技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域,具体涉及一种检测原料乳中粘质沙雷氏菌的实时荧光定量PCR方法。
背景技术
[0002] 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),是革兰氏阴性兼性厌
氧杆菌,亦称灵杆菌、神灵杆菌,属于肠杆菌科。菌体较小,约0.7um。菌株呈球形的短杆状,无荚膜,无芽孢,周边有鞭毛,具有一定运
动能力。菌落整齐,一般为易流动的粘稠液体状,且多为血红色,有恶臭味。S.marcescens广泛存在于
水、
土壤和食品中,是一种弱
毒力机会致病菌,当
机体免疫功能低下时就会引起
肺炎、败血症、脑膜炎等各种
疾病,并且能对很多抗生素产生耐药性。作为原料乳中常见的嗜冷菌,S.marcescens能产生耐热
水解酶,将原料乳进行常规
热处理后,这些酶仍然能够保持很高的活性。S.marcescens分泌的蛋白酶可以分解
酪蛋白,产生凝胶结构,进而导致原料乳变质。蛋白水解产物会导致原料乳变味,产生苦味、异味、
酵母味等。此外S.marcescens分泌的脂肪酶最适反应
温度为40-45℃,最适pH为7.0-7.5。在50℃保温1h仍能保持80%的酶活力。脂肪酶在分解原料乳脂肪的同时,会释放出一些游离
脂肪酸,进而导致乳制品腐臭等不洁味。由此可见,粘质沙雷氏菌是影响食品工业发展的重要因素之一,快速、准确地检测食品中粘质沙雷氏菌含量对提高乳制品品质,加强企业经济效益有战略意义。
[0003] 由于嗜冷菌的耐冷机制很复杂,所以对嗜冷菌的检测与计数还有一定困难。目前,嗜冷菌计数最常用的方法是低温培养法(李琳,冷凝,杜明等.嗜冷菌快速检测方法研究进展[J].中国乳品工业,2013,41(1):25-31.)。该方法只能对总菌数计数或者使用选择培养基对某种特定菌计数,缺少针对性和全面性。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR引物及检测方法,以灵敏度高、特异性强、快速准确地定量检测食品中的粘质沙雷氏菌,如原料乳中、乳制品中的粘质沙雷氏菌,为食品厂在生产上有效控制粘质沙雷氏菌的数量,减少其对产品品质的危害,提高产品
质量提供理论依据,对保障
食品安全具有重要意义。
[0005] 本发明的基本原理是,通过基因组比对,寻找粘质沙雷氏菌中的特异性识别序列,以此设计引物,进行荧光定量PCR检测食品中的粘质沙雷氏菌。采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光法进行检测,灵敏度及特异性好。
[0006] 为了实现以上目的,本发明的技术方案如下:
[0007] 本发明提供了一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物,其核苷酸序列如下:
[0008] SM-F:TGCCTGGAAAGCGGCGATGG;
[0009] SM-R:CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT。
[0010] 本发明提供了一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法,包括以下步骤:
[0011] 1)提取待测样品中的DNA;
[0012] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板,采用荧光定量PCR方法扩增粘质沙雷氏菌,其中所使用的引物的核苷酸序列如下:
[0013] SM-F:TGCCTGGAAAGCGGCGATGG;
[0014] SM-R:CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT;
[0015] 在61℃
退火阶段收集荧光值,即Ct样品值,并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的
融解曲线分析,以确定产物是否单一,进而反映引物的特异性;
[0016] 可选地,所述的荧光定量PCR方法中使用的
荧光染料为SYBR Green I。
[0017] 3)标准曲线的绘制与检测结果判定:根据所选用的模式细菌在其浓度为×102、×103、×104、×105、×106、×107时对应的Ct标准值,建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准(cfu/mL)与Ct标准值的标准曲线,并且将步骤2)所得的待测样本Ct样品值,在标准曲线上确定样品中的粘质沙雷氏菌的数量。
[0018] 可选地,上述检测方法具体包括以下步骤:
[0019] 1)提取待测样品中的DNA;
[0020] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板,采用基于SYBR Green I的荧光定量PCR方法扩增粘质沙雷氏菌,其中所使用的引物的核苷酸序列如下:
[0021] SM-F:TGCCTGGAAAGCGGCGATGG(SEQ ID No:1)
[0022] SM-R:CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT(SEQ ID No:2)
[0023] 在61℃退火阶段收集荧光值,即Ct样品值,并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析;
[0024] 进一步地,当使用SYBR Green I荧光定量测试方法时,所述的PCR扩增反应体系为20μL:SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL,AL-F 0.8μL,AL-R 0.8μL,DNA模板2.0μL,ddH2O 6.0μL,Rox Reference DyeⅡ0.4μL;
[0025] 进一步地,所述的荧光定量PCR方法中,PCR反应条件为:95℃30s;95℃5s,55℃34s,40个循环;
[0026] 3)标准曲线的绘制:选用S.marcescens ATCC14756为模式细菌,根据其浓度为6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107时对应的Ct标准值,建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准(cfu/mL)与Ct标准值的标准曲线为y=-1.864x+31.32,R2=0.999;
[0027] 4)检测结果判定:将步骤2)所得的待测样本Ct样品值,在标准曲线上确定样品中的粘质沙雷氏菌的数量。
[0028] 本发明还提供了上述粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物,以及粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法在检测食品粘质沙雷氏菌方面的应用。
[0029] 本发明的技术方案达到的有益效果是:
[0030] 1)本发明根据沙雷氏菌属
微生物的基因组比对,确定S-核糖基高半胱
氨酸酶(luxS)基因作为粘质沙雷氏菌的特异性保守基因序列,以此设计一对特异性引物,成功建立了粘质沙雷氏菌的荧光定量PCR检测方法。该方法特异性强,对食品中常见的微生物均检测不到荧光
信号,仅对粘质沙雷氏菌检测为阳性,可以快速准确地检测食品中是否存在粘质沙雷氏菌,整个检测耗时短,与常规培养检测法相比大大提高了检测效率;
[0031] 2)本发明的粘质沙雷氏菌的荧光定量PCR检测方法的灵敏度较高,其灵敏度可达到6.9×102cfu/mL,可用于食品中粘质沙雷氏菌的定量检测,对保障食品安全具有重要意义。
附图说明
[0032] 图1是荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶
电泳。M:1000bp Marker,1.luxS基因PCR产物,2.Control。
[0033] 图2是粘质沙雷氏菌荧光定量PCR扩增标准曲线。
[0034] 图3是荧光定量PCR检测粘质沙雷氏菌luxS基因的敏感性实验。其中,1-7:6.9×107~6.9×101cfu/mL。
[0035] 图4是常规PCR检测粘质沙雷氏菌luxS基因的敏感性实验。其中,1-7:6.9×107~6.9×101cfu/mL。
[0036] 图5是粘质沙雷氏菌luxS基因荧光定量PCR扩增特异性实验。
具体实施方式
[0037] 为了阐明本发明的技术方案及技术目的,下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
[0039] 1.引物的设计与合成:
[0040] 通过比对粘质沙雷氏菌及其相近菌种的基因组序列,如
液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)等,找出粘质沙雷氏菌的种间特异性序列,然后将此序列进行BLAST比对,分析其与非沙雷氏菌属微生物的同源性,最终确定S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因为粘质沙雷氏菌的特异性保守基因序列。根据此基因设计特异性引物进行分析。
[0041] 设计引物时,首先根据S.marcescens ATCC14756的S-核糖基高半胱氨酸酶氨基酸序列(GenBank登录号:EF164926.1),比对
数据库中的各种粘质沙雷氏菌,S.marcescens WW4(GenBank:CP003959.1)、S.marcescens strain CAV1492(GenBank:CP011642.1)和S.marcescens SM39(GenBank:AP013063.1),找出种间保守序列区段;再对该段氨基酸序列的编码区序列进行DNAMAN
软件同源比对,设计引物SM-F和SM-R如下:
[0042] SM-F:TGCCTGGAAAGCGGCGATGG
[0043] SM-R:CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT
[0044] 2.通过S.marcescens ATCC14756S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因序列的克隆,实现所设计引物的正确性的检测:
[0045] 利用天根细菌基因组DNA提取
试剂盒提取S.marcescens ATCC14756的总DNA,使用上述引物序列SM-F和SM-R进行PCR扩增:
[0046] PCR扩增反应体系为20μL:SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL;SM-F 0.8μL,SM-R 0.8μL;DNA模板2.0μL;ddH2O 6.0μL;Rox Reference DyeⅡ50x 0.4μL;
[0047] PCR反应条件为:95℃30s;95℃5s,55℃34s,40个循环;61℃退火。
[0048] 将所获得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析,结果(见图1)显示,扩增粘质沙雷氏菌S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因部分
片段175bp。回收目的条带并与pUCm-T连接,转化JM109,鉴定正确后送上海生工测序。经测序分析发现,与拟克隆的基因序列一致,说明S.marcescens ATCC14756 S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因序列扩增正确。
[0049] 3.荧光定量PCR标准曲线的绘制:
[0050] a)使用S.marcescens ATCC14756为绘制荧光定量PCR标准曲线的模式细菌,它可代表其它粘质沙雷氏菌。将S.marcescens ATCC14756在脑心浸液培养基(BHI)培养基中过夜培养,根据GB 4789.2-2010食品微生物学检验--菌落总数测定中的方法定量菌液,经10倍梯度稀释,得到不同浓度菌液:6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×7
10cfu/mL。
[0051] b)采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取不同浓度菌液的基因组DNA;
[0052] c)使用SYBR Green I实时定量PCR试剂盒进行PCR扩增,扩增体系和反应条件如上面2中所述;此外,在61℃退火阶段收集荧光值,即Ct标准值,并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析,每个样本3个平行;
[0053] d)进行荧光定量PCR后得到每个浓度的Ct标准值,这个值对应荧
光信号初次被检测到时的循环数,可以反映模板初始量,以细菌数的lg标准值和Ct标准值制作细菌悬液的标准曲线y=-1.864x+31.32,相关系数为0.999(图2),说明本发明建立的检测方法可以准确定量2
检测食品中的S.marcescens;且其
检测限为×10cfu/mL。
[0054] 实施例2
[0055] 在实施例2中,使用本发明提供的检测粘质沙雷氏菌的实时荧光定量PCR方法检测不同月份(11、12、1、2月)从江苏省扬州市8个奶
牛场中取样的原料乳,以确定每个牧场的原料乳是否污染了粘质沙雷氏菌(S.marcescens),以此监控每个牧场的奶源质量。
[0056] 具体方法如下:
[0057] (1)提取待测原料乳样品中的DNA:
[0058] 取1mL原料乳,12000g/min离心5min,弃上层脂肪,无菌生理盐水洗涤两次,12000g/min离心2min,然后采用
专利《从牛奶中提取总DNA的方法》(专利
申请号:
200810115822.9)中的方法提取下层沉淀中的DNA。
[0059] (2)以步骤(1)中所提取的DNA为模板,荧光定量PCR扩增粘质沙雷氏菌S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因部分片段;
[0060] PCR扩增反应体系为20μL,包括:SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL、上游引物SM-F 0.8μL、下游引物SM-R 0.8μL、DNA模板2.0μL、ddH2O 6.0μL和RoxReference DyeⅡ0.4μL;其中,所述的上游引物SM-F与下游引物SM-R的核苷酸序列见实施例1的步骤1)引物的设计与合成。
[0061] PCR反应条件为:95℃30s;95℃5s,55℃34s,40个循环;在61℃退火阶段收集荧光值Ct样品,并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析。
[0062] (3)检测结果判定:参照实施例1中3d)所建立的粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准(cfu/mL)与Ct标准值的标准曲线,确定细菌浓度为6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107、6.9×108、6.9×109时对应的Ct标准值。根据步骤(2)所得的待测样本Ct样品值,
2
对照标准曲线(y=-1.864x+31.32,R=0.999),确定原料乳中的粘质沙雷氏菌的数量。
[0063] 在对32份原料乳样品进行的检测中,常规PCR并未检测出S.marcescens阳性样品,而荧光定量PCR方法检测出S.marcescens阳性样品1份,Ct值介于24-25之间,阳性率为3.13%。由此可见,本发明可用于原料乳中粘质沙雷氏菌的定量检测,对保障乳制品的安全具有重要意义。
[0064] 实施例3
[0065] 本实施例3中比较了本发明荧光定量PCR检测方法与常规PCR的敏感性。
[0066] 以实例1中步骤4)所获得的不同浓度菌液的基因组DNA为模板,SM-F和SM-R为引物进行常规PCR扩增,其反应条件为:95℃3min,30个循环(95℃30s,55℃30s,72℃30s),72℃10min。由图4可见,常规PCR检测S.marcescens的灵敏度是6.9×103cfu/mL;将其与图3所示
2
的本发明荧光定量PCR检测的最低菌落数(6.9×10cfu/mL)相比,本发明的灵敏度明显高于普通PCR检测。
[0067] 实施例4
[0068] 本实施例4中,利用本发明提供的引物及荧光定量PCR方法(见实施例2)对8种乳中的常见微生物(鲁氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙
门氏菌、李斯特菌、阪崎杆菌、荧光假单胞菌)进行扩增,并选取S.marcescens ATCC14756作为阳性对照,检测本发明方法的特异性。
[0069] 结果(见图5)显示只有S.marcescens ATCC14756样品出现了较强的荧光信号,而其余8个样品未出现相应的荧光信号,由此可见本发明的特异性强。
[0070] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和
说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,本发明要求保护范围由所附的
权利要求书、说明书及其等效物界定。