一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物
专利汇可以提供一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物，包括如下步骤：寻找常用工业生产质粒骨架的高度同源序列，以这些高度同源序列为靶标设计qPCR引物；排除在大肠杆菌与人基因组中可能发生非特异扩增的引物，选择扩增 片段 较小的qPCR引物，并保证扩增片段为同源性最高的区域；进行SYBR-Green qPCR实验验证引物，将含该扩增片段质粒的梯度稀释作为标准品，计算引物的扩增效率，线性相关系数，热 融解曲线 ；在转化有含该扩增片段质粒的大肠杆菌样品中进行质粒拷贝数检测。本发明的qPCR引物针对工业生产质粒高度同源区域设计，扩增效率高、定量线性好、特异性好。由于扩增片段仅50bp，可将其用于以质粒DNA为原料生产的产品（如病毒）中质粒DNA残留定量。，下面是一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物专利的具体信息内容。
1.一种通用qPCR质粒定量方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，寻找常用工业生产质粒骨架的高度同源序列，以这些高度同源序列为靶标设计qPCR引物；
步骤2，设计引物时排除在大肠杆菌与人基因组中可能发生非特异扩增的引物，选择扩增片段较小的qPCR引物，并保证扩增片段为同源性最高的区域，即序列完全一致区域；
步骤3，进行SYBR-Green qPCR实验验证引物，将含该扩增片段质粒的梯度稀释作为标准品，计算引物的扩增效率，线性相关系数，热融解曲线；在转化有含该扩增片段质粒的大肠杆菌样品中进行质粒拷贝数检测，根据热融解曲线验证其在大肠杆菌基因组存在时的特异性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述常用工业生产质粒骨架包括常用中、高拷贝质粒骨架pBR322、pUC系列，常用原核表达载体pET系列、pGEX系列，常用克隆载体pGEM系列，常用噬菌体展示载体pBlueScript 系列。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中，设计的引物序列与扩增片段序列如下：
pORI-F：5’-CTCGTGCGCTCTCCTGTTC-3’，如SEQ ID NO:1所示；
pORI-R：5’-GCGGACAGGTATCCGGTAAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
扩增片段序列：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc，如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于,所有包含SEQ ID NO:3所示扩增片段序列的质粒均能使用该通用qPCR质粒定量方法进行定量检测，包括但不限于权利要求2所述的系列质粒及以其为骨架构建的重组质粒。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物的PCR产物为50bp。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法能用于以这些质粒DNA为原料生产的产品中质粒DNA残留定量。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述进行SYBR-Green qPCR实验验证引物具体为采用步骤2设计的引物进行PCR扩增反应，PCR扩增反应程序如下：
步骤1 95℃ 10min；
步骤2 95℃ 15s；
步骤3 60℃ 60s；
步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；
步骤4 95℃ 15s；
步骤5 60℃ 60s；
步骤6 以0.05℃/s的速度升温至95℃，并接收荧光信号。
8.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述进行SYBR-Green qPCR实验验证引物具体为采用步骤2设计的引物进行PCR扩增反应，qPCR反应体系中引物终浓度为
250nM。
9.用于qPCR质粒定量的通用引物，其特征在于，所述通用引物序列为：
pORI-F：5’-CTCGTGCGCTCTCCTGTTC-3’，如SEQ ID NO:1所示；
pORI-R：5’-GCGGACAGGTATCCGGTAAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
其对应的扩增片段序列为：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc，如SEQ ID NO:3所示。
一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物
技术领域
背景技术
发明内容
步骤1，寻找常用工业生产质粒骨架的高度同源序列，以这些高度同源序列为靶标设计qPCR引物；
步骤2，设计引物时排除在大肠杆菌与人基因组中可能发生非特异扩增的引物，选择扩增片段较小的qPCR引物，并保证扩增片段为同源性最高的区域，即序列完全一致区域；
步骤3，进行SYBR-Green qPCR实验验证引物，将含该扩增片段质粒的梯度稀释作为标准品，计算引物的扩增效率，线性相关系数，热融解曲线；在转化有含该扩增片段质粒的大肠杆菌样品中进行质粒拷贝数检测，根据热融解曲线验证其在大肠杆菌基因组存在时的特异性。
pORI-R：5’-GCGGACAGGTATCCGGTAAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
扩增片段序列：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc，如SEQ ID NO:3所示。
步骤2 95℃ 15s；
步骤3 60℃ 60s；
步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；
步骤4 95℃ 15s；
步骤5 60℃ 60s；
步骤6 以0.05℃/s的速度升温至95℃，并接收荧光信号。
pORI-R：5’-GCGGACAGGTATCCGGTAAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；
其对应的扩增片段序列为：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc，如SEQ ID NO:3所示。
具体实施方式
1) 多序列比对寻找共有高度同源序列
选取常用的中、高拷贝质粒骨架pBR322（常用质粒骨架）、pUC18（代表pUC系列质粒，常用质粒骨架）、pET-28-a（代表pET系列质粒，常用原核表达载体）、pGEX-6P-1（代表pGEX系列质粒，常用原核表达载体）、pBlueScript II SK+（代表常用噬菌体展示质粒）、pGEM-T（代表常用克隆载体），以及pColE1（天然质粒，中、高拷贝质粒原始来源），进行多序列比对，各质粒序列信息来源如表1，多序列比对得到高度同源序列见表2（常用质粒高度同源序列，“pColE1RC”与“pGEX-6P-1RC”中“RC”表示反向互补序列），该高度同源区域实际为ORI。
2) 设计通用特异引物
根据多序列比对结果选择高度同源区域（见表2），使用NCBIPrimerDesigningtool设计引物，排除在人（taxid:9606）基因组与大肠杆菌（taxid:562）基因组中可能发生非特异反应的引物，最终筛选得到评分较高，且扩增片段为同源序列中完成一致50bp区域的高特异性引物
引物与扩增片段序列（5’→3’）如下：
pORI-F（SEQ ID NO:1）：CTCGTGCGCTCTCCTGTTC
pORI-R（SEQ ID NO:2）：GCGGACAGGTATCCGGTAAG
扩增片段序列（SEQ ID NO:3）：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc
SEQ ID NO:3即表2中的“ORI-PCR”，加星标注明，为多序列比对中完全一致区域。
3'，来源自参考文献https://link.springer.com/article/10.1186/1475-2859-7-6）已经过验证，符合qPCR定量要求。通用qPCR质粒引物由实施例1设计并得到。
2）标准品及待测样品制备
以含目的序列质粒和大肠杆菌基因组标准品分别10倍梯度稀释作为标准曲线。质粒与基因组均选取0.5×102至0.5×107 copies/μL作标准曲线。
步骤2 95℃ 15s；
步骤3 60℃ 60s；
步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；
步骤4 95℃ 15s；
步骤5 60℃ 60s；
步骤6 以0.05℃/s的速度升温至95℃，并接收荧光信号。
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