烟粉虱对噻虫嗪抗性的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
阅读：990发布：2020-05-24
专利汇可以提供烟粉虱对噻虫嗪抗性的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于检测烟粉虱（Bemisiatabaci）对噻虫嗪抗性的特异性PCR引物对， 试剂 盒 以及检测方法，引物对正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所提供的烟粉虱对噻虫嗪的 荧光 定量PCR检测方法，需人 力 及样品量少，检测数量大的特点，灵敏度高、特异性强、快速简便和准确可靠，因而能有效的检测烟粉虱对噻虫嗪的抗性，适合于烟粉虱对噻虫嗪抗性的早期快速诊断，同时可用于田间烟粉虱噻虫嗪抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。，下面是烟粉虱对噻虫嗪抗性的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种用于检测烟粉虱（Bemisia tabaci）对噻虫嗪抗性的特异性PCR引物对，其特征在于：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种用于检测烟粉虱（Bemisia tabaci）对噻虫嗪抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的PCR引物对。
3.一种用于检测烟粉虱（Bemisia tabaci）对噻虫嗪抗性的PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测烟粉虱的RNA样品，并反转录为cDNA模板；
（2） 将所述cDNA模板加入到含有权利要求1所述的特异性引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；
（3）进行荧光定量PCR检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR检测的扩增程序为：
94℃预变性5 min，94℃变性30 sec，61℃退火40 sec，72℃延伸45 sec，40个循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：若所述待测烟粉虱的样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰融解曲线，且Ct值≤24，则说明所述烟粉虱待测的样品对噻虫嗪产生抗性；若Ct≥27值，则说明待测烟粉虱的样品未对噻虫嗪产生抗性。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于：所述待测烟粉虱的RNA样品为烟粉虱成虫的RNA样品。
烟粉虱对噻虫嗪抗性的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)，是世界性的农业害虫，给生产带了极大的危害。20世纪80年代以后，陆续分布于全球除南极洲外各大洲的90余个国家和地区，且寄住植物多达74科500多种。在中国，该害虫在90年代末期成为我国重要的经济作物害虫，主要为害种类为B生物型，由于其入侵性强危害性大又被冠以“超级害虫”；Q生物型烟粉虱于2003年首次由本实验室在云南地区花卉市场被发现，之后快速扩散到全国各地，目前这两种生物型烟粉虱是我国蔬菜和花卉等作物上危害最大的生物型。烟粉虱不仅直接刺吸植物汁液，造成植株衰弱、干枯，而且还传播植物病毒病。由烟粉虱作为传毒媒介而引起的危害甚至使部分地区整棚番茄绝收，给生存带来了极其严重的危害。鉴于烟粉虱直接危害和间接危害的严重性，在农业生产中烟粉虱的防治工作已经到了刻不容缓的地步。
[0003] 烟粉虱主要以化学防治为主，杀虫剂的过量使用，导致烟粉虱已对各种防治用药产生了不同程度的抗性，尤其对防治烟粉虱使用最长、应用范围最广的新烟碱类杀虫剂抗药性最强。噻虫嗪是第二代全新结构的新烟碱类杀虫剂，自2000年进入中国市场后，一直是防治烟粉虱的首选。首次发现烟粉虱对新烟碱类杀虫剂产生抗性是在西班牙南部的园艺生产区，后不久又在以色列和西班牙相继发现接近1000倍的烟粉虱噻虫嗪抗性种群，且高抗种群对其它烟碱类药剂存在显著交互抗性。近年来，我国的北京、江苏、浙江、新疆、湖北等全国大多数省份也陆续有烟粉虱对新烟碱类药剂产生抗性的报道，而且我国北至黑龙江、南至海南、西至青海、东到上海的大部分地区均有烟粉虱分布和危害，危害生物型主要为Q型和B型，且抗药性普遍很高。因此抗药性是导致烟粉虱大爆发且难以治理的主要原因之一。
[0004] 由此可知，烟粉虱的抗性问题已经非常突出，因此为了更有效的使用新烟碱类杀虫剂，开发有效的烟粉虱噻虫嗪抗性早期快速分子诊断技术就显得尤为重要。害虫抗药性治理依赖于害虫抗性机制的阐明，但目前人们对烟粉虱抗新烟碱类杀虫剂的抗性机制仍“知之甚少”。有关新烟碱类杀虫剂的作用机制，人们普遍认为，其主要作为后突触烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）的激动剂，作用于昆虫的中枢神经系统而使昆虫抽搐麻痹死亡。因此，关于新烟碱类杀虫剂抗性机制研究一般集中在nAChRs，如在桃蚜、果蝇、稻飞虱、疟蚊、以及蜜蜂等昆虫中均发现nAChRs突变与新烟碱类杀虫剂抗性有关。除靶标不敏感性外，昆虫对新烟碱类杀虫剂的抗性机制也和代谢机制有关，如最近在桃蚜、家蝇、褐飞虱中均发现细胞色素P450氧化酶基因介导的代谢解毒与噻虫嗪抗性有关。而在烟粉虱中，至今没有发现nAChRs的突变与新烟碱类杀虫剂抗性有关的报道，但是通过生化和分子生物学手段发现一种细胞色素P450基因（CYP6CM1）和吡虫啉抗性有关。本实验室利用转录组技术获得大量P450基因片段序列，并以噻虫嗪抗性和敏感品系为实验材料进行荧光定量PCR进行表达量验证，结果发现抗性品系中P450基因CYP4C64 的表达量显著升高，并且通过田间样品检测发现该基因与噻虫嗪抗性极其相关，国内尚未有关于田间烟碱类杀虫剂抗药性，尤其是噻虫嗪等常用药剂相关基因检测试剂盒使用。
[0005] 目前，尽管一些基于PCR方法的分子标记技术如RAPD (Random Amplifide Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP (Amplifide Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性) 已经用于烟粉虱抗性相关基因的寻找上，但这些标记并未直接用于烟粉虱抗性检测，烟粉虱噻虫嗪抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：烟粉虱噻虫嗪生物测定结果一般需要2天 (48小时)；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约800头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高。(4)操作麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(6)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC50和 LC90值的重复性和精确性较低；(7)传统的生物测定方法对供试昆虫测得的抗性水平往往具有滞后性。
[0006] 随着分子生物学技术进一步的飞速发展，人们已经将荧光定量PCR 技术 (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) 广泛应用于多种病毒、细菌的抗药性检测，并开始应用于转录水平上昆虫抗药性解毒酶基因的表达量检测。荧光定量PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。相对于生测等常规抗性检测手段，荧光定量PCR具有操作简单，灵敏度高，重复性好等优点，因而已开始成为昆虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测的首选方法，在抗药性检测上日益显示出强大的优势。烟粉虱早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药性风险预警提供技术手段，在减少害虫危害损失、减少农药对环境的污染、保障蔬菜产品的质量和保障人民身体健康等方面具有重要的意义。因此，建立一种准确、简便、快速、可靠的烟粉虱噻虫嗪抗性检测手段尤为迫切。所以为了更好的检测烟粉虱噻虫嗪抗性，开发出更有效地烟粉虱噻虫嗪抗性检测手段，我们开展了该研究内容。
发明内容
[0007] 本发明针对现有烟粉虱噻虫嗪抗性检测技术中存在的灵敏度低、周期长、重复性差及材料要求高等问题，通过特异性荧光定量PCR引物筛选及其反应体系的优化等步骤，建立一种快速准确的荧光定量PCR分子检测方法及快速、简便、准确、高效的检测烟粉虱噻虫嗪抗性的检测试剂盒，为烟粉虱噻虫嗪抗性有效检测提供有效工具。
[0008] 本发明提供的技术方案是：一种用于检测烟粉虱（Bemisia tabaci）对噻虫嗪抗性的特异性PCR引物对，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009] 本发明提还供一种用于检测烟粉虱（Bemisia tabaci）对噻虫嗪抗性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含所述的特异性PCR引物对。
[0010] 进一步地，本发明试剂盒中还包括逆转录酶，DNase，RNase抑制剂，dNTP混合物，特异性引物，MgCl2溶液，热启动Taq DNA聚合酶，荧光定量反应液，Buffer缓冲液，RNase-free水等。此外，还应包括符合该试剂盒要求的阳性对照及阴性对照样品。
[0011] 本发明还提供一种检测烟粉虱（Bemisia tabaci）对噻虫嗪抗性的PCR检测方法，该方法，包括以下步骤：（1）提取待测烟粉虱的RNA样品，并反转录为cDNA模板；
（2） 将所述cDNA模板加入到含有上述特异性PCR引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；
（3）进行荧光定量PCR检测；
本发明所述特异性PCR引物对是以烟粉虱体内CYP4C64基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的，该引物具有很高的特异性，通过不同时空的田间样品检测，发现该对引物具有很高的扩增效率，qRT-PCR检测效果极佳。
（2） 将所述cDNA模板加入到含有上述特异性PCR引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；
（3）进行荧光定量PCR检测；
本发明所述特异性PCR引物对是以烟粉虱体内CYP4C64基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的，该引物具有很高的特异性，通过不同时空的田间样品检测，发现该对引物具有很高的扩增效率，qRT-PCR检测效果极佳。
[0013] 所述荧光定量PCR检测的扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 sec，60℃退火40 sec，72℃延伸45 sec，40个循环。
[0014] PCR过程完成后，按0.l℃·s-1的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15 s，然后60℃进行1 min，接着95℃进行15 s，最后再在60℃进行15 s。
[0015] 本发明使用ABI Prism 7500荧光定量PCR仪进行检测。
[0016] ABI Prism 7500荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，样品、阴性及阳性对照的所有扩增曲线的阈值均设定为0.50 (位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。
[0017] 对上述步骤中荧光定量PCR反应产物进行荧光定量检测，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间Ct值判断结果，若所述待测烟粉虱样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰融解曲线，且Ct值≤24，则说明所述烟粉虱待测样品对噻虫嗪产生抗性；若Ct≥27值，则说明待测烟粉虱样品未对噻虫嗪产生抗性。若Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对噻虫嗪抗性产生与否视重做结果而定。
[0018] 所述待测烟粉虱的RNA样品为烟粉虱成虫的RNA样品。
[0019] 本发明系选择烟粉虱CYP4C64 基因的保守片段区为靶目标序列，根据该基因特点和荧光定量PCR引物的设计原则，设计了一对特异性引物，建立了一种用于烟粉虱噻虫嗪抗性检测的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法。较之现有生物测定技术而言，本发明所提供的烟粉虱噻虫嗪抗性检测的荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，具有如下效果及优点：(1)特异性更强。本发明是利用烟粉虱CYP4C64基因的保守片段区为靶目标序列，设计了5对引物，通过普通PCR验证片段单一与否，然后通过荧光定量PCR进行扩增效率计算得到一条特异性引物，从而在PCR过程中可以对靶目标序列进行特异性扩增，并且通过不同时间，不同地点的田间样品检测，发现该对引物扩增条带单一，设置不同浓度的烟粉虱cDNA样品进行扩增效率检测，结果显示该对引物扩增效率达到99%（90-110%可用于qRT-PCR检测），表明得到的特异性引物可以用于CYP4C64 基因qRT-PCR检测。
[0020] (2)灵敏度和准确度更高。本发明中涉及的烟粉虱噻虫嗪抗性检测方法主要应用qRT-PCR技术，通过Ct值的差异来检测烟粉虱噻虫嗪抗性水平。该技术最大优点是能够对-8微量模版DNA进行检测，灵敏度达到10 μg，既相对于传统的误判率及重复性较差的生测方法，检测的灵敏度和准确度大大提高；而且也比通常的引物达到的灵敏度要高。
[0021] (3)检测周期短。生测过程至少需要48小时的时间，而本发明方法仅需3小时即可完成判断，一次可以同时检测多个样品，特别适合于大批量样品的快速检测。
[0022] (4)材料要求少。烟粉虱毒力生物测定中测定一个标准曲线至少需要约800头标准试虫，这些试虫的饲养及挑取需要花费一定的人力、物力和财力。而本发明对一个种群的检测只需要几十头左右的烟粉虱成虫。
[0023] (5)检测独特性。通过多个田间样品的田间检测，发现CYP4C64基因过量表达与噻虫嗪的抗性密切相关，国内外尚未有田间抗性烟粉虱基因表达检测试剂盒使用，具有很强的独特性。
[0024] 综上所述，本发明的方法可替代传统的生物测定方法，它可以准确、快速、特异、方便的检出供试烟粉虱是否具有噻虫嗪抗性，对田间烟粉虱噻虫嗪抗性的监测监控具有重要意义。本发明所提供的烟粉虱对噻虫嗪抗性的PCR检测方法，需人力及样品量少，检测数量大的特点，而且灵敏度高、特异性强、快速简便和准确可靠，因而能有效的检测烟粉虱对噻虫嗪的抗性，适合于烟粉虱对噻虫嗪抗性的早期快速诊断，同时可用于田间烟粉虱噻虫嗪抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。附图说明
[0025] 图1 为本发明中所用特异性引物对扩增烟粉虱CYP4C64 基因cDNA片段序列。
[0026] 图2 为图1中该基因cDNA扩增片段2%琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：对噻虫嗪敏感的烟粉虱成虫cDNA样品；2：对噻虫嗪产生抗性的成虫cDNA样品；M：MarkerⅠ。
[0027] 图3 为标准品梯度稀释进行荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线。其中，横坐标代表循环数，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，字母代表样品cDNA的5个稀释浓度。
[0028] 图4 是根据图3中得出的数据绘制的荧光定量PCR所得到的标准曲线。其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。
[0029] 图5 为实施例1的检测烟粉虱噻虫嗪抗性的荧光定量PCR检测结果。其中，A：对噻虫嗪敏感烟粉虱种群cDNA样品；B：对噻虫嗪抗性烟粉虱种群cDNA的样品。
[0030] 图6 为实施例2的检测烟粉虱噻虫嗪抗性的荧光定量PCR检测结果。其中，A：实施例1中对噻虫嗪敏感的烟粉虱种群cDNA阴性对照样品；B：实施例1中对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群cDNA阳性对照样品； C：对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群cDNA待测样品；D：对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群cDNA待测样品；E：对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群cDNA待测样品。。
[0031]
具体实施方式
[0032] 以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0033] 实验前材料样品准备：(1) 烟粉虱噻虫嗪敏感种群TH-S：该烟粉虱种群是由实验室成员在2000年采集于北京海淀的甘蓝田间。在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内用无虫甘蓝苗进行继代饲养，期间未接触任何有毒杀虫剂，对噻虫嗪敏感(LC50为19.10 mg/L)；
(2) 烟粉虱噻虫嗪抗性种群TH-R：该种群是，一直用噻虫嗪汰选TH-S的种群，噻虫嗪抗性LC50达到1426.22 mg/L，抗性倍数达到75倍的高抗水平，甘蓝上连续饲养至今；
(3) 田间噻虫嗪抗性种群ZJ：该种群是2011年在浙江省田间采集的烟粉虱种群，噻虫嗪抗性LC50达到2471.95mg/L，抗性倍数达到129倍的高抗水平；
(4) 田间噻虫嗪抗性种群TJ：该种群是2012年在天津市田间采集的烟粉虱种群，噻虫嗪抗性LC50达到2119.15 mg/L，达到111倍的高抗水平；
(5) 田间噻虫嗪抗性种群BJ：该种群是2012年在北京市田间采集的烟粉虱种群，噻虫嗪抗性LC50达到1483.24 mg/L，达到78倍的高抗水平；
上述五个烟粉虱种群均在室内进行隔离饲养，饲养温度是25±1℃，相对湿度为
60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。
(2) 烟粉虱噻虫嗪抗性种群TH-R：该种群是，一直用噻虫嗪汰选TH-S的种群，噻虫嗪抗性LC50达到1426.22 mg/L，抗性倍数达到75倍的高抗水平，甘蓝上连续饲养至今；
(3) 田间噻虫嗪抗性种群ZJ：该种群是2011年在浙江省田间采集的烟粉虱种群，噻虫嗪抗性LC50达到2471.95mg/L，抗性倍数达到129倍的高抗水平；
(4) 田间噻虫嗪抗性种群TJ：该种群是2012年在天津市田间采集的烟粉虱种群，噻虫嗪抗性LC50达到2119.15 mg/L，达到111倍的高抗水平；
(5) 田间噻虫嗪抗性种群BJ：该种群是2012年在北京市田间采集的烟粉虱种群，噻虫嗪抗性LC50达到1483.24 mg/L，达到78倍的高抗水平；
上述五个烟粉虱种群均在室内进行隔离饲养，饲养温度是25±1℃，相对湿度为
60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。
[0034] 实施例1利用荧光定量PCR技术对TH-S和TH-R成虫cDNA样品的检测及本检测试剂盒和其使用方法的建立。
[0035] 1. 以烟粉虱CYP4C64基因的保守片段区为靶目标序列（序列表中序列3），根据荧光定量PCR引物设计原则，设计特异性荧光定量引物序列如下：正向引物 (q C64-F)：5′-GCACACACCATGACCGTAGCAG-3′（序列表中序列1）；
反向引物 (q C64-R)：5′-GGCTCTTCGTGACATCG-3′（序列表中序列2）；
该特异性引物扩增片段序列如图1所示，其扩增特异性如图2（其中，1：对噻虫嗪敏感的cDNA样品；2：对噻虫嗪产生抗性的cDNA样品；M：MarkerⅠ）所示，从图中可看出该引物扩增特异性高，扩增条带单一，大小为138bp，符合荧光定量PCR反应要求。
反向引物 (q C64-R)：5′-GGCTCTTCGTGACATCG-3′（序列表中序列2）；
该特异性引物扩增片段序列如图1所示，其扩增特异性如图2（其中，1：对噻虫嗪敏感的cDNA样品；2：对噻虫嗪产生抗性的cDNA样品；M：MarkerⅠ）所示，从图中可看出该引物扩增特异性高，扩增条带单一，大小为138bp，符合荧光定量PCR反应要求。
[0036] 2. 提取两种群成虫RNA样品，然后反转录为cDNA模板，在包括步骤1所述特异性引物的荧光定量PCR反应体系中进行反应；(1)烟粉虱成虫RNA的提取步骤如下：
①取敏感、抗性种群烟粉虱成虫各30头，液氮中冷冻备用；
②将成虫放入玻璃匀浆器内，并向匀浆器中加入l ml的Trizol试剂充分匀浆，匀浆后将液体倒入1.5ml离心管内，室温放置5min；
③向离心管中加入0.2 ml的氯仿，剧烈振荡15 s，然后室温放置3 min；
④在4℃条件下12,000 rpm离心15 min；
⑤吸取上清液转入到一个新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min；
⑥在4℃条件下12,000 rpm离心10 min；
⑦弃上清，然后加入l ml 75% 的乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500 rpm离心5 min，弃上清；
⑧RNA沉淀自然干燥后，加入约30µl DEPC水溶解，冰上保存，测OD260/OD280值，电泳检测条带，选择符合条件的RNA样品进行以下反转录实验或-80℃保存备用。
①取敏感、抗性种群烟粉虱成虫各30头，液氮中冷冻备用；
②将成虫放入玻璃匀浆器内，并向匀浆器中加入l ml的Trizol试剂充分匀浆，匀浆后将液体倒入1.5ml离心管内，室温放置5min；
③向离心管中加入0.2 ml的氯仿，剧烈振荡15 s，然后室温放置3 min；
④在4℃条件下12,000 rpm离心15 min；
⑤吸取上清液转入到一个新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min；
⑥在4℃条件下12,000 rpm离心10 min；
⑦弃上清，然后加入l ml 75% 的乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500 rpm离心5 min，弃上清；
⑧RNA沉淀自然干燥后，加入约30µl DEPC水溶解，冰上保存，测OD260/OD280值，电泳检测条带，选择符合条件的RNA样品进行以下反转录实验或-80℃保存备用。
[0037] (2)反转录合成cDNA模板：®
下面以日本TaKaRa公司去基因组的PrimeScript RT试剂盒为例，实验过程如下：
①使用前将试剂盒各组分解冻并离心混匀；
②基因组DNA的去除反应：
③反转录反应(冰上进行)：
(3) 荧光定量PCR标准曲线的建立：
对样品cDNA进行5个梯度稀释（稀释倍数分别为1×、2×、4×、8×、16×），然后采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行荧光定量PCR：
①荧光定量PCR反应体系25μl组成如下：
＊该产品为北京天根生物科技有限公司RealMasterMix (SYBR Green)试剂盒产品。
下面以日本TaKaRa公司去基因组的PrimeScript RT试剂盒为例，实验过程如下：
①使用前将试剂盒各组分解冻并离心混匀；
②基因组DNA的去除反应：
③反转录反应(冰上进行)：
(3) 荧光定量PCR标准曲线的建立：
对样品cDNA进行5个梯度稀释（稀释倍数分别为1×、2×、4×、8×、16×），然后采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行荧光定量PCR：
①荧光定量PCR反应体系25μl组成如下：
＊该产品为北京天根生物科技有限公司RealMasterMix (SYBR Green)试剂盒产品。
[0038] ②荧光定量PCR反应条件为：94℃预变性6 min，94℃变性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸35 sec，40个循环。PCR过程完成后，按0.l℃·s-1的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15 s，然后60℃进行1 min，接着95℃进行15 s，最后再在60℃进行15 s。
[0039] 最终得到的标准扩增曲线如图3所示；其中，横坐标代表循环数，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，A、B、C、D、E字母代表样品cDNA的5个稀释浓度。
[0040] 最终得到的标准曲线如图4所示；其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。
[0041] (4) 荧光定量PCR反应过程：荧光定量PCR反应过程的体系及条件如上面步骤(3)所述。
[0042] 3. 检测：本发明使用ABI Prism 7500荧光定量PCR仪进行检测。
[0043] 4. 结果分析：ABI Prism 7500荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，样品（供试烟粉虱成虫cDNA样品）、阴性对照（对噻虫嗪敏感的烟粉虱成虫cDNA为阴性对照样品）及阳性对照（对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱成虫cDNA为阳性对照样品）的所有扩增曲线的阈值均设定为0.50 (位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。
[0044] 对上述步骤中荧光定量PCR反应产物进行荧光定量检测，如图5中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的扩增曲线，且 TH-S 的样品的Ct值为27.27±0.18(SE)，TH-R的样品的Ct值为23.08±0.21(SE)，通过分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过噻虫嗪抗敏样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：Ct值≤24，则说明待测样品已对噻虫嗪产生抗性；若Ct≥27值，则说明待测样品为敏感种群，尚未对噻虫嗪产生抗性；若Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对噻虫嗪抗性产生与否视重做结果而定。
[0045] 实施例2通过其他三个噻虫嗪抗性烟粉虱种群ZJ、TJ及BJ验证实施例1中的试剂盒及检测方法的可用性，具体实验过程如实施例1所示。
[0046] 最终的荧光定量PCR反应检测结果如图6中所示，其中，A (TH-R）：实施例1中对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群TH-R成虫cDNA阳性对照样品； B (TH-S)：实施例1中对噻虫嗪敏感的烟粉虱种群TH-S成虫cDNA阴性对照样品； C (ZJ)：采集于浙江地区对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱田间种群ZJ成虫cDNA待测样品；D (TJ)：采集于天津地区对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群TJ成虫cDNA待测样品；E (BJ)：采集于北京地区对噻虫嗪产生抗性的烟粉虱种群BJ成虫cDNA待测样品。
[0047] 在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的扩增曲线，且ZJ的样品的Ct值为23.51±0.19(SE)， TJ的样品的Ct值为23.62±0.24(SE)， BJ的样品的Ct值为23.96±0.14(SE)，通过分析，相对于TH-S阴性对照，两者的表达量均以达到了极显著水平，与TH-R阳性对照水平相当，由此可知，该区分标准设定合理，通过该荧光定量PCR检测试剂盒，可以很明显的区分出噻虫嗪抗性及敏感烟粉虱。
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