(一)技术领域

本发明涉及一种腮腺炎病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒引起的急性病毒性感染，该病传染性强， 四季都可流行，病毒分离与血清学试验是目前流行性腮腺炎病毒实验室诊 断的主要手段。但由于病毒分离时间长，要求条件高，分离率低；血清学 方法敏感度低，不适用于早期诊断等原因，使这两种方法在使用中受到很 大的限制。普通PCR技术广泛应用于病毒基因的特异性检测，它具有灵 敏、特异、快速的优点，但存在反应结果判定需要电泳，且反应产物容易 产生污染而导致假阳性等缺点。

近几年发展起来的荧光定量PCR技术，它利用了PCR对脱氧核糖核 酸(DNA)的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量 特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、 特异性强、敏感性高和易操作等优点。

荧光定量PCR技术原理：荧光定量PCR是利用荧光染料在激发光的 作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变 化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化荧光定 量PCR仪就可以通过对荧光信号的采集与分析来实现对初始模板的定 量。

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1、非特异检测-双链DNA 内插式荧光染料；2、扩增序列专一检测-主要指荧光探针和引物探针， 荧光标记的探针共有三类：(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3) Taqman双标记探针。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入 一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性 地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团 (Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)。 当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的 3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是 说5′端荧光基团的发射波长正好是3′端荧光基团的吸收波长，因而能量被 吸收传递到3′端荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在 链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双 链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基 团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激 发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链， 就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同 步。从仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cycle threshold，Ct)与检 测病毒核酸量对数值呈线性负相关。根据荧光定量PCR反应中的Ct值就 能算出原始的模板量。

(三)发明内容

本发明就是根据上述原理，设计适合腮腺炎病毒的特异性引物和特异 性探针，发明目的在于提供一种腮腺炎病毒的基因快速检测试剂盒和检测 方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种腮腺炎病毒荧光扩增检测试剂盒，包括腮腺炎病毒血凝素基因标 准品、荧光扩增检测试剂及DNA聚合酶与逆转录酶，所述荧光扩增检测 试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱 氧三磷酸核苷混合物，所述腮腺炎病毒血凝素基因标准品部分序列为：5’- CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAACCACCTGCTTTCAAGAT ACCGGTGATGCTAGTG-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列5’- CTCAAGGACTRTYTGCYTCSTA-3’，下游引物序列5’-CTCTRGCAT CACCGGTATCTTGAA-3’，所述特异性探针序列为： 5’-FAM-ACCACAACCACCTGC-NFQ-MGB-3’，其中FAM为报告荧光基 团，NFQ为非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以降低PCR反应荧光 本底信号的强度，MGB为修饰基团，可以将探针退火温度提高10℃左右。

所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液            终浓度为1×

特异性扩增上游引物            0.6～1.0μM

特异性扩增下游引物            0.6～1.0μM

特异性探针                    0.2～0.5μM

脱氧三磷酸核苷混合物          400～800μM

余量为DEPC水。

以上浓度均为各物质在反应体系中的终浓度。脱氧三磷酸核苷混合物 为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合。所述的DEPC水指 diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温、高压消毒的MiliQ 级纯水。

所述一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×，即表示缓冲液中各组分在 反应液中终浓度与1×RT-PCR buffer中各组分浓度相同，各组分终浓度 如下：KCl 50mM，Tris-HCl 10mM，TritonX-100 0.1％，MgCl2 1.5mM。 本发明中选用体积为反应液总体积20％的5×RT-PCR buffer。

所述荧光扩增检测试剂中还添加有终浓度为0.8活力单位/μL的 RNA酶抑制剂RNasin。RNasin核酸酶抑制剂是由Promega研究和开发的， 具有广谱的RNA酶抑制活力，用于清除RNA酶污染。RNasin核酸酶抑 制剂是1个50kD大小的蛋白，它和RNA酶以非共价键按1∶1结合，而 抑制RNA酶活力，结合常数为10～14。RNasin核酸酶抑制剂的活力单 位定义为抑制5ngRNase A水解2`，3`-单磷酸环化胞苷的50％的活力所用 的抑制剂的量。

所述荧光扩增检测试剂中还添加有终浓度5mM的二巯基苏糖醇-

所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量 1∶1∶1∶1的混合物。

所述DNA聚合酶用量为0.5～5酶活力单位/反应，选自下列之一： ①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。

所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：① M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

具体的，所述荧光扩增检测试剂组成如下：

一步法RT-PCR buffer     终浓度为1×

二巯基苏糖醇            5mM

RNA酶抑制RNasin         0.8活力单位/μL

特异性扩增上游引物      0.88μM

特异性扩增下游引物      0.88μM

特异性探针              0.28μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

余量为DEPC水。

一种腮腺炎病毒荧光扩增检测方法，所述的检测方法以腮腺炎病毒血 凝素基因标准品为对照，采用待测病人的含漱液为分析样本，所述方法步 骤如下：

(1)取含漱液提取病毒RNA；

(2)荧光PCR扩增检测：取荧光扩增检测试剂与反应所需的DNA 聚合酶与逆转录酶配成反应液，加入标准品与分析样本的RNA 分别进行扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

(3)结果分析：选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个 循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对 照的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长， 判断为阳性；

所述腮腺炎病毒血凝素基因标准品部分序列为：5’- CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAACCACCTGCTTTCAA GATACCGGTGATGCTAGTG-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物 序列5’-CTC AAG GAC TRT YTG CYT CST A-3’，下游引物序列 5’-CTC TRG CAT CAC CGG TAT CTT GAA-3’，所述特异性探针序列 为5’-FAM-ACCACAACCACCTGC-NFQ-MGB-3’，其中FAM为报告 荧光基团，NFQ为非荧光淬灭基团，MGB为修饰基团。

具体的，所述的方法取定量荧光扩增检测试剂配制反应液，反应体系 每25μL组成如下：

5×RT-PCR buffer         5μL

二巯基苏糖醇             5mM

RNA酶抑制剂RNasin        0.8单位/μL

特异性扩增上游引物       0.88μM

特异性扩增下游引物       0.88μM

特异性探针               0.28μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

Ampli TaqR DNA聚合酶     2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶              50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA          5μL

DEPC水补足至25μL；

PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以95℃15s， 60℃退火1min扩增40个循环，在60℃进行单点荧光检测。退火温度适 宜范围为60～50℃，退火时间适宜范围为30sec～1min。

本发明的有益效果主要体现在：

1、早期诊断：PCR可直接检测病原体核酸，在腮腺炎发病早期，就可以 检测出是否含有腮腺炎病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提 供方便。

2、取样简单方便：可取潜伏期或发病早期腮腺炎患者呼吸道样本进行检 测。

3、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在 2～3小时内完成检测。

4、灵敏度高，由于采用了特异性基因扩增和特异性基因探针杂交结合的 双重技术，诊断的灵敏度更高。

5、采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可判断是否含有病毒基 因，且实验结果的判断方便准确。

6、可实现病毒核酸的定量分析，利用已知拷贝数、含有腮腺炎病毒基因 重组质粒为标准品制作标准曲线，可对原始标本中的病毒含量进行定 量分析。

(四)附图说明

图1为腮腺炎病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法标准品扩增曲线图， 从左至右：扩增的病毒拷贝数依次为107、106、105、104、103、102、10；

图2为腮腺炎病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法标准曲线；

图3为荧光定量RT-PCR对腮腺炎病毒核酸检测的重现性，从左至右：扩 增的病毒拷贝数依次为106、105、104；

图4为TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR对腮腺炎病毒临床标本的检测， 图中A为腮腺炎病毒阳性内对照核酸，B为腮腺炎病毒阳性外对照核酸。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：

TaqMan-MGB检测方法步骤如下：

(1)提取RNA

取含漱液200ul用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit提取病毒 RNA(1μg/μL)。

(2)荧光PCR扩增

取定量荧光扩增检测试剂配制反应液，反应体系为每25μL，包括：

5×RT-PCR buffer             5μL

二巯基苏糖醇                 5mM

RNA酶抑制剂RNasin            0.8单位/μL

特异性扩增上游引物           0.88μM

特异性扩增下游引物           0.88μM

特异性探针                   0.28μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

Ampli TaqR DNA聚合酶         2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶                  50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA(1μg/μL)    5μL

DEPC水补足至25μL；

PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以95℃15s， 60℃退火1min扩增40个循环，在60℃进行单点荧光检测。

按上述反应液配方，加入标准品与分析样本的RNA分别配制反应液、 进行扩增反应，反应管置于荧光定量PCR仪进行荧光检测；标准品扩增 曲线见图1，得到标准曲线见图2，选择病毒拷贝数依次为106、105、104/ 反应的标准样本进行定量RT-PCR检测，每个样本重复作五次，结果见图 3和表1，每个浓度5次反应的Ct值变异系数均小于1％。腮腺炎病毒临 床标本扩增曲线见图4；

表1：荧光定量RT-PCR检测腮腺炎病毒的重现性结果   样本                                 结果(Ct值)   平均值   变异系数   1   2   3   4   5   106/反应   12.73   12.83   12.55   12.62   12.73   12.69   0.86％   105/反应   16.72   16.66   16.82   16.89   16.56   16.73   0.78％   104/反应   20.55   20.35   20.46   20.70   20.50   20.51   0.62％

(3)结果分析：选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循 环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高 点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性； 通过荧光定量RT-PCR对腮腺炎病毒核酸检测的重现性实验表明，每 个标准核酸浓度5次重复反应的Ct值变异系数均小于1％，说明该方法 的重现好较好。

利用此TaqMan-MGB荧光定量PCR方法对浙江省部分地区疑似流行 性腮腺炎疫情标本35份进行检测，并与普通RT-PCR方法相比较，结果 表明，荧光定量PCR检测阳性27份，普通PCR检测阳性18份，而病毒 培养阳性7份。RT-PCR与病毒培养为阳性的标本，荧光定量RT-PCR检 测也均为阳性，符合率很好。

                    序列表.WorkFile

Application Project

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<120>Title：一种腮腺炎病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

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     SequenceName：腮腺炎病毒血凝素基因

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     SequenceName：上游引物

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     SequenceName：下游引物

     SequenceDescription：

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                          序列表.WorkFile

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     SequenceName：特异性探针

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