一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法
专利汇可以提供一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种基于土臭素关键合成酶的 荧光 定量PCR方法，属于 生物 检测技术领域。本 发明 设计扩增引物序列245F/551R，荧光定量PCR 鉴别 检测方法的步骤为：（1）提取总DNA模板，（2）在PCR反应管中配置反应体系，（3）PCR反应，（4）检测融解 温度 曲线，（5）结果分析，报告检测样品为阳性或阴性。采用PCR法扩增目的基因，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析 软件 计算Ct值并计算出样品geosmin编码基因的含量；同时，不同菌株具有型特异性融解温度，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现 鉴别诊断 的目的，为可疑污染源调查、传播环境、产生菌溯源等工作奠定 基础 。，下面是一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法专利的具体信息内容。
1.一种基于土臭素geosmin关键合成酶编码基因的荧光定量PCR方法，其特征在于根据已报道的保藏菌株中geosmin关键合成酶geoA的高度保守序列设计一对保守扩增引物，并调取上述菌株中geosmin关键合成酶编码基因；所述的扩增引物序列为：
245F：5’-TCTTCTTCGACGACCACTTCCT-3’，
551R：5’-CGGCGCATCTCGATGTACTC-3’；
荧光定量PCR鉴别检测方法的步骤如下：
（1）提取总DNA模板：将待测样品大曲或酒醅采用Hoffman报道的方式提取基因组提取总DNA，最后加入30 μL无菌重蒸水融解；另设阳性对照为添加含有geoA 的产geosmin菌株的样品；阴性对照为无菌生理盐水；
所述保藏菌株，即产土臭素geosmin的菌株，共四株，分别为：
①分类命名为白色链霉菌（Streptomyces albus）LBG-FXJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4206；
②分类命名为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FJ-HX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4205；
③分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4535；
④分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4536；
该四株菌株已申请中国专利，申请号201110087614.4，公开号CN102181392A，公开日
2011年9月14日；
（2）在PCR反应管中配置反应体系：以提取的总DNA为模板，体系的总体积为20μL，其TM
组成如下：10μL荧光定量2×SsoFast EvaGreen supermix（bio-rad ），分别添加浓度为
25 μM双向引物245F及551R 各1μL，模板1μL，双蒸水补至20μL；
（3）PCR反应：将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下：第一阶段：98℃，
2min；第二阶段：98℃，5s；第三阶段：56℃，5s，第二阶段和第三阶段共同操作40个PCR循环，并于每次循环中的第三阶段同时采集荧光信号，绘制扩增曲线；
（4）检测融解温度曲线：40个PCR循环结束后，在72~96℃区间检测融解温度曲线，全过程进行荧光信号的检测，检测间隔为每0.3℃，检测持续时间为0.5s；
（5）结果分析：阴性对照Ct值应显示为0或≥40.0，阳性对照的Ct值应显示0＜Ct≤30.0，否则视实验失败，需重做；
检测样品Ct值显示，0＜Ct≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；
检测样品35.0＜Ct值＜40.0，需进行一次重复实验，若Ct值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，报告样品阳性；
若重复实验结果的Ct值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值不为零，报告样品阴性；
检测样品Ct值为零，报告样品阴性。
一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法
技术领域
背景技术
发明内容
551R：5’-CGGCGCATCTCGATGTACTC-3’；该引物为针对不同菌种中geosmin合成酶编码基因中的高度保守序列设计；
荧光定量PCR鉴别检测方法的步骤如下：
（1）提取总DNA模板：将待测样品大曲或酒醅采用Hoffman报道的方式提取基因组提取总DNA，最后加入30 μL无菌重蒸水融解；另设阳性对照为添加含有geoA 的产geosmin菌株的样品；阴性对照为无菌生理盐水；
所述保藏菌株，即产土臭素geosmin的菌株，共四株，分别为：
①分类命名为白色链霉菌（Streptomyces albus）LBG-FXJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4206；
②分类命名为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FJ-HX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4205；
③分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4535；
④分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4536；该四株菌株已申请中国专利，申请号
201110087614.4，公开号CN102181392A，公开日2011年9月14日。
（3）PCR反应：将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下：第一阶段：98℃，
2min；第二阶段：98℃，5s；第三阶段：56℃，5s，第二阶段和第三阶段共同操作40个PCR循环，并于每次循环中的第三阶段同时采集荧光信号，绘制扩增曲线；
（4）检测融解温度曲线：40个PCR循环结束后，在72~96℃区间检测融解温度曲线，全过程进行荧光信号的检测，检测间隔为每0.3℃，检测持续时间为0.5s；
（5）结果分析：阴性对照Ct值应显示为0或≥40.0，阳性对照的Ct值应显示0＜Ct≤30.0，否则视实验失败，需重做；
检测样品Ct值显示，0＜Ct≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；
检测样品35.0＜Ct值＜40.0，需进行一次重复实验，若Ct值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，报告样品阳性；
若重复实验结果的Ct值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值不为零，报告样品阴性；
检测样品Ct值为零，报告样品阴性。
具体实施方式
SpeucetiusATCC27952
KitasatosporasetaeKM-6054
StreptomycesavermitilisMA-4680
Streptomycesscabiei87.22
StreptomycescoelicolorA3(2)SCO6073
根据保守区域设计引物——248F，1832R，扩增片段大小为1500bp左右。利用所设计引物，对从大曲中筛选得到的4株产geosmin菌株中geosmin合成酶的编码基因序列进行扩增。将这4种PCR产物进行测序。
②分类命名为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FJ-HX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4205；
③分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4535；
④分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4536；
该四株菌株已申请中国专利，申请号201110087614.4，公开号CN102181392A，公开日
2011年9月14日。
白色链霉菌 Streptomycesalbus + +
弗氏链霉菌 Streptomycesfradiae + +
链霉菌 Streptomycessp + +
链霉菌 Streptomycessp + +
白色链霉菌 Streptomycesalbus + +
汉逊酵母 Hanseniasporasp - -
酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae - -
产黄青霉 Penicilliumchrysogenum - -
解淀粉芽孢杆菌 Bacillusamyloliquefaciens - -
伞枝犁头霉 Absidiacorymbifera - -
卷枝毛霉 Mucorcircinelloides - -
绿色木霉 Trichodermaviride - -
a，+为阳性PCR扩增（0＜Ct ≤30.0）或产geosmin；-为阴性PCR扩增（Ct 为0或≥40.0）或不产geosmin。
98℃，5s；第三阶段：56℃，5ｓ，从第二阶段到第三阶段进行40个循环。
geosmin菌株），建立荧光定量PCR标准曲线。由图4可知，在较宽的菌体浓度范围
20 23 2
（1.76×10 ~1.76×10 个孢子）有很好的线性，R 为0.9892。
7 -5
10 倍，基因组浓度为5.12×10 ng/μL仍有较好检测效果。在该基因组浓度条件下，5次重复实验的扩增效率为101.35%~108.68%，接近理论值100%。说明该定量PCR的反应条件较好，有很好的稳定性和灵敏度。
1 2.71 3 13.84 0.09
10 1.71 3 16.63 0.07
102 0.71 3 19.46 0.13
103 -0.29 3 22.97 0.10
104 -1.29 3 26.62 0.14
105 -2.29 3 29.65 0.10
106 -3.29 3 33.38 0.11
实施例7 不同大曲中编码geosmin关键酶基因的检查与定量分析
提取汾酒三种大曲（清茬、红心、后火大曲）的总基因组，应用245F/551R（扩增geosmin关键酶部分编码基因）分别以上述基因组为模板，扩增目的条带。
1 FXJ 93.1
2 HX 94
3 QC-1 92.8
4 QC-2 92.5
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