具有增加的硅摄取的植物
阅读：106发布：2022-01-27
专利汇可以提供具有增加的硅摄取的植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及定义如在大豆(soybean，Glycine max)栽培品种Hikmok sorip中发现的赋予高 硅 (Si)积累的基因组区域的核酸序列。在其核酸中引入了称为HiSil的这个区域的 植物 表现出增加的Si摄取。此外，提供了与高Si积累相关联的标记和使用这些标记鉴定高Si累积植物的方法。本发明提供的方法可以用于通过育种、遗传修饰或任何其他形式的 植物繁殖 来开发具有高Si积累能 力 的新植物。，下面是具有增加的硅摄取的植物专利的具体信息内容。
1.一种优良HiSil大豆植物，其中所述优良HiSil大豆植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型。
2.一种优良HiSil大豆植物，其中所述优良HiSil大豆植物在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处，如来自Hikmok sorip
(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
3.一种优良HiSil大豆植物，其中所述优良HiSil大豆植物在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体对应于Williams82参考基因组的物理位置31.15M碱基对至
36.72M碱基对。
4.如权利要求1-3中任一项所述的植物，其中该优良大豆是具有商业意义的产量的商业优良大豆品种。
5.如权利要求1-4中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或一部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-
569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的
573723-577171。
6.如权利要求1-5中任一项所述的植物，其中所述植物与LoSil植物相比，在该植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中具有增加的Si积累。
7.如权利要求6所述的植物，其中所述植物与LoSil植物相比具有至少1.2X、1.5X、2X、
3X或更高的Si积累。
8.如权利要求1-7中任一项所述的植物，其中所述植物的至少一个亲本品系由位于所述染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内的分子标记选择或鉴定，其中所述分子标记与所述植物中的Si积累相关联。
9.如权利要求8所述的植物，其中该分子标记是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状座位(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
10.如权利要求8-9中任一项所述的植物，其中该分子标记位于选自下组的、与增加的Si积累相关联的单核苷酸多态性(SNP)标记的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：G(33672717)、A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的植物，其中当在水培条件下向所述植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述植物在叶中包含至少约1％Si浓度的Si浓度。
12.如权利要求1-11中任一项所述的植物，其中该染色体区间源自选自下组的株系中的任一种，该组由以下各项组成：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A或PI90763。
13.一种源自如权利要求1-12中任一项所述的植物的子代植物。
14.一种源自如权利要求1-13中任一项所述的植物的植物细胞、植物种子或植物部分。
15.如权利要求1-14中任一项所述的植物，其中所述植物对选自下组的胁迫具有增加的抗性，该组由以下各项组成：病害(例如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆静脉坏死病毒、大豆茎溃疡、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌或纹枯病)；昆虫有害生物(例如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(例如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁黄化病或耐寒性(即极端温度))。
16.如权利要求1-13或15中任一项所述的植物，其中所述植物具有改良的农艺学性状，例如幼苗活力、产量潜力、磷酸盐摄取、植物生长、幼苗生长、磷摄取、倒伏、繁殖生长或谷物品质。
17.一种优良大豆植物，其中所述植物包含HiSil性状。
18.一种包含赋予增加的Si摄取的HiSil等位基因的优良HiSil大豆植物，并且其中该HiSil等位基因包含选自下组的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
19.如权利要求18所述的植物，其中该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-577171。
20.一种用于产生具有HiSil性状的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含H1单倍型的第一大豆株系或其子代；
b)使步骤a)中提供的该大豆植物与第二大豆植物杂交；
c)收集由步骤b)中的该杂交产生的种子；
d)将c)的种子再生成植物；
e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；
f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；
g)评估步骤f)的植物的高硅摄取(即HiSil性状)；以及
h)鉴定并选择作为高Si积累者的植物。
21.一种用于产生如下种子的方法，所述种子产生具有HiSil性状的大豆植物，该方法包括以下步骤：
a.提供包含H1单倍型的第一大豆株系或其子代；
b.使步骤a)中提供的该大豆植物与第二大豆植物杂交；
c.收集由步骤b)中的该杂交产生的种子；
d.将c)的种子再生成植物；
e.通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；
f.使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；以及
g.选择并鉴定产生作为高Si积累者的大豆植物的种子。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中该H1单倍型大豆植物选自以下项中的任一种：
PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI90763或其子代。
23.一种产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使具有高Si摄取的第一大豆植物与具有低Si摄取的第二大豆植物杂交，其中所述第一大豆植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；以及b)从a)的该植物杂交产生子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；
从而产生具有增加的Si摄取的大豆植物。
24.如权利要求23所述的方法，其中该第一大豆植物包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域的染色体区间，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中该第一大豆植物是以下项中的任一种：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI90763或其子代。
26.如权利要求24所述的方法，其中该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-577171。
27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中当在水培条件下向该第一大豆植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述大豆品种在叶中包含至少约1％Si浓度的Si浓度。
28.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其中当在水培条件下向具有低Si摄取的该第二大豆植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述植物在叶中包含小于1％Si浓度的Si浓度。
29.如权利要求20-28中任一项所述的方法，该方法包括另外的步骤，包括：从b)的该子代植物中分离核酸；针对如下分子标记的存在对所述核酸进行基因分型，所述分子标记位于对应于如下基因组区域或其一部分的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置
33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；进一步地，其中所述分子标记与所述植物中的Si积累相关联。
30.如权利要求29所述的方法，其中该分子标记位于选自下组的、与增加的Si积累相关联的、对应于如下染色体区间的单核苷酸多态性(SNP)标记的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述染色体区间来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15Mb碱基对至36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
31.一种产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)对a)的该核酸进行基因分型；
c)鉴定植物为包含与增加的Si摄取相关联的至少一种分子标记，其中所述分子标记位于对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置
33.15Mb碱基对至36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；以及
d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的所述分子标记的该植物产生大豆子代植物。
32.一种产生具有增加的硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)向大豆植物的基因组中引入包含含有如下核苷酸碱基对的核酸的染色体区间，所述核苷酸碱基对对应于如下位置：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；
SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-
577171；
b)通过从所述植物中分离核酸并针对与该染色体区间的存在以及增加的Si摄取性状相关的分子标记对该核酸进行基因分型来选择包含a)的该染色体区间的大豆植物、植物种质或植物种子；以及
c)产生具有增加的硅摄取的大豆植物。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中该分子标记位于20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内或位于所述染色体区间内，或者所述标记位于选自下组的、对应于如下基因组区域或其部分的SNP的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15Mb碱基对至
36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所产生的该植物或种子包含来自下组的、对应于如下基因组区域或其部分的至少一个SNP，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至
36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
35.如权利要求20-34中任一项所述的方法，其中所产生的该植物或种子是优良大豆品种。
36.一种通过如权利要求20-35中任一项所述的方法产生的植物、植物部分或植物种子。
37.一种产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)对a)的该核酸进行基因分型；
c)将植物鉴定为包含与Si转运体基因的存在相关联的至少一种分子标记，其中该基因编码包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中任一个的蛋白质；以及
d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的所述分子标记的该植物产生大豆子代植物。
38.一种防治大豆作物中的以下病害中的任一种的方法：亚洲大豆锈菌病、大豆胞囊线虫、线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜，该方法包括以下步骤：
a.在田间种植如权利要求1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；以及
b.确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
39.一种减少大豆作物中非生物胁迫损害的方法，其中该非生物胁迫是由以下项中的任一种所引起的：干旱、水淹/水大、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、低温、热、或除草剂，该方法包括以下步骤：
a.在田间种植如权利要求1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；以及
b.确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
40.一种提高大豆作物产量的方法，该方法包括以下步骤：
a.在田间种植如权利要求1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；以及
b.确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
41.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括以下步骤：
a.在田间种植如权利要求1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；以及
b.向田间施用包含硅的化合物：
i.在种植之前，
ii.在种植时，或
iii.在种植之后。
42.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括在田间种植如权利要求1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物，其中田间的土壤包含的硅水平为至少约0.8mM。
43.一种鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a.从第一大豆植物分离核酸；
b.在该核酸中检测与增加的Si摄取相关联的分子标记的存在，并且其中所述分子标记：与H1单倍型相关联；或位于对应于如下基因组区域的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处；
或位于从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；以及
c.基于b)的该分子标记的存在鉴定或选择所述大豆植物；
从而鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物。
44.如权利要求43所述的方法，其中该分子标记是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状座位(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中该染色体区间包含如下核酸中的任一个或一部分，所述核酸包含对应于以下位置的核苷酸碱基对：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-577171。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所鉴定或选择的该植物包含对应于以下项的至少一种标记：
a.来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处的基因组区域；或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对的基因组区域，或其部分，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；或者
b.选自由以下各项组成的组的基因glyma30000或glyma30020的SNP：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
47.如权利要求43-46中任一项所述的方法，其中该染色体区间包含编码如下多肽的核酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO.15的氨基酸序列，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
48.如权利要求43-47中任一项所述的方法，其中该染色体区间包含编码如下多肽的核酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列，进一步地，其中该多肽包含对应于位置
322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
49.如权利要求43-48中任一项所述的方法，其中该方法用于商业大豆植物育种程序中。
50.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中该检测包括检测多态简单重复序列(SSR)或单核苷酸多态性(SNP)中的至少一种等位基因形式。
51.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中该检测包括扩增该标记座位或该标记座位的一部分，并检测所得到的扩增的标记扩增子。
52.如权利要求51所述的方法，其中该扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与分离自该第一大豆植物或种质的核酸混合，其中该引物或引物对与该标记座位的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用该大豆核酸为模板，通过DNA聚合酶启动DNA聚合；和b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以产生至少一个扩增子。
53.如权利要求52所述的方法，其中该核酸选自DNA或RNA。
54.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中该扩增包括采用聚合酶链式反应
(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自该第一大豆植物或种质的核酸作为该PCR或LCR中的模板。
55.如权利要求43-54中任一项所述的方法，该方法进一步包括如下步骤，其中将与增加的Si摄取相关联的该染色体区间基因渗入第二大豆植物或种质中以产生具有增加的Si摄取的经基因渗入的大豆植物或种质，其中该经基因渗入的大豆植物进一步包含以下项中的至少一种：
a.选自由以下各项组成的组的基因Glyma30000或30020上的SNP标记：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)；
b.对应于如下基因组区域或其部分的标记，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或
c.从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
56.如权利要求55所述的方法，其中与该第一大豆植物或种质相比，该第二大豆植物或种质表现出低Si摄取，其中与该第二植物或种质相比，该经基因渗入的大豆植物或种质表现出增加的Si摄取。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中该第二大豆植物或种质包括优良大豆品系或外来大豆品系。
58.如权利要求43-57中任一项所述的方法，该方法包括将代表该检测到的等位基因或分子标记的数据电子传输或电子存储在计算机可读介质中。
59.如权利要求43-58中任一项所述的方法，其中使用TASSEL、GeneFlow或MapManager-QTX软件确定该分子标记或等位基因。
60.如权利要求43-59中任一项所述的方法，其中所述染色体区间包含选自下组的
Glyma16g:30000或Glyma16g:30020基因的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，其中所述SNP的存在与Si积聚相关。
61.如权利要求1-13；15-19；和36中任一项所述的植物，其中所述染色体区间包含在大豆植物中提供增加的硅摄取的SEQ ID NO.14或16或其一部分。
62.如权利要求1-13；15-19；36和61中任一项所述的植物，其中所述植物包含与增加的Si摄取相关联的、能够用如下引物序列扩增和鉴定的分子标记：SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11和27-277。
63.如权利要求1-13；15-19；36和61-62中任一项所述的植物，其中所述植物包含能够用如下序列扩增和鉴定的标记：SEQ ID NO.12、13和278-495。
64.如权利要求61-63中任一项所述的植物，其中所述分子标记位于HiSil区域基因内，如选自下组的基因Glyma30000或30020的核酸所定义的，该组由以下各项组成：A
(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
65.一种农艺学上优良的大豆植物，当在水培条件下向植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，该植物能够以至少1％Si浓度的浓度在叶组织中积累Si，其中该大豆包含引入到其基因组中的、包含SEQ ID NO:14和16中任一个的基因组区域。
66.如权利要求65所述的植物，其中所述植物具有如下叶Si浓度，所述叶Si浓度为不包含所述基因组区域的对照植物的浓度的至少约一点二倍(1.2X)、一点五倍(1.5X)、二倍(2X)或三倍(3X)。
67.如权利要求1-13；15-19；36和61-66中任一项所述的植物，其中所述染色体区间或基因组区域包含编码具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的多肽的核酸，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
68.如权利要求1-13；15-19；36和61-67中任一项所述的植物，其中所述染色体区间或基因组区域包含编码具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的多肽的核酸，进一步地，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
69.如权利要求68所述的植物，其中该核酸是SEQ ID NO:16。
70.如权利要求67所述的植物，其中该核酸是SEQ ID NO:14。
71.一种具有高Si摄取的大豆品种或谱系的植物，其条件是所述品种不是Hikmok
sorip。
72.如权利要求71所述的植物，其中该大豆品种或谱系在其基因组中包含含有SEQ ID NO:14或16的染色体区间，其中所述染色体区间源自Hikmok sorip。
73.由如权利要求61-72中任一项所述的植物产生的种子。
74.如权利要求1-13；15-19；或36或61-72中任一项所述的植物，其中所述植物另外地在其基因组中具有赋予选自下组的性状中的任一种的转基因，该组由以下各项组成：除草剂抗性或昆虫抗性。
75.一种向其基因组中引入了如下核酸序列的植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:
15或SEQ ID NO:17中任一个具有60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的蛋白质。
76.如权利要求75所述的植物，其中该植物是单子叶植物或双子叶植物。
77.如权利要求75-76中任一项所述的植物，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵和水稻。
78.如权利要求75-77中任一项所述的植物，其中该蛋白质是促进Si摄取到该植物中的功能性Si转运体。
79.如权利要求75-78中任一项所述的植物，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:14或16中的任一个。
80.如权利要求75-79中任一项所述的植物，其中该核酸编码包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或者由其组成的蛋白质。
81.如权利要求75-80中任一项所述的植物，其中该核酸源自具有高硅摄取的大豆属植物。
82.如权利要求75-81中任一项所述的植物，其中该核酸源自具有高Si摄取的黑脐大豆品种(如Hikmok sorip)。
83.如权利要求75-82中任一项所述的植物，其中将至少两个核酸序列引入其基因组中，其中该两个核酸序列编码包含含有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的多肽序列的蛋白质。
84.如权利要求75-83中任一项所述的植物，其中该蛋白质在所述植物的根中具有活性。
85.如权利要求75-84中任一项所述的植物，其中该蛋白质赋予在该植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中的Si积累。
86.如权利要求75-85中任一项所述的植物，其中所述核酸的引入通过异源的或转基因的基因表达来完成。
87.如权利要求75-86中任一项所述的植物，其中被引入所述植物的基因组中的该核酸通过植物表达盒引入。
88.如权利要求87所述的植物，其中该植物表达盒包含与所述核酸可操作地连接的启动子，其中所述启动子促进该核酸在所述植物的根组织中的表达。
89.如权利要求88所述的植物，其中该启动子序列包含如下核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:18、19或20具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸。
90.如权利要求88-89中任一项所述的植物，其中该启动子是根特异性启动子或根偏好性启动子。
91.如权利要求90所述的植物，其中该根特异性或根偏好性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RCc3、PHT1、MtPT1、MtPT2、Pyk10、β-微管蛋白、LRX1、BTG-26、LeAMT1、LeNRT1-
1、KDC1、TobRb7、OsRAB5a、ALF5和NRT2。
92.如权利要求75-86中任一项所述的植物，其中该核酸已经通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过修饰基因组核酸被引入到该植物基因组中。
93.如权利要求75-92中任一项所述的植物，其中该核酸编码具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的多肽，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
94.如权利要求75-93中任一项所述的植物，其中该核酸编码具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的多肽，进一步地，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
95.如权利要求75-94中任一项所述的植物，其中与不包含所述核酸的对照植物相比，该植物是高Si积累者。
96.如权利要求75-86中任一项所述的植物，其中所述核酸的引入通过植物基因渗入或植物育种来完成。
97.如权利要求96所述的植物，其中所述植物的至少一个亲本品系由与所述核酸相关联的分子标记选择或鉴定。
98.如权利要求75-97中任一项所述的植物，其中该核酸的引入赋予以下项中的任一种：增加的生物抗性或耐受性、增加的非生物抗性或耐受性、增加的产量、增加的生物量、品质或其组合。
99.如权利要求75-98中任一项所述的植物，其中该核酸的引入赋予对来自下组的至少一种病原体的增加的抗性，该组由以下各项组成：线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜；或其组合。
100.如权利要求75-99中任一项所述的植物，该植物对选自下组的胁迫具有增加的抗性，该组由以下各项组成：病害(例如白粉病、终极腐霉菌、根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、叶瘟和穗瘟、或纹枯病)；昆虫有害生物(例如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(例如干旱、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼或耐寒性(即极端温度))。
101.如权利要求75-100中任一项所述的植物，该植物具有改良的农艺学性状，例如幼苗活力、产量潜力和磷酸盐摄取、植物生长、幼苗生长、磷摄取、倒伏、繁殖生长或谷物品质。
102.如权利要求75-101中任一项所述的植物，其中该植物是作物植物。
103.如权利要求75-102中任一项所述的植物，其中所述植物是大豆植物并且不是
Hikmok sorip(PI372415A)。
104.如权利要求75-103中任一项所述的植物，其中该植物是优良大豆植物。
105.如权利要求75-104中任一项所述的植物，其中当在水培条件下向植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述植物在叶中包含至少1％Si浓度的硅浓度。
106.如权利要求75-105中任一项所述的植物，其中所述植物与对照植物相比具有至少约两倍(2X)的叶Si浓度。
107.一种包含如下分离的多核苷酸的植物表达盒，所述分离的多核苷酸编码选自由SEQ ID NO:14和16组成的组的Si转运体。
108.如权利要求107所述的表达盒，其中所述多核苷酸编码选自由SEQ ID NO:15或17组成的组的多肽。
109.如权利要求107-108中任一项所述的植物表达盒，其中该多核苷酸可操作地连接至非天然启动子。
110.如权利要求107-109中任一项所述的植物表达盒，其中该DNA对编码包含SEQ ID NO:15的多肽的所述多核苷酸天然模板具有至少一个等位基因修饰，其中该多核苷酸等位基因修饰导致选自下组的氨基酸变化中的任一种，该组由以下各项组成：位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸。
111.如权利要求107-110所述的植物表达盒，其中该DNA对编码包含SEQ ID NO:17的多肽的所述多核苷酸天然模板具有至少一个等位基因修饰，其中该多核苷酸等位基因修饰导致选自下组的氨基酸变化中的任一种，该组由以下各项组成：位置322处的组氨酸或位置
431处的甘氨酸。
112.如权利要求110-111中任一项所述的植物表达盒，其中该等位基因修饰通过
CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或基因组编辑技术来实现。
113.一种包含如权利要求107-112中任一项所述的植物表达盒的载体。
114.一种包含如权利要求107-112中任一项所述的多核苷酸的植物表达盒。
115.如权利要求107-112中任一项所述的植物表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接至根特异性或根偏好性启动子。
116.如权利要求115所述的植物表达盒，其中所述启动子包含SEQ IDNO:18、19或20。
117.一种包含如权利要求114-116所述的植物表达盒的转基因植物。
118.一种包含如权利要求114-116所述的植物表达盒的转基因种子。
119.如权利要求117所述的转基因植物，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：
大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵和水稻。
120.如权利要求119所述的转基因种子，其中所述种子来自选自下组的转基因植物，该组由以下各项组成：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵和水稻。
121.一种产生具有增加的硅摄取的植物的方法，所述方法包括以下步骤：
d)将编码HiSil蛋白的核酸引入植物的基因组中；
e)选择包含a)的该核酸的植物、植物种质或植物种子；以及
f)产生具有增加的硅摄取的植物。
122.如权利要求121所述的方法，其中该核酸序列编码与SEQ ID NO:15或17中任一个具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的蛋白质序列。
123.如权利要求121-122中任一项所述的方法，其中该植物是双子叶植物或单子叶植物。
124.如权利要求121-123中任一项所述的方法，其中与不包含所述核酸的对照植物相比，该植物是高Si积累者。
125.如权利要求121-124中任一项所述的方法，其中该植物是大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵或水稻。
126.如权利要求121-125中任一项所述的方法，其中该植物向其基因组中引入了包含与SEQ ID NO:14或16中任一个具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或
100％序列同一性的核苷酸序列的核酸序列。
127.如权利要求121-126中任一项所述的方法，其中该核酸序列编码促进Si摄取的蛋白质。
128.如权利要求127所述的方法，其中该核酸序列编码HiSil蛋白。
129.如权利要求121-128中任一项所述的方法，其中该蛋白质在根组织中具有活性。
130.如权利要求121-129中任一项所述的方法，其中该蛋白质赋予在该植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中的Si积累。
131.如权利要求121-130中任一项所述的方法，其中除了该核酸之外，已经将可操作连接的根特异性或根偏好性启动子引入所述植物基因组中。
132.如权利要求121-131中任一项所述的方法，其中除了所述核酸之外，已经将可操作连接的HiSil启动子序列引入所述植物基因组中。
133.如权利要求132所述的方法，其中该启动子序列包含如下核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:18、19或20具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸。
134.如权利要求131所述的方法，其中该根特异性或根偏好性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RCc3、PHT1、MtPT1、MtPT2、Pyk10、β-微管蛋白、LRX1、BTG-26、LeAMT1、LeNRT1-1、KDC1、TobRb7、OsRAB5a、ALF5和NRT2。
135.如权利要求121-130中任一项所述的方法，其中该核酸已经通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过特异性修饰基因组核酸被引入到该植物基因组中。
136.如权利要求121-130中任一项所述的方法，其中所述核酸的引入通过异源的或转基因的基因表达来完成。
137.如权利要求121-130中任一项所述的方法，其中所述核酸的引入通过植物基因渗入、植物育种或标记辅助育种(MAB)来完成。
138.一种产生抗病害植物的方法，该方法包括以下步骤：
b)将如权利要求108-112和114-116中任一项中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中所述植物表达盒的所述引入赋予所述植物中增加的Si摄取；
从而产生抗病害植物。
139.一种产生具有增加的产量的植物的方法，该方法包括以下步骤：
b)将如权利要求114-116中任一项中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中所述植物表达盒的所述引入赋予所述植物中增加的Si摄取；
从而产生具有增加的产量的植物。
140.如权利要求138和139中任一项所述的方法，其中该植物是大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵或水稻。
141.一种作为如下转基因雌性祖先大豆植物的子代的农艺学上优良的大豆种子，所述祖先大豆植物在其基因组中具有表达如下Si转运体的重组DNA，所述Si转运体包含与SEQ ID NO:15或17中任一个的氨基酸序列具有至少约80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
142.一种用于产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，步骤包括：
a)将包含编码多肽的多核苷酸的重组DNA分子引入植物细胞中，其中该多核苷酸的核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：
i)如SEQ ID NO:14或16所示的核苷酸序列；
ii)编码具有SEQ ID NO:15或17的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
iii)与SEQ ID NO:14或16具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列；和
iv)编码与SEQ ID NO:15和17具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；
以及
b)从所述植物细胞生长植物。
143.如权利要求142所述的方法，该方法进一步包括选择与对照植物相比具有选自以下项的增强的性状的植物：增加的产量、提高的氮利用效率、提高的病害抗性、增加的非生物胁迫耐受性、提高的昆虫抗性、和提高的水分利用效率或耐旱性。
144.一种如权利要求1-19；36；74-106；119-120和141中任一项中所定义的植物的种子。
145.一种来自如权利要求1-19；36；61-72；74-106；119-120和141中任一项中所定义的植物的种子。
146.一种用于产生硅高积累植物的试剂盒，该试剂盒包含：
a)如权利要求144或145所述的种子；以及
b)用于制造硅土壤改良剂的至少一种组分。
147.如权利要求146所述的试剂盒，其中所述组分选自下组，该组由以下各项组成：矿渣、硅灰石、钢厂矿渣、碎石、硅酸钙、硅酸镁、无定形硅藻土(DE)、硅酸钙镁、磷炉副产物、硅酸钙、硅酸钾、硅酸、有机硅、硅酸钠。
148.如权利要求147所述的试剂盒，其中所述组分选自：Ca2SiO4、CaSiO2、SiO2、CaSiO3、MgSiO3、或K2SiO3、(Si(OH)4、H4SiO4、和R2SiO，其中R是有机基团，如甲基、乙基或苯基。
149.如权利要求146-148中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含关于如何在水中稀释所述硅组分用于在土壤中施用的说明书。
150.一种如权利要求144或145中所定义的种子的细胞。
151.一种如权利要求1-19；36；61-72；74-106；119-120和141中任一项中所定义的植物的细胞。
152.一种用于使植物生长的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供根据权利要求1-19；36；61-72；74-106；119-120和141中任一项所述的植物或如权利要求144或145中所定义的种子；
b)使植物从中生长；以及
c)用硅土壤改良剂灌溉所述植物。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述硅土壤改良剂选自下组，该组由以下各项组成：矿渣、硅灰石、钢厂矿渣、碎石、硅酸钙、硅酸镁、无定形硅藻土(DE)、硅酸钙镁、磷炉副产物、硅酸钙、硅酸钾、硅酸、有机硅、硅酸钠。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述硅土壤改良剂选自：Ca2SiO4、CaSiO2、SiO2、CaSiO3、MgSiO3、或K2SiO3、(Si(OH)4、H4SiO4、和R2SiO，其中R是有机基团，如甲基、乙基或苯基。
155.一种将HiSil性状引入大豆植物中的方法，该方法包括：
a)选择在其基因组中包含编码与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:15具有至少80％序列同一性的蛋白质的核酸序列的大豆植物，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含苏氨酸，以及
b)向该核酸序列中引入修饰使得该经编码的蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸，
其中定点核酸酶(SDN)将该修饰引入该核酸序列中。
156.如权利要求155所述的方法，其中该SDN选自：大范围核酸酶、锌指、转录激活子样效应子核酸酶系统(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR)。
157.一种通过如权利要求155所述的方法产生的大豆植物。
158.一种包含如下核酸序列的优良大豆植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的蛋白质，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸。
159.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括以下步骤：
a.在田间种植如权利要求152-154和157-158中任一项中所述的大豆植物；以及
b.向田间施用包含硅的化合物：
i.在种植之前，
ii.在种植时，或
iii.在种植之后。
160.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括：
a.选择用于种植该大豆作物的地点，其中该地点包含如下土壤，所述土壤具有水平为至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少30ppm、至少40ppm或至少50ppm的硅浓度，以及
b.种植如权利要求152-154和157-158中任一项中所述的大豆植物并使其生长。
161.如权利要求72-106所述的植物，其中该植物包含H1单倍型。
具有增加的硅摄取的植物
技术领域
[0001] 本发明涉及与大豆中高硅积累相关联和/或赋予大豆中高硅积累的染色体区间、标记座位以及基因。更具体地说，本发明涉及硅积累及其在植物中达到的益处，在这些植物中引入了这些染色体区间、座位和基因(通过育种、嫁接或基因工程)，从而实现高硅摄取。
本发明还涉及如下标记，所述标记可用于鉴定和/或选择含有用于硅积累及其应用的这些染色体区间、座位和基因的植物。
本发明还涉及如下标记，所述标记可用于鉴定和/或选择含有用于硅积累及其应用的这些染色体区间、座位和基因的植物。
背景技术
[0002] 硅(Si)是地球表面上最丰富的元素之一，并且占土壤质量的50％-70％(Epstein，1994)。植物中的Si吸收在缓解生物和非生物胁迫耐受性方面起着重要的作用。许多研究已经报道了作为有益元素的Si及其积累已被证实增强了植物活力并促进植物生长。更具体地说，已经发现，施Si肥对包括小麦、大麦、玫瑰、黄瓜、香瓜、小西葫芦、倭瓜、葡萄和蒲公英在内的若干作物植物中的白粉病是有效的(Bowen等人，1992；Menzies等人，1992；Fawe等人，
2001；Bélanger等人，2003；Rodrigues等人，2003)。还发现Si对治理如下其他病害是有益的：例如，水稻上的稻瘟病(稻瘟菌(Pyricularia grisea))和褐斑病(稻平脐蠕孢
(Bipolaris oryzae))，以及大豆上的大豆锈病和疫霉(Phytophthora)茎腐病和疫霉根腐病(Rodrigues等人，2003；Arsenault-Labrecque等人，2012；Guérin等人，2014)。Si在缓解非生物胁迫，像盐度、重金属、耐旱性和极端温度状况胁迫上起着类似的作用(Tuna等人，
2008；Gu等人，2011；Chen等人，2011；XiaoYu等人，2013)。Epstein(2009)最近的一篇综述得出的结论是，在胁迫下Si的有益作用非常显著，而在正常的生长条件下，其作用往往是微乎其微的，或者甚至是不存在的。因此，Si不被视为主要的必需营养素，而是在胁迫下提供保护的‘准必需’元素。
2001；Bélanger等人，2003；Rodrigues等人，2003)。还发现Si对治理如下其他病害是有益的：例如，水稻上的稻瘟病(稻瘟菌(Pyricularia grisea))和褐斑病(稻平脐蠕孢
(Bipolaris oryzae))，以及大豆上的大豆锈病和疫霉(Phytophthora)茎腐病和疫霉根腐病(Rodrigues等人，2003；Arsenault-Labrecque等人，2012；Guérin等人，2014)。Si在缓解非生物胁迫，像盐度、重金属、耐旱性和极端温度状况胁迫上起着类似的作用(Tuna等人，
2008；Gu等人，2011；Chen等人，2011；XiaoYu等人，2013)。Epstein(2009)最近的一篇综述得出的结论是，在胁迫下Si的有益作用非常显著，而在正常的生长条件下，其作用往往是微乎其微的，或者甚至是不存在的。因此，Si不被视为主要的必需营养素，而是在胁迫下提供保护的‘准必需’元素。
[0003] Si以硅酸的形式在植物中被根系吸收，并最终作为聚合的硅沉积在其嫩枝和叶中(Sangster等人，2001)。在植物物种中，叶中的Si吸收和积累并不统一。一般而言，单子叶植物(如水稻、甘蔗和大多数谷物)吸收大量的Si(高达10％干重)，并从Si供料中获得积极的益处(Ma和Yamaji，2006)。另一方面，许多双子叶植物似乎不受该元素的影响，并从硅补充剂中获得最小限度的益处(Hodson等人，2005)。在Si积累上的这种差异归因于根部吸收Si的能力。这可以解释为什么Si供料的实验和报道的益处得到了不规律的结果，取决于所测试的植物是高还是低积累者。因此，施用Si作为肥料具有局限性，这与植物物种是否能够摄取有关。
[0004] 已经发现，在像水稻这样的单子叶植物中，根部中的Si流入被称为Lsi1的水通道蛋白所控制(Ma等人，2006)。后来，发现了另一个基因Lsi2，该基因编码Si的流出转运，从而更好地定义了涉及Si摄取的分子机制(Ma等人，2007)。基因Lsi1和Lsi2二者都是使用突变体资源发现的，并且目前还没有报道有天然变体。在其他单子叶植物物种(如高粱和玉蜀黍)中，植物的Si摄取和积累机制已得到进一步验证(Mitani等人，2009)。然而，就像水稻一样，高粱和玉蜀黍中似乎也缺乏自然变异。
[0005] 与单子叶植物相比，对双子叶植物中的Si积累知之甚少。已经做出努力来证明通过转基因方法可以改善双子叶植物的Si摄取能力。拟南芥属是不携带Lsi1转运体的物种，当用来自小麦和水稻的Lsi1基因转化时，显示Si积累增加4-5倍(Montpetit等人，2012)。在大豆中尝试了类似的方法，凭借该方法测试了用来自小麦或木贼的Lsi1转化的大豆植物中改善的Si积累(Guérin，2014)。然而，经转化的植物吸收与对照相似的量，最近鉴定的促进大豆中Si流入的基因GmNIP2-1和GmNIP2-2解释了该结果(Deshmukh等人，2013)。这得出了如下结论：大豆已经携带功能性硅流入转运体(Lsi1)并且另外的转运体(天然的或转基因的)的基因渗入不会增加Si摄取。事实上，已经发现大豆中的两个Lsi1基因的DNA序列和表达在不同基因型之间是相似的，由此表明缺乏Si流入转运体基因的自然变异。因此，使用这些Si流入转运体来培育新型品种的可能性是不大可能的。
[0006] 然而，有证据表明，一些大豆基因型比其他基因型吸收更多的Si，并且因此可以在施Si肥下更好地抵抗诸如由病害施加的胁迫等的胁迫(Arsenault-Labrecque等人，2012；Guérin等人，2014)。在这一点上，可以赋予这种性质的机制或基因是未知的。因此，对针对Si摄取能力的天然大豆变体和导致该变异的机制/基因的鉴定绝对可以代表大豆改良的宝贵资源。
发明内容
[0007] 提供了用于鉴定、选择和/或产生具有增加的硅积累和/或摄取的大豆植物的组合物和方法。如本文所述，与HiSil性状相关联的标记可以包含一个或多个遗传座位处的单个等位基因或等位基因的组合、基本上由其组成或由其组成(例如参见表15-21)。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了向其基因组中引入了编码HiSil蛋白的核酸序列的植物，其中与不包含编码HiSil蛋白的核酸序列的对照植物(即LoSil植物)相比，向其基因组中的引入增加了该植物中的Si积累。
[0009] 在本发明的另外的方面，提供了在其基因组中包含如下染色体区间的植物(例如优良(elite)大豆)，所述染色体区间包含与Si积累相关联的H1单倍型。
[0010] 在本发明的另外的方面，提供了在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0011] 在本发明的另外的方面，提供了在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体对应于物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基对。具体地，碱基对的编号对应于Willaims82基因组图谱(即大豆基因组组装来自JGI第8版，基于最初的Glyma v1(2012年1月)，本文中为“Williams82图谱”)。
[0012] 在本发明的另外的方面，提供了向其基因组中引入了与H1单倍型大豆植物的Si积累相关联的染色体区间的植物。具体地，H1单倍型源自Hikmok sorip，并且其中该植物是优良大豆植物，并且在另一个实施例中，其中该染色体区间包含如表15-21中所示的至少一种分子标记。
[0013] 在本发明的另外的方面，提供了向其基因组中引入了与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。在另一个实施例中，该染色体区间包含如表15-21中所示的至少一种分子标记。
[0014] 在本发明的另外的方面，提供了向其基因组中引入了与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体，对应于Williams82图谱从物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基对。
[0015] 在另外的方面，提供了在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0016] 在另外的方面，提供了向其基因组中引入了包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0017] 在另外的方面，提供了如下植物，其中所述植物包含HiSil性状。进一步提供了包含源自Hikmok sorip或其子代的HiSil性状的植物。
[0018] 在另外的方面，提供了包含赋予增加的Si摄取的HiSil等位基因的植物，并且其中该HiSil等位基因包含选自下组的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0019] 根据本发明的具体方面，提供了如本文所定义的植物，其中该核酸的存在/引入赋予了对来自下组的至少一种病原体的增加的抗性，该组由以下各项组成：线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、小麦白粉菌(Blumeria graminis)、瓜类单囊壳(Podosphaera xanthii)、黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)、终极腐霉菌(Pythium ultimum)、葡萄钩丝壳
(Uncinula necator)、豌豆球腔菌(Mycosphaerella pinodes)、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、麦二叉蚜
(Schizaphis graminum)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)、网纹野蛞蝓(Deroceras reticulatum)、小蔗螟(Diatraea saccharalis)、麦二叉蚜和桃蚜(yzus persicae)；或其组合。
(Uncinula necator)、豌豆球腔菌(Mycosphaerella pinodes)、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、麦二叉蚜
(Schizaphis graminum)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)、网纹野蛞蝓(Deroceras reticulatum)、小蔗螟(Diatraea saccharalis)、麦二叉蚜和桃蚜(yzus persicae)；或其组合。
[0020] 根据本发明的具体方面，提供了对选自下组的胁迫具有增加的抗性的植物，该组由以下各项组成：病害(例如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆静脉坏死病毒、大豆茎溃疡、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌(Fusarium)或纹枯病)；昆虫有害生物(例如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(例如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁黄化病或耐寒性(即极端温度))。
[0022] 根据另外的方面，提供了如下抗病害植物，所述植物包含来自Hikmok sorip登录PI372415A或其子代的基因渗入，其中该基因渗入包含赋予Si摄取的与位于等效于连锁群J的染色体(16号染色体)上的至少一个标记连锁的QTL，并且其中所述标记位于如下染色体区间或其一部分内，所述染色体区间在来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上对应于约95cM至约102cM距离或从物理位置33104446bp至35762786bp。在另一个实施例中，所述基因渗入来自以下项中的任一种：PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A、PI90763或其子代。
[0023] 根据另外的方面，提供了与在水培条件下生长的LoSil或对照植物相比，可以按增加的速率摄取和积累Si到其叶或茎组织中的植物。
[0024] 根据另外的方面，提供了包含赋予增加的Si摄取的HiSil等位基因的植物，并且其中该HiSil等位基因包含选自下组的、对应于如下染色体区间的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下各项组成：G(33672717)、A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述染色体区间来自Hikmok sorip 16号染色体在约95cM至约102cM距离处或从物理位置33104446碱基对至3576286碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0026] 具体地，关于如本文所定义的植物，该植物是作物植物。更具体地，该作物植物是大豆(soybean或Glycine max)植物。最具体地，该大豆植物是优良大豆植物。
[0027] 在另外的方面，提供了用于产生具有HiSil性状的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)提供包含H1单倍型的第一大豆植物品系或其子代；b)使步骤a)中提供的大豆植物与第二大豆植物杂交；c)收集由步骤b)中的杂交产生的种子；d)将c)的种子再生成植物；e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或
多个回交世代；f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；g)评估步骤f)的植物的高硅摄取(即HiSil性状)；以及h)鉴定并选择作为高Si积累者的植物，其中通过针对与HiSil性状相关联的标记(如，在距离如下染色体区间或其一部分20cM、10cM、5cM或更少内的标记，所述染色体区间或其一部分在来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上对应于约95cM至约102cM距离或从物理位置33104446bp至35762786bp)对该植物进行基因
分型来进行该鉴定。
多个回交世代；f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；g)评估步骤f)的植物的高硅摄取(即HiSil性状)；以及h)鉴定并选择作为高Si积累者的植物，其中通过针对与HiSil性状相关联的标记(如，在距离如下染色体区间或其一部分20cM、10cM、5cM或更少内的标记，所述染色体区间或其一部分在来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上对应于约95cM至约102cM距离或从物理位置33104446bp至35762786bp)对该植物进行基因
分型来进行该鉴定。
[0028] 根据本发明的具体方面，提供了用于产生具有该HiSil性状的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)提供选自下组的以下大豆株系中的任一种或其子代，该组由以下各项组成：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A或PI90763；b)使步骤a)中提供的大豆植物与第二大豆植物杂交；c)收集由步骤b)中的杂交产生的种子；
[0029] 将c)的种子再生成植物；d)通过使步骤c)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；e)使步骤d)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；f)评估步骤e)的植物的高硅摄取(即HiSil性状)；以及g)鉴定并选择作为高Si积累者的植物，其中通过针对与HiSil性状相关联的标记(如，在距离如下染色体区间或其一部分20cM、10cM、5cM或更少内的标记，所述染色体区间或其一部分在来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上对应于约95cM至约102cM距离或从物理位置33104446bp至35762786bp)对该植物进行基因分型来进行该鉴定。
[0030] 根据本发明的具体方面，提供了用于产生如下种子的方法，所述种子产生具有HiSil性状的大豆植物，该方法包括以下步骤：a)提供包含H1单倍型的第一大豆植物品系或其子代；b)使步骤a)中提供的大豆植物与第二大豆植物杂交；c)收集由步骤b)中的杂交产生的种子；d)将c)的种子再生成植物；e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；以及g)选择并鉴定产生作为高Si积累者的大豆植物的种子，其中通过针对与HiSil性状相关联的标记(如，在距离如下染色体区间或其一部分20cM、10cM、5cM或更少内的标记，所述染色体区间或其一部分在来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上对应于约95cM至约102cM距离或从物理位置33104446bp至35762786bp)对该植物进行
基因分型来进行该鉴定。
基因分型来进行该鉴定。
[0031] 根据另外的方面，本发明提供了用于产生如下种子的方法，所述种子产生具有HiSil性状的大豆植物，该方法包括以下步骤：提供选自下组的以下大豆株系中的任一种或其子代，该组由以下各项组成：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A或PI90763；使步骤a)中提供的大豆植物与第二大豆植物杂交；收集由步骤b)中的杂交产生的种子；将c)的种子再生成植物；通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；以及选择并鉴定产生作为高Si积累者的大豆植物的种子，其中通过针对与HiSil性状相关联的标记(如，在距离如下染色体区间或其一部分20cM、10cM、5cM或更少内的标记，所述染色体区间或其一部分在来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上对应于约95cM至约102cM距离或从物理位置33104446bp至35762786bp)对该植物进行
基因分型来进行该鉴定。
基因分型来进行该鉴定。
[0032] 根据本发明的具体方面，提供了产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)使具有高Si摄取的第一大豆植物与具有低Si摄取的第二大豆植物杂交，其中所述第一大豆植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；和b)从a)的植物杂交产生子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；从而产生具有增加的Si摄取的大豆植物。
[0033] 根据本发明的具体方面，提供了防治作物中的以下病害中的任一种的方法：亚洲大豆锈菌病、大豆胞囊线虫、线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜，该方法包括以下步骤：a)在田间种植如本文所述的大豆HiSil植物；和b)确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0034] 根据本发明的具体方面，提供了减少作物中非生物胁迫损害的方法，其中该非生物胁迫是由以下项中的任一种所引起的：干旱、水淹/水大、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、低温、热、或除草剂，该方法包括以下步骤：a)在田间种植如本文所述的大豆HiSil植物；和b)确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应(例如水培或田间条件)。
[0035] 根据本发明的具体方面，提供了提高作物产量的方法，该方法包括以下步骤：a)在田间种植如本文所述的大豆HiSil植物；和b)确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0036] 根据本发明的具体方面，提供了使作物生长的方法，该方法包括以下步骤：a)在田间种植如本文所述的HiSil植物；和b)向田间施用包含硅的化合物：在种植之前、在种植时或在种植之后。
[0037] 根据本发明的具体方面，提供了使作物生长的方法，该方法包括在田间种植如本文所述的HiSil植物，其中田间的土壤包含的硅水平为至少约0.8mM。
[0038] 根据本发明的具体方面，提供了鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一植物的方法，该方法包括以下步骤：a)从第一植物分离核酸；b)在该核酸中检测与增加的Si摄取相关联的分子标记的存在，并且其中该分子标记：与H1单倍型相关；或位于对应于如下基因组区域的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处；或位于从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；和c)基于b)的分子标记的存在鉴定或选择所述大豆植物；从而鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物。
[0039] 根据如本文所定义的HiSil植物，该植物或第一植物是作物植物。更具体地，该作物植物是大豆作物。
[0040] 根据另外的方面，提供了产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：使具有低Si摄取的第一大豆植物与具有高Si摄取的第二大豆植物杂交，其中所述第二大豆植物包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域的染色体区间，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约95cM至约102cM距离处或从物理位置33104446碱基对至3576286碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；
和从a)的植物杂交产生子代植物，其中所述子代植物包含a)中的与Si积累相关联的染色体区间或其一部分；从而产生具有增加的Si摄取的大豆植物。
和从a)的植物杂交产生子代植物，其中所述子代植物包含a)中的与Si积累相关联的染色体区间或其一部分；从而产生具有增加的Si摄取的大豆植物。
[0041] 根据另外的方面，本发明提供了产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)从大豆植物中分离核酸；b)对a)的核酸进行基因分型；c)鉴定植物为包含与增加的Si摄取相关联的至少一种分子标记，其中所述分子标记位于对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sori|16号染色体在约95cM至约102cM距离处或从物理位置33104446碱基对至3576286碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；以及d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的所述分子标记的植物产生大豆子代植物。
[0042] 根据另外的方面，提供了产生具有增加的硅摄取的大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)向大豆植物的基因组中引入包含含有如下碱基对的核酸的HiSil染色体区间，所述碱基对对应于如下位置：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的565530-578331；SEQ ID NO:1的565530-568778；SEQ ID NO:1的567613-568778；SEQ ID NO:1的
575050-578331；或SEQ ID NO:1的577172-578331；b)通过从所述植物中分离核酸并针对与染色体区间的存在以及增加的Si摄取性状相关的分子标记对该核酸进行基因分型来选择
包含a)的染色体区间的大豆植物、植物种质或植物种子；和c)产生具有增加的硅摄取的大豆植物。
575050-578331；或SEQ ID NO:1的577172-578331；b)通过从所述植物中分离核酸并针对与染色体区间的存在以及增加的Si摄取性状相关的分子标记对该核酸进行基因分型来选择
包含a)的染色体区间的大豆植物、植物种质或植物种子；和c)产生具有增加的硅摄取的大豆植物。
[0043] 根据另外的实施例，提供了产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)从大豆植物中分离核酸；b)对a)的核酸进行基因分型；c)将植物鉴定为包含与Si转运体基因的存在相关联的至少一种分子标记(如表15-21中所述的任何分子标记)，其中该基因编码包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中任一个的蛋白质；以及d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的所述分子标记的植物产生大豆子代植物。
[0044] 根据另外的实施例，提供了通过如本文所定义的方法产生的植物、植物部分或植物种子。
[0045] 根据另外的方面，本发明提供了如下农艺学上优良的大豆植物，当在水培条件下向植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，该植物能够以至少1％Si浓度的浓度在叶组织中积累Si，其中该大豆包含引入到其基因组中的、对应于SEQ ID NO:14或16中任一个的基因组区域。
[0046] 根据另外的方面，本发明提供了具有高Si摄取的大豆品种或谱系的植物，其条件是所述品种不是Hikmok sorip。
[0047] 根据另外的方面，本发明提供了由如本文所定义的HiSil植物产生的种子。
[0048] 根据另外的方面，本发明提供了向其基因组中引入了编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中任一个具有60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的蛋白质的核酸序列的植物。
[0049] 根据具体的方面，该植物是大豆(soybean或Glycine max)植物。更具体地，该大豆植物是优良大豆植物，其条件是该大豆植物不是Hikmok sorip(PI372415A)。
[0050] 根据本发明的另外的方面，提供了编码选自由SEQ ID NO:14和16组成的组的Si转运体的分离的多核苷酸，用于转化在其基因组中不包含所述多核苷酸的拷贝的植物以改善该植物的Si摄取。
[0051] 根据本发明的另外的方面，提供了包含该多核苷酸的载体或如本文所定义的表达盒。
[0052] 根据本发明的另外的方面，提供了包含如本文所定义的多核苷酸(例如编码包含SEQ ID NO:15或17的蛋白质的多核苷酸)的植物表达盒。
[0053] 根据另外的方面，本发明提供了编码选自由SEQ ID NO:14和16组成的组的Si转运体的植物表达盒。
[0054] 根据本发明的另外的方面，提供了包含如本文所定义的植物表达盒的转基因植物。
[0055] 根据本发明的另外的方面，提供了包含如本文所定义的植物表达盒的转基因种子。
[0056] 根据本发明的另外的方面，提供了产生具有增加的硅摄取的植物的方法，该方法包括以下步骤：a)将编码HiSil蛋白的核酸引入植物的基因组中；b)选择包含a)的核酸的植物、植物种质或植物种子；以及c)产生具有增加的硅摄取的植物。
[0057] 根据本发明的另外的方面，提供了产生抗病害植物的方法，该方法包括以下步骤：将如本文所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中所述植物表达盒的所述引入赋予所述植物中增加的Si摄取；从而产生抗病害植物。
[0058] 根据本发明的另外的方面，提供了产生具有增加的产量的植物的方法，该方法包括以下步骤：将如本文所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中所述植物表达盒的所述引入赋予所述植物中增加的Si摄取；从而产生具有增加的产量的植物。
[0059] 根据本发明的另外的方面，提供了作为如下转基因雌性祖先大豆植物的子代的农艺学上优良的大豆种子，所述祖先大豆植物在其基因组中具有表达如下Si转运体的重组DNA，所述Si转运体包含与SEQ ID NO:15或17中任一个的氨基酸序列具有至少约80％、
90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0060] 根据本发明的另外的方面，提供了用于产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，步骤包括：将包含编码多肽的多核苷酸的重组DNA分子引入植物细胞中，其中该多核苷酸的核苷酸序列选自下组，该组由以下组成：a)如SEQ ID NO:14或16所示的核苷酸序列；b)编码具有SEQ ID NO:15或17的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；c)与SEQ ID NO:14或16具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列；以及d)编码与SEQ ID NO:15和17具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；和从所述植物细胞生长植物。
99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；和从所述植物细胞生长植物。
[0061] 根据本发明的另外的方面，提供了通过如本文所定义的方法产生的植物、植物部分或植物种子。
[0062] 根据本发明的另外的方面，提供了用于如本文所定义的植物的种子或来自如本文所定义的植物的种子。
[0063] 根据本发明的另外的方面，提供了如本文所定义的种子的细胞。具体地，包含HiSil性状的优良大豆植物细胞或种子。
[0064] 根据本发明的另外的方面，提供了如本文所定义的植物的细胞。
[0067] 根据另外的方面，本发明提供了将HiSil性状引入大豆植物中的方法，该方法包括：选择在其基因组中包含如下核酸序列的大豆植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有80％序列同一性的蛋白质，其中该蛋白质在相对于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含苏氨酸，和向该核酸序列引入修饰，使得所编码的蛋白质在相对于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸，其中定点核酸酶(SDN)将该修饰引入该核酸序列。
[0068] 根据另外的方面，本发明提供了由如本文所定义的方法中的一种所产生的大豆植物。
[0069] 根据具体的方面，该大豆植物是优良大豆植物，其条件是该大豆植物不是Hikmok sorip(PI372415A)。在另一个实施例中，该大豆植物是优良大豆植物，其条件是该大豆植物不是以下项中的任一种：PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A、PI90763、或其子代。
[0070] 根据另外的方面，本发明提供了包含如下核酸序列的优良大豆植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的蛋白质，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸。
[0071] 根据另外的方面，本发明提供了使大豆作物生长的方法，该方法包括以下步骤：a)在田间种植如本文所述的大豆植物；和b)向田间施用包含硅的化合物：在种植之前、在种植时或在种植之后。
[0072] 根据另外的方面，本发明提供了使大豆作物生长的方法，该方法包括：a)选择用于种植该大豆作物的地点，其中该地点包含如下土壤，所述土壤具有水平为至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少30ppm、至少40ppm或至少50ppm的硅浓度，以及b)种植如本文所述的大豆植物。
附图说明
附图说明
[0074] 图2.在141个重组近交品系(RIL)中观察到的硅(Si)积累的频率分布。
[0075] 图3.扫描电子显微术和X射线微量分析映射图像，显示了收获自在硅补充(1.7mM)情况下生长的Hikmok sorip和Majesta的叶中的硅(Si)积累。观察结果是三个样品的代表性分析。
[0076] 图4.使用一组139个栽培的大豆种质进行的全基因组关联研究。
[0077] 图5.针对源自Majesta和Hikmok sorip的杂交的141个重组近交品系(RIL)中大豆叶中硅(Si)积累的QTL分析。
[0078] 图6.在16号染色体上鉴定的从95cM至102cM的、源自Majesta和Hikmok sorip的杂交的HiSil区间的遗传图谱位置。
[0079] 图7.在16号染色体上鉴定的在95cM距离处的大豆叶中硅积累的Hisil座位的遗传图谱位置。
[0080] 图8.如通过由ICIMapping进行的EPIstatic QTL作图所验证的来自141个Majesta X Hikmok sorip RIL的大豆叶中的硅摄取的上位相互作用的全基因组分析。
[0081] 图9.在用于开发与HiSil连锁的标记的HiSil-Del(约286bp缺失)座位处的序列比对。
[0082] 图10.琼脂糖凝胶，显示了源自Hikmok sorip和Majesta的RIL群体中的HiSil-Del标记的分离模式。
[0083] 图11.Williams、Hikmok sorip和Majesta中的用HiSil-MboII扩增的消化的PCR产物，显示了可检测的多态性。
[0084] 图12.大豆叶Hikmok X Majesta RIL中的硅积累的Hisil座位的高分辨率QTL。
[0085] 图13.16号染色体上的从92.6cM到132cM距离的HiSil区间的遗传图谱位置。
[0086] 图14.在源自杂交Hamilton x PI 89772的F3(F2:3)品系中观察到的平均叶硅(Si)含量的频率分布。
[0087] 图15.HIkmok X Majesta和Hamilton X PI89772之间的QTL比较。
[0088] 图16.遗传图谱，显示了Hamilton x PI89772中的标记和标记的显著性。
[0089] 图17.遗传图谱，显示了Majesta x Hikmok sorip和Hamilton x PI89772中在5.57Mb处确认的区间。
[0090] 图18.在携带根据在Glyma16g30000和Glyma16g30020的编码序列中存在的单一核苷酸所定义的不同单倍型的大豆登录(accession)中的硅摄取。
[0091] 图19.使用I-TASSER服务器构建的基于蛋白质同源性的HiSil的模型(Glyma16g30020)。
[0092] 图20.在NCBI服务器上进行BLASTp搜索来鉴定水稻中的HiSil同系物的结果。
[0094] 图22.来自实例8的一般症状和测定布局的照片。A.在水处理下的易感对照。B.在AgSil处理下的易感对照。
[0095] 图23.对照组和处理组内的性状％BSR的直方图。请注意，两个直方图均不包括品系“Corsoy 79NonInoc A”和“Corsoy 79NonInoc B”的观察结果，因为它们没有得到与该实验中所有其他品系相同的接种处理。
[0096] 图24.条形图，表示了来自实例8的所有经处理和未经处理的组。
[0097] 图25.接种后大豆胞囊线虫(SCN)试验的照片。A.AgSil处理。B.水处理。
[0098] 图26.A.对照组和B.处理组内的胞囊计数的直方图。
[0099] 图27.根结线虫(RKN)试验布局的照片。
[0100] 图28.处理组和未处理组内RKN损伤率的直方图。
[0101] 图29.在处理组和未处理组内，仅针对测试的品系(即，不包括检查)的RKN损伤率的直方图。
[0102] 图30.处理组：比率平均值(4个重复的)对MATID的条形图；根据高和低(Si积累者)亚组排列MATID。
[0103] 图31.未处理组：比率平均值(4个重复的)对MATID的条形图；根据高和低(Si积累者)亚组排列MATID。
[0104] 图32.根据高和低(Si积累者)亚组的大豆品系的比率平均值的箱形图。
[0105] 图33.硅(Si)改良剂对大豆抗大豆疫霉菌种-25的抗性的影响。(a)在没有Si和有Si情况下生长的植物的存活率差异；(b)在LoSil和HiSil RIL中因施用Si而提高的存活率；
有Si情况下的(c)干重和(d)植物高度的平均增加。
有Si情况下的(c)干重和(d)植物高度的平均增加。
[0106] 图34.硅(Si)改良剂对大豆抗五个大豆疫霉菌种(4、7、13、17和25)的混合物的抗性的影响。(a)在有Si和没有Si情况下生长的大豆疫霉菌感染的大豆植物的根；有Si情况下的(b)嫩枝干重和(d)根干重的平均增加；(c)在LoSil和HiSil RIL中因施用Si而提高的存活率。
[0107] 图35.对在水培条件下生长三周并且然后通过来自系统的水浸没来施加水胁迫的大豆植物的叶萎蔫评分。萎蔫量表为：1为不萎蔫，2为非常轻微萎蔫，3为萎蔫，4为高度萎蔫，5为垂死，和6为死亡。
[0108] 图36.涉及大豆植物嫁接的主要步骤的照片。
[0109] 图37.在水培条件下生长三周并且经受水胁迫的大豆植物的叶萎蔫评分。萎蔫量表为–0–不萎蔫；1-非常轻微萎焉；2-轻微萎焉；3-萎焉；4-高度萎焉；5-垂死，和6-死亡。
Majesta/H代表嫁接在Hikmok砧木上的Majesta嫩枝，并且Hikmok/M代表嫁接在Majesta砧木上的Hikmok根。
Majesta/H代表嫁接在Hikmok砧木上的Majesta嫩枝，并且Hikmok/M代表嫁接在Majesta砧木上的Hikmok根。
[0110] 图38.转基因拟南芥中HiSil的验证。(a)有根特异性启动子CASP2和NIP5；1情况下的GUS的表达；(b)具有代表Williams和Hikmok HiSil的等位基因的Glyma16g30000和Glyma16g30020的转基因拟南芥品系的Si积累。
[0111] 图39.HiSil和无效植物中的平均Si积累。
[0112] 图40.在爪蟾卵母细胞测定中评估的由Glyma16g30020基因的Williams和Hikmok型等位基因所促进的硅(Si)流出转运。
[0113] 图41.在不同构建体(不具有或具有点突变的Glyma16g:30000和Glyma16g:30020的Hikmok和Williams等位基因)的爪蟾卵母细胞测定中评估的硅(Si)转运。
[0114] 图42.含有GmHiSil基因序列的质粒克隆pCR-GmHiSil1aNruI的示意图谱。GmHiSil的两侧为两个NruI位点。
[0115] 图43.用于表达Cas9和sgRNA的转化载体。
[0116] 发明说明
[0117] 本说明不旨在是本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文陈述的任何特征或特征的组合。另外，鉴于本披露内容，对本文建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并非穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
[0118] 除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文的本发明的说明中使用的术语是仅出于描述具体实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
[0119] 本文引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文献对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文并入本文。本文采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化或等效技术的替换。
[0120] 除非上下文另外表明，明确地预期的是本文所述的本发明的不同特征可以按任何组合使用。而且，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，本文所述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果本说明书陈述组合物包含组分A、B和C，明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
[0121] 缩写与定义
[0122] 缩写
[0123] bp：碱基对；cM：厘摩；CMLM：压缩混合线性模型；GAPIT：基因组关联和预测集成工具；GBS：通过测序的基因分型；GLM：一般线性模型；GWAS：全基因组关联研究；lGST-GBS：通过测序工具的IBIS基因分型；ICIM：完备区间作图法；LOD：几率对数；Mb：百万碱基；PCA：主成分分析；PVE：解释的表型方差；QTL：数量性状座位；SNP：单核苷酸多态性；RIL：重组近交品系；CAPS：酶切扩增多态性序列；CRISPR：规律成簇的间隔短回文重复；TALENs：转录激活子样效应子核酸酶；BSR：褐茎腐病；SCN：大豆胞囊线虫；RKN：根结线虫。
[0124] 定义
[0125] 如本文所使用的术语“约”是指所指示数字的±10％的界限。为了精确，术语约当与例如90％一起使用时是指90％+/-9％，即从81％至99％。更精确地说，术语约是指所指示数字的±5％，其中例如：90％是指90％+/-4.5％，即从86.5％到94.5％。
[0126] 如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确地指明。因而，例如，提及“一个/种细胞”包括多个/种此类细胞，并且提及“该培养物”包括提及一种或多种培养物和本领域技术人员已知的其等效物，等等。除非另外清楚地定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
[0127] 如在本说明书和一项或多项权利要求书中所使用的，过渡词“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。
[0128] 如本文所使用的，过渡短语“基本上由……组成”意指权利要求的范围将被解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在被解释为等同于“包含(comprising)”。
[0129] 术语“HiSil染色体区间”是指对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基对，具体地在约95cM至约102cM距离处或从物理位置33104446碱基对至3576286碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0130] 如本文所使用的，短语如“在X和Y之间”与“在约X和Y之间”应解释为包括X和Y。如本文所使用的，短语如“在约X和Y之间”是指“在约X和约Y”之间，并且短语如“从约X至Y”是指“从约X至约Y”。
[0131] 如本文所使用的，术语“等位基因”是指在特定座位处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个(例如，表18举例说明了针对HiSil性状的不利和有利的等位基因)。
[0132] “座位”是基因或标记或等位基因所在的染色体上的位置。在一些实施例中，座位可以涵盖一个或多个核苷酸。例如，表15-21中列出的任何标记都描述了与HiSil性状相关联的“座位”。此外，HiSil染色体区间内的任何标记可以是与HiSil性状相关联的座位。
[0133] 如本文所使用的，术语“期望的等位基因”、“靶等位基因”和/或“感兴趣的等位基因”可互换使用以指与期望的性状相关联的等位基因。在一些实施例中，期望的等位基因可以与给定性状的或给定性状中的增加或减少(相对于对照)相关联，这取决于所期望表型的性质。在本发明的一些实施例中，短语“期望的等位基因”、“靶等位基因”或“感兴趣的等位基因”是指与大豆植物中的HiSil性状相关联的一个或多个等位基因(相对于不具有所述一个或多个靶等位基因的对照大豆植物)。因此，例如，包含表18中所示的一个或多个期望的等位基因的大豆植物或与表15-21中的标记紧密关联的标记可用于选择、鉴定或产生与不包含所述标记的对照植物相比，具有增加的Si积累的大豆植物(例如HiSil大豆植物)。
[0134] 如本文所使用的，术语“标记”和“遗传标记”可互换使用，以指已经与表型和/或性状相关联的核苷酸和/或核苷酸序列。标记可以是但不限于等位基因、基因、单倍型、染色体区间、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey，Trends in Genetics[遗传学趋势]9:275(1993))、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]23:4407(1995))、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes，Gene[基因]234:177(1993))、序列特征性扩增区域(SCAR)(Paran和Michelmore，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]85:985(1993))、序列标签位点(STS)(Onozaki等人，Euphytica[荷兰植物育种杂志]138:255(2004))、单链构象多态性(SSCP)(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2766(1989))、简单重复序列区间(ISSR)(Blair等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]
98:780(1999))、逆转座子间扩增多态性(IRAP)、逆转座子微卫星扩增多态性(REMAP)
(Kalendar等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:704(1999))、同工酶标记、RNA切割产物(例如Lynx标签)或本文中所述标记的任意组合。标记可以存在于基因组核酸或表达的核酸(例如EST)中。大量的大豆遗传标记是本领域已知的，并且是已公开的或可以从各种来源如SoyBase互联网资源(www.soybase.org)获得。在一些实施例中，本发明的遗传标记是SNP等位基因(例如参见表15-20)、位于对应于HiSil染色体区间的染色体区间中的SNP等位基因)和/或单倍型(例如H1单倍型)或来自表20的SNP等位基因的组合，这些SNP等位基因中的每一个都与HiSil性状相关。
98:780(1999))、逆转座子间扩增多态性(IRAP)、逆转座子微卫星扩增多态性(REMAP)
(Kalendar等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:704(1999))、同工酶标记、RNA切割产物(例如Lynx标签)或本文中所述标记的任意组合。标记可以存在于基因组核酸或表达的核酸(例如EST)中。大量的大豆遗传标记是本领域已知的，并且是已公开的或可以从各种来源如SoyBase互联网资源(www.soybase.org)获得。在一些实施例中，本发明的遗传标记是SNP等位基因(例如参见表15-20)、位于对应于HiSil染色体区间的染色体区间中的SNP等位基因)和/或单倍型(例如H1单倍型)或来自表20的SNP等位基因的组合，这些SNP等位基因中的每一个都与HiSil性状相关。
[0135] 可以通过本领域中公认的方法检测对应于群体成员之间的遗传多态性的标记。这些方法包括但不限于，核酸测序、杂交方法、扩增方法(例如基于PCR的序列特异性扩增方法)、限制性片段长度多态性(RFLP)检测、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自持序列复制检测、简单重复序列(SSR)检测、随机扩增多态性DNA(RAPD)检测、单核苷酸多态性(SNP)检测、和/或扩增片段长度多态性(AFLP)检测。因此，在本发明的一些实施例中，可以使用这些熟知的方法来检测如本文所定义的SNP等位基因。
[0136] 因此，在本发明的一些实施例中，通过例如扩增反应(如聚合酶链式反应(PCR))用两个寡核苷酸引物通过扩增大豆属核酸来检测标记。
[0137] “标记等位基因”，也描述为“标记座位的等位基因”，可以指在群体中对标记座位而言是多态性的该标记座位处发现的多个多态性核苷酸序列中的一个。
[0138] 标记辅助选择(本文中为“MAS”)或可交换地标记辅助育种(本文中为“MAB”)是基于标记基因型选择表型的方法。标记辅助选择包括使用标记基因型来鉴定包含在育种程序或种植中和/或从其中移除的植物。
[0139] 如本文所使用的，术语“标记座位(marker locus)”、“标记座位(marker loci)”、“座位(locus)”或“座位(loci)”是指在其中可以找到一个或多个特异性标记的生物基因组中的一个或多个特定染色体定位。标记座位可用于追踪第二连锁座位(例如编码或有助于表型性状表达的连锁座位)的存在。例如，标记座位可以用来监测在座位(如QTL或单一基因)处的等位基因的分离，这些等位基因遗传地或物理地连锁至该标记座位上。
[0140] 如本文所使用的，当鉴定连锁座位时，术语“分子标记”可以用于指如上文所定义的遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。分子标记能够源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来自剪接的RNA、cDNA等)。该术语也指与标记序列互补或与其侧接的核苷酸序列，如用作能够扩增该标记序列的探针或引物的核苷酸序列。例如根据沃森-克里克碱基配对原则，当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，所述核苷酸序列是“互补的”。当位于indel区域上时，本文所述的标记中的一些也称为杂交标记。这是因为，根据定义，该插入区域是关于不具有该插入的植物的多态性。因此，该标记仅需要指示该indel区域是否存在。任何合适的标记检测技术(例如SNP检测技术)都可以用于鉴定这种杂交标记。
[0141] 当性状与标记连锁并且当该标记的存在指示了期望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含该标记的植物/种质中时，则该标记与所述性状“相关联”。类似地，当标记与等位基因或染色体区间连锁并且当该标记的存在指示了该等位基因或染色体区间是否存在于包含该标记的植物/种质中时，该标记与该等位基因或染色体区间“相关联”。例如，“与HiSil性状相关联的标记”是指如下标记(例如，该HiSil染色体区间内的标记或与所述HiSil染色体区间密切关联的那些标记，也参见表15至21)，该标记的存在或不存在可用于预测植物是否将显示增加的Si积累。
[0142] 如本文所使用的，术语“探针”是指将在靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中与互补序列形成氢键合双链体的单链寡核苷酸序列。因此，“标记探针”和“探针”是指可用于检测标记座位内一个或多个特定等位基因的存在的核苷酸序列或核酸分子(例如，通过核酸杂交与该标记或标记座位中的所有或部分互补的核酸探针)。包含约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续核苷酸的标记探针可用于核酸杂交。可替代地，在某些方面，标记探针是指能够区别(即基因分型)存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型的探针。本发明的探针的非限制性实例可见于表19和序列表(即SEQ ID NO 278至495)。
[0143] 如本文所使用的，术语“引物”是指当置于诱导合成引物延伸产物的条件(例如在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下并且在合适的温度和pH下)下时能够退火至核酸靶标并用作DNA合成的启动点的寡核苷酸。为了在延伸和/或扩增中获得最大效
率，在一些实施例中，引物(在一些实施例中是延伸引物，并且在一些实施例中是扩增引物)是单链的。在一些实施例中，引物是寡脱氧核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸和/或扩增产物的合成。引物的最小长度可以取决于许多因素，包括但不限于该引物的温度和组成(A/T对G/C含量)。在扩增引物的情况下，这些扩增引物通常作为由一个正向和一个反向引物组成的一对双向引物提供，或作为DNA扩增领域中(例如在PCR扩增中)常用的一对正向引物提供。如此，应该理解的是，如本文所使用的术语“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些歧义的情况下。因此，“引物”可以包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。可以通过任何合适的方法来制备引物。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当的序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如美国专利号4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相支持体法。若需要，可以通过并入可检测部分，例如光谱部分、荧光部分、光化学部分、生物化学部分、免疫化学部分或化学部分来标记引物。本发明的引物的非限制性实例包括表13、14和/或19以及序列表(例如SEQ ID NO:27至277)。
率，在一些实施例中，引物(在一些实施例中是延伸引物，并且在一些实施例中是扩增引物)是单链的。在一些实施例中，引物是寡脱氧核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸和/或扩增产物的合成。引物的最小长度可以取决于许多因素，包括但不限于该引物的温度和组成(A/T对G/C含量)。在扩增引物的情况下，这些扩增引物通常作为由一个正向和一个反向引物组成的一对双向引物提供，或作为DNA扩增领域中(例如在PCR扩增中)常用的一对正向引物提供。如此，应该理解的是，如本文所使用的术语“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些歧义的情况下。因此，“引物”可以包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。可以通过任何合适的方法来制备引物。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当的序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如美国专利号4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相支持体法。若需要，可以通过并入可检测部分，例如光谱部分、荧光部分、光化学部分、生物化学部分、免疫化学部分或化学部分来标记引物。本发明的引物的非限制性实例包括表13、14和/或19以及序列表(例如SEQ ID NO:27至277)。
[0144] 如本文所使用的，术语“回交(backcross)”和“使回交(backcrossing)”是指如下方法，凭借该方法将子代植物与其亲本之一回交一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待基因渗入的所期望的等位基因或座位的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或座位被基因渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人，Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example,in TECHNIQUES ET UTILISATIONS DES MARQUEURS MOLECULAIRES LES COLLQUES[标记辅助回交：实践范例，分子标记技术和应用专题讨论会]卷72，第45-56页(1995)；以及Openshaw等人，Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,in PROCEEDINGS OF THE SYMPOSIU“M ANALYSIS OF MOLECULAR MARKER DATA”[回交育种中的标记辅助选择，专题讨论会会议记录“分子标记数据分析”]，第41-43页(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，以此类推。在一些实施例中，回交的次数可以是约1至约10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。在一些实施例中，回交的次数为约7。
[0145] 如本文所使用的，术语“杂交(cross)”或“经杂交的(crossed)”是指通过授粉融合配子以产生子代(例如，细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一个植物由另一个授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠是来自相同的植物时)两者。术语“使杂交(crossing)”是指通过授粉使配子融合以产生子代的行为。
[0146] 如本文所使用的，术语“栽培品种”和“品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
[0147] 如本文所使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“使基因渗入(introgressing)”和“经基因渗入的(introgressed)”是指使一个或多个遗传座位的所期望的等位基因或所期望的等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人
工传送。例如，可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定座位处的所期望的等位基因传送给至少一个子代，其中所述亲本中的至少一个在其基因组内具有该所期望的等位基因。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所期望的等位基
因。所期望的等位基因可以是标记的经选择的等位基因、QTL、转基因等。包含所期望的等位基因的后代可以与具有所期望的遗传背景的品系回交一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10或更多次)，选择所期望的等位基因，其结果是该所期望的等位基因在所期望的遗传背景中变得固定。例如，与HiSil性状相关联的标记可以从供体基因渗入到作为LoSil植物的轮回亲本中。然后可以使得到的后代回交一次或多次并进行选择，直到该子代包含与该轮回亲本背景中的HiSil性状相关联的一种或多种遗传标记(例如，如表15-21中所示的标
记)。
工传送。例如，可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定座位处的所期望的等位基因传送给至少一个子代，其中所述亲本中的至少一个在其基因组内具有该所期望的等位基因。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所期望的等位基
因。所期望的等位基因可以是标记的经选择的等位基因、QTL、转基因等。包含所期望的等位基因的后代可以与具有所期望的遗传背景的品系回交一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10或更多次)，选择所期望的等位基因，其结果是该所期望的等位基因在所期望的遗传背景中变得固定。例如，与HiSil性状相关联的标记可以从供体基因渗入到作为LoSil植物的轮回亲本中。然后可以使得到的后代回交一次或多次并进行选择，直到该子代包含与该轮回亲本背景中的HiSil性状相关联的一种或多种遗传标记(例如，如表15-21中所示的标
记)。
[0148] 如本文所使用的，术语“连锁”是指一个标记座位与另一个标记座位或一些其他座位(例如，BSR或FLS抗性座位)的相关联程度。遗传标记与表型之间的连锁关系可以作为“概率”或“调整的概率”给出。连锁可以表示为所需的限值或范围。例如，在一些实施例中，当标记以小于约50、40、30、25、20或15个图距单位(或cM)分开时，则任何标记与任何其他标记(遗传上和物理上)连锁。例如，本发明的一个方面是使用与HiSil性状相关联的标记来鉴定或产生HiSil植物，其中这些标记位于距离表15-21中列出的任何标记或HiSil染色体区间的50、40、30、25、20或15个图距单位(或cM)内。
[0149] 厘摩(“cM”)或遗传图谱单位(m.u.)是重组频率的度量单位，并且定义为如下基因之间的距离，对所述基因而言，100个减数分裂产物中的一个是重组的。一个cM等于有1％的机会，一个遗传座位处的标记会由于单代中的交换而与第二座位处的标记分离。因此，1％的重组频率(RF)相当于1m.u.。
[0150] 如本文所使用的，短语“连锁群”是指位于相同染色体上的所有基因或遗传性状。在连锁群中，足够接近的那些座位可以在遗传杂交中显示出连锁。由于交换的概率随着染色体上的座位之间的物理距离而增加，所以在连锁群中定位彼此远离的座位在直接基因测试中可以不表现出任何可检测的连锁。术语“连锁群”主要用于指如下遗传座位，其在尚未进行染色体定位的遗传系统中展示出连锁行为。因此，术语“连锁群”与染色体的物理实体同义，但是本领域的普通技术人员将理解，连锁群还可以被定义为对应于给定染色体的区域(即，小于整体)。
[0151] 如本文所使用的，术语“连锁不平衡”是指遗传座位或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的座位沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离的性状的情况下，控制这些性状的座位彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁的座位超过50％的时间(例如从约51％至约100％的时间)进行共分离。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同染色体上分离小于50cM)的重组频率。如本文所使用的，连锁可以存在于两个标记之间，或可替代地，标记和表型之间。标记座位可以与性状(如HiSil性状)“相关联”(连锁)。例如，遗传标记与表型性状的连锁程度被测量为例如该标记与该表型共分离的统计概率。
[0153] “遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体上的座位之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描述。对于每个遗传图谱，座位之间的距离是通过它们之间的重组频率来测量的。座位之间的重组可以使用各种标记来检测。遗传图谱是作图群体、所用标记的类型以及不同群体之间每个标记的多态性潜力的产物。一个遗传图谱与另一个遗传图谱的座位之间的顺序和遗传距离可以不同。
[0154] 如本文所使用的，术语“基因型”是指与可观察到的和/或可检测的和/或所表现的性状(表型)形成对照，在一个或多个遗传座位处的个体(或个体组)的遗传组成。基因型由个体遗传自其亲本的一个或多个已知座位的一个或多个等位基因定义。术语基因型可以用来指单一座位处、多个座位处的个体的遗传组成，或者更普遍地，术语基因型可以用来指其基因组中所有基因的个体遗传构成。可以例如使用标记来间接表征基因型和/或通过例如核酸测序来直接表征基因型。
[0155] 如本文所使用的，术语“种质”是指属于或来自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物品系、品种或家族)、或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从该生物或细胞中分离。一般而言，种质提供了具有特定的遗传构成的遗传物质，所述特定的遗传构成为生物体或细胞培养物的某些或全部遗传品质提供基础。如本文所使用的，种质包括可以从中生长新植物的细胞、种子或组织，以及可以培养成完整植物的植物部分(例如，叶、茎、芽、根、花粉、细胞等)。在一些实施例中，种质包括但不限于组织培养物。
[0156] “单倍型”是多个遗传座位处个体的基因型，即等位基因的组合。典型地，定义单倍型的遗传座位在物理和遗传上是连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定座位(例如单标记座位)处的多态性，或者是沿着染色体区段的多个座位处的多态性。
[0157] 如本文所使用的，术语“H1单倍型”是指包含如下各项的标记座位：位置33673022处的A；位置33673483处的G；位置33681630处的C；位置33682500处的T；位置33683047处的G；和位置33683049处的C，对应于如下基因组区域，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基对，具体地在约95cM至约102cM距离处或从物理位置33104446碱基对至3576286碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的(还参见例如表9)。
[0158] 如本文所使用的，术语“杂合的”是指如下遗传状态，其中不同的等位基因位于同源染色体上的相应座位处。
[0159] 如本文所使用的，术语“纯合的”是指如下遗传状态，其中相同的等位基因位于同源染色体上的相应座位处。本发明的一个实施例是对HiSil性状而言纯合的优良大豆植物。
[0160] PCR方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过PCR扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，所述探针多核苷酸在严格至中度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列形成稳定的杂交体。如果预期探针与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。在一些实施例中，选择条件以排除非特异性/偶然结合。影响杂交的条件和针对非特异性结合选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如以下文献中：Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition[分子克隆：实验室手册，第三版]，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，美国。通常，较低的盐浓度和较高温度的杂交和/或洗涤增加了杂交条件的严格性。
[0161] 具有同源性的不同核苷酸序列或多肽序列在本文中称作“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列以及来自相同物种和其他物种的直向同源序列。“同源性”指两个或更多个核苷酸序列和/或氨基酸序列之间就位置同一性百分数而言的相似性水平(即，序列相似性或同一性)。同源性还指不同核酸、氨基酸、和/或蛋白质之间相似功能特性的概念。
[0162] 如本文所使用的，短语“核苷酸序列同源性”是指两个多核苷酸之间同源性的存在。当进行比对以获得最大对应时，如果在这两个序列中的核苷酸的序列是相同的，那么多核苷酸具有“同源的”序列。多核苷酸的“序列同源性的百分比”，如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性，可以在比较窗口(例如，约20-200个连续核苷酸)上通过比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列相比，在比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括添加或缺失(即，空位)。可以通过已知算法的计算机化实施方式或者通过目视检查进行用于比较的序列的最佳比对。易于获得的序列比较以及多重序列比对的算法分别是基本局部比对搜索工具(BLAST；Altschul等人，(1990)J Mol Biol[分子生物学杂志]215:403-10；
Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res[核酸研究]25:3389-3402)和ClustalX(Chenna等人，(2003)Nucleic Acids Res[核酸研究]31:3497-3500)程序，两者都可在因特网上获得。其他合适的程序包括但不限于，GAP、BestFit、PlotSimilarity以及FASTA，它们是Accelrys GCG软件包的一部分，可以从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Accelrys软件公司获得。
Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res[核酸研究]25:3389-3402)和ClustalX(Chenna等人，(2003)Nucleic Acids Res[核酸研究]31:3497-3500)程序，两者都可在因特网上获得。其他合适的程序包括但不限于，GAP、BestFit、PlotSimilarity以及FASTA，它们是Accelrys GCG软件包的一部分，可以从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Accelrys软件公司获得。
[0163] 如本文所使用的“序列同一性”指两个最佳比对的多核苷酸序列或多肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口范围内不变的程度。“同一性”可通过已知方法容易地计算，这些方法包括但不限于描述在以下文献中的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)牛津大学出版社，纽约(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组计划](Smith,D.W.编辑)学术出版社，纽约(1993)；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析]，第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社]，新泽西(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学的序列分析])(von
Heinje,G.编辑)学术出版社(1987)；和Sequence Analysis Primer[序列分析引物]
(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)斯托克顿出版社，纽约(1991)。
Heinje,G.编辑)学术出版社(1987)；和Sequence Analysis Primer[序列分析引物]
(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)斯托克顿出版社，纽约(1991)。
[0164] 如本文所使用的，术语“基本上一致的”或“相对应”指两个核苷酸序列具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。在一些实施例中，两个核苷酸序列可以具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性，以及其中的任何范围或值。在代表性实施例中，两个核苷酸序列可以具有至少约95％、96％、97％、98％、
99％或100％的序列同一性，以及其中的任何范围或值。
99％或100％的序列同一性，以及其中的任何范围或值。
[0165] 测试序列和参考序列的已比对区段的“同一性分数”是由两个已比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即，完整的参考序列或参考序列的更小限定部分)中组分的总数目。序列同一性百分比被表示为同一性分数乘以100。如本文所使用的，术语“序列同一性百分数”或“同一性百分数”指在最佳比对两个序列时(在比较窗口范围内存在总计少于参考序列的20％的适宜核苷酸插入、缺失或空位)，与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线状多核苷酸序列中的相同核苷酸的百分数。在一些实施例中，“同一性百分比”可以是指氨基酸序列中相同的氨基酸的百分比。
[0166] 用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员所熟知的并且可以由以下工具实施：如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，并且任选地由这些算法的计算机化实现方式来实施，如作为 Wisconsin (Accelrys公司，伯灵顿，马萨诸塞州)的部分可获得
的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸序列或其一部分，或相对于较长的多核苷酸序列。出于本发明的目的，也可以使用针对翻译的核苷酸序列的2.0版BLASTX和针对多核苷酸序列的2.0版BLASTN测定“同一性百分
比”。
的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸序列或其一部分，或相对于较长的多核苷酸序列。出于本发明的目的，也可以使用针对翻译的核苷酸序列的2.0版BLASTX和针对多核苷酸序列的2.0版BLASTN测定“同一性百分
比”。
[0167] 可以使用Sequence Analysis Software PackageTM(版本10；遗传计算机集团公司(Genetics Computer Group,Inc)，麦迪逊，威斯康辛州)的“Best Fit”或“Gap”程序确定序列同一性百分比。“Gap”使用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunschc，J Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453,1970)来找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的比对。“BestFit”执行两个序列之间最佳相似性区段的最佳比对并且使用Smith和Waterman的局部同源性算法插入空位以使匹配数最大化(Smith和Waterman，
Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，2:482-489，1981；Smith等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]11:2205-2220，1983)。
Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，2:482-489，1981；Smith等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]11:2205-2220，1983)。
[0168] 用于确定序列同一性的可用方法也在如下文献中披露：Guide to Huge Computers[巨型计算机指南](Martin J.Bishop编著，学术出版社，圣地亚哥(1994))，和Carillo等人(Applied Math[应用数学]48:1073(1988))。更具体地，优选的用于确定序列同一性的计算机程序包括但不限于：公共可获得的来自国家生物技术信息中心(National Center Biotechnology Information，NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序，NCBI是在美国国立卫生研究院(贝塞斯达，马里兰州，20894)的国家医学库中；参见BLAST手册，Altschul等人，NCBI，NLM，NIH；(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-
410(1990))；2.0版本或更高版本的BLAST程序允许缺口(缺失和插入)引入比对中；对于肽序列可以使用BLASTX来确定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，可以使用BLASTN来确定序列同一性。
410(1990))；2.0版本或更高版本的BLAST程序允许缺口(缺失和插入)引入比对中；对于肽序列可以使用BLASTX来确定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，可以使用BLASTN来确定序列同一性。
[0169] 如本文所使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状。表型对于裸眼或通过本领域中已知的任何其他评估方法(例如显微术、生物化学分析法、和/或电子机械测定)是可观察的。在一些情况中，表型直接由单一基因或基因座位控制，即，“单基因性状”。在其他情况下，表型是多个基因的结果。例如，以下发明包含引起HiSil性状的两个基因，其中这些基因独立地或共同地赋予大豆植物中增加的Si积累。
[0170] 如本文所使用的，术语“多态性”是指座位处的核苷酸序列中的变异，其中所述变异太常见，而不仅仅是由于自发突变。多态性可以是单核苷酸多态性(SNP)或插入/缺失多态性(本文中也称为“indel”)。另外，该变异可以在转录谱或甲基化模式中。可以通过在两个或更多个种质条目中的一个或多个座位处进行核苷酸序列比较来确定核苷酸序列的一个或多个多态性位点。
[0171] 如本文所使用的，术语“植物部分”包括但不限于胚、花粉、种子、叶、花(包括但不限于花药、胚珠等)、果实、茎或枝、根、根尖、细胞(包括在植物和/或植物部分中完整的细胞)、原生质体、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。因此，植物部分包括可以再生成大豆植物的大豆组织培养物。另外，如本文所使用的，“植物细胞”是指植物的结构和生理学单位，包括细胞壁并且也可以指原生质体。本发明的植物细胞可以处于分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是作为较高级的组织单位(例如像，植物组织或植物器官)的一部分。本发明的一个实施例是来自具有HiSil性状的植物的植物部分。
[0172] 如本文所使用的，术语“群体”是指共享共同的遗传衍生(genetic derivation)的植物的遗传上异质的集合。
[0173] 如本文所使用的，术语“子代”、“子代植株”和/或“后代”是指由一个或多个亲本植物营养或有性繁殖产生的植物。子代植物可以通过单一亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并且包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是产生自两个亲本的第一代后代(两个亲本的至少一个是第一次用作性状的供体)，而第二代(F2)或后续代(F3、F4等)的后代是产生于F1、F2等的自交或杂交的样本。因此F1可以(并且在一些实施例中)是由两个真正育种亲本之间杂交产生的杂交体(短语“真正育种”是指对于一种或多种性状而言是纯合的个体)，而F2可以是由F1杂交体自花授粉产生的后代。
[0174] 如本文所使用的，术语“参考序列”是指用作核苷酸序列比较基础的经定义的核苷酸序列(例如，大豆栽培品种Williams 82的16号染色体)。例如可以通过对在一个或多个感兴趣的座位处的多个品系进行基因分型、在序列比对程序中比对这些核苷酸序列并且然后获得比对的共有序列来获得标记的参考序列。因此，参考序列鉴定座位处等位基因中的多态性。参考序列可以不是来自任何特定生物体的实际核酸序列的拷贝；然而，对于设计针对一个或多个座位中的实际多态性的引物和探针是有用的。
[0175] 与特定表型(例如增加的Si积累)相关的遗传座位可以被映射到生物体的基因组中。通过鉴定与感兴趣的性状共分离的标记或标记簇，育种人员能够通过选择合适的标记(称为标记辅助选择或MAS的方法)来迅速选择所期望的表型。育种人员也可以使用此类标记来在计算机上模拟设计基因型并实施全基因组选择。
[0176] 如本文所使用的，除非另有说明，或提及特定的SEQ ID NO.，染色体、基因、碱基对、氨基酸或其他序列的所有编号均基于如在公众可获得的Williams82参考品系(SOYBASE)；大豆基因组组装来自JGI第8版，基于最初的Glyma v1(2012年1月)中发现的大豆品种Williams82的参考序列。
[0177] 如本文所使用的术语“嵌合基因”是指如下基因，其中在自然情况下，该编码序列不与该启动子或该基因中DNA的至少一个其他调节区相关联。
[0178] 如本文所使用的术语“表达盒”是指包含如下嵌合基因的DNA的可转移区域，所述嵌合基因侧接有一个或多个限制性酶切位点或其他位点，这些位点有助于从一个DNA座位精确切除并插入另一个座位中。
[0179] 如本文所使用的，术语“HiSil蛋白”是指当被引入植物基因组中时赋予增加的Si积累/摄取的蛋白质。具体地，该HiSil蛋白包含与SEQ ID NO:15(其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸)和/或SEQ ID NO:17(其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的蛋白质序列；并且将其引入植物的基因组中赋予该植物高Si摄取。
[0180] 如本文所使用的术语“HiSil性状”是指在其基因组中具有编码HiSil蛋白的核苷酸。因此，在水培条件下(温度约20℃-26℃，湿度约55％-65％)，当供应浓度为至少约0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、或0.8mM的硅并生长至少28天后，包含该性状的植物将具有至少1％的干重硅。更具体地，当向高Si摄取植物提供浓度为至少约1.5mM的Si的供应时，该植物叶中的硅浓度高于约1.53％。最具体地，当向高Si摄取植物提供浓度为至少约1.5mM的Si的供应时，该植物叶中的硅浓度高于1.53％、1.54％、1.55％、1.56％、1.57％、1.58％、
1.59％或1.6％Si浓度。
1.59％或1.6％Si浓度。
[0181] “HiSil植物”是具有HiSil性状的植物。更具体地说，“HiSil大豆植物”是具有HiSil性状的大豆植物。“HiSil大豆植物”是具有HiSil性状的大豆植物。
[0182] “LoSil植物”是不具有HiSil性状的植物。
[0183] 如本文所使用的，具有“高Si摄取”的植物意指当与相同植物中的平均硅积累相比，增加的硅积累。具体地，当在水培条件下(如本文所定义)生长时，在Williams82品种的大豆植物中建立平均硅积累。
[0184] 因此，在水培条件下，当在至少约0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM或0.8mM的硅浓度下生长时，具有高Si摄取的植物将具有至少约1％的干重硅。例如，高Si摄取植物中增加的Si积累表示当与最初的低Si摄取植物相比，Si摄取增加约0.1％至约3.0％。例如，当向两个植物供应浓度为至少约0.8mM的硅时，在至少一个植物部分中总Si浓度中积累增加约10％至约300％被认为是与低Si摄取植物相比在Si摄取上的增加。具体地，当与在相同生长条件下的LoSil植物相比时，约1.1X、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.9X、2X、2.5X或3X的Si积累增加被认为是Si摄取增加。
[0185] 如本文所使用的，术语“LoSil蛋白”是指当存在于植物基因组中时赋予平均Si积累的蛋白质。如本文所使用的，具有“低Si摄取”的植物是指非Si积累植物中的平均Si积累。例如，LoSil大豆植物具有对应于约Williams82的水平的硅摄取。
[0186] 具体地，如本文所使用的术语“低硅摄取”是指在具有硅浓度为约0.8mM的水培条件下在生长时，约28天后具有小于约1％的干重硅的植物。例如，植物中低/正常/基本/平均硅积累大约为从0.65％至约1.5％Si积累。更具体地，当向具有低Si摄取的植物提供浓度为至少约1.5mM的Si的供应时，该植物叶中的硅浓度低于约1.5％Si浓度。最具体地，当向具有低Si摄取的植物提供浓度为至少约1.5mM的Si的供应时，该植物叶中的硅浓度为小于1.49％、1.50％、1.51％、1.52％或1.53％Si浓度。
[0187] 如本文所使用的关于植物的术语“引入”是指以任何方式完成，所述方式包括但不限于：基因渗入、转基因、规律成簇的间隔短回文重复修饰(CRISPR)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(Feng等人2013；Joung和Sander 2013)、大范围核酸酶或锌指核酸酶(ZFN)。
[0188] 如本文所使用的术语“植物”是指以谷物、树木、灌木、草本植物、草类、蕨类植物和苔藓类为例的一种活的有机体，其通常具有茎、叶、根和花，并产生种子，并通常生长在不变的场所(如土壤)，通过其根部吸收水和无机物质，并使用绿色色素叶绿素通过光合作用在其叶子中合成营养物质；或其组织培养物。
[0189] 术语“作物植物”具体地是指单子叶植物，如谷物(小麦、小米、高粱、黑麦、小黑麦、燕麦、大麦、埃塞俄比亚画眉草、斯卑尔脱小麦、荞麦、福尼奥米和藜麦)、水稻、玉蜀黍(玉米)和/或甘蔗；或双子叶植物，如甜菜根(如甜菜或饲用甜菜)；水果(如梨果、核果或软果，例如苹果、梨、李子、桃、扁桃、樱桃、草莓、树莓或黑莓)；豆科植物(如菜豆、扁豆、豌豆或大豆)；油料作物(如油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆或落花生)；黄瓜类植物(如西葫芦、黄瓜或香瓜)；纤维植物(如棉花、亚麻、大麻或黄麻)；柑橘类水果(如橙子、柠檬、葡萄柚或柑橘)；蔬莱(如菠菜、莴苣、卷心菜、胡萝卜、番茄、马铃薯、葫芦或辣椒)；樟科(如鳄梨、肉桂或樟脑)；烟草；坚果；咖啡；茶；藤本植物；蛇麻草；榴莲；香蕉；天然橡胶植物；以及观赏植物(如花、灌木、阔叶树或常青树(如松柏))。上述列举并不代表任何限制。
[0190] 具体地，该作物植物是单子叶植物。更适合地，该作物植物为谷物，特别是小麦或大麦。具体地，该作物植物是水稻植物，更具体地，是甘蔗植物。仍然更具体地，该作物植物是玉米植物。
[0191] 例如，该作物植物可以是单子叶植物或禾本科的成员，如小麦植物、玉蜀黍植物、甜玉米植物、水稻植物、野生稻植物、大麦植物、黑麦、小米植物、高粱植物、甘蔗植物、草坪草植物、竹子植物、燕麦植物、雀麦草植物、芒草植物、潘帕斯草植物、柳枝稷(黍)植物和/或墨西哥类蜀黍植物；或是葱科的成员，如洋葱植物、韭葱植物或大蒜植物。
[0192] 例如，该作物植物可以是双子叶植物或苋科的成员，如菠菜植物、藜麦植物；漆树科的成员，如芒果植物；菊科的成员，如向日葵植物、菊苣植物、莴苣植物、朝鲜蓟植物；十字花科的成员，如拟南芥植物、油菜植物、油菜籽油菜植物、西兰花植物、球芽甘蓝植物、卷心菜植物、卡诺拉植物、花椰菜植物、大头菜植物、芜菁植物、萝卜植物；凤梨科的成员，如菠萝植物；番木瓜科的成员，如番木瓜植物；藜科的成员，如甜菜植物；葫芦科的成员，如香瓜植物、罗马甜瓜植物、倭瓜植物、西瓜植物、白兰瓜植物、黄瓜植物、南瓜植物；薯蓣科的成员，如山药植物；杜鹃花科的成员，如蓝莓植物；大戟科的成员，如木薯植物；蝶形花科的成员，如紫花苜蓿植物、三叶草植物、花生植物；茶藨子科的成员，如醋栗植物；胡桃科的成员，如胡桃植物；唇形科的成员，如薄荷植物；樟科的成员，如鳄梨植物；豆科的成员，如大豆植物、菜豆植物、豌豆植物；锦葵科的成员，如棉花植物；竹芋科的成员，如竹芋植物；桃金娘科的成员，如番石榴植物、桉树植物；蔷薇科的成员，如桃植物、苹果植物、樱桃植物、李子植物、梨植物、西梅植物、黑莓植物、覆盆子植物、草莓植物；茜草科的成员，如咖啡植物；芸香科的成员，如柑橘植物、橙子植物、柠檬植物、葡萄柚植物、橘子植物；杨柳科的成员，如白杨植物、柳树植物；茄科的成员，如马铃薯植物、甘薯植物、番茄植物、辣椒植物、烟草植物、绿番茄植物、茄子植物、颠茄(Atropa belladona)植物、曼陀罗(Datura stramonium)植物；葡萄科的成员，如葡萄植物；伞形科的成员，如胡萝卜植物；芭蕉科的成员，如香蕉植物；或者其中该植物是松科的成员，如雪松植物、冷杉植物、铁杉植物、落叶松植物、松树植物或云杉植物。
[0193] 具体地，该作物植物选自：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵、水稻。
[0194] 具体地，这些作物植物是双子叶植物。在一个实施例中，这些作物植物是谷物或大豆。在一个实施例中，这些作物植物选自下组，该组由以下各项组成：夏季大麦、冬黑麦和大豆。更具体地，该作物植物是大豆。更具体地，该大豆是大豆的优良品系。
[0195] “优良品系”或“优良品种”是农艺学上有优势的品系，该品系是从针对有优势的农艺学表现的许多个周期的选育而产生的。众多的优良品系是可获得的并且对于大豆育种领域的普通技术人员是已知的。“优良群体”是一类优良个体或品系，其可以用来代表在给定作物物种(如大豆)的农艺学上有优势的基因型方面的现有技术。类似地，“优良种质”或种质的优良品种是农艺学上有优势的种质，通常源自和/或能够产生具有有优势的农艺学表现的植物，例如现有的或新开发的大豆优良品系。
[0196] 优良植物是来自优良品系的任何植物，因此优良植物是来自优良品种的代表性植物。农民或大豆育种者可商购的优良大豆品种的非限制性实例包括：AG00802、A0868、AG0902、A1923、AG2403、A2824、A3704、A4324、A5404、AG5903、AG6202、AG0934；AG1435；
AG2031；AG2035；AG2433；AG2733；AG2933；AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；
AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司(Asgrow Seeds)，美国爱荷华州德梅因)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所(Bio Plant Research)，美国伊利诺伊州营点(Camp Point))；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司(DeKalb Genetics)，美国伊利诺伊州迪卡尔布)；DP 4546 RR,、和DP 7870 RR(三角洲和松树陆地公司(Delta&Pine Land Company)，美国德克萨斯州卢博克市)；JG 03R501、JG 32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司，美国印第安纳州格林卡斯尔)；NKS 13-K2(先正达种子公司NK部门(NK Division of Syngenta Seeds)，美国明尼苏达洲黄金谷)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、
97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；
P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International)，美国爱荷华州庄士敦)；SG4771NRR和SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司(Soygenetics,
LLC)，美国印第安纳州拉斐特)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司(Syngenta Seeds)，美国肯塔基州亨德森市)；Richer(北极星种业有限责任公司
(Northstar Seed Ltd.)，加拿大亚伯达省)；14RD62(斯汀种子公司(Stine Seed Co.)，美国爱荷华州)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司(Armor Seed,LLC)，美国阿拉斯加州)。
AG2031；AG2035；AG2433；AG2733；AG2933；AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；
AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司(Asgrow Seeds)，美国爱荷华州德梅因)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所(Bio Plant Research)，美国伊利诺伊州营点(Camp Point))；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司(DeKalb Genetics)，美国伊利诺伊州迪卡尔布)；DP 4546 RR,、和DP 7870 RR(三角洲和松树陆地公司(Delta&Pine Land Company)，美国德克萨斯州卢博克市)；JG 03R501、JG 32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司，美国印第安纳州格林卡斯尔)；NKS 13-K2(先正达种子公司NK部门(NK Division of Syngenta Seeds)，美国明尼苏达洲黄金谷)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、
97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；
P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International)，美国爱荷华州庄士敦)；SG4771NRR和SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司(Soygenetics,
LLC)，美国印第安纳州拉斐特)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司(Syngenta Seeds)，美国肯塔基州亨德森市)；Richer(北极星种业有限责任公司
(Northstar Seed Ltd.)，加拿大亚伯达省)；14RD62(斯汀种子公司(Stine Seed Co.)，美国爱荷华州)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司(Armor Seed,LLC)，美国阿拉斯加州)。
[0197] 如本文所使用的术语“农艺学上优良的”是指具有许多可区分性状(例如出苗、活力、营养活力、抗病性、种子成型(seed set)、可立性、产量和脱粒性)的基因型，其允许生产者收获具有商业意义的产物。
[0198] 表达“有商业意义的产量”是指当在相同条件下生长时，由检查品系AG2703和DKB23-51的实际谷粒产量为103％所代表的对于种植者具有商业意义的谷物产量。
[0199] 相反，“外来大豆品种”或“外来大豆种质”是源自不属于可获得的优良大豆品系或种质品种的大豆的品种或种质。在两个大豆植物或种质品种之间杂交的情况下，外来种质和与其杂交的优良种质不是世代密切相关的。最普遍的是，外来种质不是源自任何已知的优良大豆品系，而是被选择用来将新的遗传元件(通常是新的等位基因)引入育种程序中。
[0200] 术语“脐”定义了大豆种子附着在豆荚上的点。品种间脐的颜色不同，并且可以是黄色(Y)、不完美的黄色(IY)、灰色(GR)、浅黄色(BF)、棕色(BR)、黑色(BL)或不完美的黑色(IBL)。针对出口市场通常优选黄脐大豆。具体地，在不完美的黄色(IY)品种上可能会发生脐变色。受影响的豆类可能不是出口市场所能接受的。
[0201] 术语“抗病的”涵盖对生物胁迫(例如病害或有害生物)或非生物胁迫(例如环境条件)的抗性。
[0202] 如在本上下文中使用的术语“抗病的”是指如所定义的对选自下组的以下病害中的任一种具有抗性的植物，该组由以下各项组成：线虫，细菌或病毒，例如锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜、大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和桃蚜；或其组合。对例如如下项的具体病害的抗性涵盖在本发明内：白粉病、终极腐霉菌、根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、叶瘟和穗瘟、纹枯病；麦二叉蚜；褐茎腐病；大豆胞囊线虫；或有害生物，如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫。
[0203] 影响葫芦科的病害包括线形病毒组，具体地，该线形病毒组是甜菜伪黄化病毒(BPYV)或南瓜黄色矮化失调病毒(CYSDV)。
[0205] 术语“水培”是指如下条件，其中使用矿物营养溶液，使植物在水中而没有土壤生长。陆生植物可以在仅有其根部在矿物溶液中或在惰性介质(如珍珠岩或砾石)中的情况下生长。对所有植物生长所必需的氮(N)、磷(P)和钾(K)和微量元素，如硫、铁、锰、锌、铜、硼、镁、钙、氯和钼。例如，对应于水培培养的物理条件可以是：空气种植、静态溶液、连续流、雾培、被动地下灌溉、潮涨落或水淹和排水地下灌溉、白白流掉(run to waste)、深水培养、上部供料深水培养或旋转。通常用于水培的基材包括但不限于：膨胀粘土粒料、生长石、泥炭、稻壳、蛭石、浮石、沙子、砾石、木纤维、羊毛、岩棉、砖碎片或聚苯乙烯包装花生。
[0206] 具体而言，适合于大豆植物生长的水培条件描述于：“Hydroponic Growth and the Nondestructive Assay for Dinitrogen Fixation[水培生长和二氮固定的无损检测]”，John Imsande和Edward J.Ralston.，Plant Physiol.[植物生理学](1981)68,1380-
1384。更具体地，温室中的大豆水培培养条件可以包含基于如下Imsande和Ralston 1981的营养溶液组合物，按原样或者进行一些改变：
1384。更具体地，温室中的大豆水培培养条件可以包含基于如下Imsande和Ralston 1981的营养溶液组合物，按原样或者进行一些改变：
[0207] 溶液A：制备20L的30X大量营养素溶液(2L/60L)
[0208]大量营养素 (g/20L)30X (mg/L)1X
K2HPO4 10.4 17.4
KNO3 60.6 101
KCl 87.3 221
CaCL2 141 235
MgCl2.6H2O 87 145
MgSO4.7H2O 150 250
K2HPO4 10.4 17.4
KNO3 60.6 101
KCl 87.3 221
CaCL2 141 235
MgCl2.6H2O 87 145
MgSO4.7H2O 150 250
[0209] 溶液B：制备500ml的5000X微量营养素溶液(12ml/60L)
[0210]
[0211] 溶液C：制备1L的3000X FeNa EDTA溶液(19.8ml/60L)
[0212] FeNa EDTA(13.2％Fe) 45g
[0213] 溶液D：Kasil 6：制备200L的1X硅溶液(76g/200L)
[0214] KASIL 6 22.8g/60L
[0216] 溶液E：制备20L的针对N和P的30X溶液(2L/60L)
[0217] 盐 (g)
[0218] NH4H2PO4 36
[0219] NH4NO3 120
[0220] 如本文所使用的，术语“启动子”或“启动子序列”是指启动特定基因转录的DNA或DNA序列的区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，在相同的链和DNA的上游(向着正义链的5'区)处。启动子可以长约100-1000个碱基对。可以理解的是，跨越距离天然基因起始密码子上游1000至5000个碱基对的基因组序列可以用作启动相应基因的基因转录的启动子。
[0221] 如本文所使用的，如“天然启动子”中的“天然”是指自然和/或最初存在于细胞中的启动子，并且其通常被指定用于表达特定基因。在一个实施例中，“天然启动子”在细胞的自然原始基因组中被编码。在一个实施例中，没有通过另一种生物体来采取额外的普通措施来将该启动子人工插入细胞中。如本文所使用的，“天然响应元件(RE)”或“天然启动子(RE)”是指自然地存在于启动子DNA序列中的RE。例如，人载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达自HNF4α(HNF4A)转录因子依赖性ApoC3启动子，该启动子针对HNF4A具有两个RE。针对HNF4A的两个RE(H4RE)是ApoC3启动子的天然RE。同样，肝细胞核因子1α(HNF1A)转录因子依赖性人HNF4A P2启动子针对HNF1α具有一个RE(H1RE)。人HNF4A P2启动子的天然RE中的H1RE。
[0222] “非天然启动子”是最初不存在于细胞中并且已被人工地插入到细胞中的启动子。在一个实施例中，基因的非天然启动子是不与该基因自然地相关联的启动子。例如，将小鼠肝细胞核因子1αDup4×H4RE(Hnf1α.sup.Dup4×H4RE)启动子与人肝细胞核因子1α(HNF1α)cDNA可操作地连接。Hnf1α.sup.Dup4×H4RE是非天然启动子。
具体实施方式
[0223] 大豆的新染色体区间
[0224] 根据本发明的具体实施例，提供了在16号染色体上发现的、是大豆中增加的Si摄取的原因的新基因组区域，该基因组区域在Hikmok sorip遗传连锁图谱上跨越从92.6cM至132cM距离，更具体地从94.9cM至101.6cM距离。
[0225] 更具体地，该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或一部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-577171。最具体地，该染色体区间包含选自下组的Glyma16g:30000或Glyma16g:30020基因的至少一个单核苷酸多
态性(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，其中SNP的存在与Si积累相关联。
态性(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，其中SNP的存在与Si积累相关联。
[0226] 根据本发明的具体实施例，该染色体区间包含SEQ ID NO:14或16。具体地，该染色体区间包含在植物中提供增加的硅摄取的SEQ ID NO.14或16或其一部分。具体地，此染色体区间源自Hikmok sorip大豆品种。
[0227] 根据具体实施例，本发明提供了包含SEQ ID NO:16的核酸或编码具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的多肽的核酸的染色体区间或基因组区域，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
[0228] 根据具体实施例，本发明提供了包含SEQ ID NO:14的核酸或编码具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的多肽的核酸的染色体区间或基因组区域，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
[0229] 具体地，该染色体区间源自黑脐大豆品种。更具体地，该核酸源自具有高Si摄取的黑脐大豆品种，特别是Hikmok sorip品种。
[0230] 植物
[0231] 根据具体的方面，本发明提供了如下HiSil植物，其中该植物在其基因组中包含如下染色体区间，该染色体区间包含H1单倍型。具体地，与不包含对应于H1单倍型的核酸的对照植物相比，所得植物是高Si积累者。
[0232] 根据可替代的方面，本发明提供了在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的HiSil植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处，如来自Hikmok sorip
(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。具体地，其中该植物是优良大豆(soybean，
Glycine max)植物。
(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。具体地，其中该植物是优良大豆(soybean，
Glycine max)植物。
[0233] 根据可替代的实施例，提供了在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的HiSil植物，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体对应于Williams82参考基因组的物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基
对。
对。
[0234] 因此，本发明的另外的方面提供了具有高Si摄取的植物，该植物向其基因组中引入了编码如SEQ ID NO:15或17所定义的HiSil蛋白的核酸序列。
[0235] 具体地，该植物包含引入其基因组中的包含SEQ ID NO:14、16或18中任一个的基因组区域。具体地，其中该植物是优良大豆(soybean，Glycine max)植物。
[0236] 根据具体实施例，本发明提供了如下植物，所述植物具有包含SEQ ID NO:16的核酸或编码具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的多肽的核酸的染色体区间或基因组区域，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
[0237] 根据具体实施例，本发明提供了如下植物，所述植物具有包含SEQ ID NO:14的核酸或编码具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的多肽的核酸的染色体区间或基因组区域，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
[0238] 具体地，该植物包含与增加的Si摄取相关联的、能够用如本文所定义的引物序列进行扩增和鉴定的分子标记。更具体地，该植物包含能够用下列序列扩增和鉴定的标记：SEQ ID NO.12、13和278-495。在另一个例子中，当用下列序列扩增时，该植物能够产生扩增子：SEQ ID NO.12、13和278-495。
[0239] 在具体的实施例中，该植物是大豆(Glycine max)(即，大豆(soybean))植物。具体地，该大豆植物是优良大豆植物。更具体地，该优良大豆植物包含HiSil性状。
[0240] 根据具体实施例，本发明提供了在其基因组中包含H1单倍型染色体区间的优良HiSil大豆植物。在一个方面，该H1单倍型源自Hikmok sorip或其子代。
[0241] 根据可替代的实施例，提供了如下优良HiSil大豆植物，其中该优良HiSil大豆植物在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0242] 根据具体的实施例，本发明提供了如下优良HiSil大豆植物，其中该优良HiSil大豆植物在其基因组中包含与硅积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体对应于Williams82参考基因组的物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基对。
[0243] 在具体实施例中，当该植物是优良大豆植物时，它是具有商业意义产量的商业上优良的大豆品种。更具体地，该植物是农艺学上优良的大豆。
[0244] 根据具体实施例，该植物的染色体区间源自选自下组的株系中的任一种，该组由以下各项组成：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A或PI90763。
[0245] 根据具体实施例，该植物具有改良的农艺学性状，例如幼苗活力、产量潜力、磷酸盐摄取、植物生长、幼苗生长、磷摄取、倒伏、繁殖生长或谷物品质。
[0246] 本发明的具体方面提供了向其基因组中引入了编码HiSil蛋白的核酸序列的植物，其中与不包含编码HiSil蛋白的核酸序列的对照植物相比，向基因组中的引入增加了该植物中的Si积累。
[0247] 最具体地，其中引入了H1单倍型的植物特此涵盖在本发明中，特别是那些包含Glyma16g30000和Glyma16g30020HiSil基因的编码序列的H1单倍型的植物。具体地，该H1单倍型由选自下组的核酸等位基因谱定义，该组由以下各项组成：G(33672717)、A
(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。可替代地，与高Si摄取相关联的分子标记位于HiSil区域基因内，并且能够被选自下组的基因Glyma16g:30000或Glyma16g:30020的核酸所定义，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。可替代地，与高Si摄取相关联的分子标记位于HiSil区域基因内，并且能够被选自下组的基因Glyma16g:30000或Glyma16g:30020的核酸所定义，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
[0248] 具体地，该H1单倍型由选自下组的氨基酸谱定义，该组由与SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性组成，其中该多肽进一步包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。具体地，该H1单倍型由选自下组的氨基酸谱定义，该组由与SEQ ID NO:15具有至少80％序列同一性组成，其中该蛋白质包含位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸。
[0249] 在本发明的一个实施例中，可以设想可以通过HiSil植物来源(例如Hikmok sorip)修饰或引入大豆基因组内的基因同系物以产生具有增加的Si摄取和/或积累的植
物。例如，编码序列Glyma09G24930、Glyma09G24943和Glyma09G24956(统称“Soy Chr9HiSil同系物”)可以被修饰以包含H1单倍型和/或包含对应于G(33672717)、A(33673022)、G
(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)或C(33683049)的等位基因修饰。在另一个例子中，不受理论的限制，“Soy Chr9HiSil同系物”中的任一个都可以被转基因表达以产生HiSil植物。可替代地，考虑了包含如下染色体区间的优良大豆植物，所述染色体区间包含源自HiSil来源(如Hikmok sorip)的“Soy
Chr9HiSil同系物”中的任一个，其中所述染色体区间的引入赋予增加的Si摄取和/或积累。
在其基因组中包含如下染色体区间的优良大豆植物，所述染色体区间包含Glyma09G24930、Glyma09G24943或Glyma09G24956中的任一个，其中与对照植物相比，所述区间赋予增加的Si摄取和/或积累。进一步考虑了，通过在植物基因组中检测与选自下组的基因中的任一个的存在相关联的标记来鉴定或选择HiSil植物的方法，该组由以下各项组成：
Glyma09G24930、Glyma09G24943和Glyma09G24956，其中所述基因的存在与增加的Si摄取和/或积累相关联。
物。例如，编码序列Glyma09G24930、Glyma09G24943和Glyma09G24956(统称“Soy Chr9HiSil同系物”)可以被修饰以包含H1单倍型和/或包含对应于G(33672717)、A(33673022)、G
(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)或C(33683049)的等位基因修饰。在另一个例子中，不受理论的限制，“Soy Chr9HiSil同系物”中的任一个都可以被转基因表达以产生HiSil植物。可替代地，考虑了包含如下染色体区间的优良大豆植物，所述染色体区间包含源自HiSil来源(如Hikmok sorip)的“Soy
Chr9HiSil同系物”中的任一个，其中所述染色体区间的引入赋予增加的Si摄取和/或积累。
在其基因组中包含如下染色体区间的优良大豆植物，所述染色体区间包含Glyma09G24930、Glyma09G24943或Glyma09G24956中的任一个，其中与对照植物相比，所述区间赋予增加的Si摄取和/或积累。进一步考虑了，通过在植物基因组中检测与选自下组的基因中的任一个的存在相关联的标记来鉴定或选择HiSil植物的方法，该组由以下各项组成：
Glyma09G24930、Glyma09G24943和Glyma09G24956，其中所述基因的存在与增加的Si摄取和/或积累相关联。
[0250] 根据具体实施例，本发明提供了向其基因组中引入了编码与SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.17中任一个具有60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的蛋白质的核酸序列的植物。更具体地，该蛋白质包含SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.17或由其组成。
[0251] 具体地，该蛋白质是促进Si摄取到植物中的功能性Si转运体。更具体地，该蛋白质赋予在植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中的Si积累。最具体地，该蛋白质在该植物的根部是有活性的。
[0252] 更具体地，该核酸序列包含SEQ ID NO:14和16中的任一个。可替代地，该核酸源自具有高硅摄取的大豆属植物。仍然，具体地，该核酸源自具有高Si摄取的黑脐大豆品种(如Hikmok sorip)。
[0253] 可替代地，将至少两个核酸序列引入该植物的基因组中，其中这两个核酸序列编码包含含有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的多肽序列的蛋白质。
[0254] 仍然，具体地，本发明提供了包含赋予增加的Si摄取的HiSil等位基因的优良HiSil大豆植物，并且其中该HiSil等位基因包含选自下组的至少一个单核苷酸多态性
(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示
的。
(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示
的。
[0255] 子代、植物部分、种子和细胞
[0256] 本发明的具体实施例提供了在其基因组中包含或向其基因组中引入了编码HiSil蛋白的核酸序列的植物，其中与不包含编码HiSil蛋白的核酸序列的对照植物相比，向基因组中的引入增加了该植物中的Si积累。
[0257] 在具体实施例中，提供了由本文所定义的植物产生或从其来源的子代植物。更具体地，提供了源自如本文所定义的植物的植物细胞、植物种子或植物部分。
[0258] 具体地，根据本发明的所有方面，术语“植物”是指其包括任何植物部分(如根、叶、枝干等)、种子或其组织培养物。更具体地，它包括植物的细胞、来自该植物的种子、种子的细胞或其组织培养物。
[0259] 根据本发明的另外的方面，提供了用于产生如本文所定义的植物的种子。可替代地，该植物来自该植物本身。
[0260] 根据具体实施例，该植物是单子叶植物或双子叶植物。
[0261] 作物/大豆
[0262] 具体地，这些植物是双子叶植物，例如作物植物。在一个实施例中，该作物植物是谷物或大豆。在一个实施例中，这些作物植物选自下组，该组由以下各项组成：夏季大麦、冬黑麦和大豆。更具体地，该作物植物是大豆。更具体地，该大豆是大豆优良品系，最具体地，是农艺学上优良的大豆。
[0263] 具体地，根据本发明的实施例，提供了包含如下核酸序列的优良大豆植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的蛋白质，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸。
[0264] 具体地，根据本发明的实施例，该植物是大豆植物并且不是Hikmok sorip(PI372415A)。更具体地，该植物属于具有高Si摄取的大豆品种或谱系，其条件是该品种不是Hikmok sorip。
[0265] 根据具体的实施例，本发明提供了提高大豆作物产量的方法，该方法包括以下步骤：在田间种植如本文所述的大豆植物；和确保向该植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0266] 根据具体的实施例，本发明提供了使大豆作物生长的方法，该方法包括以下步骤：在田间种植如本文所述的大豆植物；和向田间施用包含硅的化合物：在种植之前、在种植时或在种植之后。
[0267] 根据具体的实施例，本发明提供了使大豆作物生长的方法，该方法包括：在田间种植如本文所述的大豆植物，其中田间的土壤包含的硅水平为至少约0.8mM。
[0268] 大豆亲本品种
[0269] 根据本发明的具体方面，具有低Si摄取(即，在本实例中“低”意指“正常”或“平均”)的大豆品种选自不含与HiSil性状相关的分子标记(例如表15-20中的任何标记)的任何大豆品种。
[0270] 根据本发明的具体方面，具有高Si摄取的大豆品种具有更高的Si摄取，如在Hikmok sorip或含有赋予高Si摄取的标记的任何其他品系中发现的。更具体地，携带H1单倍型的品系、品种或等位基因可以用作用于嫁接的砧木。在本发明的实施例中，在其上嫁接包含HiSil性状(例如H1单倍型或来自表15-20的任何分子标记)的植物部分的植物。
[0271] 脐色品种
[0272] 具体地，具有高Si摄取的外来大豆品种源自黑脐大豆品种，Hikmok sorip品种。脐是大豆种子附着在豆荚上的点。品种间脐的颜色不同，并且可以是黄色(Y)、不完美的黄色(IY)、灰色(GR)、浅黄色(BF)、棕色(BR)、黑色(BL)或不完美的黑色(IBL)。在不完美的黄色(IY)品种上可能会发生脐变色。具体地，黄脐大豆是针对出口市场通常优选的类型。
[0273] 其他植物
[0274] 在具体的方面，该植物选自下组，该组由以下各项组成：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵、水稻。
[0275] 植物中发现的Si浓度
[0276] 根据本发明的具体实施例，提供了如下植物，当在水培条件下向植物提供浓度为至少约0.4mM至约0.8mM的Si的供应时，所述植物能够以至少1％Si浓度的浓度在叶组织中积累Si。根据具体的实施例，该植物具有如下叶Si浓度，所述叶Si浓度为不包含该基因组区域的对照植物的浓度的至少约一点二倍(1.2X)、一点五倍(1.5X)、二倍(2X)或三倍(3X)。仍然，具体地，该植物与LoSil植物相比，在其植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中具有增加的Si积累。更具体地，该植物与LoSil植物相比具有至少1.1X、1.2X、1.5X、2X、3X或更高的Si积累。
[0277] 根据具体实施例，当在水培条件下向其提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，该植物在其叶中包含至少1％Si浓度的硅浓度。更具体地，该植物与对照(LoSil)植物相比具有至少约两倍(2X)的叶Si浓度。
[0278] 具体地，根据本发明的不同方面，当向具有高Si摄取的植物(特别是大豆植物)提供充足的Si供应时，这些植物定义为在叶中具有1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％或1.6％以上的Si浓度。具体地，Si的充足供应被定义为在盆栽土或供料溶液中至少约0.8mM的Si浓度。更具体地，高Si摄取可以被定义为植物在叶中具有1.1％与3％之间的Si浓度；最具体地：在叶中具有1.5％与2.75％之间的Si浓度。
[0279] 抗病性
[0280] 根据本发明的具体方面，还提供了对胁迫(具体地：生物胁迫或非生物胁迫)具有增加的抗性的植物。
[0281] 在本发明的另外的方面，具有高Si摄取的植物对多种病害、有害生物和胁迫更具抗性。硅(Si)摄取对作物培养的益处被广泛接受，并且是在农业界被报道的概念。有超过1000种科学出版物描述了硅对植物健康的有益作用，更具体地说是对生物和非生物胁迫耐受性的有益作用(表1-4)。可以说Si衍生的益处最常与抗病性相关联。
[0282] 更具体地，该胁迫是：a)病害，选自：例如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆静脉坏死病毒、大豆茎溃疡、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌或纹枯病；b)昆虫有害生物，例如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫；或c)非生物胁迫，例如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁黄化病或耐寒性(即极端温度)。
[0283] 具体地，在大豆作物中发现了以下病害：亚洲大豆锈菌病、大豆胞囊线虫、线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜。
[0284] 在本发明的具体实施例中，提供了用于增加植物中对病害抗性的方法，该方法包括以下步骤：在田间种植如本文所述的植物；和确保向该植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0285] 在本发明的具体实施例中，提供了减少作物中非生物胁迫损害的方法，其中该非生物胁迫是由以下项中的任一种所引起的：干旱、水淹/水大、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、低温、热、或除草剂，该方法包括以下步骤：在田间种植如本文所述的植物；和确保向该植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0286] 对例如如下项的病害的抗性涵盖在本发明内：白粉病、终极腐霉菌、根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、叶瘟和穗瘟、纹枯病；麦二叉蚜；褐茎腐病；大豆胞囊线虫；以及根结线虫。同样地，对例如如下项的有害生物的抗性涵盖在本发明内：粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫。
[0287] 对例如如下项的生物和非生物胁迫的抗性也涵盖在本发明内：盐(盐度)、干旱、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼或寒冷(即极端温度)。
[0288] 在大多数情况下，Si的有益作用将在积累更高量的Si的植物种(如禾本科的成员)中更多显示。例如在水稻的情况下，发现了Si改良剂增强了对诸如稻瘟病、褐斑病和纹枯病等病害的抗性(表1)。在几项研究中也观察到了Si对昆虫有害生物的预防效果(表2)。甘蔗是另一种高Si积累者，并且在施Si肥情况下观察到许多针对甘蔗的积极效应(表2)。类似地，在玉蜀黍、水稻、小麦和黄瓜中已经报道了对不同昆虫有害生物(具体地，线形病毒组，其可能为甜菜伪黄化病毒(BPYV)或南瓜黄色矮化失调病毒(CYSDV))的抗性增强。
[0289] 非生物胁迫耐受性是包括大豆在内的作物产量生产的主要制约因素。由水分受限的环境造成的干旱、洪水、高水平盐度和重金属胁迫是非生物胁迫的主要问题。在不同的植物物种中，Si施用已经显示出对抗这些胁迫的良好水平的产量提高(表3)。
[0290] 除了改善生物和非生物胁迫抗性外，还报道了Si施用改进了几种农艺学性状。在水稻中施用Si时，观察到了幼苗活力、产量潜力和磷酸盐摄取的增加(表4)。
[0291] 通过高Si摄取改进的农艺学性状也涵盖在本发明内，所述改进的农艺学性状可以选自，除其他：植物生长、产量、幼苗生长、磷摄取、倒伏、繁殖生长或谷物品质。
[0292] 表1.报告中提供的证实了硅改良剂对不同植物物种中抗病性的有益作用的实验证据的细节
[0293]
[0294]
[0295]
[0296]
[0297]
[0298] 表2.报告中提供的证实了硅改良剂对不同植物物种中昆虫抗性的有益作用的实验证据的细节
[0299]
[0300]
[0301] 表3.报告中提供的证实了硅改良剂对不同植物物种中非生物胁迫耐受性的有益作用的实验证据的细节
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309] 表4.报告中提供的证实了硅改良剂对不同植物物种中农艺学表现的有益作用的实验证据的细节
[0310]
[0311]
[0312]
[0313] 鉴定方法
[0314] 根据本发明的另外的实施例，提供了用于鉴定高Si积累大豆品种或谱系的方法，该方法包括以下步骤：a)获得大豆植物的一部分；和b)分析该部分以检测针对大豆高Si摄取的标记，该标记包含如下核酸，所述核酸包含在16号染色体的某一位置处的从33104446bp至35762786bp的至少一个单核苷酸多态性(SNP)；其中当检测到该标记时，该品种或谱系被鉴定为高Si积累者(例如，选自表15-20的任何标记或与其非常接近的标记)。
[0315] 可替代地，在具体实施例中，本发明提供了鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)从第一大豆植物分离核酸；b)在该核酸中检测与增加的Si摄取相关联的分子标记的存在，并且其中该分子标记：与H1单倍型相关；或位于对应于如下基因组区域的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处；或位于从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；和c)基于b)的分子标记的存在鉴定或选择该大豆植物；从而鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物。
[0316] 具体地，此方法被用于商业大豆植物育种程序中。更具体地，此方法中的这一检测步骤包括检测多态简单重复序列(SSR)或单核苷酸多态性(SNP)的至少一种等位基因形式。最具体地，检测包括扩增该标记座位或该标记座位的一部分，并检测所得扩增的标记扩增子(例如由选自SEQ ID NO.12、13和278-495的引物对产生的扩增子)。
[0317] 根据具体的实施例，用于鉴定或选择的方法进一步包括如下步骤，其中与增加的Si摄取相关联的染色体区间被基因渗入第二大豆植物或种质中以产生具有增加的Si摄取的基因渗入的大豆植物或种质，其中该基因渗入的大豆植物进一步包含以下项中的至少一种：a)选自下组的基因Glyma30000或30020上的SNP标记，该组由以下各项组成：A
(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)；b)对应于如下基因组区域或其部分的标记，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或c)从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)；b)对应于如下基因组区域或其部分的标记，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或c)从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0318] 仍然，根据此方法，与该第一大豆植物或种质相比，该第二大豆植物或种质表现出低Si摄取，其中与该第二植物或种质相比，该经基因渗入的大豆植物或种质表现出增加的Si摄取。具体地，该第二大豆植物或种质包括优良大豆品系或外来大豆品系。
[0319] 根据具体的方面，鉴定方法还可以包括将代表检测到的等位基因或分子标记的数据电子传输或电子存储在计算机可读介质中。仍然，具体地，使用TASSEL、GeneFlow或MapManager-QTX软件确定该分子标记或等位基因。
[0320] 具体地，该植物的至少一个亲本品系可以通过与如本文所定义的核酸相关联的分子标记来选择或鉴定。
[0321] 标记
[0322] 具体地，本发明提供了指示大豆或其他植物的高Si摄取的至少一种标记，具体地位于Williams82参考基因组的从33.15Mb对至36.72Mb对。此标记对于开发和鉴定具有高Si摄取或已经被修饰以实现高Si摄取的大豆植物是有用的。
[0323] 仍然，具体地，该植物源于由位于该染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内的分子标记所选择或鉴定的亲本品系，其中该分子标记与该植物中的Si积累，更具体地说与高Si积累相关联。
[0324] 根据具体实施例，该标记对应于：来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处的基因组区域；或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对的基因组区域，或其部分，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。可替代地，该标记对应于选自下组的基因glyma16g:30000或glyma16g:30020的SNP，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
[0325] 可替代地，该分子标记位于选自下组的、与增加的Si积累相关联的单核苷酸多态性(SNP)标记的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：G(33672717)、A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)、C(33683049)和表15-18中所示的任何标记，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0326] 更具体地，如在Hikmok sorip的16号染色体上所发现的，该标记是可以包括选自下组的单核苷酸多态性的核酸，该组由以下各项组成：SNP605(33104446bp)、SNP606(33527064bp)、SNP607(33595090bp)、SNP608(33802005bp)、SNP609(35218844bp)和SNP610(35762786bp)。
[0327] 具体地，该分子标记是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状座位(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
[0328] 对应于所发现的标记的16号染色体上的基因组区域如SEQ ID NO.1所定义。表5列出了来自Hikmok sorip大豆植物的16号染色体的高硅积累区和相应的由SEQ ID NO.1所定义的推定的基因起始和终止密码子。
[0329] 表5.存在于来自Hikmok sorip的从33104446bp至35762786bp的在16号染色体上的Hisil区域处的潜在基因的列表
[0330]
[0331]
[0332]
[0333]
[0334]
[0335]
[0336]
[0337]
[0338]
[0339]
[0340]
[0341]
[0342] 注意：16号染色体上的标记的物理位置(以Mb或bp计)基于公开可获得的Williams82参考品系(SOYBASE)；来自JGI第8版的大豆基因组组装，基于最初的Glyma v1(2012年1月)。
[0343] 在本发明的一个实施例中，可以通过引入或检测表5中列出的基因来产生、选择或鉴定HiSil植物。具体地，基因Glyma16g29990、Glyma16g30000、Glyma16g30020中的任一个。在另一个实施例中，可以将表5中列出的基因上游的约2千碱基对、1千碱基对或0.5千对碱基对用作启动子来促进细胞中基因表达。具体地，Glyma16g29990、Glyma16g30000、
Glyma16g30020中的任一个的5'起始密码子上游的2、1或0.5千碱基可以用作根优选的启动子区域。在这方面，如所述的任何启动子序列或包含所述启动子区的任何表达盒和包含所得表达盒的任何植物。
Glyma16g30020中的任一个的5'起始密码子上游的2、1或0.5千碱基可以用作根优选的启动子区域。在这方面，如所述的任何启动子序列或包含所述启动子区的任何表达盒和包含所得表达盒的任何植物。
[0344] 针对分离群体中的HiSil基因的判别检测，开发了HiSil区域中的一组五个标记。称为HiSil-Del的第一标记是基于当与Williams82参考基因组相比时在栽培品种Hikmok
sorip中存在的大缺失(约286bp，Gm16:33,712,274至33,712,559)而设计的。HiSil-Del与HiSil紧密连锁，因为分开的距离只有28Kb。因为PCR扩增子的大的尺寸差异，所以甚至使用琼脂糖凝胶电泳，使用标记HiSil-Del来筛选HiSil的存在。
sorip中存在的大缺失(约286bp，Gm16:33,712,274至33,712,559)而设计的。HiSil-Del与HiSil紧密连锁，因为分开的距离只有28Kb。因为PCR扩增子的大的尺寸差异，所以甚至使用琼脂糖凝胶电泳，使用标记HiSil-Del来筛选HiSil的存在。
[0345] 根据本发明的另外的方面，开发了对HiSil基因具特异性的四种基因标记(包括三种缺失和一种插入)。具体地，这些标记可以由SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10和11定义。
[0346] 另外，开发了其他四种基因特异性标记，包括三种缺失和一种插入。这些标记有助于跟踪分离子代中的HiSil基因，并可用于在任何新的种质来源中鉴定该基因。具体地，这些标记可以被定义为HiSil-del1；HiSil-del2；HiSil-del3b；HiSil-ins1和HiSil-Del，并且能够用以下引物序列进行扩增和鉴定：SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
[0347] 根据本发明的另外的方面，提供了与HiSil基因连锁的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记。这些标记被限制性内切酶特异性地切割以在该HiSil基因中产生不同的片段。
具体地，这些标记可以被定义为HiSil-MboII_F或HiSil-MboII_R，并且能够用以下序列进行扩增和鉴定：SEQ ID NO.12和13。
具体地，这些标记可以被定义为HiSil-MboII_F或HiSil-MboII_R，并且能够用以下序列进行扩增和鉴定：SEQ ID NO.12和13。
[0348] 核酸和蛋白质序列
[0349] 根据本发明的不同方面，包含该HiSil基因的基因组区域对应于由SEQ ID NO.1定义的区域，或者可以被定义为14或16或其一部分。
[0350] 表6.Williams和Hikmok序列的列表
[0351]
[0352]
[0353] 仍然，根据用于鉴定的方法的具体实施例，扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与分离自该第一大豆植物或种质的核酸混合，其中该引物或引物对与该标记座位的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用该大豆核酸为模板，通过DNA聚合酶启动DNA聚合；和b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以产生至少一个扩增子。具体地，该核酸选自DNA或RNA。
[0354] 根据用于鉴定的方法的具体实施例，扩增步骤包括采用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自该第一大豆植物或种质的核酸作为PCR或LCR中的模板。
[0355] 表7.基因标记的引物序列的列表
[0356]
[0357] 根据本发明的另外的方面，提供了与HiSil基因连锁的CAPS(酶切扩增多态性序列)标记。这些标记被限制性内切酶特异性地切割，以与Williams82品种的野生型基因中的片段相比在Hikmok sorip品种的Hisil基因中产生不同的片段。具体地，可以使用选自SEQ ID NO.12-13(表8)和27-277(表19)的引物以及选自SEQ ID NO.278-495(表19)的探针来发现这些标记。
[0358] 表8.CAPS标记的引物序列的列表。
[0359]
[0360] 等位基因和单倍型
[0361] 在属于不同的大豆成熟组的328个不同大豆登录中进行等位基因挖掘。根据Glyma16g:30000和Glyma16g:30020的编码序列中的等位基因变异鉴定若干单倍型组。
[0362] 根据本发明的另外的方面，提供了Glyma16g:30000和Glyma16g:30020的编码序列中的H1等位基因。发现携带单倍型H1的植物积累了高水平的Si，从而证实了单倍型H1与大豆中高Si摄取能力的相关性。具体地，该H1单倍型可以被选自下组的核酸中的至少一种定义，该组由以下各项组成：G(33672717)、A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
[0363] 发现五个登录携带与Hikmok sorip类似的单倍型(H1)。发现来自携带与Hikmok sorip类似的单倍型H1的整组登录的植物积累了高水平的Si，从而证实了单倍型H1与大豆中高Si摄取能力的相关性。H1和其他单倍型由存在于HiSil基因(SEQ ID NO:14或16)的如下位置处的单核苷酸变异定义：33672717、33673022、33673483、33681630、33681946、
33681961、33682500、33683047、和/或33683049。表9中提供了存在于这些位置处的核苷酸。
可以如本领域所熟知的，通过对区域测序、针对变异设计引物和检测变异的其他几种技术来表征这些单倍型。
33681961、33682500、33683047、和/或33683049。表9中提供了存在于这些位置处的核苷酸。
可以如本领域所熟知的，通过对区域测序、针对变异设计引物和检测变异的其他几种技术来表征这些单倍型。
[0364] 表9.代表单倍型H1(即Hikmok sorip)的核苷酸和氨基酸改变。
[0365]
[0366] 表10.在Hisil QTL中鉴定的控制大豆中Si积累的三个候选基因的等位基因变异
[0367]
[0368] HiSil蛋白质序列(SEQ ID NO.15或17)与水稻(水稻是单子叶植物)中鉴定的低Si转运体2(Lsi2，流出Si转运体)具有57％的同源性。当在双子叶植物(如大豆)中观察HiSil同系物时，可以看到约70％的同源性。因此，本发明涵盖包含如下HiSil蛋白质序列的植物，所述HiSil蛋白质序列在单子叶植物中与SEQ ID NO:15或17具有大于60％的同源性并且在双子叶植物中与SEQ ID NO:15或17具有大于70％的同源性。
[0369] 可替代地，根据本发明的具体实施例，该植物包含H1单倍型，其条件是该植物不是Hikmok sorip。
[0370] 用于开发HiSil大豆品种的方法
[0371] 因此，根据另外的实施例，本发明提供了用于开发具有高硅摄取的大豆品种的方法，该方法包括以下步骤：a)使具有低Si摄取的第一大豆品种与包含标记的第二大豆品种杂交，其中该标记包含如下核酸，所述核酸包含在16号染色体的某一位置处的从33104446bp至35762786bp的至少一个单核苷酸多态性(SNP)；和b)选择包含该标记的子代；
其中包含该标记的子代具有高Si摄取。
其中包含该标记的子代具有高Si摄取。
[0372] 因此，根据另外的实施例，本发明提供了用于开发具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)由于具有高Si摄取的第二大豆品种包含源于16号染色体的某一区域的从33104446bp至35762786bp的核酸序列，所以用该第二大豆品种嫁接具有低Si摄取的第一大豆品种。
[0373] 仍然，根据可替代的实施例，本发明提供了为了产生具有高硅摄取的品系的目的用于遗传修饰具有低硅摄取的大豆品系的方法，该方法包括以下步骤：在植物中引入源于Hikmok sorip大豆品种的16号染色体的某一区域的从33104446bp至35762786bp的核酸(例如，选自表5的任何基因，具体地，Glyma16g29990、Glyma16g30000、Glyma16g30020)。
[0374] 用于产生Si高积累植物的方法
[0375] 根据另外的可替代的实施例，本发明提供了用于产生具有HiSil性状的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)提供包含H1单倍型的第一大豆植物品系或其子代；b)使步骤a)中提供的大豆植物与第二大豆植物杂交；c)收集由步骤b)中的杂交产生的种子；d)将c)的种子再生成植物；e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植
物；g)评估步骤f)的植物的高硅吸收(即HiSil性状)；以及h)鉴定并选择作为高Si积累者的植物。
物；g)评估步骤f)的植物的高硅吸收(即HiSil性状)；以及h)鉴定并选择作为高Si积累者的植物。
[0376] 可替代地，本发明提供了用于产生如下种子的方法，所述种子产生具有HiSil性状的大豆植物，该方法包括以下步骤：a)提供包含H1单倍型的第一大豆植物品系或其子代；b)使步骤a)中提供的大豆植物与第二大豆植物杂交；c)收集由步骤b)中的杂交产生的种子；d)将c)的种子再生成植物；e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；以及g)选择并鉴定产生作为高Si积累者的大豆植物的种子。具体地，该H1单倍型大豆植物选自以下项中的任一种：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI90763或其子代。
[0377] 根据另外的可替代的实施例，本发明提供了用于产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)使具有高Si摄取的第一大豆植物与具有低Si摄取的第二大豆植物杂交，其中该第一大豆植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；和b)从a)的植物杂交产生子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；从而产生具有增加的Si摄取的大豆植物。具体地，该第一大豆植物包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域的染色体区间，所述基因组区域来自如本文所定义的Hikmok sorip 16号染色体。具体地，该第一大豆植物是以下项中的任一种：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI90763或其子代。
[0378] 根据具体实施例，当在水培条件下向该第一大豆植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，该大豆品种在叶中包含至少约1％Si浓度的Si浓度。具体地或可替代地，当在水培条件下向具有低Si摄取的第二大豆植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，该植物在叶中包含小于1％Si浓度的Si浓度。
[0379] 根据另外的可替代的实施例，此方法包括另外的步骤，包括：从b)的子代植物分离核酸；针对与如本文所定义的植物中Si积累相关联的分子标记的存在对该核酸进行基因分型。
[0380] 根据可替代的实施例，本发明进一步提供了产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)从大豆植物中分离核酸；b)对a)的核酸进行基因分型；c)将植物鉴定为包含与如本文所定义的增加的Si摄取相关联的至少一种分子标记；以及d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的分子标记的植物产生大豆子代植物。
[0381] 一种产生具有增加的硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：a)将如本文所定义的染色体区间引入大豆植物的基因组中；b)通过从该植物中分离核酸并针对与染色体区间的存在以及增加的Si摄取性状相关的分子标记对该核酸进行基因分型来选择包含a)的染色体区间的大豆植物、植物种质或植物种子；和c)产生具有增加的硅摄取的大豆植物。具体地，所产生的植物或种子是优良大豆品种。
[0382] 根据具体实施例，提供了产生具有增加的硅摄取的植物的方法，该方法包括以下步骤：a)将编码HiSil蛋白的核酸引入植物的基因组中；b)选择包含a)的核酸的植物、植物种质或植物种子；以及c)产生具有增加的硅摄取的植物。具体地，该核酸序列编码与SEQ ID NO:15或17中任一个具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的蛋白质序列。更具体地，该核酸包含与SEQ ID NO:14或16中任一个具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
[0383] 根据另外的实施例，提供了产生抗病害植物的方法，该方法包括以下步骤：将如本文中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中该植物表达盒的引入赋予该植物中增加的Si摄取；从而产生抗病害植物。
[0384] 根据具体实施例，提供了产生具有增加的产量的植物的方法，该方法包括以下步骤：将如本文中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中该植物表达盒的引入赋予该植物中增加的Si摄取；从而产生具有增加的产量的植物。
[0385] 根据具体实施例，提供了用于产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，步骤包括：a)将包含编码多肽的多核苷酸的重组DNA分子引入植物细胞中，其中该多核苷酸的核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：i)如SEQ ID NO:14或16所示的核苷酸序列；ii)编码具有SEQ ID NO:15或17的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；iii)与SEQ ID NO:14或16具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列；和iv)编码与SEQ ID NO:15和17具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；以及b)从该植物细胞生长植物。
[0386] 植物中的引入
[0387] 根据本发明的另外的实施例，提供了将HiSil性状引入植物(如，大豆植物)中的方法，该方法包括：a)选择包含如本文所定义的HiSil基因或在其基因组中包含编码与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:15具有至少80％序列同一性的蛋白质的核酸序列的大豆植物，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含苏氨酸，和b)向该核酸序列中引入修饰使得该经编码的蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸。
[0388] 根据本发明的另外的实施例，提供了用于产生具有增加的Si摄取的植物(如大豆植物)的方法，步骤包括：a)将包含编码多肽的多核苷酸的重组DNA分子引入植物细胞中，其中该多核苷酸的核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：i)如SEQ ID NO:14或16所示的核苷酸序列；ii)编码具有SEQ ID NO:15或17的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；iii)与SEQ ID NO:14或16具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列；和iv)编码与SEQ ID NO:15和17具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；以及b)从该植物细胞生长植物。
97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；以及b)从该植物细胞生长植物。
[0389] 具体地，本发明中使用的HiSil核酸序列可以包含与SEQ ID NO:14或16具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸序列，其中向植物基因组中的引入赋予该植物增加的Si积累。更具体地，本发明中使用的HiSil蛋白可以包含与SEQ ID NO:15和/或17具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的氨基酸序列，其中植物中该基因的表达赋予该植物增加的Si积累。
[0390] 该HiSil基因可通过本领域熟知的传统育种或转基因技术引入任何植物基因组中。同样，引入可以通过本领域已知的任何方式完成，包括：基因渗入、转基因或定点核酸酶(SDN)。具体地，通过定点核酸酶(SDN)的方式引入对该核酸序列的修饰。更具体地，该SDN选自：大范围核酸酶、锌指、转录激活子样效应子核酸酶系统(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR)。
[0391] 基因组编辑
[0392] SDN也被称为“基因组编辑”，或用工程化核酸酶进行基因组编辑(GEEN)。这是一种类型的遗传工程，其中使用在基因组中的期望定位处产生位点特异性双链断裂(DSB)的工程化核酸酶在生物体的基因组中插入、缺失或取代DNA。通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复诱导的双链断裂，导致靶向突变(‘编辑’)。具体地，SDN可以包括如下技术，例如：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(Feng等人，2013；Joung和Sander 2013)、和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR-Cas)系统。
[0393] 根据这种具体的方法，可以通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过基因组核酸的特定修饰将核酸引入植物基因组。最具体地，核酸的引入是通过异源或转基因基因表达来实现的。
[0394] 转基因
[0395] 根据具体实施例，进一步提供了产生具有增加的硅摄取的植物的方法，该方法包括以下步骤：将编码HiSil蛋白的核酸引入植物的基因组中；选择包含a)的该核酸的植物、植物种质或植物种子；以及产生具有增加的硅摄取的植物。
[0396] 可替代的，本发明还提供了产生抗病害植物的方法，该方法包括以下步骤：将如本文中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中该植物表达盒的引入赋予该植物中增加的Si摄取；从而产生抗病害植物。
[0397] 可替代地，还提供了产生具有增加的产量的植物的方法，该方法包括以下步骤：将如本文中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中该植物表达盒的引入赋予该植物中增加的Si摄取；从而产生具有增加的产量的植物。因此，还提供了包含如本文所定义的植物表达盒的转基因植物或转基因种子。
[0398] 仍然，根据此具体实施例，本发明因此提供了作为如下转基因雌性祖先大豆植物的子代的农艺学上优良的大豆种子，所述祖先大豆植物在其基因组中具有表达如下Si转运体的重组DNA，所述Si转运体包含如本文所定义的氨基酸序列，具体地与SEQ ID NO:15或17中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。更具体地，该蛋白质在根组织中是有活性的。最具体地，该蛋白质赋予在植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中的Si积累。
[0399] 表达盒
[0400] 根据具体的实施例，通过植物表达盒将本发明的核酸引入植物基因组中。
[0401] 根据本发明的另外的方面，提供了用于在植物中引入和表达的表达盒，该表达盒包含与植物启动子序列可操作地连接的编码HiSil基因的核酸。具体地，本发明提供了包含编码如本文所定义的Si转运体的经分离的多核苷酸的植物表达盒，具体地，选自由SEQ ID NO:14和16组成的组的多核苷酸或编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中任一个具有60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的蛋白质的多核苷酸。更具体地，该表达盒编码选自由SEQ ID NO:15或17组成的组的多肽。
[0402] 根据具体实施例，该表达盒包含编码如下多肽的核酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列，其中该多肽进一步包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。具体地，该植物表达盒的DNA对编码包含SEQ ID NO:17的多肽的多核苷酸天然模板具有至少一个等位基因修饰，其中该多核苷酸等位基因修饰导致选自下组的氨基酸变化中的任一种，该组由以下各项组成：位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸。
[0403] 根据可替代的实施例，该表达盒包含编码如下多肽的核酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。具体地，该植物表达盒的DNA对编码包含SEQ ID NO:15的多肽的多核苷酸天然模板具有至少一个等位基因修饰，其中该多核苷酸等位基因修饰导致选自下组的氨基酸变化中的任一种，该组由以下各项组成：位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸。
[0404] 更具体地，通过如下基因组编辑将该表达盒引入植物基因组中，例如像：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、和Cas9-指导RNA系统(改编自CRISPR原核免疫系统)，或者通过基因组核酸的特定修饰。
[0405] 根据可替代的实施例，该植物表达包括与天然或非天然启动子可操作连接的如本文所定义的多核苷酸。具体地，该植物表达盒包含如本文所定义的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至根特异性或根偏好性启动子，具体地，如本文所定义的启动子。
[0406] 根据可替代的实施例，本发明提供了包含如本文所定义的植物表达盒的载体。
[0407] 启动子
[0408] 启动子是启动特定基因转录的DNA或DNA序列的区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，在相同的链和DNA的上游(向着正义链的5'区)处。启动子可以长约100-1000个碱基对。在本发明中，天然或非天然启动子可以启动植物中HiSil基因的转录。
[0409] 天然启动子是指自然和/或最初存在于细胞中的启动子，并且通常指定用于表达特定基因，例如在该细胞的自然原始基因组中被编码的基因。因此，除了核酸之外，将可操作连接的根特异性或根偏好性启动子引入植物基因组中，特别地，将可操作连接的HiSil启动子序列引入植物基因组中。
[0410] 具体地，该HiSil启动子序列包含由SEQ ID NO:18、19或20所定义的核酸序列。更具体地，该启动子包含与SEQ ID NO:18、19或20具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸。具体地，该启动子序列包含如下核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:18、19或20具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸。
[0411] 非天然启动子可以是最初不存在于细胞中并且已经被人工地插入到该细胞中的启动子，例如与该基因自然地不相关联的基因的启动子。具体地，该启动子序列是根特异性或根偏好性启动子。更具体地，该根特异性或根偏好性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RCc3、PHT1、MtPT1、MtPT2、Pyk10、β-微管蛋白、LRX1、BTG-26、LeAMT1、LeNRT1-1、KDC1、TobRb7、OsRAB5a、ALF5、NRT2、RB7、RD2和Gns1葡聚糖酶根启动子。根特异性启动子的其他实例包括但不限于分别在美国专利号5,459,252和5,837,876中描述的RB7和RD2启动子。
[0412] 仍然，该启动子可以选自：RolD启动子、RolD-2启动子、富含甘氨酸的蛋白质启动子、GRP启动子、ADH启动子、玉蜀黍ADH1启动子、PHT启动子、Pht1基因家族启动子、金属摄取蛋白质启动子、玉蜀黍金属硫蛋白质启动子、35S CaMV结构域A启动子、pDJ3S启动子、SIREO启动子、pMe1启动子、Sad1启动子、Sad2启动子、TobRB7启动子、RCc3启动子、FaRB7启动子、SPmads启动子、IDS2启动子、pyk10启动子、Lbc3豆血红蛋白启动子、PEPC启动子、Gns1葡聚糖酶根启动子、35S2启动子、GI4启动子、GI5启动子、和GRP启动子。
[0413] 基因渗入或育种
[0414] 根据具体实施例，如下实施本发明的方法，其中通过植物基因渗入、植物育种或标记辅助育种(MAB)完成核酸的引入。
[0415] 用于使Si高积累植物生长的方法
[0416] 根据具体实施例，本发明进一步提供了用于使植物生长的方法，该方法包括以下步骤：a)提供如本文所定义的植物或如本文所定义的种子；b)使植物从中生长；和c)用硅土壤改良剂灌溉该植物。
[0417] 具体地，该硅土壤改良剂可以选自下组，该组由以下各项组成：矿渣、硅灰石、钢厂矿渣、碎石、硅酸钙、硅酸镁、无定形硅藻土(DE)、硅酸钙镁、磷炉副产物、硅酸钙、硅酸钾、硅酸、有机硅、硅酸钠。更具体地，该硅土壤改良剂可以选自：Ca2SiO4、CaSiO2、SiO2、CaSiO3、MgSiO3、或K2SiO3、(Si(OH)4、H4SiO4、和R2SiO，其中R是有机基团，如甲基、乙基或苯基。
[0418] 根据具体的实施例，本发明提供了使作物(如大豆作物)生长的方法，该方法包括以下步骤：a)在田间种植如本文所述的大豆植物；和b)向田间施用包含硅的化合物：i)在种植之前、ii)在种植时、或iii)在种植之后。
[0419] 根据具体的实施例，提供了使大豆作物生长的方法，该方法包括：a)选择用于种植该大豆作物的地点，其中该地点包含如下土壤，该土壤具有水平为至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少30ppm、至少40ppm或至少50ppm的硅浓度，以及b)种植如本文所述的大豆植物并使其生长。
[0420] Si土壤改良剂和Si组分或来源
[0421] 根据具体实施例，该Si改良剂可以包含水平为至少0.4mM、至少约0.5mM、至少约0.6mM、至少约0.7mM或至少约0.8mM的硅浓度。
[0422] 具体地，该土壤改良剂的Si组分来自于选自下组的来源，该组来自于以下各项：矿渣、硅灰石、钢厂矿渣、碎石、硅酸钙、硅酸镁、无定形硅藻土(DE)、硅酸钙镁、磷炉副产物、硅酸钙、硅酸钾、硅酸、有机硅、硅酸钠。更具体地，该Si来源选自：Ca2SiO4、CaSiO2、SiO2、CaSiO3、MgSiO3、或K2SiO3、(Si(OH)4、H4SiO4、和R2SiO，其中R是有机基团，如甲基、乙基或苯基。
[0423] 用于组合销售的试剂盒
[0424] 根据本发明的另外的方面，提供了用于组合销售如本文所定义的植物种子和用于制造Si土壤改良剂的至少一种组分的试剂盒。根据具体的方面，该试剂盒进一步包含关于如何在液体(例如水)中稀释硅组分用于制造硅土壤改良剂的说明书；以及任选地，用于灌溉植物的说明书。
[0425] 具体实施例的列表
[0426] 根据本发明的另外的方面，提供了以下具体实施例：
[0427] 1.一种优良HiSil大豆植物，其中所述优良HiSil大豆植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型。
[0428] 2.一种优良HiSil大豆植物，其中所述优良HiSil大豆植物在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0429] 3.一种优良HiSil大豆植物，其中所述优良HiSil大豆植物在其基因组中包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间，所述基因组区域或其部分来自Hikmok sorip 16号染色体对应于Williams82参考基因组的物理位置31.15M碱基对至36.72M碱基对。
[0430] 4.如段落1-3中任一项所述的植物，其中该优良大豆是具有商业意义的产量的商业优良大豆品种。
[0431] 5.如段落1-4中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或一部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-
569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的
573723-577171。
569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的
573723-577171。
[0432] 6.如段落1-5中任一项所述的植物，其中所述植物与LoSil植物相比，在该植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中具有增加的Si积累。
[0433] 7.如段落6所述的植物，其中所述植物与LoSil植物相比具有至少1.2X、1.5X、2X、3X或更高的Si积累。
[0434] 8.如段落1-7中任一项所述的植物，其中所述植物的至少一个亲本品系由位于所述染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内的分子标记选择或鉴定，其中所述分子标记与所述植物中的Si积累相关联。
[0435] 9.如段落8所述的植物，其中该分子标记是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状座位(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
[0436] 10.如段落8-9中任一项所述的植物，其中该分子标记位于选自下组的、与增加的Si积累相关联的单核苷酸多态性(SNP)标记的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：G(33672717)、A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33681946)、T(33681961)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0437] 11.如段落1-10中任一项所述的植物，其中当在水培条件下向所述植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述植物在叶中包含至少约1％Si浓度的Si浓度。
[0438] 12.如段落1-11中任一项所述的植物，其中该染色体区间源自选自下组的株系中的任一种，该组由以下各项组成：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI372415A或PI90763。
[0439] 13.一种源自如段落1-12中任一项所述的植物的子代植物。
[0440] 14.一种源自如段落1-13中任一项所述的植物的植物细胞、植物种子或植物部分。
[0441] 15.如段落1-14中任一项所述的植物，其中所述植物对选自下组的胁迫具有增加的抗性，该组由以下各项组成：病害(例如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆静脉坏死病毒、大豆茎溃疡、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌或纹枯病)；昆虫有害生物(例如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(例如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁黄化病或耐寒性(即极端温度))。
[0442] 16.如段落1-13或15中任一项所述的植物，其中所述植物具有改良的农艺学性状，例如幼苗活力、产量潜力、磷酸盐摄取、植物生长、幼苗生长、磷摄取、倒伏、繁殖生长或谷物品质。
[0443] 17.一种优良大豆植物，其中所述植物包含HiSil性状。
[0444] 18.一种包含赋予增加的Si摄取的HiSil等位基因的优良HiSil大豆植物，并且其中该HiSil等位基因包含选自下组的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下各项组
成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0445] 19.如段落18所述的植物，其中该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-577171。
[0446] 20.一种用于产生具有HiSil性状的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0447] a)提供包含H1单倍型的第一大豆株系或其子代；
[0448] b)使步骤a)中提供的该大豆植物与第二大豆植物杂交；
[0449] c)收集由步骤b)中的该杂交产生的种子；
[0450] d)将c)的种子再生成植物；
[0451] e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；
[0452] f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；
[0453] g)评估步骤f)的植物的高硅摄取(即HiSil性状)；以及
[0454] h)鉴定并选择作为高Si积累者的植物。
[0455] 21.一种用于产生如下种子的方法，所述种子产生具有HiSil性状的大豆植物，该方法包括以下步骤：
[0456] a)提供包含H1单倍型的第一大豆株系或其子代；
[0457] b)使步骤a)中提供的该大豆植物与第二大豆植物杂交；
[0458] c)收集由步骤b)中的该杂交产生的种子；
[0459] d)将c)的种子再生成植物；
[0460] e)通过使步骤d)的植物或其自交后代与大豆育种材料杂交以提供回交植物来提供一个或多个回交世代；
[0461] f)使步骤e)的植物自交并使该自交的种子生长成植物；以及
[0462] g)选择并鉴定产生作为高Si积累者的大豆植物的种子。
[0463] 22.如段落20或21所述的方法，其中该H1单倍型大豆植物选自以下项中的任一种：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI90763或其子代。
[0464] 23.一种产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0465] a)使具有高Si摄取的第一大豆植物与具有低Si摄取的第二大豆植物杂交，其中所述第一大豆植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；以及[0466] b)从a)的该植物杂交产生子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含如下染色体区间，所述染色体区间包含H1单倍型；
[0467] 从而产生具有增加的Si摄取的大豆植物。
[0468] 24.如段落23所述的方法，其中该第一大豆植物包含与Si积累相关联的、对应于如下基因组区域的染色体区间，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0469] 25.如段落20-24中任一项所述的方法，其中该第一大豆植物是以下项中的任一种：PI372415A、PI209332、PI404166、PI437655、PI89772、PI90763或其子代。
[0470] 26.如段落24中任一项所述的方法，其中该染色体区间包含对应于以下位置的核苷酸碱基对中的任一个或部分：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；
SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-
577171。
SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-
577171。
[0471] 27.如段落20-26中任一项所述的方法，其中当在水培条件下向该第一大豆植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述大豆品种在叶中包含至少约1％Si浓度的Si浓度。
[0472] 28.如段落20-27中任一项所述的方法，其中当在水培条件下向具有低Si摄取的该第二大豆植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述植物在叶中包含小于1％Si浓度的Si浓度。
[0473] 29.如段落20-28中任一项所述的方法，该方法包括另外的步骤，包括：从b)的该子代植物中分离核酸；针对如下分子标记的存在对所述核酸进行基因分型，所述分子标记位于对应于如下基因组区域或其一部分的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；进一步地，其中所述分子标记与所述植物中的Si积累相关联。
[0474] 30.如段落29所述的方法，其中该分子标记位于选自下组的、与增加的Si积累相关联的、对应于如下染色体区间的单核苷酸多态性(SNP)标记的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述染色体区间来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15Mb碱基对至36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0475] 31.一种产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0476] a)从大豆植物中分离核酸；
[0477] b)对a)的该核酸进行基因分型；
[0478] c)鉴定植物为包含与增加的Si摄取相关联的至少一种分子标记，其中所述分子标记位于对应于如下基因组区域或其部分的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15Mb碱基对至36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；以及
[0479] d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的所述分子标记的该植物产生大豆子代植物。
[0480] 32.一种产生具有增加的硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0481] a)向大豆植物的基因组中引入包含含有如下核苷酸碱基对的核酸的染色体区间，所述核苷酸碱基对对应于如下位置：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的
573723-577171；
573723-577171；
[0482] b)通过从所述植物中分离核酸并针对与该染色体区间的存在以及增加的Si摄取性状相关的分子标记对该核酸进行基因分型来选择包含a)的该染色体区间的大豆植物、植物种质或植物种子；以及
[0483] c)产生具有增加的硅摄取的大豆植物。
[0484] 33.如段落31或32所述的方法，其中该分子标记位于20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内或位于所述染色体区间内，或者所述标记位于选自下组的、对应于如下基因组区域或其部分的SNP的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15Mb碱基对至
36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
36.72Mb碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0485] 34.如段落30-33所述的方法，其中所产生的该植物或种子包含来自下组的、对应于如下基因组区域或其部分的至少一个SNP，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或从物理位置33.15M碱基对至
36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0486] 35.如段落20-34所述的方法，其中所产生的该植物或种子是优良大豆品种。
[0487] 36.一种通过如段落20-35所述的方法产生的植物、植物部分或植物种子。
[0488] 37.一种产生具有高硅摄取的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0489] a)从大豆植物中分离核酸；
[0490] b)对a)的该核酸进行基因分型；
[0491] c)将植物鉴定为包含与Si转运体基因的存在相关联的至少一种分子标记，其中该基因编码包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中任一个的蛋白质；以及
[0492] d)从c)的鉴定为具有与增加的Si摄取相关联的所述分子标记的该植物产生大豆子代植物。
[0493] 38.一种防治大豆作物中的以下病害中的任一种的方法：亚洲大豆锈菌病、大豆胞囊线虫、线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜，该方法包括以下步骤：
[0494] a)在田间种植如段落1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；和
[0495] b)确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0496] 39.一种减少大豆作物中非生物胁迫损害的方法，其中该非生物胁迫是由以下项中的任一种所引起的：干旱、水淹/水大、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、低温、热、或除草剂，该方法包括以下步骤：
[0497] a)在田间种植如段落1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；和
[0498] b)确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0499] 40.一种提高大豆作物产量的方法，该方法包括以下步骤：
[0500] a)在田间种植如段落1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；和
[0501] b)确保向所述植物提供浓度为至少约0.8mM的Si的供应。
[0502] 41.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括以下步骤：
[0503] a)在田间种植如段落1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物；和
[0504] b)向田间施用包含硅的化合物：
[0505] i.在种植之前，
[0506] ii.在种植时，或
[0507] iii.在种植之后。
[0508] 42.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括在田间种植如段落1-13；15-19；或36中任一项中所述的大豆植物，其中田间的土壤包含的硅水平为至少约0.8mM。
[0509] 43.一种鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0510] a)从第一大豆植物分离核酸；
[0511] b)在该核酸中检测与增加的Si摄取相关联的分子标记的存在，并且其中所述分子标记：与H1单倍型相关联；或位于对应于如下基因组区域的染色体区间的20cM、10cM、5cM、1cM或0.5cM内，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处；或位于从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；以及
[0512] c)基于b)的该分子标记的存在鉴定或选择所述大豆植物；
[0513] 从而鉴定或选择具有增加的Si摄取的第一大豆植物。
[0514] 44.如段落43所述的方法，其中该分子标记是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状座位(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
[0515] 45.如段落43或44所述的方法，其中该染色体区间包含如下核酸中的任一个或一部分，所述核酸包含对应于以下位置的核苷酸碱基对：SEQ ID NO:1的1-2658341；SEQ ID NO:1的567613-569933；SEQ ID NO:1的564321-567612；SEQ ID NO:1的577172-579696；或SEQ ID NO:1的573723-577171。
[0516] 46.如段落43-45中任一项所述的方法，其中所鉴定或选择的该植物包含对应于以下项的至少一种标记：
[0517] a)来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处的基因组区域；或从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对的基因组区域，或其部分，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的；或选自由以下各项组成的组的基因Glyma16g:30000或Glyma16g:30020的SNP：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
[0518] 47.如段落43-46所述的方法，其中该染色体区间包含编码如下多肽的核酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
[0519] 48.如段落43-47所述的方法，其中该染色体区间包含编码如下多肽的核酸，所述多肽具有包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列，进一步地，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
[0520] 49.如段落43-48所述的方法，其中该方法用于商业大豆植物育种程序中。
[0521] 50.如段落43-49所述的方法，其中该检测包括检测多态简单重复序列(SSR)或单核苷酸多态性(SNP)中的至少一种等位基因形式。
[0522] 51.如段落43-50所述的方法，其中该检测包括扩增该标记座位或该标记座位的一部分，并检测所得到的扩增的标记扩增子。
[0523] 52.如段落51所述的方法，其中该扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与分离自该第一大豆植物或种质的核酸混合，其中该引物或引物对与该标记座位的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用该大豆核酸为模板，通过DNA聚合酶启动DNA聚合；和b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以产生至少一个扩增子。
[0524] 53.如段落52所述的方法，其中该核酸选自DNA或RNA。
[0525] 54.如段落51-53中任一项所述的方法，其中该扩增包括采用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自该第一大豆植物或种质的核酸作为该PCR或LCR中的模板。
[0526] 55.如段落43-54中任一项所述的方法，该方法进一步包括如下步骤，其中将与增加的Si摄取相关联的该染色体区间基因渗入第二大豆植物或种质中以产生具有增加的Si摄取的经基因渗入的大豆植物或种质，其中该经基因渗入的大豆植物进一步包含以下项中的至少一种：
[0527] a)选自由以下各项组成的组的基因Glyma30000或30020上的SNP标记：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)；
[0528] b)对应于如下基因组区域或其部分的标记，所述基因组区域来自Hikmok sorip 16号染色体在约92.6cM至约132cM距离处或
[0529] c)从物理位置33.15M碱基对至36.72M碱基对，如来自Hikmok sorip(PI372415A)的遗传连锁图谱上所指示的。
[0530] 56.如段落55所述的方法，其中与该第一大豆植物或种质相比，该第二大豆植物或种质表现出低Si摄取，其中与该第二植物或种质相比，该经基因渗入的大豆植物或种质表现出增加的Si摄取。
[0531] 57.如段落55-56中任一项所述的方法，其中该第二大豆植物或种质包括优良大豆品系或外来大豆品系。
[0532] 58.如段落43-57中任一项所述的方法，该方法包括将代表该检测到的等位基因或分子标记的数据电子传输或电子存储在计算机可读介质中。
[0533] 59.如段落43-58中任一项所述的方法，其中使用TASSEL、GeneFlow或MapManager-QTX软件确定该分子标记或等位基因。
[0534] 60.如段落43-59中任一项所述的方法，其中所述染色体区间包含选自下组的Glyma16g:30000或Glyma16g:30020基因的至少一个单核苷酸多态性(SNP)，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C
(33683049)，其中所述SNP的存在与Si积聚相关。
(33683049)，其中所述SNP的存在与Si积聚相关。
[0535] 61.如段落1-13；15-19；或36所述的植物，其中所述染色体区间包含在大豆植物中提供增加的硅摄取的SEQ ID NO.14或16或其一部分。
[0536] 62.如段落1-13；15-19；或36或61所述的植物，其中所述植物包含与增加的Si摄取相关联的、能够用如下引物序列扩增和鉴定的分子标记：SEQ ID NO.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和27-277。
[0537] 63.如段落1-13；15-19；或36或61-62中任一项所述的植物，其中所述植物包含能够用如下序列扩增和鉴定的标记：SEQ ID NO.12、13和278-495。
[0538] 64.如段落61-63中任一项所述的植物，其中所述分子标记位于HiSil区域基因内，如选自下组的基因Glyma30000或30020的核酸所定义的，该组由以下各项组成：A(33673022)、G(33673483)、C(33681630)、T(33682500)、G(33683047)和C(33683049)。
[0539] 65.一种农艺学上优良的大豆植物，当在水培条件下向植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，该植物能够以至少1％Si浓度的浓度在叶组织中积累Si，其中该大豆包含引入到其基因组中的、包含SEQ ID NO:14、16或18中任一个的基因组区域。
[0540] 66.如段落65所述的植物，其中所述植物具有如下叶Si浓度，所述叶Si浓度为不包含所述基因组区域的对照植物的浓度的至少约一点二倍(1.2X)、一点五倍(1.5X)、二倍(2X)或三倍(3X)。
[0541] 67.如段落1-13；15-19；或36或61-66中任一项所述的植物，其中所述染色体区间或基因组区域包含编码具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的多肽的核酸，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
[0542] 68.如段落1-13；15-19；或36或61-67中任一项所述的植物，其中所述染色体区间或基因组区域包含编码具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的多肽的核酸，进一步地，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
[0543] 69.如段落68所述的植物，其中该核酸是SEQ ID NO:16。
[0544] 70.如段落67所述的植物，其中该核酸是SEQ ID NO:14。
[0545] 71.一种具有高Si摄取的大豆品种或谱系的植物，其条件是所述品种不是Hikmok sorip。
[0546] 72.如段落71所述的植物，其中该大豆品种或谱系在其基因组中包含含有SEQ ID NO:14或16的染色体区间，其中所述染色体区间源自Hikmok sorip。
[0547] 73.由如段落61-72所述的植物产生的种子。
[0548] 74.如段落1-13；15-19；或36或61-72所述的植物，其中所述植物另外地在其基因组中具有赋予选自下组的性状中的任一种的转基因，该组由以下各项组成：除草剂抗性或昆虫抗性。
[0549] 75.一种向其基因组中引入了如下核酸序列的植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17中任一个具有60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的蛋白质。
[0550] 76.如段落75所述的植物，其中该植物是单子叶植物或双子叶植物。
[0551] 77.如段落75-76中任一项所述的植物，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵和水稻。
[0552] 78.如段落75-77中任一项所述的植物，其中该蛋白质是促进Si摄取到该植物中的功能性Si转运体。
[0553] 79.如段落75-78中任一项所述的植物，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:14或16中的任一个。
[0554] 80.如段落75-79中任一项所述的植物，其中该核酸编码包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或者由其组成的蛋白质。
[0555] 81.如段落75-80中任一项所述的植物，其中该核酸源自具有高硅摄取的大豆属植物。
[0556] 82.如段落75-81中任一项所述的植物，其中该核酸源自具有高Si摄取的黑脐大豆品种(如Hikmok sorip)。
[0557] 83.如段落75-82中任一项所述的植物，其中将至少两个核酸序列引入其基因组中，其中该两个核酸序列编码包含含有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的多肽序列的蛋白
质。
质。
[0558] 84.如段落75-83中任一项所述的植物，其中该蛋白质在所述植物的根中具有活性。
[0559] 85.如段落75-84中任一项所述的植物，其中该蛋白质赋予在该植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中的Si积累。
[0560] 86.如段落75-85中任一项所述的植物，其中所述核酸的引入通过异源的或转基因的基因表达来完成。
[0561] 87.如段落75-86中任一项所述的植物，其中被引入所述植物的基因组中的该核酸通过植物表达盒引入。
[0562] 88.如段落87所述的植物，其中该植物表达盒包含与所述核酸可操作地连接的启动子，其中所述启动子促进该核酸在所述植物的根组织中的表达。
[0563] 89.如段落88所述的植物，其中该启动子序列包含如下核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:18、19或20具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸。
[0564] 90.如段落88-89中任一项所述的植物，其中该启动子是根特异性启动子或根偏好性启动子。
[0565] 91.如段落90所述的植物，其中该根特异性或根偏好性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RCc3、PHT1、MtPT1、MtPT2、Pyk10、β-微管蛋白、LRX1、BTG-26、LeAMT1、LeNRT1-1、KDC1、TobRb7、OsRAB5a、ALF5和NRT2。
[0566] 92.如段落75-86中任一项所述的植物，其中该核酸已经通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过修饰基因组核酸被引入到该植物基因组中。
[0567] 93.如段落75-92中任一项所述的植物，其中该核酸编码具有包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的多肽，并且进一步地，其中该多肽包含对应于位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸的至少一个氨基酸。
[0568] 94.如段落75-93中任一项所述的植物，其中该核酸编码具有包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的多肽，进一步地，其中该多肽包含对应于位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸的至少一个氨基酸。
[0569] 95.如段落75-94中任一项所述的植物，其中与不包含所述核酸的对照植物相比，该植物是高Si积累者。
[0570] 96.如段落75-86中任一项所述的植物，其中所述核酸的引入通过植物基因渗入或植物育种来完成。
[0571] 97.如段落96所述的植物，其中所述植物的至少一个亲本品系由与所述核酸相关联的分子标记选择或鉴定。
[0572] 98.如段落75-97中任一项所述的植物，其中该核酸的引入赋予以下项中的任一种：增加的生物抗性或耐受性、增加的非生物抗性或耐受性、增加的产量、增加的生物量、品质或其组合。
[0573] 99.如段落75-98中任一项所述的植物，其中该核酸的引入赋予对来自下组的至少一种病原体的增加的抗性，该组由以下各项组成：线虫、锈菌、黑粉菌、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜和桃蚜；或其组合。
[0574] 100.如段落75-99中任一项所述的植物，该植物对选自下组的胁迫具有增加的抗性，该组由以下各项组成：病害(例如白粉病、终极腐霉菌、根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、叶瘟和穗瘟、或纹枯病)；昆虫有害生物(例如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(例如干旱、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼或耐寒性(即极端温度))。
[0575] 101.如段落75-100中任一项所述的植物，该植物具有改良的农艺学性状，例如幼苗活力、产量潜力和磷酸盐摄取、植物生长、幼苗生长、磷摄取、倒伏、繁殖生长或谷物品质。
[0576] 102.如段落75-101中任一项所述的植物，其中该植物是作物植物。
[0577] 103.如段落75-102中任一项所述的植物，其中所述植物是大豆植物并且不是Hikmok sorip(PI372415A)。
[0578] 104.如段落75-103中任一项所述的植物，其中该植物是优良大豆植物。
[0579] 105.如段落75-104中任一项所述的植物，其中当在水培条件下向植物提供浓度为约0.8mM的Si的供应时，所述植物在叶中包含至少1％Si浓度的硅浓度。
[0580] 106.如段落75-105中任一项所述的植物，其中所述植物与对照植物相比具有至少约两倍(2X)的叶Si浓度。
[0581] 107.一种包含如下分离的多核苷酸的植物表达盒，所述分离的多核苷酸编码选自由SEQ ID NO:14和16组成的组的Si转运体。
[0582] 108.如段落107所述的表达盒，其中所述多核苷酸编码选自由SEQ ID NO:15或17组成的组的多肽。
[0583] 109.如段落107-108中任一项所述的植物表达盒，其中该多核苷酸可操作地连接至非天然启动子。
[0584] 110.如段落107-109中任一项所述的植物表达盒，其中该DNA对编码包含SEQ ID NO:15的多肽的所述多核苷酸天然模板具有至少一个等位基因修饰，其中该多核苷酸等位基因修饰导致选自下组的氨基酸变化中的任一种，该组由以下各项组成：位置5处的脯氨酸、位置295处的异亮氨酸或位置439处的缬氨酸。
[0585] 111.如段落107-110所述的植物表达盒，其中该DNA对编码包含SEQ ID NO:17的多肽的所述多核苷酸天然模板具有至少一个等位基因修饰，其中该多核苷酸等位基因修饰导致选自下组的氨基酸变化中的任一种，该组由以下各项组成：位置322处的组氨酸或位置431处的甘氨酸。
[0586] 112.如段落110-111中任一项所述的植物表达盒，其中该等位基因修饰通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或基因组编辑技术来实现。
[0587] 113.一种包含如段落107-112中任一项所述的植物表达盒的载体。
[0588] 114.一种包含如段落107-112中任一项所述的多核苷酸的植物表达盒。
[0589] 115.如段落107-112中任一项所述的植物表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接至根特异性或根偏好性启动子。
[0590] 116.如段落115所述的植物表达盒，其中所述启动子包含SEQ ID NO:18、19或20。
[0591] 117.一种包含如段落114-116所述的植物表达盒的转基因植物。
[0592] 118.一种包含如段落114-116所述的植物表达盒的转基因种子。
[0593] 119.如段落117所述的转基因植物，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵和水稻。
[0594] 120.如段落119所述的转基因种子，其中所述种子来自选自下组的转基因植物，该组由以下各项组成：大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵和水稻。
[0595] 121.一种产生具有增加的硅摄取的植物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0596] a)将编码HiSil蛋白的核酸引入植物的基因组中；
[0597] b)选择包含a)的该核酸的植物、植物种质或植物种子；以及
[0598] c)产生具有增加的硅摄取的植物。
[0599] 122.如段落121所述的方法，其中该核酸序列编码与SEQ ID NO:15或17中任一个具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的蛋白质序列。
[0600] 123.如段落121-122中任一项所述的方法，其中该植物是双子叶植物或单子叶植物。
[0601] 124.如段落121-123中任一项所述的方法，其中与不包含所述核酸的对照植物相比，该植物是高Si积累者。
[0602] 125.如段落121-124中任一项所述的方法，其中该植物是大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵或水稻。
[0603] 126.如段落121-125中任一项所述的方法，其中该植物向其基因组中引入了包含与SEQ ID NO:14或16中任一个具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或
100％序列同一性的核苷酸序列的核酸序列。
100％序列同一性的核苷酸序列的核酸序列。
[0604] 127.如段落121-126中任一项所述的方法，其中该核酸序列编码促进Si摄取的蛋白质。
[0605] 128.如段落127所述的方法，其中该核酸序列编码HiSil蛋白。
[0606] 129.如段落121-128中任一项所述的方法，其中该蛋白质在根组织中具有活性。
[0607] 130.如段落121-129中任一项所述的方法，其中该蛋白质赋予在该植物叶、植物茎或植物部分中的任一者中的Si积累。
[0608] 131.如段落121-130中任一项所述的方法，其中除了该核酸之外，已经将可操作连接的根特异性或根偏好性启动子引入所述植物基因组中。
[0609] 132.如段落121-131中任一项所述的方法，其中除了所述核酸之外，已经将可操作连接的HiSil启动子序列引入所述植物基因组中。
[0610] 133.如段落132所述的方法，其中该启动子序列包含如下核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:18、19或20具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的核酸。
[0611] 134.如段落131所述的方法，其中该根特异性或根偏好性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RCc3、PHT1、MtPT1、MtPT2、Pyk10、β-微管蛋白、LRX1、BTG-26、LeAMT1、LeNRT1-1、KDC1、TobRb7、OsRAB5a、ALF5和NRT2。
[0612] 135.如段落121-130中任一项所述的方法，其中该核酸已经通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过特异性修饰基因组核酸被引入到该植物基因组中。
[0613] 136.如段落121-130中任一项所述的方法，其中所述核酸的引入通过异源的或转基因的基因表达来完成。
[0614] 137.如段落121-130中任一项所述的方法，其中所述核酸的引入通过植物基因渗入、植物育种或标记辅助育种(MAB)来完成。
[0615] 138.一种产生抗病害植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0616] a)将如段落108-112和114-116中任一项中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中所述植物表达盒的所述引入赋予所述植物中增加的Si摄取；
[0617] 从而产生抗病害植物。
[0618] 139.一种产生具有增加的产量的植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0619] a)将如段落114-116中任一项中所述的植物表达盒稳定地引入植物基因组中，其中所述植物表达盒的所述引入赋予所述植物中增加的Si摄取；
[0620] 从而产生具有增加的产量的植物。
[0621] 140.如段落138和139中任一项所述的方法，其中该植物是大豆、番茄、香瓜、玉蜀黍、甘蔗、卡诺拉、西兰花、卷心菜、花椰菜、胡椒、油菜籽油菜、甜菜、芹菜、倭瓜、菠菜、黄瓜、西瓜、小西葫芦、普通菜豆、小麦、大麦、甜玉米、向日葵或水稻。
[0622] 141.一种作为如下转基因雌性祖先大豆植物的子代的农艺学上优良的大豆种子，所述祖先大豆植物在其基因组中具有表达如下Si转运体的重组DNA，所述Si转运体包含与SEQ ID NO:15或17中任一个的氨基酸序列具有至少约80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0623] 142.一种用于产生具有增加的Si摄取的大豆植物的方法，步骤包括：
[0624] a)将包含编码多肽的多核苷酸的重组DNA分子引入植物细胞中，其中该多核苷酸的核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：
[0625] i)如SEQ ID NO:14或16所示的核苷酸序列；
[0626] ii)编码具有SEQ ID NO:15或17的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
[0627] iii)与SEQ ID NO:1、14或16具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列；和
[0628] iv)编码与SEQ ID NO:15和17具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白质的核苷酸序列；
[0629] 以及
[0630] b)从所述植物细胞生长植物。
[0631] 143.如段落142所述的方法，该方法进一步包括选择与对照植物相比具有选自以下项的增强的性状的植物：增加的产量、提高的氮利用效率、提高的病害抗性、增加的非生物胁迫耐受性、提高的昆虫抗性、和提高的水分利用效率或耐旱性。
[0632] 144.一种如段落1-19；36；74-106；119-120和141中任一项中所定义的植物的种子。
[0633] 145.一种来自如段落1-19；36；61-72；74-106；119-120和141中任一项中所定义的植物的种子。
[0634] 146.一种用于产生硅高积累植物的试剂盒，该试剂盒包含：
[0635] a)如段落144或145所述的种子，和
[0636] b)用于制造硅土壤改良剂的至少一种组分。
[0637] 147.如段落146所述的试剂盒，其中所述组分选自下组，该组由以下各项组成：矿渣、硅灰石、钢厂矿渣、碎石、硅酸钙、硅酸镁、无定形硅藻土(DE)、硅酸钙镁、磷炉副产物、硅酸钙、硅酸钾、硅酸、有机硅、硅酸钠。
[0638] 148.如段落147所述的试剂盒，其中所述组分选自：Ca2SiO4、CaSiO2、SiO2、CaSiO3、MgSiO3、或K2SiO3、(Si(OH)4、H4SiO4、和R2SiO，其中R是有机基团，如甲基、乙基或苯基。
[0639] 149.如段落146-148中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含关于如何在水中稀释所述硅组分用于在土壤中施用的说明书。
[0640] 150.一种如段落144或145中所定义的种子的细胞。
[0641] 151.一种如段落1-19；36；61-72；74-106；119-120和141中任一项中所定义的植物的细胞。
[0642] 152.一种用于使植物生长的方法，该方法包括以下步骤：
[0643] a)提供根据段落1-19；36；61-72；74-106；119-120和141中任一项所述的植物或如段落144或145中所定义的种子；
[0644] b)使植物从中生长；以及
[0645] c)用硅土壤改良剂灌溉所述植物。
[0646] 153.如段落152所述的方法，其中所述硅土壤改良剂选自下组，该组由以下各项组成：矿渣、硅灰石、钢厂矿渣、碎石、硅酸钙、硅酸镁、无定形硅藻土(DE)、硅酸钙镁、磷炉副产物、硅酸钙、硅酸钾、硅酸、有机硅、硅酸钠。
[0647] 154.如段落153所述的方法，其中所述硅土壤改良剂选自：Ca2SiO4、CaSiO2、SiO2、CaSiO3、MgSiO3、或K2SiO3、(Si(OH)4、H4SiO4、和R2SiO，其中R是有机基团，如甲基、乙基或苯基。
[0648] 155.一种将HiSil性状引入大豆植物中的方法，该方法包括：
[0649] a)选择在其基因组中包含编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的蛋白质的核酸序列的大豆植物，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置
295的位置处包含苏氨酸，以及
295的位置处包含苏氨酸，以及
[0650] b)向该核酸序列中引入修饰使得该经编码的蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸，
[0651] 其中定点核酸酶(SDN)将该修饰引入该核酸序列中。
[0652] 156.如段落155所述的方法，其中该SDN选自：大范围核酸酶、锌指、转录激活子样效应子核酸酶系统(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR)。
[0653] 157.一种通过如段落155所述的方法产生的大豆植物。
[0654] 158.一种包含如下核酸序列的优良大豆植物，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的蛋白质，其中该蛋白质在对应于SEQ ID NO:15的位置295的位置处包含异亮氨酸。
[0655] 159.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括以下步骤：
[0656] a)在田间种植如段落152-154中任一项中所述的大豆植物，和
[0657] b)向田间施用包含硅的化合物：
[0658] i.在种植之前，
[0659] ii.在种植时，或
[0660] iii.在种植之后。
[0661] 160.一种使大豆作物生长的方法，该方法包括：
[0662] a)选择用于种植该大豆作物的地点，其中该地点包含如下土壤，所述土壤具有水平为至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少30ppm、至少40ppm或至少50ppm的硅浓度，以及
[0663] b)种植如段落152-154中任一项中所述的大豆植物并使其生长。
[0664] 161.如段落72-106中任一项所述的植物，其中该植物包含H1单倍型。
[0665] 实例
[0666] 提出以下实例以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整披露和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为他们的发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是进行的所有或仅有的实验。就使用的数字(例如，量、温度等)而言，已努力确保其精确度，但仍应考虑到有一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是或接近大气压。
[0667] 实例1–Hikmok sorip大豆中HiSil区域的发现
[0668] 材料与方法
[0669] 植物材料
[0670] 评估了一组代表早熟组的139个大豆栽培品种的Si积累。随后，在已知的高吸收品系Hikmok sorip和典型的吸收品系(Majesta)之间进行杂交，并且我们开发了141个重组近交品系(RIL)，也对其进行了评估。使大豆植物(每种品系三株)在控制条件下在温室中生长。使用2％次氯酸钠处理5分钟接着用蒸馏水洗涤三次进行种子表面灭菌。使植物在盆栽土中生长，该盆栽土具有或不具有从硅酸钾(Kasil#6，23.6％SiO2，国家硅酸盐公司(National Silicates))制备的1.7mM Si。
[0671] 量化大豆叶样品中的硅
[0672] 在施用第一Si改良剂后三周收集每株植物的第一个三叶形叶子进行Si浓度分析。将干燥的叶子在珠式均化器(Omni Bead Ruptor，奥美尼国际公司(Omni International))中研磨成粉末。根据Reidinger等人(2012)的方法，使用便携式X射线荧光光谱仪(Niton Xl3t900GOLDD XRF分析仪；赛默科技公司(Thermo Scientific))在英国约克大学
(University of York)进行测量。用未接种的植物进行Si比率测定。
(University of York)进行测量。用未接种的植物进行Si比率测定。
[0673] X射线微量分析和扫描电子显微术
[0674] 使用扫描电子显微术结合能量色散X射线(DXR)微量分析仪分析不同大豆基因型叶子中的Si分布。从有或没有Si情况下生长的每个植物物种收获单个完全伸展的健康叶
子，该叶子没有任何病害症状或物理损伤。从该叶子的中部区域切下小的分段(约10×
10mm)，避免中脉。将切下的叶片冻干并用金和钯进行涂覆以提供导电性。使用CAMECA SX-
100通用EPMA显微镜(法国亚义赛公司(Cameca instruments Inc.)，特兰伯尔，美国)检查被涂覆的样品。使用15kV的电压和20nA的电流进行处理以获得整个叶样品中的元素浓度分布曲线。
子，该叶子没有任何病害症状或物理损伤。从该叶子的中部区域切下小的分段(约10×
10mm)，避免中脉。将切下的叶片冻干并用金和钯进行涂覆以提供导电性。使用CAMECA SX-
100通用EPMA显微镜(法国亚义赛公司(Cameca instruments Inc.)，特兰伯尔，美国)检查被涂覆的样品。使用15kV的电压和20nA的电流进行处理以获得整个叶样品中的元素浓度分布曲线。
[0675] 通过测序对大豆栽培品种进行基因分型
[0676] 采用先前使用GBS方法进行的SNP基因分型(Sonah等人，2014)。根据Elshire的方案(Elshire等人，2011)使用Sonah等人(2013)描述的小修改，将ApeK1限制性内切酶用于文库制备。使用在麦吉尔大学Génome Québec创新中心(蒙特利尔，魁北克省，加拿大)的Illumina HiSeq2000进行多重GBS文库的单端测序。使用IGST-GBS流水线进行Illumina序列读取处理、作图、SNP调用和基因分型(Sonah等人，2013)。使用Vcftools和几个内部脚本来获得高质量的SNP。用fastPHASE 1.3进行缺失数据的填补(Scheet和Stephens，2006)。使用SnpEff(版本3.3H)和Phytozome数据库中提供的大豆基因组注释来进行SNP的功能和结
构注释(Goodstein等人，2012；Cingolani等人，2012)。
构注释(Goodstein等人，2012；Cingolani等人，2012)。
[0677] 全基因组关联分析(GWAS)
[0678] 使用软件工具如TASSEL 3.0以及基因组关联和预测集成工具(GAPIT)进行GWAS(Bradbury等人，2007；Lipka等人，2012)。用或不用来自主成分分析(PCA)的协变量P和获得自STRUCTURE的协变量Q来使用一般线性模型(GLM)。使用VanRaden方法(K)或EMMA方法(K*)计算亲缘关系矩阵，以确定个体之间的关联性(Kang等人，2008；Loiselle等人，1995)。测试了掺入亲缘关系矩阵(K或K*)以及P或Q的压缩混合线性模型(CMLM)。使用负log(1/n)来建立显著性阈值。
[0679] QTL作图
[0680] 使用GBS获得源自Majesta x Hikmok sorip杂交的141个RIL的基因型数据并将该数据用于QTL作图。使用QTL IciMapping软件(版本3.3，2013年7月发布，
www.isbreeding.net)进行QTL作图。
www.isbreeding.net)进行QTL作图。
[0681] 嫁接实验
[0682] 在四个栽培品种Jack、Majesta、Williams 82和Hikmok sorip之间进行嫁接。为了促进分枝，在V1阶段采集嫩枝分生组织。在两个出现的分枝中，一个分枝嫁接地非常接近分枝点。从两个分枝取叶子样品以比较Si积累。将相同基因型的植物彼此接枝并用作对照。
[0683] 结果
[0684] 大豆种质中硅(Si)摄取的评估
[0685] 在温室条件下评估栽培的大豆种质组以测量Si摄取能力。数值范围在0.65％与1.53％之间，平均值约为1.0％，并且标准差为0.15(图1)。频率分布表明这种性状的变异性有限。
[0686] Majesta X Himok sorip RIL中硅(Si)摄取的评估
[0687] 根据我们自己的观察结果，由于Hikmok sorip似乎是具有吸收Si的特殊能力的品系，所以它与显示出平均Si积累的栽培品系Majesta杂交，以产生141个RIL，以试图对可以支配Si积累的遗传座位作图。叶组织的X射线显微术证实了与Majesta相比Hikmok sorip中更高的Si积累(图3)。
[0688] 源自Majesta和Hikmok sorip之间的杂交的所有141个RIL的叶组织中的Si积累显示出在最低值和最高值之间近2.0％的范围。平均值为1.69％，标准差为0.45。不同于加拿大种质品系的数据，频率分布显示出双峰分布模式，这表明特定基因参与了Si摄取调节(图
2)。
2)。
[0689] 针对大豆中Si积累的全基因组关联研究(GWAS)
[0690] 最初使用一组139个栽培品系进行GWAS。基于此分析，这些标记均没有显示与大豆叶中的Si积累显著相关(图4)。随后，将95个PI(植物引入)品系与加拿大品系组合起来，再进行一次GWAS。再一次，尽管PI品系中表型范围看起来更广，但这些标记均没有显示与Si积累显著相关。
[0691] 针对Hikmok sorip中的Si积累对数量性状座位(QTL)进行鉴定
[0692] 使用768种SNP标记的连锁图谱用于使用来自Majesta X Hikmok sorip的141个RIL的Si积累的QTL作图。在16号染色体上观察到LOD得分为39.33的单个大效应QTL(以后命名为Hisil座位)(图5)。此单独的QTL解释了超过66％的表型变异(表11)。发现此Hisil座位位于16号染色体的遗传图谱上约95cM处(图6和7)。使用如通过ICIMapping进行的
EPIstatic QTL作图，未检测到显著的上位相互作用(图8)。
EPIstatic QTL作图，未检测到显著的上位相互作用(图8)。
[0693] 表11.使用不同的软件工具鉴定大豆叶中硅积累的数量性状座位(QTL)的细节
[0694]
[0695] ICIM-完备区间作图法；IM-区间作图法；Chr.–染色体；PVE-解释的表型方差；Add.effect–加性效应。
[0696] 嫁接实验
[0697] 为了进一步表征Si摄取性状，将不同的栽培品种嫁接到Hikmok sorip砧木上并且将Hikmok sorip嫁接到不同的栽培品种砧木上，并评估Si吸收。结果显示，给定的嫁接物中的Si积累是由砧木而不是植物的地上部分决定的。此外，用Hikmok sorip作为砧木的嫁接物吸收了与Hikmok sorip一样多的Si，从而证实了Hikmok sorip吸收更高量的Si的独特性状(表12)。
[0698] 表12.在嫁接于Hikmok sorip砧木上的不同大豆栽培品种和嫁接于不同大豆栽培品种砧木上的Hikmok sorip的叶中观察到的硅(Si)摄取
[0699]
[0700] 讨论
[0701] 在这项工作中，我们在称为Hikmok sorip的特定大豆栽培品种中发现了赋予积累更高量的硅(Si)的能力的特定基因组区域，此后命名为Hisil。已知当Si在生长基质中足够可用或被改良时能够为植物提供许多益处，主要在预防生物和非生物胁迫方面。
[0702] 硅对抗胁迫的保护作用将极大地受处理下植物物种吸收该元素的能力的影响。由于这个原因，一些植物物种不会对硅处理作出响应，并且结果常常被解释为由Si赋予保护导致的失败而不是生物限制。一般来说，所有的单子叶植物都是Si积累者。对于双子叶植物来说，由于大多数双子叶植物不能积累Si，所以总体情况并不清楚。例如，模式植物拟南芥只会积累有限的量。双子叶植物中值得注意的例外是葫芦科，众所周知，葫芦科可以从Si供料中获益。其他例外包括豆科植物中的一些物种，如木豆和大豆(Hodson等人，2005)。
[0703] 在种内水平上，已经报道或观察到Si吸收能力上的有限变异。为此目的，已经研究了单子叶植物并且更具体地水稻，并且测试的栽培品种之间的变异从未超过30％。因此，观察到Hikmok sorip和其他测试的大豆栽培品种之间的变异高达200％(Arsenault-Labrecque等人，2012；Guérin等人，2014)是相当意外的。
[0704] 为了确定大豆种质中常见的高硅摄取情况，我们测试了139个栽培的大豆品种。我们的结果显示，在测试的种质中几乎没有变异，大部分品系平均值为大约1％Si。预料之中地，考虑到有限的变异，GWAS分析未能鉴定出相关的SNP标记。这些观察结果表明，大豆种质在Si吸收的变异方面受到限制，Si吸收这一特性似乎被植物界大多数(如果不是全部的话)所共有。
[0705] 在我们的基于Majesta X Hikmok sorip的RIL的集合中，与最初的一组139个栽培的品系相比，我们观察到了Si积累的广得多的变异。事实上，出现了两个不同的峰值，这表明极少数座位控制了此性状。这一点被我们的QTL分析所证实，所述QTL分析揭示几乎所有的表型变异都可以通过16号染色体上的单个座位来解释。我们的结果进一步表明此性状没有上位相互作用。
[0706] 从育种角度来看，此发现带来了一个新的独特的机会，来产生具有改进的Si摄取并且从而对生物和非生物胁迫有更大的抗性的大豆品系。考虑到与Si相关的益处已经广泛可及，携带此性状的大豆品系可以显示对影响大豆生产的众多制约因素的多重持久抗性。
[0707] 实例2-标记开发
[0708] 标记开发的材料与方法
[0709] 使用与Williams 82比对的Hikmok sorip的全基因组重新测序数据来预测Hisil-Del，约286bp的大的缺失。使用Primer3软件工具(bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计靶向Hisil-Del的侧翼引物。类似地，使用Primer3软件工具设计其他缺失和插入的引物。使用来自Hikmok sorip、Williams的DNA进行这些引物的PCR扩增，并且从Hikmok sorip和
Magesta之间的杂交开发重组近交品系(RIL)。通过琼脂糖凝胶电泳分辨PCR扩增子。
Magesta之间的杂交开发重组近交品系(RIL)。通过琼脂糖凝胶电泳分辨PCR扩增子。
[0710] 结果
[0711] 针对分离群体中的HiSil基因的判别检测，开发了HiSil区域中的一组五个标记。基于当与Williams 82参考基因组相比在栽培品种Hikmok sorip中存在的大的缺失(约
286bp，Gm16:33,712,274至33,712,559)来设计标记HiSil-Del(G.max V1.1，图9)。HiSil-Del与HiSil紧密连锁，因为分开的距离只有28Kb。因为PCR扩增子的大的尺寸差异，所以甚至使用琼脂糖凝胶电泳，使用标记HiSil-Del来筛选HiSil的存在(图10)。
286bp，Gm16:33,712,274至33,712,559)来设计标记HiSil-Del(G.max V1.1，图9)。HiSil-Del与HiSil紧密连锁，因为分开的距离只有28Kb。因为PCR扩增子的大的尺寸差异，所以甚至使用琼脂糖凝胶电泳，使用标记HiSil-Del来筛选HiSil的存在(图10)。
[0712] 另外，与Williams 82参考基因组相比，在Hikmok sorip中开发了四种基因特异性标记，包括三个缺失和一个插入(表13)。这些标记有助于跟踪分离子代中的HiSil基因，并可用于在任何新的种质来源中鉴定该基因。
[0713] 表13.与HiSil基因连锁的标记的细节
[0714]
[0715] 我们还设计了与该HiSil基因连锁的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记。便利地，MboII限制性内切酶在Hikmok sorip品种的Hisil中将PCR产物切割成两个片段，并且在
Williams品种的野生型基因中将PCR产物切割成三个片段(表14，图11)。
Williams品种的野生型基因中将PCR产物切割成三个片段(表14，图11)。
[0716] 表14.与HiSil基因连锁的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记的细节
[0717]
[0718] 实例3–用Majesta X Hikmok sorip的高密度遗传图谱确认QTL
[0719] 基于在SNP605和SNP610的侧翼标记间的连锁群J中鉴定的QTL，用94种新的SNP标记进一步充满该靶向区域。通过使用具有Kosambi映射函数的回归映射，通过JoinMap(版本
3.0)完成遗传作图。针对连锁群J构建了132cM的高密度遗传图谱。
3.0)完成遗传作图。针对连锁群J构建了132cM的高密度遗传图谱。
[0720] 对连锁群J的所有155个标记数据(61种较早作图的标记和94种新确定基因型的标记)进行分析，以发现与叶Si含量表型的相关性的显著性。
[0721] 在内部工作流程中进行了QTL作图，其中整合了区间作图、多重区间作图和复合区间作图算法。使用13.8145(LOD＝2.0)的LR校验统计学显著性阈值来说明QTL。
[0722] 使用高密度遗传图谱的QTL作图也在低密度图谱中所检测的连锁群J中同一区间中检测到单一主要QTL。
[0723] 新HiSil区间
[0724] 标记分析表明，在Hikmok X Majesta群体中，跨越从约SNP595(31.13Mb)到SNP615(36.55Mb)(图12和13)的染色体区间与该HiSil性状高度关联。
[0725] 在此染色体区间内总共鉴定出155种标记，其P值小于或等于0.05，这表明在此区间内的标记可用于产生和/或选择具有该HiSil性状的品系。
[0726] 实例4-在Hamilton x PI 89772的可替代的作图群体中进行QTL作图
[0727] 由于PI 89772在该HiSil基因区域中具有相同的Hikmok的单倍型，因此使用替代物Hamilton x PI 89772的F2:3作图群体来确认在Majesta x Hikmok中鉴定的HiSil QTL。
[0728] 方法
[0729] Hamilton x PI 89772作图群体的表型分析
[0730] 源自杂交Hamilton x PI 89772的作图群体被用于QTL作图。在拉瓦尔大学(University Laval)的温室中评估了总共100个F3(F2:3)品系的Si摄取。使大豆植物(每种品系五株)在控制条件下在温室中生长。使植物在盆栽土中生长，该盆栽土具有充足供应的从硅酸钾(Kasil#6，23.6％SiO2，国家硅酸盐公司)制备的Si(1.7mM)。收集每株植物的第一个三叶形叶子(5×100)，进行干燥并粉碎成细粉。根据Reidinger等人(2012)所述的方法，通过使用Niton XL3t Ultra Analyzer XRF来估计叶Si含量。
[0731] 用Hamilton x PI89772作图群体进行基因分型、图谱构建和QTL作图
[0732] 通过2990种全基因组标记对作图群体Hamilton x PI 89772F2:3的子代进行基因分型。除去单态标记后，使用1149种标记用于遗传作图。通过使用具有Kosambi映射函数的回归映射，通过JoinMap(版本3.0)完成遗传作图。构建178cM的高密度遗传图谱。遗传和物理作图间的标记顺序高度保守。
[0733] 在内部工作流程中进行了QTL作图，其中整合了区间作图、多重区间作图和复合区间作图算法。用13.8145(LOD＝2.0)的LR校验统计学显著性阈值鉴定QTL。
[0734] 结果
[0735] Hamilton x PI 89772作图群体中叶硅含量的分离
[0736] 在Si补充下生长三周的F3品系显示平均值为1.30％Si，最大值为2.03％并且最小值为0.71％Si。观察到典型的1:2:1分离，表明Si吸收的单一座位调节(图14)。
[0737] 针对叶硅含量的遗传图谱和QTL
[0738] 根据两个作图群体的高密度遗传连锁图谱和单个标记与叶Si含量表型的相关性，针对HiSil基因区域所定义的区间位于标记SY0089B到IGGY260之间。Majesta X Hikmok sorip的遗传图谱中的此区间在92.6cM到132cM之间，并且对应于在16号染色体中31.15Mb到36.72Mb(5.57Mb片段)的物理图谱位置(图13、15、16和17)。在这两个作图群体中的此区间内的标记具有非常显著的针对硅摄取的p值。
[0739] 在此区间内开发了135种标记，其中一些描述于下表15中。表16-20中给出了更多的标记和有利的HiSil等位基因调用、靶向序列、引物序列和SNP。
[0740] 表15.针对每个群体的标记p值
[0741]
[0742] 表16.针对Majesta X Hikmok sorip的标记
[0743]
[0744]
[0745]
[0746]
[0747]
[0748]
[0749]
[0750]
[0751]
[0752]
[0753] 表17.针对Hamilton X PI89772的标记
[0754]
[0755]
[0756]
[0757]
[0758]
[0759]
[0760]
[0761]
[0762] 表18：有利的等位基因
[0763]
[0764]
[0765]
[0766]
[0767]
[0768] 表19.针对标记的引物和探针
[0769]
[0770]
[0771]
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[0790]
[0791] 表20.SNP靶序列
[0792]
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[0893]
[0894]
[0895]
[0896] 实例5-等位基因挖掘
[0897] 我们在属于不同成熟组的428个不同的大豆登录中进行了等位基因挖掘。结果，基于Glyma16g30000和Glyma16g30020的编码序列中的等位基因变异鉴定了9个单倍型组(表21)。大多数分析的基因型(94.6％)携带与Williams 82(H5)类似的单倍型。发现五个登录携带与Hikmok sorip类似的单倍型(H1)。发现来自携带单倍型H1的整组登录的植物积累了高水平的Si(图18)，从而证实了单倍型H1与大豆中高Si摄取能力的相关性。
[0898] 表21.基于在属于不同成熟组的428个大豆登录中评估的Glyma16g30000和Glyma16g30020基因的编码序列中鉴定的非同义SNP的单倍型组的细节
[0899]
[0900] 粗体–Hikmok sorip类型等位基因，斜体–非同义SNP
[0901] 与Hikmok sorip和来自单倍型H1的其他PI品系的平均值相比，对属于H2至H9单倍型的品系的评估显示低水平的Si积累(图18)。
[0902] 实例6-HiSil基因的序列和三维结构
[0903] 通过水通道蛋白GmNIP2-1和GmNIP2-2在根部流入，并随后通过HiSil流出向地上部分，促进大豆中Si的摄取。没有观察到针对GmNIP2-1和GmNIP2-2基因的遗传变异。我们已经表明，Hikmok sorip和另外五个携带单倍型H1的登录中的高Si摄取与HiSil座位处的遗传变异直接且唯一相关。HiSil基因(SEQ ID NO.14或16)编码具有由数个跨膜结构域组成的特异性蛋白结构的跨膜蛋白(图19)。
[0904] 实例7-与其他单子叶植物和双子叶植物的序列同源性
[0905] HiSil蛋白质序列(SEQ ID NO.15或17)与水稻(水稻是单子叶植物)中鉴定的低Si转运体2(Lsi2，流出Si转运体)具有57％的同源性(图20)。当在双子叶植物(如大豆)中观察HiSil同系物时，我们看到约70％的同源性。因此，本发明涵盖包含如下HiSil蛋白质序列的植物，所述HiSil蛋白质序列在单子叶植物中具有大于60％的同源性并且在双子叶植物中具有大于70％的同源性。
[0906] 实例8-增加的抗性
[0907] 材料与方法
[0908] 程序概述：在用任何有害生物或病原体接种大豆前至少一周(7天)开始用AgSil21浇水。制备100X(10,000ppm)AgSil 21(CA5684A)的储备溶液，并以1升批次储存。在准备施用于植物时，将每种100X储备溶液稀释100倍(每升自备水(onsite water)10mL 100X储备液)，并通过添加一小部分浓酸(3M HCl：CAS#7647-01-0)将pH调节到6.0至7.9之间。将100ppm(1X)溶液施用于两种处理中的每种中的植物，针对每种处理使用专用的喷壶。每次需要灌溉时，施用1X稀释的溶液。对照为自备水，并检查自备水的pH值，以确保其落入与AgSil21浇灌溶液相同的范围内。
[0909] 将该实验设计为具有裂-裂区的因子，其中主区是土壤改良剂(浇水管理)，并且副区是大豆品系，使得大豆品系在每个复制中是随机化的。以每个处理8盆/复制，用无菌无土生长介质(Sun Metro Mix 900)进行种植，并且将5粒种子/12-oz杯种植在周界附近，并且幼苗被3/4”介质覆盖。在每个盆的中间种植一粒易感大豆种子(Corsoy 79)。
[0910] 种子从蛭石中开始，然后在出苗后不久(3-5天)，将种子轻轻连根拔起，并以大约10x 106个繁殖体/ml的速率将每株幼苗的根部浸入悬浮在溶液中的Cadaphora gregata孢子中。在每杯中，留下一株植物不进行接种，用于比较。将植物保持在70°F和14小时的光照下。
[0911] 8A-评估有和没有硅土壤改良剂情况下的大豆(Soybean，Glycine max)重组近交品系(RIL)以确定对褐茎腐病“BSR”(Cadaphora gregata)的抗性
[0912] 本研究的目的是在温室条件下评估20个大豆品系、2个亲本品系、加另外7个对照(有或没有Si土壤改良剂情况下)(表22)，以确定对褐茎腐病(BSR)的抗性。这些大豆品系具有摄取更高水平硅的能力，并且与硅土壤改良剂结合，已经显示出对褐茎腐病的抗性。
[0913] 表22–大豆品系的列表
[0914]
[0915]
[0916] 评估是在接种后大约35天进行，其中通过评估感染组织的百分比，从0至100％，评估每个盆中每种植物的叶和外部茎的病害症状。除了叶面症状之外，每个植物茎也被劈开，并测量和量化由真菌引起的维管组织的褐变(图21)。使用手术刀来劈开每个茎，并且记录每个茎的全高度(mm)以及由于真菌而变成褐色的维管组织的长度。
[0917] 在每次试验期间，对叶子取样一次。在试验结束时，取第一个完全的三叶形叶子样品。从每个植物的第一个完全的三叶形收获完整的三叶形叶子。将叶样品放入授粉袋并进行标记。将来自同一盆中的植物的叶子放置在相同的授粉袋中。将样品风干直至完全干燥，易碎。
[0918] 如果在植物外观或生长上有任何明显的差异，则针对每个条目/浇水管理进行拍照。还对以下项拍摄了照片：一般症状、检测布局和使用的方法(图22)。
[0919] BSR温室实验的统计学分析
[0920] 实验的设计是这样的：所有的对照复制都集中在温室的左侧，并且所有经处理的复制都集中在温室的右侧。因此，整个温室内的对照和经处理的复制不是随机的。该实验的设计不允许联合分析来自处理组和对照组的数据。因此，对属于每个组的数据进行单独分析。该分析也丢弃了来自名为“Corsoy 79NonInoc A”和“Corsoy 79NonInoc B”的数据，因为它们没有得到与所有其他品系相同的接种处理。
[0921] 探索性分析
[0922] 每个组内性状％BSR的直方图显示高度向左倾斜且具有大量零的分布。在对照组的直方图(图23A)中有48个％BSR等于零的观察值，并且在处理组的直方图(图23B)中有26个％BSR等于零的观察值。对照组中％BSR的平均值和标准差分别为20.15％和21.28％。处理组中的％BSR的平均值和标准差分别为28.54％和25.88％，并且两个直方图中的观察值总数为240。对于对照组，具有低Si积累(“低”)的所有品系中的％BSR的平均值为22.33％，并且具有高Si积累(“高”)的所有品系中的％BSR的平均值为14.95％。对于处理组，具有“低”的所有品系的％BSR的平均值为32.90％，并且具有“高”的所有品系的％BSR的平均值为22.94％。
[0923] 模型拟合
[0924] 我们使用广义线性模型进行我们的参数分析，因为性状％BSR的数据不是正态分布的(如图23的直方图所示)。因此，我们假设每个组的％BSR具有倒数典型连接函数的指数分布。我们在每个组中拟合了以下模型：
[0925] ％BSR＝平均值+植物高度+MATID+REP+误差
[0926] 我们在该模型中包括了植物高度作为协变量，以便将％BSR和植物高度之间可能的线性关系分解出来。
[0927] 随后对于模型拟合，我们使用对比来检验该假设：
[0928] Ho：MATID低的平均值＝MATID高的平均值
[0929] Ha：MATID低的平均值≠MATID高的平均值
[0930] 结果：对照(水)组
[0931] 对属于对照组的数据分析显示MATID的高度显著效应(p值<0.0001)和REP效应的10％显著性水平(p值＝0.1007)。对于具有“低”和“高”Si的品系之间的％BSR上的差异的测试显示出估计为42.97％(低-高)的显著性差异，p值＝0.03，即我们否定了在3％显著性水平下具有“低”的品系的％BSR与具有“高”的品系的％BSR之间没有差异的零假设。
[0932] 结果：处理(Si)组
[0933] 对属于处理组的数据的分析显示对于MATID和REP两者都具有非常显著的效应(两个p值<0.0001)。对于具有“低”和“高”Si积累的品系之间的％BSR上的差异的测试显示出估计为63.21％(“低”-“高”)的显著性差异，p值＝0.02，即我们否定了在2％显著性水平下具有“低”的品系的％BSR与具有“高”的品系的％BSR之间没有差异的零假设。
[0934] 结论
[0935] 根据图24，具有“高”Si积累的品系比具有“低”Si积累的品系显示出显著更少的BSR损伤，即对照组中具有“低”的品系比具有“高”的品系显示出大约多43％的损伤，并且处理组中具有“低”的品系比具有“高”的品系显示出大约多63％的损伤。
[0936] 有证据表明，处理组比对照组具有更大的压力，即处理组的总％BSR平均值为29％左右，而对照组的总％BSR平均值为20％左右。另外，处理组(26)的零％BSR损伤的品系数低于对照组(48)。这可以解释处理组中“低”和“高”之间的％BSR比对照组有较大的差异。
[0937] 8B-评估有和没有硅土壤改良剂情况下的大豆(Soybean，Glycine max)重组近交品系(RIL)以确定对大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode(“SCN”)，Heterodera
glycines-种3)的抗性
glycines-种3)的抗性
[0938] 本研究的目的是在温室条件下评估20个大豆品系(有或没有Si土壤改良剂情况下)(表22)，以确定对大豆胞囊线虫“SCN”的抗性。
[0939] 材料与方法
[0940] 程序概述：在用任何有害生物或病原体接种大豆前至少一周(7天)开始用AgSil21浇水。制备100X(10,000ppm)AgSil 21(CA5684A)的储备溶液，并以1升批次储存。在准备施用于植物时，将每种100X储备溶液稀释100倍(每升自备水10mL 100X储备液)，并通过添加一小部分浓酸(3M HCl：CAS#7647-01-0)将pH调节到6.0至7.9之间。将100ppm(1X)溶液施用于两种处理中的每种中的植物，针对每种处理使用专用的喷壶。每次需要灌溉时，施用1X稀释的溶液。对照为自备水，并检查自备水的pH值，以确保其落入与AgSil21浇灌溶液相同的范围内。
[0941] 将该实验设计为具有裂-裂区的因子，其中主区是土壤改良剂(浇水管理)，并且副区是大豆品系，使得大豆品系在每个复制中是随机化的。每个处理以8盆/复制进行种植。每盆种植2粒种子，或者使种子预发芽，并且发芽后立即移植幼苗。在所有处理的种子发芽后(种植后约5天)，以每盆一株幼苗进行疏苗。约种植后7天，将SCN接种到每个处理中，以每盆大约2000个卵的比率。
[0942] 在将SCN接种到植物上大约一个月后，取下试验植物进行评估，并通过在筛网上洗涤从根部移除的胞囊以收集胞囊。通过在显微镜下计数目测评估胞囊的数量。
[0943] 在每次试验期间，对叶子取样一次。在试验快结束前收获叶样品。此时，从第一个完全的三叶形中取样完整的三叶形。
[0944] 如果在植物外观或生长上有任何明显的差异，则针对每个条目/浇水管理进行拍照。还对以下项拍摄了照片：一般症状、检测布局和使用的方法(图25)。
[0945] SCN温室实验的统计学分析
[0946] 实验的设计是这样的：所有对照重复集中在温室的一个工作台上，并且所有经处理的重复集中在不同的工作台上。因此，对照重复和经处理的重复在用于该实验的2个工作台上不是随机化的，并且该实验的设计不允许联合分析来自处理组和对照组的数据。因此，对属于每个组的数据进行单独分析。
[0947] 探索性分析
[0948] 各组内SCN胞囊计数的直方图(对照和Si处理的；图26)显示左倾斜分布。在对照组的直方图中有17个胞囊计数等于零的观察值，并且在处理组的直方图中有16个胞囊计数等于零的观察值。针对218个观察值，对照组的胞囊计数的平均值和标准差分别为135.3和95.4(图26A)。针对221个观察值，处理组的胞囊计数的平均值和标准差分别为119.0和93(图26B)。对于对照组，具有“低”的所有品系中的胞囊计数的平均值为166.8(sd＝83.8)，并且具有“高”的所有品系中的胞囊计数的平均值为142.2(sd＝83.2)。对于处理组，具有“低”的所有品系中的胞囊计数的平均值为158.6(sd＝87.6)，并且具有“高”的所有品系中的胞囊计数的平均值为124.2(sd＝80)(现在所示)。
[0949] 模型拟合
[0950] 我们使用广义线性模型进行我们的参数分析，因为性状胞囊计数的数据是离散变量(如图26的直方图所示)，广义线性模型可以满足方差过度离散的泊松分布的要求。因此，我们假设每组中胞囊计数的模型拟合具有log连接函数和过度离散的泊松分布。我们在每个组中拟合了以下模型：
[0951] 胞囊计数＝平均值+MATID+板(Plate)+误差
[0952] 我们认为板是一个不完全的区组因素。随后对于模型拟合，我们使用对比来检验该假设：
[0953] Ho：MATID低的平均值＝MATID高的平均值
[0954] Ha：MATID低的平均值≠MATID高的平均值
[0955] 结果：对照(水)组
[0956] 对属于对照组的数据分析显示MATID的高度显著效应(p值<0.0001)和板效应(p值＝0.0065)。对于具有“低”和“高”的品系之间的胞囊计数上的差异的测试显示出显著性差异(低-高)，p值＝0.05，即我们否定了在5％显著性水平下具有“低”的品系中观察到的胞囊计数与具有“高”的品系中观察到的胞囊计数之间没有差异的零假设。然而，如果在我们的对比中不包括亲本品系，即低Si积累者组中的“低”(Majesta)和高Si积累者组中的“高”(Hikmok)，那么在具有低和高的品系中观察到的胞囊计数上的差异不再具有统计学显著
性。
性。
[0957] 结果：处理(Si)组
[0958] 对属于处理组的数据的分析显示对于MATID和板效应两者都具有非常显著的效应(两个p值<0.0001)。对于具有“低”和“高”的品系之间的胞囊计数上的差异的测试显示出显著性差异(低-高)，p值＝0.05，即我们否定了在1％显著性水平下具有“低”的品系中观察到的胞囊计数与具有“高”的品系中观察到的胞囊计数之间没有差异的零假设。当在我们的对比中不包括亲本品系时，“低”和“高”之间胞囊计数上的差异仍然具有统计学显著性(p值＝
0.02)。
0.02)。
[0959] 结论
[0960] 具有“高”的品系显示出比具有“低”的品系显著更少的胞囊计数。Si处理组显示出比对照组更强的(更一致的)结果，因为具有“高”的品系显示出比具有“低”的品系一致地更少的胞囊计数，与在对比分析中包括亲本品系无关。
[0961] 8C-评估有和没有硅土壤改良剂情况下的大豆(Soybean，Glycine max)重组近交品系(RIL)以确定对根结线虫(Root-knot nematode(“RKN”)，Meloidogyne incognita)的抗性
[0962] 本研究的目的是在温室条件下评估20个大豆品系(有或没有Si土壤改良剂情况下)(参见表22)，以确定对根结线虫“RKN”的抗性。
[0963] 材料与方法
[0964] 程序概述：在用任何有害生物或病原体接种大豆前至少一周(7天)开始用AgSil21浇水。制备100X(10,000ppm)AgSil 21(CA5684A)的储备溶液，并以1升批次储存。在准备施用于植物时，将每种100X储备溶液稀释100倍(每升自备水10mL 100X储备液)，并通过添加一小部分浓酸(3M HCl：CAS#7647-01-0)将pH调节到6.0至7.9之间。将100ppm(1X)溶液施用于两种处理中的每种中的植物，针对每种处理使用专用的喷壶。每次需要灌溉时，施用1X稀释的溶液。对照为自备水，并检查自备水的pH值，以确保其落入与AgSil21浇灌溶液相同的范围内。
[0965] 将该实验设计为具有裂-裂区的因子，其中主区是土壤改良剂(浇水管理)，并且副区是大豆品系。用无菌盆栽介质进行种植，每个处理4盆/复制并且每盆2粒种子。可替代地，使种子预发芽，并且发芽后立即移植幼苗。在所有处理的种子发芽后(种植后大约5天)，将植物疏苗成每盆一株幼苗。将RKN接种到每个处理中，以每盆大约2500到3000个卵的比率。这在种植后大约7天完成。
[0966] 当将试验植物取下时，在接种RKN后约45天进行评估。使用评级系统评估根部，以查看形成虫瘿的根的百分比(而不是虫瘿的数量)。
[0967] 如果在植物外观或生长上有任何明显的差异，则针对每个条目/浇水管理进行拍照。还对以下项拍摄了照片：一般症状、检测布局和使用的方法(图27)。
[0968] RKN温室实验的统计学分析
[0969] 在RKN实验中没有真正的复制，因为在所有重复中都重复了复制内品系的相同安排。因此，我们不能通过假设测试进行统计推断(给出p值等)。因此，我们进行了探索性分析，其中获得了该数据的统计摘要、箱形图并显示了该数据的趋势。
[0970] 探索性分析
[0971] RKN损伤率的直方图(图28)在处理组和未处理组中均显示了具有长右尾的分布。未处理组显示出比处理组(3.2/2)(图28A)稍大的平均值/中值(3.43/4)(图28B)。图29显示了没有检查情况下的RKN损伤的直方图。我们可以在图29中观察到，图28中观察到的长尾最有可能是由于检查的评级。没有来自检查的数据，未处理组仍然显示出比处理组(2.42/2)(图29A)稍大的平均值/中值(2.63/3)(图29B)。重要的是要注意所有检查都放置在每个复制边界处的相邻圆锥体中。我们获得了针对每个品系的4个重复的比率平均值(参见带有统计学摘要的excel文件)。图30和图31的条形图显示了根据“高”和“低”亚组排列的比率平均值(4个重复的)对MATID。
[0972] 图32的箱形图显示了亚组“高”和“低”的比率平均值之间的可能差异，即亚组低的总平均值(处理组为2.71，并且未处理组为2.94)大于亚组高的总平均值(处理组为2.24，并且未处理组为2.39)。
[0973] 8D-携带HiSil的RIL对大豆疫霉菌具有更佳的抗性
[0974] 测试携带(或不携带)来自Hikmok sorip的HiSil等位基因的RIL在水培条件下对大豆疫霉菌的抗性。一组四个RIL(每个具有和不具有HiSil)与亲本品系Hikmok sorip和
Majesta一起在温室中生长。
Majesta一起在温室中生长。
[0975] 为了评估Si对疫霉根腐病(PRR)的影响，进行了两个独立的实验。用大豆疫霉菌种-25进行的第一个实验显示，Si处理将经大豆疫霉菌感染的大豆植物的存活率提高了超过两倍(图33a)。与LoSil RIL相比，HiSil RIL中的存活率增加更高(图33b)。类似地，Si处理的植物中的植物干重和高度更高(图33c，33d)。这些实验强调了硅对PRR的预防作用，并支持如下假说：在携带HiSil等位基因的植物中，这些有益效果更为突出。
[0976] 使用大豆疫霉菌种的混合物进行第二个实验。为此目的，使用五个毒性最强的种(包括4、7、13、17和25)来接种HiSil和LoSil RIL。即使在这种高病害压力下，在Si处理后仍观察到显著更高的存活率以及根和嫩枝干重(图34a)。对于所有测量的变量，HiSil中的增加显著高于LoSil植物(图34b，34c，34d)。总之，Si提供了针对PRR(覆盖广泛的大豆疫霉菌种)的水平抗性，并且这种抗性在HiSil植物中更多显现。
[0977] 8E-携带HiSil的RIL具有更佳的耐旱性
[0978] 测试携带来自Hikmok sorip的HiSil等位基因的RIL在施Si肥下的耐旱性。一组四个RIL(每个具有和不具有HiSil等位基因)与亲本品系Hikmok sorip和Majesta一起在温室中生长。记录在水培条件下生长三周并且然后通过切断水供应而经受水胁迫的大豆植物的叶萎蔫评分。使用的萎蔫量表为：1为不萎蔫，2为非常轻微萎蔫，3为萎蔫，4为高度萎蔫，5为垂死，和6为死亡。由于施Si肥，观察到显著较低水平的萎蔫。携带HiSil等位基因的RIL中的这种差异比不携带HiSil等位基因的RIL中更显著(图35)。
[0979] 方法
[0980] 进行嫁接实验以创造如下情况：来自两种不同砧木的植物的地上部分具有完全相同的遗传背景但具有差别的Si摄取能力。对于通常是评估基因的等位基因效应所需的等基因系来说，这提供了一个明智的替代方案。在Oasis立方中生长的一周龄幼苗上进行大豆植物的嫁接。使用劈接法来产生嫁接物。在子叶下方以直角切割嫩枝。然后以1英寸深在中心将砧木劈开。如图36所示，从两侧砍下接穗以形成尖端。然后将接穗插入砧木裂口，并用石蜡胶带包裹联合体。
[0981] 在移植到水培系统中之前，将嫁接的植物在塑料圆顶下在高湿度下保持3天。共有20株植物被移植到每个塑料大棚中。向植物供应用或不用Si(1.7mM)进行改良的营养液。移植后三周，通过从大棚中撤走水来施加水胁迫。用萎蔫量表对叶萎蔫症状进行评分，其中：-
0-无萎蔫；1-非常轻微萎焉；2-轻微萎焉；3-萎焉；4-高度萎蔫；5-垂死，和6-死亡。
0-无萎蔫；1-非常轻微萎焉；2-轻微萎焉；3-萎焉；4-高度萎蔫；5-垂死，和6-死亡。
[0982] 结果
[0983] 在没有Si改良剂的情况下，Hikmok植物是最易感于水胁迫的。但是，在存在Si的情况下，萎蔫症状急剧减少。在Hikmok根部嫁接的Majesta接穗中观察到相同的现象。相比之下，Majesta植物没有从Si改良剂中受益。最后，在Majesta砧木上嫁接的Hikmok接穗中观察到干旱胁迫的减少(图37)。
[0984] 实例9-评估Glyma16g30000和Glyma16g30020在转基因拟南芥中的作用
[0985] 方法
[0986] 植物材料与生长条件
[0987] 本项工作中使用了四种不同的拟南芥基因型[Colombia(Col-0；俄亥俄州立大学(Ohio State University))，TaLsi1品系(Montpetit等人，2012)，TaLsi1Hisila和
TaLsi1Hisilb品系]。对于所有实验，将种子表面灭菌(5％漂白剂，2分钟)，用水漂洗五次并在4℃下储存3天以打破休眠。在长日照条件下(22℃下14h的光照，19℃下10h的黑暗，55％-
65％湿度和150μmol/m2/s的光照强度)，将Col-0种子直接播种在生长室中的
Container Mix(Fafard etfrères)上，并用塑料板材覆盖一个星期。在具有含有用于
TaLsi1品系的潮霉素(15mg/L)和用于TaLsi1HiSil品系的卡那霉素(50μg/ml)的Gamborg维生素(MS)(西格玛-奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH))的Murashige和Skoog Basal Medium上选择TaLsi1品系和T2TaLsi1HiSil品系。在第10天，将均匀尺寸的幼苗转移到含有
Container Mix的盆中，密度为每盆五株植物。将植物用含有1.7mM Si(以K2SiO3
形式)的水处理。只有对照(Col-0和TaLsi1品系)接受了不含可溶性Si的处理，其中氯化钾用于补充钾。将植物保持在如上所述的生长室中。移植后一个月，将不同基因型的拟南芥植物用于实验。
TaLsi1Hisilb品系]。对于所有实验，将种子表面灭菌(5％漂白剂，2分钟)，用水漂洗五次并在4℃下储存3天以打破休眠。在长日照条件下(22℃下14h的光照，19℃下10h的黑暗，55％-
65％湿度和150μmol/m2/s的光照强度)，将Col-0种子直接播种在生长室中的
Container Mix(Fafard etfrères)上，并用塑料板材覆盖一个星期。在具有含有用于
TaLsi1品系的潮霉素(15mg/L)和用于TaLsi1HiSil品系的卡那霉素(50μg/ml)的Gamborg维生素(MS)(西格玛-奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH))的Murashige和Skoog Basal Medium上选择TaLsi1品系和T2TaLsi1HiSil品系。在第10天，将均匀尺寸的幼苗转移到含有
Container Mix的盆中，密度为每盆五株植物。将植物用含有1.7mM Si(以K2SiO3
形式)的水处理。只有对照(Col-0和TaLsi1品系)接受了不含可溶性Si的处理，其中氯化钾用于补充钾。将植物保持在如上所述的生长室中。移植后一个月，将不同基因型的拟南芥植物用于实验。
[0988] 启动子区的分离，启动子的构建：GUS报告基因和植物转化
[0989] 从BAC克隆扩增NIP5；1基因(AT4G10380)的起始密码子上游的2.5kb区域。使用高保真聚合酶 新英格兰生物实验室(New England BioLabs))，通过PCR从提取自Col-0拟南芥植物的基因组DNA中扩增CASP2基因(AT3G11550)的起始密码子上游的290bp区域。设计引物以扩增启动子并引入SmaI和HindIII或SbfI限制性位点(参见表1)。容易地使用Takara连接试剂盒(Takara公司)将PCR产物克隆到 T中。然后将启动子克隆
到TOP10大肠杆菌细胞中，并用菌落PCR筛选克隆中插入物的存在。接下来，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从新鲜的细菌培养物回收质粒。最后，用限制性内切酶消化1μg的纯质粒DNA，接着通过DNA测序确认扩增子。
到TOP10大肠杆菌细胞中，并用菌落PCR筛选克隆中插入物的存在。接下来，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从新鲜的细菌培养物回收质粒。最后，用限制性内切酶消化1μg的纯质粒DNA，接着通过DNA测序确认扩增子。
[0990] 将启动子插入质粒pBI121(克隆技术公司(Clontech))(一种含有GUS报道基因的二元载体)中。插入SmaI和HindIII或SbfI位点以取代CaMV 35s启动子，并使用Takara连接试剂盒(Takara公司)评估连接。先在TOP10大肠杆菌细胞中进行克隆用于增殖，然后在根癌土壤杆菌菌株GV3101中进行克隆用于植物转化。
[0991] 通过改良的花浸法(Zhang等人，2006)转化Col-0拟南芥植物。针对卡那霉素抗性(50μg/ml)，在MS培养基(西格玛-奥德里奇公司)上选择独立的转基因品系(T1)，并通过PCR验证调节区的存在(参见表1)。收获T2转基因种子，并在含有卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上播种持续10天，并转移到Magenta盒中进行生长。使用T2转基因植物用于表型分析。
[0992] 组织化学GUS染色
[0993] 在3周龄的转基因拟南芥植物上进行Gus测定。为了β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性的组织化学定位，根据制造商的说明书使用β-葡萄糖醛酸酶报告基因染色试剂盒(西格玛公司(Sigma))。在37℃下在黑暗中孵育过夜并用100％乙醇洗涤组织两次，直到叶绿素色素完全漂白。在双目和光学显微镜下直接观察整株植物。
[0994] 植物表达载体的构建和植物转化
[0995] 从Hikmok sorip和Williams扩增两个HiSil大豆候选基因，Glyma16g30000(Hisila)和Glyma16g30020(Hisilb)基因，并验证序列的正确性。在具有SmaI和SacI位点的pUC57中合成所有四个等位基因(来自两个基因的等位基因Williams和Hikmok)(金斯瑞公
司(GenScript))以确保序列准确性。使用Col-0和TaLsi1品系来表达Hisila和Hisilb。应用常规分子克隆技术来构建植物表达载体。将含有NIP5；1或CASP2启动子的二元载体pBI121用SmaI和SacI消化以除去GUS报道基因。将所有合成的等位基因也用SmaI和SacI消化。使用Takara连接试剂盒(Takara公司)制备含有总共8个不同构建体的两种启动子之一的载体中的四个不同等位基因的连接。将构建体克隆到TOP10大肠杆菌细胞中，并用菌落PCR筛选克隆中插入物的存在。接下来，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司)从新鲜的细菌培养物回收质粒。将纯质粒DNA用限制性内切酶消化，并将小量制备物送去测序进行确认。
使用改良的冻融方法(Jyothishwaran等人，2007)将每个构建体的一个阳性克隆克隆到农杆菌菌株GV3101中，并且在用菌落PCR验证后，每个构建体选择一个克隆用于植物转化。根据改良的花浸法(Zhang等人，2006)转化拟南芥。在含有卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基(西格玛-奥德里奇公司)上选择独立的T1转基因品系，并通过聚合酶链式反应(PCR)验证HiSil转基因的存在(见表1)。从分别携带每个构建体的独立转基因品系收获T2种子，并将其播种在含有卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上。对于所有实验，分析了T2转基因植物的表型。
司(GenScript))以确保序列准确性。使用Col-0和TaLsi1品系来表达Hisila和Hisilb。应用常规分子克隆技术来构建植物表达载体。将含有NIP5；1或CASP2启动子的二元载体pBI121用SmaI和SacI消化以除去GUS报道基因。将所有合成的等位基因也用SmaI和SacI消化。使用Takara连接试剂盒(Takara公司)制备含有总共8个不同构建体的两种启动子之一的载体中的四个不同等位基因的连接。将构建体克隆到TOP10大肠杆菌细胞中，并用菌落PCR筛选克隆中插入物的存在。接下来，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司)从新鲜的细菌培养物回收质粒。将纯质粒DNA用限制性内切酶消化，并将小量制备物送去测序进行确认。
使用改良的冻融方法(Jyothishwaran等人，2007)将每个构建体的一个阳性克隆克隆到农杆菌菌株GV3101中，并且在用菌落PCR验证后，每个构建体选择一个克隆用于植物转化。根据改良的花浸法(Zhang等人，2006)转化拟南芥。在含有卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基(西格玛-奥德里奇公司)上选择独立的T1转基因品系，并通过聚合酶链式反应(PCR)验证HiSil转基因的存在(见表1)。从分别携带每个构建体的独立转基因品系收获T2种子，并将其播种在含有卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上。对于所有实验，分析了T2转基因植物的表型。
[0996] 转基因拟南芥嫩枝中硅浓度的测定
[0997] 在此研究中分析了用Si处理或不用Si处理的转基因品系TaLsi1、TaLsi1HiSil和Col-0植物。在HCL-HF提取后，通过比色分析测量实验植物中的Si含量(Taber等人，2002)。
在开始施用Si改良剂后一个月，对来自每个处理(每个品系5株植物)的植物的地上部分进行收集并冷冻干燥。在Si分析之前将样品研磨成粉末。对于每个处理，使用最少五个生物学复制。
在开始施用Si改良剂后一个月，对来自每个处理(每个品系5株植物)的植物的地上部分进行收集并冷冻干燥。在Si分析之前将样品研磨成粉末。对于每个处理，使用最少五个生物学复制。
[0998] 统计学分析
[0999] 使用JMP 12软件(SAS研究所有限公司(SAS institute Inc.))，用学生t检验(Student’s t-test)和邓奈特检验(Dunnett’s test)评估统计学显著性。使用最小均方表示结果。标准误差被用作图中的误差线。
[1000] 结果
[1001] 转基因拟南芥中HiSil活性的验证
[1002] 用针对候选基因Glyma16g30020和Glyma16g30000的替代等位基因进行拟南芥转化以验证HiSil活性。为了在根组织中实现组成型表达，使用两个启动子NIP5；1和CASP2来构建构建体。具有两种启动子的构建体显示GUS在根组织中的表达(图38a)。制备代表两种启动子的总共8个不同的构建体，以及代表Williams和Hikmok序列的两个等位基因。与
Glyma16g30020的Williams等位基因相比，转基因拟南芥品系的评估显示出针对Hikmok等位基因的显著更高的Si积累(图38b)。
Glyma16g30020的Williams等位基因相比，转基因拟南芥品系的评估显示出针对Hikmok等位基因的显著更高的Si积累(图38b)。
[1003] 表23.本研究中使用的引物的列表
[1004]
[1005] 实例10-在其天然启动子/终止子序列控制下表达HiSil基因(30020)的转基因大豆
[1006] 方法：
[1007] 用由天然启动子(SEQ ID NO.20)和天然终止子区域组成的HiSil等位基因(SEQ ID NO.14)转化Williams82大豆植物。
[1008] 将来自10个独立事件的T1代种子播种在发芽土壤中，并使用 基因表达测定通过接合性测定分离。
[1009] 一旦分离，从V2阶段(不使用NPK肥料)开始用1.77mM的AgSil(约pH 7.5)对纯合的和无效的同胞进行浇水，并且在时间0和在施用硅后10、20和30天时从第一和/或第二三叶形取样单个小叶。然后将叶子冷冻干燥并将其运送用于分析。
[1010] 结果
[1011] 图39显示，平均起来(对所有对照和所有纯合池求平均值)，表达HiSil基因(SEQ ID NO.14)的植物给出的平均叶积累为1.5857个Si单位，而“无效”植物平均为1.364个Si单位。
[1012] 结论
[1013] 相对于无效植物，来自该纯合池的植物显示出平均16.22％的Si积累。
[1014] 实例11-在爪蟾卵母细胞测定中评估的Glyma16g30020的硅流出转运活性
[1015] 方法
[1016] 在爪蟾卵母细胞中针对异源表达的质粒构建
[1017] 用具有针对SpeI和BglII内切核酸酶位点的延伸序列的引物扩增Glyma16g30020的完整编码DNA序列(CDS)。将代表Hikmok soprip和Majesta等位基因的经扩增的CDS序列用SpeI和BglII核酸内切酶消化。然后，将消化的CDS产物克隆到预消化的pT7TS载体中，一种源自pGEM4Z的爪蟾卵母细胞表达载体，包含T7和SP6启动子、爪蟾β-珠蛋白基因的5'和3'非翻译区(UTR)和聚(A)段(Addgene质粒#17091，www.addgene.org)。将所有载体转化到大肠杆菌TOP10菌株中并储存在-80℃。在体外翻译之前通过测序确认构建体的正确性。
[1018] 在爪蟾卵母细胞中使用异源表达的Si转运测定
[1019] 使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司)从新鲜的细菌培养物回收含有Glyma16g:30020CDS的质粒。使用SmaI(罗氏公司(Roche)，http://www.roche.com)将总共5μg的每种质粒线性化。使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司)对消化产物进行柱纯化，并使用
mMessage mMachine T7Ultra试剂盒(Ambion公司，www.invitrogen.com/site/us/en/
home/brands/ambion.html)在体外转录1μg的DNA。使用苯酚/氯仿沉淀来纯化互补RNA
(cRNA)，并悬浮于用0.1％DEPC(西格玛-奥德里奇公司，www.sigmaaldrich.com/)处理的水中。用25nL的8.5nM Si溶液(对照)，或用溶于8.5nM最终Si溶液中的25nl的500ng/μl cRNA注射去卵泡阶段V-VI的卵母细胞。回收针对每个注射处理的第一池十(10)个卵母细胞(＝T0)，在蔗糖-HEPES溶液中漂洗并冷冻直至Si细胞内测量。在18℃，将剩余的卵保持在补充有100μM的青霉素/链霉素的经改良的Barth培养基(MBS)(88mM NaCl、1mM KCI、2.4mM
NaHCO3、0.82mM MgSO4、0.33mM Ca(NO3)2·4H2O、0.41mM CaCl2、15mM Hepes，pH 7.6)中。注射后七十二(72)小时，回收针对每次处理的第二池10个卵母细胞，在蔗糖-HEPES溶液中漂洗并冷冻直至Si细胞内测量。
mMessage mMachine T7Ultra试剂盒(Ambion公司，www.invitrogen.com/site/us/en/
home/brands/ambion.html)在体外转录1μg的DNA。使用苯酚/氯仿沉淀来纯化互补RNA
(cRNA)，并悬浮于用0.1％DEPC(西格玛-奥德里奇公司，www.sigmaaldrich.com/)处理的水中。用25nL的8.5nM Si溶液(对照)，或用溶于8.5nM最终Si溶液中的25nl的500ng/μl cRNA注射去卵泡阶段V-VI的卵母细胞。回收针对每个注射处理的第一池十(10)个卵母细胞(＝T0)，在蔗糖-HEPES溶液中漂洗并冷冻直至Si细胞内测量。在18℃，将剩余的卵保持在补充有100μM的青霉素/链霉素的经改良的Barth培养基(MBS)(88mM NaCl、1mM KCI、2.4mM
NaHCO3、0.82mM MgSO4、0.33mM Ca(NO3)2·4H2O、0.41mM CaCl2、15mM Hepes，pH 7.6)中。注射后七十二(72)小时，回收针对每次处理的第二池10个卵母细胞，在蔗糖-HEPES溶液中漂洗并冷冻直至Si细胞内测量。
[1020] 爪蟾卵母细胞中硅的剂量
[1021] 将浓硝酸(25μl)添加到每池十(10)个卵母细胞中，然后将其在82℃下干燥2小时。添加等离子级水(100μl)，并将样品在室温下孵育1小时。使样品涡旋，然后以13,000g离心5分钟。使用配备有GTA120Zeeman石墨管雾化器的Zeeman原子光谱仪AA240Z(瓦里安公司
(Varian)；www.varian.com)，通过Zeeman原子吸收在10μl上清液中测量细胞内Si浓度。使用1,000ppm六氟硅酸铵溶液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，
www.fishersci.com)获得标准曲线。用SpectrA软件(瓦里安公司)分析数据。
(Varian)；www.varian.com)，通过Zeeman原子吸收在10μl上清液中测量细胞内Si浓度。使用1,000ppm六氟硅酸铵溶液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，
www.fishersci.com)获得标准曲线。用SpectrA软件(瓦里安公司)分析数据。
[1022] 结果
[1023] 对爪蟾卵母细胞中Si转运活性的评估显示针对Glyma16g:30020的流出活性。与Williams等位基因相比，观察到针对Hikmok等位基因的显著更高的Si流出(图40)。
Williams等位基因代表单倍型5(H5；参见图18)，这是在包括Majesta在内的大多数大豆栽培品种中观察到的最频繁的等位基因类型。
Williams等位基因代表单倍型5(H5；参见图18)，这是在包括Majesta在内的大多数大豆栽培品种中观察到的最频繁的等位基因类型。
[1024] 在评估了几个不同的构建体之后，图41显示Glyma16g:30000和Glyma16g:30020这两种基因都是功能性Si流出转运体。有趣的是，对应于Glyma16g30020(也是SEQ ID NO:15)的位置295(异亮氨酸)的位置可能是增强或降低该蛋白质功能性的重要蛋白质结构。例如，如图41所示，与不包含位置295处的所述异亮氨酸的LoSil 30020相反，包含位置295处的异亮氨酸的HiSil 30020Hikmok表现出Si流出的增加。此外，当位置295处的HiSil 30020Hikmok异亮氨酸(I)被苏氨酸(T)取代时，该蛋白质出乎意料地起类似于LoSil 30020蛋白的作用，从而表明位置295可能是对于蛋白质功能来说重要的氨基酸(参见图41中的
“HiSil I295T”)。此外，值得注意的是，当Glyma16g30000的相应位置(即位置298)从T变为I时，流出活性增加，同样增强了流出功能(参见图41)。
“HiSil I295T”)。此外，值得注意的是，当Glyma16g30000的相应位置(即位置298)从T变为I时，流出活性增加，同样增强了流出功能(参见图41)。
[1025] 实例12-优良大豆基因渗入
[1026] 使在其基因组中具有HiSil座位的供体品系与受体品系杂交，该受体品系是例如像选自以下各项的优良大豆品系：AG00802、A0868、AG0902、A1923、AG2403、A2824、A3704、A4324、A5404、AG5903、AG6202、AG0934；AG1435；AG2031；AG2035；AG2433；AG2733；AG2933；
AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司，美国爱荷华州德梅因)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所，美国伊利诺伊州营点)；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司，美国伊利诺伊州迪卡尔布)；DP
4546RR,、和DP 7870RR(三角洲和松树陆地公司，美国德克萨斯州卢博克市)；JG 03R501、JG
32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司，美国印第安纳州格林卡斯尔)；NKS 13-K2(先正达种子公司NK部门，美国明尼苏达洲黄金谷)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、
97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；
P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司，美国爱荷华州庄士敦)；SG4771NRR和
SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司，美国印第安纳州拉斐特)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；
S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；
S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司，美国肯塔基州亨德森市)；Richer(北极星种业有限责任公司，加拿大亚伯达省)；14RD62(斯汀种子公司，美国爱荷华州)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司，美国阿拉斯加州)。
AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司，美国爱荷华州德梅因)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所，美国伊利诺伊州营点)；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司，美国伊利诺伊州迪卡尔布)；DP
4546RR,、和DP 7870RR(三角洲和松树陆地公司，美国德克萨斯州卢博克市)；JG 03R501、JG
32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司，美国印第安纳州格林卡斯尔)；NKS 13-K2(先正达种子公司NK部门，美国明尼苏达洲黄金谷)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、
97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；
P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司，美国爱荷华州庄士敦)；SG4771NRR和
SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司，美国印第安纳州拉斐特)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；
S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；
S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司，美国肯塔基州亨德森市)；Richer(北极星种业有限责任公司，加拿大亚伯达省)；14RD62(斯汀种子公司，美国爱荷华州)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司，美国阿拉斯加州)。
[1027] 然后从步骤1的杂交中收集种子，并使子代长大。然后使用标记辅助育种以鉴定与该性状相关联的标记/QTL(例如像对应于表15-20中所列的标记的标记)来选择具有该HiSil座位的子代。
[1028] 用优良大豆进行一次或多次回交。然后将植物自交并收集种子。然后评估来自这些种子的植物中HiSil座位的存在(即标记辅助育种)。
[1029] 然后从所选择的植物生长并产生优良大豆Hisil植物。
[1030] 实例13-含有来自Hikmok sorip品系的HiSil等位基因的基因组片段的顺基因事件的产生
[1031] 用含有由天然启动子、5'-非翻译编码区(包括内含子)和3'-非翻译区组成的HiSil等位基因(SEQ ID NO:630)的Hikmok sorip基因组片段转化Jack大豆愈伤组织。由于该片段的5’-(CGA)和3’-(TCG)末端都含有一半NruI切割位点(5'-TCGCGA-3')，所以在两个末端都添加3个碱基，使得该片段在引物合成过程中被两个NruI位点侧接以扩增用于克隆的片段。使用高保真DNA聚合酶从Hikmok sorip大豆品系扩增GmHiSil基因组DNA序列并将其克隆到pCR-TOPO载体中。用DNA测序分析具有PCR产物插入物的pCR-TOPO克隆。具有非PCR引入的突变的GmHiSil克隆被命名为pCR-GmHiSil1aNruI(图42)。
[1032] 对于大豆转化，将含有该HiSil基因的整个NruI片段(6275bp)从质粒pCR-GmHiSil1aNruI中释放出来，并使用标准方法，如制备型凝胶电泳接着进行电洗脱来进行纯化。还制备了由选择性标记基因(ALS或PMI)盒组成的单独的DNA片段，用于与该HiSil片段一起共同递送到大豆愈伤组织中。大豆愈伤组织的转化是通过物理递送方法进行的，优选地基因枪轰击[McCabe等人(1988)Transformation of shoot meristems by particle
acceleration.Bio/Technol[通过粒子加速转化嫩枝分生组织，生物技术]6:923-926；
Finer和McMullen(1991)Transformation of soybean via particle bombardment of
embryogenic suspension culture tissue.In Vitro Cell Dev Biol.[通过粒子轰击胚
性悬浮培养组织转化大豆，体外细胞发育生物学]27P:175-182；Santarém和Finer(1999)Transformation of soybean[Glycine max(L.)Merrill]using proliferative
embryogenic tissue maintained on semi-solid medium.In Vitro Cellular&
Developmental Biology-Plant[用保持在半固体培养基中的增殖性胚胎发生组织转化大
豆[Glycine max(L.)Merrill]，体外细胞与发育生物学-植物]35:451-455]。从未成熟的胚胎中诱导愈伤组织并用于粒子轰击。如果使用乙酰乳酸合酶(ALS)基因作为选择性标记，则在包含选择剂(如ALS抑制剂除草剂氯磺隆)的培养基上选择转化的愈伤组织。可替代地，如果使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)作为标记，则甘露糖可以用作选择剂。将选择的转基因愈伤组织置于再生培养基上以形成体细胞胚。然后将体细胞胚置于成熟培养基上，并且稍后将成熟体细胞胚进行干燥，并然后发芽以形成T0转基因植物。测定T0顺基因/转基因植物中GmHiSil基因插入的存在。最佳地，选择具有低拷贝的GmHiSil和ALS或PMI标记基因插入的植物，使其生长至成熟。使T0植物自花授粉或与大豆的其他基因型回交以产生子代种子。种植子代种子，并对个体植物进行基因分型以选择仅包含GmHiSil插入(但没有ALS或PMI选择性标记转基因)的单个拷贝的品系。仅具有GmHiSil插入物的品系是“顺基因的”，因为它们不包含任何外来DNA序列。
acceleration.Bio/Technol[通过粒子加速转化嫩枝分生组织，生物技术]6:923-926；
Finer和McMullen(1991)Transformation of soybean via particle bombardment of
embryogenic suspension culture tissue.In Vitro Cell Dev Biol.[通过粒子轰击胚
性悬浮培养组织转化大豆，体外细胞发育生物学]27P:175-182；Santarém和Finer(1999)Transformation of soybean[Glycine max(L.)Merrill]using proliferative
embryogenic tissue maintained on semi-solid medium.In Vitro Cellular&
Developmental Biology-Plant[用保持在半固体培养基中的增殖性胚胎发生组织转化大
豆[Glycine max(L.)Merrill]，体外细胞与发育生物学-植物]35:451-455]。从未成熟的胚胎中诱导愈伤组织并用于粒子轰击。如果使用乙酰乳酸合酶(ALS)基因作为选择性标记，则在包含选择剂(如ALS抑制剂除草剂氯磺隆)的培养基上选择转化的愈伤组织。可替代地，如果使用磷酸甘露糖异构酶(PMI)作为标记，则甘露糖可以用作选择剂。将选择的转基因愈伤组织置于再生培养基上以形成体细胞胚。然后将体细胞胚置于成熟培养基上，并且稍后将成熟体细胞胚进行干燥，并然后发芽以形成T0转基因植物。测定T0顺基因/转基因植物中GmHiSil基因插入的存在。最佳地，选择具有低拷贝的GmHiSil和ALS或PMI标记基因插入的植物，使其生长至成熟。使T0植物自花授粉或与大豆的其他基因型回交以产生子代种子。种植子代种子，并对个体植物进行基因分型以选择仅包含GmHiSil插入(但没有ALS或PMI选择性标记转基因)的单个拷贝的品系。仅具有GmHiSil插入物的品系是“顺基因的”，因为它们不包含任何外来DNA序列。
[1033] 实例14-含有Hikmok sorip品系的HiSil等位基因的基因型的基因组编辑的大豆植物的产生
[1034] 可转化品系Williams 82和Jack的硅转运体基因(GmLSi)的蛋白质编码序列与Hikmok sorip序列(GmHiSil，SEQ ID NO:630)仅有5个碱基不同。这5个碱基中只有2个导致硅转运体蛋白中氨基酸序列的改变。可以使用基因组编辑技术将低硅积累品系(如Jack)中的GmLSi基因转化为Hikmok sorip中存在的高硅积累GmHiSil等位基因。可以使用几种类型的可编程定点核酸酶来实现这样的目的，所述核酸酶包括但不限于，锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)、工程化大范围核酸酶(eMN)、CRISPR-Cas9和DNA指导的Argonaute系统(Puchta和Fauser(2014)Synthetic nucleases for genome engineering in plants:
prospects for a bright future.Plant Journal[用于植物基因组工程的合成核酸酶：前景光明，植物杂志]78:727–741；Chen和Gao(2014)Targeted genome modification
technologies and their applications in crop improvements.Plant Cell Rep.[靶向基因组修饰技术及其在作物改良中的应用，植物细胞报告]33:575–583；Gao等人(2016)DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi
Argonaute.Nature Biotech.[使用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)
Argonaute进行DNA指导的基因组编辑，自然生物技术]doi:10.1038/nbt.3547)。
prospects for a bright future.Plant Journal[用于植物基因组工程的合成核酸酶：前景光明，植物杂志]78:727–741；Chen和Gao(2014)Targeted genome modification
technologies and their applications in crop improvements.Plant Cell Rep.[靶向基因组修饰技术及其在作物改良中的应用，植物细胞报告]33:575–583；Gao等人(2016)DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi
Argonaute.Nature Biotech.[使用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)
Argonaute进行DNA指导的基因组编辑，自然生物技术]doi:10.1038/nbt.3547)。
[1035] 这里，我们描述了使用基因组编辑系统之一，CRISPR-Cas9，来介导用来自Hmmok sorip的GmHiSil等位基因取代大豆品系Jack中的GmLSi基因的核苷酸序列。CRISPR-Cas9介导的基因修饰需要这些组分：Cas9核酸酶、识别诱变靶标的crRNA(CRISPR RNA)、tracRNA(反式激活RNA)和修复供体DNA模板分子。为了便于使用，通常将crRNA和tracRNA融合并作为单个指导RNA分子(gRNA或sgRNA)递送[Sander和Joung(2014)CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes[用于编辑、调节和靶向基因组的CRISPR-Cas系统]，32:347-355]。为了在玉蜀黍细胞中实现良好的表达，用玉蜀黍偏好性密码子来优化来自酿脓链球菌SF370的II型Cas9基因。核定位信号也被并入Cas9的C-末端以改进其对核的靶向。为了在大豆细胞中表达Cas9，将大豆优化的Cas9基因置于强组成型拟南芥延长因子启动子(prAtEF1a)的控制之下，并且其后跟着的是NOS终止子序列(tNOS)(图43)。
[1036] 在此实例中，转化载体pNtALS-GmCas9-HiSil(图Y-1)含有针对选择性标记基因ALS、Cas9和两个sgRNA(单一指导RNA)的表达盒。两个sgRNA指导在2个靶区域周围的Jack基因组序列的Cas9介导的切割并产生dsDNA断裂。将两个修复供体寡核苷酸序列共同递送到Jack大豆愈伤组织中以介导用Hikmok sorip的HiSil等位基因取代GmLSi靶序列。两个供体寡核苷酸都具有对应于突变的PAM序列(5'-NGG)的核苷酸之一，所以被取代的等位基因序列不会再次被Cas9切割。更确切地，在Jack靶标1(SEQ ID NO 631：5’-ATGGC ATTGG CTCTT ACTCC AACAG TTGTC TTTGG-3’)中，经取代的等位基因与Hikmok sorip序列(SEQ ID NO
632：5'-ATGGC ATTGG CTCCT ACTCC AACAG TTGTC TTTGG-3')在一个核苷酸(加下划线的)上不同，但是这种差异是沉默突变，不导致氨基酸序列改变。对于此靶标，使用含有靶向序列xGmHiSil-T1(SEQ ID NO 633：5'-TTTAA CCACA ACAAT GGCAT-3')的pNtALS-GmCas9-
HiSil(图Y-1)中的sgRNA-T1来指导Cas9切割。对于此靶标，使用74bp的供体寡核苷酸(DON-HiSil-T1，SEQ ID NO 634：5'-GTTTG GAAAT TGTTG CTTGT TTAAC CACAA CAATG GCATT
CGCTC CTACT CCAAC AGTTG TCTTT GGCTC AATA-3')来取代Jack靶序列。为了取代Jack中的序列，靶标2(SEQ ID NO 635：5'-AATTT CAGCT ATATC AAGTG CCTTT TTCA-3')与Hikmok sorip等位基因(SEQ ID NO 636：5'-AATTT CTGCT ATATC AAGTG CTTTT TTCA-3')具有两个不同的碱基。对于此靶标，将含有靶向序列xGmHiSil-T2(sgRNA-2，SEQ ID NO.637：5'-AGATG TGTCA TTGGT GAAAA-3'，靶向编码链)的pNtALS-GmCas9-HiSil(图43)中的指导RNA sgRNA-T2用于指导Cas9切割。对于此靶标，使用83bp的供体寡核苷酸(DON-HiSil-T2，SEQ ID NO 638：5’-AAGGA CTTAC TCTGT AGAAT TTGTT TAATT TCTGC TATAT CAAGT GCTTT
TTTCA CCAAT GACAC ATCTT GTGTT GTATT GAC-3’)来取代Jack靶序列。
632：5'-ATGGC ATTGG CTCCT ACTCC AACAG TTGTC TTTGG-3')在一个核苷酸(加下划线的)上不同，但是这种差异是沉默突变，不导致氨基酸序列改变。对于此靶标，使用含有靶向序列xGmHiSil-T1(SEQ ID NO 633：5'-TTTAA CCACA ACAAT GGCAT-3')的pNtALS-GmCas9-
HiSil(图Y-1)中的sgRNA-T1来指导Cas9切割。对于此靶标，使用74bp的供体寡核苷酸(DON-HiSil-T1，SEQ ID NO 634：5'-GTTTG GAAAT TGTTG CTTGT TTAAC CACAA CAATG GCATT
CGCTC CTACT CCAAC AGTTG TCTTT GGCTC AATA-3')来取代Jack靶序列。为了取代Jack中的序列，靶标2(SEQ ID NO 635：5'-AATTT CAGCT ATATC AAGTG CCTTT TTCA-3')与Hikmok sorip等位基因(SEQ ID NO 636：5'-AATTT CTGCT ATATC AAGTG CTTTT TTCA-3')具有两个不同的碱基。对于此靶标，将含有靶向序列xGmHiSil-T2(sgRNA-2，SEQ ID NO.637：5'-AGATG TGTCA TTGGT GAAAA-3'，靶向编码链)的pNtALS-GmCas9-HiSil(图43)中的指导RNA sgRNA-T2用于指导Cas9切割。对于此靶标，使用83bp的供体寡核苷酸(DON-HiSil-T2，SEQ ID NO 638：5’-AAGGA CTTAC TCTGT AGAAT TTGTT TAATT TCTGC TATAT CAAGT GCTTT
TTTCA CCAAT GACAC ATCTT GTGTT GTATT GAC-3’)来取代Jack靶序列。
[1037] 为了产生等位基因取代的大豆品系，将转化载体pNtALS-GmCas9-HiSil(图43)与两个寡核苷酸(DON-HiSil-T1和DON-HiSil-T2)共沉淀到金颗粒上，并且然后通过基因枪轰击共递送到Jack愈伤组织中。用ALS除草剂(如氯磺隆)选择被轰击的愈伤组织，并将选定的愈伤组织再生为体细胞胚。如上所述地使体细胞胚发芽以产生顺基因植物。发芽后，对幼苗进行取样用于分子分析，以鉴定含有具有Hikmok sorip型等位基因的所期望突变的品系。
如果可以发现合适的位点来将WT和突变体区分开来，则候选突变体的鉴定可以使用限制性消化来完成。可替代地，可以设计高度敏感的SNP测定或qPCR Taqman测定来鉴定所期望的编辑的突变体。经鉴定的潜在突变通常通过这些候选突变品系中的PCR产物的测序分析来确认。应该注意的是，可以使用其他定点核酸酶来产生序列特异性断裂来介导序列取代。另外，可以使用其他DNA、RNA或蛋白质递送方法来递送编辑机械的组分和供体修复分子以实现对大豆转运体基因的编辑，以使其在转运硅中更有效。
如果可以发现合适的位点来将WT和突变体区分开来，则候选突变体的鉴定可以使用限制性消化来完成。可替代地，可以设计高度敏感的SNP测定或qPCR Taqman测定来鉴定所期望的编辑的突变体。经鉴定的潜在突变通常通过这些候选突变品系中的PCR产物的测序分析来确认。应该注意的是，可以使用其他定点核酸酶来产生序列特异性断裂来介导序列取代。另外，可以使用其他DNA、RNA或蛋白质递送方法来递送编辑机械的组分和供体修复分子以实现对大豆转运体基因的编辑，以使其在转运硅中更有效。
[1038] 虽然结合本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但将会理解能够进行进一步的修改，并且本申请意在涵盖任何一般而言遵循本发明的原理的变化、用途或改编，并且包括这样的偏离本披露的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内，并且可以适用于此前所示的关键特征，并且遵循所附权利要求的范围。
[1039] 在本说明书中提到的所有专利、专利申请和出版物都通过引用并入本文，其程度如同每个单独的专利、专利申请或出版物被具体地并且单独地指明通过引用并入本文。
[1040] 参考文献
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