技术领域
[0001] 本
发明属于细胞研究领域，涉及一种基于慢病毒载体骨架的、稳定株筛选、观察细胞内自噬体变化的慢病毒绿色荧光自噬报告载体及构建方法。
背景技术
[0002] 自噬是细胞内的一种“自食”的现象，凋亡是“自杀”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发
阈值和
门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚。自噬是指膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、
蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
[0003] 由于自噬过程很快，所以在研究自噬时要进行动态观察，自噬体属于亚细胞结构，所以要在投射电镜下观察自噬体，但是投射电镜耗时太长，不利于监测自噬形成。利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3技术：没有发生自噬时，绿色荧光自噬标记基因LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬发生时，绿色荧光自噬标记基因LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光
显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。可见构建一种绿色荧光自噬载体对研究的重要性。
[0004] 目前已有一些商品化的自噬检测的绿色荧光载体，但存在一些局限性：1、载体骨架为普通质粒载体，难以获得稳定表达的细胞株；2、价格昂贵且使用受限制。售价从5000元到上万元不等；3、含有绿色荧光蛋白的载体质粒不能特异性的观察自噬体的变化情况。4、有的载体含有G418筛选基因，筛选周期长，
稳定性不高。因此构建一种慢病毒绿色荧光自噬报告载体在细胞和相关领域的研究具有重要的意义和广阔的应用前景。
发明内容
[0005] 本发明解决的问题在于提供一种慢病毒质粒为骨架、插入绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因，获得慢病毒绿色荧光自噬报告载体及构建方法。
[0006] 本发明通过以下技术方案来实现：
[0007] 一种慢病毒绿色荧光自噬报告载体，包含
氨苄青霉素抗性、嘌呤霉素筛选标记和绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因序列。
[0008] 本发明所述的绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。
[0009] 一种慢病毒绿色荧光自噬报告载体的构建方法，包括以下步骤：
[0010] (1)根据绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因序列信息，设计并合成引物，以pEX-GFP-hLC3WT载体质粒为模板，PCR扩增获得绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因序列；
[0011] (2)根据绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因序列和pLenti-puro序列，用BamHI和XhoI酶切绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因的PCR产物和pLenti-puro载体质粒，将酶切产物连接，获得目的载体pLenti-puro-GFP-LC3，载体完整序列SEQ.ID.NO.2；
[0012] (3)无内毒素提取验证载体pLenti-puro-GFP-LC3质粒，用BamHI和XhoI酶切载体pLenti-puro-GFP-LC3质粒，核酸
电泳检测基因序列大小，同时将载体pLenti-puro-GFP-LC3质粒测序验证序列是否与预期一致；
[0013] (4)用载体pLenti-puro-GFP-LC3质粒
转染Hep2细胞,48h后激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3的表达情况。
[0014] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0015] 1、本发明的绿色荧光自噬标记蛋白LC3质粒以慢病毒作为骨架，有利于获得稳定表达绿色荧光细胞系的建立，而且由于慢病毒对
哺乳动物细胞广泛的适用性，本发明的绿色荧光质粒可用于多种细胞。与使用普通载体昂贵的价格和特异性相比，成本很低。
[0016] 2、本发明的绿色荧光pLenti载体绿色荧光和目的基因LC3使用CMV启动子，该启动子在哺乳动物细胞中高表达。
[0017] 3、本发明的绿色荧光自噬标记蛋白LC3基因融合蛋白能够利用荧
光标签观察并判断自噬体的变化情况。
[0018] 4、本发明的慢病毒绿色荧光自噬报告载体含有嘌呤霉素筛选基因，筛选的周期短，稳定性更高。
附图说明
[0019] 图1为pLenti-puro载体结构图谱；
[0020] 图2为pLenti-puro-GFP-LC3目的载体酶切电泳鉴定结果图；
[0021] 图3为pEX-GFP-hLC3WT载体结构图谱；
[0022] 图4为绿色荧光自噬标记蛋白LC3目的基因PCR产物电泳鉴定结果图；
[0023] 图5为pLenti-puro载体质粒及绿色荧光自噬标记蛋白LC3目的基因酶切图谱；
[0024] 图6为pLenti-puro-GFP-LC3目的载体电泳鉴定结果图；
[0025] 图7为pLenti-puro-GFP-LC3载体测序结果部分峰图；
[0026] 图8为激光共聚焦显微镜检测绿色荧光自噬标记蛋白LC3表达结果图。
具体实施方式
[0027] 本发明提供一种慢病毒绿色荧光自噬报告载体构建方法，包括插入目的载体pLenti-puro-GFP-LC3构建、插入目的基因的验证、转染细胞荧光显微镜观察自噬体的验证。下面结合具体的实验过程和实验结果对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0028] 一种慢病毒绿色荧光自噬报告载体的构建方法，包括以下步骤：
[0029] 首先提供质粒和主要
试剂的来源或制备方法：
[0030] pLenti-puro载体和pEX-GFP-hLC3WT载体由本实验室所提供。DH5α感受态细胞购于北京全式金
生物技术公司。Lipofectamine 3000转染试剂购自Thermo Fisher Scientific公司。限制性内切酶购自NEB公司。PCR酶购于北京全式金生物技术公司。连接酶购自Vazyme公司。
[0031] LB液体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g；
酵母提取物5g；NaCl 10g。加1L ddH2O搅拌至完全溶解，高压灭菌。
[0032] LB固体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g。加1L ddH2O搅拌至完全溶解，高压灭菌。
[0033] 氨苄青霉素(100mg/mL):1g溶于10mL1L ddH2O，0.22μm滤器过滤除菌。
[0034] 1、构建载体pLenti-puro-GFP-LC3
[0035] 1)设计并合成以下引物：F：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4；R：5’-CCGCTCGAGTTACACTGACAATTTCATCCCGAACGTC-3’核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5。引物中下划线部分分别为BamHI和Xhol的酶切位点。以pEX-GFP-hLC3WT(载体结构如图3)质粒为模板，使用该引物对进行PCR反应获得含有目的基因绿色荧光自噬标记蛋白LC3的产物，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，PCR反应条件为：95℃，3min；95℃,30Sec,57℃,30Sec,72℃1min，35个循环；72℃，3min。核酸电泳，结果显示和目的
片段大小相符，电泳结果如图4所示，胶回收绿色荧光自噬标记蛋白LC3产物。
[0036] 2)使用BamHI和Xhol切割2ug的绿色荧光自噬标记蛋白LC3和1ug的pLenti-puro质粒(核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2)，核酸电泳，结果如图5所示，胶回收酶切产物。
[0037] 3)酶切后回收的绿色荧光自噬标记蛋白LC3与pLenti-puro质粒片段按照1：5的摩尔比用连接酶4度过夜连接。
[0038] 4)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取。
[0039] 5)提取的质粒进行电泳鉴定，结果见图6。使用BamHI和Xhol酶切质粒进行电泳鉴定，结果见图2。电泳检测阳性的质粒进行DNA测序，验证序列方向和部分峰图，结果见SEQ.ID.NO.3和图7。pLenti-puro-GFP-LC3部分序列如SEQ.ID.NO.1所示。
[0040] 2、无内毒素小量提取pLenti-puro-GFP-LC3质粒
[0041] 1)取测序验证正确的pLenti-puro-GFP-LC3菌液20微升，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的15mL LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。
[0042] 2)无内毒素质粒小提
试剂盒提取培养的菌液中的pLenti-puro-GFP-LC3质粒，测定浓度。
[0043] 3、目的基因表达和验证
[0044] 1)将Hep2细胞按适当浓度传代到60mm培养皿中，转染时细胞
密度在60-70％。
[0045] 2)用lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-puro-GFP-LC3质粒转染Hep2细胞。
[0046] 3)转染48小时后在激光共聚焦显微镜下观察结果如图8。
