本发明涉及一种标记的非肽配体库，它包含一个或多个配体部分，它们各自连接到一个或多个不同标记部分；其制备方法；合理设计库以及由标记配体库进行选择的方法；包含用于制备标记的非肽配体库的活性非肽配体以及活性标记底物的试剂盒；伴随其药理学信息产生的标记的非肽配体；新的标记的配体；新的配体前体及其制备方法；已知的和新的标记的配体以及标记的配体库在研究受体结合中的用途，所述受体结合如G-蛋白质偶联受体(GPCR)结合或者细胞内酶抑制如环核苷酸磷酸二酯酶抑制以及将药物结合到药物转运蛋白(例如，核苷转运蛋白或者ATP结合盒转运蛋白)；更具体地是使用如共焦显微术和荧光激活分选以及荧光相关显微镜的技术研究细胞群或单细胞如急性分散细胞中的这些相互作用。

所述腺苷-A1受体(A1-AR)是GPCR，它是在各种组织(包括脑、心脏、脂肪组织以及肌肉)中发现的，并且已经在各种病症的病理生理学中提到(Ralevic，V.和Burnstock，J(1998)Pharmacol.Rev.50，415)。

目前，A1-AR药理学的研究仅可以在细胞中很好的进行，所述细胞可以使用例如放射性配体结合的技术大量生长。放射自显影法能进行单独的细胞研究，但是不能直接判读结合情况，而且要花费至多4-6周来使胶片显影，得到结合的结果。为了克服这一问题，已经采用很少的荧光配体来使受体显像，并使用共焦显微术(CSLM)、共焦板读数器、荧光偏振板读数器以及荧光相关光谱(FCS)在单细胞中获得定量的受体-配体结合的数据。共焦显微术可以显示细胞的剖面，荧光团在细胞边缘的浓度显示膜受体的结合。FCS分析荧光种类的扩散特征，快速扩散的游离配体可以不同于缓慢扩散的受体结合配体，并在容积定位到于细胞膜上时同时进行定量。

McGrath等TiPS，1996年11月(卷17)393-399讲述了使用荧光配体代替更多常规放射性配体来研究细胞受体的可能性，使用共焦光谱学和荧光激活细胞分选(FACS)来记录指示受体数的配体-受体复合物的量。他之处为了识别其结合位点(主要目的在于受体的定位，而不是研究其性质)，已经作出很多努力来将荧光分子共轭到受体配体上。已经报道一些化合物在结合到受体上时发荧光，但是在水相中则产生低的背景噪声。所报道的目的是生产荧光药物，当结合到受体上时仍能保持荧光，而且，当洗去未结合的药物时仍能保持结合。因此，需要很高的受体结合亲和性。评论性的工作包括结合到烟碱受体、β-肾上腺素受体、阿片样GPCR型受体、组胺、神经加压素和α-肾上腺素受体的荧光配体。所述出版物也评论了共焦显微术的优点。只有在很少的上述情况下报道了研究配体的药理学性质的努力。

但是，很少使受体和受体类显像的努力起到作用。药理学性质通常在一定程度上受到将荧光团连接到任意受体结合配体的影响，并且包括结合亲和性改变以及受体(即激动剂或拮抗剂的性质)的活化等。为了量化所观察到的结合效果，在任何研究中了解荧光配体的药理学是重要的。

事实上，合成用于GPCR的非肽荧光配体存在严重的问题。少数合成的用于细胞表面受体的市售非肽荧光配体包括阻胺-BODIPYTMFL和(以下图示)CGP12177-BODIPYTMTMR(分子探针)：

所述BODIPYTM(BDI)荧光团最初设计用于附着于蛋白质，所述蛋白质具有更加均一的附着可能性。可以得到一种试剂盒，它包含荧光团和一组普遍附着于大多数蛋白质的试剂。

这些非特异性附着于感兴趣蛋白质的任意活性位点，通常不需要知道附着结合的性质或位置。但是，这些蛋白质是比非肽配体更大的分子，包括本发明所提到的药物如XAC(黄嘌呤胺同类物)等。许多GPCR受体的配体结合位点也通常在受体跨膜区域内的深处，因此，困难在于连接到荧光团上，以便保持药理活性。这些BDI荧光团中没有一个涉及在GPCR处具有规定性质的荧光激动剂/拮抗剂的具体设计，而是涉及作为”累加”探针的荧光团。

因此，荧光配体的有效性，具体是适于FCS和CM结合研究的非肽荧光配体实际上是不存在的。这种化合物的制备不同于常规，而且几乎没有做过努力来确立药理学。以上McGrath仅着眼于少数研究的受体类型。

而且，在许多现有技术中没有任何统一的途径。单独的研究针对荧光配体系统，它限于具体的药物类型，或者限于使用具体的荧光团。这种系统在所获得的信息以及可研究的系统数量上都是有限的。

因此，需要用于在所需受体上结合的新型选择性荧光配体，提供可靠和有效的受体显形以及具有确定药效的受体选择性(在亲和性以及激动剂和拮抗剂性质方面)。

现在，我们已经将多种学科方法使用到荧光配体设计上，提供合理设计的荧光标记配体库及其制备方法，它们可以用在选择荧光标记配体的方法中，所述配体对所需GPCR具有选择性，具有所需的规定药理特性。

所述库较好由非肽配体前体制得，所述前体包含用于连接到任意荧光团的化学官能团，提供在所需位点具有接头部分的已知或新型荧光配体，它们能选择荧光配体，同时保留受体的结合能力，并且以不会干扰受体结合能力或者以已知方式改变结合能力的方式连接。所述接头前体在连接到荧光部分或任何其它所需非亲水探针上时也提供改进的性能，如水溶性。

在本发明最广泛的方面中，提供了一种库，它包含许多通式(I)所示标记非肽配体：

(Lig JL)mL(JTTag)m(JTL(JLLig)m)p，

及其盐，

它包含一个或多个相同或不同的配体部分Lig，它们各自通过相同或不同的接头L以及相同或不同的连接位点或连接官能团JT和JL连接到一个或多个相同或不同的标记部分Tag；其中，Lig包含GPCR配体，细胞内酶或底物的抑制剂，或者药物转运蛋白的抑制剂；

L是单键或者是选自如N、O、S、P的杂原子、支链或直链饱和或不饱和的，任选包含杂原子的C1-600烃基及其组合的任意接头部分，它们可以是单体、具有2-30个低聚重复的低聚物、具有超过30到至多300个聚合重复的聚合物；

Tag是任何已知或新的标记底物；

m各独立地选自1-3的整数；

p是0-3；

其特征在于，连接是在包含不同Lig、JL、L、JT和/或-Tag的化合物中的相同或不同的连接位点上，以及在包含相同Lig、JL、L、JT和/或-Tag的化合物中的不同连接位点上。

所述库优选不包括Lig NECA，Tag丹磺酰胺或NBD，各J为单键，L是C3-12的亚甲基链。

本发明的创新之处涉及具体标记的配体或”药物”，例如，具有已知或可选择的药效性质的荧光配体或”药物”。这一成功的关键在于各标记或荧光团对所得产物的药效具有具体的影响，并且假设所述化合物将保持所述前体药物的性质是不正确的。较好的是，所述库由合理设计的代表连接位点和配体部分改变的库成员构成，它们可以作为选择保持前体配体性能的标记或荧光配体的基础。较好的是，所述库包括许多规定的和表征良好的标记配体，具有和那些非标记配体对应的核实性能。

GPCR配体选自任何能有效作为腺苷受体、β-肾上腺素受体、蕈毒碱受体、阻胺受体、阿片受体、大麻素受体、趋化因子受体、α-肾上腺素受体、GABA受体、前列腺素类受体、5-HT(血清素)受体、刺激性氨基酸受体(例如，谷氨酸盐)、多巴胺受体、蛋白酶活化受体、神经激肽受体、血管紧张肽受体、催产素受体、白细胞三烯受体、核苷酸受体(嘌呤和嘧啶)、钙传感(sensing)受体、甲状腺-刺激激素受体、神经降压肽受体、血管降压肽受体、嗅觉受体、核碱基受体(例如，腺苷)、溶血磷脂酸受体、鞘脂受体、酪胺受体(痕量胺类)、游离脂肪酸受体以及环核苷酸受体等的激动剂或拮抗剂的化合物，较好是用于GPCR受体，例如a)腺苷受体拮抗剂，b)腺苷受体激动剂，c)β-肾上腺素受体激动剂和d)β-肾上腺素受体拮抗剂的化合物。配体较好是非肽配体。

细胞内酶的抑制剂较好是e)细胞内酶的抑制剂，如环核苷酸磷酸二酯酶的抑制剂，或者它们的衍生物或同系物。

药物转运蛋白的底物是任意通过转运蛋白进入或离开细胞的药物。药物转运蛋白的抑制剂是任何结合到转运蛋白并防止底物转移的化合物。因此，标记的抑制剂可以结合到转运蛋白上，并定位在其上。本发明标记的底物可以跟踪转运进入或离开细胞，并测试抑制剂药物是否防止标记底物的转运。底物或抑制剂较好选自基于任意平衡的药物转运蛋白或ATP驱动泵如儿茶酚胺转运蛋白、核苷转运蛋白、ATP-结合盒转运蛋白、环核苷酸转运蛋白等的底物或抑制剂。

较好的是，所述库提供标记的配体，它们适于表面细胞受体结合或者用于细胞内结合，或者用于渗入或离开活细胞。因此，所述库代表合理设计的化合物，它们预计具有适于具体结合应用的保留药效和性质。

各Tag可以独立地选自标记分子领域中已知的任意实体，形成用于检测分子并可用于配体分析研究(尤其是显形)中的标记或报道基团，包括但不限于本领域已知的荧光团标记物。可以存在其它的Tag，并且可以在原位起作用，例如可以是任意激光活化的Tag，它们可以激活以具有局部或靶向的治疗或破坏性效果。这允许在第一阶段通过Tag显形来使通式I所示化合物显形，在第二阶段进行激光活化Tag的活化，并且任选在第三阶段使通式I所示化合物或其片段显形。例如，激光活化Tag可以包含孔雀石绿，它可以被活化用于靶向蛋白质破坏。

具体的优势是在Tag是可以通过通式I所示化合物参与抑制受体-配体结合或者抑制细胞内酶或药物转运蛋白抑制的化学实体时，这种抑制是消极的，或者因存在基团L和/或各J或者在一个或多个库成员中所选择的连接位点而被消除。

较好的是，在一个或多个或者各库化合物中的一个或多个-Tag是实体-F1，且包含任意已知或新的荧光团，由此，所述库包含通式I’所示的一种或多种或者所有的化合物：

(LigJL)mL(JTFl)m(JTL(JLLig)m)p

通式I或I’所示的各化合物较好包含许多荧光团和/或标记物中的一个，提供包含一个或多个不同荧光团(较好是不同化学组成、光谱特征等)的不同荧光标记的配体的库；和/或提供包括至少一个荧光标记配体的不同标记配体的库；或者，通式I或I’所示化合物包含许多各自连接到一个或多个不同标记物上的前体配体中的一个，提供多配体类型的相同或不同标记配体的库；或者，通式I所示化合物包含在相同或不同连接位点接头前体配体和至少一个Tag的许多接头中的一个；或者，通式I所示化合物包含相同的接头前体配体的接头部分以及在不同连接位点处的至少一个Tag，提供不同连接的标记配体的库，所述配体具有不同的构型或者所参与的药效和结合。

在这种情况下，本发明所述库提供了对所需结合亲和性抑制或在具有所需药理学、显形力、机理等的所需受体、细胞内酶或通过药物转运蛋白处转运的标记配体的选择机会。

更好地是，所述库包含通式II-III”中一种或多种所示的许多化合物：

II   (LigJL)mLJTTagJTL(JLLig)m，其中，各m如上所述，较好是1或2，更好是1。

III  (LigJL)mL(JTTag)m，其中，各m如上所述，较好是1和/或2，更好是LigJL-L-JLTag和/或

和/或

其中，各JL和JT包含上述的J，它们可以相同或不同，并且可以源自在Lig或L，以及Tag或L，或它们组合中最初存在的官能团，其特征在于，在包含不同Lig、JL、L、JT和/或Tag化合物中，连接是在相同或不同的连接位点，并且在任意两种或多种化合物包含相同Lig、JL、L、JT和/或Tag的情况下，所述连接是在不同的连接位点。

在一个优选实施方式中，所述发明包含以上所述通式I所示的化合物库，其中，Lig、JL、L、JT和Tag在所有化合物中相同，并且所述化合物差别是其连接位点。

在更优选的实施方式中，所述发明包含以上所述通式I或I’所示的化合物库，其中，Lig和JL在所有化合物中相同，L和JT在所有化合物中相同或类似，Tag在一些或所有化合物中不同。

在更优选的实施方式中，所述发明包含以上所述通式I或I’所示的化合物库，其中，Lig-和-Tag在所有化合物中相同，-L在所有化合物中不同。

所述库可以包含3-250个标记的配体。所述库较好由包含3-25个标记配体1-10个类组成，各个类包含普通配体类型和3-25个不同标记部分类型的配体部分，上述标记部分中至少一个是荧光标记，更好是不同的荧光标记；或者所述库包含5-250个不同配体类型和不同荧光类型的荧光标记配体。

提供包含不同Fl的荧光配体的库可用于研究结合、抑制或者和不同颜色荧光转运，例如，用于区别相同颜色的自然荧光或者区别许多类型的结合位点、酶、转运蛋白等。

已知通过连接到荧光团上进行修饰的配体通常会改变结合亲和性、抑制或转运特征，并且本发明所述库适于包括各化合物的药效的描述，包括对某种GPCR、细胞内酶或药物转运蛋白的结合亲和性或抑制或转运。所述库较好包括该库中所含各标记配体的信息，涉及用于连接或抑制GPCR受体或抑制细胞内酶如环核苷酸磷酸二酯酶，或药物转运蛋白的抑制或通过药物转运蛋白转运的药效(包括作为激动剂、拮抗剂、底物或抑制剂的指示以及亲和性或抑制性等的测量)，这样就能将结论量化。

在配体制备方法的现有技术中，在许多情况下所述连接位点是非特异性的或未知的，如在分子探针配体的情况下，或者至多是特异性的或已知的，但是其所需的效果不是预定的，设计的或理性推断的。在本发明的库中，标记的配体较好包含在许多连接位点处连接的荧光团；在连接位点处，很大程度上保持了配体受体结合、抑制或转运，或者改变或抑制到很小的程度。所述库较好包含标记配体，它设计自活性前体配体和活性荧光团的反应，用于位点特异性反应和连接，所述活性荧光团具有活性位点化学官能团且适于和相关试剂反应，其中，所述设计是对所有或许多可能连接位点和所得药理学特性的广泛研究以及对一种或多种连接组合的选择结果，提供有利的结合、抑制或转运特征。

Lig较好选自

a)黄嘌呤样结构，包括XAC、茶碱、咖啡因、可可碱、dyphilline、恩丙茶碱等；或稠合的二芳基结构，包括罂粟碱、二氢奎尼酮如西洛酰胺、潘生丁、长春西汀等；以及它们的类似物；

b)腺苷样结构，包括ADAC、NECA以及它们的类似物；

c)乙醇胺样结构，包括沙莫特罗、沙丁胺醇、特布他林、喹丙那林、柳胺心定、心得怡、班布特罗、非诺特罗、reprotolol、妥洛特罗、克仑特罗以及它们的类似物；

d)氧代丙醇胺样结构，包括CGP12177、心得安、心得宁、acebutalol、倍他索洛尔、ICI 118551、阿普洛尔、塞利洛尔(塞利托尔)、美托洛尔(倍他洛克)、CGP20712A、阿替洛尔、比索洛尔、misaprolol、卡维地洛、布新洛尔、艾司洛尔、纳多洛尔、萘比洛尔、氧烯洛尔、扎莫特罗、吲哚洛尔、噻吗咯尔以及它们的类似物；

e)黄嘌呤样结构，包括XAC、茶碱、咖啡因、可可碱、dyphilline、恩丙茶碱、西登那菲、EHNA(赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤)、扎普司特等；或螺二环结构，包括by吡啶s如氨利酮、咪唑啉类如CI930、二氢哒嗪酮类如indolan、咯利普兰、SB207499、等；或稠合的二芳基结构，包括罂粟碱、二氢奎尼酮如西洛酰胺、潘生丁、长春西汀等以及它们的类似物.

接头L可以发挥许多功能，包括在通过直接连接Lig和F1进行的修饰会干扰配体结合、抑制或转运时，通过拉开荧光团部分和配体结构之间的距离来防止配体在变为包含荧光部分时损失亲和性，在这种情况下，因为合适接头L可以设计成短的、中等或长的链结构。

通式I或I’所示的库化合物任选包含下文所述的官能团J，它源自通过反应接头前体或其组分的一种或多种反应基团(提供接头部分)与一种或多种配体前体的活性基团(提供配体部分)的合成以及接头前体的一种或多种其它活性基团和一种或多种标记前体如荧光标记前体的活性基团(提供标记部分)的反应。

本发明的具体优势在于当各部分基团非活性时，或者当立体化学或其它影响会抑制连接，或者当市售前体配体和荧光团中已有的活性基团的反应需要加入本文中官能团的保护基团时，接头L和/或连接位点或官能团J便于连接荧光部分和配体，上述情况中，接头通常来自短的、中等的或长的链结构。更好地是，接头L可以来自三，四，五或六功能性前体，连接3个或更多配体Lig和标记F1，能修饰或更复杂的结合、抑制或转运以及相关的药理学，例如，连接到许多受体位点来研究受体的二聚反应，如均二聚或杂二聚反应。在本发明更有利的方面中，接头L可以按需赋予便于穿过细胞膜的性质、疏水性、亲水性等，在这种情况下，接头通常是任何官能化的结构。

L较好选自饱和或不饱和单键或双键、-O-、-S-、胺、COO-、酰胺、-NN-肼；以及饱和或不饱和、取代的或未取代的C1-600、较好是C1-300、更好是C1-100支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们中任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P，其中，任选的取代基选自任意的C1-20脂族、芳族或脂环族取代基，它们中任一个包含一个或多个上述杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基、羰基等.

L更好选自单键、-O-、-S-、氨基；和支链或直链C1-50烷基、链烯基、炔基、烷氧基、氨基、环烷基、杂环、芳基、杂芳基以及它们的组合如芳烷基、芳烷基氨基、芳烷基酰胺基等，任选包含一个或多个杂原子，其中杂原子如以上所述，任选如上所述进行取代，所述取代基选自C1-12脂族、芳族或脂环族取代基、羟基、硫醇、卤素、胺、氧代、羰基等。

JL和JT可以包含官能团，来自连接到荧光团和/或配体上的活性基团或位点，选自饱和或不饱和单键或双键、-O-、-S-、氨基、酰胺基、肼、羰基、氧代、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、硫氧基等。

在包含单键或双键时，JL和JT(若存在的话)可以包含来自用于连接接头和荧光团的活性基团或位点的官能团，上述荧光团来自荧光部分和/或配体部分。

较好是，所述部分JLmLJTm包含单、二、三、四、五或六氨基、烷硫基、烷氧基、羧酸以及它们的组合，更好是单、二或三氨基烷硫基、氨基烷氧基、烷氧基羧酸、烷氧基胺等。较好是，JLmLJTm选自单、二或三氨基薄荷烷、氨基乙烷、硫代乙烷、乙烷、氨基酰基，选自多肽，或选自单或聚醚衍生物，例如二胺或二硫代如单或聚乙二醇二胺或三胺或硫代。

较好是，以上所述接头部分JLmLJTm包含单键或双键或上述单原子或基团，或包含通式-L.I-所示的单-、二-、三-或四、五、六官能化直链或支链或环取代的或未取代的烃基，

J[A]qLRL[A’qL’J’]pA”qL”J”

式中，J-J”各自是上述的连接位点或者官能团，独立地选自单键、亚甲基、炔、烯烃、NR、O、NRCO、S、CO、NCO、CHHal、P等，其中，R是H或C1-8烷基或环烷基，或形成具有N的环的部分，Hal是任意卤素，选自氯、碘、溴；并且存在于基团A-A”的任意合理位置；A-A“各自是选自-O-、-C(＝O)-、C1-12烷氧基、醇基(alkoyl)、环烷基、杂环、烷基、链烯基、芳基、芳基酰胺、芳基胺、氨基、硫代烷基、杂芳基(如上所述)以及它们的组合等的基团，任选被独立地选自C1-3烷基、C1-5烷氧基等的基团取代；

qL-qL”各独立地选自0或1，或显示为低聚的重复，且为2-30，或显示为聚合重复，为31到至多300。

RL是C、N或S原子或是CRL’、NRL’、烷基、环烷基、杂环、芳基杂芳基、胺或硫代部分，并当p是1或2时形成支链；其中，RL’是H或C1-3烷基；和

p如以上所述，为0、1或2。

较好是，各J、J’和J”各自是单键或双键、NRL、-O或-S或-C(O)或-NRC(O)或-C(O)NR，如上所述；

A是烷氧基，较好是CH2CH2O(PEG)及其低聚物，或是芳烷基胺、芳烷基酰胺、芳烷氧基，或是烷基，较好是(CH2)1-12；

当p是1或2时，RL是包括或包含一个或两个支链碳原子的C1-5烷基链；

p是0、1或2；

A’和A”各独立地选自C1-8烷基、胺、苯胺、苯酰胺；和

qL是0、1、2-30或31-300，且qL’和qL”是0或1。

更好的是，JLmLJTm是单键或具有如下通式

JAqLRLJ”

式中，各J和J”是胺或-O-，A是CH2CH2O，qL是1-30或31-300，RL是CH2CH2或具有如下通式

JAqLRL(A’J’)J”

式中，各J、J’和J”单独是胺、-O或单键，qL是1、2或3-30或31-300，A是CH2CH2O或HNCH2CO，或qL是1，A是C(O)或(CH2)1-8，或qL是0，RL是CH或CH2CH，qL’是0，或qL’是1，A’是CH2，qL”是0。

较好是O(CH2CH2O)qLCH2CH2NH、O(CH2CH2O)qLCH2CH(CH2NH)NH、OCH(CH2NH)NH、-CH(CH2NH)NH、-C(O)NH-、-(CH2)1-8-、(-HNCH2CO-)1-3(＝-gly1-3-)-等。

更好的是，以上通式I或I’所示各化合物包含部分Lig和L，如下所述：

其中，Lig.am较好为以下任一形式所示的通式，包括其任意可能的连接构型或位点：

Lig.a 1m

其中，任意或各Ra1-Ra4、X1和X2可以包含连接位点或官能团J，如以上所述；

X1和X2各独立地选自H、O、OR.a、NR.a、NHR.a；

X1和X2各自较好是O；

R.a1、R.a2、R.a3和R.a4各独立地选自H或C1-4直链或支链烷基，较好是H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基或异丁基，任选被单或多羟基或卤素取代，如CH2OH、CH2F或CH2CHOHCH2OH；

R.a4选自杂原子O、S或取代的或未取代的胺或饱和或不饱和，取代的或未取代的C1-20支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们中任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P；其中任选的取代基选自任意C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，任意一个可以包含一个或多个以上所述的杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等；

较好的是，R.a4选自任选取代的芳基、环烷基、烷基、酮、(二)胺、(二)酰胺，更好是任选取代的烷氧基、环烷基、胺、酰胺、羧酸，或任选o-、m-或p-取代的苯基，其中所述取代基包括芳基、烷基、环烷基、杂芳基或杂烷基、胺、酰胺、羧基、羰基等，例如，所述取代基包括，或R.a4包含环己基、环戊基、乙氧基、(CH2)2PhPh、CH2Ph、CONH(CH2)nCONH、CH2CONH(CH2)2NH、CH2PhNHCOCH2、CH2CH2OCOCH2、琥珀酰亚氨基酯、NHCOCH2、CH2(CH3)NCOCH2、H2N(CH2)2NHCOCH2、H2N(CH2)8NHCOCH2、H2NNHCOCH2、CH2CONH(CH2)2NHCOCH2、HOPhCH2N(CH2CH3.HOAc)(CH2)2NHCOCH2、杂环-(CH2)4CONH(CH2)2NHCOCH2、杂环-NHCON(杂环)COCH2等；

或Lig.a具有通式Lig.a2-

式中，任意或各Ra5-Ra6，或环C或杂原子可以包含连接位点或官能团J，如以上所述；

C.A1和C.A2各独立地选自C5-6芳基、杂芳基、环烷基和杂环，更好选自苯基、或包含1或2个环杂原子的芳基、或包含1个环杂原子和/或1个环-C＝C-基团的杂环；

各至多7个R.a5是环碳原子或环杂原子的取代基，并且独立地选自H、卤素、羟基、硫醇、胺、COOH、肼、氰基、饱和或不饱和，取代的或未取代的C1-20支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们中任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P，式中任选的取代基选自任意C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，它们任一个可以包含一个或多个以上所述的杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等，如＝O、OCH3、CH2Ph(OCH3)2、O(CH2)3CON(CH3)c.hex、N(CH2CH2OH)2、c.hex、COOCH2CH3、CH2CH3；

或者，任意两个或多个R.a5形成一个、两个或三个环的稠合环状结构，较好包含稠合的3个环芳基、5-杂环、具有与稠合双环Lig.a结构共有的4个环原子的6-杂环结构；

R.a6是以上针对R.a5所述的部分；

L.a如以上针对L或JLLJT所述的，并且较好是以上所述的通式L.I或子通式，更好选自单键、氨基酸或酰胺，如肽或多肽，例如，gly或Gly3、通式-(CH2)n所示的烷基，其中n是3-8，较好是3、4或6，任选包括一个或多个杂原子或不饱和基团，如-O-或-S-或-CH＝CH-等：

Lig.b较好如通式Lig.b所示，包括任意可能的连接构型或位点：

Lig.b

式中，任意或各Rb1-Rb5或Xb1-Xb3可以包含以上所述的连接位点或官能团J。

环取代基X.b1和X.b2独立地选自烃如烷基或SRX、NRX2和ORX，其中，(各)RX选自H、C1-5烷基、链烯基；

环杂原子X.b3选自-S-、-O-和-CH2-；

Rb1选自饱和或不饱和，取代的或未取代的C1-4脂族、或C1-3脂环族，任选包括一个或多个杂原子N、O、S、P，其中所述取代基选自一个或多个环烷基、杂环、羟基、氧代、卤素、胺；较好的是，R.b1包含被H、烷基或直链或环状伯、仲或叔胺取代的羰基、取代的C1-3烷基、环烷基或酰胺，更好是环丙基或CONHC1-3烷基如CONHEt或CH2OH；

各R.b2和R.b3选自H、卤素、羟基、硫醇、胺、COOH、CHO、肼、氰基或饱和或不饱和，取代的或未取代的C1-20支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P；其中任选的取代基选自任意C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，它们任一个可以包含一个或多个以上所述杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等，较好选自H、卤素或羟基，较好是H或Cl；

Rb4是H；

Rb5是H或烷基；

L.b可以包含连接位点或官能团J，如以上所述；并且如以上针对L或其子通式所述的，更好是饱和不饱和取代的或未取代的C1-12脂族或C1-24芳族，如针对L所述的，较好包括一个或多个杂原子O、S或N、环状或杂环基团，更好是通式L.I或子通式所示，最好是(CH2)m，其中m是2-12，较好是3、4、6或8，或是(Ph-CH2CONH)2(CH2)2；

Lig.c较好是通式Lig.c所示的非肽，包括任意可能的连接构型或位点：

Lig.c HOC*(R.c1)CH2NH-R.c2

在此，任意或各Rc1-Rc2或OH，或链C或N可以包含连接位点或官能团J，如以上所述；

*表示旋光中心，且

其中，R.c1是C6-14芳基，任选包括一个或多个杂原子，选自H、O，任选被OH、Hal(例如Cl)、NH2、NHC1-3烷基、磺酰胺、氧代胺(-CONH2)等取代，更好是单、二或三取代的苯基或喹啉，其中，所述取代基包括OH、Cl或NH2，更好是m-CH2OH、p-OH苯基、m-，p-二羟基苯酚或m-，m-二羟基苯酚，m-，m-二Cl、p-NH2苯酚、p-OH、m-CONH2苯酚或5-OH、8-喹啉等，如

R.c2选自饱和或不饱和，取代的或未取代的C1-20，较好是C1-12支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们中任一个可以包含一个或多个杂原子选自N、O、S、P；其中，任选的取代基选自任意任选取代的C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，它们任一个可以包含一个或多个以上所述杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等以及它们的组合；

较好的是，R.c2选自C1-6支链或直链脂族、任选被OH取代的C6-10芳代脂肪族(araliphatic)，以及任选包括杂原子，选自N、O，较好是包括醚O、如选自-(CH2)6OCH((CH2)3Ph)、CHCH3(CH2)2Ph、CHCH3CH2PhOH、C(CH3)2CH2Ph，或选自如下所示结构：

L.c可以作为R.c2存在，或可以包含以上所述连接位点或官能团J，并且如针对L所述的，较好是具有以上所述通式L.I或其子通式，更好选自C1-12烷基、酰胺等；

Lig.d较好是通式Lig.d所示的非肽，包括任意可能的连接构型或位点：

Lig.d  R.d1OCH2C*HOHCH2NH-R.d2

式中，任意或各Rd1-Rd2或OH，链C或N可以包含连接位点或官能团J，如上所述；

*表示旋光中心；

其中，R.d1是饱和或不饱和、取代的或未取代的C1-20支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们中任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P；式中，任选的取代基选自任意C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，它们任一个可以包含一个或多个以上所述的杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等；

较好的是，R.d1是取代的或未取代的C1-24芳烷基或杂芳烷基，包括单环和稠合的环系统，具有(杂)芳基或环烷基环，其中任选的取代基包括C1-6烷基、烷氧基、醚、羰基、链烯基、胺、酰胺，各自任选用羰基、酰胺、卤素或OH取代，或卤素如氯或OH，R.d1较好是未取代的或取代的烷基、链烯基、卤素、胺、酰胺、羰基、酮、醚取代的苯基或萘基，如以下所述，最好是单-、二-、三-或四取代的单环或多环稠合的芳基或环芳基或杂环芳基如苯基、咔唑或以下所示的结构，或螺环体系，最好是单-、二-、三-或四烷氧基烷基、烷氧基烷氧基烷基或CF3取代的苯基或未取代的或单取代的萘或5，6环体系，最好是如下所示的结构：

R.d2是取代的或未取代的胺、饱和或不饱和，取代的或未取代的C1-12支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P；其中，任选的取代基选自任意的C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，它们中任一个可以包含一个或多个以上所述的杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等，更好是胺、C1-6支链或直链烷基，任选包括醚O，且任选被C6-10芳基取代，例如，i.pr、i.bu、或以下通式所示：

L.d可以作为R.d2存在，或可以包含以上所述的连接位点或官能团J，并且如针对L及其子通式所述的，较好是以上通式L.I及其子通式所示，更好是单键或如针对L.a所述的；

Lig.e包括细胞渗透部分，或和细胞渗透L或Fl部分相关，并且较好如以下所列形式的通式所示，包括任意可能的连接构型或位点：

Lig.e1

其中，任意或各自Re1-Re4、X和环C或N可以包含以上所述的连接位点或官能团J；

h选自

各自任选被R.e3-R.e4取代，其中，R.e1-R.e4如以上所述的R.a1-R.a4，R.e3是C5-9直链或支链烷基、任选单或多羟基或卤素取代的，或是任选被烷氧基、磺酰基等取代的芳基：

例如，邻-OEt、

各X独立地选自H、O、-OR.e2、N、HN、NR.e5、HR.e6以及任选被醚取代的芳基；或X是任选被烷基或烷氧基取代的芳基，如Ph-邻-OCH2CH2CH3；

当R.e5如对于以上R.e1的所述，或形成具有相邻环N原子的稠环；较好是1或2稠合的5元环；

R.e6如对于以上R.e1的所述，或选自任选取代的苯基，其中任选的取代基包括醚如o-乙氧基或o-丙氧基、烷基、OH等、磺酰基、羰基等，它们被杂环、或环C5-8烷基如甲基、哌嗪基、磺酰基等取代；

或Lig.e如通式Lig.e2所示

Lig.e2

其中，任意或各自的游离环原子或其取代基可以包含连接位点或官能团J，如上所述；

各螺环任选包含零或一个或多个杂原子h，它们较好是N，更好的是，

包含0或1个N杂原子；和

包含0、1或2个N杂原子，并且是不饱和的，或包含一个或两个C＝C-或-C＝N-基团；和

其中，各环任选被一个或多个氧代、CO、COOH、C1-6烷基或线状或环状烷氧基如甲氧基、乙氧基或环戊氧基取代，任选被一个或多个氧代、CO、COOH、CN或C1-6脂环族或胺基团、胺或一个或多个螺环或稠合的杂环取代；

或Lig.e如通式Lig.e3所示

式中，任意或各Re11-Re12，或环C或杂原子或环取代基可以包含连接位点或官能团J，如上所述。

C.E1和C.E2各独立地选自C5-6芳基、杂芳基、环烷基和杂环，更好选自苯基，或包含1或2个环杂原子的芳基、或包含1个环杂原子和/或1个环上-C＝C-基团的杂环；

至多7个R.e11各自是环碳或环杂原子的取代基，且各独立地选自饱和或不饱和、取代的或未取代的C1-20支链或直链脂族、芳族、脂环族以及它们的组合，它们中任一个可以包含一个或多个杂原子，选自N、O、S、P，其中任选的取代基选自任意C1-12脂族、芳族或脂环族取代基，它们中任一个可以包含一个或多个以上所述的杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基等，如＝O、OCH3、CH2Ph(OCH3)2、O(CH2)3CON(CH3)c.hex、N(CH2CH2OH)2、c.hex、COOCH2CH3、CH2CH3；

或任意两个或多个R.e11形成单环、二环或三环稠合的环状结构，较好包括稠合的三环芳基、5-杂环、具有与稠合双环Lig.e3结构共有的4个环原子的6-杂环结构；

R.e12是以上R.e11所定义的部分；

较好的是，Lig.e如通式Lig.e1所示(如上所述，特别是当R.e2和R.e3分别为丙基和丁基)时

L.e可以包含如上所述的连接位点或官能团J，较好是如以上对于L.a.所述。

以上所述连接位点宜具有任意性质和位置，即不会抑制结合、抑制或转运的任意位点。受体连接是复杂的，并且需要得到特异性结合位点，和/或需要特异性荧光配体构型。

本发明库的荧光配体的特征在于以上所述不同连接位点连接配体和荧光部分。从对结合、抑制或转运行为以及特异性靶位点(在本发明荧光配体中保持不变)的综合知识，我们已经能确定选择合适连接位点以保持结合、抑制或转运以及药效性质的方法。较好的是，通式I或I’所示的化合物包括表示所有有效的连接构型的化合物，所述构型显示可能的结合、抑制或转运。

Fl可以包括任意红、绿、近红外、蓝等吸收染料和其它类型的染料。较好的是，Fl选自染料，尤其是包括荧光素、荧光素衍生物，包括FITC和荧光素样分子，如Oregon GreenTM和其衍生物、Texas redTM、7-硝基苯-2-氧代-1，3-二唑(NBD)及其衍生物、香豆素和衍生物、萘(包括衍生物)、丹磺酰氯或其类似物或衍生物、Cascade BlueTM、EvoBlue及其荧光衍生物、芘和吡啶基噁唑衍生物、菁蓝染料、dyomics(DY染料和ATTO染料)及其荧光衍生物、Alexaflu染料及其衍生物、BDI染料，包括市售的BodipyTM染料、赤藓红、曙红、芘、蒽、吖啶、荧光藻胆蛋白及其共轭物和荧光化微珠、若丹明及其荧光衍生物，包括若丹明GreenTM，包括四甲基若丹明、X-若丹明和Texas红衍生物、以及Rhodol GreenTM，使用异氰酸酯、琥珀酰亚胺基酯或二氯三嗪基活性基团偶合到胺基上，以及其它红、蓝或绿的吸光荧光染料，尤其是红色吸收染料，如Buschmann V等、BioconjugateChemistry(2002)，ASAP文章所述。

更好的是，Fl选自荧光素衍生物和荧光素样分子，如Oregon GreenTM和其衍生物、Texas redTM、7-硝基苯-2-氧代-1，3-二唑(NBD)及其衍生物、香豆素及其衍生物、萘(包括其衍生物)、丹磺酰氯或其类似物或其衍生物、Cascade BlueTM、EvoBlue及其荧光衍生物、芘和吡啶基噁唑衍生物、菁蓝染料、dionics(DY染料和ATTO染料)及其荧光衍生物、Alexaflu或染料及其衍生物、BDI染料，包括市售的BodipyTM染料、赤藓红、曙红、FITC、芘、蒽、吖啶、荧光藻胆蛋白及其共轭物和荧光化微粒、若丹明及其衍生物，包括若丹明GreenTM，包括四甲基若丹明、X-若丹明和Texas红衍生物以及Rhodol GreenTM。

更好的是，Fl包括荧光素、Texas RedTM、Cy5.5或Cy5或其类似物、BODIPYTM630/650以及它们的类似物、DY-630、DY-640、DY-650或DY-655或其类似物、ATTO 655或ATTO 680或其类似物、EvoBlue 30或其类似物、Alexa 647或其类似物。

Fl较好来自以上任意市售的荧光团，包括或修饰成包含便于通过以上部分连接到配体上的活性基团。较好的是，Fl包括上述任意市售的荧光团，它修饰形成适于使上述包含JT-t-Fl的库中的配体结合、抑制或转运显影的衍生物或衍生物基团，其中JT如上所述，且包括来自连接到上述前体配体的官能团，且任选包含连接基团-t-，是最接近的不饱和或芳基部分，包括中短、中等或长链炔基或环烷基部分，且包括通过以上活性基团连接的部分，如羧基、磺酸盐，或作为杂原子如O或S或亚甲基，来自在烷基卤化物如甲基溴化物、卤代乙酰胺、磺酸酯等亲电基团的连接。

例如，Fl可以包括取代基-t-，它起到荧光修饰的功能，例如，是杂芳基或链烯基如单-、二-或三-烯基团，它们将化合物的荧光移到光谱的红区，并提高吸收的最大值，或发挥连接功能。

优选的BODIPYTM(4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-苯并二茚)荧光团包括跨过可见光谱的那些，且包括在美国专利No.4,774,339；美国专利No.5,187,288；美国专利No.5,248,782；美国专利No.5,274,113；美国专利No.5,433,896；美国专利No.5,451,663中所列的那些。在该组中优选选自任意杂芳基取代的BODIPYTM染料，如以上专利中所述的，其内容参考引用于此。

合适的是，包括BODIPYTM结构的JT-t-Fl的特征在于双吡咯亚甲基硼二氟化物芯，任选通过一个或两个稠合的环进行修饰，任选用一个或几个取代基如烷基、烷氧基、芳基、杂环等取代，其中，一个取代基-t-如上所述用于连接上述配体前体，所述取代基-t-任选包含最接近的不饱和或芳基部分，包括中短、中等或长链炔基或环烷基部分，且包含以上所述通过活性基团连接的部分，如羧基、磺酸酯或杂原子如O或S或来自烷基卤化物处连接的亚甲基，如甲基溴、卤代乙酰胺、磺酸酯等亲电基团。

Fl可以包括以上所述的取代基-t-，它们是杂芳基或链烯基，如单-、二-或三-烯基，使化合物的荧光移到光谱的红区，并提高吸收最大值，如US 5187288所述；或可以包括连接到一个或多个芳基、羰基等的链烯基取代基，较好连接到脂肪酸的侧链上，所述侧链包含(CH2)nCO2H，其中n＝5-22，如US 5338854所述，更好是通过芳氧基亚甲基连接到羰基上，或者可以包括芳基链烯基芳基，如US6005113所述。

更好的是，-Fl如通式-Fl1所示：

Fl1双吡咯基亚甲基硼二氟化物类似物，包括任意可能的连接构型或位点：

其中，任意或各R1-R7，或环原子可以包含连接位点或官能团J，如上所述

R7是N或C-R8；

取代基R1、R2、R3、R4、R5、R6和R8可以相同或不同，为H、卤素、硝基、磺基、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、链烯基、炔基、环烷基、芳基烷基、或酰基，其中，各自的烷基部分包含少于20个碳；或取代的或未取代的芳基或杂芳基；较好的是，至少4个R1-R8不是氢，或者邻接的取代基R1和R2组合在一起，以及邻接的取代基R5和R6组合在一起形成稠合的6-元(杂)芳族环，或

包括任意可能的连接构型或位点：

其中，任意或各R3、R4或R7，或环原子可以包含连接位点或官能团J，如上所述

各稠合的环任选和单独被H、卤素、硝基、磺基、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、链烯基、炔基、环烷基、烷硫基、烷基酰胺基、氨基、(单或二烷基)氨基(其中，各自的烷基部分包含少于20个的碳)、或取代的或未取代的芳基、杂芳基、芳基酰胺基、杂芳基酰胺基、芳氧基、杂芳氧基、芳基氨基或杂芳基氨基取代；或者被1-2个其它稠合的苯并或杂芳族环(任选取代或未取代的)取代。

较好的是，任意或所有的R2，3-R4，5是杂芳基，更好是单环单杂原子如吡咯、噻吩、呋喃或单环二杂原子结构如噁唑、异噁唑、氧代二唑、咪唑，或多环如苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑，或多环单杂原子结构如苯并呋喃、吲哚，较好是噻吩基。

更好的是，Fl选自通式FL.A1或FL.A2所示的BODIPY核心结构，如下文所示。在这种情况中，＝表示侧链的连接位点，包括任意可能的连接构型或位点：

Fl.A1

较好的是，包括或来自BODIPY TMR或BODIPY FL(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-苯并二茚-3-丙酸)或BODIPY FL乙二胺，包括任意可能的连接构型或位点：

BODIPY TMR                                  BODIPY FL乙二胺(X是CONH(CH2)2NH2)

                                            或BODIPY FL(X是COOH)

或Fl.A2，包括任意可能的连接构型或位点：

较好包括或来自BODIPY 630/650或BODIPY 630/650甲基溴，包括任意可能的连接构型或位点：

BODIPY 630/650甲基溴                                       BODIPY 630/650

BODIPY 630/650X

最好是其琥珀酰亚胺基酯，例如，BODIPY 630/650 X-SE.

在本发明的另一方面，提供一种用于制备以上所述库的方法，包括使许多配体前体中的一个或各个与包含接头部分或配体、标记物以及接头前体的标记前体反应，其中，如上所述，连接可以在不同化合物中的相同或不同活性位点处。

较好的是，所述方法是一个组合方法。所述方法较好包括使通式IV和/或IV’所示一种或多种配体前体与通式V和/或V’所示许多分析标记底物中的一种或多种以及任选的一种或多种连接种类VI或VI’或VI”反应：

IV   (LigJL)m-L-YLm

IV’ Lig YLigm

其中，所述配体包含一个或多个，或不同活性基团YL或YLig，如上所述形成连接官能团J、JL或JT；

V    YTmTag

V’  YTmL(JTTag)m

其中，所述分析标记底物包含一个或多个，或不同活性基团YT，如上所述形成连接官能团J或JT；

VI   YLm L YLm

其中，Lig、J、L、JT和Tag以及各m单独如上所述；

其中，通式IV或IV’所示各化合物能与通式V或V’所示各化合物反应，任选通过各种类VI或VI’或VI”形成通式I所示许多化合物，如上所述。

较好的是，在通式V或V’所示一些或各化合物中，Tag是如上所述的Fl，在此，所述方法是用于制备包含许多化合物的库的方法，所述化合物中的一个或多个或所有的均如以上通式I’所示。

合适的活性基团YLig、YL和YT具有用于连接的合适活性基团官能团，如以上所述，例如通过取代反应或加成或加成-消去反应。取代反应宜选自亲电和亲核反应位点的反应，如以上所述，例如：

亲电Y             亲核Y         所得共价键，J       离去基团

羧酸              醇            酯                  -OH，-H

羧酸              胺            甲酰胺              -OH，-H

羧酸              肼            酰肼                -OH，-H

烷基卤化物        醇            醚                  -Hal，-H

烷基卤化物        硫醇          硫代醚              -Hal，-H

烷基卤化物        胺            烷基胺              -Hal，-H

烷基卤化物        COOH          酯                  -Hal，-H

卤代乙酰胺        硫            醇硫代醚            -Hal，-H

磺酸酯类          胺            烷基胺类            RSO3-，-H

磺酸酯类          醇            醚                  RSO3-、-H

磺酸酯类          硫醇类        硫代醚类            RSO3-、-H

磺酰基卤化物      胺            磺酰胺类            -H

磺酰基卤化物      醇            磺酸酯类            -Hal，-H

琥珀酰亚胺酯      醇            酯                  -OSu*、-H

琥珀酰亚胺酯      羟氧化物类    酯                  -OSu*、H或M+

琥珀酰亚胺酯      硫醇类        硫代酯类            -OSu*、-H

琥珀酰亚胺酯      胺            甲酰胺              -OSu*、-H

琥珀酰亚胺酯      肼            酰肼                -OSu*、-H

其中，*是

其中，*是[3+2]双极性环加成。

通式IV或IV’所示化合物较好没有保护基，且能任选通过通式VI所示化合物与通式V或V’所示化合物反应，无需通过选择反应和各反应位点来降低官能度；或者通式IV或IV’所示化合物包含一个或多个保护基，所述保护基能在室温条件(例如，中性pH，室温等)下除去。较好的是，所述方法包括其中反应基团Y选择能与完全脱保护的配体反应即无需脱保护基的反应，或者能与在温和条件下可以除去的保护基反应，例如，YLig或YL或YT中一个包含胺或醇或硫醇，且其它包含琥珀酰亚胺酯。

在活性基团的选择需要保护通式IV或IV’所示的化合物的情况下，保护基较好能在温和条件下除去，较好包含苄氧基羰基等，它能在环境条件如室温或在不损害官能团如Lig.b中的糖苷基团的条件下除去。

本发明方法的特征在于，如上所述，借助使用化学选择性，通式I或I’所示化合物的产率高，并且比使用非化学选择性反应基团或保护基团而对产率不利的已知方法优越。

较好的是，通式I或I’所示的化合物通过如下所述制得：

在室温下，在溶剂中使以上所述通式IV所示的化合物的未保护的伯烷基胺基与包含活性琥珀酰亚胺酯基的通式V所示化合物反应，无需进行后续的脱保护。本发明特别的优点在于所述方法提供了比已有技术的方法较大的产率。

通式IV，IV’，V’，V’或VI所示的化合物可以是市售的，或者可以通过已知方法制得。接头可以作为独立的实体行安装；或者如以上所述作为合成方法的部分构建，较好的是，在其反应之前作为配体部分或荧光部分上的加成取代基进行合成。

本发明另一方面提供一种制备以上所述通式I所示化合物的方法，所述方法包括如上所述使通式IV或IV’所示化合物与通式V或V’所示化合物以及任选还有通式VI所示化合物反应。

本发明另一方面提供了制备以上所述通式IV所示化合物的方法，包括通过购买或者本领域已知的方法制得配体前体Lig，若需要的话，与接头前体VI”或其组分反应，和/或形成一个或多个反应位点Y或YLig或YL。在反应之后需要除去反应过程中存在的任意保护基的情况下需要保护IV，并任选用保护基替换，该保护基可以在环境条件下除去。活性基团Y或YLig或YL较好选自以上所述的基团。

较好的是，所述方法包括：

a)，e)在酸性条件下，用氯化铁将5，6-二氨基-1，3-二烷基尿嘧啶和取代的醛进行闭环，

b)使包含保护的肌苷衍生物的Lig.b与氯化剂反应，并连接具有适当保护的胺活性接头H-L-PL的胺基的氯代衍生物(其中，PL包含N-苄氧基羰基-)，形成Lig.b-L-PL，并去除PL，产生Lig.b-L.b；较好的是，R.b1包含OH封端基，保护的肌苷包含酰基保护基，或R.b1包含稳定基团，如胺或酰胺，且保护的肌苷包含2，2-二甲氧基丙烷保护基；较好的是，所述保护的肌苷和氧化剂及保护的烷基胺(即N-烷基甲酰胺)反应，除去胺保护基，产生活性配体；

c)，d)在酸催化条件下使p-羟基苯甲醛和甲醛反应，用二甲氧基丙烷保护所得的4-羟基-3-羟基甲基苯甲醛，产生所得的丙酮化合物。将苯甲醛转化成其对应的环氧化物，并用适当保护的接头如Boc-L.c-H进行开环，提供Ligm-L-PL。最后，在酸条件下进行脱保护反应，提供用于偶联到合适标记物上的Lig.cLc或Lig.dLd。

本发明的优点在于，在所述部分是非活性的，或者立体化学或其它效应抑制连接，或者市售通式IV或IV’和V或V’所示化合物中已有活性基团的反应需要加入其中官能团的保护基团时，接头L便于连接荧光部分和配体部分，这种情况下，接头通常是双官能化短、中或长链结构。本发明的另一优势在于，接头L可以具有便于贯穿细胞膜、疏水性、亲水性等的性质，这种情况下，接头部分通常是任意官能化的结构。

较好的是，以上通式IV所示接头前体选自杂原子类，如提供N、O、S或P的种类，或支链或直链饱和或不饱和的(任选包含杂原子的)C1-600活性烃以及它们的组合，它们可以是单体、具有2-30个低聚重复的低聚物或者具有超过30到至多300个聚合重复的聚合物，且包含用于连接到配体的活性基团或位点以及荧光团，所述荧光团选自羟基、烷氧基、硫醇，硫氧基、胺、肼和羰基等。在接头包含单键时，活性位点通常在通式IV’所示化合物中存在，由此与通式V或V’所示化合物反应。

通式VI所示化合物较好包含3个、4个、5个或6个活性位点，用于连接3个或多个通式IV或V所示的配体和标记物。接头前体较好选自能产生或提供以上所述部分L的任意底物。

通式VI所示接头前体较好是短、中等或长链，包含合理构思的官能团，且包含在以上所述部分L中提供官能团的活性位点。通式VI所示接头前体较好是单、二或混合的胺、羟基、硫醇、羧酸、酰氯、酰氟、酰溴(酰卤)、异氰酸酯NCO、异硫代氰酸酯NCS、卤化物、烷基卤化物、醛、环氧化物、磺酰氯SO2Cl或肼NHNH2，更好是选自单，二或三氨基薄荷烷、氨基乙烷、乙烷硫醇、羟基乙烷、氨基酸，选自多肽，或选自其单或多醚衍生物，例如二胺或二硫醇如单或聚乙二醇二或三胺或硫醇。

通式VI所示接头前体较好选自任意C1-12取代的或未取代的烷基胺、氨基酸、环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基等，提供一个或多个用于连接Fl的活性端基，更好选自(二)胺，包括环状或线形胺，更好是二胺薄荷烷、或二氨基乙烯、氨基酸或多肽，或选自单或多醚二胺如聚乙二醇二胺，更好是选自H2N(CH2)4NHCO2CH2Ph、H2N(CH2)5NHCO2CH2Ph、H2N((CH2)2O)2(CH2)2NHCO2CH2Ph和H2N(CH2)nNHBoc，其中n是2-8。

较好的是，接头前体包含通式YLmL.I YLm所示具有一个、两个或三个活性位点的线性或支链，或环取代的或未取代的烷基，其中L.I如以上所述。

较好的是，各YL独立地选自H、CO2H、NH2、O、P、S和在反应时提供单键的基团、烷基如亚甲基、炔、烯烃、NH、NR、O、NRCO、S、CO、NCO、CHHal、P等，其中，Hal是任意卤素，选自氯、碘、溴，或

其中，YL包括保护离去基团ZL，如-NHCO2CH2Ph、H、OH、SH、卤素、胺、脂肪族、N-烷基甲酰胺、Boc等；

本发明另一方面提供一种由以上所述库中选择通式I所示化合物的方法，包括使用以上所述方法合理设计以上通式I所示化合物的库，确定所述库中许多或所有化合物的药效，并选择在所需靶标显示所需药效的化合物。

所述方法较好包括制备化合物的预备库，进行筛选以评定结合、抑制、转运等，选择在筛选中认为具有有利性能的化合物，并基于筛选的指示接头部分的性质或连接位置进行修饰或官能化，制得优化的库。本发明的具体优势在于，来自筛选的分子药效和光化学反馈到所述库的设计中。

在一些情况下，所述接头的策略对要用的标记物具有特异性，这样修饰标记物要求修饰接头。我们惊奇地发现修饰一个部分而没有随之修饰其它部分会导致产生非活性化合物，例如不能结合。

本发明另一方面提供以上通式I或I’所示的已知或新的化合物，其中，所述化合物和涉及其药效性能的信息相关，所述药效以激发最大值和发射最大值表示的光谱性能、荧光寿命和发射量子产率、以及以表达以上所述GPCR受体或表达细胞内酶如环核苷酸磷酸二酯酶的细胞，或以上所述药物转运蛋白限定的药效来表示，并加之以受体结合或受体官能团的抑制或拮抗以及抑制(pKB)或拮抗(pK1)结合常数的值，以及任选连同在单个活细胞中药理结合说明所述抑制或拮抗的荧光图像。

所述化合物较好与涉及其药效性能的信息相关，其中，药效以细胞或蛋白质的形式限定，所述细胞表达GPCR、细胞内酶或药物转运蛋白，或者所述蛋白是GPCR、细胞内酶或药物转运蛋白，较好是CHO细胞包含以上所述的GPCR受体，较好选自腺苷受体，如A1-、A2A-、A2B-和A3-受体、β-肾上腺素受体如β1、β2-和β3-肾上腺素受体等受体，或包括细胞内酶的抑制剂，如环核苷酸磷酸二酯酶，或以上所述药物转运蛋白的底物或抑制剂；更好的是CHO-细胞表达人类腺苷A1-受体或β-肾上腺素受体，或细胞内酶的抑制剂如细胞内磷酸二酯酶的抑制剂。所述药效以EC50值(激动剂刺激)或者pKi值(激动剂刺激第二信使产生的拮抗作用)或底物Km值或拮抗剂K1值(用于刺激或抑制细胞内酶或药物转运蛋白)。

新化合物较好如以上通式I或I’所示，更好选自通式Lig.am L.a-Fl.an到Lig.em L.eFl.en，如以上所述。

其条件是：

a)当Lig是Lig.a中的XAC ie时，当R.a1和R.a2各自是丙基时，R.a3是H，R.a4是-Ph-OCH2CONH(CH2)2NH-，L是单键，或L是gly，n＝3；或L是NCS，Fl不是荧光素；或

当Lig是XAC，L是单键或NCS时，Fl不是荧光素或NBD；

b)当Lig是腺苷时，Fl不是Fmoc(CA134：204756)；或

当Lig是ADAC，即R.b1是CH2OH时，R.b2和R.b3是H，L是-(Ph-CH2CONH)2(CH2)2-，或L是单键，Fl不是荧光素、NBD或若丹明；或当Lig是NECA(结合部分-(CH2)m)，即R.b2和R.b3是H，L是单键，或是-(CH2)m；当m是2，4，6，8或10，那么Fl不是NBD，或当m是3，4，6，8，10或12，那么Fl不是丹磺酰基；或

当Lig是N6-[2-(4-氨基苯基)乙基]腺苷，L是(CH2)2PhNH时，Fl不是FITC(CA131：56155(8))

d)当Lig是CGP12177，L(R.d2)是单胺薄荷烷时，Fl不是BODIPY_TMR；或

当Lig是CGP12177，L是1，1，4，4-四甲基丁基胺，即C(CH3)2(CH2)2C(CH3)2NH-时，Fl不是BODIPY_FL；或当L是C(CH3)2(CH2)2C(CH3)2NHCSNH-时，那么Fl不是FITC、曙红或赤藓红；或当L是单胺薄荷烷时，Fl不是FITC(CA 131：56155(4))；或

当Lig是CGP12177，L是单键时，Fl不是NBD；或

当Lig是阿普洛尔，即o-2-丙烯苯基，L是-C(CH3)2-或单键时，Fl不是NBD。

此外，任选

a)当Lig是Lig.a中的XAC ie，当R.a1和R.a2各自是丙基，R.a3是H，R.a4是-Ph-OCH2CONH(CH2)2NH-，L是单键时，Fl不是BODIPYTM630/650；或

b)当Lig是ABEA，即m是4和L是单键时，Fl不是BODIPYTM 630/650。

本发明所述配体或荧光配体较好是激动剂，它保持其结合亲和性及其官能活性；或者是拮抗剂，，它保持其在连接时或当连接到荧光部分Fl时的结合亲和性。荧光配体具有亲和性，使它们永久、半永久或暂时结合，即当洗去未结合配体时可以保持结合，或可以被洗去。

本发明的荧光配体可以本身具有旋光或者可以已知方式官能化成旋光，且任意这种配体可以作为外消旋物或作为其一个旋光异构体存在。

本发明另一方面提供以上通式IV或IV’所示新活性配体或其库，用于连接到以上通式V或V’所示任意合适的标记物上；其条件是：

当Lig是Lig.a，并是以上所述1，3-二烷基黄嘌呤，式中X1和X2是＝O，R.a3是H，R.a1和R.a2均为CH3或均为n-C3H7，那么R.a4不是4-羟基苯酚或PhOCH2CO2H；或

当R.a1和R.a2均是n-C3H7，那么R.a4不是PhOCH2OCNHPhOH、PhOCH2OCONsuccin、PhOCH2CONH2、PhOCH2CONH(CH2)2NH2、PhOCH2CONH(CH2)8NH2、PhOCH2COHNNH2或PhOCH2CONH(CH2)2N(CH2CH3.HOAc)CH2PhOH；或

当Lig是CGP12177，那么L不是-C(CH3)2(CH2)2C(CH3)2NH2(CA 121：103486；或

当Lig是aden，L不是-(CH2)2S(CH2)2NH2(CA 125：218348；或L不是(CH2)6NH2或CH2CONH(CH2)6NH2(CA 134：2043)；或L不是(CH2)2NH2或(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2NH2(CA135：25706)；或L不是(CH2)nNH2，式中n是2-12(CA 108：715)；

或当Lig是阿普洛尔时，L不是(CH2)8NH2；或当Lig是心得安时，L不是(CH2)4NH2(CA 124：8848)；

或当Lig是阿普洛尔时，L不是CH2C(CH3)2NH2(CA 108：215827)；

或当Lig是ICI 118551时，L不是(CH2)2NH2；或当Lig是心得安时，L不是(CH2)2NH2(CA 98：4564)。

较好的是，新配体-接头包含通式IV所示化合物，其中，组分如上所述，活性基团YLig如上所述，较好是以上通式Lig L.I或Lig LI’所示的活性基团。

本发明另一方面提供一种以上通式V或V’所示的新荧光团接头，或其库。

本发明另一方面提供一种试剂盒，它包含配体前体、接头前体和以上通式IV、IV’、V、V’和/或VI所示的标记前体，用于制备以上通式I所示化合物的库。

本发明另一方面提供以上通式I或I’所示荧光配体或其库用于显影受体或受体结合、评定荧光配体的药效性能、在结合到靶受体的新化学实体的高通量筛选中、在抑制细胞内酶或抑制药物转运蛋白或药物转运蛋白的底物中，在研究适于转运的药物转运蛋白或药物，在区分健康组织或患病组织等中的应用。所述应用较好包括使用任意荧光检测技术，更好是共焦显微术或荧光关联光谱。所述应用较好能计算配体的亲和性常数以及受体类亚群、细胞内酶或药物转运蛋白的浓度，如以上所述。

本发明另一方面提供用于受体结合或抑制、细胞内酶抑制或药物转运或抑制以及显影的方法，所述方法包括使以上所述荧光配体和样品接触，便于其结合或抑制或由此转运，并检测荧光或其位置的变化。

所述样品可以包括细胞材料、选自细胞、细胞提取物、细胞均浆、纯化的或重建的蛋白质、重组蛋白质或合成蛋白质等，包括通式I所示化合物的靶标。包含细胞材料的样品可以来自植物、动物、真菌、原生生物、细菌、古生菌或来源于这种生物的细胞系。用于制备样品的动物或植物细胞可以是健康的或功能不良的，且任选用于诊断疾病，如白血病或癌症。在本发明优选的实施方式中，所述样品包括哺乳动物的细胞、提取物和均浆。

所述样品较好包括活细胞材料，更好包括单个细胞或亚细胞隔室，最好是包括活细胞中的GPCR、细胞内酶或药物转运蛋白、包含这些蛋白质的膜、增溶的受体、酶或药物转运蛋白或GPCR阵列。细胞材料可以已知方式通过培养细胞或在细胞中表达蛋白质来获得。

在优选的实施方式中，所述细胞材料是表达GPCR的细胞、酶或药物转运蛋白。GPCR可能是目前前瞻性药物治疗所用单个最重要的靶标。

更好地是，所述样品包括GPCR受体，选自腺苷A1-、A2A-、A2B-和A3-受体，β1、β2-和β3-肾上腺素受体，或者包括细胞内酶抑制剂，如环核苷酸磷酸二酯酶，最好是表达人类CHO-细胞的腺苷A1-受体或β-肾上腺素受体或细胞内酶的抑制剂，如细胞内磷酸二酯酶的抑制剂。

在接触荧光配体前，细胞材料可以标记，例如通过用GFP例如GFP标记的GPCR、GFP标记的细胞内酶以及GFP标记的药物转运蛋白，或者天然受体、细胞内酶或药物转运蛋白(荧光抗体已经靶向该转运蛋白)，使细胞受体、酶或转运蛋白显影，并覆盖所述荧光配体。

受体可以在膜样品中，或者在剧烈分散的细胞样品中提供，例如内源生受体如剧烈分散的细胞中的A1-AR。所述腺苷受体结合位点位于受体口袋内的深处，这样具有接头的荧光配体是优选的荧光激动剂(拮抗剂)。同时，改变所述配体并保持拮抗剂结合活性相当自由，更难保持激动剂活化活性，即活化受体对结合的功能。

用于药物转运蛋白的底物的药物转运的方法将在通式I所示化合物摄入到细胞溶质之后进行(若所述转运蛋白将药物转移到细胞中)，或者在将底物加入所述细胞中或，随之通式I所示化合物从细胞中消失，或出现在细胞间介质中(若所述转运蛋白将药物从细胞内转移出来，例如当所述转运蛋白是ATP-驱动泵时)。所述方法较好包括监控通过平衡转运蛋白将药物转运到细胞中，所述转运蛋白将所述化合物转运到细胞中，然后，施加这种第一平衡转运蛋白的抑制剂，并监控通过ATP-驱动泵转运蛋白将药物从细胞中输出。

药物转运蛋白抑制的方法可以通过检测结合细胞表面上的转运蛋白来监控。

所述包括检测荧光变化的方法较好包括检测强度的变化、荧光(单光子和多光子)的激发或发射波长分布、荧光寿命、荧光偏振或者它们的组合等。所述光响应通过已知方式来检测，如照相机、胶片、激光扫描器件、荧光计、光电二极管、量子计数器、微型、显微镜、荧光显微镜如落射荧光(epifluorescence)或共焦、细胞计数器、读数器等，较好是CSLM、共焦板读数器、荧光偏振板读数器或FCS。当使用流动细胞计数器检查所述样品时，所述样品检查任选包括按照其荧光响应分选所述样品的组分。

本发明结合或抑制或检测的方法可以在体外或体内进行。

本发明尤其有利的是所述新荧光配体适于和FCS组合使用，能在单分子水平上研究配体-受体的结合。由于监控了所述事件的本质，FCS能理想地用于研究分子在溶液中相互作用的热动力和动力学特征。本发明另一个具体优势在于FCS途径可以在单分子水平上使用光子计数荧光强度测量法监控配体-受体的结合。这不需要在共焦体积内移动所述分子。

在配体显示低背景荧光的情况下，不需要通过在进行共焦显微术或FCS之前进行洗涤来除去未结合的配体。因此，可以按照依赖于时间和浓度的方式测量随时间变化的荧光情况。

共焦显微术(CSLM)能使细胞的剖面显影，显示在细胞边缘处的荧光团浓度，表明膜受体的结合。显影是具体聚焦的平面，可以观察单个细胞的”薄片”如本领域已知的。可以选择不同的着色通道来显影不同的荧光团类型。

FCS是一种非侵入性技术，它通过统计分析其光子发射的图案来分析荧光物质通过很小的发射体积(＜10-15l)的扩散特征。这样，快速扩散的游离配体可以和缓慢扩散的受体-结合配体区分开来，并在所述体积位于细胞膜上时同时量化。所述结合FCS的方法较好包括在共焦体积＜10-15l的条件下测量荧光强度的波动。这些波动的统计分析提供了有关扩散速度(即，质量)和荧光分子浓度的信息。因此，游离配体(快速扩散)和结合的配体(缓慢扩散)可以在单细胞上同时量化。

FCS(荧光相关光谱法)涉及颗粒荧光发射对用于研究分子在溶液中相互作用的参数如颗粒质量以及浓度的波动。FCS基本上通过分析紧密聚焦激光束来监控显微镜检测体积(10-15l)中荧光标记的分子的自发荧光强度波动。

这些波动提供了有关颗粒扩散速度或扩散时间的信息，它直接取决于给定分子的质量。当小的(因此快速扩散的)分子经过激光通路时，它们产生快速波动的荧光强度图案，而当更大分子经过所述光束时，它们产生更持久的荧光爆炸。因此，当所得生物分子扩散时间增加时，则可以检测到生物分子的质量增加例如由于配体结合的结果。

可以使用荧光显微镜将受体在一定灵敏度和速度下定位在单细胞或亚细胞水平上。在这种方式中，高亲和性标记的配体有助于说明GPCR受体亚型的分子特征，如腺苷等受体，其区域分布和细胞定位。

在本发明另一方面中，提供了荧光靶标对荧光配体的用途，例如，绿荧光蛋白质标记的受体、细胞内酶或药物转运蛋白。在这种情况下，所述荧光配体的光谱特征选择用于单独检测荧光配体和荧光受体、细胞内酶或药物转运蛋白的定位。然后，交叉关联的荧光相关光谱或荧光强度测量能在单独测量中定量分析配体-受体、配体-酶、配体-药物转运蛋白或药物转运相互作用。这和已有技术中涉及GFP-蛋白质转运测定和涉及荧光能量转移(FRET)测定的方法不同。图1举例说明了这种方式。

本发明另一方面提供一种细胞表面GPCR，在其N-端或天然存在域上修饰，以表达用于市售抗体(例如，myc，血细胞凝集素，FLAG)的短表位标记物。然后，这在CHO细胞中表达，标记物序列的荧光抗体用在活细胞中，如以上GFP-标记蛋白质中所述提供对荧光配体-受体相互作用的两色分析。

本发明另一方面提供表达细胞表面GPCR的CHO细胞的，如权利要求37所述进行修饰，同时，标记物序列的荧光抗体用在活细胞中，如以上GFP-标记蛋白质中所述提供对荧光配体-受体相互作用的两色分析。

本发明另一方面提供一种试剂盒，它包含以上通式I或I’所示的化合物以及作为细胞系、来自这种细胞系的膜或者由该细胞系增溶的蛋白质提供的靶标。所述来自细胞的材料可以作为三种形式中的一种提供：(1)来自表达绿荧光蛋白质标记的受体、细胞内酶或药物转运蛋白的细胞；(2)来自表达表位标记物的细胞，用于市售的荧光抗体；或者(3)野生型蛋白质，也提供了特异性荧光抗体。

在另一实施方式中，提供了一种试剂盒，它包含以上通式I或I’所示的化合物以及对天然蛋白质的荧光抗体，它可以用在天然(非重组)细胞中。

在各情况下，选择通式I或I’所示化合物以及荧光抗体或绿色荧光蛋白质的光谱特征，以进行最佳的两色交叉相关的荧光相关光谱法(单光子或多光子)。

参考以下附图和实施例以及附带的合成流程以非限制的方式说明了本发明。

在附图中：

图1显示了BODIPY-XAC结合到表达人A1受体的CHO-K1细胞上的情况，上述受体具有连接到C末端的绿色荧光蛋白质标记物。(a)红色配体的结合；(b)A1-GFP受体的位置以及(c)通过共焦显微术获得的双信号共同定位(黄色)；更具体的是，图1显示了a)来自结合到CHO细胞表面上的受体的XAC BY-630的荧光的共焦显微术图像，在红色通道观察到；(b)来自稠合到人腺苷A1-受体(由指示受体位置的CHO细胞表达的)的C末端的绿色荧光蛋白质的荧光的共焦显微术图像，通过绿色通道观测到；(c)来自(a)和(b)显示荧光重叠的图像，因此，证实配体结合对受体具有特异性。图2显示BODIPY-ABEA结合到表达人A1受体的CHO-K1细胞上的情况，上述受体具有连接到C末端的绿色荧光蛋白质标记物。(a)红色配体的结合；(b)A1-GFP受体的位置以及(c)通过共焦显微术获得的双信号共同定位(黄色)。

在所述流程中：

流程1显示腺苷受体拮抗剂Lig-L-FlL的合成路线。

流程2和3显示两种腺苷受体激动剂Lig-L-FlL的合成路线，包括由接头前体ZL’-L-ZL合成配体前体Lig-L-ZL。

流程4显示两种β肾上腺素受体激动剂Lig-L-FlL的合成路线，包括由接头前体ZL’-L-ZL合成配体前体Lig-L-ZL。

实施例A-C

合成以下化合物，或将以下化合物作为模型，并研究其结合亲和性：

实施例A1/B1/C1腺苷受体拮抗剂：

XAC-BODIPY 630/650(1)

实施例A2/B2腺苷受体激动剂：

腺苷-BODIPY 630/650(2)

NECA-BODIPY 630/650(3)(ABEA-BODIPY 630)

APEA-BODIPY 630/650(3a)

ABIPEA-BODIPY 630/650(3b)

实施例A3/B3β-肾上腺素受体激动剂

沙莫特罗-BODIPY 630/650(4)

氨哮素-BODIPY 630/650(9)

实施例A4/B4β-肾上腺素受体拮抗剂

CGP12177-BODIPY 630/650(5)

心得安-BODIPY 630/650(6)

ICI118551-BODIPY 630/650(7)

阿普洛尔-BODIPY 630/650(8)

实施例A5/B5环核苷酸磷酸二酯酶的抑制剂

XAC-BODIPY 630/650(1)

材料和方法

在Bruker am250(250MHz)光谱仪上在CDCl3或DMSO-d6中获得1H NMR的光谱。参考残留溶剂信号/TMS以ppm记录化学偏移(δ)。以赫兹记录偶合常数(J)，信号的多样性以s(单峰)、d(双峰)、dd(两个双峰)、t(三峰)、m(多峰)、br(宽峰)来表示。在给定条件下，根据同核相关光谱(COSY-45)进行分配，所得值与文献值一致(Jacobsen KA等，J.Med.Chem.(1985)，28，1341-6)。

(在Waters Millenium LC系统(996PDA洗脱检测，用Vydac C8色谱柱(150mmx4.6mm)，流速1.0mL/分钟)中进行分析RP-HPLC。所述移动相为溶剂A，水(用氦气鼓泡脱气)；溶剂B，乙腈(用超声波脱气))。

A.合成

实施例A1-合成腺苷基荧光A1-受体拮抗剂

1.XAC-BY630(1)

流程1

试剂和条件：(i)BODIPY 630/650-X-SE，DMF 2小时，室温(72％)

通过反应XAC的伯烷基胺基和BODIPY_-630/650-X-琥珀酰亚胺基酯(Molecular Probes)来合成XAC-BODIPY 630/650。在室温下，在N，N-二甲基甲酰胺中搅拌XAC和BY630 2小时，通过HPLC纯化所述产品。通过Jacobsen等在J.Med.Chem 1985，28，1334-1340中所述的方法合成XAC和类似物。

TOF ES+测量值974.3998(C50H55BF2N9O7S要求974.4006)

Rt12.5分钟(35-100％v/v B，30分钟)

δH 0.87，0.90(6H，重叠t，J 9.3，N1-，N3-CH2CH2CH3)，1.14-1.25(2H，m，C24H2)，1.36-1.62(6H，m，C23H2，C25H2，N1/3-CH2CH2CH3)，1.68-1.78(2H，m，N1/3-CH2CH2CH3)，2.04(2H，t，J 7.3，C22H2)，3.04-3.19(6H，m，C18H2，C19H2，C26H2)，3.86(2H，t，J 7.4，N1/3-CH2CH2CH3)，4.01(2H，t，J 7.1，N1/3-CH2CH2CH3)，4.52，4.53(4H，2×s，C15H2，C29H2)，6.95(1H，d，J 4.2)，7.05-7.10(4H，m)，7.27-7.30(3H，m)，7.35-7.40(2H，m)，7.41(1H，br s)，7.54-7.65(3H，m)，7.70(1H，s)，7.77(1H，s)，7.80-7.92(2H，s)，8.01-8.23(4H，m)(2×C11H，2×C12H，2×C32H，2×C33H，C35H，C36H，C38H，C39H，C41H，C43H，C44H，C47H，C48H，C49H，N9H，N17H，N20H，N27H)。

实施例A2-合成在人A1-腺苷受体(A1-AR)处的腺苷基荧光激动剂，基于具有保持功能活性的5’-N-乙基甲酰胺基腺苷(NECA)的受体

化合物2，3，3a和3b通过使适当保护的肌苷衍生物特定地特定地与氯化剂反应，引入保护的接头来合成。保护基的除去在通过连接基团共轭荧光剂之前进行。

流程2

试剂和条件：(a)Ac2O，吡啶，40℃，1小时，97％.(b)POCl3，N，N-二甲基苯胺，回流，5分钟，85％.(c)(i)H2N(CH2)4NHR，DIEA，EtOH，回流，18小时，(ii)饱和NH3/MeOH，0℃，2小时。66％。(d)H2，Pd/C，MeOH∶H2O∶AcOH(7∶2∶1)，室温，2小时，80％(e)BODIPY 630/650-SE，DMF，室温，3小时，63％

1.腺苷-C4-BODIPY 630/650(ABA-BY630)(2)

使用流程2a-e中所述的方法、试剂和条件合成ABA-BY630，其中R是COCH2Ph。

ES+测量值885.4(C43H48BF2N9O7S要求885.4)

Rt 22.5分钟(5-100％v/v B，30分钟)

2.NECA-C4-BODIPY 630/650(ABEA-BY630)(3).

由市售的试剂分6步合成N6-氨基丁基-5’-脱氧-5’-氧代-5’-乙基氨基腺苷(ABEA)。所述ABEA的伯胺基团用荧光团BODIPY_630/650-X-琥珀酰亚胺基酯(BY-630，Molecular Probes)进行酰化，制得BY630-ABEA，它通过RP-HPLC进行纯化(流程3)。

所述合成步骤如流程3所示，使用通式H2N(CH2)4HNCOOCH2Ph所示的接头前体：

流程3

试剂和条件：(a)2，2-二甲氧基丙烷，TsOH，丙酮，室温，18小时。(b)TEMPO，BAIB，MeCN∶H2O(1∶1)，室温，4小时。(c)(i)SOCl2，DMF，CHCl3，回流，6小时。(ii)EtNH2，CHCl3，5℃，30分钟.(d)H2N(CH2)4NHZ，DIEA，EtOH，回流，18小时。(e)0.1M HCl(水溶液)，50℃，4小时。(f)H2，Pd/C，MeOH∶H2O∶AcOH(9∶0.9∶0.1)，室温，3小时。(g)BODIPY 630/650-X-SE，DMF，室温，4小时。

合成接头修饰的配体，通式IV所示的化合物

2’，3’-异亚丙基肌苷1：将肌苷(5.36g，0.02mol)和对甲苯磺酸一水合物(3.80g，0.02mol)悬浮在2，2-二甲氧基丙烷(50cm3)和丙酮(200cm3)的混合物中，并搅拌18小时。加入碳酸氢钠(2.52g，0.02mol)和水(40cm3)，所述悬浮液搅拌15分钟。所述悬浮液蒸发至恒定体积，由残留水中重结晶所述粗产物，制得丙酮化合物1(3.71g，60％)，为白色针状物；熔点：266-268℃(从H2O中)(文献值：266℃)；[α]22D-67.1(c 0.59，MeOH中)(文献值：[α]20D-66.9(c 0.8，在MeOH中))；δH(250MHz；DMSO-d6)1.31(3H，s，CH3)，1.53(3H，s，CH3)，3.53(2H，m，C5’H2)，4.22(1H，m，C4’H)，4.93(1H，dd，J 6.1和2.5，C3’H)，5.26(1H，dd，J 6.1和2.9，C2’H)，6.1O(1H，d，J 2.9，C1’H)，8.10(1H，s，腺嘌呤CH)，8.31(1H，s，腺嘌呤CH)；δC(69.2MHz；DMSO-d6)25.2，27.0(2×丙酮化合物)，61.4(C5’)，81.3(C4’)，83.8(C3’)，86.6(C2’)，89.6(C1’)，113.1(4°)，124.4(4°)，138.7(CH)，146.1(CH)，147.8(4°)，156.5(4°)；m/z(ES+)309(MH+)，137(M-核糖).

2’，3’-异亚丙基-5’-氧代肌苷2：将丙酮化合物1(3.08g，10mmol)、TEMPO(313mg，2mmol)和二乙酸亚碘酰苯酯(7.09g，22mmol)溶解在MeCN∶H2O(1∶1，50cm3)中，并搅拌，在遮光条件下进行4小时。从所得悬浮液中仔细蒸发所述溶剂，并用丙酮和二乙醚依次滴定所述反应残留物，制得酸2(2.67g，83％)，为白色粉末；熔点224-229℃(从二乙醚中)(文献值：274-276℃)；(测量值：C，48.55；H，4.3；N，17.0.C13H14N4O6要求C，48.45；H，4.4；N，17.4％)；δH(250MHz；DMSO-d6)1.33(3H，s，CH3)，1.51(3H，s，CH3)，4.68(1H，d，J 1.6，C4’H)，5.36-5.44(2H，m，C2’H和C3’H)，6.30(1H，s，C1’H)，8.02(1H，s，腺嘌呤CH)，8.27(1H，s，腺嘌呤CH)，12.42(1H，br s，NH；δC(69.2MHz；DMSO-d6)25.1，26.7(2×丙酮化合物)，83.9，85.8，90.0(4×CH)，112.9(4°)，124.4(4°)，140.0(CH)，145.8(CH)，148.2(4°)，156.8(4°)，171.8(C＝O)；m/z(ES+)323(MH+)，137(M-核糖)。

6-氯-6-脱氧-5’-乙基氨基-2’，3’-异亚丙基-5’-氧代-5’-脱氧肌苷3：(N.B.极干燥的反应条件，并在惰性气氛下)，将酸2(967mg，3mmol)悬浮在CHCl3(15cm3)中，其中已经加入N，N-DMF(581μL，7.5mmol)和SOCl2(1.09cm3，15mmol)。将所述悬浮液置于热油浴中，并在回流条件下保持6小时。蒸发所得溶液，并在5℃下将黄色油溶解在THF(20cm3)中。滴加乙胺(在THF中的2.0M溶液，3.75cm3，7.5mmol)，并在5℃下搅拌15分钟，并加热至室温。将所述溶剂蒸发，并将残留物溶解在DCM(25cm3)中，并用水(2×20cm3)和饱和盐水溶液(2×20cm3)洗涤。将所述有机馏分干燥，并蒸发留下黄色油，通过在二氧化硅上柱色谱(5％MeOH-DCM)进行纯化，制得标题化合物3(525mg，48％)，为黄色浆液；[α]19D-12.9(c 0.50，CHCl3中)；δH(250MHz；CDCl3；Me4Si)0.78(3H，t，J 7.3，CH2CH3)，1.41(3H，s，CH3)，1.64(3H，s，CH3)，2.90-3.11(2H，m，CH2CH3)，4.74(1H，d，J 1.9，C4’H)，5.46(1H，dd，J 6.2和2.3，C2’H)，5.54(1H，dd，J 6.2和1.9，C3’H)，6.24(1H，d，J 2.3，C1’H)，6.28(1H，br s，NH)，8.35(1H，s，腺嘌呤CH)，8.68(1H，s，腺嘌呤CH)；δC(69.2MHz；CDCl3；Me4Si)14.2(CH2CH3)，25.0，26.9(2×丙酮化合物)，33.9(CH2CH3)，82.9，83.4，86.7，92.0(4×CH)，114.6(4°)，132.3(4°)，144.8(CH)，150.9(4°)，151.9(4°)，152.2(CH)，168.1(C＝O)；m/z(ES-)366((M-H)-)，153(M-核糖)。

N6-(4-苄氧基羰基氨基丁基)-5’-乙基氨基-2’，3’-异亚丙基-5’-氧代-5’-脱氧腺苷4：将氯化物3(337mg，0.92mmol)溶解在EtOH(10cm3)中，往其中加入N-苄氧基羰基丁基-1，4-二胺(305mg，1.37mmol)和DIEA(159μL，0.92mmol)。将所述溶液置于热油浴中，并在回流条件下保持18小时。所得溶液进行蒸发，并且所述黄色油在二氧化硅上柱色谱(2.5％MeOH-DCM)进行纯化，制得标题化合物4(445mg，88％)，为淡黄色胶；δH(250MHz；CDCl3；Me4Si)0.99(3H，t，J 7.1，CH2CH3)，1.43(3H，s，CH3)，1.55-1.71(7H，m，CH3和2×CH2)，3.20-3.35(2H，m，CH2)，3.55-4.01(4H，m，CH2CH3和CH2)，4.81(1H，s，CH)，5.10(3H，m，苄基CH2和CH)，5.51(1H，d，J 5.9，CH)，5.71(1H，d，J 5.9，CH)，6.10(1H，br s，NH)，6.16(1H，br s，NH)，7.30-7.36(5H，m，芳族s)，7.86(1H，s，腺嘌呤CH)，8.22(1H，s，腺嘌呤CH)；δC(69.2MHz；CDCl3；Me4Si)13.7(CH2CH3)，25.1，26.6(2×丙酮化合物)，26.8，27.0，40.0，40.4(4×CH2)，61.5(CH2CH3)，66.6(苄基 CH2)，84.1，84.7，87.0，91.6(4×CH)，113.7(4°)，128.1(C)，128.5(CH)，136.7(4°)，139.9(CH)，152.8(CH)，154.9(4°)，156.5(CH)，169.4(C＝O)；m/z(ES+)554(MH+)，341(M-核糖).

N6-(4-苄氧基羰基氨基丁基)-5’-乙基氨基-5’-氧代-5’-脱氧腺苷5：将腺苷衍生物4(261mg，0.47mmol)溶解在1M HCl(水溶液)∶1，4-二噁烷(1∶1，4cm3)中，置于50℃的油浴中，并搅拌4小时。所得溶液调整为pH 8(饱和的NaHCO3(水溶液))，用NaCl饱和，并用EtOAc(3×5cm3)提取。所述混合的有机组分进行干燥，并蒸发，通过制备型层色谱法(10％MeOH-DCM)纯化所述粗产物，制得标题化合物5(160mg，66％)，为无色油；δH(250MHz；DMSO-d6)1.08(3H，t，J 7.2，CH2CH3)，1.45-1.62(4H，m，C2H2和C3H2)，2.98-3.06(2H，m，C1H2)，3.17-3.26(2H，m，CH2CH3)，3.37-3.53(2H，m，C4H2)，4.12-4.16(1H，m，C3’H)，4.31(1H，d，J 1.1，C4’H)，4.58-4.65(1H，m，C2’H)，4.99(2H，s，苄基CH2)，5.56(1H，d，J 6.5，C2’-OH)，5.76(1H，d，J 4.2，C3’OH)，5.96(1H，d，J 7.6，C1’H)，7.25-7.34(6H，m，芳族s和NH)，8.01(1H，br s，氨基甲酸酯NH)，8.27(1H，s，腺嘌呤CH)，8.39(1H，s，腺嘌呤CH)，8.94(1H，t，J 5.6，酰胺NH)；δC(69.2MHz；DMSO-d6)14.9(CH2CH3)，26.6，27.1，33.4，39.5，40.3(5×CH2)，65.3(苄基 CH2)，72.2，73.3，84.9，88.0(4×CH)，120.2(4°)，127.9(CH)，128.5(CH)，137.5(CH)，140.6(4°)，152.6(CH)，154.9(4°)，156.3(4°)，169.3(4°)；m/z(ES+)514(MH+).

N6-(4-氨基丁基)-5’-乙基氨基-5’-氧代-5’-脱氧腺苷(ABEA)6：将腺苷衍生物5(48mg，0.09mmol)溶解在MeOH∶H2O∶AcOH(9∶0.9∶0.1，5cm3)中，往其中加入10％Pd/C(10mg)。将所述烧瓶排空，并充入氢气(气球)，并剧烈搅拌3小时。所述反应混合物通过硅藻土过滤，并用MeOH洗涤所述硅藻土。蒸发所述混合的有机过滤液，并从MeCN(2×15cm3)再次蒸发所得油，制得标题化合物6(35mg，定量)，为无色油；δH(250MHz；DMSO-d6)1.08(3H，t，J 7.2，CH2CH3)，1.46-1.88(6H，m，2×CH2和NH2)，2.63(2H，t，J 6.8，CH2)，3.16-3.29(2H，m，CH2CH3)，3.40-3.52(2H，m，CH2)，4.10-4.15(1H，m，C3’H)，4.30(1H，d，J 1.3，C4’H)，4.53-4.62(1H，m，C2’H)，5.96(1H，d，J 7.7，C1’H)，8.05(1H，br s，NH)，8.27(1H，s，腺嘌呤CH)，8.39(1H，s，腺嘌呤CH)，8.95(1H，t，J 5.6，酰胺NH)；m/z(ES+)380(MH+).

合成荧光配体，通式I所示化合物

ABEA-BY630(3)：在惰性气氛以及遮光条件下，将ABEA 6(5.74mg，15.1μmmol)溶解在N，N-DMF(1cm3)。加入Bodipy 630/650-X-琥珀酰亚胺基酯(MolecularProbes)(5.0mg，7.55μmmol，1cm3N，N-DMF)，并将所述反应物搅拌4小时。蒸发所述溶液，并通过制备型层色谱法(10％MeOH-DCM)纯化所述粗产物，制得标题化合物7(3)(5.24mg，75％)，为紫色粉末；m/z(ES+)测量值：947.37(

C45H51BF2N10O7SNa要求947.36)。

ABEA-BY630

3.NECA-C5-BODIPY 630/650(APEA-BY630)(3a)

使用通式H2N(CH2)5NHCOOCH2Ph所示的接头前体，使用流程3所述的方法合成这种化合物(如针对化合物(3)中所述的)：

制得APEA-BY630，它具有如下通式：

Rt8.6分钟(30-100％v/v B，25分钟)

4.NECA-PEG8-BODIPY 630/650(ABIPEA-BY630)(3b)

使用通式H2N((CH2)2O)2(CH2)2NH COOCH2Ph所示的接头前体，通过流程3所述的方法合成这种化合物(如化合物(3)中所述)，其中，以下中间体1-3分别是结构式4-7的类似物，如流程3所示：

N6-(8-苄氧基羰基氨基-3，6-二噁辛基)-5’-乙基氨基-2’，3’-异亚丙基-5’-氧代-5’-脱氧腺苷1：δH(400MHz；CDCl3)0.88(3H，t J 7.3，EtCH3)，1.38(3H，s，丙酮化合物 CH3)。1.62(3H，s，丙酮化合物CH3)，3.03-3.16(2H，m，EtCH2)，3.40-3.93(14H，m，6x接头亚甲基，C3’H，C4’H)，4.67(1H，s，C2’H)，5.11(2H，s，苄基CH2)，5.32(1H，s，C1’H)，5.80(1H，br s，氨基甲酸酯NH)，6.55(1H，br s，C6-NH)，7.02(1H，br s，酰胺NH)，7.28-7.37(5H，m，芳族CH)，7.64(1H，br s，腺嘌呤CH)，8.29(1H，s，腺嘌呤CH).

N6-(8-苄氧基羰基氨基-3，6-二噁辛基)-5’-乙基氨基-5’-氧代-5’-脱氧腺苷2：δH(400MHz；DMSO-d6)1.08(3H，t J 7.2，Et CH3)，3.12-3.17(2H，m，接头CH2)，3.18-3.25(2H，m，EtCH2)，3.41(2H，t J 6.0，接头CH2)，3.49-3.54(4H，m，2x接头CH2)，3.57-3.67(4H，m，2x接头CH2)，4.14(1H，br m，C3’H)，4.31(1H，d J 1.5，C4’H)，4.58-4.63(1H，m，C2’H)，5.00(2H，s，苄基CH2)，5.54(1H，dJ  6.4，C2’-OH)，5.74(1H，d J 4.1，C3’-OH)，5.97(1H，d J 7.6，C1’H)，7.25-7.36(6H，m，芳族CH和氨基甲酸酯NH)，7.85(1H，br s，C6-NH)，8.28(1H，br s，腺嘌呤CH)，8.40(1H，s，腺嘌呤CH)，8.87(1H，t J 5.6，酰胺NH).

N6-(8-氨基-3，6-二噁辛基)-5’-乙基氨基-5’-氧代-5’-脱氧腺苷3：δH(400MHz；DMSO-d6)1.05(3H，t J 7.1，EtCH3)，1.86(2H，br s，-NH2)，2.71-2.80(2H，m，接头CH2)，3.17-3.26(2H，m，EtCH2)，3.41-73(10H，m，5x接头CH2)，4.15(1H，br m，C3’H)，4.34(1H，s，C4’H)，4.47-4.54(1H，m，C2’H)，5.95(2H，br s，C2’-OH，C3’-OH)，6.01(1H，d J 7.5，C1’H)，7.92(1H，br s，C6-NH)，8.31(1H，br s，腺嘌呤CH)，8.44(1H，s，腺嘌呤CH)，8.95(1H，t J 5.6，酰胺NH)。

制得ABIPEA-BY630，它具有如下通式：

TOF ES+测量值985.3993(C47H56BF2N10O9S要求985.4013)

Rt 8.3分钟(35-100％v/v B，25分钟)

实施例A3-合成β-肾上腺素受体激动剂

沙莫特罗-BODIPY 630/650(4)和衍生物-沙莫特罗-BODIPY 630/650(4a)

沙莫特罗通过两种不同连接位点按照以下合成方式连接到荧光团上：

在第一步中，一个接头取代到沙莫特罗侧链上，接着通过它连接所述荧光团。在第二步中，所述沙莫特罗的天然烷基侧链用接头和荧光团代替。在本发明这种情况下，结合、荧光以及活性的保持并不确定，因此必须证实，所述信息由荧光配体提供，以制得有用的化合物。

流程4

试剂和条件：(i)(a)HCHO，HCl(水溶液)，二噁烷，60℃，(b)2，2-二甲氧基丙烷，TsOH。(ii)Me3SI，NaH，THF。(iii)(a)BocNH(CH2)nNH2，EtOH，(b)HCl，Et2O.(iv)BODIPY 630/650-X-SE，DMF，RT.(v)(a)ZL’YL’-L-YLPL，EtOH，(b)HCl，Et2O，ZL’YL’-L-YLPL是

并形成化合物4a

如流程4及以上所述，以下所有分子取决于相同的两个接头部分的合成，(此时，所述烃链长度容易变化，或者化学改变成例如乙二醇结构，提高溶解性)。

2.克仑特罗-BODIPY 630/650(9)

实施例A4-合成β-肾上腺素受体拮抗剂

如流程4及实施例A3中所述，以下所有分子取决于所述相同的两个接头部分的合成，(此时，所述烃链长度容易变化，或者化学改变成例如乙二醇结构，提高溶解性)。

1.CGP 12177-BODIPY 630/650(5) 2.心得安-BODIPY 630/650(6)

3.ICI118551-BODIPY 630/650(7)  4.阿普洛尔-BODIPY 630/650(8)

B.药理学

实施例B1-腺苷基荧光A1-受体拮抗剂的结合

1.XAC-BY630(1)

所述腺苷-A1受体(A1-AR)是G-蛋白偶联受体，它可以在各种组织包括脑、心脏、脂肪组织和肌肉中发现。通过将A1-AR拮抗剂黄嘌呤胺同源物(cogener)(XAC)共轭到荧光团BODIPY_-630/650(BY630)上，我们合成了荧光A1-AR配体，XAC-BY630，使这种受体在活细胞中显影。

在表达人A1-受体的CHO-A1细胞上进行[3H]DPCPX结合以及环AMP和肌醇磷酸累积试验。按照Dulbecco改进的Eagle培养基：包含5％胎牛血清和和2mM谷氨酰胺的Ham氏F12，在8-孔LabtekTM平板皿上使用生长至50％汇合的CHO-A1细胞，采用Zeiss LSM510共焦显微术获得图像。用所述化合物在22℃下培育之前，用HEPES-缓冲盐水洗涤所述细胞两次。

XAC-BY630和BY630的光谱分析本身显示其峰激发(分别为630和632nm)和发射波长(650，653nm)不是完全不同。对CHO-A1细胞膜的[3H]DPCPX结合研究显示XAC-BY630对A1-AR的亲和性比XAC更低(XAC和XAC-BY630各自为pKi＝7.79±0.13和6.82±0.11，平均值±标准偏差，n＝4)。在cAMP生产的5’-N-乙基甲酰胺基腺苷-介导的抑制(表观pKB＝6.98±0.15，与XAC的8.06±0.24比较，n＝3)和肌醇磷酸生产的刺激(表观pKB＝6.26±0.20，与XAC的7.46±0.08比较，n＝4)中，XAC-BY630也起到竞争性A1-AR拮抗剂的作用。共焦图像显示XAC-BY630以依赖于时间和浓度的方式结合到膜-定位的A1-ARs。在5分钟之后检测XAC-BY630(25-250nM)的结合，在培育30分钟之后主要位于膜处。XAC-BY630的膜结合是受体特异性的，这是因为用DPCPX(10-8-10-6M)进行30分钟预培育导致膜结合(30分钟，50nM)的依赖浓度的抑制作用。

这些研究表明，XAC-BY630是具有中等亲和性的官能化A1-AR拮抗剂，它可以用于使主要组织和细胞系中的A1-AR显影。

荧光相关光谱法(FCS)

FCS是非侵入式技术，它测量在共焦体积小于10-15l中荧光强度的波动。这些波动的统计学分析给出了有关扩散速度(即，质量)和存在的荧光分子的浓度的信息。因此，在单个细胞上可以同时量化游离配体(快速扩散)和结合配体(缓慢扩散)。我们使用FCS来测量荧光配体，黄嘌呤胺同源物-BODIPY_630/650(XAC-BY630)结合到人腺苷A1受体(A1-AR)的情况。

表达人A1-AR或A1-AR-Topaz融合的CHO细胞在玻璃底8-孔平板皿上培养，制备用于肝细胞测量。使用安装有Axiocam CCD相机(用于x-y定位)的ZeissConfocor 2进行FCS测量。在22℃下，用配体培育所述细胞一定的时间，在上膜上定位共焦体积。收集2×30秒的数据，之后15秒预漂白，并使用Zeiss AIM软件进行多参数方程式分析。

最初，在CHO-A1Tpz细胞中确定A1-AR-Topaz融合蛋白质(A1-AR-Tpz)的扩散特征。自动相关分析显示A1-AR的扩散时间(τD)为15.0±0.9ms(平均值±标准误差，n＝84)。也看到第二组分(τD＝118±14微秒)，可能由荧光团内的偶发光学时间(“闪光”)引起。缓冲液中XAC-BY630的FCS分析显示了单个组分扩散(τD＝60±2微秒，n＝10)。在用XAC-BY630(1-40nM，10-60分钟，n＝71)培育的CHO-A1细胞的上膜上，除了游离配体以外还检测到其它两种缓慢扩散的种类。所述第一组分具有与A1-AR-Tpz类似的扩散时间(τD1＝17.4±1.1ms；69/71细胞)，显示是受体-结合配体。所述第二部分是扩散很缓慢的组分(τD2＝345±41ms，61/71细胞)。在用8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤(DPCPX)(1M，30分钟)预培育之后，在30/31细胞中存在tD2，显示这种组分是非特异性结合的。但是，所述tD1组分仅存在于17/31细胞中。此外，在接触15nM XAC-BY63030分钟的细胞中，τD1组分的量从51.8±14.9降低到13.6±5.4受体/平方微米，DPCPX(分别为n＝8和4，斯图顿特t-试验，P＜0.05)，进一步提示该组分是A1-AR结合的配体。

我们使用FCS来量化A1-AR的结合，并测量在单个肝细胞中的受体扩散。进一步的研究允许内源生A1-AR在急剧分散的细胞中进行定量受体-配体结合。

这些研究显示XAC-BY630是具有中等亲和性的官能化A1-AR拮抗剂，它可用于显影和测量在主要组织和细胞系中结合A1-AR的情况。

实施例B2-NECA基荧光A1-受体激动剂的结合

2.BY630-ABEA(3)

在表达人A1-AR和c-fos-pGL3报道载体(CHO-A1fos细胞)的CHO-K1细胞中进行功能研究。细胞在不含血清的DMEM/F-12培养基中培育24小时，然后用激动剂刺激5小时，在一些情况下，之后用8-环戊基-1，3-二丙基黄嘌呤(DPCPX)培育30分钟。按照制造商的说明书使用Luclite_试剂盒量化荧光素酶的表达。在CHO细胞上或在表达用绿色荧光蛋白(CHO-A1Tpz)在C末端上标记的A1-AR的CHO-A1细胞或CHO细胞上进行肝细胞共焦图像。

在CHO-A1fos细胞中，BY630-ABEA和A1-AR激动剂，N6-环戊基腺苷(CPA)以剂量依赖的方式刺激荧光素酶表达(对于CPA和BY630-ABEA，pEC50分别为7.01±0.04(n＝6)和6.76±0.18(n＝5)，平均值±标准偏差)。刺激通过A1-AR受体介导，因为浓度响应曲线由于10nM DPCPX以竞争的方式偏移到右边，pKd值分别为8.72±0.03和9.05±0.10与CPA和BY630-ABEA比较(n＝3)。更高剂量的DPCPX(100nM)使CPA刺激的pKd值为8.62±0.02，但是完全阻断对BY630-ABEA(n＝3)的响应。对于受体的显影，CHO-A1细胞用100nM BY630-ABEA培育至多60分钟。在5分钟之后可以检测到配体结合到膜上，并在30分钟之后结合牢固(n＝3)。结合是针对A1-AR的，因为通过用DPCPX(1μM，30分钟)预培育充分降低了。此外，在CHO-A1Tpz细胞中的实验显示在膜上的配体荧光与荧光标记的A1-AR共同定位。

结果如图1所示，显示a)来自结合到CHO细胞上的本发明荧光配体的受体结合的共焦显微术图像，在红色通道观察到；(b)指示受体位置的CHO细胞表达的绿色荧光蛋白质的荧光的共焦显微术图像，通过绿色通道观察到；(c)来自(a)和(b)的显示荧光重叠的重叠图像，由此证实配体结合对受体是特异的。

总之，我们成功合成了一种新的用于人A1-AR的荧光激动剂配体。这种配体可用于监控内源生A1-AR受体在剧烈分散的细胞和细胞系中的定位。

C.与药理学数据相关的配体

实施例C1-用于包含腺苷基荧光A1-受体拮抗剂的库/目录化合物的数据表

1.XAC-BY630(1)

性能描述：荧光腺苷A1-受体拮抗剂

合成和分析：见以上A1

存储：-20℃(暗)

光谱性能：

激发最大值638nm

发射最大值655nm

荧光寿命4.2ns

发射量子产率0.33

药理学：

表达人腺苷A1-受体的CHO-细胞：

3H-DPCPX结合(膜)的抑制pKB＝-6.82+0.11

3H-DPCPX结合(整个细胞)的抑制pKB＝-6.9

NECA-刺激的cAMP累积的拮抗pKI＝-6.98+0.15

NECA-刺激的肌醇磷酸酯累积的拮抗pKI＝-6.26+0.20

成像：

XAC-BY630/650结合到CHO-A1细胞和CHO-A1-GFP细胞的图像

所述图像也显示通过非荧光拮抗剂DPCPX置换结合的情况。

实施例D具有不同荧光标记的配体的库

D1集合包含3种荧光配体的库，各库包含用荧光团荧光标记的ABIPEA，提供不同的荧光特性，所述荧光团选自BODIPY 630/650-X-SE、EvoBlue 30SE、BODIPYFL乙二胺等。

荧光标记的配体通过本发明以上所述的方法制得。

所述库包含用于各配体的数据表(以上的C.)。

D2集合包含2种荧光配体的另一库，各配体包含以上所述的腺苷和ABIPEA，它们各自分成3个样品，并通过结合碳链长度不同的接头(C3-6)进行修饰，此时，通式IV所示包含JL的化合物是胺，L是(CH2)3-6，YL是胺。所述化合物与荧光团反应，提供不同的荧光特性，所述荧光团选自EvoBlue 30SE和BODIPY 630/650X-SE。

荧光标记的配体通过本发明以上所述的方法来制得。

所述库包含用于各配体的数据表(以上的C.)。

D3集合包含3种标记配体的另一库，各配体包含用选择本领域已知标记物标记的ABIPEA，包括用荧光团标记的一种。

所述库包括用于各配体的数据表(以上的C.)。

如本领域已知，该库可用于进行具有所需荧光团的荧光配体的结合研究，或者选择荧光配体，或者选择其中一种包含所需荧光团的配体。

然后，对所述库进行选择，以筛选用于在所需受体处的结合，并选择一种荧光配体，它为所需受体提供最佳的药效。通过合理设计所述库有利于对要筛选的库进行选择，提供所需的类似物，以产生正选择。