技术领域
[0001] 本
发明属于光学、
生物学、化学领域，尤其涉及一种超分辨
荧光寿命成像系统。
背景技术
[0002] 荧光显微技术具有无损、非
接触、高特异性、高灵敏、高活体友好以及能够提供功能信息等突出优点，一直是生命科学，尤其是细胞生物学研究的重要工具。近年来，随着生命科学的发展，对荧光显微技术也提出了越来越高的要求，激光技术、荧光探针标记技术、新型荧光探测技术和成像手段的不断发展，极大地促进了荧光显微技术的发展，成为推动生命科学发展的重要动
力。此外，荧光显微技术也在成像的对比机制方面获得了很大的进展。
[0003] 目前，生命科学的研究已进入分子层次，为了更好地理解生命活动和
疾病发展的分子机理，需要在分子
水平上研究细胞内
蛋白质位置与功能的关系以及蛋白质分子之间相互作用等，这对荧光显微技术提出了更高的要求。突破衍射极限限制，发展具有纳米空间分辨的远场荧光显微技术已成为国际显微成像领域的前沿热点之一。超分辨(SR)成像技术的发展，也为荧光寿命成像(FLIM)的新发展提供了巨大的机遇。研究和发展超分辨荧光寿命成像(SR-FLIM)技术，可以显著提高FLIM荧光寿命的测量
精度以及
定位精度，利用基于SR-FLIM的荧光共振
能量转移(FRET)，可以在分子尺度研究蛋白质分子之间的相互作用，获得分子之间相互作用的效率及其精确定位。
[0004] 然而，受光学衍射极限的限制，荧光显微技术的空间
分辨率只能达到200纳米左右，难以满足生命科学研究的需要。而对于荧光寿命成像来说，其空间分辨率受衍射极限的影响尤为严重。传统的衍射受限FLIM图像中各个
像素的荧光寿命值，并不能反映其所对应的分子的荧光寿命，无法做到分子尺度的荧光寿命成像。
[0005] 超分辨荧光寿命成像是一个新兴的研究领域，寻求具有高度原创性的技术原理与方案，并率先解决超分辨荧光寿命成像在生命科学应用中存在的难题，具有重大的科学意义与应用价值。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种超分辨荧光寿命成像系统，旨在突破光学衍射极限限制，实现超分辨荧光寿命成像。
[0007] 本发明是这样实现的，一种超分辨荧光寿命成像系统，包括：
[0008] 第一
激光器，用于实现对标记于样品中的光
开关染料分子的稀疏激活；
[0009] 第二激光器，用于激发样品中被激活的光开关染料分子；
[0010] 合束镜，用于将所述第一激光器所发出的光和所述第二激光器所发出的光合成为一束光；所述第一激光器所发出的光由所述合束镜的第一反射面呈一定入射
角射入，并在第一反射面反射；所述第二激光器所发出的光由所述合束镜的第二反射面射入，经所述合束镜透射后由所述合束镜的第一反射面射出；
[0011] 依次设于所述第一激光器和所述合束镜之间的第一透镜、第一滤光片、反射镜；
[0012] 依次设于所述第二激光器和所述合束镜之间的第二透镜、第二滤光片、扫描振镜；
[0013] 第一物镜、第二物镜；
[0014] 依次设于所述合束镜的第一反射面与所述第一物镜的之间的第一管镜、双色镜；
[0015] 时间相关单
光子计数器，用于对接收到的光子进行计数；
[0016] 依次设于所述双色镜与所述时间相关单光子计数器之间的第一发射滤光片、第二管镜、
光电倍增管；
[0017]
电子倍增型CCD摄相机，用于记录光开关染料分子的荧光图像；
[0018] 设于所述第二物镜与所述电子倍增型CCD摄相机之间的第二发射滤光片、第三管镜；
[0019] 主机，同时连接所述时间相关单光子计数器和所述电子倍增型CCD摄相机，用于结合所述电子倍增型CCD摄相机记录的光开关染料分子的荧光图像，对荧光图像中的光开关染料分子进行质心定位，并根据所述时间相关单光子计数器在质心定位处对接收到的光子进行计数的结果，构建超分辨荧光寿命图像；同时还连接所述第一激光器和所述第二激光器，用于控制所述第一激光器和所述第二激光器的工作；
[0020] 以及
[0021] 延迟器，连接于所述主机和所述电子倍增型CCD摄相机之间，用于实现所述第二激光器和所述电子倍增型CCD摄相机的同步。
[0022] 本发明将基于单分子定位的超分辨荧光显微技术和基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像结合，实现超分辨荧光寿命成像，突破了光学衍射极限限制，极具科学意义与应用价值。
附图说明
[0023] 图1是本发明
实施例提供的超分辨荧光寿命成像方法的实现
流程图；
[0024] 图2是本发明实施例提供的超分辨荧光寿命成像系统的光学结构图。
具体实施方式
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 本发明实施例的基本思路是将基于单分子定位的超分辨荧光显微STORM技术和基于时间相关单光子计数(TCSPC)的荧光寿命成像结合，实现超分辨荧光寿命成像(SR-FLIM)。
[0027] 以下结合本发明的具体实施例予以详细描述。
[0028] 图1示出了本发明实施例提供的超分辨荧光寿命成像方法的实现流程，详述如下：
[0029] 在步骤S101中，对标记于样品中的光开关染料分子进行稀疏激活。
[0030] 其中，光开关染料分子和样品中所要观察的分子需能够特异性结合，可以选用红色花青染料分子，如Cy5和Alexa 647，通过免疫荧光
染色的方式将红色花青染料分子标记于样品中。也可以选用利用顺式-反式异构体的构像变化造成可逆开关的荧光蛋白，如Dronpa系列，通过
转染的方式将荧光蛋白标记于样品中。
[0031] 本发明实施例中，具体可通过全场面照明的方法激活光开关染料分子。
[0032] 在步骤S102中，激发样品中被激活的光开关染料分子，收集被激发的光开关染料分子所发射的光子并记录光开关染料分子的荧光图像，对荧光图像中的光开关染料分子进行质心定位。
[0033] 可采用皮秒脉冲光扫描激发被激活的荧光分子，由于本发明实施例是将基于单分子定位的超分辨荧光显微STORM技术和基于时间相关单光子计数(TCSPC)的荧光寿命成像结合，因此对被激发的光开关染料分子所发射的光子需要收集两份：一份用于记录光开关染料分子的荧光图像，对样品中的单个发光分子进行质心定位，实现横向达到
纳米级的定位精度；另一份则用于实现对单个分子所发光子的准确分类，通过采用负指数函数拟合，从而可以得到各个发光分子的准确的荧光寿命，拟合公式为I(t)＝I0 exp(-t/τ)，其中，t为时间，τ为荧光寿命，I0为初始时刻(t＝0时)的荧光强度，I(t)为t时刻的荧光强度。
[0034] 质心定位的目的是实现横向达到纳米级的定位精度。虽然对于显微系统来说，一个点
光源的像为由系统点扩散函数决定的
艾里斑，但是点光源的空间位置可以通过其荧光图像的质心求出，定位精度(标准差)和系统探测到的来自该点源的光子数的平方根成反比，与系统本身点扩散函数的标准差成正比，因此可以获得高达纳米的定位精度。而横向的质心定位就直接用高斯函数拟合就可以实现，轴向单分子定位显微结合某些轴向分辨辅助手段，例如改造点扩散函数，使得不同轴向位置上的点扩展函数(PSF)携带有z轴的坐标信息，例如利用柱面镜像散，螺旋形的PSF，也能将轴向分辨率提高到50纳米甚至更高的水平。
[0035] 在步骤S103中，对在质心定位处接收到的光子进行计数，确定被激发的光开关染料分子的荧光寿命。
[0036] 根据计数结果计算荧光寿命的原理如上文步骤S102中所述，此处不再赘述。
[0037] 在步骤S104中，结合得到的光开关染料分子的质心定位结果和荧光寿命，构建超分辨荧光寿命图像。
[0038] 将寿命和定位信息结合即可重构出超分辨的荧光寿命图像，例如图像中的各个点代表了各个分子的位置，该点所对应像素的
颜色，可以表示该分子的荧光寿命。
[0039] 图2示出了本发明实施例提供的超分辨荧光寿命成像系统的光学结构图，为了便于描述，仅示出了与本实施例相关的部分。图2中的英文标记定义如下：Laser1：第一激光器；Laser2：第二激光器(发射皮秒脉冲激发光)；L1：第一透镜；L2：第二透镜；F1：第一滤光片；F2：第二滤光片；Scan Device：扫描振镜；M：反射镜；DM：双色镜；BS：合束镜；TL1：第一管镜；TL2：第二管镜；TL3：第三管镜；O1：第一物镜；O2：第二物镜；S：样品；TCSPC：时间相关单光子计数器；Delay：延迟器；PMT：光电倍增管；EMCCD：电子倍增型CCD摄相机；
EF1：第一发射滤光片；EF2：第二发射滤光片。
[0040] 上述第一激光器Laser1用于实现对标记于样品中的光开关染料分子的稀疏激活，第二激光器Laser2则用于激发样品中被激活的光开关染料分子。合束镜BS用于将第一激光器Laser1所发出的光和第二激光器Laser2所发出的光合成为一束光，其中第一激光器Laser1所发出的光由合束镜BS的第一反射面(图2中合束镜BS的右侧面)呈一定入射角射入，并在第一反射面反射，第二激光器Laser2所发出的光由合束镜BS的第二反射面(图2中合束镜BS的左侧面)射入，经合束镜BS透射后由合束镜BS的第一反射面射出。第一透镜L1、第一滤光片F1、反射镜M依次设于第一激光器Laser1和合束镜BS之间，第二透镜L2、第二滤光片F2、扫描振镜Scan Device依次设于第二激光器Laser2和合束镜BS之间。第一管镜TL1、双色镜DM依次设于合束镜BS的第一反射面与第一物镜O1之间。时间相关单光子计数器TCSPC用于对接收到的光子进行计数。第一发射滤光片EF1、第二管镜TL2、光电倍增管PMT依次设于双色镜DM与时间相关单光子计数器TCSPC之间。电子倍增型CCD摄相机EMCCD用于记录光开关染料分子的荧光图像。第二发射滤光片EF2、第三管镜TL3设于第二物镜O2与电子倍增型CCD摄相机EMCCD之间。主机同时连接时间相关单光子计数器TCSPC和电子倍增型CCD摄相机EMCCD，用于结合电子倍增型CCD摄相机EMCCD记录的光开关染料分子的荧光图像，对荧光图像中的光开关染料分子进行质心定位，并根据时间相关单光子计数器TCSPC在质心定位处对接收到的光子进行计数的结果，构建超分辨荧光寿命图像；主机同时还连接第一激光器Laser1和第二激光器Laser2，控制第一激光器Laser1和第二激光器Laser2的工作。延迟器Delay连接于主机和电子倍增型CCD摄相机EMCCD之间，用于实现所述第二激光器和所述电子倍增型CCD摄相机的同步。
[0041] 参照图2，Laser1可选用输出
波长为640纳米的CW
半导体激光器，作为开关分子的激活光源。在光路中，采用面照明的方法，利用物镜O1将激活光会聚到样品S上。通过控制激活光的功率和激活时间等，实现开关分子的稀疏激活。Laser2是输出波长为640纳米的皮秒脉冲半导体激光器，作为被激活的开关分子的激发光源。在光路中，皮秒脉冲激发光聚焦到样品S上，通过振镜Scan Device沿样品做快速扫描，用于激发被激活的开关分子。样品S所发出的光用相对的两个物镜O1和O2收集，分别送入PMT和EMCCD。前者将接收到的光子
信号送入TCSPC，用于光子的计数；后者得到稀疏激活分子的荧光图像并将图像传输至主机，主机通过质心定位
算法，可以获得发光分子的准确位置。通过主机控制激活光路和激发光路的切换，以及TCSPC检测和EMCCD成像的同步，具体每一个循环过程为：Laser1发出激光以对光开关染料分子进行稀疏激活---Laser2激发样品中被激活的光开关染料分子---EMCCD成像---TCSPC计数。
[0042] 实验步骤如下：
[0043] (1)利用大功率的CW激光Laser1，对样品S进行全场面照明，通过Laser1的
控制器或设于所述第一滤光片前侧或后侧的中性
密度滤光片(图2中未示出)来控制照明强度，通过快
门来控制照明时间，实现对样品中光开关染料分子的稀疏激活。
[0044] (2)利用小功率的皮秒脉冲激光Laser2，并通过扫描振镜Scan Device对样品进行扫描，激发样品中已被激活的开关分子。
[0045] (3)由于样品在整个空间发射光子，实现本项目超分辨成像的根本思路是先进行分子定位，然后将光子“分配”到正确的分子上。因此，对激活分子所发出的荧光，分别由O1和O2两个物镜收集。O2物镜收集的光子采用普通的STORM成像方法，对单分子进行定位分析，获得超分辨荧光显微图像；O1物镜的光子被光电倍增管PMT接收，送入时间相关单光子计数器TCSPC进行荧光寿命测量。
[0046] (4)重复步骤1-3，直至所有分子均被定位及寿命分析完毕。通过图像重构得到样品的超分辨荧光寿命图像。
[0047] 本发明将基于单分子定位的超分辨荧光显微技术和基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像结合，实现超分辨荧光寿命成像，突破了光学衍射极限限制，极具科学意义与应用价值，将有力地推动中国在生命科学领域的发展。
[0048] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
