1-向FAb形式克隆鼠5A10单克隆抗体
[0241] 试剂
[0242] 限制性酶来自Fermentas和Promega，碱性磷酸酶来自Amersham Pharmacia Biotech，且dNTP’s和T4DNA连接酶来自Fermentas。引物来自University of Turku，
Department of Biotechnology和来自Eurogentec。将Qiagen试剂盒用于DNA纯化。
Department of Biotechnology和来自Eurogentec。将Qiagen试剂盒用于DNA纯化。
[0243] mRNA提取和cDNA合成
[0244] 根据生产商在“Biomagnetic Techniques in Molecular Biology：Technical handbook”(DynalA.S，第2版，1995)中描述的操作，用Dynal聚-dT磁珠从产生5A10MAb的杂交瘤细胞(2E6细胞；Lilja等人，1991)提取mRNA。用Super Script酶(Gibco BRL)实施从mRNA合成cDNA：首先，将与mRNA结合的磁性颗粒在含有1x反应缓冲液、0.1M DTT、2mM dNTP’s和RNA酶抑制剂的反应物中(1.5μl在50μl总反应物体积)在42℃温育2min。然后，加入1μl Super Script(200U)，并使反应在42℃进行1小时。cDNA合成以后，将颗粒和反应混合物通过磁性颗粒收集器分离，将液体除去，并将颗粒悬浮于TE缓冲液中和在95℃温育1min以释放mRNA。温育以后，收集颗粒结合的cDNA，将含有mRNA的缓冲液除去，将颗粒用TE洗涤并最后悬浮于50μl TE中进行贮存。
[0245] 从cDNA扩增抗体基因和克隆
[0246] 在University of Turku，Center of Biotechnology测序服务中通过Edman降解方法确定轻链和重链的N-端氨基酸序列。从轻链和重链得到的序列分别是DIVMTQS[SEQ ID NO：18]和EVQLVESG[SEQ ID NO：19]。基于N-端氨基酸序列，实施数据库检索(SwissProt)以鉴定小鼠的免疫球蛋白种系V-基因中的对应核苷酸序列。基于检索来设计正向PCR引物的互补区以克隆重链和轻链。将反向引物设计成分别结合CH1和CL。引物还含有克隆所需的限制性酶识别位点(在以后标有下划线)。
[0247] 在以下条件(除了改变引物和模板以外)进行PCR反应：125μM dNTP’s，0.5μM正向引物和反向引物，1x Pfu反应缓冲液和2.5U Pfu DNA聚合酶(Stratagene)。通过30个95℃30s、55℃1min和72℃1min 30s的循环进行扩增。
[0248] 用下述引物从cDNA扩增轻链：
[0249] ●5A10-L
[0250] (5’-CCAGCCATGGCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCA-3’，NcoI[SEQ ID NO：20])和
[0251] ●WO252(5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’，XbaI[SEQ ID NO：21])。
[0252] 将轻链和含有无关Fab的基因的载体pComb3(Barbas等人，1991)用NcoI和XbaI消化(对于载体，用NcoI部分消化)，从琼脂糖凝胶纯化并连接。将连接产物转化进大肠杆菌XL1-Blue中以得到质粒p5A10-L。
[0253] 用 下 述 引 物 对 扩 增 F d ( V H + C H 1 ) 链 ：5 A 1 0 - H ( 5 ’-CCAGCCATGGCTGAGGTGCAATTGGTGGAGTCTGG-3’，NcoI[SEQ ID NO：22])和WO267(5’-
CTAGACTAGTACAATCCCTGGGCACAATTTTC-3’，SpeI[SEQ ID NO：23])。将Fd链克隆进载体
pComb3中以替换由该载体携带的另一个Fab的Fd基因。将PCR产物和载体用NcoI(对于载体和插入物，用NcoI部分消化)和SpeI(New England Biolabs)消化，从琼脂糖凝胶纯化和连接。将连接产物转化进大肠杆菌XL1-Blue以产生载体p5A10-H。
CTAGACTAGTACAATCCCTGGGCACAATTTTC-3’，SpeI[SEQ ID NO：23])。将Fd链克隆进载体
pComb3中以替换由该载体携带的另一个Fab的Fd基因。将PCR产物和载体用NcoI(对于载体和插入物，用NcoI部分消化)和SpeI(New England Biolabs)消化，从琼脂糖凝胶纯化和连接。将连接产物转化进大肠杆菌XL1-Blue以产生载体p5A10-H。
[0254] 将5A10轻链用SpeI和XbaI从质粒p5A10-L消化，并在凝胶纯化以后，与凝胶纯化的也用对应酶消化的质粒p5A10-H连接。将连接产物转化进大肠杆菌XL1-Blue以得到含有Fab 5A10的轻链和Fd链的质粒pComb3-5A10。为了除去与Fd链融合的噬菌体外壳蛋白基因
gIIIp，将pComb3-5A10用SpeI和NheI进一步消化，自我连接并转化进大肠杆菌XL1-Blue中。
质粒pComb3-5A10DIII实现可溶性的功能性Fab 5A10的表达。
gIIIp，将pComb3-5A10用SpeI和NheI进一步消化，自我连接并转化进大肠杆菌XL1-Blue中。
质粒pComb3-5A10DIII实现可溶性的功能性Fab 5A10的表达。
[0255] 参考文献
[0256] Barbas CF 3rd，Kang AS，Lerner RA，Benkovic SJ.(1991)Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces：The gene III
site.Proc.Nat.Acad.Sci.，第88卷，第7978-7982页
site.Proc.Nat.Acad.Sci.，第88卷，第7978-7982页
[0257] Biomagnetic Techniques in Molecular Biology：Technical handbook.Dynal A.S，第2版，1995
[0258] Lilja H，Christensson A，Dahlén U，Matikainen MT，Nilsson O，Pettersson K，T.(1991)Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin.Clin Chem.37(9)：1618-25
[0259] 实施例2-人源化5A10抗体的表达和纯化
[0260] 将HEK293细胞扩增进在FreeStyle 293表达培养基(Life Technologies)中的2L悬浮培养物中。在转染当天，细胞密度是1x 106个细胞/ml。
[0261] 为了在哺乳动物细胞中表达，将编码组分重链或轻链的核苷酸序列(即分别SEQ ID NO：16和17)进行密码子优化，合成，并克隆至IgG表达载体。然后，将含有重链和轻链的核苷酸序列的质粒DNA(表达载体)与转染剂混合，并且在RT温育10分钟。在缓慢涡旋烧瓶的同时，将DNA-转染剂-混合物缓慢地加入细胞培养物。然后，在37℃、8％CO2在以约135rpm旋转的定轨摇床平台上将经转染的细胞培养物温育7天。
[0264] 通过吸收测量浓度。
[0265] DNA：
[0266] 轻链：p5A10VLhDhk(4300bp)量：0.35mg
[0267] 重链：p5A10VHhDhIgG1(4900bp)量：0.60mg
[0268] 没有优化DNA量。
[0269] 转染剂：专有的(但是，合适的商业可得到的转染剂是容易得到的，诸如XfectTM转染试剂(Clontech)，Lipofectamine(Life Technologies)， HD转染试剂(Promega)，FreeStyleTMMax试剂(Invitrogen)，DEAE-葡聚糖，聚乙烯亚胺和磷酸钙)。
[0270] 总收率：15mg(7.5mg/L)。
[0271] 实施例3-h5A10的表征：亲和力
[0272] 研究的目的
[0274] 为了研究蛋白样品(抗体和抗原)的质量，在SPR实验之前运行SDS-PAGE凝胶。
[0275] 在预研究中，研究不同参数以发现对于研究中的实验而言适当的条件。
[0276] 在研究中，对8种抗体和抗原实施多次结合测量。从收集的数据，计算结合和解离速率常数(kon和koff)和解离常数(KD)，并且在本文中报告。
[0277] 试剂和仪器信息
[0278] 8种抗体和1种抗原的以下溶液由DiaprostAB提供：
[0279] ●PSA 169μg/ml
[0280] ●m5A10(141203)1mg/ml
[0281] ●m5A10(140905)4μM
[0282] ●m5A10-DFO(140905)4μM
[0283] ●m5A10-DOTA(140905)4μM
[0284] ●m5A10-DTPA(140905)4μM
[0285] ●h5A10(141203)1mg/ml
[0286] ●h5A10-DFO(141203)2mg/ml
[0287] ●h5A10-DTPA(141203)1mg/ml
[0288] ●h5A10-DOTA(141211)2.5μM
[0289] 将所有样品等分取样，并且在分析前保持在-20℃冰柜中。
[0290] 在Biacore 3000仪器上在CM4芯片上实施所有结合实验。芯片和用于活化、固定化、灭活、结合和再生需要的所有试剂购自GE Healthcare，并且根据来自生产商的指南使用。
[0291] SDS-PAGE
[0292] (a)实验的描述
[0293] 根据生产商的指南在来自Novex的TRIS-Tricine 10-20％丙烯酰胺凝胶上运行由DiaprostAB提供的试剂。
[0294] 与标准样品一起在相同凝胶上同时运行两个系列的蛋白样品(天然的和还原的)。
[0295] 天然系列中的每个样品含有：1-1.3μg蛋白、TRIS缓冲液pH7.4、SDS和加载缓冲液。
[0296] 还原系列中的每个样品含有：1-1.3μg蛋白、TRIS缓冲液pH7.4、SDS、加载缓冲液和0.04％v/vβ2-巯基乙醇(还原剂)。
[0298] 在具有0.7、3.0、6.3的相应比例的乙酸、乙醇和水的溶液中实施凝胶的脱色。
[0299] (b)结果和结论
[0300] 从这些结果显而易见，抗体和抗原样品具有高质量和纯度(结果未显示)。
[0301] 亲和力研究
[0302] (a)为了确定相互作用的亲和力，使用下述条件实施两个实验。
[0303] 将抗原固定化在CM4芯片上.
[0304] 根据生产商关于胺偶联的指南，使用EDC和NHS混合物实施芯片CM4-1的活化。
[0305] 使含有3.00μg/ml的抗原PSA的溶液(在10mM NaAc-缓冲液pH3.8中稀释的PSA的储备溶液)在芯片CM4-1上的通道fc2-4上流过，以便将抗原固定化至芯片。流速：5μl/min，体积：200μl。
[0306] 靶RU≤Mw/10Mw(PSA)＝30 000Da靶RU(PSA)≤3000
[0307] 将通道fc1用作空白。
[0308] 在第一个实验中实现以下固定化：
[0309] fc2＝1450RU fc3＝850RU fc4＝900RU
[0310] 在第二个实验中实现以下固定化：
[0311] fc2＝1325RU fc3＝890RU fc4＝1060RU
[0312] 在活化和固定化以后通过乙醇胺封闭所有通道(fc1-4)。
[0313] 这些数据证实，使用3.00μg/ml的抗原实现了适当的固定化。
[0314] (b)结合阶段的研究
[0315] 当使每种抗体的4种不同浓度的溶液(在HSP缓冲液中稀释的储备溶液)在芯片CM4-1上的通道fc2-4上以30μl/min的速率流过时，跟踪8种抗体与芯片CM4-1的结合阶段5分钟。
[0316] 每种抗体的研究浓度是：100、50、25和12.5nM。
[0317] 另外，从实验获得结合数据，其中跟踪解离过程8小时。
[0318] 总共，实施针对每种抗体的3-9个单独结合实验。
[0319] 对于所有数据，扣除来自空白fc1的信号。
[0320] 我们发现在5分钟以后，我们能够拟合关于结合过程的数据。
[0321] (c)解离阶段的研究
[0322] 对于每种抗体，跟踪解离阶段8小时。
[0323] 在用于计算解离速率常数的所有数据中，扣除来自空白fc1的信号。
[0324] 数据指示，解离过程是非常缓慢的。
[0325] (d)解离速率常数(koff)的估计
[0326] 拟合解离阶段数据，并且估计解离速率常数(koff)(参见表1)。
[0327] (e)结合速率常数(kon)的估计
[0328] 为了估计结合速率常数，在拟合方程式中使用解离速率常数(表1)。
[0329] (f)解离常数(kD)的估计
[0330] 每种试验的抗体的解离常数(KD)显示在表1中。
[0331] 表1
[0332]
[0333]
[0334] 对于所有8种抗体，解离常数(KD)是在10-11M范围内。
[0335] 尽管不是统计上显著的，人源化抗体的解离常数似乎高于亲本鼠抗体的解离常数。
[0336] 由于KD没有显著变化，人源化抗体的缀合似乎不会显著地影响亲和力。
[0337] 总结
[0338] ●对于所有抗体，结合过程是非常快的，并且基于每种抗体的3-9个实验，结合速率常数(kon)都是在105M-1s-1范围内。
[0339] ●解离过程是非常缓慢的，并且几乎在Biacore的技术限度的范围内。基于每种抗体的3-9个实验，解离速率常数(koff)都是在10-6s-1范围内。
[0340] ●对于所有抗体，解离常数(KD)是在10-11M范围内。
[0341] 实施例4-h5A10的表征：聚集
[0342] 执行总结
[0343] 已经对IgG的6种变体实施动态光散射(DLS)研究以便研究它们的聚集倾向。DLS结果表明，所有构建体都具有合理的大小(假设球形蛋白，200kDa或稍微高于200kDa)，且几乎没有或根本没有聚集。
[0344] 目的
[0345] 为了使用动态光散射就寡聚状态而言表征6种IgG构建体。
[0346] 结果
[0347] 动态光散射
[0348] 使用Malvern Zetasizer APS设备在20℃在一式两份样品中测量动态光散射。对每个样品测量3次。使用HBS-EP缓冲液(来自客户)作为对照以确保所述缓冲液合理地不含尘埃和聚集体。没有做出HBS-EP缓冲液中的聚集体的可靠测量，这是好的，因为所述缓冲液应当不含有聚集体。可以使用数量分布函数可靠地测量所有样品。计算最丰富的种类的平均半径以及该种类的多分散性。还计算此种类的平均质量分布，参见表2。
[0349] 表2
[0350] 源自尺寸分布的动态光散射数据
[0351]
[0352] 多分散性＝半径的标准差/平均半径x100％
[0353] 对于具有完美球形形状的蛋白，5.7nm的半径对应于约200kDa的分子量。对于具有完美球形形状的蛋白，6.1nm的半径对应于约230kDa的分子量。这合理地接近于IgG分子的150kDa分子量，这意味着大多数样品主要由单体和/或二聚体IgG分子组成。不排除二聚体的原因是，基于分子形状，光散射给出大致的大小估计，并且这使得难以分离单体和二聚体，但是容易将大聚集体与单体分离。在所有小鼠IgG样品中发现了低于1kDa的小颗粒。这些颗粒已经在表1中忽略，因为假定它们属于在缓冲液中发现的组分(由于它们的小尺寸)。
相反，在所有人IgG中发现了小比例的较大聚集体，但是在小鼠IgG中没有发现。
相反，在所有人IgG中发现了小比例的较大聚集体，但是在小鼠IgG中没有发现。
[0354] 结论
[0355] 动态光散射表明，所有构建体具有合理的大小和几乎没有或根本没有聚集。所有6种构建体的尺寸分布是重叠的。令人惊讶地，在所有小鼠IgG样品中发现了缓冲液样颗粒(＜1kDa)，而仅在人IgG样品中发现了较大聚集体。
[0356] 实施例5-h5A10的表征：体内生物分布
[0357] 该研究对比了当用111In标记时鼠5A10和人5A10的体内生物分布。
[0358] 材料和方法
[0359] 如下所述生产人源化的副本抗体h5A10。
[0360] ·抗体：由Innovagen AB，Lund(批号90475.33，浓度1.0mg/ml在PBS中，pH7.4)提供示例性的人源化单克隆抗体5A10(IgG1/κ，在HEK 293细胞中短暂表达；参见实施例2)，其包含根据SEQ ID NO：12的重链和根据SEQ ID NO：13的轻链。将非特异性的IgG抗体用作同种型对照(来自小鼠血清的IgG抗体，Sigma I-8765)。
[0361] 缀合和放射性标记
[0362] CHX-A”-DTPA与5A10的缀合：使用0.07M硼酸钠缓冲液(Sigma Aldrich)将鼠和人源化的5A10mAb在PBS或NaCl中的溶液调至pH 9.2。然后将蛋白溶液与螯合剂CHX-A”-DTPA(Macrocyclics，USA)在40℃以3∶1的螯合剂：抗体摩尔比缀合4h。将反应终止，并将CHX-A”-DTPA-11B6(DTPA-11B6)通过NAP-5柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱法从游离螯合物分离，用20ml 0.2M乙酸铵缓冲液pH5.5平衡。将缀合的5A10抗体用1ml乙酸铵缓冲液洗脱，并将200uL的等分样品在-20℃储存。
[0363] DTPA-5A10的放射性标记：将在乙酸铵缓冲液pH5.5中的鼠和人源化的DTPA-5A10与预定量的111InCl3(Mallinkrodt Medical，Dublin，爱尔兰)混合。在室温温育2h以后，将标记终止并在用PBS(Thermo Scientific，USA)平衡过的NAP-5柱上纯化。通过用0.2M柠檬酸(Sigma Aldrich)洗脱的快速薄层色谱法(ITLC)(Biodex，Shirley，NY，USA)监测标记效率和动力学。在该系统中，放射性标记的缀合物保留在起始线，而游离111In。使用具有Optiquant定量软件的Cyclone Storage Phosphor System(Perkin Elmer；Waltham，MA，USA)确定放射性分布。
[0364] 动物研究
[0365] 对于体内研究，使用表达hK2的前列腺癌细胞系LNCaP(ATCC，Manassas，VA，USA)。将细胞在补充了10％胎牛血清和PEST(青霉素100IU/ml和100μg/ml链霉素)(来自Thermo Scientific)的RPMI 1640培养基(Thermo Scientific)中培养。将细胞在含有5％CO2的保湿培养箱中维持在37℃，并用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶，0.02％EDTA缓冲液，Thermo Scientific)脱离。当异种移植LNCaP细胞时，使用Matrigel基质(BD-Biosciences，San-Jose，California，USA)。
[0366] 根据关于实验动物的保护的国家法律并经过动物研究伦理委员会(Ethics Committee for Animal Research)(Lund University，瑞典)批准，实施所有动物实验。
[0367] 将6-8周龄的雄性免疫缺陷裸鼠NMRI-Nu(Janvier Labs，法国)用于该研究。给所有小鼠在它们的左胁腹皮下异种移植LNCaP细胞(5-6百万个细胞，在100μl生长培养基和100μl Matrigel中)。允许异种移植物生长6-8周。
[0368] SPECT/CT成像研究
[0369] 在111In-DTPA-h5A10和111In-DTPA-m5A10上实施SPECT/CT成像研究。在成像过程中，将动物用2％至3％异氟烷气体(Baxter；Deerfield，IL，USA)麻醉。给具有皮下LNCaP异种移植物的NMRI-nu小鼠在尾静脉中静脉内地注射111In-DTPA-h5A10(n＝4)或111In-DTPA-h5A10(n＝4)(大约13-15MBq，50ug mAb在100uL PBS中)。使用具有NSP-106多针孔小鼠瞄准仪的临床前SPECT/CT扫描仪(NanoSPECT/CT Plus，Bioscan；Washington，DC，USA)将动物成像1h。在注射后1、2、3和7天实施成像。使用HiSPECT软件(SciVis；Goettingen，德国)重构SPECT数据。在每个全身SPECT之前进行CT成像。使用InVivoScope 2.0软件(inviCRO；Boston，MA，USA)分析SPECT/CT图像，并使用CT图像作为解剖学参照来绘制目标区域ROI。
[0370] 生物分布研究
[0371] 在111In-DTPA-h5A10和111In-DTPA-m5A10上实施生物分布研究。给小鼠的动物组(n＝12)静脉内地注射111In-DTPA-h5A10(大约3-4MBq，50ug mAb在100uL PBS中)或111In-DTPA-m5A10(3-4MBq，50ug mAb在100uL PBS中)。在注射后7天将动物处死，并将目标器官收集和用具有3-英寸NaI(T1)检测器(1480WIZARD，Wallac Oy，Turku，芬兰)的自动化NaI(T1)井式计数器分析。
[0372] 如下计算组织摄取值，将其表达为每克组织的注射剂量百分比(％IA/g)：％IA/g＝(组织放射性/注射的放射性)/器官重量x 100
[0373] 其中对于静脉内注射：
[0374] 注射的放射性＝在注射器中的放射性
[0375] -在使用的注射器中剩余的放射性
[0376] -在微巴中的放射性
[0377] 还在解剖后将器官称重。针对背景和自然衰变校正数据。
[0378] 结果
[0379] SPECT/CT成像
[0380] 直到111In-DTPA-h5A10和111In-DTPA-m5A10注射后7天扫描的LNCaP异种移植物的代表性SPECT/CT图像显示在图1和2中。所述活性在24小时之前在LNCaP肿瘤中快速地积累，并且放射性在注射后7天保持较高。还在肝中检测到高活性积累。ROI分析表明，对侧腿的肿瘤与软组织比率在注射后7天为5.2±0.84(对于111In-DTPA-m5A10)和6.4±1.3(对于111In-DTPA-h5A10)。
[0381] 生物分布
[0382] 为了更彻底地研究在不同器官中的活性积累，在较大数目的动物(n＝12/抗体)中实施离体生物分布。
[0383] 111In-DTPA-m5A10和111In-DTPA-h5A10随时间的肿瘤与对侧比率显示在图3中。意外地，观察到该比率对于人源化抗体而言显著高于‘亲本’鼠抗体。
[0384] 111In-DTPA-m5A10和111In-DTPA-h5A10随时间的肿瘤与肝比率显示在图4中。再次意外地，观察到该比率对于人源化抗体而言显著高于‘亲本’鼠抗体。
[0385] 111In-DTPA-m5A10和111In-DTPA-h5A10的生物分布数据显示在图5中。
[0386] 鼠和人源化的5A10在具有LNCaP异种移植物的NMRI小鼠中的生物分布表明在7天时的高肿瘤积累，而在其它器官(诸如骨、肌肉)中的积累低得多。
[0387] 人源化的111In-DTPA-h5A10的生物分布数据与亲本鼠抗体(111In-DTPA-m5A10)的生物分布数据的对比揭示意外的且有利的差异。人源化抗体的肿瘤积累比鼠抗体显著高得多，在注射后7天h5A10为7.4±1.4％IA/g，与此相比，m5A10为2.7±0.75％IA/g(p＜0.001)(图6)。对于两种抗体，在其它器官中的放射性积累是大约相同水平，从而使得人源化的h5A10的肿瘤与器官比率比亲本鼠m5A10高得多(表3)。
[0388] 表3
[0389]
[0390]
[0391] 结论和讨论
[0392] 该研究的结果证实了以下内容：
[0393] ●人源化5A10抗体111In-h5A10有效地靶向体内前列腺肿瘤；
[0394] ●人源化h5A10抗体表现出比它的鼠抗体意外地更好的肿瘤积累，和
[0395] ●人源化h5A10抗体提供了比鼠抗体更好的成像反差(如用更高肿瘤与器官比率表明的)。
[0396] 总之，这些发现提供了人源化5A10抗体在前列腺癌的诊断中的更好靶向性能和在前列腺癌的治疗中可能更好的治疗效果的强大证据。
[0397] 实施例6-放射性核素疗法剂量测定法计划和患者中的前列腺癌的治疗
[0399] RNT处理应当基于规定的吸收剂量(2)。然后，首先人们应当使用示踪剂量的放射性药物实施疗法前研究，并且确定肿瘤和器官吸收剂量。通常，将该信息表达为描述每单位施用活性的器官吸收剂量的因素，以mGy/MBq为单位；DPT(器官)。
[0400] 如果然后在相似条件下提供治疗性施用，则可以使用该因素来确定为了将规定的吸收剂量递送至给定器官、组织或肿瘤需要施用的活性(4，6)。
[0401] 在用放射性标记的h5A10抗体的前列腺癌治疗的情况下，疗法前研究应当是基于用111In-h5A10的111In成像。当然后177Lu要是治疗性放射性核素时，111In最适合于定量(平面/SPECT)成像。当然后确定DPT(器官)时，可以给予疗法，其中疗法活性AT提供规定的疗法效果。在疗法期间，应当基于成像来计算活性分布和相应的剂量比率，以得到对于治疗治疗而言必需的给肿瘤和正常器官提供的实际疗法吸收剂量。
[0402] 在由于治疗计划而达到骨髓毒性水平的疗法的情况下，则骨髓支持物是必需的，并且基于骨髓腔的剂量测定法计算，必须确定用于再输注干细胞的时间。
[0403] 总之，应当相应地计划以下治疗方案：
[0404] 疗法前剂量测定法研究
[0405] 1. 111In-标记的h5A10(200-300MBq)注射
[0406] 2.血液取样-在第一周测定的血液和血浆中的活性浓度。
[0407] 3.在至少1周中的成像(SPECT/平面)(3-5次)
[0408] 4.基于LundaDose方案(3)或等同计划的器官剂量测定法
[0409] 5.确定的疗法活性，其受限于对放射敏感器官如骨髓(2-3Gy)、肾(20-30Gy)和肝(12-36Gy)的规定吸收剂量。
[0410] 包括疗法内剂量测定法的疗法
[0411] 1.施用的177Lu-标记的h5A10(基于疗法前剂量测定法)
[0412] 2.血液取样-血液和血浆中的活性浓度
[0413] 3.在至少1周内的成像(3-5次)
[0414] 4.基于LundaDose方案(3)或等同计划的器官剂量测定法＝＞规定的疗法吸收剂量的确认。
[0415] 关于剂量测定法的具体评述
[0416] 累积的活性是在一段时间里在给定区域中发生的衰变的数目。单位是Bq s或Bq h。当电离放射穿过物质移动时，它相互作用并沉积能量。赋予的能量是给定体积中的所有能量沉积物的总和。吸收剂量是赋予的能量和体积质量的比率。吸收剂量的单位是格雷
(Gray)(Gy)，1Gy等于1J/kg。
(Gray)(Gy)，1Gy等于1J/kg。
[0417] 从在不同时间时组织中的活性值，通过积分确定累积的活性，并且可以确定吸收剂量。使用平面成像做出活性测量以用于全器官剂量测定法。定量SPECT/CT允许使用基于体元的方法实现的在较小体积中的剂量测定法。
[0418] 从活性浓度值的3D分布，可以使用所谓的点剂量核或体元S值(其描述位于组织中的点源周围的能量沉积样式)计算吸收的剂量比率分布。该方法假设解剖学区域就密度而言是同质的，诸如躯干内的软组织。对于其中密度为异质的身体区域，如在肺中，直接的Monte Carlo计算是优选的。在这里，使用来自SPECT或PET的活性分布作为Monte Carlo剂量计算代码的输入。
[0419] 参考文献
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Chisea C.，Tennvall J.，Lindén O.，Strand SE，Ljungberg M..Q J Nucl Med Mol
Imaging，2011April；55(2)：126-54.
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