纳米级光学荧光标记及其用途
阅读：872发布：2021-06-11
专利汇可以提供纳米级光学荧光标记及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开一种能用于检测的组合物，它包含一种包囊化的贵金属纳米簇。还公开该包囊化的贵金属纳米簇的制备方法、和使用包囊化的贵金属纳米簇的方法。优选的是贵金属纳米簇被树枝状分子或肽包囊化。该包囊化的贵金属纳米簇有特征性 光谱 发射，其中该光谱发射靠控制包囊材料的性质而变化，如控制纳米簇的尺寸和/或树枝状分子的级别，而且其中该发射用来提供关于 生物 状态的信息。，下面是纳米级光学荧光标记及其用途专利的具体信息内容。
1.一种包含水溶性荧光标记的组合物，该标记包含包囊化的贵金属 纳米簇。
2.权利要求1的组合物，其中该贵金属纳米簇包含2～8个贵金属原 子。
3.权利要求1的组合物，其中该贵金属是金。
4.权利要求1的组合物，其中该贵金属是银。
5.权利要求1的组合物，其中该贵金属是铜。
6.权利要求1的组合物，其中该包囊化的贵金属纳米簇的荧光量子 产率大于约1％，饱和强度为约1～1000W/cm2。
7.权利要求6的组合物，其中在约460nm下的低激发强度为约 30W/cm2。
8.权利要求1的组合物，其中该荧光标记显示偏振光谱发射，并显 示偶极发射模式。
9.权利要求1的组合物，其中该荧光标记的光谱发射提供有关生物 状态的信息。
10.权利要求9的组合物，其中该生物状态选自生物部分的定量和定 性存在；生物部分的结构、组成、和构象；生物部分在环境中的定位； 生物部分间的相互作用；生物化合物结构的变化和在细胞过程中的变化。
11.权利要求1的组合物，其中该贵金属纳米簇带有不定的电荷。
12.权利要求1的组合物，其中当荧光标记被激发时，在pH约3～约 8范围内发荧光。
13.权利要求1的组合物，其中该荧光标记的直径为约小于1nm到 15nm。
14.权利要求1的组合物，其中该贵金属纳米簇在光漂白前发射多于 约108个光子。
15.权利要求1的组合物，其中当包含多于一种贵金属纳米簇的组合 物被激发时，大于约80％的贵金属纳米簇发荧光长达约30分钟以上。
16.权利要求15的组合物，其中该贵金属纳米簇在514.5nm或476nm 下，在约300W/cm2的连续激发能激发时发荧光且其中荧光是饱和荧光。
17.权利要求1的组合物，其中该贵金属纳米簇被包囊化在树枝状分 子里。
18.权利要求17的组合物，其中该树枝状分子包含聚酰胺胺。
19.权利要求18的组合物，其中聚酰胺胺树枝状分子选自0级、1 级、2级、3级、4级和更高级聚酰胺胺树枝状分子。
20.权利要求18的组合物，其中聚酰胺胺树枝状分子是2级、或4 级羟基封端的聚酰胺胺树枝状分子。
21.权利要求1的组合物，其中该贵金属纳米簇被包囊化在肽里。
22.权利要求21的组合物，其中肽的长度为约5～500个氨基酸。
23.权利要求21的组合物，其中肽的长度约为5～20个氨基酸。
24.权利要求21的组合物，其中该肽包含如SEQ ID No：1中确定的 多肽序列。
25.一种树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇的制备方法，它包括下列 步骤：a)把树枝状分子、含贵金属的水溶液、和水性溶剂混合，以产生 混合溶液；b)添加还原剂；c)接着添加足量酸性化合物把混合溶液调 至中性范围pH；和d)搅拌调好pH的混合溶液使树枝状分子包囊化的贵 金属纳米簇得以形成。
26.权利要求25的方法，其中还原剂选自光、化学还原剂、及其组 合。
27.权利要求25的方法，其中从步骤a)到步骤c)混合溶液的温度 为约65°F～约100°F。
28.权利要求27的方法，其中该混合溶液的温度为约68°F～约74 °F。
29.权利要求25的方法，其中贵金属选自银、金、和铜。
30.权利要求25的方法，其中含贵金属的水溶液选自AgNO3溶液、 HAuCl4·nH2O溶液、和CuSO4·nH2O溶液。
31.权利要求25的方法，其中含贵金属的水溶液为HAuCl4·nH2O，且 其中搅拌调好pH的混合溶液至少1小时使树枝状分子包囊化的金纳米簇 得以形成。
32.权利要求31的方法，其中搅拌调好pH的混合溶液约48小时， 使其形成树枝状分子包囊化的金纳米簇。
33.权利要求25的方法，其中当在约460nm的约30W/cm2低激发强度 激发时，该树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇显示偏振光谱发射。
34.权利要求25的方法，其中当树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇 被激发时的光谱发射至少部分取决于纳米簇的粒径。
35.权利要求25的方法，其中该树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇 能在pH约3～8范围内发荧光。
36.权利要求25的方法，其中该树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇 在光漂白前发射多于约106个光子。
37.权利要求25的方法，其中当多于一种贵金属纳米簇在514.5nm 或476nm约300W/cm2的连续激发能激发时，大于约90％的贵金属纳米簇 发荧光长达30分钟以上。
38.权利要求25的方法，其中该树枝状分子包含聚酰胺胺。
39.权利要求38的方法，其中该聚酰胺胺树枝状分子选自0级、1 级、2级、3级、4级和更高级聚酰胺胺树枝状分子。
40.一种肽包囊化的能发荧光的贵金属纳米簇的制备方法，它包括下 列步骤：a)把肽、含贵金属的水溶液、和蒸馏水混合，以产生混合溶液； b)添加还原剂；c)接着添加足量酸性化合物把混合溶液调至中性范围 pH；和d)搅拌调好pH的混合溶液使肽包囊化的贵金属纳米簇得以形成。
41.权利要求40的方法，其中该还原剂选自光，化学还原剂及其组 合。
42.权利要求40的方法，其中步骤a)贵金属与肽的摩尔比为约 0.1∶1。
43.权利要求40的方法，其中从步骤a)到步骤c)混合溶液的温度 为约65°F～约100°F。
44.权利要求43的方法，其中该混合溶液的温度为约68°F～约74 °F
45.权利要求40的方法，其中该贵金属选自银、金、和铜。
46.权利要求40的方法，其中含贵金属的水溶液选自AgNO3、 HAuCl4·nH2O、和CuSO4·nH2O。
47.权利要求40的方法，其中肽的长度为约5～500个氨基酸。
48.权利要求40的方法，其中肽的长度为约5～20个氨基酸。
49.权利要求40的方法，其中该肽包括如SEQ ID No：1中确定的多 肽序列。
50.权利要求40的方法，其中该肽包囊化的贵金属纳米簇的粒径为 约小于1nm到约15nm。
51.权利要求40的方法，其中该肽包囊化的贵金属纳米簇能在pH约 3～9范围内发荧光。
52.权利要求40的方法，其中该肽包囊化的贵金属纳米簇在光漂白 前发射多于约106个光子。
53.权利要求40的方法，其中当多于一种贵金属纳米簇在514.5nm 或476nm约300W/cm2的连续激发能激发时，大于90％的贵金属纳米簇发 荧光长达约30分钟以上。
54.一种监测目的分子的方法，包括：
a)使包含包囊化的贵金属纳米簇的水溶性荧光标记附着在目的分子 上，其中该荧光标记发出发射光谱；和
b)检测该荧光标记的发射光谱。
55.权利要求54的方法，其中该贵金属纳米簇包含2～8个贵金属原 子。
56.权利要求54的方法，其中该贵金属选自金、银、和铜。
57.权利要求54的方法，其中该包囊化的贵金属纳米簇在低激发强 度发荧光，且其中该包囊化的贵金属纳米簇的饱和强度在纳米簇激发高 峰约为1～1000W/cm2。
58.权利要求57的方法，其中该低激发强度在约460nm为约30W/cm2。
59.权利要求54的方法，其中该荧光标记显示偏振光谱发射，并显 示偶极发射模式。
60.权利要求54的方法，其中该荧光标记的发射光谱提供有关生物 状态的信息。
61.权利要求60的方法，其中该生物状态选自生物部分的定量和定 性存在；生物部分的结构、组成、和构象；生物部分在周围环境中的定 位；生物部分间的相互作用；生物化合物结构的变化和细胞过程的变化。
62.权利要求54的方法，其中当荧光标记被激发时，它能在pH约为 3～9范围内发荧光。
63.权利要求54的方法，其中该贵金属纳米簇在光漂白前发射多于 约106个光子。
64.权利要求54的方法，其中当含有多于一个贵金属纳米簇的组合 物被激发时，大于约80％的贵金属纳米簇发荧光长达约30分钟以上。
65.权利要求64的方法，其中该贵金属纳米簇在514.5nm或476nm 约300W/cm2的连续激发能激发时发荧光，且其中荧光是饱和或不饱和的 荧光。
66.权利要求54的方法，该法还包括使连接体分子附着在包囊化的 贵金属纳米簇的起始步骤，其中该连接体分子能使荧光标记附着在目的 分子上。
67.权利要求54的方法，其中该目的分子存在于生物样品里。
68.权利要求54的方法，其中该荧光标记的直径为约小于1nm到 15nm。
69.权利要求54的方法，其中该贵金属纳米簇被包容在树枝状分子 里。
70.权利要求69的方法，其中该树枝状分子包含聚酰胺胺。
71.权利要求70的方法，其中该聚酰胺胺树枝状分子选自0级、1 级、2级、3级、4级、和更高级聚酰胺胺树枝状分子。
72.权利要求70的方法，其中该聚酰胺胺树枝状分子是2级、或4 级羟基封端的聚酰胺胺树枝状分子。
73.权利要求54的方法，其中该贵金属纳米簇被包囊化在肽里。
74.权利要求73的方法，其中该肽在细胞里表达。
75.权利要求73的方法，其中该肽包含融合多肽。
76.权利要求73的方法，其中该肽的长度为约5～500个氨基酸。
77.权利要求73的方法，其中该肽的长度为约5～20个氨基酸。
78.权利要求73的方法，其中该肽的长度为约20～40个氨基酸。
79.权利要求73的方法，其中该肽包含如SEQ ID No：1中确定的多 肽序列。
技术领域
本发明涉及一种基于金属簇荧光的新型荧光/发光探针的开发，其制 备方法，及其使用方法。
背景技术
单分子荧光显微技术研究会带来一个极限，其中微弱信号必须在实 质上为O的本底上观察。这种依靠高强度激光激发强发射和强力荧光团 的光学方法需要非常有效的本底排斥。依靠引入人工标记来鉴定特定目 的蛋白质或结构，基于荧光的方法有两个另外的问题—光漂白(由于探 针失效而丢失信号)和自发荧光(来自生物介质中天然物质自然存在的 本底荧光)。尽管有这些问题，当使生物介质成像的时候，荧光显微技术 仍然是一种具有单分子和化学灵敏度潜力的主要光学方法。
大多数体外荧光标记是经由标准的化学偶联法来做的：或使N-琥珀 酰亚氨酸酯缀合的染料同游离的、溶剂-暴露的胺(常在赖氨酸残基上) 偶联，或者使马来酰亚胺缀合的染料同硫醇(在天然存在或基因引入的 溶剂-暴露的半胱氨酸上)偶联。这两种化学偶联法在使小的强荧光染料 附着在目的蛋白质上仍然是非常有用的。这种荧光生物材料因而足以适 用于体外单分子研究，或者经由微量注射或其它膜转运法高浓度地再引 入细胞里来做全细胞内目的蛋白质的整体荧光研究。不仅蛋白质功能可 能被荧光标记的粒径和附着点两者所改变，而且往往由于所用的化学偶 联法使荧光标记的位点不能确切知道。因此，一种尽可能小的基因编程 标记(smallest possible genetically programmed lable)就会是非 常有用的。
而且，在生物系统中，来自黄素、卟啉、和其它有微弱荧光的天然 物质的自发荧光本底会产生一个干扰激光-诱导的荧光信号的大本底。由 于这些问题，生物系统里少量拷贝的蛋白质的动态特性研究要求开发新 的荧光探针，该探针强烈吸收和发射且无明显的光漂白，以致用极微弱 的断续照明就能轻易地长久看到荧光。这种照明，较之激发微弱的本底 信号，将能优先激发目的荧光团。而且，该微弱照明会将光毒性效应减 至最小来保护生物生存力。遗憾的是，单分子的灵敏度尚难达到像这样 高的体内研究本底，且即使在较低的体外研究本底上也往往难以看到荧 光。
由于信噪限制因素，伴有其各种麻烦的单分子研究就被限制在荧光 法测定方面。当单分子方法在使总体均值“脱壳(peeling back)”以检 查环境、机制异质性方面有效的同时，现有的技术仍需要昂贵的基于激 光的装置，专门的合成方法，且基本上仍被现有荧光标记的不良光学性 能或生物不相容性所限制。
若干主要的实验已明确证明单分子显微技术有能力探索导致生物活 性的关键步聚(Lu等人，Science 1998，282：1877-1882；Dickson等 人，Nature 1997，388；355-358；Funatsm等人，Nature 1995，374：555-59； Ha等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 1996，93，6264-6268；Vale等人， Nature 1996，380：451-453；Deniz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 2000，97：5179-5184；Ha等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999， 96：893-898；Harada等人，Biophys.J.1999，76：709-715；Kinosita， Biophys.J.2000，78：149Wkshp)。在个体运动蛋白的移动的研究种，对 生物力学循环里蛋白功能和子步的机械认识都能直接可视化，而无需进 行麻烦的外部同步化(Funatsu等人，Nature 1995，374：555-59；Vale 等人，Nature 1996，380：451-453；Kinosita，BiopHys.J.2000，78：149 Wkshp；Yanagida等人，Curr.Opin.Cell Biol.2000，12：20-25)。甚至已经 探测了生物分子折叠以揭示导向错误折叠和折叠状态的途径(Deniz等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2000，97：5179-5184；Ha等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1999，96；893-898)。因为已经在单分子水平上开发了定向 法(Bartko，& Dickson，J.Phys.Chem.B 1999，103：3053-3056；Bartko & Dickson，J Phys.Chem.B 1999，103：11237-11241；Bartko等人，Chem. Phys.Lett.2002，358：459-465；Hollars & Dunn，J.Chem.Phys. 2000，122：7822-7830)和荧光共振能量转移法(FRET)(Weiss， Science1999，283：1676-1683)，更多的实验目前都是可能做到的。遗 憾的是，在所有的单分子研究中，研究人员都只限于去做目的蛋白的人 工荧光标记，且限于体外观察。由于有机体荧光团的大荧光本底和不良 的光稳定性，标记蛋白质向细胞内的再引入仍不能产生可行的体内单分 子信号。
单个分子也有许多固有的不良性能限制了实验的时间长度。激发速 率必须很高从而以合理的时间分辨率(毫秒～秒)和良好信噪比产生生 物学相关的信息。因为最好的有机荧光团的吸收截面(即消光系数ε) 在室温下只有～10-16cm2(即ε～105M-1cm-1)(Macklin等人，Science1996， 272：255-258)，须使用高强度激光激发以供单分子荧光研究。而且，有 机体分子在光化学分解前只能耐得住～107激发周期(Dickson等人， Nature 1997，388：355-358；Lu & Xie，Nature1997，385：143-146； Macklin等人，Science 1996，272：255-258)。在106激发/秒(使用～ 5kW/cm2激发强度和常用的5％的采集/检测效率)，这把时间分辨率限制 在～1ms(带有理想化的信噪比～7)，并且在光漂白前跟踪个体分子的平 均总时间为～10秒钟。尽管对于真正生物相关时间长度来说这可能是大 量的数据，但是许多激发周期在采集数据之前被寻找目的分子所耗费。 显然，减少氧气往往能增加光漂白前的时间，而有机染料的光稳定性和 总亮度限制了全部生物单分子实验。因而荧光团性能的提高将是生物系 统中的全部单分子光学研究持续成功的关键。
最近已提出并证明水溶性II-VI量子点(quantum dot)可以作为生 物标记(需要使用与有机荧光团类似的化学偶联)(Brucher等人，Science 1998，281：2013-2016；Chan & Nie，Science 1998，281：2016-2018；Zhang 等人，Analyst 2000，125：1029-1031)一些材料，诸如有ZnS外敷层(起 保护和稳定作用)的CdSe，具有粒径依赖型的光学性能并能以很窄的粒 径分布合成(Murray等人，Z，Phys，D-Atoms Mol.Clusters 1993，26：S231-S233；Murray等人，J.Am.Chem.Soc.1993，115：8706-8715； Peng等人，Nature 2000，404：59-61)。这些纳米材料的强吸收，光谱稳 定性、和可由尺寸调节的窄发射，意味着它们很可能用于生物标记，只 要对ZnS外层再做化学处理使这些材料成为水溶性的(Rodriguez-Viejo 等人，J.Appl.Phys.2000，87：8526-8534；Dabbousi等人，J.Phys.chem.B 1997，101：9463-9475)。因为表面钝化在总量子点光学性能里是非常重要 的，因此要把很多的注意力用在量子点的表面钝化和衍生化上，以使之 以可预知的光学响应能再现地结合到蛋白质上(Bruchez等人，Science 1998，281：2013-2016；Chan & Nie，Science 1998，281：2016-2018； Rodriguez-Viejo等人，J.Appl.pHys.2000，87：8526-8534；Dabbousi等 人，J.Phys.Chem.B 1997，101：9463-9475；Nirmal & Brus，Acc.Chem.Res. 1999，32：407-414；Nirmal等人，Nature 1996，383：802-804)。事实上，水 溶解和表面钝化现在才开始取得成功(Dubertret等人，Science 2002，298：1759-1762；Jaiswal等人，Nat.Biotechnol.2003，21：47-51；Wu 等人，Nat.Biotechnol.2003，21：41-46；Sutherland，Curr.Opin.Solid State Mat.Sci.2002，6：365-370；Gao等人，J.Biomed.Opt.2002， 7：532-537；Mattoussi等人，J.Am.Chem.Soc.2000，122：12142-12150)。
尽管因其明亮和很窄的粒径依赖型发射而大有前途，可是用CdSe作 生物标记依然存在许多问题。它们的合成方法需要用高毒性前体和高温， 它们的大小与它们所要标记的蛋白质的大小相当(直径2-6nm)，它们同 样需要目的蛋白的外部标记，以及可能要把标记的蛋白再引入细胞。因 此，尽管强烈的振荡强度使量子点借助弱汞灯的激发就能很容易观察到， 从而避免大量额外的更弱的吸收性自发荧光本底，可是，对体内或体外 单分子研究来说，它们仍然不是一个理想的解决办法。
理想地，人们需要一种表达在目的蛋白上或其附近的尽可能小的基 因编程标记。这一理想的标记必须有足够强的吸收和发射，以及显著的 光稳定性，从而即使在高本底荧光存在下也能以高时间分辨率持久地观 察单个分子。这样的荧光探针现在还没有。目前，可用的最好选择由于 仅由氨基酸，绿色荧光蛋白(GFP；Dickson等人，Nature 1997，388：355-358；Heim，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1994，91：12501-04； Ormo等人，Science 1996，273：1392-5；Chattoraj等人，Proc.Nat.Acad. Sci，USA 1996，93：362-67；Brejc等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1997， 94：2306-11；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20：448-55；Kain & Kitts，Methods Mol.Biol.1997，63：305-24)以及DsRed组成(Gross等 人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA2000，97：11990-11995；Jakobs等人，FEBS Lett.2000，479：131-135；Wall等人，Nat.Struct，Biol，2000，7：1133- 1138；Yarbrough等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2001，98：462-467)， 是极好的体内标记，已由许多作者在体外研究中于单分子水平上观察到 (Dickson等人，Nature 1997，388：355-358；Malvezzi-Campeggi等 人，BiopHys.J.2001，81：1776-1785；Garcia-Parajo等人，Proc.Natl. Acad.Sci.，USA2000，97：7237-7242；Cotlet等人，Chem.Phys.Lett. 2001，336，415-423；Lounis等人，J.Phys.Chem.B 2001，105：5048-5054； Garcia-Parajo等人，Pure Appl.Chem.2001，73：431-434；Garcia-Parajo 等人，Chem Phys Chem 2001，2：347-360；Garcia-Parajo等 人，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA 2001，98：14392-14397；Blum等 人，Chem.Phys.Lett.2002，362：355-361)。
在最早的这批研究之一中，当用光子使GFP生色团在两种不同光可 达状态间转换时，研究了GFP的闪烁和光学转换能力(Dickson等人， Nature 1997，388：355-358)。遗憾的是，尽管GFP能特异性地附着于 任何蛋白质的N或C末端并体内表达为强荧光标记，但是仍然存在问题， 特别是在单分子水平上。GFP为27kD或直径为～4nm(Ormo等人；Science 1996，273：1392-5；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20： 448-55)，因而对其所附着的蛋白质是一大干扰。而且，只有当GFP折叠 成其最终构象才出现发射，该过程时间可达约1小时，尽管GFP标记的 例子已在不同细胞的所有区域里报道过，但是有时候在一组给定的条件 之下GFP并不能正确折叠(Heim，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1994， 91：12501-04；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20：448-55)。 而且，当考虑到单分子研究时，其发射与自发荧光本底明显重叠，而其发 射强度只和标准外源性有机染料相当，从而使体内单分子研究面临真正 挑战。尽管基本上对氧非常不敏感，其一般也在～107激发周期后漂白， 与标准有机染料类似(Dickson等人，Nature 1997，388：355-358)。DsRed 部分克服了与自发荧光本底重叠的问题，但是尽管DsRed相对于GFP的 红移发射是一个优点，其相当的荧光强度以及即使在极低浓度下四重化 的趋势可能进一步限制作为一种理想的生物标记的应用(Lounis等人，J. Phys.Chem.B 2001，105：5048-5054；Garcia-Parajo等人，Chem Phys Chem 2001，2：347-360；Verkhusha等人，J.Biol.Chem. 2001，276：29621-29624；Sacchetti等人，FEBS Lett.2002，525：13-19)。 所以，理想的标记应该同时具有无机量子点的强吸收、发射和光稳定性 以及有机染料的小尺寸和简单附着的化学性质，或优选的是象GFP和 DsRed那样，能在体内表达为附着在任何目的蛋白质的单分子生物标记， 而无需首先纯化、标记和再注入蛋白质。
总之，尽管现有的标记方法和材料已使数不清的整体研究和许多体 外单分子实验成为可能，但是单分子实验仍然受到即使是最好的荧光探 针的不利条件的限制。本领域中需要新的单分子探针，其具有大大提高 的光稳定性，在弱照射下更强的吸收和发射，易于合成和易于与蛋白质 缀合，以及可调的发射颜色。理想地，这种荧光标记也应该是基因编程 的，以便待研究的蛋白质能够直接在细胞内进行标记，而无需首先进行 过度表达、纯化、标记、然后再重新引入细胞。
发明概述
本发明的一个目的在于克服、或至少减轻一种或多种与现有技术有 关的困难或缺点。本发明部分满足那种鉴定新的、独特的强荧光标记的 需求，该荧光标记可在单分子或大浓度场合下分子的简易研究之用。本 发明的组合物包含水溶性荧光标记，该荧光标记包含包囊化的贵金属纳 米簇。在一个实施方式中，贵金属纳米簇包含2～8个贵金属原子。在优 选的实施方式中，贵金属选自金、银、和铜。在某一实施方式中，该贵 金属纳米簇具有可变的电荷。
优选的是，该荧光标记显示偏振发射光谱并显示偶极发射模式。荧 光标记的光谱发射提供有关生物状态的信息，其中该生物状态选自生物 部分的定量和定性存在；生物部分的结构、组成和构象；生物部分在周 围环境中的定位；生物部分间的相互作用，生物化合物结构方面的变化 和在细胞过程中的变化。
优选的是，本发明的荧光标记能在约3到约8的pH范围内发射荧光， 该贵金属纳米簇在光漂白前发射＞约106、＞107、＞108、或＞109个光子。 在一个实施方式中，在纳米簇光谱激发最大值处，包囊化的贵金属纳米 簇的荧光量子产量大于约1％，饱和强度在约1-1000W/CM2范围。
在某些优选的实施方式中，用树枝状分子包囊贵金属纳米簇。在一 个实施方式中，树枝状分子包括聚(酰胺胺)，其中，该聚(酰胺胺)树 枝状分子选自0级、1级、2级、3级、4级、和更高级聚(酰胺胺)树 枝状分子。在另一实施方式中，该聚(酰胺胺)树枝状分子是一种2级、 或4级羟基封端的聚(酰胺胺)树枝状分子。
在某些其它的优选实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的 是，该肽的长度为约5～500个氨基酸。在另外的实施方式中，肽的长度 为约5-20个氨基酸。在进一步的实施方式中，该肽包括SEQ ID No.1 所定义的多肽序列。
本发明提供一种此处所述能发荧光的树枝状分子包囊化的贵金属纳 米簇之制备方法，它包括下列步骤：(a)把树枝状分子、含贵金属的水 溶液、和水性溶剂混合以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)接着添 加足量酸性化合物把混合溶液调至中性范围或生理pH值；和(d)混合 调好pH值的混合溶液使树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇得以形成。本 发明还提供一种此处所述能发荧光的肽包囊化的的贵金属纳米簇的制备 方法，它包括下列步骤；(a)把肽、含贵金属的水溶液和水性溶液混合 以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)添加足量酸性化合物把混合溶 液调至中性范围的pH值；和(d)混合调好pH值的混合溶液使肽包囊化 的贵金属纳米簇得以形成。
本发明还包括为研究生物状态而使用此处所述荧光标记的方法。本 发明提供一种监测目的分子的方法，它包括：(a)把含包囊化的贵金属 纳米簇的水溶性荧光标记附着在目的分子上，其中荧光标记在某一可见 光或近红外波长范围内发出发射光谱；和(b)检测荧光标记的发射光谱。 在某些实施方式中，该方法还包括把连接体分子附着在包囊化的贵金属 纳米簇上的起始步骤，其中连接体分子能使荧光标记附着在目的分子上。 在一个优选的实施方案中，目的分子存在于生物样品中。在一个优选的 实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的是，该肽在细胞里表达。 在一个实施方式中，该肽包含融合多肽。
附图简述
图1A提供了银/树枝状分子水溶液的UV-可见光吸收光谱。(1)显示 了大的非荧光树枝状分子包囊化的银纳米颗粒的强等离子吸收(398nm) 特性，该纳米颗粒由树枝状分子主体里的银离子经NaBH4还原制成(1∶ 12树枝状分子∶Ag)。(2)显示了未还原的非荧光1∶3(树枝状分子∶ Ag)溶液在光活化前的吸收光谱。(3)显示了同一溶液在光活化/光还原 后产生强荧光银纳米点(nanodot)。图1B提供了光活化G2-OH PAMAM(MW： 3272amu)-AgNO3溶液的电雾化电离质谱。Agn纳米点峰被Ag原子质量 (107.8amu)隔开，仅显现在有荧光的光活化纳米点溶液里。
图2A-D显示了汞灯激发(450～480nm，30W/cm2，标尺＝15μm)落射 荧光显微技术图象，证明水性树枝状分子包囊化的银纳米点的时间依赖 型光活化。各300msCCD帧显示：随照明时间增加(0秒、0.3秒、1.5 秒、和6秒)荧光也增强。图2E显示了水溶液中表面结合的银纳米点的 发射模式。在弱汞灯激发下可轻易观察到指示单个分子的各向异性发射 模式和荧光闪烁。
图3显示了室温单个纳米点共聚焦荧光光谱(476-nm Ar+激光激发， 496-nm长通滤波器，带有300-mm单色仪)。5个典型纳米点的最大发射 波长为533nm、553nm、589nm、611nm和648nm。整体银纳米点溶液的总 体荧光光谱(顶部)基本上由这5个光谱型组成，它们与在AgO表面上 的那些难以区分。
图4A显示了单个纳米点的荧光寿命，图5B显示了典型的树枝状分 子-包囊化的纳米点的饱和强度测定。图5A中，400-nm激发的寿命受 300ps仪器响应的限制，而在去褶合后显示亚-100ps组分(92％)和1.6 纳秒组分(8％)。图4B中，饱和发生在～400W/cm2(使用偏共振、514.5-nm 激发)，带有各种纳米点间量子产量变化而产生的总强度差异。作为比较， 有机染料DiIC18的饱和强度为10kW/cm2。与DiI相比，得到一个荧光量 子产率为～30％的较低估算量。
图5A显示了水性金纳米点和纯树枝状分子溶液的UV-可见光吸收光 谱。图5B表明：扣除A中的吸收光谱，显出PAMAM包囊化的Au纳米点 的384-nm吸收。
图6显示了G4-OH PAMAM包囊化的金纳米簇在室温下的激发和发射 光谱。“1”表示激发光谱，“2”表示发射光谱。
图7A显示了水溶液里金纳米点的寿命测定。经过拟合的仪器响应和 纳米点数据显示7.5ns(93％)和2.8μs(7％)的寿命。图7B显示了G2-OHPAMAM包囊化的金纳米点的ESI质谱，G2-OH+Au8+5H2O+H+的预期m/z为 4940。
图8显示了PAMAM树枝状分子包囊化的铜纳米簇在室温下的激发和 发射光谱。“1”表示激发谱，“2”表示发射谱。
发明详述
本发明提供包括荧光标记的组合物、该组合物的制备方法及其使用 方法。本发明的组合物包含能发荧光的包囊化的贵金属纳米簇。上述荧 光标记提供超过已知荧光标记的某些优越性，包括尺寸小、在弱光照下 更强的吸收和发射、易于合成和缀合于蛋白质、可调的发射颜色、和可 以选择给标记做基因编程以便能在细胞内直接标记蛋白质。
本发明提供的组合物包含水溶性荧光标记，该荧光标记包含包囊化 的贵金属纳米簇。在一个实施方式中，贵金属纳米簇包含2～8个贵金属 原子。在优选的实施方式中，贵金属选自金、银、和铜。
在一个实施方式中，该荧光标记显示偏振发射光谱和/或偶极发射模 式。荧光标记的发射光谱提供有关生物状态的信息，其中该生物状态选 自生物部分的定量和定性存在；生物部分的位置、结构、组成、和构象； 生物部分在周围环境中的定位；生物部分间的相互作用，生物化合物的 结构改变和细胞过程的改变。
优选的是，本发明的荧光标记能在约3到约8的pH范围内发荧光， 该贵金属纳米簇在光漂白前发射大于约106个光子。在另一实施例方式 中，该贵金属纳米簇在光漂白前发射大于约107、108、或大于109个光子。
在某些优选的实施方式中，用树枝状分子包囊化贵金属纳米簇。在 一个实施方式中，树枝状分子包括聚(酰胺胺)，其中聚(酰胺胺)树枝 状分子选自0级、1级、2级、3级、4级、和更高级聚(酰胺胺)树枝 状分子。在另一实施方式中，该聚(酰胺胺)树枝状分子是一种2级、 或4级羟基封端的聚(酰胺胺)树枝状分子。
在某些其它优选实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的是， 该肽的长度为约5～500个氨基酸。在其它的实施方式中，该肽的长度为 约5～20个氨基酸。在另外的实施方式中，该肽包括如SEQ ID NO：1所 定义的多肽序列。
本发明提供一种用树枝状分子包囊的贵金属纳米簇的制备方法，它 包括下列步骤：(a)把树枝状分子、含贵金属的水溶液和水性溶剂混合 以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)添加足量酸性化合物把混合溶 液调至中性范围pH或生理pH；和(d)混合调好pH的混合溶液以使树枝 状分子包囊化的贵金属纳米簇得以形成。本发明还提供一种能发荧光的 肽包囊化的贵金属纳米簇的制备方法，它包括下列步骤：(a)把肽、含 贵金属的水溶液和水性溶液混合以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c) 添加足量酸性化合物把混合溶液调至中性范围或生理pH；和(d)混合调 好pH的混合溶液使肽包囊化的贵金属纳米簇得以形成。
本发明还包括为研究生物状态而使用该荧光标记的方法。本发明提 供一种监测目的分子的方法，它包括；(a)把含包囊化的贵金属纳米簇 的水溶性荧光标记附着在目的分子上，其中该荧光标记在某一可见光和 近红外波长范围内发出发射光谱；和(b)检测该荧光标记的发射光谱。 在某一实施方式中，该方法还包括把连接体分子附着在包囊化的贵金属 纳米簇上的起始步骤，其中该连接体分子能使荧光标记附着在目的分子 上。在一个优选的实施方式中，目的分子存在于生物样品中。在一个优 选的实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的是，该肽在细胞里 表达。在一个实施方式中，该肽包含融合多肽。
此处所述的强荧光水溶性贵金属纳米簇(纳米点)能借助弱汞灯的 激发以单个纳米点的形式轻易地观察到，这是因其具有极强的吸收和发 射能力(Peyser等人；Science 2001，291：103；Peyser等人，J.Phys. Chem.B 2002，106：7725)。借助可与更大的量子点相比的吸收强度，这 些强荧光和非常光稳定的纳米点，在一个实施方式中，可用作单分子和 多分子荧光生物标记。这种稳定、生物相容性的单个贵金属纳米簇的开 发，大大促进了这些光活化纳米材料作为极小的明亮的荧光团的应用。 本发明如此明亮的、容易合成的、强有力的纳米材料将会扩大单分子方 法的可利用性，因为它大大降低了实验的费用和复杂性，提供了光激活 的荧光团，该受激荧光团能从单个分子产生比现有技术多几个数量级的 光子。
此处所述的本发明的一个方面提供一种光活化生物标记的制造和表 征，该生物标记极为强力，非常明亮，同时很小又生物相容，适用于体 外和体内特异性标记，并只借助弱汞灯的激发就容易在单分子水平上观 察到。比最好的有机染料至少明亮20倍，这种亮度和合成的简易性使研 究人员能以廉价的标准灯型荧光显微镜轻易地做单分子实验。如此处所 述，产生非常明亮的、容易在单分子水平观察到的化合物只需几个到几 十个贵金属原子。因此，包囊贵金属纳米簇的合适的生物相容性支架(通 常是树枝状分子、基因优化的肽，或任何其它合适的包囊材料)使它们 很有用，并使它们成为潜在的尽可能小的体内和体外标记。
除非另行指出，此处所用的术语应按相关领域里普通技术人员的传 统使用来理解。除一些术语的定义提供于下以外，分子生物学的常用术 语的定义也可在下列参改文献中找到：Rieger等人，1991 Glossary of genetics：Classical and molecular，5th Ed.Berlin：Springer-Verlag； Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，Eds， Current Protocots，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley Sons，Inc.(1998 Supplement)。应理 解的是，说明书和权利要求书中所用的“a”或“an”可以表示单数或复 数，取决于它所处的上下文。例如“细胞”意思可以是“至少一个或至 少一种细胞”。
通过参看本发明优选实施方式的下列详细描述和此处的各实施例， 可更容易地理解本发明。但是，在公开和描述本发明的化合物、组合物、 和方法之前，应理解的是，本发明不局限于特定的贵金属、特定的多肽， 特定的树枝状分子，特定的条件，或特定的方法等等，因为它们显然可 以变化，并且对其的大量修改和变动对本领域技术人员来说都是显而易 见的。同样应理解的是，此处所用的术语只是为了描述特定的实施方式 而不是用来进行限制本发明的。
正如此处所用，“包囊材料”是指一种基质(substrate)，它能附着 于或物理性结合于一个或多个贵金属纳米簇分子上。包囊材料能提供一 种把贵金属纳米簇间接附着于目的分子上的手段，并能保护贵金属纳米 簇免于环境影响。所述附着或连接是借助于共价键、氢键、吸附、吸收、 金属键、范德华力或离子键，或者其任何组合。正如此处所用，“包囊化 的”是指一个或多个贵金属纳米簇分子能物理性结合于或包含在包囊材 料里，部分或完全分散到整个包囊材料中，或附着或连接于包囊材料上， 或其任一组合，其中所述附着或连接是借助于共价键、氢键、吸附、吸 收、金属键、范德华力或离子键、或其任何组合。
本发明包括的贵金属纳米簇可用任何合适的包囊材料来包囊，包囊 材料包括，但不局限于树枝状分子、多肽，表面活性剂、和非树枝状分 子聚合物。在一个实施方式中，树枝状分子是PAMAM树枝状分子。在另 一实施方式中，多肽包含长度为5～500个氨基酸的序列。在又一实施方 式中，多肽包含抗体。
正如此处所用，涉及树枝状分子时，例如“包囊化的”是指一个或 多个贵金属纳米簇分子能物理性结合于或包含在树枝状分子的核心里， 部分或完全分散到整个树枝状分子中，或者附着于或连接于树枝状分子， 或其任一组合，其中该附着或连接是借助于共价键、氢键、吸附、吸收、 金属键、范德华力或离子键，或其任一组合。由于树枝状分子的大小、 形状和官能团密度可以借助熟知的方法加以精确控制，因此有许多方法 可以将被运载物质(即贵金属纳米簇)结合在树枝状分子上。例如，(a) 在被运载物质和实体(通常为位于树枝状分子表面或其附近的官能团) 之间可有共价、库伦、疏水、或螯合等类型的结合；(b)在被运载物质 和位于树枝状分子内部的部分之间可有共价、库伦、疏水、或螯合等类 型的结合；(c)树枝状分子可制成其内部主要为空腔的形式，可供在该 内部(空腔)中包含(例如，物理性包含于或者结合在致密的星形树枝 状分子的内部部分)被运载物质之用，(例如，在树枝状分子里由金属离 子的螯合以及完全或不完全还原成零价态或非零价态所产生的磁性或顺 磁性核心或结构域)，这些含有磁性内部的树枝状分子可用于获得各种生 物活性实体，该实体借助磁体等能与各种树枝状分子表面复合，其中被 运载物质的释放可以可选择地用扩散控制部分挤压树枝状分子表面来控 制；或(d)可利用上述现象的各种组合。
此处所用的术语“贵金属”是指选自金、银、铜，以及铂族金属(PGM) 铂、钯、锇、铱、钌、和铑的元素组。在某些优选的实施方式中，贵金 属选自金、银、和铜。在其它优选的实施方式中，贵金属是银。在其它 优选的实施方式中，贵金属是金。在其它优选的实施方式中，贵金属是 铜。
正如此处所用，“纳米簇”是指一种2～27个金属原子的缔合体 (association)。制造的纳米簇是已知的，并且在催化剂、陶瓷、半导 体和材料科学以及其它领域中变得越来越重要。它们的重要性归因于纳 米簇中表面原子相对于内部原子的高比例。这产生了一些特性，如高的 表面反应性、增加的硬度、产率和强度、降低的延展性、低温下的液体 状性能、和与尺寸相关的化学、物理、和/或量子效应(这些效应都与其 宏观对应物的性能不同)。在其最小的组成单元，元素由单个原子组成。 分子由几个原子的简单聚集体组成，而金属和其它粗晶固体包括向外连 续延伸的三维原子阵列，即单晶或多晶晶格。原子和分子的尺度用埃来 度量，1埃为10-10m或0.1nm。微晶固体诸如金属中的晶畴一般用微米来 度量。纳米簇处于简单原子态到纳米晶态的过渡段，其直径在约0.1到 约3nm范围内。优选的是，此处所述的纳米簇包括大约2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、或27个原子。在其它优选的实施方式中，纳米簇包括约2～ 27个原子，约2～25个原子，约2～20个原子，约2～15个原子，约2～ 10个原子，或者约2～8个原子。优选包囊于包囊材料诸如树枝状分子或 肽里的纳米簇的大小可取决于所用金属的种类、想要的发射颜色、和特 定的用途。
正如此处所用，“纳米颗粒”定义为一种直径为约3到约100纳米 的粒子，具有任意大小、形状或形态，并包含此处定义的贵金属。
正如此处所用，“纳米点”是一种贵金属纳米簇，它包囊在诸如树枝 状分子或肽之类的包囊材料里，其中包囊化的贵金属纳米簇能在低激发 强度下发荧光。优选的是，在纳米簇最大激发下，包囊化的贵金属纳米 簇的荧光量子产率大于约1％，其饱和强度在约1～1000W/cm2范围内。在 某些实施方式中，荧光量子产率大于约2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、或更高。在某些实施方式中，饱 和强度为约1～1000W/cm2、约10～800W/cm2、或约10～500W/cm2。最大 激发因纳米簇而异，并至少取决于纳米簇中金属原子的种类和数目。最 大激发可由本领域普通技术人员用本领域熟知的方法不费力地测定。
正如此处所用，术语“饱和强度”是指使分子的吸收饱和且与激发 强度不再成线性关系时的强度。在分子非线性吸收的饱和强度时，多光 子吸收不再取决于那种由非线性相互作用的能量产生的强度。量子产率 定义为发射光子数与吸收光子数之比。
正如此处所用，术语“水溶性”是指在水溶液中溶解和/或形成悬浮 体的能力。尽管荧光标记可以明显溶于水溶液，但它在水溶液中至少是 暂时可分散的或能形成悬浮体。
正如此处所用，“荧光”或“发荧光的”是指一种基于某些分子在不 同波长吸收和发射光线的能力的物理现象。在第一波长光(光子)的吸 收后为第二波长和不同能量光子的发射。正如此处所用，“荧光标记”就 是这样的分子，它在第一波长吸收光，在第二波长发射不同能量的光子。 正如此处所用，“荧光标记”与“发光标记”可互换地使用，而“发荧光 的”和“荧光”分别与“发光的”和“发光”可互换地使用。照这样， 荧光包括磷光和拉曼发射，并且所有发射都由术语“发光”表示。正如 此处所用，“饱和荧光”是指在所有入射强度下分子发荧光的能力。优选 的是，荧光标记包括包囊化的贵金属纳米簇。优选的是，本发明的荧光 标记是在低激发强度(诸如由汞灯提供)激发时发荧光的。优选的是， 低激发强度为约30W/cm2(～460nm)。在其它实施方式中，激发强度可为 ＜1W/cm2到最高10kW/cm2(激发波长约330nm～900nm)。激发强度的变化 至少取决于纳米簇的大小和构成纳米簇的金属，并可由本领域普通技术 人员用本领域熟知的方法不费力地测定。尽管此处所述的荧光标记能在 诸如用弱汞灯之类的低激发能量激发时发出荧光，但在一个实施方式中， 当荧光标记用激光活化时也能发荧光。
可测定本发明荧光标记的发射光谱。原子和原子(或分子)的集合 能够借助吸收或发射能级间的能量差，依据量子力学在电子能级之间跃 迁。发射或吸收光的波长使光子带有两个轨道之间的能量差。该能量可 由普朗克常数与光速之积(hc)除以光的波长来算出。这样，某个原子 或原子集合只能吸收或发射那些取决于原子精细结构的特定波长(或相 应的频率或能量)。当相应的光通过棱镜或摄谱仪时，它按照波长在空间 分散。相应的光谱即显出连续光谱，或者叠加在连续明线上(发射光谱)。 这样，当原子受到的碰撞不多(由于低密度)时就产生发射光谱。发射 谱线对应于发射的光子，所述光子是当分子或原子的集合的激发态允许 返回低能级时发射出来的。在本发明的一个优选的实施方式中，荧光标 记的发射光谱是偏振化的。在其它实施方式中，取决于纳米簇的性能， 发射可显示不同的偏振。在某些实施方式中，包囊化的贵金属纳米簇显 示偶极发射模式。优选的是，荧光标记的光谱发射特性至少部分取决于 一种或多种选自下列的特性：所用的包囊材料、树枝状分子的级别、测 试环境的pH、形成纳米点的环境的pH、由肽序列决定的肽对贵金属纳米 簇的亲合力、纳米簇的大小，和形成包囊化的贵金属纳米簇所用的特定 贵金属。
优选的是贵金属纳米簇有不定的电荷。正如此处所用，“不定的电 荷”是指贵金属纳米簇可完全或不完全还原，或者可带负电。在某些应 用中，带有一定电荷的贵金属纳米簇可能是优选的。贵金属纳米簇的电 荷可由本领域普通技术人员用本领域熟知的方法不费力地测定。
本发明贵金属纳米簇的直径优选应低于3nm，并可小于2nm或1nm。 包囊化之后，包囊化的贵金属纳米簇的直径可在小于1nm至约为或大于 15nm范围之内。包囊化的贵金属纳米簇的大小主要取决于所用的包囊材 料。例如，在一个实施方案中，用一种抗体诸如IgG来包囊贵金属纳米 簇。此抗体的直径为约10nm。在体内成象应用上，10～50nm大包囊化的 贵金属纳米簇可由淋巴系统过滤。
正如此处所用，“树枝状聚合物”是一种显示出规则树枝状分枝的聚 合物，是通过向核心或自核心顺次或分级添加分枝层而形成的。术语树 枝状聚合物包括“树枝状分子”，其特征在于有核心，至少一个内部分枝 的层，和表面分枝的层(Dvornic & Tomalia in Chem.in Britain，641-645，August 1994)。“延展型两性分子(dendron)”是树枝 状分子的一种，其带有从焦点发散的分枝，该焦点直接或经由连接部分 连接或能连接于核心以形成树枝状分子。许多树枝状分子包含2个或多 个连接到共同核心上的延展型两性分子。但是，术语树枝状分子的含义 不仅包括单个延展型两性分子。在本发明中，优选的树枝状分子是聚(酰 胺胺)或PAMAM树枝状分子，但是，也预期使用其它树枝状分子。优选 的是，树枝状分子选自0级、1级、2级、3级、4级或更高级的树枝状 分子。树枝状分子可有各种末端，包括但不限于OH末端、COOH末端和 NH2末端。所选树枝状分子的级别因包囊化的贵金属纳米簇的特定应用而 异。
树枝状聚合物包括，但不限于，对称和不对称的分枝型树枝状分子、 级联分子(cascade molecule)、arborol等等，不过最优选的树枝状聚 合物是致密的星型聚合物。此处公开的PAMAM树枝状分子是对称的，其 中分枝臂的长度相等。在前一级分枝氨基末端的氢原子上出现分枝。
即使不是通过由有规律地逐次添加分枝层而形成，过度分枝的聚合 物(例如过度支化的多元醇)可相当于树枝状分子聚合物，其分枝模式 显示类似于树枝状分子的规律性程度。
带有大小和形状受控地结构域的拓扑聚合物是一种经由其活性末端 基团彼此连接(例如共价桥接或如下文限定的其它连接)的树枝状分子， 它们叫做“桥接树枝状分子”。当多于两个致密的星形树枝状分子聚集在 一起时，它们叫做“聚集体”或“致密星形聚集体”。
因此，树枝状聚合物包括桥接树枝状分子和树枝状分子聚集体。树 枝状聚合物包括树枝状分子的级别单分散和级别多分散溶液。在单分散 性溶液中，树枝状分子基本上全部是同一级别，因此大小和形状一致。 在多分散性溶液中，树枝状分子包括不同级别树枝状分子的分布。
树枝状聚合物也包括表面改性的树枝状分子。例如PAMAM树枝状分 子的表面可借助添加氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)来改性。
正如此处所用，当涉及树枝状分子时，术语“级别”意指添加到树 枝状分子的起始核心上的重复单元的层数。例如，1级树枝状分子包含起 始核心和1层重复单元，2级树枝状分子包含起始核心和2层重复单元， 依此类推。级别(即级数和重复单元的大小和性质)的逐次建立决定了 树枝状分子的大小及其内部。
把树枝状分子连接在生物底物上的方法是本领域技术人员熟知的， 并包括连接体分子的使用。例如，硫醇-反应性物质的制法是使树枝状分 子的羟基同双官能交联剂(N-(对马来酰亚氨基苯基)异氰酸)的异氰 酸末端偶联，留下硫醇-反应性马来酰亚胺义与蛋白质偶联。
正如此处所用，“光漂白”包括导致在激发波长产生的荧光强度降低 的所有过程。在本发明的各实施方式中，贵金属纳米簇在光漂白前发射 出大于约106、107、或108个光子。在一个更优选的实施方案中，贵金属 纳米簇在光漂白前发射出大于约109个光子。光漂白可由本领域普通技术 人员不费力地加以确定。
在本发明某些优选的实施方式中，当激发包囊化的贵金属纳米簇时， 大于约80％的贵金属纳米簇发出荧光长达约30分钟以上。优选的是，贵 金属纳米簇在连续激发能(约300W/cm2，在514.5nm或476nm)下发出荧 光。在另一个实施方式中，优选的是大于约90％的贵金属纳米簇发出荧光 长达约30分钟以上。在其它实施方式中，大于80％或大于90％的纳米簇 的荧光量子产率大于约1％，饱和强度为1～1000W/cm2，发射延续长达30 分钟以上。
在一个实施方式中，树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇用于把贵金 属纳米簇穿过细胞膜运送给能与该贵金属纳米簇强力结合的肽。与贵金 属纳米簇的结合强度可以由本领域普通技术人员不费力地测定，并包括 荧光强度的目测。在一个优选的实施方式中，树枝状分子是低级别的树 枝状分子，诸如0级、1级或2级。在其它实施方式中，树枝状分子是高 级别的树枝状分子，诸如3级、4级或更高级。在某些实施方式中，该肽 在某一pH范围内与贵金属纳米簇结合。优选的是，肽在pH10～1、更优 选在9～2，最优选在8～3范围内与贵金属簇稳定地结合。在其它实施方 式中，肽在pH9、8、7、6、5、4或3下与贵金属稳定结合。这一实施方 式允许在体外和体内容易地标记蛋白质。
“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此处包括核 苷酸的任意长度的多聚形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖 核苷酸。此术语仅指分子的一级结构；因此此术语包括三链、双链和单 链DNA，以及三链、双链和单链RNA。此术语也包括修饰型式，诸如甲基 化和/或加帽，和多核苷酸的未修饰形式。更具体而言，术语“多核苷酸”、 “寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多聚脱氧核糖核苷酸(含2- 脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它形式的多核苷酸 (嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷)，和含非核苷酸主链的其它聚合物， 例如，聚酰胺(如肽核酸(PNA))和聚吗啉代(商品名Neugene，可从 Anti-Virals Inc.Coruallis，Ore.购得)聚合物，和其它合成得序列特 异性的核酸聚合物，只要该聚合物所含核碱基的构象允许碱基配对和碱 基堆叠，如同在DNA和RNA中的那样。没有打算区别“多核苷酸”、“寡 核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间的长度，这些术语可互换使用。 这些术语仅指分子的一级结构。因此这些术语包括，例如3’-脱氧-2’， 5’-DNA，寡聚脱氧核糖核苷酸N3’P5’氨基磷酸，2’-O-烷基取代的 RNA，双和单链DNA，以及双和单链RNA，DNA：RNA杂合体，和PNA和DNA 或RNA间的杂合体，而且也包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的 标记、甲基化、“加帽”、用类似物取代1种或多种天然核苷酸，核苷酸 间的修饰，例如，用不带电的连接物(如磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷 酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电的连接物(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯 等)和带正电的连接物(如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯) 进行的修饰，用含有侧链部分的那些例如蛋白质(包括核酸酶，毒素、 抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)进行的修饰，用嵌入剂(如吖啶、补骨 脂素等)进行的修饰，用含有螯合物的那些(如金属、放射性金属、硼、 氧化性金属等)进行的修饰，含有烷化剂的那些进行的修饰，用改性的 连接物(如α异头核酸等)进行的修饰，以及多核苷酸或寡核苷酸的未 修饰形式。尤其是，DNA是脱氧核糖核酸。
这些术语还包括位于基因编码区3’和5’两端的非翻译序列：基因 编码区5’端上游至少约1000核苷酸及其3’端下游至少约200核甘酸。 不太常见的碱基，诸如肌苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黄嘌呤 及其它也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿嘧啶和胞苷的 C-5丙炔类似物的多核苷酸已被证明以强亲合力结合RNA并且是基因表 达有效的反义抑制剂。也可以进行其它修饰型式，诸如磷酸二酯主链的 修饰、或者RNA核糖基团的2’-羟基的修饰。反义多核苷酸和核酶可完 全由核糖核苷酸组成，或可混合含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本 发明的多核苷酸可用各种方法制造，包括基因组制备，cDNA制备，体外 合成，RT-PCR和体外或体内转录。
“分离的”核酸分子是一种基本上与该核酸的天然来源中的其它核 酸分子(如编码其它多肽的序列)分开的核酸。优选的是，分离的核酸 不含其天然复制子里天然位于该核酸侧翼的某些序列(如位于该核酸5’ 和3’端的序列)。例如，克隆的核酸被认为是分离的。如果核酸已由人 为干预而经过改变、或者放在不是其天然位点的基因座或位置中、或者 已经通过转染而引入细胞中，则该核酸也被认为是分离的。并且，“分离 的”核酸可以不含其天然伴随的某些细胞材料，或者当用重组技术生产 时，不含培养基，或者当化学合成时不含化学前体或其它化学品。
从“分离的核酸”定义中明确排除的是：天然染色体(诸如染色体 片段(spread))、人工染色体文库、基因组文库、和cDNA文库，它们以 体外核酸制剂或转染/转化宿主细胞制剂的形式存在，其中该宿主细胞是 体外异质制剂或者是作为单集落的异质群体而平板培养的。同样明确排 除的是其中特定的核酸在载体分子中占核酸插入片段数目不到5％的上面 各文库。进一步明确排除的是全细胞基因组DNA或全细胞RNA制剂(包 括机械切割或酶促消化的全细胞制剂)。更加进一步明确排除的是作为体 外制剂或者作为一种用电泳法分离出来的异质混合物的全细胞制剂，其 中本发明的核酸未曾进一步从电泳介质里异源核酸中分离出来(如从琼 脂糖凝胶或尼龙印迹里的异质条带群体中分割单一条带来进一步分离)。
在一个优选的实施方式中，将编码结合贵金属纳米簇的肽的分离核 酸引入细胞，该肽被表达并结合贵金属纳米簇。在某些实施方式中，编 码结合该贵金属纳米簇的肽的分离核酸也可以是嵌合或融合多核苷酸。 正如此处所用，“嵌合多核苷酸”或“融合多核苷酸”包括编码结合贵金 属纳米簇的肽的核酸，该核酸可操作地连接在第二核酸序列上。优选的 是，第二核酸序列不结合或不强力结合贵金属纳米簇，并且与编码结合 贵金属纳米簇的肽的核酸相比，既具有不同的多核苷酸序列，也编码具 有不同功能的蛋白质。在融合多核苷酸里，“可操作地连接”表示：编码 结合贵金属纳米簇的肽的所述核酸和第二核酸序列彼此相互融合，从而 使得该两个序列实现使用它们所要达到的目的。第二核酸序列可以融合 到结合贵金属纳米簇的肽的编码核酸之N端或C端上。
核酸引入细胞的方法是本领域普通技术人员熟知的，它包括，但不 限于，转染、转化或转导，电穿孔，粒子轰击，农杆菌感染等等。在某 些实施方式中，核酸整合入载体或表达盒中，然后引入细胞。核酸引入 宿主细胞的其它合适的方法可在下列文献里找到：Sambrook，等 人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，及其它实验手册如Methods in Molecular Biology，1995，Vol.44，Agrobacterium protocols，Ed：Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。
正如此处所用，“多肽”是指由肽键连接的至少4个氨基酸的链。该 链可以是线性的，分支的，环状的或其组合。术语“肽”、“多肽”和“蛋 白质”在此处可互换使用。此术语不是指产物的特定长度。所以，“肽”、 “寡肽”和“蛋白质”都包括在多肽定义之内。此术语包括多肽的翻译 后修饰，例如，糖基化，乙酰化、磷酸化等等。而且，蛋白质片段、类 似物、突变或变体蛋白质、融合蛋白质等等也包括在多肽的含义之内。
本发明还提供嵌合或融合多肽。正如此处所用，“嵌合多肽”或“融 合多肽”包括结合贵金属纳米簇的多肽，该多肽可操作地与第二多肽相 连。优选的是，第二多肽的氨基酸序列实质上和贵金属纳米簇最佳结合 多肽不一样，例如，如此处所述不稳定地结合贵金属纳米簇的多肽。如 此处所用，涉及融合多肽时，术语“可操作地连接”是用来表明两个多 肽相互融合从而使得这两个序列都能实现其所使用的目的功能。第二多 肽可以融合到结合贵金属纳米簇的肽的N端或C端上。这种多肽能促进 单分子或整体研究，并允许体内或体外肽的直接标记。
在本发明的某些实施方式中，结合贵金属纳米簇的肽之长度为约5～ 1000个氨基酸，1～800个氨基酸或5～500个氨基酸。在某些实施方式 中，肽的长度为约5～10个氨基酸。在其它实施方式中，肽的长度为约 10～20个氨基酸或20～40个氨基酸。在一个实施方式中，肽包含如SEQ ID NO.1中定义的多肽序列。
本发明还包括具有上述特性的包囊化的贵金属纳米簇的制备方法。 在一个实施方式中，树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇的制备方法包括 下列步骤：(a)把树枝状分子、含贵金属的水溶液和水性溶剂混合以产 生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)接着添加足量酸性化合物把混合溶 液调至中性范围pH；和(d)混合调好pH的混合溶液使树枝状分子包囊 化的贵金属纳米簇得以形成。在第二个实施方式中，能发荧光的肽包囊 化的贵金属纳米簇的制备方法包括下列步骤：(a)把肽、含贵金属的水 溶液和蒸馏水混合以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)接着添加足 量酸性化合物把混合溶液调至中性范围pH；和(d)混合调好pH的混合 溶液使肽包囊化的贵金属纳米簇得以形成。
在这些方法中，把还原剂添加到混合溶液里以使贵金属纳米簇光活 化。优选的是，还原剂选自化学还原剂、光或其组合。在这些方法的某 些实施方式中，光可用作还原剂以使贵金属纳米簇光活化。在这些方法 的某些其它实施方式中，化学还原剂可用作还原剂。在一个实施方式中， 光与还原剂组合使用以使贵金属纳米簇光活化。优选的是包囊化的贵金 属纳米簇的制备方法是在约65°F～100°F的温度下实施的。更优选的 是，从步骤a)到步骤c)，混合溶液的温度是约68°F到约80°F，更优 选的是约68°F到约74°F。
优选的是，用于制备该化合物的含贵金属的水溶液选自AgNO3、 HAuCl4·nH2O和CuSO4·nH2O。在一个实施方式中，含贵金属的水溶液是 AgNO3溶液。在另一实施方式中，含贵金属的水溶液是HAuCl4·nH2O溶液。 在另外的实施方式中，含贵金属的水溶液是CuSO4·nH2O溶液。
在一个实施方式中，含贵金属的水溶液是HAuCl4·nH2O，还原剂添加 到混合溶液里，搅拌调好pH的混合液至少1小时，形成树枝状分子包囊 化的金纳米簇。在另一实施方式中，搅拌调好pH的混合液至少48小时， 使其形成树枝状分子包囊化的金纳米簇。在另一实施方式中，包囊化的 贵金属纳米簇是经由光还原(经由可见光或紫外光照射)，从而形成树枝 状分子包囊化的金、银或铜纳米簇。
在另一个实施方式中，当包囊材料是肽时，优选的是，步骤(a)中 贵金属与肽之摩尔比为约0.1∶1。在另一个实施方式中，步骤(a)中贵 金属与肽之摩尔比小于约0.1∶1，在其它实施方式中大于0.1∶1，并可为 1∶1或更大。
在某些实施方式中，包囊化的贵金属纳米簇荧光标记存在于生物样 品中。在某些优选的实施方式中，包囊贵金属纳米簇的肽在细胞里面表 达，也叫做“基因编程”。如此处所用，术语“表达”包含肽的转录和/ 或翻译。在另外的实施方式中，把包囊贵金属纳米簇的肽引入生物样品。 如此处所用，“生物样品”是指分离的细胞、组织或流体的样品，包括但 不限于，例如血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠 道、和生殖泌尿道的外面部分、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器 官、还有体外细胞培养组分的样品(包括但不限于，细胞在培养基中生 长所产生的条件培养基、推定的病毒感染细胞、重组细胞、和细胞组分)。 荧光标记可用于来自任何种类生物的细胞，其中该生物为原核生物或真 核生物。在本发明优选的实施方式中，该生物是真核生物。本发明真核 细胞的非限制性例子包括那些来自动物、植物、真菌、原生生物、和其 它微生物的细胞。在某些实施方式中，该细胞是多细胞生物(如植物或 动物)的一部分。
如此处所述，包囊化的纳米簇组合物以及树枝状分子大小或肽序列 的选择都会影响半导体纳米晶的特征发射光谱波长。所以，本领域普通 技术人员会意识到，此处所述纳米点的特定组成要根据待监测的光谱区 来选择。例如，可以设计在可见光区、或者在红光、蓝光或近红外区发 射能量的纳米点。在一个实施方式中，随着纳米簇尺寸的减小，包囊化 的贵金属纳米簇显示能量发射越来越强。
本发明的水溶性包囊化的贵金属纳米簇在经常使用其它不太可靠的 标记方法的各种测定方法中获得应用，这些测定方法包括但不限于，荧 光显微术、组织学、细胞学、病理学、流式细胞术、FISH和其它核酸杂 交测定法、信号放大测定法、DNA和蛋白质序列测定、免疫测定法诸如竞 争性结合测定法和ELISAs、免疫组织化学分析、蛋白质和核酸分离、同 质性测定、多聚化(multiplexing)、高流通量筛选、染色体核型分析等 等。上述包囊化的贵金属纳米簇荧光标记在可接受环境中可用于各种基 于报道分子的测定法。
在某些优选的实施方式中，本发明的包囊化的贵金属纳米簇荧光标 记用于单分子或多分子研究。本发明包含一种监测目的分子的方法，该 方法包括：(a)把包含包囊化的贵金属纳米簇的水溶性荧光标记附着在 目的分子上，其中所述荧光标记发出发射光谱；和(b)检测所述荧光标 记的发射光谱。如此处所用，检测发射光谱包括测定荧光标记的光发射 性能。单分子研究能允许测定局部环境的各个层面，从信号强度、定向 和寿命，一直到分子的发射光谱和与邻近分子的能量传递程度。单分子 研究已经用于操作个体分子并测量由分子马达或共价键产生的力。新探 针技术的开发为实时观测活细胞里分子的相互作用和交换创造条件。这 些工具使群体的个体成员在细胞亚群和亚结构里得到观察、鉴定和定量 比较。单分子研究具有提供空间和时间信息的潜力，这些信息是使用其 它更加静态的技术不可能获得的。单分子研究能够测量单个分子在细胞 内空间的体内动态移动，或者在一个延长的时段内观察单个分子的行为。 通过使用单分子方法，应该能够研究细胞集群里个体成员的时间轨迹和 反应途径而不用算出在群体的平均值。细胞过程，诸如胞吐、经通道的 流出、或转录复合物的装配都能目视观察。由等位基因多态性产生的在 结构或功能方面的个体差异，理应能在单分子层次探测出来。而且，使 用这些技术能够对特定组织里或者在某些发育阶段的基因或基因组的协 调表达实施监测。照此，包囊化的贵金属纳米簇荧光探针的使用，就为 提供生物状态信息的光谱发射之测定创造条件。如此处所用，“生物状 态”是指进行条件测定，诸如生物部分的定量和定性存在；生物部分的 结构、组成和构象；生物部分在环境里的定位；生物部分之间的相互作 用，生物化合物结构的改变和细胞过程的改变。
本发明的方法和组合物还包括连接体分子的使用，其中连接体分子 能使含有包囊化的贵金属纳米簇的荧光标记附着在目的分子上。
克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，涉及DNA连接酶、DNA聚 合酶、限制性内切核酸酶等等酶促反应的标准技术，和各种分离技术都 是已知的，而且是本领域普通技术人员普遍使用的。大量的标准技术在 下列文献中有描述：Sambrook等人，1989 Molecular Cloning，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等人，1982 Molecular CLoning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(ed.)1993 Meth.Enzymol.218，Part I；Wu(ed.)1979 Meth Enzymol.68；Wu等人，(Eds.)1983 Meth. Enzymol.100 and 101；Grossman & Moldave(Eds.)1980 Meth.Enzymol.65；Miller(ed.)1972 Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring，Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old and Primrose，1981 Princeples of Gene Manipulation，University of California Press，Berkeley；Schleif & Wensink，1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover (ed.)1985 DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK；Hames & Higgins(eds.)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press Oxford，UK； 和Setlow & Hollaender 1979 Genetic Engineering：Principles and Methods，Vols.1-4，Plenum Press，New York.所用的缩写词及术语在本领 域中被认为是标准的，并且普遍用于此处所引用的专业杂志中。
在整个申请文件中，参考了多种出版物。所有这些出版物及其中的 引用文献的公开内容都以其整体引用作为参考，以便更充分地描述本发 明所属技术领域的状态。下列各实施例不是用来限制本发明权利要求的 范围，相反是为给某些实施方式作例证的。熟练技术人员想到的对所实 施的方法之任何改变都被属于本发明范围以内。
实施例
实施例1
树枝状分子包囊化的银纳米簇的产生
方法
PAMAM从溶液中螯合金属离子的作用是已知的(Crooks等 人，Accounts Chem.Res.2001，34：181；Ottaviani等人，Macromolecules 2002，35：5105；Zheng等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：1252；Varnavski等 人，J.Chem.Phys.2001，114：1962)。PAMAM G4-OH和G2-OH树枝状分子(分 别为4级和2级羟基封端的聚(酰胺胺)，Aldrich)因而被用来浓缩、 稳定和溶解Ag纳米簇于充气和脱气两水溶液中。通过把0.5μmol G4-OH和1.5μmol AgNO3溶于1ml蒸馏水(18MΩ)并用160μmol乙酸 把溶液调到中性，银离子就很容易地与树枝状分子相互作用。通常当生 成小纳米颗粒(直径＞3nm)时，文献记载的制备方法通常添加少量还原 剂诸如NaBH4(Crook等人，Accounts Chem.Res.201，34：181；Ottaviani等 人，Macromolecules 2002，35：5105；Zheng等人，J.Phys.Chem.B 2002， 106：1252；Varnavski等人，J.Chem.Phys.2001，114：1962)。为产生树枝 状分子包囊化的纳米簇(“纳米点”)而不是纳米颗粒，反应中是不加还 原剂的。探测这类溶液荧光的方法是，在环境空气、氮气、和/或真空(10～ 5乇)条件下把10ml溶液滴加在清洁的盖玻片上，用带通滤过的汞灯之 蓝光(450～480nm)照射，通过标准的落射荧光显微镜来探测。其结果 不受氧化程度或树枝状分子产生的影响。
结果
起初，看不到这类溶液的可见吸收或荧光，但在暴露于白光前后由 溶液吸收光谱清楚地阐明了光活化(Fig。1A)。起初，光谱上只有树枝 状分子的单一吸收(284nm)。光活化后，由于光还原的小的银纳米点(Ag2～ Ag8)的吸收，溶液显示出两个新峰(345nm和430nm)(Rabin等 人，G.Chem.Phys.Lett.1999，312：394；Bonacic’-Koutecky等人，J.Chem. Phys.2001，115：10450)。光活化中同时生成的小的银纳米点的大小和几 何形状差别产生了整个可见光区的多种颜色荧光。这种大小的银纳米簇 是唯一已知的强可见光吸收和发射之物(Rabin等 人，G.Chem.Phys.Lett.1999，312：394；Bonacic’Koutecky等人，J.Chem. Phys.2001，115：10450；Linnert等人，J.AM.Chem.Soc.1990，112：4657； Mostafavi等人，Chem.Phys.Lett.1990，167：193)。光活化的荧光纳米 点溶液的质谱分析确认了这样小的尺寸(Fig.1B)。氢硼化物-还原的溶 液产生了较大的银纳米颗粒(3～7nm)，它有特征性的表面等离子的强吸 收(398nm)，但基本上没有荧光(Fig.1A)。所以，因为只出现不带等离 子吸收的荧光银纳米点，故它们应该远小于3nm，并且可能小于2nm。
与吸收的变化相关，当银离子在树枝状分子主体内光还原时，荧光 随照射时间的增加而增强。在约6秒钟之内，经少量连续的光活化，视 野就被闪烁的单个荧光粒子填满(Figs 2A～D)。这种很亮、很稳定的荧 光特性是被高度偏振的并显示出清晰的偶极发射模式(Fig.2E；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B 1999，103：11237)和单个发射物的闪烁动 态特性(Lu等人，Science 1998，282：1877；Dickson等人，Nature 1997，388：355；Hu等人.J.Am.Chem.Soc.1999，121：6936)。在此银-限 定的环境中完成光活化后，荧光银-树枝状分子纳米点在平均发射强度和 光谱特性两方面都保持非常稳定。因此与在AgO膜上相比，树枝状分子 稳定了纳米簇并提高了其光学性能(Peyser等人，Science 2001，291：103； Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：7725)。因为小Ag纳米簇的 结合能小于激发能，树枝状分子的笼效应可能类似于稀有气体基质的笼 效应(Rabin等人，Chem.Phys.Lett.1999，312：394)，通过防止光解离以 稳定并提高纳米簇荧光。尽管已知AgO膜上的Ag纳米簇荧光能被水焠灭 (Mihalcea等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123：7172)，但是树枝状分子- 包囊化的银纳米点在水溶液中却是强荧光性的且相当稳定。所以，光化 学法制成的Ag纳米簇在树枝状分子内同样已被保护，从而避免与溶液中 的焠灭剂起反应。
上述光活化的纳米点溶液的电雾化电离质谱(ESI-MS)显示出树枝 状分子+Agn(n＝2～4)的强力富集化，其富集程度胜过末光活化的因此 是非荧光性的纳米点溶液(Fig 1B)。在未光活化的纳米点溶液中，树枝 状分子+Ag2和较大的纳米簇峰没能观察到，这清楚地表明，只要溶液受 到光活化，就有来自树枝状分子-包囊化的Ag纳米簇(大小为2～8个原 子)的发射(Zheng & Dickson，J.Am.Chem.Soc.， 2002，124：13982-13983)。
与研究AgO膜上的纳米簇(Peyser等人.Seience 2001，291：103； Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：7725)相反，单个纳米簇的 光谱测定很容易在这些可溶性树枝状分子-包囊化的银纳米点上进行。尽 管AgO上的Agn在整体光谱方面与纳米点水溶液难区分(Fig.3)，但是同 整体纳米点试样或AgO膜上的单个纳米簇相比，单个Ag纳米点具有更窄、 更稳定的发射光谱(Fig.3)。由于AgO膜上的纳米簇大小因激发而频频 改变，所以单个纳米簇显示出较大的谱移(Peyser等人，Science 2001， 291：103；Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：7725)。相反，从 这些高度分散的树枝状分子-包囊化的的银纳米点得到了5条稳定且易于 区分的荧光光谱(Fig.3)，这表明整体光谱是由少至5种尺寸的纳米簇 决定的。室温下单个纳米点荧光光谱比整体纳米点膜或溶液的光谱显著 狭窄，并且没有出现明显的光谱扩散。由于没有另外的银能整合到纳米 点里及树枝状分子稳定了纳米点荧光，所以单个纳米点的发射是相当稳 定、强劲的，最大值在533nm、553nm、589nm、611nm、和648nm，不过 易于见到荧光间歇现象。与II-VI纳米颗粒相比，这些纳米点颇为光稳 定，有约80％的个体特点在300W/cm2(514.5nm或476nm)的连续激发下 保持荧光＞30分钟。只是在小尺寸的纳米点上观察到了纳米点光活化、 闪烁、偶极发射模式、光谱稳定性、质谱测定法和荧光，这进一步证实， 尺寸小于8个原子的单个树枝状分子-包囊化的Agn纳米簇导致了所观察 到的发射。类似方法制备的无树枝状分子的溶液或者无银的溶液中就看 不到荧光。对溶解度和稳定化至关重要的是，树枝状分子包囊和保护纳 米簇，产生强发射并提供防止进一步光还原/纳米簇生长的银-限定环境 (silver-limited environment)。
通过这些方法，以及通过环境条件下的直接光还原，一种十分光稳 定的水溶性银纳米点业已在树枝状分子里成功地产生。这种银纳米点在 水溶液和膜中都相当稳定和具有强荧光性，而且借助弱汞灯激发 (30W/cm2)容易在单分子水平观察到。借助树枝状分子附着的合成控制 (例如，可把树枝状分子羟基偶联到双功能交联剂N-(对马来酰亚氨苯 基)异氰酸的异氰酸末端，保留硫醇-反应性马来酰亚胺用于与蛋白质偶 联，从而制备硫醇-反应性物质)，这种简单的纳米材料可能用作生物标 记，从而能更广泛地进行单分子研究，而无需昂贵的激光源。光漂白前 强烈的光活化发射和非常长的寿命，使它们成为用于研究化学和生物系 统的有吸引力的新型纳米材料。
实施例2
单个Ag纳米点的表征
一系列PAMAM树枝状分子级别[GO-OH到G4-OH，直径(MW)从1.5nm (517g/mol)到4.5nm(14，215g/mol)]用来产生有强荧光性的Agn纳 米点。极亮的荧光在pH8.0～3.0范围内看到。这些不同级别的PAMAM 能成为控制纳米簇分布的一种手段：用小级别树枝状分子产生的纳米点 与用大级别树枝状分子产生的纳米点显出不同的发射光谱。纳米点发射 不仅在光谱和强度方面非常稳定，而且显出带有十分清晰和稳定的偶极 发射模式的高度偏振发射(Fig2E)。发射模式的观测使得使用三维取向 法成为可能，该方法的开发是来跟踪溶液或固定特征方面的取向动态特 性，如下列文献所述：Bartko & Dickson，J，Phys.Chem，B 1999，103：3053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem，B1999，103：11237 -11241；及Bartko等人，Chem，Phys，Lett.2002，358：459-465.
这些单个Ag纳米点的许多光物理参数也已被表征鉴定(Fig，4A)。 虽然远小于量子点，在低激发强度(30W/cm2460nm，紧邻450nm激发高峰) 下由极短荧光寿命产生极亮的纳米点荧光。在仪器响应去褶后，用来自 双重Ti：蓝宝石的400nm激发，时间相关单光子计数测定个体纳米点寿 命，显示出一个主要的亚100ps部分(92％)。纳米点也有一个较慢(1.6 纳秒)衰变部分。极快的松驰表明基态与激发态间有极强的联系，因而 产生一个来自在极小(几个原子)纳米簇的极强的跃迁动量。
单个纳米点的吸收截面是通过饱和强度测定法测定的(Fig，4B)。 这些纳米点与明确表征的单个DiIC18分子相比较，该分子有熟知的饱和 强度，寿命、及荧光量子产率(Macklin et al，Science 1996，272： 255-258)。这些实验指出：Ag纳米点的吸收截面比最佳有机染料强约 20倍，几乎和最佳CdSe量子点相等。加之，通过单个DiI分子和单个纳 米点两者的吸收光子总数的比较，其纳米点荧光量子产率计算的低估计 值至少为约30％。另外，这些Ag纳米点显示出至少可与更大的II-VI量 子点相当的光稳定性，带有＞90％的个体特征，在300W/cm2连续514.5-nm 激发保持发荧光＞＞30分钟。当发射＞106个光子/秒接近饱和时，通常 持续大于1小时的连续光激发，典型的单个纳米点在光漂白前发射的光 子大大超过109。这比最佳有效染料发射的总光子数大两个数量级。因此， 这些纳米点有机会探测广泛范围内生物系统短期和长期单个分子的动态 特性。
于是，通过环境条件下直接光还原，一种树枝状分子-包囊化的水溶 性银纳米簇(Ag纳米点)业已产生。这种银纳米点在溶液和膜中都相当 稳定，且当激发紧邻吸收峰450nm时，通过弱汞灯激发(30W/cm2)，可在 单分子水平上进行观察。通过树枝状分子附着的合成控制，这种简单的 纳米材料作为生物标记是很有用的，从而使单个分子研究，不用昂贵的 激光源，得以极广泛地应用。光漂白前强烈的光活化发射和极长的寿命， 使这些有吸引力的新纳米材料用于研究生物系统。
实施例3
树枝状分子包囊化的金纳米簇的产生
以前的研究已产生了有荧光性的，表面钝化的金纳米簇，其大小从 28个原子到更小粒子(＜1.2nm)，并具有近红外(Link等人，J，Phys， Chem.B2002，106：3410-3415)，红的(Huang & Murray，J.Phys.Chem.B 2001，105：12498-12502)和蓝的发射(Wilcoxon等人， J.Chern，Phys.1998，108：9137-9143)，随着纳米簇粒径的减小有越来越 高的能量发射。尽管与整体金膜相比有百万倍增强的荧光量子产率φF的 Au纳米簇业已产生，(Mooradian，A.Phys.Reu.Lett.1969，22：185-187) 10-3～10-4量子产率和多分散的纳米颗粒粒径分布已使它们不能当做有效 的荧光团(Link等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem.B 2001，105：12498-12502)。本发明公开了一 种水溶性单分散的蓝-发射Au8纳米点，当其由生物相容性PAMAM树枝状 分子(Tomalia，Sci，Am.1995，272：62-66)包囊化和稳定时，显示出41 ±5％的荧光量子产率，比其它已报道的金纳米簇(Link等人，J.Phys. Chem，B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.CHem B2001，105：12498-12502)提高不止100倍。较大的Aun纳米点，带有全 可见区强发光，也已产生。
2级和4级的OH-封端PAMAM(G2-OH和G4-OH，Aldrich)适用于稳 定和加溶处于水和甲醇两溶液中的金纳米簇。通过把0.5μmol G4-OH或 G2-OH和1.5μmol HAuCl4·nH2O(Aldrich)溶于2ml蒸馏水(18MΩ)， 通过向溶液中慢慢加入等量NaBH4，金离子就螯合到树枝状分子里并被还 原。还原了的金原子聚集在树枝状分子里形成小纳米点(树枝状分子-包 囊化的纳米簇)和大纳米颗粒。溶液搅拌两天直到反应和聚集过程完结。 接着，溶液经由离心作用(13,000g)纯化以除去大金纳米颗粒(Crooks 等人，Accounts Chem.Res.2001，34：181-190；Esum等人.Langmuir 1998，14：3157-3159)，留下一种无色透明的金纳米点溶液。尽管比纯树 枝状分子峰(285nm)弱(见Fig，5A)，但减去纯树枝状分子吸收后仍得 到一清晰的树枝状分子包囊化的金纳米簇吸收光谱。由Fig.5B可见，一 条新吸收谱带384nm(带宽～60nm，FWHM)出现在最后的荧光金纳米点溶 液中。与大金纳米颗粒的吸收光谱相反，没有看到此溶液的表面等离振 子吸收(520nm)，表明该纳米点小于～2nm(Crooks等人，Accounts Chem， Res，2001，34：181-190；Esumi等人，Langmuir 1998，14：3157-3159)。
清楚地看到了这些树枝状分子包囊化的金纳米点溶液的强蓝色荧光 (激发峰384nm，发射峰450nm)(Fig6)。荧光激发峰和带宽与纳米点吸 收谱带(Fig 5B)完全一样。在相同的合成条件下，G2-OH和G4-OH树枝 状分子产生无法区别的荧光溶液，可是G0树枝状分子却只产生一种带有 黑色金粒的非荧光溶液。这种多相溶液使人们认为，不象较大的2级和4 级产物，小的0级树枝状分子产物不足以保护和稳定金纳米簇。惹人注 目的是，对于384-nm激发，G4-OH和G2-OH包囊化的金纳米点的累积荧 光量子产率为41％±5％，用同样发射硫酸奎宁为参照。该量子产率在甲醇 中进一步增加到52％±5％。发射的时间相关性显示，有两个寿命部分(Fig， 7A)是金纳米点发射的特征(Link等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：3410-3415)。短寿命部分为7.5ns，在发射中占优势(93％)，可 能起因于金纳米点的低位d轨道和激发sp能带间的单态跃迁。长寿命部 分(2.8μs，7％)可能是由于三态单态能带内跃迁(Link等人，J.Phys. Chem，B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem.B 2001，105：12498-12502)。
清楚的树枝状分子结构使通过电雾化电离(ESI)质谱法分析包囊化 的纳米簇的粒径成为可能。如Fig，7B所示，Au8是荧光溶液中的主要含 金组分而其丰度直接与荧光强度有关，与试样制备无关。取决于还原条 件，在质谱中能出现Au浓度、树枝状分子级别，及不同的含金峰。在所 有情况(＞20个各种制备试样)下，蓝荧光强度仅仅与质谱中看到的含 Au8粒子之丰度有关.与稳定的有8个价电子的纳米簇一致(每个Au原子 有1个；Lin等人，Inorg.Chem.1991，30：91-95)，此主要纳米簇被证实 是处于总体中性氧化态，因为即使100倍过量强还原性BH4 -也没改变该纳 米点的荧光。当溶于D2O而不是H2O时，通过相对于树枝状分子母体峰的 预期谱移证实，还发现有5个水分子与亲水性PAMAM树枝状分子-Au络合 物缔合着。5个水分子可认为是有利数值，同时在其它同样制备的试样的 质谱中也看到对应于有1～6个水分子的Au8的较小的峰。这些含Au8的峰 仅在有荧光性的Au纳米点溶液中看到，而且不同方法制备的溶液之荧光 强度仅仅与该Au8纳米点峰的相对丰度成正比。加之，使用HAuCl4和AuBr3 两者的Au纳米点制剂产生带有完全一样质谱的无法区别的荧光性溶液。 这就表明，该高效蓝发射起因于Au8纳米点。各种颜色的发射可以通过调 整Au：树枝状分子的相对浓度以产生较大的Au纳米点而发生。
如上所述，来自金纳米点的发光，被认为是由d满带与sp导带间的 跃迁引起的(Link等人.J.Phys.Chem.B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem，B 2001，105：12498-12502；Mohamed等人，Chem. Phys.Lett.2000，317：517-523)。随纳米簇粒径减小，各谱带中分立态 间的间隔加大，导致相对于更大纳米点的荧光的蓝移。比不同方法制备 的较大纳米簇大不止100倍的荧光量子产率的提高可能起因于两个因素。 存在于极小Au8纳米簇的态的低密度使内部无辐射松弛路径最少化。加 之，更大树枝状分子笼更好地保护这些纳米簇/纳米点免于在溶液中猝 灭。这后一解释是来自于0级树枝状分子产物不能稳定有荧光性的Au纳 米点。另外，纯化了的溶液中，没有大的金纳米颗粒以猝灭纳米点荧光 (Dulkeith等人，Phys.Rev.Lett.2002，89，art，No-203002；Haang & Murray，Langmuir 2002，18：7077-7081)。
总之，单分散性Au8纳米点是在树枝状分子PAMAM水溶液中合成并稳 定化的。Au8纳米点显示出强的粒径特性发射，其水溶液中的量子产率实 测为～41％。金纳米点作为一种新荧光团的实际应用，由于量子产率不止 100倍的提高而变得可能。
实施例4
树枝状分子-包囊化的铜纳米簇的产生
OH封端PAMAM的2级和4级产物(G2-OH和G4-OH，Aldrich)用于 稳定和加溶处于水和甲醇两溶液中的铜纳米簇。通过把0.5μmol G4-OH 或G2-OH和1.5μmol硫酸铜溶于2mL蒸馏水(18MΩ)，通过向溶液中慢 慢加入等量NaBH4，铜离子就螯合到树枝状分子里并被还原。被还原的铜 原子聚集在树枝状分子内部并形成小纳米点(树枝状分子-包囊化的纳米 簇)和大纳米颗粒，留下一种黄色透明的铜纳米点溶液。
清楚地看到了这些树枝状分子包囊化的铜纳米点溶液强的蓝色荧光 (激发峰392nm，发射峰470nm)(Fig，8)。用不同级别的PAMAM树枝状 分子产物重做这种实验并测定其发射和激发光谱。测定各级树枝状分子 包囊化的铜纳米簇的量子产率。用电雾化电离(ESI)质谱法分析包囊化 的纳米簇的粒径。取决于还原条件、铜的浓度，和树枝状分子级别，各 种含铜峰出现在质谱中。树枝状分子包囊化的铜纳米簇的进一步表征的 实施，如实施例5-6对树枝状分子包囊化的银纳米点所述的。
实施例5
水溶性光活化的荧光Ag纳米点产生的最优化和控制
树枝状分子和化学还原剂通常用于合成大的金属和半导体纳米颗 粒，而更小的Ag纳米点却能不费力地合成，就是把0.5mM AgNO3水溶液 添加到所需的PAMAM树枝状分子溶液(适当摩尔比，pH调至中性)中。 通常，不加化学还原剂，靠慢慢加入少量NaBH4来防止光活化也可得到类 似的结果。在没加任何化学还原剂的溶液中，该混合物只要保存在暗处， 就看不到可见吸收且没有荧光。但是，经用一未滤光的100W汞灯光活化 整个溶液5分钟后，可见吸收(～450nm)和强荧光二者都出现。当该溶 液通过显微镜高强度照射时在小体积内发生更快的光活化。
虽然此纳米点合成方法做得很好，可是此法产生一种分布很宽的带 有全可见区荧光的纳米点。为使合成纳米点的分布变窄，必须使光谱性 能与产生条件发生连系。某些纳米簇粒径可能在特定的激发和浓度条件 下优先产生。例如，有人指出总荧光强度和总体发射颜色是和所用树枝 状分子级别非常相关的：0级树枝状分子产物在低Ag∶树枝状分子比 (0.3∶1)时主要产生黄和绿色强荧光纳米点，而4级PAMAM则需要更高 的Ag：树枝状分子比(3∶1)以产生全色纳米点。在与0级～4级或高 级树枝状分子起反应中，通过调节Ag∶树枝状分子比和总浓度两者来使 反应条件最佳化。工作在各树枝状分子级别只是刚开始产生荧光的比例 下，最小的发射纳米簇之浓度会优选提高。用不同波长范围对等分量的 各溶液照射不同时间。把这些溶液与那些经由亚化学计量添加NaBH4溶液 制得的溶液相比，以对照化学和光还原方法。用电雾化电离质谱法测定 等分量的各试样溶液并与来自未光活化的溶液之信号对照。用荧光显微 术和ESI-MS的平行分析来鉴定最小纳米簇的光谱特征。
此组实验会帮助阐明Ag纳米簇在纳米点试样中的分布。因为纳米点 只含几个原子，纳米点粒径可能至少会粗略地遵守泊松统计规律(小数 统计)，给出每个树枝状分子可预测的银原子数。但是泊松统计是假设不 存在其它干扰以偏离计数统计。因为不同纳米簇在不同情况下大体上稳 定，调整纳米点产生条件会得出修正的泊松分布，对鉴定各粒径纳米点 的性能，有关总数作出实验验证是重要的。在给定浓度下，调节浓度应 改变这个由反应进度调节的有关总数。偏离泊松统计规律将是相对平衡 浓度和特定纳米簇粒径优选稳定的一个直接量度。所以，对于给定量的 树枝状分子改变Ag的浓度用质谱法和荧光显微术测定在光活化前后各该 混合物将会提供关于控制纳米点形成的平衡常数之详细信息。这些实验 将会决定所需的Ag浓度来优选产生一种在该纳米点范围内想要的银纳米 簇和各级PAMAM的平衡常数。
加之，利用彩色CCD摄象机和荧光分光计，在荧光显微镜视野中对 某一给定颜色的纳米点进行计数。图象的模拟、拟合、和处理软件已记 载于IDL(Interactue Data Language Research Systems Inc.)。一个 开放的程序设计环境对图象和数学处理来说是理想的。测量单个分子荧 光光谱可能是一种冗长乏味的工作方法，单个纳米点的一个代表性试样 用分光计来探测以决定给定试样中不同的发射纳米点的数目。只要光谱 纯度和单个纳米点发射窄度确定，便用彩色CCD摄象机来对单个的特征 计数。一种带标准镶嵌滤光器产生彩色图像的单片式CCD，用4个像素(1 红，1蓝，2绿)生成一个复合彩色像素。在单片彩色CCD上受衍射限制 的小部件不能覆盖足够的像素以产生准确颜色。当用此摄象机检测时， 由于通过不同数目的红、蓝和绿像素检测，任何试样位置的小变化实际 上会记录成发射的颜色变化。由于各特征尺寸小，三片式CCD将会提供 准确的颜色信息。采用三片式CCD，每个粒子的发射颜色将被鉴别，而用 户编制的粒子计数软件将被用来自动检点各色纳米点的数目。来自单个 纳米点的荧光颜色分布将与各光活化或化学还原的溶液的质谱发生连 系，以在各类纳米点溶液内的特定纳米簇粒径指定颜色。分光计将会表 征鉴定纳米点发射的谱宽，而CCD只提供综合颜色，但带有高灵敏度和 时间分辨率。因此，为了准确表征鉴定单个纳米点，及起因于某组产生 条件的纳米点分布，它们的组合是重要的。
实施例6
特定Ag纳米点尺寸合成的最优化
已知的PAMAM树枝状分子和Ag离子及原子的pH敏感性，可用来控 制Ag纳米簇尺寸、因而控制光谱性能。已知PAMAM的尺寸随pH的降低 而增大(Kleinman等人，J.Phys.Chem.B 2000，104：11472-11479；Lee 等人，Macromolecules 2002 35：4510-4520；及Bosman等人，Chem. Rev.1999，99：1665-1688)。此粒径变化使树枝状分子外部显然更加可渗 透，且在其表面产生较大空腔来容纳纳米簇甚至纳米颗粒。在高pH下， 树枝状分子相当紧密，从而使离子不能到达树枝状分子核心。此尺寸行 为很好地配合了银对碱性环境的偏爱。因此，Ag离子和金属纳米簇在树 枝状分子内部与碱性的胺强相互作用。随着pH降低，Ag向树枝状分子内 部的分配会明显增多。在酸性pH下提高了的树枝状分子渗透性和银易与 树枝状分子内部相互作用两者都使人认为较大的纳米簇理应在低pH下更 易形成。由于pH对高级树枝状分子具有更明显的作用，对4级产物G4-OH和G4-NH2 PAMAM树枝状分子的pH研究将会实施。此方案用来把纳米点的 尺寸分布优先转移到较大和较小的尺寸。作为pH的一个函数，测量整体 吸收和发射光谱，如上所述对给定颜色的单个纳米点计数。作为树枝状 分子级别和pH两者的函数，测定纳米点分布以便获得控制纳米点的光谱 性能。只要纳米点产生，就使pH返回到7，以测定形成的纳米点在PAMAM 主体中的稳定性。对全部上述溶液做ESI-MS，使纳米点试样的光学性能 的变化与Ag纳米簇粒径的变化直接发生连系。同时，这些方法将能测定 那些涉及PAMAM树枝状分子内特定Ag纳米簇粒径的光谱性能。
树枝状分子-包囊化的纳米点的光物理表征
对时间范畴内的纳米点做整体寿命测定，使用倍频钛蓝宝石激光器 作为激发(400nm、82MHz重复率、200fs脉冲宽度)、10GHz Si光电二极 管、和20GSample/sec数字示波器，在每个方式中，此组合能以50ps时 间分辨率采取样点。此快速检测系统足够灵敏地通过光学显微镜为整体 试样工作。但是，对于单个纳米点，使用一种时间相关单光子计数板 (Picoquant)和较慢但很敏感的雪崩光电二极管，两者都受APD抖动的 限制到～300ps的寿命。通过仪表响应的去褶，Ag纳米点的主要荧光寿 命部分测定为～100ps。所以，对来自Ag纳米点组较亮的发射，亚100ps 寿命的快速测定就使用这一更快的检测系统。如有多寿命存在，则有时 间范畴法来使各种时间组分去褶是相当直接的。
吸收截面测定的方法是，通过与单个DiIC18分子相比，一种带有非 常明确表征的吸收截面的染料和一种在单分子态以其为工作对象的染料 (Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B1999，103；3053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B1999，103：11237-11241；和Bartko等人， Chem.Phys.Lett.2002，358：459-456)。通过鉴定闪烁物种和那些同时 显示的偶极发射模式来确认单分子性能，便于避免给定试样中不知其准 确浓度，和简单测定已知吸收截面的单分子之吸收强度，并比较饱和强 度。在给定的试样中，利用个体纳米点光谱，在给定纳米点溶液范围内 的分布、及其相应的吸收截面的组合，测定各纳米点品种的浓度。这将 用于测定在给定溶液中给定颜色纳米点的光密度，并通过利用树枝状分 子和银的初始浓度来测定纳米点形成的平衡常数。
利用各粒径纳米点的测得的浓度及其对总溶液吸收的贡献，来测定 给定纳米点类型的光密度。通过与罗丹明6G甲醇溶液的比较，制备相同 光密度的纳米点溶液。通过在和标准罗丹明溶液等同的纳米点光密度之 波长激发下测定荧光量子产率。罗丹明荧光强度与所需纳米簇荧光强度 (当在其特征光谱窗范围内查看时，在考虑到来自溶液中其它纳米簇的 更小而已测到的贡献之后)之比，将直接产生各纳米点的量子产率。这 种比例测量方法不需要知道纳米点的绝对浓度就能够准确测定量子产 率，因为罗丹明6G参考标准和被探测的纳米点两都吸收的光子数目是一 样的。加之，整体和单分子试样两者的质谱和光物理的表征法将明确地 决定各色纳米点的粒径和光物理特征。此信息也将引出一套用于相对于 其它粒径优选富集一种纳米点粒径的合成方法。
荧光稳定性
基本上不受环境相互作用的影响，正在进一步仔细研究树枝状分子- 稳定的发射，以求产生在多种不同环境里一种给定纳米点的在数量上相 似的发射。这种环境不敏感性与II-VI(如CdSe)量子点的环境不灵敏 性完全相反，其中表面钝化由于表面存在阱态而对综合光物理性能非常 关键(Bracheg等人，Science 1998，281：2013-2016；Chan & Nie， Science 1998，281：2016-2018；Nirmal等人，Nature 1996 383：802-804； Huynh等人，Adv.Mater.1999，11：923；Alaisatos，Endeauomr 1997， 21：56-60；Klimou等人，Phys，Rev.B 2000，61：R 13349-R13352)。树 枝状分子-包囊化的纳米点看来象是通过一种隐藏在水溶性树枝状分子 核心里的生色团来避免这样一些困难。闪烁(荧光间歇现象)是作为离 子强度和pH的函数来探测的。通常使用的缓冲剂诸如磷酸盐缓冲剂和乙 酸钠/乙酸等用来同时控制pH并调节离子强度。把带有不同吸收的从丙 烯酰胺到染料的猝灭剂添加到各纳米点溶液中来测定Ag纳米点的能量传 递。为测定猝灭度，和树枝状分子对纳米簇的稳定性及与环境的隔离性 而做Stern-Valmer猝灭研究。但是，快的寿命就意味着这些纳米点基本 上对猝灭不敏感。除闪烁和总发射强度以外，还有荧光寿命和光谱也将 被测，以判定是否发生由于环境相互作用的任何变化。但是，因其极强 跃迁和短寿命，它们可能在FRET供体-受体对中形成极好的受体。整体 和单个实验译解那些可能发生的光物理动态特性的变化，该变化起因于 异常闪烁动态特征或荧光效率中的平均总减少。主体密度和树枝状分子 粒径也得到调节。为直接测定由连续的较大、和较高密度的树枝状分子 主体提供的保护，探测了Ag纳米点的闪烁动态特性和0级到4级PAMAM 树枝状分子的光物理参数。这些研究将直接测定溶剂和猝灭剂向树枝状 分子核心里的渗入程度。
取向动态特性
以线性偏振个体表面为界(bound)的纳米点之取向动态特性研究有 两个目的：认为小Ag纳米簇的几何结构变化结果形成极不相同的吸收和 发射波长(Harbich等人，J.Chem.Phys.1990，93：8535-8543；Fedrigo等 人c，J.Chem.Phys.1993，99：5712-5717；Rabin等人，Chem.Phys.Lett. 2000，320：59-64)，以及取向信息可能对生物标记实验非常有用，无论是 用于能量传递测量或是用于跟踪个体蛋白质的取向运动。这与更大的不 是线式偏振的CdSe量子点相反，其是各方向发射，其特征在于一个单独 的“暗”轴(Empedocles等人，Nature 1999，399：126-130)。因此， 使纳米簇的取向动态特性与任何观测的光谱变化发生连系，对了解几何 结构的变化是否也产生不同着色的Ag纳米点这一问题是极其重要的。这 些实验也将用三片彩色CCD来进行以获得彩色发射模式。为确认光谱足 够窄，利用150l/mm衍射光栅通过显微镜联合摄谱仪获得单个纳米点荧 光光谱。将取向迹线拟合到偶极界面处的发射模型.(Bartko等人， J.Phys.Chem，B1999，103：3053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys，Chem. B1999，103：11237-11241；Hollars & Dunm，J.Chem.Phys.2000，112：7822- 7830；Helle & Axelrod，J.Opt.Soc.Am，B-Opt.Phys.1987，4：337-350)， 当通过光学显微镜观察来跟踪起因于树枝状分子主体中纳米簇迁移的真 实3-D纳米簇取向动态特性。
实施例7
银纳米点的肽包囊化的
着手利用生物系统固有的巨大多样性(Whaley等人，Nature 2000， 405：665-668；Lee等人，Science 2002，296，892-5；和Seeman & Belcher， 2002.Proc.Nat.Acad.Sci USA，99Supp12：6451-5)，已经证明，一 个短的九氨基酸肽能使Agn纳米簇荧光稳定。最近报道，序列为AHHAHHAAD (SEQ ID NO：1)的短肽在NaBH4还原时与大的金属和半导体纳米颗粒相 互作用(Djalali等人，J.Am.Chem.Soc.2002，124：13660-13661； Slocik等人.Nano Lett.2002，2：169-173)。利用上述轻度光活化步骤， 不用化学还原剂，以Ag与肽之摩尔比为0.1∶1，产生了有极强荧光性的 肽一包囊化的纳米点。与在其它支架里形成纳米点所需的高比例相比， 这个比例产生了许多更有荧光性的品种。在当量支架浓度下，3∶1的Ag与树枝状分子之比是树枝状分子包囊化的所必需的，而从BSA(牛血清清 蛋白)产生荧光就需要更高的比例(高的Ag浓度)，上两个结果就确实 意味着该肽优先结合纳米簇。这种初步结果指出，即使对未优化的肽来 说，非特定标记应当不成问题，这是由于极强的肽-银相互作用。加之， 用此肽荧光图象几乎没有全红和橙色发射体，表明比那些由大树枝状分 子稳定的纳米点有更窄的荧光分布。因此，即使是肽包囊化的初步尝试， 这一更强更特定结合也优选产生了一种以更窄的粒径分布，在肽支架里 的更短发射波长(大概更小)的Ag纳米簇。这一结果强力支持如下的假 说：高选择性的纳米点结合肽可经由推荐的筛选方法来鉴定，而不同的 肽可能使不同粒径/颜色的纳米点稳定。
极小，有强荧光性和非常光稳定的水溶性Ag纳米点已经产生。它只 有几个由PAMAM树枝状分子和短肽包囊化的的原子。非常有利的光学性 质已经产生了具有全可见区粒径相关发射的、非常光稳定、和强力吸收 和发射的物质。我们可以利用单分子显微镜和水溶性贵金属纳米簇来产 生和表征那些更强有力的标记方法和材料。这些特定的，多色的标记使 那些高灵敏度的单分子实验成为可能、大大提高了容易程度和实验简单 性。这一类型的新荧光探针开发的关键在于单分子方法在探索生物系统 复杂性方面的一般适用范围和利用。
实施例8
用于银纳米点包囊化的最佳肽的鉴定
因为Ag是生物相容的，且能做到无毒，这就为开发一种可能达到的 最小和最亮的体内荧光标记提供极好机会。上述这些方法可应用在肽支 架里面金和铜纳米点的形成。树枝状分子-包囊化的纳米点已能用作小 型、极亮的生物相容标记。尽管比绿色荧光蛋白(GFP)小得多，3.272kD2 级PAMAM树枝状分子仍然大于多数有机染料。为进一步探究Ag纳米点用 作生物标记的开发潜力，对那些特异地结合在不同大小金属纳米簇的特 定肽序列作鉴定，对其用作生物分子的特异性多色标记之真实前景作评 估。对于Ag纳米点荧光通过肽文库的建立和搜索，对那些最紧密结合的 序列作鉴定。对在这些序列里形成的纳米点之稳定性、光活化、和光物 理性能作测定。与树枝状分子主体比较的相对稳定性也作评估。照这样， 对纳米簇在树枝状分子与肽间的转移作了研究。
实验方法
许多蛋白质-配体相互作用的研究利用噬菌体展示技术来鉴定那些 结合其它分子的肽(Wolcke & Weinhold，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2001，20：1239-41；Krook等人，Biochem，BiopHys，Res， Commun，1994，204：849-54；Nicholls等人，J.Molecular Recognition 1996，9：652-7(1996)；Stern & Gershoni，Methods Mol，Biol.1998，87， 137-54)。尽管是一种有效的方法，噬菌体展示也需要把相互作用组分之 一固定在固体表面。基于噬菌体的肽文库筛选的应用最近也已在合成和 稳定单一的无机材料中得到了证明(Whaley等人，Nature 2000，405：665-668；Lee，等人Science 2002，296：892-895；Seeman & Belcher，Proc，Natl.Acad.Sci，USA 2002，99：6451-6455)。
因为靶肽会使溶液中的强Ag纳米簇荧光稳定，Agn结合型肽的鉴定 则通过一种基于大肠杆菌的系统(FliTrx随机肽展示文库，Invitrogen) 与荧光激活细胞分选术(FACS)偶联来完成。这两种技术的组合将允许 进行基于溶液的筛选策略。使用主要的细菌鞭毛蛋白(FliC)和硫氧还 蛋白(TrxA)，FliTrx肽文库把肽展示在大肠杆菌表面上。市场上买得到 的Fli Trx文库由不同组插入硫氧还蛋白之活性部位环的随机十二肽的 组成，该硫氧还蛋白本身插入鞭毛蛋白的非必需区。随机十二肽被形成 在TrxA里的二硫键限定。给培养物添加色氨酸，能诱导肽蛋白融合体的 表达，而这将保证全部肽融合体同时展示。当诱导后，该融合蛋白就输 出并装配在细菌细胞表面组装成鞭毛，提供受限肽的展示。因这些肽是 以高拷贝数产生在大肠杆菌的外面，对这些肽稳定Ag纳米点荧光的性能 进行了测定。然后用流式细胞术按照荧光性质对细菌群体进行分选，以 分离那些发射荧光的细菌。
Agn纳米点在展示的Fli Trx肽上产生的最佳化
用上述鉴定的Agn通过光学显微镜来测定在细菌表面上形成肽包囊 化的纳米点的最佳光还原条件(见实施例7)。合成了一种编码九肽序列 的寡核苷酸，以及侧翼BglII和EcoRV识别序列(Operon Co.)并将其 克隆到来自Invitrogen Co的pFli Trx载体之多克隆位点上。这一构建 体将把肽如上所述地插入鞭毛蛋白的非必需区。分离质粒并转化入宿主 菌株GI826(Invitrogen)导致该肽在大肠杆菌表面展示。然后用此菌株 来鉴定那些当用FACS来筛选FliTrx文库时适于产生荧光肽-包囊化的Ag纳米点的光活化和化学还原条件。当用蓝光照射和当使其受到BH4还原 时，评估细胞的生存力以及产生Ag纳米点的效率。起初，来自个体细菌 的总荧光，将作为通过光学显微镜许多不同Ag+浓度的光还原时间的一个 函数来测量。这一方法非常简单，它包括用溶液中的电子供体来光化学 地还原Ag离子(Tani & Murofushi，J.Imag.Sci.Technol.1994，98：1-9； Stellacci等人，Adv.Mater.2002，14：194；Eachus等人，Annu.Rev.Phys. Chem.1999，50：117-144).此方法使用情况良好，这是因为相对于电子 激发的分子之能级来说，Ag的能级有利(Tani & Murofushi，J.Imag.Sci. Technol.1994，98：1-9；Marchetti等人J.Phys.Chem.B1998， 102：5287-5297；Stellacci等人，Adv.Mater.2002，14：194；Eachus等 人..Annu.Rev.Phys.Chem.1999，50：117-144)。光还原提供控制纳米簇 粒径和颜色的机会，这是由于只有几个原子(即Ag2～8)构成的Ag纳米簇 之不同的还原势。或者，可通过慢慢添加多达1个当量的NaBH4或其它还 原剂来利用化学还原，借此也产生荧光纳米点。产生最强荧光的Ag纳米 点标记的大肠杆菌细胞的条件就是全部文库搜索研究的初始条件。使用 鉴定了的强荧光产生条件，把荧光细菌培养物洗涤、接着悬浮在磷酸盐 缓冲剂中以供FACS分析。此洗过的大肠杆菌悬浮液也将在显微镜载物台 上再测定总荧光，以便评估当试样制备之际细菌表面存在的荧光之稳定 性。
通过随机肽展示文库鉴定特异性Ag纳米点的结合序列
使用一种商品展示文库(Invitrogen)，该文库包括1.8×108的多样 性，以鉴定那些特异地与Ag纳米簇相互作用的肽序列。制备的文库将分 为50小瓶并冷冻，以供总荧光测定时Ag纳米点结合条件的个体分析和 最佳化。各小瓶将包括大部分肽文库并在光学显微镜载物台上经由低倍 率物镜测定最佳Agn结合条件。首先，文库培养物在有色氨酸的情况下生 长6小时以诱导融合鞭毛蛋白的表达，培养物先用磷酸盐缓冲液洗涤然 后用硝酸银孵育，以通过光还原形成银纳米点。
流式细胞计量术能使细胞/粒子粒径与荧光相关。将产生FSC(正向 散射，定义相对大小)和SSC(侧向散射，定义相对粒度)的点曲线图 (CellQuest程序)来确定一个使用FACS时规定细菌群体的“门”。将按 总荧光强度分布来把细菌分选。三个荧光检测波道是可用的：FL1，530nm (30nm宽度)，FL2，585nm(42nm宽)和FL3，650nm及以上，上述波道 可单用或并用于细胞分选。预料大部分带Ag纳米簇非结合肽的细菌荧光 极微而只有带显著荧光的被回收。但是，各波道的荧光强度和正向散射 一起将用来鉴定那些起因于Agn结合和稳定的强荧光细胞，使采集的细菌 在氨苄青霉素选择琼脂平板上培养以分离单一菌落。各单一菌落将被保 存并再次用流式细胞计量术和光学显微镜检验以确认相关的荧光表型。 一旦测定荧光强度，就从那些带有明亮纳米点荧光的细菌中分离质粒 DNA，并通过直接测序分析来确定肽序列。阳性克隆序列的对比可产生一 连续的共有肽序列；或者，也可识别一种由不连续的保守残基形成的结 构基序。通过固相肽合成法来合成所确定的序列，通过类似于上述研究 的荧光显微技术、光物理表征法和质谱测定法来表征其与Ag纳米点的结 合性能。
在FliTrx肽展示系统内建立用户定义的文库
带有各种肽长度的鞭毛蛋白展示文库能够利用pFliTrx载体而产生， 可以代替商品文库筛选。将合成15bp(5a.a.)、27bp(9a.a.)、45bp(15a.a.) 和60bp(20a.a.)的简并寡核苷酸，在该寡核苷酸侧翼有Bgl ∏和EcoRV 限制性识别序列(Operon Co.)。用所述两酶消化寡核苷酸混合物，并克 隆到已被该两酶所切的pFli Trx载体里。从菌落集合中分离出来的质粒 转化入测试菌株GI 826，重复上述的筛选方法。
此法利用氨基酸的天然多样性选择特异的Ag纳米簇结合来形成一种 生物相容性的强荧光纳米点。在许多方法中这是一种类似于把(His)6 标签基因结合到目的蛋白质的N端或C端的通用方法，该蛋白质是将要 经由与Ni起特异反应而纯化的。类似地，此研究定义的Agn结合型肽能 够特异和选择性地结合Ag纳米簇，借此增强其荧光。加之，FACS的多荧 光检测波道也能够鉴定一序列的肽，该肽优选稳定不同粒径，因而不同 颜色的纳米点。
Agn纳米簇结合型肽的表征法
一旦常规地鉴定和合成了最佳肽的长度和序列，荧光纳米簇的环境 稳定性和光物理性能就象上述树枝状分子-包囊化的纳米点那样直接测 定。很可能特定序列用优选稳定特定的纳米簇粒径并具有比在PAMAM树 枝状分子主体里可能更窄的发射，而同样的粒子计数方法将用来表征鉴 定那些包囊化的在各特性肽里的各类纳米簇数目。其实，即便在使用的 那种产生并稳定Ag纳米点荧光的初始肽里，也看到纳米点粒径分布较之 树枝状分子包囊化的里的更窄。由于Agn与碱性残基的亲合力，较大的纳 米簇可能被更碱性序列优选稳定。这可能在肽-Ag结合相互作用中赋予粒 径和因而是纳米点的选择性。结果，这种Ag纳米点结合肽的基因选择可 能产生种种各自稳定不同纳米簇的肽。这将产生许多带有不同光学性能 的各种可编程标记，各自都能用作独立的单生物分子标记。为了测定在 各鉴定Agn结合肽里的纳米簇粒径分布及其相关给定颜色的发射源数目， 将要对合成、并接着测Agn纳米点结合的全部肽做质谱测定(ESI和 MALDI)。此相关单纳米点荧光显微技术、整体吸收和发射，以及质谱分 析涉及区分肽和银离子的浓度，直接表征鉴定各经由FACS文库的筛选的 肽的结合常数。
实施例9
树枝状分子和肽间Ag纳米簇的转移
由于银盐通常在水中的溶解度非常有限，由于其极小的溶度积和存 在于生物介质中的大量氯离子。AgCl很可能会从与生物相关的溶液中沉 淀出来。这会带来一个潜在问题：把Agn纳米簇运送给那些上述研究中规 定的肽，且可能限制强荧光Ag纳米簇的直接递送。但是发现，当包囊化 在树枝状分子主体中时，Ag纳米簇非常稳定并在生理盐水浓度保持很亮 的荧光。连小的2级PAMAM树枝状分子实际上都使Ag纳米簇免于AgCl沉淀。而且，树枝状分子是熟知的、能使其内部装有的物质穿过生物膜 运送(Toth等人.，STP Pharma Sci.1999，9：93-99；Bielinska等 人，Biomaterials 2000，21：877-887；Lmo等人，Macromolecules 2002，35：3456-3462；Yoo等人，Pharm.Res.1999，16；1799-1804；Wiwatt anapatapee等人，Pharm Res.2000，17：991-998；Esfand & Tomalia，Drug Discov.Today 2001，6：427-436)，在开发体内标记实验方面是一种有价 值的性能。因此，对小的PAMAM树枝状分子进行了作为载体的研究，该 载体把Ag纳米簇直接转移到那些鉴定的、强力结合Ag纳米簇的肽上。 用同样的筛选方法进行了Ag纳米点转移作为肽的鉴定和选择的研究。不 是使用于有效标记那些在Fli Trx文库里的肽之银离子浓度最佳化，而 是当观察显微镜载物台上的溶液(用10×物镜)以监测纳米点交换时， 调节树枝状分子-包囊化的纳米点的浓度。一旦标记E.coli细胞的情况 得到鉴定，为那些含有能从树枝状分子获得纳米点的肽细胞之肽文库就 被明确地筛选出来。因为流式细胞计量术能根据散射和荧光选择细胞， 很小的树枝状分子在各通道都是不可探测出来的。只有那些大到足以散 射足够光来引发采集的细胞，从而避免由于树枝状分子-包囊化的纳米点 荧光的假阳性。加之FliTrx文库里的各个细菌都有成千成万的肽拷贝， 因而提供一种更强荧光信号的潜力。只有那些显示强荧光和散射光的细 胞才被采集、氨苄青霉素选择生长，并测序。这种树枝状分子-肽文库纳 米点转移可能有利于特定环境条件下的较低级PAMAM树枝状分子，诸如 在那些使树枝状分子-包囊化的纳米点更易逃脱的特定pH，对pH最稳定 的肽-包囊化的纳米点因而可能在未来标记实验中非常实用。这一额外的 筛选方法将进一步选择那些能够优先从树枝状分子提取Ag纳米簇的肽， 为体外和体内简易地标记蛋白质提供了可能性。
大多数体外荧光标记是经由标准的化学偶联法来做的：或使N-琥珀 酰亚氨酸酯缀合的染料同游离的、溶剂-暴露的胺(常在赖氨酸残基上) 偶联，或者使马来酰亚胺缀合的染料同硫醇(在天然存在或基因引入的 溶剂-暴露的半胱氨酸上)偶联。这两种化学偶联法在使小的强荧光染料 附着在目的蛋白质上仍然是非常有用的。这种荧光生物材料因而足以适 用于体外单分子研究，或者经由微量注射或其它膜转运法高浓度地再引 入细胞里来做全细胞内目的蛋白质的整体荧光研究。不仅蛋白质功能可 能被荧光标记的粒径和附着点两者所改变，而且往往由于所用的化学偶 联法使荧光标记的位点不能确切知道。因此，一种尽可能小的基因编程 标记(smallest possible genetically programmed lable)就会是非 常有用的。
而且，在生物系统中，来自黄素、卟啉、和其它有微弱荧光的天然 物质的自发荧光本底会产生一个干扰激光-诱导的荧光信号的大本底。由 于这些问题，生物系统里少量拷贝的蛋白质的动态特性研究要求开发新 的荧光探针，该探针强烈吸收和发射且无明显的光漂白，以致用极微弱 的断续照明就能轻易地长久看到荧光。这种照明，较之激发微弱的本底 信号，将能优先激发目的荧光团。而且，该微弱照明会将光毒性效应减 至最小来保护生物生存力。遗憾的是，单分子的灵敏度尚难达到像这样 高的体内研究本底，且即使在较低的体外研究本底上也往往难以看到荧 光。
由于信噪限制因素，伴有其各种麻烦的单分子研究就被限制在荧光 法测定方面。当单分子方法在使总体均值“脱壳(peeling back)”以检 查环境、机制异质性方面有效的同时，现有的技术仍需要昂贵的基于激 光的装置，专门的合成方法，且基本上仍被现有荧光标记的不良光学性 能或生物不相容性所限制。
若干主要的实验已明确证明单分子显微技术有能力探索导致生物活 性的关键步聚(Lu等人，Science 1998，282：1877-1882；Dickson等 人，Nature 1997，388；355-358；Funatsm等人，Nature 1995，374：555-59； Ha等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 1996，93，6264-6268；Vale等人， Nature 1996，380：451-453；Deniz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 2000，97：5179-5184；Ha等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999， 96：893-898；Harada等人，Biophys.J.1999，76：709-715；Kinosita， Biophys.J.2000，78：149Wkshp)。在个体运动蛋白的移动的研究种，对 生物力学循环里蛋白功能和子步的机械认识都能直接可视化，而无需进 行麻烦的外部同步化(Funatsu等人，Nature 1995，374：555-59；Vale 等人，Nature 1996，380：451-453；Kinosita，BiopHys.J.2000，78：149 Wkshp；Yanagida等人，Curr.Opin.Cell Biol.2000，12：20-25)。甚至已经 探测了生物分子折叠以揭示导向错误折叠和折叠状态的途径(Deniz等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2000，97：5179-5184；Ha等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1999，96；893-898)。因为已经在单分子水平上开发了定向 法(Bartko，& Dickson，J.Phys.Chem.B 1999，103：3053-3056；Bartko & Dickson，J Phys.Chem.B 1999，103：11237-11241；Bartko等人，Chem. Phys.Lett.2002，358：459-465；Hollars & Dunn，J.Chem.Phys. 2000，122：7822-7830)和荧光共振能量转移法(FRET)(Weiss， Science1999，283：1676-1683)，更多的实验目前都是可能做到的。遗 憾的是，在所有的单分子研究中，研究人员都只限于去做目的蛋白的人 工荧光标记，且限于体外观察。由于有机体荧光团的大荧光本底和不良 的光稳定性，标记蛋白质向细胞内的再引入仍不能产生可行的体内单分 子信号。
单个分子也有许多固有的不良性能限制了实验的时间长度。激发速 率必须很高从而以合理的时间分辨率(毫秒～秒)和良好信噪比产生生 物学相关的信息。因为最好的有机荧光团的吸收截面(即消光系数ε) 在室温下只有～10-16cm2(即ε～105M-1cm-1)(Macklin等人，Science1996， 272：255-258)，须使用高强度激光激发以供单分子荧光研究。而且，有 机体分子在光化学分解前只能耐得住～107激发周期(Dickson等人， Nature 1997，388：355-358；Lu & Xie，Nature1997，385：143-146； Macklin等人，Science 1996，272：255-258)。在106激发/秒(使用～ 5kW/cm2激发强度和常用的5％的采集/检测效率)，这把时间分辨率限制 在～1ms(带有理想化的信噪比～7)，并且在光漂白前跟踪个体分子的平 均总时间为～10秒钟。尽管对于真正生物相关时间长度来说这可能是大 量的数据，但是许多激发周期在采集数据之前被寻找目的分子所耗费。 显然，减少氧气往往能增加光漂白前的时间，而有机染料的光稳定性和 总亮度限制了全部生物单分子实验。因而荧光团性能的提高将是生物系 统中的全部单分子光学研究持续成功的关键。
最近已提出并证明水溶性II-VI量子点(quantum dot)可以作为生 物标记(需要使用与有机荧光团类似的化学偶联)(Brucher等人，Science 1998，281：2013-2016；Chan & Nie，Science 1998，281：2016-2018；Zhang 等人，Analyst 2000，125：1029-1031)一些材料，诸如有ZnS外敷层(起 保护和稳定作用)的CdSe，具有粒径依赖型的光学性能并能以很窄的粒 径分布合成(Murray等人，Z，Phys，D-Atoms Mol.Clusters 1993，26：S231-S233；Murray等人，J.Am.Chem.Soc.1993，115：8706-8715； Peng等人，Nature 2000，404：59-61)。这些纳米材料的强吸收，光谱稳 定性、和可由尺寸调节的窄发射，意味着它们很可能用于生物标记，只 要对ZnS外层再做化学处理使这些材料成为水溶性的(Rodriguez-Viejo 等人，J.Appl.Phys.2000，87：8526-8534；Dabbousi等人，J.Phys.chem.B 1997，101：9463-9475)。因为表面钝化在总量子点光学性能里是非常重要 的，因此要把很多的注意力用在量子点的表面钝化和衍生化上，以使之 以可预知的光学响应能再现地结合到蛋白质上(Bruchez等人，Science 1998，281：2013-2016；Chan & Nie，Science 1998，281：2016-2018； Rodriguez-Viejo等人，J.Appl.pHys.2000，87：8526-8534；Dabbousi等 人，J.Phys.Chem.B 1997，101：9463-9475；Nirmal & Brus，Acc.Chem.Res. 1999，32：407-414；Nirmal等人，Nature 1996，383：802-804)。事实上，水 溶解和表面钝化现在才开始取得成功(Dubertret等人，Science 2002，298：1759-1762；Jaiswal等人，Nat.Biotechnol.2003，21：47-51；Wu 等人，Nat.Biotechnol.2003，21：41-46；Sutherland，Curr.Opin.Solid State Mat.Sci.2002，6：365-370；Gao等人，J.Biomed.Opt.2002， 7：532-537；Mattoussi等人，J.Am.Chem.Soc.2000，122：12142-12150)。
尽管因其明亮和很窄的粒径依赖型发射而大有前途，可是用CdSe作 生物标记依然存在许多问题。它们的合成方法需要用高毒性前体和高温， 它们的大小与它们所要标记的蛋白质的大小相当(直径2-6nm)，它们同 样需要目的蛋白的外部标记，以及可能要把标记的蛋白再引入细胞。因 此，尽管强烈的振荡强度使量子点借助弱汞灯的激发就能很容易观察到， 从而避免大量额外的更弱的吸收性自发荧光本底，可是，对体内或体外 单分子研究来说，它们仍然不是一个理想的解决办法。
理想地，人们需要一种表达在目的蛋白上或其附近的尽可能小的基 因编程标记。这一理想的标记必须有足够强的吸收和发射，以及显著的 光稳定性，从而即使在高本底荧光存在下也能以高时间分辨率持久地观 察单个分子。这样的荧光探针现在还没有。目前，可用的最好选择由于 仅由氨基酸，绿色荧光蛋白(GFP；Dickson等人，Nature 1997，388：355-358；Heim，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1994，91：12501-04； Ormo等人，Science 1996，273：1392-5；Chattoraj等人，Proc.Nat.Acad. Sci，USA 1996，93：362-67；Brejc等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 1997， 94：2306-11；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20：448-55；Kain & Kitts，Methods Mol.Biol.1997，63：305-24)以及DsRed组成(Gross等 人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA2000，97：11990-11995；Jakobs等人，FEBS Lett.2000，479：131-135；Wall等人，Nat.Struct，Biol，2000，7：1133- 1138；Yarbrough等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA2001，98：462-467)， 是极好的体内标记，已由许多作者在体外研究中于单分子水平上观察到 (Dickson等人，Nature 1997，388：355-358；Malvezzi-Campeggi等 人，BiopHys.J.2001，81：1776-1785；Garcia-Parajo等人，Proc.Natl. Acad.Sci.，USA2000，97：7237-7242；Cotlet等人，Chem.Phys.Lett. 2001，336，415-423；Lounis等人，J.Phys.Chem.B 2001，105：5048-5054； Garcia-Parajo等人，Pure Appl.Chem.2001，73：431-434；Garcia-Parajo 等人，Chem Phys Chem 2001，2：347-360；Garcia-Parajo等 人，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA 2001，98：14392-14397；Blum等 人，Chem.Phys.Lett.2002，362：355-361)。
在最早的这批研究之一中，当用光子使GFP生色团在两种不同光可 达状态间转换时，研究了GFP的闪烁和光学转换能力(Dickson等人， Nature 1997，388：355-358)。遗憾的是，尽管GFP能特异性地附着于 任何蛋白质的N或C末端并体内表达为强荧光标记，但是仍然存在问题， 特别是在单分子水平上。GFP为27kD或直径为～4nm(Ormo等人；Science 1996，273：1392-5；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20： 448-55)，因而对其所附着的蛋白质是一大干扰。而且，只有当GFP折叠 成其最终构象才出现发射，该过程时间可达约1小时，尽管GFP标记的 例子已在不同细胞的所有区域里报道过，但是有时候在一组给定的条件 之下GFP并不能正确折叠(Heim，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1994， 91：12501-04；Cubitt等人，Trends in Biochem.Sci.1995，20：448-55)。 而且，当考虑到单分子研究时，其发射与自发荧光本底明显重叠，而其发 射强度只和标准外源性有机染料相当，从而使体内单分子研究面临真正 挑战。尽管基本上对氧非常不敏感，其一般也在～107激发周期后漂白， 与标准有机染料类似(Dickson等人，Nature 1997，388：355-358)。DsRed 部分克服了与自发荧光本底重叠的问题，但是尽管DsRed相对于GFP的 红移发射是一个优点，其相当的荧光强度以及即使在极低浓度下四重化 的趋势可能进一步限制作为一种理想的生物标记的应用(Lounis等人，J. Phys.Chem.B 2001，105：5048-5054；Garcia-Parajo等人，Chem Phys Chem 2001，2：347-360；Verkhusha等人，J.Biol.Chem. 2001，276：29621-29624；Sacchetti等人，FEBS Lett.2002，525：13-19)。 所以，理想的标记应该同时具有无机量子点的强吸收、发射和光稳定性 以及有机染料的小尺寸和简单附着的化学性质，或优选的是象GFP和 DsRed那样，能在体内表达为附着在任何目的蛋白质的单分子生物标记， 而无需首先纯化、标记和再注入蛋白质。
总之，尽管现有的标记方法和材料已使数不清的整体研究和许多体 外单分子实验成为可能，但是单分子实验仍然受到即使是最好的荧光探 针的不利条件的限制。本领域中需要新的单分子探针，其具有大大提高 的光稳定性，在弱照射下更强的吸收和发射，易于合成和易于与蛋白质 缀合，以及可调的发射颜色。理想地，这种荧光标记也应该是基因编程 的，以便待研究的蛋白质能够直接在细胞内进行标记，而无需首先进行 过度表达、纯化、标记、然后再重新引入细胞。
发明概述
本发明的一个目的在于克服、或至少减轻一种或多种与现有技术有 关的困难或缺点。本发明部分满足那种鉴定新的、独特的强荧光标记的 需求，该荧光标记可在单分子或大浓度场合下分子的简易研究之用。本 发明的组合物包含水溶性荧光标记，该荧光标记包含包囊化的贵金属纳 米簇。在一个实施方式中，贵金属纳米簇包含2～8个贵金属原子。在优 选的实施方式中，贵金属选自金、银、和铜。在某一实施方式中，该贵 金属纳米簇具有可变的电荷。
优选的是，该荧光标记显示偏振发射光谱并显示偶极发射模式。荧 光标记的光谱发射提供有关生物状态的信息，其中该生物状态选自生物 部分的定量和定性存在；生物部分的结构、组成和构象；生物部分在周 围环境中的定位；生物部分间的相互作用，生物化合物结构方面的变化 和在细胞过程中的变化。
优选的是，本发明的荧光标记能在约3到约8的pH范围内发射荧光， 该贵金属纳米簇在光漂白前发射＞约106、＞107、＞108、或＞109个光子。 在一个实施方式中，在纳米簇光谱激发最大值处，包囊化的贵金属纳米 簇的荧光量子产量大于约1％，饱和强度在约1-1000W/CM2范围。
在某些优选的实施方式中，用树枝状分子包囊贵金属纳米簇。在一 个实施方式中，树枝状分子包括聚(酰胺胺)，其中，该聚(酰胺胺)树 枝状分子选自0级、1级、2级、3级、4级、和更高级聚(酰胺胺)树 枝状分子。在另一实施方式中，该聚(酰胺胺)树枝状分子是一种2级、 或4级羟基封端的聚(酰胺胺)树枝状分子。
在某些其它的优选实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的 是，该肽的长度为约5～500个氨基酸。在另外的实施方式中，肽的长度 为约5-20个氨基酸。在进一步的实施方式中，该肽包括SEQ ID No.1 所定义的多肽序列。
本发明提供一种此处所述能发荧光的树枝状分子包囊化的贵金属纳 米簇之制备方法，它包括下列步骤：(a)把树枝状分子、含贵金属的水 溶液、和水性溶剂混合以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)接着添 加足量酸性化合物把混合溶液调至中性范围或生理pH值；和(d)混合 调好pH值的混合溶液使树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇得以形成。本 发明还提供一种此处所述能发荧光的肽包囊化的的贵金属纳米簇的制备 方法，它包括下列步骤；(a)把肽、含贵金属的水溶液和水性溶液混合 以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)添加足量酸性化合物把混合溶 液调至中性范围的pH值；和(d)混合调好pH值的混合溶液使肽包囊化 的贵金属纳米簇得以形成。
本发明还包括为研究生物状态而使用此处所述荧光标记的方法。本 发明提供一种监测目的分子的方法，它包括：(a)把含包囊化的贵金属 纳米簇的水溶性荧光标记附着在目的分子上，其中荧光标记在某一可见 光或近红外波长范围内发出发射光谱；和(b)检测荧光标记的发射光谱。 在某些实施方式中，该方法还包括把连接体分子附着在包囊化的贵金属 纳米簇上的起始步骤，其中连接体分子能使荧光标记附着在目的分子上。 在一个优选的实施方案中，目的分子存在于生物样品中。在一个优选的 实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的是，该肽在细胞里表达。 在一个实施方式中，该肽包含融合多肽。
附图简述
图1A提供了银/树枝状分子水溶液的UV-可见光吸收光谱。(1)显示 了大的非荧光树枝状分子包囊化的银纳米颗粒的强等离子吸收(398nm) 特性，该纳米颗粒由树枝状分子主体里的银离子经NaBH4还原制成(1∶ 12树枝状分子∶Ag)。(2)显示了未还原的非荧光1∶3(树枝状分子∶ Ag)溶液在光活化前的吸收光谱。(3)显示了同一溶液在光活化/光还原 后产生强荧光银纳米点(nanodot)。图1B提供了光活化G2-OH PAMAM(MW： 3272amu)-AgNO3溶液的电雾化电离质谱。Agn纳米点峰被Ag原子质量 (107.8amu)隔开，仅显现在有荧光的光活化纳米点溶液里。
图2A-D显示了汞灯激发(450～480nm，30W/cm2，标尺＝15μm)落射 荧光显微技术图象，证明水性树枝状分子包囊化的银纳米点的时间依赖 型光活化。各300msCCD帧显示：随照明时间增加(0秒、0.3秒、1.5 秒、和6秒)荧光也增强。图2E显示了水溶液中表面结合的银纳米点的 发射模式。在弱汞灯激发下可轻易观察到指示单个分子的各向异性发射 模式和荧光闪烁。
图3显示了室温单个纳米点共聚焦荧光光谱(476-nm Ar+激光激发， 496-nm长通滤波器，带有300-mm单色仪)。5个典型纳米点的最大发射 波长为533nm、553nm、589nm、611nm和648nm。整体银纳米点溶液的总 体荧光光谱(顶部)基本上由这5个光谱型组成，它们与在AgO表面上 的那些难以区分。
图4A显示了单个纳米点的荧光寿命，图5B显示了典型的树枝状分 子-包囊化的纳米点的饱和强度测定。图5A中，400-nm激发的寿命受 300ps仪器响应的限制，而在去褶合后显示亚-100ps组分(92％)和1.6 纳秒组分(8％)。图4B中，饱和发生在～400W/cm2(使用偏共振、514.5-nm 激发)，带有各种纳米点间量子产量变化而产生的总强度差异。作为比较， 有机染料DiIC18的饱和强度为10kW/cm2。与DiI相比，得到一个荧光量 子产率为～30％的较低估算量。
图5A显示了水性金纳米点和纯树枝状分子溶液的UV-可见光吸收光 谱。图5B表明：扣除A中的吸收光谱，显出PAMAM包囊化的Au纳米点 的384-nm吸收。
图6显示了G4-OH PAMAM包囊化的金纳米簇在室温下的激发和发射 光谱。“1”表示激发光谱，“2”表示发射光谱。
图7A显示了水溶液里金纳米点的寿命测定。经过拟合的仪器响应和 纳米点数据显示7.5ns(93％)和2.8μs(7％)的寿命。图7B显示了G2-OHPAMAM包囊化的金纳米点的ESI质谱，G2-OH+Au8+5H2O+H+的预期m/z为 4940。
图8显示了PAMAM树枝状分子包囊化的铜纳米簇在室温下的激发和 发射光谱。“1”表示激发谱，“2”表示发射谱。
发明详述
本发明提供包括荧光标记的组合物、该组合物的制备方法及其使用 方法。本发明的组合物包含能发荧光的包囊化的贵金属纳米簇。上述荧 光标记提供超过已知荧光标记的某些优越性，包括尺寸小、在弱光照下 更强的吸收和发射、易于合成和缀合于蛋白质、可调的发射颜色、和可 以选择给标记做基因编程以便能在细胞内直接标记蛋白质。
本发明提供的组合物包含水溶性荧光标记，该荧光标记包含包囊化 的贵金属纳米簇。在一个实施方式中，贵金属纳米簇包含2～8个贵金属 原子。在优选的实施方式中，贵金属选自金、银、和铜。
在一个实施方式中，该荧光标记显示偏振发射光谱和/或偶极发射模 式。荧光标记的发射光谱提供有关生物状态的信息，其中该生物状态选 自生物部分的定量和定性存在；生物部分的位置、结构、组成、和构象； 生物部分在周围环境中的定位；生物部分间的相互作用，生物化合物的 结构改变和细胞过程的改变。
优选的是，本发明的荧光标记能在约3到约8的pH范围内发荧光， 该贵金属纳米簇在光漂白前发射大于约106个光子。在另一实施例方式 中，该贵金属纳米簇在光漂白前发射大于约107、108、或大于109个光子。
在某些优选的实施方式中，用树枝状分子包囊化贵金属纳米簇。在 一个实施方式中，树枝状分子包括聚(酰胺胺)，其中聚(酰胺胺)树枝 状分子选自0级、1级、2级、3级、4级、和更高级聚(酰胺胺)树枝 状分子。在另一实施方式中，该聚(酰胺胺)树枝状分子是一种2级、 或4级羟基封端的聚(酰胺胺)树枝状分子。
在某些其它优选实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的是， 该肽的长度为约5～500个氨基酸。在其它的实施方式中，该肽的长度为 约5～20个氨基酸。在另外的实施方式中，该肽包括如SEQ ID NO：1所 定义的多肽序列。
本发明提供一种用树枝状分子包囊的贵金属纳米簇的制备方法，它 包括下列步骤：(a)把树枝状分子、含贵金属的水溶液和水性溶剂混合 以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)添加足量酸性化合物把混合溶 液调至中性范围pH或生理pH；和(d)混合调好pH的混合溶液以使树枝 状分子包囊化的贵金属纳米簇得以形成。本发明还提供一种能发荧光的 肽包囊化的贵金属纳米簇的制备方法，它包括下列步骤：(a)把肽、含 贵金属的水溶液和水性溶液混合以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c) 添加足量酸性化合物把混合溶液调至中性范围或生理pH；和(d)混合调 好pH的混合溶液使肽包囊化的贵金属纳米簇得以形成。
本发明还包括为研究生物状态而使用该荧光标记的方法。本发明提 供一种监测目的分子的方法，它包括；(a)把含包囊化的贵金属纳米簇 的水溶性荧光标记附着在目的分子上，其中该荧光标记在某一可见光和 近红外波长范围内发出发射光谱；和(b)检测该荧光标记的发射光谱。 在某一实施方式中，该方法还包括把连接体分子附着在包囊化的贵金属 纳米簇上的起始步骤，其中该连接体分子能使荧光标记附着在目的分子 上。在一个优选的实施方式中，目的分子存在于生物样品中。在一个优 选的实施方式中，贵金属纳米簇包囊在肽中。优选的是，该肽在细胞里 表达。在一个实施方式中，该肽包含融合多肽。
此处所述的强荧光水溶性贵金属纳米簇(纳米点)能借助弱汞灯的 激发以单个纳米点的形式轻易地观察到，这是因其具有极强的吸收和发 射能力(Peyser等人；Science 2001，291：103；Peyser等人，J.Phys. Chem.B 2002，106：7725)。借助可与更大的量子点相比的吸收强度，这 些强荧光和非常光稳定的纳米点，在一个实施方式中，可用作单分子和 多分子荧光生物标记。这种稳定、生物相容性的单个贵金属纳米簇的开 发，大大促进了这些光活化纳米材料作为极小的明亮的荧光团的应用。 本发明如此明亮的、容易合成的、强有力的纳米材料将会扩大单分子方 法的可利用性，因为它大大降低了实验的费用和复杂性，提供了光激活 的荧光团，该受激荧光团能从单个分子产生比现有技术多几个数量级的 光子。
此处所述的本发明的一个方面提供一种光活化生物标记的制造和表 征，该生物标记极为强力，非常明亮，同时很小又生物相容，适用于体 外和体内特异性标记，并只借助弱汞灯的激发就容易在单分子水平上观 察到。比最好的有机染料至少明亮20倍，这种亮度和合成的简易性使研 究人员能以廉价的标准灯型荧光显微镜轻易地做单分子实验。如此处所 述，产生非常明亮的、容易在单分子水平观察到的化合物只需几个到几 十个贵金属原子。因此，包囊贵金属纳米簇的合适的生物相容性支架(通 常是树枝状分子、基因优化的肽，或任何其它合适的包囊材料)使它们 很有用，并使它们成为潜在的尽可能小的体内和体外标记。
除非另行指出，此处所用的术语应按相关领域里普通技术人员的传 统使用来理解。除一些术语的定义提供于下以外，分子生物学的常用术 语的定义也可在下列参改文献中找到：Rieger等人，1991 Glossary of genetics：Classical and molecular，5th Ed.Berlin：Springer-Verlag； Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，Eds， Current Protocots，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley Sons，Inc.(1998 Supplement)。应理 解的是，说明书和权利要求书中所用的“a”或“an”可以表示单数或复 数，取决于它所处的上下文。例如“细胞”意思可以是“至少一个或至 少一种细胞”。
通过参看本发明优选实施方式的下列详细描述和此处的各实施例， 可更容易地理解本发明。但是，在公开和描述本发明的化合物、组合物、 和方法之前，应理解的是，本发明不局限于特定的贵金属、特定的多肽， 特定的树枝状分子，特定的条件，或特定的方法等等，因为它们显然可 以变化，并且对其的大量修改和变动对本领域技术人员来说都是显而易 见的。同样应理解的是，此处所用的术语只是为了描述特定的实施方式 而不是用来进行限制本发明的。
正如此处所用，“包囊材料”是指一种基质(substrate)，它能附着 于或物理性结合于一个或多个贵金属纳米簇分子上。包囊材料能提供一 种把贵金属纳米簇间接附着于目的分子上的手段，并能保护贵金属纳米 簇免于环境影响。所述附着或连接是借助于共价键、氢键、吸附、吸收、 金属键、范德华力或离子键，或者其任何组合。正如此处所用，“包囊化 的”是指一个或多个贵金属纳米簇分子能物理性结合于或包含在包囊材 料里，部分或完全分散到整个包囊材料中，或附着或连接于包囊材料上， 或其任一组合，其中所述附着或连接是借助于共价键、氢键、吸附、吸 收、金属键、范德华力或离子键、或其任何组合。
本发明包括的贵金属纳米簇可用任何合适的包囊材料来包囊，包囊 材料包括，但不局限于树枝状分子、多肽，表面活性剂、和非树枝状分 子聚合物。在一个实施方式中，树枝状分子是PAMAM树枝状分子。在另 一实施方式中，多肽包含长度为5～500个氨基酸的序列。在又一实施方 式中，多肽包含抗体。
正如此处所用，涉及树枝状分子时，例如“包囊化的”是指一个或 多个贵金属纳米簇分子能物理性结合于或包含在树枝状分子的核心里， 部分或完全分散到整个树枝状分子中，或者附着于或连接于树枝状分子， 或其任一组合，其中该附着或连接是借助于共价键、氢键、吸附、吸收、 金属键、范德华力或离子键，或其任一组合。由于树枝状分子的大小、 形状和官能团密度可以借助熟知的方法加以精确控制，因此有许多方法 可以将被运载物质(即贵金属纳米簇)结合在树枝状分子上。例如，(a) 在被运载物质和实体(通常为位于树枝状分子表面或其附近的官能团) 之间可有共价、库伦、疏水、或螯合等类型的结合；(b)在被运载物质 和位于树枝状分子内部的部分之间可有共价、库伦、疏水、或螯合等类 型的结合；(c)树枝状分子可制成其内部主要为空腔的形式，可供在该 内部(空腔)中包含(例如，物理性包含于或者结合在致密的星形树枝 状分子的内部部分)被运载物质之用，(例如，在树枝状分子里由金属离 子的螯合以及完全或不完全还原成零价态或非零价态所产生的磁性或顺 磁性核心或结构域)，这些含有磁性内部的树枝状分子可用于获得各种生 物活性实体，该实体借助磁体等能与各种树枝状分子表面复合，其中被 运载物质的释放可以可选择地用扩散控制部分挤压树枝状分子表面来控 制；或(d)可利用上述现象的各种组合。
此处所用的术语“贵金属”是指选自金、银、铜，以及铂族金属(PGM) 铂、钯、锇、铱、钌、和铑的元素组。在某些优选的实施方式中，贵金 属选自金、银、和铜。在其它优选的实施方式中，贵金属是银。在其它 优选的实施方式中，贵金属是金。在其它优选的实施方式中，贵金属是 铜。
正如此处所用，“纳米簇”是指一种2～27个金属原子的缔合体 (association)。制造的纳米簇是已知的，并且在催化剂、陶瓷、半导 体和材料科学以及其它领域中变得越来越重要。它们的重要性归因于纳 米簇中表面原子相对于内部原子的高比例。这产生了一些特性，如高的 表面反应性、增加的硬度、产率和强度、降低的延展性、低温下的液体 状性能、和与尺寸相关的化学、物理、和/或量子效应(这些效应都与其 宏观对应物的性能不同)。在其最小的组成单元，元素由单个原子组成。 分子由几个原子的简单聚集体组成，而金属和其它粗晶固体包括向外连 续延伸的三维原子阵列，即单晶或多晶晶格。原子和分子的尺度用埃来 度量，1埃为10-10m或0.1nm。微晶固体诸如金属中的晶畴一般用微米来 度量。纳米簇处于简单原子态到纳米晶态的过渡段，其直径在约0.1到 约3nm范围内。优选的是，此处所述的纳米簇包括大约2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、或27个原子。在其它优选的实施方式中，纳米簇包括约2～ 27个原子，约2～25个原子，约2～20个原子，约2～15个原子，约2～ 10个原子，或者约2～8个原子。优选包囊于包囊材料诸如树枝状分子或 肽里的纳米簇的大小可取决于所用金属的种类、想要的发射颜色、和特 定的用途。
正如此处所用，“纳米颗粒”定义为一种直径为约3到约100纳米 的粒子，具有任意大小、形状或形态，并包含此处定义的贵金属。
正如此处所用，“纳米点”是一种贵金属纳米簇，它包囊在诸如树枝 状分子或肽之类的包囊材料里，其中包囊化的贵金属纳米簇能在低激发 强度下发荧光。优选的是，在纳米簇最大激发下，包囊化的贵金属纳米 簇的荧光量子产率大于约1％，其饱和强度在约1～1000W/cm2范围内。在 某些实施方式中，荧光量子产率大于约2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、或更高。在某些实施方式中，饱 和强度为约1～1000W/cm2、约10～800W/cm2、或约10～500W/cm2。最大 激发因纳米簇而异，并至少取决于纳米簇中金属原子的种类和数目。最 大激发可由本领域普通技术人员用本领域熟知的方法不费力地测定。
正如此处所用，术语“饱和强度”是指使分子的吸收饱和且与激发 强度不再成线性关系时的强度。在分子非线性吸收的饱和强度时，多光 子吸收不再取决于那种由非线性相互作用的能量产生的强度。量子产率 定义为发射光子数与吸收光子数之比。
正如此处所用，术语“水溶性”是指在水溶液中溶解和/或形成悬浮 体的能力。尽管荧光标记可以明显溶于水溶液，但它在水溶液中至少是 暂时可分散的或能形成悬浮体。
正如此处所用，“荧光”或“发荧光的”是指一种基于某些分子在不 同波长吸收和发射光线的能力的物理现象。在第一波长光(光子)的吸 收后为第二波长和不同能量光子的发射。正如此处所用，“荧光标记”就 是这样的分子，它在第一波长吸收光，在第二波长发射不同能量的光子。 正如此处所用，“荧光标记”与“发光标记”可互换地使用，而“发荧光 的”和“荧光”分别与“发光的”和“发光”可互换地使用。照这样， 荧光包括磷光和拉曼发射，并且所有发射都由术语“发光”表示。正如 此处所用，“饱和荧光”是指在所有入射强度下分子发荧光的能力。优选 的是，荧光标记包括包囊化的贵金属纳米簇。优选的是，本发明的荧光 标记是在低激发强度(诸如由汞灯提供)激发时发荧光的。优选的是， 低激发强度为约30W/cm2(～460nm)。在其它实施方式中，激发强度可为 ＜1W/cm2到最高10kW/cm2(激发波长约330nm～900nm)。激发强度的变化 至少取决于纳米簇的大小和构成纳米簇的金属，并可由本领域普通技术 人员用本领域熟知的方法不费力地测定。尽管此处所述的荧光标记能在 诸如用弱汞灯之类的低激发能量激发时发出荧光，但在一个实施方式中， 当荧光标记用激光活化时也能发荧光。
可测定本发明荧光标记的发射光谱。原子和原子(或分子)的集合 能够借助吸收或发射能级间的能量差，依据量子力学在电子能级之间跃 迁。发射或吸收光的波长使光子带有两个轨道之间的能量差。该能量可 由普朗克常数与光速之积(hc)除以光的波长来算出。这样，某个原子 或原子集合只能吸收或发射那些取决于原子精细结构的特定波长(或相 应的频率或能量)。当相应的光通过棱镜或摄谱仪时，它按照波长在空间 分散。相应的光谱即显出连续光谱，或者叠加在连续明线上(发射光谱)。 这样，当原子受到的碰撞不多(由于低密度)时就产生发射光谱。发射 谱线对应于发射的光子，所述光子是当分子或原子的集合的激发态允许 返回低能级时发射出来的。在本发明的一个优选的实施方式中，荧光标 记的发射光谱是偏振化的。在其它实施方式中，取决于纳米簇的性能， 发射可显示不同的偏振。在某些实施方式中，包囊化的贵金属纳米簇显 示偶极发射模式。优选的是，荧光标记的光谱发射特性至少部分取决于 一种或多种选自下列的特性：所用的包囊材料、树枝状分子的级别、测 试环境的pH、形成纳米点的环境的pH、由肽序列决定的肽对贵金属纳米 簇的亲合力、纳米簇的大小，和形成包囊化的贵金属纳米簇所用的特定 贵金属。
优选的是贵金属纳米簇有不定的电荷。正如此处所用，“不定的电 荷”是指贵金属纳米簇可完全或不完全还原，或者可带负电。在某些应 用中，带有一定电荷的贵金属纳米簇可能是优选的。贵金属纳米簇的电 荷可由本领域普通技术人员用本领域熟知的方法不费力地测定。
本发明贵金属纳米簇的直径优选应低于3nm，并可小于2nm或1nm。 包囊化之后，包囊化的贵金属纳米簇的直径可在小于1nm至约为或大于 15nm范围之内。包囊化的贵金属纳米簇的大小主要取决于所用的包囊材 料。例如，在一个实施方案中，用一种抗体诸如IgG来包囊贵金属纳米 簇。此抗体的直径为约10nm。在体内成象应用上，10～50nm大包囊化的 贵金属纳米簇可由淋巴系统过滤。
正如此处所用，“树枝状聚合物”是一种显示出规则树枝状分枝的聚 合物，是通过向核心或自核心顺次或分级添加分枝层而形成的。术语树 枝状聚合物包括“树枝状分子”，其特征在于有核心，至少一个内部分枝 的层，和表面分枝的层(Dvornic & Tomalia in Chem.in Britain，641-645，August 1994)。“延展型两性分子(dendron)”是树枝 状分子的一种，其带有从焦点发散的分枝，该焦点直接或经由连接部分 连接或能连接于核心以形成树枝状分子。许多树枝状分子包含2个或多 个连接到共同核心上的延展型两性分子。但是，术语树枝状分子的含义 不仅包括单个延展型两性分子。在本发明中，优选的树枝状分子是聚(酰 胺胺)或PAMAM树枝状分子，但是，也预期使用其它树枝状分子。优选 的是，树枝状分子选自0级、1级、2级、3级、4级或更高级的树枝状 分子。树枝状分子可有各种末端，包括但不限于OH末端、COOH末端和 NH2末端。所选树枝状分子的级别因包囊化的贵金属纳米簇的特定应用而 异。
树枝状聚合物包括，但不限于，对称和不对称的分枝型树枝状分子、 级联分子(cascade molecule)、arborol等等，不过最优选的树枝状聚 合物是致密的星型聚合物。此处公开的PAMAM树枝状分子是对称的，其 中分枝臂的长度相等。在前一级分枝氨基末端的氢原子上出现分枝。
即使不是通过由有规律地逐次添加分枝层而形成，过度分枝的聚合 物(例如过度支化的多元醇)可相当于树枝状分子聚合物，其分枝模式 显示类似于树枝状分子的规律性程度。
带有大小和形状受控地结构域的拓扑聚合物是一种经由其活性末端 基团彼此连接(例如共价桥接或如下文限定的其它连接)的树枝状分子， 它们叫做“桥接树枝状分子”。当多于两个致密的星形树枝状分子聚集在 一起时，它们叫做“聚集体”或“致密星形聚集体”。
因此，树枝状聚合物包括桥接树枝状分子和树枝状分子聚集体。树 枝状聚合物包括树枝状分子的级别单分散和级别多分散溶液。在单分散 性溶液中，树枝状分子基本上全部是同一级别，因此大小和形状一致。 在多分散性溶液中，树枝状分子包括不同级别树枝状分子的分布。
树枝状聚合物也包括表面改性的树枝状分子。例如PAMAM树枝状分 子的表面可借助添加氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)来改性。
正如此处所用，当涉及树枝状分子时，术语“级别”意指添加到树 枝状分子的起始核心上的重复单元的层数。例如，1级树枝状分子包含起 始核心和1层重复单元，2级树枝状分子包含起始核心和2层重复单元， 依此类推。级别(即级数和重复单元的大小和性质)的逐次建立决定了 树枝状分子的大小及其内部。
把树枝状分子连接在生物底物上的方法是本领域技术人员熟知的， 并包括连接体分子的使用。例如，硫醇-反应性物质的制法是使树枝状分 子的羟基同双官能交联剂(N-(对马来酰亚氨基苯基)异氰酸)的异氰 酸末端偶联，留下硫醇-反应性马来酰亚胺义与蛋白质偶联。
正如此处所用，“光漂白”包括导致在激发波长产生的荧光强度降低 的所有过程。在本发明的各实施方式中，贵金属纳米簇在光漂白前发射 出大于约106、107、或108个光子。在一个更优选的实施方案中，贵金属 纳米簇在光漂白前发射出大于约109个光子。光漂白可由本领域普通技术 人员不费力地加以确定。
在本发明某些优选的实施方式中，当激发包囊化的贵金属纳米簇时， 大于约80％的贵金属纳米簇发出荧光长达约30分钟以上。优选的是，贵 金属纳米簇在连续激发能(约300W/cm2，在514.5nm或476nm)下发出荧 光。在另一个实施方式中，优选的是大于约90％的贵金属纳米簇发出荧光 长达约30分钟以上。在其它实施方式中，大于80％或大于90％的纳米簇 的荧光量子产率大于约1％，饱和强度为1～1000W/cm2，发射延续长达30 分钟以上。
在一个实施方式中，树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇用于把贵金 属纳米簇穿过细胞膜运送给能与该贵金属纳米簇强力结合的肽。与贵金 属纳米簇的结合强度可以由本领域普通技术人员不费力地测定，并包括 荧光强度的目测。在一个优选的实施方式中，树枝状分子是低级别的树 枝状分子，诸如0级、1级或2级。在其它实施方式中，树枝状分子是高 级别的树枝状分子，诸如3级、4级或更高级。在某些实施方式中，该肽 在某一pH范围内与贵金属纳米簇结合。优选的是，肽在pH10～1、更优 选在9～2，最优选在8～3范围内与贵金属簇稳定地结合。在其它实施方 式中，肽在pH9、8、7、6、5、4或3下与贵金属稳定结合。这一实施方 式允许在体外和体内容易地标记蛋白质。
“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此处包括核 苷酸的任意长度的多聚形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖 核苷酸。此术语仅指分子的一级结构；因此此术语包括三链、双链和单 链DNA，以及三链、双链和单链RNA。此术语也包括修饰型式，诸如甲基 化和/或加帽，和多核苷酸的未修饰形式。更具体而言，术语“多核苷酸”、 “寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多聚脱氧核糖核苷酸(含2- 脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它形式的多核苷酸 (嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷)，和含非核苷酸主链的其它聚合物， 例如，聚酰胺(如肽核酸(PNA))和聚吗啉代(商品名Neugene，可从 Anti-Virals Inc.Coruallis，Ore.购得)聚合物，和其它合成得序列特 异性的核酸聚合物，只要该聚合物所含核碱基的构象允许碱基配对和碱 基堆叠，如同在DNA和RNA中的那样。没有打算区别“多核苷酸”、“寡 核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间的长度，这些术语可互换使用。 这些术语仅指分子的一级结构。因此这些术语包括，例如3’-脱氧-2’， 5’-DNA，寡聚脱氧核糖核苷酸N3’P5’氨基磷酸，2’-O-烷基取代的 RNA，双和单链DNA，以及双和单链RNA，DNA：RNA杂合体，和PNA和DNA 或RNA间的杂合体，而且也包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的 标记、甲基化、“加帽”、用类似物取代1种或多种天然核苷酸，核苷酸 间的修饰，例如，用不带电的连接物(如磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷 酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电的连接物(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯 等)和带正电的连接物(如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯) 进行的修饰，用含有侧链部分的那些例如蛋白质(包括核酸酶，毒素、 抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)进行的修饰，用嵌入剂(如吖啶、补骨 脂素等)进行的修饰，用含有螯合物的那些(如金属、放射性金属、硼、 氧化性金属等)进行的修饰，含有烷化剂的那些进行的修饰，用改性的 连接物(如α异头核酸等)进行的修饰，以及多核苷酸或寡核苷酸的未 修饰形式。尤其是，DNA是脱氧核糖核酸。
这些术语还包括位于基因编码区3’和5’两端的非翻译序列：基因 编码区5’端上游至少约1000核苷酸及其3’端下游至少约200核甘酸。 不太常见的碱基，诸如肌苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黄嘌呤 及其它也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿嘧啶和胞苷的 C-5丙炔类似物的多核苷酸已被证明以强亲合力结合RNA并且是基因表 达有效的反义抑制剂。也可以进行其它修饰型式，诸如磷酸二酯主链的 修饰、或者RNA核糖基团的2’-羟基的修饰。反义多核苷酸和核酶可完 全由核糖核苷酸组成，或可混合含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本 发明的多核苷酸可用各种方法制造，包括基因组制备，cDNA制备，体外 合成，RT-PCR和体外或体内转录。
“分离的”核酸分子是一种基本上与该核酸的天然来源中的其它核 酸分子(如编码其它多肽的序列)分开的核酸。优选的是，分离的核酸 不含其天然复制子里天然位于该核酸侧翼的某些序列(如位于该核酸5’ 和3’端的序列)。例如，克隆的核酸被认为是分离的。如果核酸已由人 为干预而经过改变、或者放在不是其天然位点的基因座或位置中、或者 已经通过转染而引入细胞中，则该核酸也被认为是分离的。并且，“分离 的”核酸可以不含其天然伴随的某些细胞材料，或者当用重组技术生产 时，不含培养基，或者当化学合成时不含化学前体或其它化学品。
从“分离的核酸”定义中明确排除的是：天然染色体(诸如染色体 片段(spread))、人工染色体文库、基因组文库、和cDNA文库，它们以 体外核酸制剂或转染/转化宿主细胞制剂的形式存在，其中该宿主细胞是 体外异质制剂或者是作为单集落的异质群体而平板培养的。同样明确排 除的是其中特定的核酸在载体分子中占核酸插入片段数目不到5％的上面 各文库。进一步明确排除的是全细胞基因组DNA或全细胞RNA制剂(包 括机械切割或酶促消化的全细胞制剂)。更加进一步明确排除的是作为体 外制剂或者作为一种用电泳法分离出来的异质混合物的全细胞制剂，其 中本发明的核酸未曾进一步从电泳介质里异源核酸中分离出来(如从琼 脂糖凝胶或尼龙印迹里的异质条带群体中分割单一条带来进一步分离)。
在一个优选的实施方式中，将编码结合贵金属纳米簇的肽的分离核 酸引入细胞，该肽被表达并结合贵金属纳米簇。在某些实施方式中，编 码结合该贵金属纳米簇的肽的分离核酸也可以是嵌合或融合多核苷酸。 正如此处所用，“嵌合多核苷酸”或“融合多核苷酸”包括编码结合贵金 属纳米簇的肽的核酸，该核酸可操作地连接在第二核酸序列上。优选的 是，第二核酸序列不结合或不强力结合贵金属纳米簇，并且与编码结合 贵金属纳米簇的肽的核酸相比，既具有不同的多核苷酸序列，也编码具 有不同功能的蛋白质。在融合多核苷酸里，“可操作地连接”表示：编码 结合贵金属纳米簇的肽的所述核酸和第二核酸序列彼此相互融合，从而 使得该两个序列实现使用它们所要达到的目的。第二核酸序列可以融合 到结合贵金属纳米簇的肽的编码核酸之N端或C端上。
核酸引入细胞的方法是本领域普通技术人员熟知的，它包括，但不 限于，转染、转化或转导，电穿孔，粒子轰击，农杆菌感染等等。在某 些实施方式中，核酸整合入载体或表达盒中，然后引入细胞。核酸引入 宿主细胞的其它合适的方法可在下列文献里找到：Sambrook，等 人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，及其它实验手册如Methods in Molecular Biology，1995，Vol.44，Agrobacterium protocols，Ed：Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。
正如此处所用，“多肽”是指由肽键连接的至少4个氨基酸的链。该 链可以是线性的，分支的，环状的或其组合。术语“肽”、“多肽”和“蛋 白质”在此处可互换使用。此术语不是指产物的特定长度。所以，“肽”、 “寡肽”和“蛋白质”都包括在多肽定义之内。此术语包括多肽的翻译 后修饰，例如，糖基化，乙酰化、磷酸化等等。而且，蛋白质片段、类 似物、突变或变体蛋白质、融合蛋白质等等也包括在多肽的含义之内。
本发明还提供嵌合或融合多肽。正如此处所用，“嵌合多肽”或“融 合多肽”包括结合贵金属纳米簇的多肽，该多肽可操作地与第二多肽相 连。优选的是，第二多肽的氨基酸序列实质上和贵金属纳米簇最佳结合 多肽不一样，例如，如此处所述不稳定地结合贵金属纳米簇的多肽。如 此处所用，涉及融合多肽时，术语“可操作地连接”是用来表明两个多 肽相互融合从而使得这两个序列都能实现其所使用的目的功能。第二多 肽可以融合到结合贵金属纳米簇的肽的N端或C端上。这种多肽能促进 单分子或整体研究，并允许体内或体外肽的直接标记。
在本发明的某些实施方式中，结合贵金属纳米簇的肽之长度为约5～ 1000个氨基酸，1～800个氨基酸或5～500个氨基酸。在某些实施方式 中，肽的长度为约5～10个氨基酸。在其它实施方式中，肽的长度为约 10～20个氨基酸或20～40个氨基酸。在一个实施方式中，肽包含如SEQ ID NO.1中定义的多肽序列。
本发明还包括具有上述特性的包囊化的贵金属纳米簇的制备方法。 在一个实施方式中，树枝状分子包囊化的贵金属纳米簇的制备方法包括 下列步骤：(a)把树枝状分子、含贵金属的水溶液和水性溶剂混合以产 生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)接着添加足量酸性化合物把混合溶 液调至中性范围pH；和(d)混合调好pH的混合溶液使树枝状分子包囊 化的贵金属纳米簇得以形成。在第二个实施方式中，能发荧光的肽包囊 化的贵金属纳米簇的制备方法包括下列步骤：(a)把肽、含贵金属的水 溶液和蒸馏水混合以产生混合溶液；(b)添加还原剂；(c)接着添加足 量酸性化合物把混合溶液调至中性范围pH；和(d)混合调好pH的混合 溶液使肽包囊化的贵金属纳米簇得以形成。
在这些方法中，把还原剂添加到混合溶液里以使贵金属纳米簇光活 化。优选的是，还原剂选自化学还原剂、光或其组合。在这些方法的某 些实施方式中，光可用作还原剂以使贵金属纳米簇光活化。在这些方法 的某些其它实施方式中，化学还原剂可用作还原剂。在一个实施方式中， 光与还原剂组合使用以使贵金属纳米簇光活化。优选的是包囊化的贵金 属纳米簇的制备方法是在约65°F～100°F的温度下实施的。更优选的 是，从步骤a)到步骤c)，混合溶液的温度是约68°F到约80°F，更优 选的是约68°F到约74°F。
优选的是，用于制备该化合物的含贵金属的水溶液选自AgNO3、 HAuCl4·nH2O和CuSO4·nH2O。在一个实施方式中，含贵金属的水溶液是 AgNO3溶液。在另一实施方式中，含贵金属的水溶液是HAuCl4·nH2O溶液。 在另外的实施方式中，含贵金属的水溶液是CuSO4·nH2O溶液。
在一个实施方式中，含贵金属的水溶液是HAuCl4·nH2O，还原剂添加 到混合溶液里，搅拌调好pH的混合液至少1小时，形成树枝状分子包囊 化的金纳米簇。在另一实施方式中，搅拌调好pH的混合液至少48小时， 使其形成树枝状分子包囊化的金纳米簇。在另一实施方式中，包囊化的 贵金属纳米簇是经由光还原(经由可见光或紫外光照射)，从而形成树枝 状分子包囊化的金、银或铜纳米簇。
在另一个实施方式中，当包囊材料是肽时，优选的是，步骤(a)中 贵金属与肽之摩尔比为约0.1∶1。在另一个实施方式中，步骤(a)中贵 金属与肽之摩尔比小于约0.1∶1，在其它实施方式中大于0.1∶1，并可为 1∶1或更大。
在某些实施方式中，包囊化的贵金属纳米簇荧光标记存在于生物样 品中。在某些优选的实施方式中，包囊贵金属纳米簇的肽在细胞里面表 达，也叫做“基因编程”。如此处所用，术语“表达”包含肽的转录和/ 或翻译。在另外的实施方式中，把包囊贵金属纳米簇的肽引入生物样品。 如此处所用，“生物样品”是指分离的细胞、组织或流体的样品，包括但 不限于，例如血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠 道、和生殖泌尿道的外面部分、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器 官、还有体外细胞培养组分的样品(包括但不限于，细胞在培养基中生 长所产生的条件培养基、推定的病毒感染细胞、重组细胞、和细胞组分)。 荧光标记可用于来自任何种类生物的细胞，其中该生物为原核生物或真 核生物。在本发明优选的实施方式中，该生物是真核生物。本发明真核 细胞的非限制性例子包括那些来自动物、植物、真菌、原生生物、和其 它微生物的细胞。在某些实施方式中，该细胞是多细胞生物(如植物或 动物)的一部分。
如此处所述，包囊化的纳米簇组合物以及树枝状分子大小或肽序列 的选择都会影响半导体纳米晶的特征发射光谱波长。所以，本领域普通 技术人员会意识到，此处所述纳米点的特定组成要根据待监测的光谱区 来选择。例如，可以设计在可见光区、或者在红光、蓝光或近红外区发 射能量的纳米点。在一个实施方式中，随着纳米簇尺寸的减小，包囊化 的贵金属纳米簇显示能量发射越来越强。
本发明的水溶性包囊化的贵金属纳米簇在经常使用其它不太可靠的 标记方法的各种测定方法中获得应用，这些测定方法包括但不限于，荧 光显微术、组织学、细胞学、病理学、流式细胞术、FISH和其它核酸杂 交测定法、信号放大测定法、DNA和蛋白质序列测定、免疫测定法诸如竞 争性结合测定法和ELISAs、免疫组织化学分析、蛋白质和核酸分离、同 质性测定、多聚化(multiplexing)、高流通量筛选、染色体核型分析等 等。上述包囊化的贵金属纳米簇荧光标记在可接受环境中可用于各种基 于报道分子的测定法。
在某些优选的实施方式中，本发明的包囊化的贵金属纳米簇荧光标 记用于单分子或多分子研究。本发明包含一种监测目的分子的方法，该 方法包括：(a)把包含包囊化的贵金属纳米簇的水溶性荧光标记附着在 目的分子上，其中所述荧光标记发出发射光谱；和(b)检测所述荧光标 记的发射光谱。如此处所用，检测发射光谱包括测定荧光标记的光发射 性能。单分子研究能允许测定局部环境的各个层面，从信号强度、定向 和寿命，一直到分子的发射光谱和与邻近分子的能量传递程度。单分子 研究已经用于操作个体分子并测量由分子马达或共价键产生的力。新探 针技术的开发为实时观测活细胞里分子的相互作用和交换创造条件。这 些工具使群体的个体成员在细胞亚群和亚结构里得到观察、鉴定和定量 比较。单分子研究具有提供空间和时间信息的潜力，这些信息是使用其 它更加静态的技术不可能获得的。单分子研究能够测量单个分子在细胞 内空间的体内动态移动，或者在一个延长的时段内观察单个分子的行为。 通过使用单分子方法，应该能够研究细胞集群里个体成员的时间轨迹和 反应途径而不用算出在群体的平均值。细胞过程，诸如胞吐、经通道的 流出、或转录复合物的装配都能目视观察。由等位基因多态性产生的在 结构或功能方面的个体差异，理应能在单分子层次探测出来。而且，使 用这些技术能够对特定组织里或者在某些发育阶段的基因或基因组的协 调表达实施监测。照此，包囊化的贵金属纳米簇荧光探针的使用，就为 提供生物状态信息的光谱发射之测定创造条件。如此处所用，“生物状 态”是指进行条件测定，诸如生物部分的定量和定性存在；生物部分的 结构、组成和构象；生物部分在环境里的定位；生物部分之间的相互作 用，生物化合物结构的改变和细胞过程的改变。
本发明的方法和组合物还包括连接体分子的使用，其中连接体分子 能使含有包囊化的贵金属纳米簇的荧光标记附着在目的分子上。
克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，涉及DNA连接酶、DNA聚 合酶、限制性内切核酸酶等等酶促反应的标准技术，和各种分离技术都 是已知的，而且是本领域普通技术人员普遍使用的。大量的标准技术在 下列文献中有描述：Sambrook等人，1989 Molecular Cloning，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等人，1982 Molecular CLoning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(ed.)1993 Meth.Enzymol.218，Part I；Wu(ed.)1979 Meth Enzymol.68；Wu等人，(Eds.)1983 Meth. Enzymol.100 and 101；Grossman & Moldave(Eds.)1980 Meth.Enzymol.65；Miller(ed.)1972 Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring，Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old and Primrose，1981 Princeples of Gene Manipulation，University of California Press，Berkeley；Schleif & Wensink，1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover (ed.)1985 DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK；Hames & Higgins(eds.)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press Oxford，UK； 和Setlow & Hollaender 1979 Genetic Engineering：Principles and Methods，Vols.1-4，Plenum Press，New York.所用的缩写词及术语在本领 域中被认为是标准的，并且普遍用于此处所引用的专业杂志中。
在整个申请文件中，参考了多种出版物。所有这些出版物及其中的 引用文献的公开内容都以其整体引用作为参考，以便更充分地描述本发 明所属技术领域的状态。下列各实施例不是用来限制本发明权利要求的 范围，相反是为给某些实施方式作例证的。熟练技术人员想到的对所实 施的方法之任何改变都被属于本发明范围以内。
实施例
实施例1
树枝状分子包囊化的银纳米簇的产生
方法
PAMAM从溶液中螯合金属离子的作用是已知的(Crooks等 人，Accounts Chem.Res.2001，34：181；Ottaviani等人，Macromolecules 2002，35：5105；Zheng等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：1252；Varnavski等 人，J.Chem.Phys.2001，114：1962)。PAMAM G4-OH和G2-OH树枝状分子(分 别为4级和2级羟基封端的聚(酰胺胺)，Aldrich)因而被用来浓缩、 稳定和溶解Ag纳米簇于充气和脱气两水溶液中。通过把0.5μmol G4-OH和1.5μmol AgNO3溶于1ml蒸馏水(18MΩ)并用160μmol乙酸 把溶液调到中性，银离子就很容易地与树枝状分子相互作用。通常当生 成小纳米颗粒(直径＞3nm)时，文献记载的制备方法通常添加少量还原 剂诸如NaBH4(Crook等人，Accounts Chem.Res.201，34：181；Ottaviani等 人，Macromolecules 2002，35：5105；Zheng等人，J.Phys.Chem.B 2002， 106：1252；Varnavski等人，J.Chem.Phys.2001，114：1962)。为产生树枝 状分子包囊化的纳米簇(“纳米点”)而不是纳米颗粒，反应中是不加还 原剂的。探测这类溶液荧光的方法是，在环境空气、氮气、和/或真空(10～ 5乇)条件下把10ml溶液滴加在清洁的盖玻片上，用带通滤过的汞灯之 蓝光(450～480nm)照射，通过标准的落射荧光显微镜来探测。其结果 不受氧化程度或树枝状分子产生的影响。
结果
起初，看不到这类溶液的可见吸收或荧光，但在暴露于白光前后由 溶液吸收光谱清楚地阐明了光活化(Fig。1A)。起初，光谱上只有树枝 状分子的单一吸收(284nm)。光活化后，由于光还原的小的银纳米点(Ag2～ Ag8)的吸收，溶液显示出两个新峰(345nm和430nm)(Rabin等 人，G.Chem.Phys.Lett.1999，312：394；Bonacic’-Koutecky等人，J.Chem. Phys.2001，115：10450)。光活化中同时生成的小的银纳米点的大小和几 何形状差别产生了整个可见光区的多种颜色荧光。这种大小的银纳米簇 是唯一已知的强可见光吸收和发射之物(Rabin等 人，G.Chem.Phys.Lett.1999，312：394；Bonacic’Koutecky等人，J.Chem. Phys.2001，115：10450；Linnert等人，J.AM.Chem.Soc.1990，112：4657； Mostafavi等人，Chem.Phys.Lett.1990，167：193)。光活化的荧光纳米 点溶液的质谱分析确认了这样小的尺寸(Fig.1B)。氢硼化物-还原的溶 液产生了较大的银纳米颗粒(3～7nm)，它有特征性的表面等离子的强吸 收(398nm)，但基本上没有荧光(Fig.1A)。所以，因为只出现不带等离 子吸收的荧光银纳米点，故它们应该远小于3nm，并且可能小于2nm。
与吸收的变化相关，当银离子在树枝状分子主体内光还原时，荧光 随照射时间的增加而增强。在约6秒钟之内，经少量连续的光活化，视 野就被闪烁的单个荧光粒子填满(Figs 2A～D)。这种很亮、很稳定的荧 光特性是被高度偏振的并显示出清晰的偶极发射模式(Fig.2E；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B 1999，103：11237)和单个发射物的闪烁动 态特性(Lu等人，Science 1998，282：1877；Dickson等人，Nature 1997，388：355；Hu等人.J.Am.Chem.Soc.1999，121：6936)。在此银-限 定的环境中完成光活化后，荧光银-树枝状分子纳米点在平均发射强度和 光谱特性两方面都保持非常稳定。因此与在AgO膜上相比，树枝状分子 稳定了纳米簇并提高了其光学性能(Peyser等人，Science 2001，291：103； Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：7725)。因为小Ag纳米簇的 结合能小于激发能，树枝状分子的笼效应可能类似于稀有气体基质的笼 效应(Rabin等人，Chem.Phys.Lett.1999，312：394)，通过防止光解离以 稳定并提高纳米簇荧光。尽管已知AgO膜上的Ag纳米簇荧光能被水焠灭 (Mihalcea等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123：7172)，但是树枝状分子- 包囊化的银纳米点在水溶液中却是强荧光性的且相当稳定。所以，光化 学法制成的Ag纳米簇在树枝状分子内同样已被保护，从而避免与溶液中 的焠灭剂起反应。
上述光活化的纳米点溶液的电雾化电离质谱(ESI-MS)显示出树枝 状分子+Agn(n＝2～4)的强力富集化，其富集程度胜过末光活化的因此 是非荧光性的纳米点溶液(Fig 1B)。在未光活化的纳米点溶液中，树枝 状分子+Ag2和较大的纳米簇峰没能观察到，这清楚地表明，只要溶液受 到光活化，就有来自树枝状分子-包囊化的Ag纳米簇(大小为2～8个原 子)的发射(Zheng & Dickson，J.Am.Chem.Soc.， 2002，124：13982-13983)。
与研究AgO膜上的纳米簇(Peyser等人.Seience 2001，291：103； Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：7725)相反，单个纳米簇的 光谱测定很容易在这些可溶性树枝状分子-包囊化的银纳米点上进行。尽 管AgO上的Agn在整体光谱方面与纳米点水溶液难区分(Fig.3)，但是同 整体纳米点试样或AgO膜上的单个纳米簇相比，单个Ag纳米点具有更窄、 更稳定的发射光谱(Fig.3)。由于AgO膜上的纳米簇大小因激发而频频 改变，所以单个纳米簇显示出较大的谱移(Peyser等人，Science 2001， 291：103；Peyser等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：7725)。相反，从 这些高度分散的树枝状分子-包囊化的的银纳米点得到了5条稳定且易于 区分的荧光光谱(Fig.3)，这表明整体光谱是由少至5种尺寸的纳米簇 决定的。室温下单个纳米点荧光光谱比整体纳米点膜或溶液的光谱显著 狭窄，并且没有出现明显的光谱扩散。由于没有另外的银能整合到纳米 点里及树枝状分子稳定了纳米点荧光，所以单个纳米点的发射是相当稳 定、强劲的，最大值在533nm、553nm、589nm、611nm、和648nm，不过 易于见到荧光间歇现象。与II-VI纳米颗粒相比，这些纳米点颇为光稳 定，有约80％的个体特点在300W/cm2(514.5nm或476nm)的连续激发下 保持荧光＞30分钟。只是在小尺寸的纳米点上观察到了纳米点光活化、 闪烁、偶极发射模式、光谱稳定性、质谱测定法和荧光，这进一步证实， 尺寸小于8个原子的单个树枝状分子-包囊化的Agn纳米簇导致了所观察 到的发射。类似方法制备的无树枝状分子的溶液或者无银的溶液中就看 不到荧光。对溶解度和稳定化至关重要的是，树枝状分子包囊和保护纳 米簇，产生强发射并提供防止进一步光还原/纳米簇生长的银-限定环境 (silver-limited environment)。
通过这些方法，以及通过环境条件下的直接光还原，一种十分光稳 定的水溶性银纳米点业已在树枝状分子里成功地产生。这种银纳米点在 水溶液和膜中都相当稳定和具有强荧光性，而且借助弱汞灯激发 (30W/cm2)容易在单分子水平观察到。借助树枝状分子附着的合成控制 (例如，可把树枝状分子羟基偶联到双功能交联剂N-(对马来酰亚氨苯 基)异氰酸的异氰酸末端，保留硫醇-反应性马来酰亚胺用于与蛋白质偶 联，从而制备硫醇-反应性物质)，这种简单的纳米材料可能用作生物标 记，从而能更广泛地进行单分子研究，而无需昂贵的激光源。光漂白前 强烈的光活化发射和非常长的寿命，使它们成为用于研究化学和生物系 统的有吸引力的新型纳米材料。
实施例2
单个Ag纳米点的表征
一系列PAMAM树枝状分子级别[GO-OH到G4-OH，直径(MW)从1.5nm (517g/mol)到4.5nm(14，215g/mol)]用来产生有强荧光性的Agn纳 米点。极亮的荧光在pH8.0～3.0范围内看到。这些不同级别的PAMAM 能成为控制纳米簇分布的一种手段：用小级别树枝状分子产生的纳米点 与用大级别树枝状分子产生的纳米点显出不同的发射光谱。纳米点发射 不仅在光谱和强度方面非常稳定，而且显出带有十分清晰和稳定的偶极 发射模式的高度偏振发射(Fig2E)。发射模式的观测使得使用三维取向 法成为可能，该方法的开发是来跟踪溶液或固定特征方面的取向动态特 性，如下列文献所述：Bartko & Dickson，J，Phys.Chem，B 1999，103：3053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem，B1999，103：11237 -11241；及Bartko等人，Chem，Phys，Lett.2002，358：459-465.
这些单个Ag纳米点的许多光物理参数也已被表征鉴定(Fig，4A)。 虽然远小于量子点，在低激发强度(30W/cm2460nm，紧邻450nm激发高峰) 下由极短荧光寿命产生极亮的纳米点荧光。在仪器响应去褶后，用来自 双重Ti：蓝宝石的400nm激发，时间相关单光子计数测定个体纳米点寿 命，显示出一个主要的亚100ps部分(92％)。纳米点也有一个较慢(1.6 纳秒)衰变部分。极快的松驰表明基态与激发态间有极强的联系，因而 产生一个来自在极小(几个原子)纳米簇的极强的跃迁动量。
单个纳米点的吸收截面是通过饱和强度测定法测定的(Fig，4B)。 这些纳米点与明确表征的单个DiIC18分子相比较，该分子有熟知的饱和 强度，寿命、及荧光量子产率(Macklin et al，Science 1996，272： 255-258)。这些实验指出：Ag纳米点的吸收截面比最佳有机染料强约 20倍，几乎和最佳CdSe量子点相等。加之，通过单个DiI分子和单个纳 米点两者的吸收光子总数的比较，其纳米点荧光量子产率计算的低估计 值至少为约30％。另外，这些Ag纳米点显示出至少可与更大的II-VI量 子点相当的光稳定性，带有＞90％的个体特征，在300W/cm2连续514.5-nm 激发保持发荧光＞＞30分钟。当发射＞106个光子/秒接近饱和时，通常 持续大于1小时的连续光激发，典型的单个纳米点在光漂白前发射的光 子大大超过109。这比最佳有效染料发射的总光子数大两个数量级。因此， 这些纳米点有机会探测广泛范围内生物系统短期和长期单个分子的动态 特性。
于是，通过环境条件下直接光还原，一种树枝状分子-包囊化的水溶 性银纳米簇(Ag纳米点)业已产生。这种银纳米点在溶液和膜中都相当 稳定，且当激发紧邻吸收峰450nm时，通过弱汞灯激发(30W/cm2)，可在 单分子水平上进行观察。通过树枝状分子附着的合成控制，这种简单的 纳米材料作为生物标记是很有用的，从而使单个分子研究，不用昂贵的 激光源，得以极广泛地应用。光漂白前强烈的光活化发射和极长的寿命， 使这些有吸引力的新纳米材料用于研究生物系统。
实施例3
树枝状分子包囊化的金纳米簇的产生
以前的研究已产生了有荧光性的，表面钝化的金纳米簇，其大小从 28个原子到更小粒子(＜1.2nm)，并具有近红外(Link等人，J，Phys， Chem.B2002，106：3410-3415)，红的(Huang & Murray，J.Phys.Chem.B 2001，105：12498-12502)和蓝的发射(Wilcoxon等人， J.Chern，Phys.1998，108：9137-9143)，随着纳米簇粒径的减小有越来越 高的能量发射。尽管与整体金膜相比有百万倍增强的荧光量子产率φF的 Au纳米簇业已产生，(Mooradian，A.Phys.Reu.Lett.1969，22：185-187) 10-3～10-4量子产率和多分散的纳米颗粒粒径分布已使它们不能当做有效 的荧光团(Link等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem.B 2001，105：12498-12502)。本发明公开了一 种水溶性单分散的蓝-发射Au8纳米点，当其由生物相容性PAMAM树枝状 分子(Tomalia，Sci，Am.1995，272：62-66)包囊化和稳定时，显示出41 ±5％的荧光量子产率，比其它已报道的金纳米簇(Link等人，J.Phys. Chem，B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.CHem B2001，105：12498-12502)提高不止100倍。较大的Aun纳米点，带有全 可见区强发光，也已产生。
2级和4级的OH-封端PAMAM(G2-OH和G4-OH，Aldrich)适用于稳 定和加溶处于水和甲醇两溶液中的金纳米簇。通过把0.5μmol G4-OH或 G2-OH和1.5μmol HAuCl4·nH2O(Aldrich)溶于2ml蒸馏水(18MΩ)， 通过向溶液中慢慢加入等量NaBH4，金离子就螯合到树枝状分子里并被还 原。还原了的金原子聚集在树枝状分子里形成小纳米点(树枝状分子-包 囊化的纳米簇)和大纳米颗粒。溶液搅拌两天直到反应和聚集过程完结。 接着，溶液经由离心作用(13,000g)纯化以除去大金纳米颗粒(Crooks 等人，Accounts Chem.Res.2001，34：181-190；Esum等人.Langmuir 1998，14：3157-3159)，留下一种无色透明的金纳米点溶液。尽管比纯树 枝状分子峰(285nm)弱(见Fig，5A)，但减去纯树枝状分子吸收后仍得 到一清晰的树枝状分子包囊化的金纳米簇吸收光谱。由Fig.5B可见，一 条新吸收谱带384nm(带宽～60nm，FWHM)出现在最后的荧光金纳米点溶 液中。与大金纳米颗粒的吸收光谱相反，没有看到此溶液的表面等离振 子吸收(520nm)，表明该纳米点小于～2nm(Crooks等人，Accounts Chem， Res，2001，34：181-190；Esumi等人，Langmuir 1998，14：3157-3159)。
清楚地看到了这些树枝状分子包囊化的金纳米点溶液的强蓝色荧光 (激发峰384nm，发射峰450nm)(Fig6)。荧光激发峰和带宽与纳米点吸 收谱带(Fig 5B)完全一样。在相同的合成条件下，G2-OH和G4-OH树枝 状分子产生无法区别的荧光溶液，可是G0树枝状分子却只产生一种带有 黑色金粒的非荧光溶液。这种多相溶液使人们认为，不象较大的2级和4 级产物，小的0级树枝状分子产物不足以保护和稳定金纳米簇。惹人注 目的是，对于384-nm激发，G4-OH和G2-OH包囊化的金纳米点的累积荧 光量子产率为41％±5％，用同样发射硫酸奎宁为参照。该量子产率在甲醇 中进一步增加到52％±5％。发射的时间相关性显示，有两个寿命部分(Fig， 7A)是金纳米点发射的特征(Link等人，J.Phys.Chem.B 2002，106：3410-3415)。短寿命部分为7.5ns，在发射中占优势(93％)，可 能起因于金纳米点的低位d轨道和激发sp能带间的单态跃迁。长寿命部 分(2.8μs，7％)可能是由于三态单态能带内跃迁(Link等人，J.Phys. Chem，B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem.B 2001，105：12498-12502)。
清楚的树枝状分子结构使通过电雾化电离(ESI)质谱法分析包囊化 的纳米簇的粒径成为可能。如Fig，7B所示，Au8是荧光溶液中的主要含 金组分而其丰度直接与荧光强度有关，与试样制备无关。取决于还原条 件，在质谱中能出现Au浓度、树枝状分子级别，及不同的含金峰。在所 有情况(＞20个各种制备试样)下，蓝荧光强度仅仅与质谱中看到的含 Au8粒子之丰度有关.与稳定的有8个价电子的纳米簇一致(每个Au原子 有1个；Lin等人，Inorg.Chem.1991，30：91-95)，此主要纳米簇被证实 是处于总体中性氧化态，因为即使100倍过量强还原性BH4 -也没改变该纳 米点的荧光。当溶于D2O而不是H2O时，通过相对于树枝状分子母体峰的 预期谱移证实，还发现有5个水分子与亲水性PAMAM树枝状分子-Au络合 物缔合着。5个水分子可认为是有利数值，同时在其它同样制备的试样的 质谱中也看到对应于有1～6个水分子的Au8的较小的峰。这些含Au8的峰 仅在有荧光性的Au纳米点溶液中看到，而且不同方法制备的溶液之荧光 强度仅仅与该Au8纳米点峰的相对丰度成正比。加之，使用HAuCl4和AuBr3 两者的Au纳米点制剂产生带有完全一样质谱的无法区别的荧光性溶液。 这就表明，该高效蓝发射起因于Au8纳米点。各种颜色的发射可以通过调 整Au：树枝状分子的相对浓度以产生较大的Au纳米点而发生。
如上所述，来自金纳米点的发光，被认为是由d满带与sp导带间的 跃迁引起的(Link等人.J.Phys.Chem.B 2002，106：3410-3415；Huang & Murray，J.Phys.Chem，B 2001，105：12498-12502；Mohamed等人，Chem. Phys.Lett.2000，317：517-523)。随纳米簇粒径减小，各谱带中分立态 间的间隔加大，导致相对于更大纳米点的荧光的蓝移。比不同方法制备 的较大纳米簇大不止100倍的荧光量子产率的提高可能起因于两个因素。 存在于极小Au8纳米簇的态的低密度使内部无辐射松弛路径最少化。加 之，更大树枝状分子笼更好地保护这些纳米簇/纳米点免于在溶液中猝 灭。这后一解释是来自于0级树枝状分子产物不能稳定有荧光性的Au纳 米点。另外，纯化了的溶液中，没有大的金纳米颗粒以猝灭纳米点荧光 (Dulkeith等人，Phys.Rev.Lett.2002，89，art，No-203002；Haang & Murray，Langmuir 2002，18：7077-7081)。
总之，单分散性Au8纳米点是在树枝状分子PAMAM水溶液中合成并稳 定化的。Au8纳米点显示出强的粒径特性发射，其水溶液中的量子产率实 测为～41％。金纳米点作为一种新荧光团的实际应用，由于量子产率不止 100倍的提高而变得可能。
实施例4
树枝状分子-包囊化的铜纳米簇的产生
OH封端PAMAM的2级和4级产物(G2-OH和G4-OH，Aldrich)用于 稳定和加溶处于水和甲醇两溶液中的铜纳米簇。通过把0.5μmol G4-OH 或G2-OH和1.5μmol硫酸铜溶于2mL蒸馏水(18MΩ)，通过向溶液中慢 慢加入等量NaBH4，铜离子就螯合到树枝状分子里并被还原。被还原的铜 原子聚集在树枝状分子内部并形成小纳米点(树枝状分子-包囊化的纳米 簇)和大纳米颗粒，留下一种黄色透明的铜纳米点溶液。
清楚地看到了这些树枝状分子包囊化的铜纳米点溶液强的蓝色荧光 (激发峰392nm，发射峰470nm)(Fig，8)。用不同级别的PAMAM树枝状 分子产物重做这种实验并测定其发射和激发光谱。测定各级树枝状分子 包囊化的铜纳米簇的量子产率。用电雾化电离(ESI)质谱法分析包囊化 的纳米簇的粒径。取决于还原条件、铜的浓度，和树枝状分子级别，各 种含铜峰出现在质谱中。树枝状分子包囊化的铜纳米簇的进一步表征的 实施，如实施例5-6对树枝状分子包囊化的银纳米点所述的。
实施例5
水溶性光活化的荧光Ag纳米点产生的最优化和控制
树枝状分子和化学还原剂通常用于合成大的金属和半导体纳米颗 粒，而更小的Ag纳米点却能不费力地合成，就是把0.5mM AgNO3水溶液 添加到所需的PAMAM树枝状分子溶液(适当摩尔比，pH调至中性)中。 通常，不加化学还原剂，靠慢慢加入少量NaBH4来防止光活化也可得到类 似的结果。在没加任何化学还原剂的溶液中，该混合物只要保存在暗处， 就看不到可见吸收且没有荧光。但是，经用一未滤光的100W汞灯光活化 整个溶液5分钟后，可见吸收(～450nm)和强荧光二者都出现。当该溶 液通过显微镜高强度照射时在小体积内发生更快的光活化。
虽然此纳米点合成方法做得很好，可是此法产生一种分布很宽的带 有全可见区荧光的纳米点。为使合成纳米点的分布变窄，必须使光谱性 能与产生条件发生连系。某些纳米簇粒径可能在特定的激发和浓度条件 下优先产生。例如，有人指出总荧光强度和总体发射颜色是和所用树枝 状分子级别非常相关的：0级树枝状分子产物在低Ag∶树枝状分子比 (0.3∶1)时主要产生黄和绿色强荧光纳米点，而4级PAMAM则需要更高 的Ag：树枝状分子比(3∶1)以产生全色纳米点。在与0级～4级或高 级树枝状分子起反应中，通过调节Ag∶树枝状分子比和总浓度两者来使 反应条件最佳化。工作在各树枝状分子级别只是刚开始产生荧光的比例 下，最小的发射纳米簇之浓度会优选提高。用不同波长范围对等分量的 各溶液照射不同时间。把这些溶液与那些经由亚化学计量添加NaBH4溶液 制得的溶液相比，以对照化学和光还原方法。用电雾化电离质谱法测定 等分量的各试样溶液并与来自未光活化的溶液之信号对照。用荧光显微 术和ESI-MS的平行分析来鉴定最小纳米簇的光谱特征。
此组实验会帮助阐明Ag纳米簇在纳米点试样中的分布。因为纳米点 只含几个原子，纳米点粒径可能至少会粗略地遵守泊松统计规律(小数 统计)，给出每个树枝状分子可预测的银原子数。但是泊松统计是假设不 存在其它干扰以偏离计数统计。因为不同纳米簇在不同情况下大体上稳 定，调整纳米点产生条件会得出修正的泊松分布，对鉴定各粒径纳米点 的性能，有关总数作出实验验证是重要的。在给定浓度下，调节浓度应 改变这个由反应进度调节的有关总数。偏离泊松统计规律将是相对平衡 浓度和特定纳米簇粒径优选稳定的一个直接量度。所以，对于给定量的 树枝状分子改变Ag的浓度用质谱法和荧光显微术测定在光活化前后各该 混合物将会提供关于控制纳米点形成的平衡常数之详细信息。这些实验 将会决定所需的Ag浓度来优选产生一种在该纳米点范围内想要的银纳米 簇和各级PAMAM的平衡常数。
加之，利用彩色CCD摄象机和荧光分光计，在荧光显微镜视野中对 某一给定颜色的纳米点进行计数。图象的模拟、拟合、和处理软件已记 载于IDL(Interactue Data Language Research Systems Inc.)。一个 开放的程序设计环境对图象和数学处理来说是理想的。测量单个分子荧 光光谱可能是一种冗长乏味的工作方法，单个纳米点的一个代表性试样 用分光计来探测以决定给定试样中不同的发射纳米点的数目。只要光谱 纯度和单个纳米点发射窄度确定，便用彩色CCD摄象机来对单个的特征 计数。一种带标准镶嵌滤光器产生彩色图像的单片式CCD，用4个像素(1 红，1蓝，2绿)生成一个复合彩色像素。在单片彩色CCD上受衍射限制 的小部件不能覆盖足够的像素以产生准确颜色。当用此摄象机检测时， 由于通过不同数目的红、蓝和绿像素检测，任何试样位置的小变化实际 上会记录成发射的颜色变化。由于各特征尺寸小，三片式CCD将会提供 准确的颜色信息。采用三片式CCD，每个粒子的发射颜色将被鉴别，而用 户编制的粒子计数软件将被用来自动检点各色纳米点的数目。来自单个 纳米点的荧光颜色分布将与各光活化或化学还原的溶液的质谱发生连 系，以在各类纳米点溶液内的特定纳米簇粒径指定颜色。分光计将会表 征鉴定纳米点发射的谱宽，而CCD只提供综合颜色，但带有高灵敏度和 时间分辨率。因此，为了准确表征鉴定单个纳米点，及起因于某组产生 条件的纳米点分布，它们的组合是重要的。
实施例6
特定Ag纳米点尺寸合成的最优化
已知的PAMAM树枝状分子和Ag离子及原子的pH敏感性，可用来控 制Ag纳米簇尺寸、因而控制光谱性能。已知PAMAM的尺寸随pH的降低 而增大(Kleinman等人，J.Phys.Chem.B 2000，104：11472-11479；Lee 等人，Macromolecules 2002 35：4510-4520；及Bosman等人，Chem. Rev.1999，99：1665-1688)。此粒径变化使树枝状分子外部显然更加可渗 透，且在其表面产生较大空腔来容纳纳米簇甚至纳米颗粒。在高pH下， 树枝状分子相当紧密，从而使离子不能到达树枝状分子核心。此尺寸行 为很好地配合了银对碱性环境的偏爱。因此，Ag离子和金属纳米簇在树 枝状分子内部与碱性的胺强相互作用。随着pH降低，Ag向树枝状分子内 部的分配会明显增多。在酸性pH下提高了的树枝状分子渗透性和银易与 树枝状分子内部相互作用两者都使人认为较大的纳米簇理应在低pH下更 易形成。由于pH对高级树枝状分子具有更明显的作用，对4级产物G4-OH和G4-NH2 PAMAM树枝状分子的pH研究将会实施。此方案用来把纳米点的 尺寸分布优先转移到较大和较小的尺寸。作为pH的一个函数，测量整体 吸收和发射光谱，如上所述对给定颜色的单个纳米点计数。作为树枝状 分子级别和pH两者的函数，测定纳米点分布以便获得控制纳米点的光谱 性能。只要纳米点产生，就使pH返回到7，以测定形成的纳米点在PAMAM 主体中的稳定性。对全部上述溶液做ESI-MS，使纳米点试样的光学性能 的变化与Ag纳米簇粒径的变化直接发生连系。同时，这些方法将能测定 那些涉及PAMAM树枝状分子内特定Ag纳米簇粒径的光谱性能。
树枝状分子-包囊化的纳米点的光物理表征
对时间范畴内的纳米点做整体寿命测定，使用倍频钛蓝宝石激光器 作为激发(400nm、82MHz重复率、200fs脉冲宽度)、10GHz Si光电二极 管、和20GSample/sec数字示波器，在每个方式中，此组合能以50ps时 间分辨率采取样点。此快速检测系统足够灵敏地通过光学显微镜为整体 试样工作。但是，对于单个纳米点，使用一种时间相关单光子计数板 (Picoquant)和较慢但很敏感的雪崩光电二极管，两者都受APD抖动的 限制到～300ps的寿命。通过仪表响应的去褶，Ag纳米点的主要荧光寿 命部分测定为～100ps。所以，对来自Ag纳米点组较亮的发射，亚100ps 寿命的快速测定就使用这一更快的检测系统。如有多寿命存在，则有时 间范畴法来使各种时间组分去褶是相当直接的。
吸收截面测定的方法是，通过与单个DiIC18分子相比，一种带有非 常明确表征的吸收截面的染料和一种在单分子态以其为工作对象的染料 (Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B1999，103；3053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys.Chem.B1999，103：11237-11241；和Bartko等人， Chem.Phys.Lett.2002，358：459-456)。通过鉴定闪烁物种和那些同时 显示的偶极发射模式来确认单分子性能，便于避免给定试样中不知其准 确浓度，和简单测定已知吸收截面的单分子之吸收强度，并比较饱和强 度。在给定的试样中，利用个体纳米点光谱，在给定纳米点溶液范围内 的分布、及其相应的吸收截面的组合，测定各纳米点品种的浓度。这将 用于测定在给定溶液中给定颜色纳米点的光密度，并通过利用树枝状分 子和银的初始浓度来测定纳米点形成的平衡常数。
利用各粒径纳米点的测得的浓度及其对总溶液吸收的贡献，来测定 给定纳米点类型的光密度。通过与罗丹明6G甲醇溶液的比较，制备相同 光密度的纳米点溶液。通过在和标准罗丹明溶液等同的纳米点光密度之 波长激发下测定荧光量子产率。罗丹明荧光强度与所需纳米簇荧光强度 (当在其特征光谱窗范围内查看时，在考虑到来自溶液中其它纳米簇的 更小而已测到的贡献之后)之比，将直接产生各纳米点的量子产率。这 种比例测量方法不需要知道纳米点的绝对浓度就能够准确测定量子产 率，因为罗丹明6G参考标准和被探测的纳米点两都吸收的光子数目是一 样的。加之，整体和单分子试样两者的质谱和光物理的表征法将明确地 决定各色纳米点的粒径和光物理特征。此信息也将引出一套用于相对于 其它粒径优选富集一种纳米点粒径的合成方法。
荧光稳定性
基本上不受环境相互作用的影响，正在进一步仔细研究树枝状分子- 稳定的发射，以求产生在多种不同环境里一种给定纳米点的在数量上相 似的发射。这种环境不敏感性与II-VI(如CdSe)量子点的环境不灵敏 性完全相反，其中表面钝化由于表面存在阱态而对综合光物理性能非常 关键(Bracheg等人，Science 1998，281：2013-2016；Chan & Nie， Science 1998，281：2016-2018；Nirmal等人，Nature 1996 383：802-804； Huynh等人，Adv.Mater.1999，11：923；Alaisatos，Endeauomr 1997， 21：56-60；Klimou等人，Phys，Rev.B 2000，61：R 13349-R13352)。树 枝状分子-包囊化的纳米点看来象是通过一种隐藏在水溶性树枝状分子 核心里的生色团来避免这样一些困难。闪烁(荧光间歇现象)是作为离 子强度和pH的函数来探测的。通常使用的缓冲剂诸如磷酸盐缓冲剂和乙 酸钠/乙酸等用来同时控制pH并调节离子强度。把带有不同吸收的从丙 烯酰胺到染料的猝灭剂添加到各纳米点溶液中来测定Ag纳米点的能量传 递。为测定猝灭度，和树枝状分子对纳米簇的稳定性及与环境的隔离性 而做Stern-Valmer猝灭研究。但是，快的寿命就意味着这些纳米点基本 上对猝灭不敏感。除闪烁和总发射强度以外，还有荧光寿命和光谱也将 被测，以判定是否发生由于环境相互作用的任何变化。但是，因其极强 跃迁和短寿命，它们可能在FRET供体-受体对中形成极好的受体。整体 和单个实验译解那些可能发生的光物理动态特性的变化，该变化起因于 异常闪烁动态特征或荧光效率中的平均总减少。主体密度和树枝状分子 粒径也得到调节。为直接测定由连续的较大、和较高密度的树枝状分子 主体提供的保护，探测了Ag纳米点的闪烁动态特性和0级到4级PAMAM 树枝状分子的光物理参数。这些研究将直接测定溶剂和猝灭剂向树枝状 分子核心里的渗入程度。
取向动态特性
以线性偏振个体表面为界(bound)的纳米点之取向动态特性研究有 两个目的：认为小Ag纳米簇的几何结构变化结果形成极不相同的吸收和 发射波长(Harbich等人，J.Chem.Phys.1990，93：8535-8543；Fedrigo等 人c，J.Chem.Phys.1993，99：5712-5717；Rabin等人，Chem.Phys.Lett. 2000，320：59-64)，以及取向信息可能对生物标记实验非常有用，无论是 用于能量传递测量或是用于跟踪个体蛋白质的取向运动。这与更大的不 是线式偏振的CdSe量子点相反，其是各方向发射，其特征在于一个单独 的“暗”轴(Empedocles等人，Nature 1999，399：126-130)。因此， 使纳米簇的取向动态特性与任何观测的光谱变化发生连系，对了解几何 结构的变化是否也产生不同着色的Ag纳米点这一问题是极其重要的。这 些实验也将用三片彩色CCD来进行以获得彩色发射模式。为确认光谱足 够窄，利用150l/mm衍射光栅通过显微镜联合摄谱仪获得单个纳米点荧 光光谱。将取向迹线拟合到偶极界面处的发射模型.(Bartko等人， J.Phys.Chem，B1999，103：3053-3056；Bartko & Dickson，J.Phys，Chem. B1999，103：11237-11241；Hollars & Dunm，J.Chem.Phys.2000，112：7822- 7830；Helle & Axelrod，J.Opt.Soc.Am，B-Opt.Phys.1987，4：337-350)， 当通过光学显微镜观察来跟踪起因于树枝状分子主体中纳米簇迁移的真 实3-D纳米簇取向动态特性。
实施例7
银纳米点的肽包囊化的
着手利用生物系统固有的巨大多样性(Whaley等人，Nature 2000， 405：665-668；Lee等人，Science 2002，296，892-5；和Seeman & Belcher， 2002.Proc.Nat.Acad.Sci USA，99Supp12：6451-5)，已经证明，一 个短的九氨基酸肽能使Agn纳米簇荧光稳定。最近报道，序列为AHHAHHAAD (SEQ ID NO：1)的短肽在NaBH4还原时与大的金属和半导体纳米颗粒相 互作用(Djalali等人，J.Am.Chem.Soc.2002，124：13660-13661； Slocik等人.Nano Lett.2002，2：169-173)。利用上述轻度光活化步骤， 不用化学还原剂，以Ag与肽之摩尔比为0.1∶1，产生了有极强荧光性的 肽一包囊化的纳米点。与在其它支架里形成纳米点所需的高比例相比， 这个比例产生了许多更有荧光性的品种。在当量支架浓度下，3∶1的Ag与树枝状分子之比是树枝状分子包囊化的所必需的，而从BSA(牛血清清 蛋白)产生荧光就需要更高的比例(高的Ag浓度)，上两个结果就确实 意味着该肽优先结合纳米簇。这种初步结果指出，即使对未优化的肽来 说，非特定标记应当不成问题，这是由于极强的肽-银相互作用。加之， 用此肽荧光图象几乎没有全红和橙色发射体，表明比那些由大树枝状分 子稳定的纳米点有更窄的荧光分布。因此，即使是肽包囊化的初步尝试， 这一更强更特定结合也优选产生了一种以更窄的粒径分布，在肽支架里 的更短发射波长(大概更小)的Ag纳米簇。这一结果强力支持如下的假 说：高选择性的纳米点结合肽可经由推荐的筛选方法来鉴定，而不同的 肽可能使不同粒径/颜色的纳米点稳定。
极小，有强荧光性和非常光稳定的水溶性Ag纳米点已经产生。它只 有几个由PAMAM树枝状分子和短肽包囊化的的原子。非常有利的光学性 质已经产生了具有全可见区粒径相关发射的、非常光稳定、和强力吸收 和发射的物质。我们可以利用单分子显微镜和水溶性贵金属纳米簇来产 生和表征那些更强有力的标记方法和材料。这些特定的，多色的标记使 那些高灵敏度的单分子实验成为可能、大大提高了容易程度和实验简单 性。这一类型的新荧光探针开发的关键在于单分子方法在探索生物系统 复杂性方面的一般适用范围和利用。
实施例8
用于银纳米点包囊化的最佳肽的鉴定
因为Ag是生物相容的，且能做到无毒，这就为开发一种可能达到的 最小和最亮的体内荧光标记提供极好机会。上述这些方法可应用在肽支 架里面金和铜纳米点的形成。树枝状分子-包囊化的纳米点已能用作小 型、极亮的生物相容标记。尽管比绿色荧光蛋白(GFP)小得多，3.272kD2 级PAMAM树枝状分子仍然大于多数有机染料。为进一步探究Ag纳米点用 作生物标记的开发潜力，对那些特异地结合在不同大小金属纳米簇的特 定肽序列作鉴定，对其用作生物分子的特异性多色标记之真实前景作评 估。对于Ag纳米点荧光通过肽文库的建立和搜索，对那些最紧密结合的 序列作鉴定。对在这些序列里形成的纳米点之稳定性、光活化、和光物 理性能作测定。与树枝状分子主体比较的相对稳定性也作评估。照这样， 对纳米簇在树枝状分子与肽间的转移作了研究。
实验方法
许多蛋白质-配体相互作用的研究利用噬菌体展示技术来鉴定那些 结合其它分子的肽(Wolcke & Weinhold，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2001，20：1239-41；Krook等人，Biochem，BiopHys，Res， Commun，1994，204：849-54；Nicholls等人，J.Molecular Recognition 1996，9：652-7(1996)；Stern & Gershoni，Methods Mol，Biol.1998，87， 137-54)。尽管是一种有效的方法，噬菌体展示也需要把相互作用组分之 一固定在固体表面。基于噬菌体的肽文库筛选的应用最近也已在合成和 稳定单一的无机材料中得到了证明(Whaley等人，Nature 2000，405：665-668；Lee，等人Science 2002，296：892-895；Seeman & Belcher，Proc，Natl.Acad.Sci，USA 2002，99：6451-6455)。
因为靶肽会使溶液中的强Ag纳米簇荧光稳定，Agn结合型肽的鉴定 则通过一种基于大肠杆菌的系统(FliTrx随机肽展示文库，Invitrogen) 与荧光激活细胞分选术(FACS)偶联来完成。这两种技术的组合将允许 进行基于溶液的筛选策略。使用主要的细菌鞭毛蛋白(FliC)和硫氧还 蛋白(TrxA)，FliTrx肽文库把肽展示在大肠杆菌表面上。市场上买得到 的Fli Trx文库由不同组插入硫氧还蛋白之活性部位环的随机十二肽的 组成，该硫氧还蛋白本身插入鞭毛蛋白的非必需区。随机十二肽被形成 在TrxA里的二硫键限定。给培养物添加色氨酸，能诱导肽蛋白融合体的 表达，而这将保证全部肽融合体同时展示。当诱导后，该融合蛋白就输 出并装配在细菌细胞表面组装成鞭毛，提供受限肽的展示。因这些肽是 以高拷贝数产生在大肠杆菌的外面，对这些肽稳定Ag纳米点荧光的性能 进行了测定。然后用流式细胞术按照荧光性质对细菌群体进行分选，以 分离那些发射荧光的细菌。
Agn纳米点在展示的Fli Trx肽上产生的最佳化
用上述鉴定的Agn通过光学显微镜来测定在细菌表面上形成肽包囊 化的纳米点的最佳光还原条件(见实施例7)。合成了一种编码九肽序列 的寡核苷酸，以及侧翼BglII和EcoRV识别序列(Operon Co.)并将其 克隆到来自Invitrogen Co的pFli Trx载体之多克隆位点上。这一构建 体将把肽如上所述地插入鞭毛蛋白的非必需区。分离质粒并转化入宿主 菌株GI826(Invitrogen)导致该肽在大肠杆菌表面展示。然后用此菌株 来鉴定那些当用FACS来筛选FliTrx文库时适于产生荧光肽-包囊化的Ag纳米点的光活化和化学还原条件。当用蓝光照射和当使其受到BH4还原 时，评估细胞的生存力以及产生Ag纳米点的效率。起初，来自个体细菌 的总荧光，将作为通过光学显微镜许多不同Ag+浓度的光还原时间的一个 函数来测量。这一方法非常简单，它包括用溶液中的电子供体来光化学 地还原Ag离子(Tani & Murofushi，J.Imag.Sci.Technol.1994，98：1-9； Stellacci等人，Adv.Mater.2002，14：194；Eachus等人，Annu.Rev.Phys. Chem.1999，50：117-144).此方法使用情况良好，这是因为相对于电子 激发的分子之能级来说，Ag的能级有利(Tani & Murofushi，J.Imag.Sci. Technol.1994，98：1-9；Marchetti等人J.Phys.Chem.B1998， 102：5287-5297；Stellacci等人，Adv.Mater.2002，14：194；Eachus等 人..Annu.Rev.Phys.Chem.1999，50：117-144)。光还原提供控制纳米簇 粒径和颜色的机会，这是由于只有几个原子(即Ag2～8)构成的Ag纳米簇 之不同的还原势。或者，可通过慢慢添加多达1个当量的NaBH4或其它还 原剂来利用化学还原，借此也产生荧光纳米点。产生最强荧光的Ag纳米 点标记的大肠杆菌细胞的条件就是全部文库搜索研究的初始条件。使用 鉴定了的强荧光产生条件，把荧光细菌培养物洗涤、接着悬浮在磷酸盐 缓冲剂中以供FACS分析。此洗过的大肠杆菌悬浮液也将在显微镜载物台 上再测定总荧光，以便评估当试样制备之际细菌表面存在的荧光之稳定 性。
通过随机肽展示文库鉴定特异性Ag纳米点的结合序列
使用一种商品展示文库(Invitrogen)，该文库包括1.8×108的多样 性，以鉴定那些特异地与Ag纳米簇相互作用的肽序列。制备的文库将分 为50小瓶并冷冻，以供总荧光测定时Ag纳米点结合条件的个体分析和 最佳化。各小瓶将包括大部分肽文库并在光学显微镜载物台上经由低倍 率物镜测定最佳Agn结合条件。首先，文库培养物在有色氨酸的情况下生 长6小时以诱导融合鞭毛蛋白的表达，培养物先用磷酸盐缓冲液洗涤然 后用硝酸银孵育，以通过光还原形成银纳米点。
流式细胞计量术能使细胞/粒子粒径与荧光相关。将产生FSC(正向 散射，定义相对大小)和SSC(侧向散射，定义相对粒度)的点曲线图 (CellQuest程序)来确定一个使用FACS时规定细菌群体的“门”。将按 总荧光强度分布来把细菌分选。三个荧光检测波道是可用的：FL1，530nm (30nm宽度)，FL2，585nm(42nm宽)和FL3，650nm及以上，上述波道 可单用或并用于细胞分选。预料大部分带Ag纳米簇非结合肽的细菌荧光 极微而只有带显著荧光的被回收。但是，各波道的荧光强度和正向散射 一起将用来鉴定那些起因于Agn结合和稳定的强荧光细胞，使采集的细菌 在氨苄青霉素选择琼脂平板上培养以分离单一菌落。各单一菌落将被保 存并再次用流式细胞计量术和光学显微镜检验以确认相关的荧光表型。 一旦测定荧光强度，就从那些带有明亮纳米点荧光的细菌中分离质粒 DNA，并通过直接测序分析来确定肽序列。阳性克隆序列的对比可产生一 连续的共有肽序列；或者，也可识别一种由不连续的保守残基形成的结 构基序。通过固相肽合成法来合成所确定的序列，通过类似于上述研究 的荧光显微技术、光物理表征法和质谱测定法来表征其与Ag纳米点的结 合性能。
在FliTrx肽展示系统内建立用户定义的文库
带有各种肽长度的鞭毛蛋白展示文库能够利用pFliTrx载体而产生， 可以代替商品文库筛选。将合成15bp(5a.a.)、27bp(9a.a.)、45bp(15a.a.) 和60bp(20a.a.)的简并寡核苷酸，在该寡核苷酸侧翼有Bgl ∏和EcoRV 限制性识别序列(Operon Co.)。用所述两酶消化寡核苷酸混合物，并克 隆到已被该两酶所切的pFli Trx载体里。从菌落集合中分离出来的质粒 转化入测试菌株GI 826，重复上述的筛选方法。
此法利用氨基酸的天然多样性选择特异的Ag纳米簇结合来形成一种 生物相容性的强荧光纳米点。在许多方法中这是一种类似于把(His)6 标签基因结合到目的蛋白质的N端或C端的通用方法，该蛋白质是将要 经由与Ni起特异反应而纯化的。类似地，此研究定义的Agn结合型肽能 够特异和选择性地结合Ag纳米簇，借此增强其荧光。加之，FACS的多荧 光检测波道也能够鉴定一序列的肽，该肽优选稳定不同粒径，因而不同 颜色的纳米点。
Agn纳米簇结合型肽的表征法
一旦常规地鉴定和合成了最佳肽的长度和序列，荧光纳米簇的环境 稳定性和光物理性能就象上述树枝状分子-包囊化的纳米点那样直接测 定。很可能特定序列用优选稳定特定的纳米簇粒径并具有比在PAMAM树 枝状分子主体里可能更窄的发射，而同样的粒子计数方法将用来表征鉴 定那些包囊化的在各特性肽里的各类纳米簇数目。其实，即便在使用的 那种产生并稳定Ag纳米点荧光的初始肽里，也看到纳米点粒径分布较之 树枝状分子包囊化的里的更窄。由于Agn与碱性残基的亲合力，较大的纳 米簇可能被更碱性序列优选稳定。这可能在肽-Ag结合相互作用中赋予粒 径和因而是纳米点的选择性。结果，这种Ag纳米点结合肽的基因选择可 能产生种种各自稳定不同纳米簇的肽。这将产生许多带有不同光学性能 的各种可编程标记，各自都能用作独立的单生物分子标记。为了测定在 各鉴定Agn结合肽里的纳米簇粒径分布及其相关给定颜色的发射源数目， 将要对合成、并接着测Agn纳米点结合的全部肽做质谱测定(ESI和 MALDI)。此相关单纳米点荧光显微技术、整体吸收和发射，以及质谱分 析涉及区分肽和银离子的浓度，直接表征鉴定各经由FACS文库的筛选的 肽的结合常数。
实施例9
树枝状分子和肽间Ag纳米簇的转移
由于银盐通常在水中的溶解度非常有限，由于其极小的溶度积和存 在于生物介质中的大量氯离子。AgCl很可能会从与生物相关的溶液中沉 淀出来。这会带来一个潜在问题：把Agn纳米簇运送给那些上述研究中规 定的肽，且可能限制强荧光Ag纳米簇的直接递送。但是发现，当包囊化 在树枝状分子主体中时，Ag纳米簇非常稳定并在生理盐水浓度保持很亮 的荧光。连小的2级PAMAM树枝状分子实际上都使Ag纳米簇免于AgCl沉淀。而且，树枝状分子是熟知的、能使其内部装有的物质穿过生物膜 运送(Toth等人.，STP Pharma Sci.1999，9：93-99；Bielinska等 人，Biomaterials 2000，21：877-887；Lmo等人，Macromolecules 2002，35：3456-3462；Yoo等人，Pharm.Res.1999，16；1799-1804；Wiwatt anapatapee等人，Pharm Res.2000，17：991-998；Esfand & Tomalia，Drug Discov.Today 2001，6：427-436)，在开发体内标记实验方面是一种有价 值的性能。因此，对小的PAMAM树枝状分子进行了作为载体的研究，该 载体把Ag纳米簇直接转移到那些鉴定的、强力结合Ag纳米簇的肽上。 用同样的筛选方法进行了Ag纳米点转移作为肽的鉴定和选择的研究。不 是使用于有效标记那些在Fli Trx文库里的肽之银离子浓度最佳化，而 是当观察显微镜载物台上的溶液(用10×物镜)以监测纳米点交换时， 调节树枝状分子-包囊化的纳米点的浓度。一旦标记E.coli细胞的情况 得到鉴定，为那些含有能从树枝状分子获得纳米点的肽细胞之肽文库就 被明确地筛选出来。因为流式细胞计量术能根据散射和荧光选择细胞， 很小的树枝状分子在各通道都是不可探测出来的。只有那些大到足以散 射足够光来引发采集的细胞，从而避免由于树枝状分子-包囊化的纳米点 荧光的假阳性。加之FliTrx文库里的各个细菌都有成千成万的肽拷贝， 因而提供一种更强荧光信号的潜力。只有那些显示强荧光和散射光的细 胞才被采集、氨苄青霉素选择生长，并测序。这种树枝状分子-肽文库纳 米点转移可能有利于特定环境条件下的较低级PAMAM树枝状分子，诸如 在那些使树枝状分子-包囊化的纳米点更易逃脱的特定pH，对pH最稳定 的肽-包囊化的纳米点因而可能在未来标记实验中非常实用。这一额外的 筛选方法将进一步选择那些能够优先从树枝状分子提取Ag纳米簇的肽， 为体外和体内简易地标记蛋白质提供了可能性。
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