一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法
专利汇可以提供一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用悬浮细胞MO7e评价促血小板生成素受体（TPO受体）激动剂体外活性的分析方法。该方法通过评价样品对细胞的促增殖发育能 力 来反映样品与TPO受体结合活性以及促血小板生成活性。本发明一方面解决了 现有技术 中BaF3-hMpl细胞系构建难度大耗时长，检测结果不稳定的问题；另一方面解决了悬浮细胞MTT法显色时间长并且产生不溶性甲臜产物，导致结果重现性差、准确度低的问题；同时采用优于存活率评价指标的四参数 数据处理 方法，可直接定义样品活性值。，下面是一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法专利的具体信息内容。
1.一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于该方法是利用悬浮细胞MO7e进行促血小板生成素受体激动剂体外活性的评价。
2.根据权利要求1所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于该方法含有如下步骤：
（1）细胞复苏及传代；
（2）细胞活力评价；
（3）标准品及样品制备；
（4）样品活性检测；
（5）显色方法；
（6）原始数据处理。
3.根据权利要求2所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于该方法含有如下步骤：
（1）细胞复苏及传代：
将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解；在超净台中将其移入离心管中，加入浓度为10%-20%的FBS+1640培养基重悬细胞；800-1000rpm离心3-10min后弃去上清，加入细胞培养基及生长因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，吹打混匀，移至细胞培养瓶中；瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次；
将处于对数生长期的细胞吹打混匀，取100 μl细胞悬液测定活细胞浓度、细胞存活
4 4
率；将细胞悬液用新鲜细胞培养基稀释至细胞浓度约为5×10 个/ml～10×10 个/ml，每瓶15ml；轻轻摇匀，37℃，5%- 10%CO2条件下培养；复苏后最多传至20代弃用；
（2）细胞活力评价：
取50～100 μl细胞悬液与0.4%台盼蓝等体积混合；于细胞计数仪测定活细胞浓度、
4 4
细胞存活率；细胞传代浓度为5×10 个/ml～10×10 个/ml，每3～4天传代一次；
（3）标准品及样品制备
取一支TPO受体激动剂，注射用水溶解至蛋白浓度为0.02～0.07mg/ml，用浓度为
10%-20%的 FBS+1640培养基进行5～10倍梯度稀释，配制7～9个浓度的活性标准品溶液；
（4）样品活性检测：
取处于对数生长期的MO7e细胞，吹打混匀，800-1000rpm离心；上清液高速离心后加入空白对照孔；沉淀细胞用无血清1640培养基洗涤两次；再用浓度为10%-20%的 FBS+1640
5 5
培养基重悬；用细胞计数仪计数后调整细胞浓度至1.5×10 ～2.2×10 个/ml；样品及空白对照50µl/孔，细胞150µl/孔加入96孔板中，37℃，5%- 10% CO2条件下培养48～72小时；
（5）显色方法：
将CCK-8试剂用浓度为10%-20%的 FBS+1640培养基等体积稀释；加入96孔板中；每孔20μl，摇匀，放入CO2培养箱中孵育2h，用酶标仪测定450nm和600nm处吸光度；
（6）原始数据处理
以标准品溶液和样品溶液的稀释倍数为x值，以对应的吸光度为y值，用Gen5 1.10软件作四参数回归曲线；Y=（A-D）/（1+（X/C）＾B） + D；
其中：A：曲线上渐近线估值即最大吸光度值； B：曲线的斜率； C：最大有效量一半时对应的浓度； D：曲线下渐近线估值即最小吸光度值；
将标准品溶液四参数曲线的（A+D)/2代入标准品与样品方程，得到标准品Er与样品Es；
其中：A：标准品最大吸光度值即为450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照；
D：标准品最小吸光度值即为450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照；
其中：样品活性/比活性计算公式：供试品活性/比活性计算公式：
供试品活性（U/ml）=Pr×；
供试品比活性（U/mg)=；
其中：
Pr：标准品活性，U/ml；
Ds：样品预稀释倍数；
Dr：标准品预稀释倍数；
Es：样品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er：标准品半效量的稀释倍数。
4.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于步骤（1）中所使用的培养基是完全培养基，且添加的MO7e生长所依赖的GM-CSF终浓度为5～10ng/ml。
5.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于步骤（2）中进行细胞活力评价时，用于样品检测的细胞活力范围为：活细胞
5 5
浓度7×10 个/ml～12×10 个/ml，细胞存活率≥90%。
6.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于步骤（3）中标准品和样品的浓度范围为：0.00005ng/ml～5000ng/ml，采用
5～10倍梯度稀释对样品进行处理。
7.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于步骤（4）中样品活性检测过程使用培养基不含有MO7e细胞复苏和传代时所依赖的生长因子，而是加入一定浓度待检测的TPO受体激动剂。
8.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于，步骤（5）中的显色方法为细胞培养48～72小时后加入CCK-8显色试剂。
9.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于步骤（6）中的原始数据处理采用四参数计算法。
10.根据权利要求1至3所述的一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法，其特征在于，促血小板生成素受体激动剂含有重组人全长血小板生成素rhTPO或聚乙二醇修饰的重组人巨核细胞生长和发育因子PEG-rhMG-DF或TPO/IL3融合蛋白或TPO肽类模拟物或TPO非肽类模拟物和抗体类小分子TPO受体激动剂中的任意一种。
一种评价促血小板生成素受体激动剂体外活性的分析方法
技术领域
背景技术
发明内容
将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解；在超净台中将其移入离心管中，加入浓度为10%-20%的FBS+1640培养基重悬细胞；800-1000rpm离心3-10min后弃去上清，加入细胞培养基及生长因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，吹打混匀，移至细胞培养瓶中；瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次；
将处于对数生长期的细胞吹打混匀，取100 μl细胞悬液测定活细胞浓度、细胞存活率；将细胞悬液用新鲜细胞培养基稀释至细胞浓度约为5×104个/ml～10×104个/ml，每瓶15ml；轻轻摇匀，37℃，5%- 10%CO2条件下培养；复苏后最多传至20代弃用；
（2）细胞活力评价：
取50～100 μl细胞悬液与0.4%台盼蓝等体积混合；于细胞计数仪测定活细胞浓度、细胞存活率；细胞传代浓度为5×104个/ml～10×104个/ml，每3～4天传代一次；
（3）标准品及样品制备
取一支TPO受体激动剂，注射用水溶解至蛋白浓度为0.02～0.07mg/ml，用浓度为
10%-20%的 FBS+1640培养基进行5～10倍梯度稀释，配制7～9个浓度的活性标准品溶液；
（4）样品活性检测：
取处于对数生长期的MO7e细胞，吹打混匀，800-1000rpm离心；上清液高速离心后加入空白对照孔；沉淀细胞用无血清1640培养基洗涤两次；再用浓度为10%-20%的 FBS+1640培养基重悬；用细胞计数仪计数后调整细胞浓度至1.5×105～2.2×105个/ml；样品及空白对照50µl/孔，细胞150µl/孔加入96孔板中，37℃，5%- 10% CO2条件下培养48～72小时；
（5）显色方法：
将CCK-8试剂用浓度为10%-20%的 FBS+1640培养基等体积稀释；加入96孔板中；每孔20μl，摇匀，放入CO2培养箱中孵育2h，用酶标仪测定450nm和600nm处吸光度；
（6）原始数据处理
以标准品溶液和样品溶液的稀释倍数为x值，以对应的吸光度为y值，用Gen5 1.10软件作四参数回归曲线；Y=（A-D）/（1+（X/C）＾B） + D；
其中：A：曲线上渐近线估值即最大吸光度值；
B：曲线的斜率；
C：最大有效量一半时对应的浓度；
D：曲线下渐近线估值即最小吸光度值；
将标准品溶液四参数曲线的（A+D)/2代入标准品与样品方程，得到标准品Er与样品Es；
其中：A：标准品最大吸光度值即为450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照；
D：标准品最小吸光度值即为450nm扣除600nm吸光度，再减去空白对照；
其中：样品活性/比活性计算公式：供试品活性/比活性计算公式：
供试品活性（U/ml）=Pr× ；
供试品比活性（U/mg)= ；
其中：
Pr：标准品活性，U/ml；
Ds：样品预稀释倍数；
Dr：标准品预稀释倍数；
Es：样品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er：标准品半效量的稀释倍数。
浓度7×10 个/ml～12×10 个/ml，细胞存活率≥90%。
（2）本细胞株可稳定表达TPO受体，大大提高了检测结果的稳定性、重复性；
（3）本方法使用CCK-8进行显色，与传统MTT法相比，显色时间仅1～4小时，节省传统方法中需要过夜放置的时间，并且在悬浮细胞显色不会出现沉淀；
（4）本检测方法采用四参数回归计算法处理原始数据，与传统存活率计算方式相比，数据结果更可靠、直观。
附图说明
具体实施方式
将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解。在超净台中将其移入离心管中，加入10% FBS+1640培养基重悬细胞。800rpm离心5min后弃去上清，加入细胞培养基及生长因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），终浓度10ng/ml，吹打混匀，移至细胞培养瓶中。瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次。
活率等。将细胞悬液用新鲜细胞培养基稀释至细胞浓度约为10×10 个/ml，每瓶15ml。轻轻摇匀，37℃，8% CO2条件下培养。复苏后最多传至第4代用于本次检测。
5
11×10 个/ml、细胞存活率95.3%。
5倍梯度稀释，配制9个浓度的样品溶液
（4）样品活性检测
取处于对数生长期的MO7e细胞，吹打混匀，800rpm离心。上清液高速离心后加入空白对照孔。沉淀细胞用无血清1640培养基洗涤两次，再用10% FBS+1640培养基重悬。用细
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胞计数仪计数后调整细胞浓度至1.8×10 个/ml。样品及空白对照50µl/孔，细胞150µl/孔加入96孔板中，37℃，8% CO2条件下培养60小时。
20μl，摇匀，放入CO2培养箱中孵育2h，用酶标仪测定450nm和600nm处吸光度。
将标准品溶液四参数曲线的（A+D)/2代入标准品与样品方程，得到待测样品半数有效浓度。
细胞增殖量与 TMP-Fc浓度的以10为底的对数呈现出良好的线性关系，R =0.998。TMP-Fc半效浓度为2.8ng/ml。
结果如图3所示，在TMP-Fc浓度为0.0005ng/ml ～5000ng/ml的范围内，MO7e细胞增
2
殖量与TMP-Fc浓度的以10为底的对数呈现出良好的线性关系，R =0.999。TMP-Fc半效浓度为3.0ng/ml。
细胞增殖量与罗米司亭浓度浓度的以10为底的对数呈现出良好的线性关系，R =0.995。罗米司亭浓度半效浓度为3.0ng/ml。
2
样品浓度范围 线性R
实例一 0.0032ng/ml ～1250ng/ml 0.998
实例二 0.0005ng/ml ～5000ng/ml 0.999
实例三 0.0005ng/ml ～5000ng/ml 0.997
（2）重现性
根据发明内容中具体步骤及线性与范围要求稀释TMP-Fc样品，重复测定6次计算RSD，表1结果显示，采用该方法检测TMP-Fc体外活性的重现性RSD= 8.1% ，RSD≤20%，符合一般生物制品活性检测精密度要求。
1 447897
2 435795
3 389073 400933 9.5%
4 409427
5 345565
6 377843
（3）准确度
TMP-Fc样品与TMP-Fc标准品按照一定比例混合，分别制成50%、100%、150%添加回收率样品，按发明内容中具体步骤测定未添加对照、50%、100%及150%添加回收率样品的活性，并与理论添加值比较，回收率在70%～130%范围内满足本方法准确度要求。
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